JP4679375B2 - キャピラリ電気泳動装置 - Google Patents

Description

本発明は核酸やタンパク質等を電気泳動によって分離分析する電気泳動装置に関し、特に、キャピラリ電気泳動装置に関する。

キャピラリ電気泳動装置では、一般に、励起用光源としてレーザ光源が用いられる。しかしながら、近年、キャピラリ電気泳動装置の低価格化を目的として、励起用光源として発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いることが提案されている。特許文献１には、発光ダイオード（LED）を使用する電気泳動装置が開示されている。

また、特許文献２や３には、キャピラリ軸と垂直にレーザ光を照射する方法ではなく、キャピラリ軸方向に励起光を照射する電気泳動装置が提案されている。励起光は、キャピラリ内を伝播し、キャピラリ中を移動する検出目的物質をその位置に関係なく励起する。広範囲の励起領域つまり検出領域を得るので、装置の高感度化が可能となる。その線状の発光部からの検出光を回折格子によって分光し、２次元検出器によって検出する。

また、特許文献４及び５には、従来の波長校正データの取得方法の例が記載されている。

また、非特許文献１には、回折格子の代わりに複数のフィルタを用いる方法が開示されている。
US20030178312 特開平５−５２８１０ 特許第２８３３１１９号 US6821402 US6863791 シー・コーネル他；バイオテクニクス ５巻、６４８頁（１９８７年）（C.Connell et.al.;BioTechniques5，342(1987)）

本願発明者が鋭意検討した結果、次のような課題が判明した。特許文献２や３に開示の技術においては、キャピラリ自身が励起部兼検出部となるので、キャピラリの交換により検出位置がずれるといった問題が生じる。従って、キャピラリ交換毎に、波長校正データの取得が必要である。波長校正データが不正確であると、分析処理において、波長ずれに起因した擬似信号が生じる。波長ずれが大きくなると、擬似信号も大きくなり、分析結果の信頼性が低下する。

また、特許文献４や５に開示された波長校正データの取得方法は、既知のサンプルを実際に電気泳動させる必要があるため、操作者にとっては、大変な手間となっている。

また、非特許文献１に開示された方法では、複数のフィルタを回転させるため、感度及びデータ取得の同時性を確保することが困難である。

つまり、回折格子を用いる方法では、感度及びデータ取得の同時性を確保することができるが、キャピラリ交換毎の波長校正データの取得が必要である。一方、複数のフィルタを用いる方法では、キャピラリ交換毎の波長校正データの取得は不要であるが、感度及びデータ取得の同時性を確保することができない。

本発明の目的は、電気泳動路交換毎の波長校正データの取得を不要にし、且つ、感度、データ取得の同時性を確保し、擬似信号を低減することができる電気泳動装置を提供することにある。

本発明は、検出光学系にマルチバンドパスフィルタを設けたことを特徴とする電気泳動装置に関する。

本発明によると、２次元検出器の信号検出領域を、マルチバンドパスフィルタの波長透過領域に対応して複数の領域に分割する。複数の領域のうち分析試料の蛍光スペクトルのピークを含む領域において蛍光スペクトルの信号の積算値を求める。この積算値を用いて分析を行う。

本発明によると、電気泳動路交換毎に波長校正データの取得を行う必要がなく、また、信号強度及び信号取得の同時性も損なわず、擬似信号を低減することが可能となる。

以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と利益を、図面を参酌して説明する。ただし、図面はもっぱら解説のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。

図１Ａに示すように、本例のキャピラリ電気泳動装置は、キャピラリアレイ１０１、照射光学ユニット１２１、検出光学ユニット１３１、オートサンプラユニット１４１、泳動媒体充填ユニット１５０、電源ユニット１１０、及び、温度制御ユニット１６１を有する。本例のキャピラリ電気泳動装置は、泳動媒体が充填された複数本のキャピラリを用い、各キャピラリに試料を導入し、試料中の試料成分を電気泳動分離し、分析する。例えば、ＤＮＡ含有試料を有する複数のサンプルを同時に分析し、塩基配列を解析する。

キャピラリアレイ１０１は、複数のキャピラリ１０２から構成されている。図１の例では、２本のキャピラリ１０２から構成されているが、１本であってもよく、4本、8本等であってもよい。キャピラリ１０２は、内径が数十〜数百ミクロン、外径が数百ミクロンの石英製の細管であり、強度を向上させるために表面がポリイミドによってコーティングされている。光を伝播させる部分では、フッ素コーティングでもよい。

キャピラリアレイ１０１は、着脱可能な交換部材であり、所定回数の分析によって品質が劣化し、分離能が低下したとき、新品に交換される。また、測定手法を変更し、キャピラリ１０２の長さを変更する必要がある場合には、長さが異なるキャピラリアレイ１０１に交換する。それによって、キャピラリ１０２の長さを任意に調節することができる。

キャピラリアレイ１０１は、励起光が照射される照射部１０３、試料を導入するための試料導入端１０５、及び、複数本のキャピラリを束ねて形成されたキャピラリヘッド１０８を有する。試料導入端１０５は試料導入部１０４によって保持される。

図１Ｂに示すように、キャピラリ１０２の先端には中空電極１０６が挿入され、その先端は中空電極１０６から少し突出している。中空電極１０６は、例えば、ステンレス製パイプである。キャピラリヘッド１０８は泳動媒体充填ユニット１５０に接続されている。

照射光学ユニット１２１は、光源１２３、第１の集光レンズ１２４、照射用フィルタ１２５、及び、第２の集光レンズ１２６を有する。

照射部１０３では、キャピラリ１０２はガラス基板１０７上に支持されている。照射光学ユニット１２１からの励起光はキャピラリ１０２に照射される。光源１２３は、キャピラリアレイ１０１の照射部１０３に照射する励起光１２２を発生する。光源１２３として、通常、レーザ光源が用いられるが、本例では、発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いる。

第１の集光レンズ１２４は光源１２３からの励起光１２２を集光する。照射用フィルタ１２５は、励起光１２２より不要な波長成分をカットする。第２の集光レンズ１２６は、励起光１２２を集光する。第２の集光レンズ１２６によって集光された光はキャピラリ１０２に照射される。本例によると、励起光はキャピラリの軸線に沿って、又は、キャピラリの軸線に対して所定の角度にて傾斜して照射される。この所定の角度は４５度以下である。

キャピラリ１０２内にて電気泳動によって分離された試料成分に励起光１２２を照射する。試料成分に標識された蛍光体は、試料成分毎に異なる波長の光を放出する。この光は、検出光学ユニット１３１によって検出される。

検出光学ユニット１３１は、第１カメラレンズ１３２、マルチバンドパスフィルタ１３３、回折格子１３４、第２カメラレンズ１３５、及び、２次元検出器１３６を有する。検出光学ユニット１３１の詳細に後に図３を参照して説明する。

オートサンプラユニット１４１は、サンプル容器１４３、バッファ容器１４４、洗浄容器１４５、及び、廃液容器１４６を、試料導入部１０４の直下に搬送する。

サンプル容器１４３は、複数の微量試料を保持する容器であり、試料導入時に試料導入部１０４の直下に搬送される。試料は、例えば、４種類のヌクレオシド塩基分子が蛍光標識された、多数の適当な長さ（大きさ）の核酸を含む溶液である。

サンプル容器１４３は、例えば、数１０μＬの試料を保持することができるウェルを２４行１６列備えたサンプルプレートに、樹脂製のシートであるセプタを乗せ、それをホルダとクリップで挟むように構成されている。セプタは、ウェルに対応する位置に通常は密閉状態の貫通孔を有し、ウェル中の試料の蒸発を防止する。試料導入時には貫通孔を介して試料導入端１０５が試料に接触することができる。また、セプタの上面に保護フィルムを貼り付け、試料蒸発を防止することもできる。

バッファ容器１４４は、試料導入端１０５を浸す緩衝液を保持する容器であり、泳動分析時、試料導入部１０４の直下に搬送される。また、装置の待機中にも、泳動分析時と同様に試料導入部１０４の直下に搬送され、試料導入端１０５を緩衝液に浸し、キャピラリ１０２内の泳動媒体の乾燥を防止する。

洗浄容器１４５は、試料導入端１０５を洗浄する洗浄液を保持する容器であり、泳動媒体充填時、予備泳動時、及び試料導入の後に、試料導入部１０４の直下に搬送される。試料導入端１０５を、洗浄容器中の洗浄液に浸すことによって、試料導入端１０５を洗浄し、コンタミネーションを回避することができる。

廃液容器１４６は、使用済の泳動媒体を保持する容器であり、泳動媒体充填時に試料導入部１０４の直下に搬送される。泳動媒体充填時に、試料導入端１０５から排出される使用済の泳動媒体を受け入れる。

泳動媒体充填ユニット１５０は、ポリマ充填ブロック１５１、シリンジ１５２、チューブ１５３、電磁弁１５４、及び、陽極バッファ容器１１２を有し、分析開始前に新しい泳動媒体をキャピラリ１０２内に自動的に充填する。

ポリマ充填ブロック１５１は、ポリマ流路１５５を有する。ポリマ流路１５５は、泳動媒体によって満たされたシリンジ１５２と、電磁弁１５４を備えたチューブ１５３に連通している。チューブ１５３の他端は、陽極バッファ容器１１２に保持された緩衝液に浸されている。キャピラリヘッド１０８は、耐圧気密を維持しながらポリマ充填ブロック１５１に装着される。

電源ユニット１１０は、１５ｋＶ前後の高電圧を発生する高圧電源１１１を含む。高圧電源１１１の負極は中空電極１０６に接続され、正極は電流計１１４を介して接地されている。尚、陽極電極１１３の一端は陽極バッファ容器１１２内の緩衝液に浸けられており、他端は接地されている。

泳動媒体充填ユニット１５０を用いてキャピラリ１０２内に泳動媒体を充填する方法を簡単に説明する。試料導入部１０４の直下に廃液容器１４６を配置し、電磁弁１５４を閉じ、シリンジ１５２のプランジャを押す。それによって、シリンジ１５２内の泳動媒体が、ポリマ流路１５５を経由して、キャピラリヘッド１０８からキャピラリ１０２内に流入する。キャピラリ１０２内の使用済泳動媒体は、試料導入端１０５から排出され、廃液容器１４６にて受け入れられる。

キャピラリ１０２内に試料を導入する方法を簡単に説明する。キャピラリ１０２、ポリマ流路１５５及びチューブ１５３の内部を泳動媒体で満たす。試料導入部１０４の直下にサンプル容器１４３を配置し、サンプル容器１４３のウェルに保持された試料に試料導入端１０５を浸し、電磁弁１５４を開く。これによって、高圧電源１１１の正極と負極の間に、中空電極１０６、サンプル容器１４３中の試料、キャピラリ１０２内の泳動路、ポリマ充填ブロック１５１のポリマ流路１５５、チューブ１５３、陽極バッファ容器１１２内の緩衝液、及び、陽極電極１１３からなる通電路が形成される。そして、中空電極１０６を負電位、陽極電極１１３を正電位として、この通電路にパルス電圧を印加する。これによって、ウェル内に存在する負に帯電する試料成分、例えばＤＮＡが、試料導入端１０５から泳動路に導入される。尚、試料の導入方法は、電気泳動に限定されず、圧力や分注によって試料を泳動路に導入してもよい。

泳動分析時は、試料導入部１０４の直下にバッファ容器１４４を配置し、バッファ容器１４４に保持された緩衝液に試料導入端１０５を浸す。これによって、高圧電源１１１の正極と負極の間に、中空電極１０６、バッファ容器１４４中の緩衝液、キャピラリ１０２内の泳動路、ポリマ充填ブロック１５１のポリマ流路１５５、チューブ１５３、陽極バッファ容器１１２内の緩衝液、及び、陽極電極１１３からなる通電路が形成される。中空電極１０６を負電位、陽極電極１１３を正電位として、この通電路に、１５ｋＶ前後の高電圧を印加する。これによって、照射部１０３から試料導入部１０４の方向に電界が生じ、泳動路に導入された負に帯電する試料成分が、照射部１０３の方向に電気泳動する。

温度制御ユニット１６１は、試料成分の泳動速度に影響を与える泳動路の温度を制御する。本例の温度制御ユニットは、図示しない恒温槽内にキャピラリ１０２を収容する。そして、ペルチェ等の温度制御機構によって一定温度に保たれた空気を、ファン等の送風機構によって恒温槽内を循環させ、キャピラリ１０２を所定温度に保持する。

上述のように、本例のキャピラリ電気泳動装置の検出光学ユニット１３１には、マルチバンドパスフィルタ１３３が設けられている。マルチバンドパスフィルタ１３３を設けることによって、２次元検出器１３６によって得られる蛍光スペクトルが、キャピラリ１０２の位置ずれ又は傾斜の影響を受けることがない。こうして本例では、キャピラリ交換時にキャピラリ１０２の位置ずれ又は傾斜が生じても、新たな波長校正データの取得は不要となる。

図２を参照して、照射部１０３を詳細に説明する。図２Ａに示すように、キャピラリヘッド１０８に近い位置にて、ガラス基板１０７が設けられている。図２Ｂに示すように、複数のキャピラリ１０２は、ガラス基板１０７上に配列されている。各キャピラリ１０２は、ガラス基板１０７上にて、互いにある程度平行に、且つ、ガラス基板に対して実質的に平行に配列されている。ある程度とは、数度の傾斜があってもよいことを意味し、実質的にとは、精度誤差に収まる程度であることを意味する。また、ガラス基板１０７は、ある程度の平面精度を有する基板であればよい。

照射光学ユニット１２１からの励起光は、キャピラリ１０２の軸方向に沿って、又は、キャピラリ１０２の軸方向に対して所定の角度にて傾斜した方向に沿って照射される。照射部１０３では、キャピラリ１０２のポリイミド皮膜は除去されている。従って、励起光は、複数のキャピラリ１０２の外面を全反射してキャピラリ１０２内をそれぞれ伝播し、各キャピラリ１０２内の試料を同時に励起する。キャピラリ１０２内を伝播する励起光によって、キャピラリ１０２内の試料は、数ｍｍから数十ｍｍの範囲にて、蛍光を発生する。こうして本例では、線状の発光部位を形成するため、励起光源として、発光ダイオード（LED）を用いることができる。

キャピラリ１０２内の試料から発生した蛍光は、図１に示したように、キャピラリ１０２の軸方向に対して垂直な方向に沿って配置された検出光学ユニット１３１によって検出される。

図３を参照して検出光学ユニット１３１を説明する。図３Ａに示すように、検出光学ユニット１３１は、第１カメラレンズ１３２、マルチバンドパスフィルタ１３３、回折格子１３４、第２カメラレンズ１３５、及び、２次元検出器１３６を含む。本例では、波長分散方法として、回折格子１３４を用いる。キャピラリ１０２の発光部位から放出された蛍光は、第１カメラレンズ１３２によって、平行光束になる。この平行光束は、マルチバンドパスフィルタ１３３に導かれる。マルチバンドパスフィルタ１３３は、非連続な波長透過特性を有する。マルチバンドパスフィルタ１３３の波長透過特性及び機能は後に図４〜図７を参照して説明する。マルチバンドパスフィルタ１３３を透過した蛍光は、回折格子１３４によって波長分散され、第２カメラレンズ１３５によって、２次元検出器１３６上に結像される。２次元検出器１３６は、例えば、ＣＣＤカメラである。２次元検出器１３６からの画像信号は、コンピュータによって処理され、試料の分析がなされる。

図３Ｂは、２次元検出器１３６によって得られた画像を示す。本例では、２本のキャピラリに対応して２つの画像が得られる。この画像の横軸は波長分散方向、縦軸はキャピラリの軸方向である。

尚、回折格子１３４の代わりに、プリズムを適宜組み合わせた波長分散手段を用いてもよい。２次元検出器１３６は、ＣＣＤカメラの代わりに、１次元検出器、フォトマル、フォトダイオード等、及び、光学機構を適宜組み合わせて構成したものであってもよい。

図４はマルチバンドパスフィルタ１３３の波長透過特性を示す。本例のマルチバンドパスフィルタ１３３は、所定の長波長端より長い波長の光と所定の短波長端より短い波長の光を遮断する。短波長端と長波長端の間に、６個の非連続的な透過領域５１と、この６個の透過領域の間に、５個の非連続的な遮断領域５２を有する。透過領域では、光の透過率は略１００％であるが、遮断領域５２では、光の透過率は５％以下である。遮断領域５２における光の透過率は小さければ小さいほど良い。

図５を参照してマルチバンドパスフィルタ１３３の機能を説明する。図５Ａは、キャピラリが基準位置にあるときの基準蛍光スペクトルを示す。基準位置とは、波長校正データ取得時におけるキャピラリの位置である。ここでは、４色の蛍光色素、E2、E6、E10、E16を用いる。４色の蛍光色素からの蛍光は回折格子１３４によって波長分散され連続スペクトルとなる。実際の分析では、これらの基準蛍光スペクトルを用いる。こうして、ＤＮＡサンプルの検出光から4色の蛍光スペクトルを分離し、４種類のDNAを正確に同定することができる。

図５Ｂは、マルチバンドパスフィルタ１３３を透過した４色の蛍光色素のスペクトルを示す。図４のマルチバンドパスフィルタ１３３の波長透過特性と比較すると判るように、透過領域５１以外の領域では、蛍光スペクトルは削除されている。

図６を参照して、キャピラリの交換による位置ずれが生じたとき、２次元検出器１３６の画像上のキャピラリの像の変化を説明する。２次元検出器１３６に結像された蛍光スペクトルの像の位置は、キャピラリ１０２と２次元検出器１３６の相対的な位置によって決まる。２次元検出器１３６は固定されているものとする。キャピラリの交換によってキャピラリ１０２の位置が変わると、２次元検出器１３６の画像上の蛍光スペクトル像の形状は変化しないが、その位置は、波長分散方向又はキャピラリ軸方向に平行移動する。これは、本例のようにマルチバンドパスフィルタ１３３を用いている場合でも同様である。

図６Ａは基準位置における２本のキャピラリ１０２とキャピラリの像を示す。基準位置は、波長校正データ取得時におけるキャピラリの位置であり、キャピラリ１０２は、位置ずれ、傾斜がない。

図６Ｂは、キャピラリの交換によって、一方のキャピラリ１０２の位置が、基準位置より、波長分散方向にずれた場合を示す。キャピラリの交換によってキャピラリ１０２の位置が変わると、２次元検出器１３６の画像上の蛍光スペクトル像の形状は変化しないが、その位置は、波長分散方向に平行移動する。

図６Ｃは、キャピラリの交換によって、一方のキャピラリ１０２が、基準位置より、キャピラリ軸に対して傾斜した場合を示す。キャピラリ１０２がキャピラリ軸に対して傾斜した場合は、キャピラリ１０２が複数の短い部分からなると考え、各部分が順に波長分散方向にずれた場合を想定すればよい。

図７を参照してマルチバンドパスフィルタ１３３を使用することによりキャピラリの交換毎の波長校正データの取得が不要である理由を説明する。図７Ａ、図７Ｂ及び図７Ｃは、マルチバンドパスフィルタ１３３を使用しないで通常の検出フィルタを用いた従来の場合である。図７Ａは、２次元検出器１３６によって検出された波長領域を示す。検出フィルタは、分析に使用する全ての波長領域の蛍光を透過させる。従って、２次元検出器１３６によって全ての波長領域が検出される。

図７Ｂは、２次元検出器１３６によって検出された基準蛍光スペクトルを示す。通常、波長校正には、蛍光スペクトルのピークを含む所定の波長領域の信号を積算した値を使用する。例えば、２次元検出器１３６の撮像領域を波長方向に６つの領域に分割する。蛍光スペクトルのピークが存在する領域において、蛍光スペクトル信号を積算する。例えば、全ての領域において蛍光スペクトル信号を積算し、積算値が最大となる領域に蛍光スペクトルのピークがあると判定してよい。本例では、左から２番目の領域に蛍光スペクトルのピークがある。従って、左から２番目の領域における蛍光スペクトル信号の積算値を波長校正に用いる。１つの撮像領域は、２次元検出器１３６の画素の数ピクセルに相当する。

図７Ｃは、キャピラリ交換後の、ある場合の２次元検出器１３６によって検出された分析試料の蛍光スペクトルを示す。キャピラリの交換によってキャピラリの位置が基準位置よりずれている。従って、図７Ｂの基準蛍光スペクトルと図７Ｃの蛍光スペクトルを比較すると、図７Ｃの蛍光スペクトルは、波長分散方向にずれている。２次元検出器１３６の撮像領域に設定した６つの領域は、図７Ｂの場合と同一である。本例では、左から２番目の領域に蛍光スペクトルのピークがある。しかしながら、図７Ｃの蛍光スペクトルの位置はずれているから、左から２番目の領域における蛍光スペクトル信号の積算値は、図７Ｂの左から２番目の領域の蛍光スペクトル信号の積算値とは異なる。従って、左から２番目の領域の蛍光スペクトル信号の積算値を波長校正に使用すると、擬似信号が発生し、誤差が生じる。従って、この場合には、キャピラリ交換の際に波長校正データを取得する必要がある。

図７Ｄ、図７Ｅ及び図７Ｆは、マルチバンドパスフィルタ１３３を使用する本発明の場合である。図７Ｄは、２次元検出器１３６によって検出された波長領域を示す。マルチバンドパスフィルタ１３３は、透過領域の蛍光のみを透過させる。従って、２次元検出器１３６によって不連続な波長領域が検出される。即ち、マルチバンドパスフィルタ１３３の遮断領域に対応する波長領域において検出信号は無い。

図７Ｅは、２次元検出器１３６によって検出された基準蛍光スペクトルを示す。２次元検出器１３６の撮像領域は、波長方向に６つの領域に分割されている。６つの領域は、図４に示したマルチバンドパスフィルタ１３３の波長透過領域の周期に対応している。本例では、左から２番目の領域に蛍光スペクトルのピークがある。従って、左から２番目の領域における蛍光スペクトル信号の積算値を波長校正に用いる。

図７Ｆは、キャピラリ交換後の、ある場合の２次元検出器１３６によって検出された分析試料の蛍光スペクトルを示す。２次元検出器１３６の撮像領域に設定した６つの領域は、図７Ｅの場合と同一である。本例では、左から２番目の領域に蛍光スペクトルのピークがある。

キャピラリの交換によってキャピラリの位置が基準位置よりずれている。従って、図７Ｅの基準蛍光スペクトルと図７Ｆの蛍光スペクトルを比較すると、図７Ｆの蛍光スペクトルは、波長分散方向にずれている。しかしながら、各領域における蛍光スペクトル信号の両端は、マルチバンドパスフィルタ１３３の遮断領域に対応して削除されている。

図７Ｆの左から２番目の領域の蛍光スペクトル信号の積算値は、図７Ｅの左から２番目の領域の蛍光スペクトル信号の積算値と略同一である。従って、図７Ｆの左から２番目の領域の蛍光スペクトル信号の積算値を波長校正に使用しても、擬似信号は発生しない。従って、誤差は生じない。こうして本例では、キャピラリ交換の際に波長校正データを取得する必要がない。

マルチバンドパスフィルタ１３３の遮断領域の波長範囲が大きければ大きいほど、キャピラリ１０２の位置ずれ裕度を確保することができる。

図８は、キャピラリ位置ずれによって生じる蛍光スペクトルのずれ量と擬似信号との間の関係を示す。蛍光色素としてｄR１１０を用いた。横軸はキャピラリの位置ずれ量（ｎｍ）、縦軸は擬似信号の割合（％）である。図８Ａは、マルチバンドパスフィルタ１３３を使用しないで通常の検出フィルタを用いた従来の場合である。擬似信号を１％以下に抑えるためには、２次元検出器の撮像領域においてずれ量は波長０．２ｎｍ以下にする必要がある。これは、キャピラリの取り付け位置の誤差が１μｍ以下でなければならないことを意味する。この仕様を満たす構造の実現は困難であるため、キャピラリの取り付け毎に波長校正データの取得が必要である。

図８Ｂは、マルチバンドパスフィルタ１３３を使用する本発明の場合である。擬似信号を１％以下に抑えるためには、２次元検出器の撮像領域においてずれ量は波長５．０ｎｍ以下にすればよい。これは、キャピラリの取り付け位置の誤差が数十μｍ以下でよいことを意味する。この仕様を満たす構造の実現は可能であるため、キャピラリの交換毎の波長校正データの取得は不要である。

図９を参照して、本発明によるキャピラリ電気泳動装置を使用した分析方法の操作の詳細手順を説明する。ステップ２００にて、波長校正データの取得を行う。波長校正データの取得は通常出荷前に製造工場にて行う。例えば4色の蛍光色素によって標識された波長校正済みのDNAサンプルを電気泳動させ、基準蛍光スペクトルを取得する。こうして波長校正データとして基準蛍光スペクトルが得られると、以下のように電気泳動分析を行う。

電気泳動分析の基本的手順は、ステップ２０１の分析前準備、ステップ２０２の分析開始、ステップ２０３の泳動媒体充填、ステップ２０４の予備泳動、ステップ２０５の試料導入、ステップ２０６の電気泳動、及び、ステップ２０７の分析を含み、ユーザ側にて行う。

オペレータは、ステップ２０１の分析前準備を行う。キャピラリ１０２が劣化している場合、又は、キャピラリ１０２の長さを変更する必要がある場合、キャピラリアレイ１０１を交換する。ここではキャピラリの交換を行ったものとする。先ず、バッファ容器１４４と陽極バッファ容器１１２に、緩衝液を満たす。緩衝液は、例えば、電気泳動用として市販されている電解質液である。次に、サンプル容器１４３のウェル内に、分析対象である試料を分注する。試料は、例えば、DNAのPCR産物である。また、洗浄容器１４５に洗浄液を分注する。洗浄液は、例えば、純水である。また、シリンジ１５２内に、泳動媒体を注入する。泳動媒体は、例えば、電気泳動用として市販されているポリアクリルアミド系分離ゲルである。

オペレータは、ステップ２０２の分析開始を行う。ステップ２０３の泳動媒体充填では、キャピラリ１０２内に新しい泳動媒体を充填し、泳動路を形成する。先ず、オートサンプラユニットによって、廃液容器１４６を試料導入部１０４の直下に搬送する。次に、シリンジ１５２を駆動して、キャピラリ１０２内に新しい泳動媒体を充填し、使用済の泳動媒体を廃液容器１４６に廃棄する。最後に、オートサンプラユニットによって、洗浄容器１４５を試料導入部１０４の直下に搬送し、洗浄液に試料導入端１０５を浸し、泳動媒体によって汚れた試料導入端１０５を洗浄する。

ステップ２０４の予備泳動では、泳動媒体に所定の電圧を印加し、泳動媒体を電気泳動に適した状態にする。先ず、オートサンプラユニットによって、バッファ容器１４４を試料導入部１０４の直下に搬送し、緩衝液に試料導入端１０５を浸し、通電路を形成する。次に、電源ユニットによって、泳動媒体に数〜数十キロボルト程度の電圧を数〜数十分間印加する。それによって、泳動媒体は電気泳動に適した状態となる。最後に、オートサンプラユニットによって、洗浄容器１４５を試料導入部１０４の直下に搬送し、洗浄液に試料導入端１０５を浸し、緩衝液によって汚れた試料導入端１０５を洗浄液によって洗浄する。

ステップ２０５の試料導入では、試料成分を泳動路に導入する。先ず、オートサンプラユニットによって、サンプル容器１４３を試料導入部１０４の直下に搬送し、サンプル容器１４３のウェル内に保持された試料に試料導入端１０５を浸す。これによって、通電路が形成され、泳動路に試料成分を導入することができる状態となる。電源ユニットによって、パルス電圧を通電路に印加し、泳動路に試料成分を導入する。最後に、オートサンプラユニットによって、洗浄容器１４５を試料導入部１０４の直下に搬送し、洗浄液に試料導入端１０５を浸し、試料によって汚れた試料導入端１０５を洗浄液によって洗浄する。

ステップ２０６の電気泳動では、電気泳動によって、試料中に含まれる各試料成分を分離分析する。まず、オートサンプラユニットによって、バッファ容器１４４を試料導入部１０４の直下に搬送し、緩衝液に試料導入端１０５を浸し、通電路を形成する。次に、電源ユニットによって、通電路に１５ｋＶ前後の高電圧を印加し、泳動路に電界を発生させる。

発生した電界によって、泳動路内の試料成分は、各試料成分の性質に依存した速度で照射部１０３へ移動する。つまり、試料成分は、その移動速度の差によって分離される。そして、照射部１０３に到達した試料成分から順番に検出される。例えば、試料が、塩基長の異なるＤＮＡを多数含む場合は、その塩基長によって移動速度に差が生じ、塩基長の短いＤＮＡから順に照射部１０３に到達する。照射部１０３にて励起光を照射する。蛍光標識された各ＤＮＡの末端塩基配列は照射部１０３に到達した順に蛍光を発生する。

２次元検出器１３６によって蛍光スペクトルが検出される。蛍光スペクトルの検出は、図７を参照して説明した。

ステップ２０７の分析では、ステップ２００にて得られた波長校正データを利用して、電気泳動によって得られたデータを正規化し、目的とする波長分散データを得る。波長校正データが不正確であると、擬似信号が生じ、分析結果の信頼性が低下する。

予定していたデータを取り終えたら処理を終了する。電圧印加を停止し、泳動分析を終了する。以上が、一連の分析手順である。更に分析を実施したい場合には、ステップ２０３の泳動媒体充填から分析手順を繰り返す。他の分析を実施する場合には、ステップ２０１の分析前準備から分析手順を繰り返す。いずれにしても、ステップ２００の波長校正データの取得は繰り返さない。

図１０はマルチバンドパスフィルタの他の例を示す。図１０Ａに示すように、本例のマルチバンドパスフィルタは、３個のノッチフィルタ１００１と１個のバンドパスフィルタ１００２を含む。図１０Ｂは、第１のノッチフィルタ１００１の波長透過特性を示し、図１０Ｃは第２のノッチフィルタ１００１の波長透過特性を示す。図示のように、所定の狭い波長領域における光の透過率は５％以下であるが、それ以外の波長領域では、光を完全に遮断する。但し、狭い波長領域は、ノッチフィルタ毎に異なり、順にずれている。第３のノッチフィルタ１００１では、狭い波長特性は更にずれている。

図１０Ｄは、バンドパスフィルタ１００２の波長透過特性を示す。バンドパスフィルタは、所定の波長領域の光を透過させるが、それ以外の光は完全に遮断する。

図１０Ｅは、本例のマルチバンドパスフィルタの波長特性を示す。この波長特性は、３個のノッチフィルタ１００１の波長透過特性と１個のバンドパスフィルタ１００２の波長透過特性を重ね合わせたものである。本例によると図４に示したマルチバンドパスフィルタの波長透過特性と同様な波長透過特性が得られる。ここでは３個のノッチフィルタ１００１を用いたが、４個以上のノッチフィルタを用いてもよい。

図１１を参照して、本発明のキャピラリ電気泳動装置の他の例を説明する。本例のキャピラリ電気泳動装置では、キャピラリ１０２の発光部位からの蛍光は、キャピラリの末端から放出される。検出光学ユニット１３１は、キャピラリの末端からの蛍光を検出することができるように、キャピラリの軸線方向に沿って配置されている。

光源１２３からの励起光１２２は、キャピラリ１０２を照射し、検出光は、キャピラリの末端から放出される。この検出光は、泳動媒体充填ユニット１５０の検出窓１８１を経由して検出光学ユニット１３１に達する。

本例の検出光学ユニット１３１は、第１カメラレンズ１３２、マルチバンドパスフィルタ１３３、プリズム１８２、第２カメラレンズ１３５、及び、２次元検出器１３６を含む。本例では、波長分散素子として、回折格子の代わりにプリズム１８２を用いる。キャピラリ１０２の末端から放出された蛍光は、第１カメラレンズ１３２によって、平行光束になる。この平行光束は、マルチバンドパスフィルタ１３３に導かれる。マルチバンドパスフィルタ１３３は、複数の非連続な波長透過特性を有する。マルチバンドパスフィルタ１３３を透過した蛍光は、プリズム１８２によって波長分散され、第２カメラレンズ１３５によって、２次元検出器１３６上に結像される。２次元検出器１３６は、例えば、ＣＣＤカメラである。２次元検出器１３６からの画像信号は、コンピュータによって処理され、試料の分析がなされる。

本例のキャピラリ電気泳動装置においても、キャピラリの交換によってキャピラリの位置がずれることがある。しかしながら、上述のようにマルチバンドパスフィルタ１３３を用いるため、２次元検出器によって検出した蛍光スペクトル信号は、キャピラリの位置ずれ又は傾斜の影響を受けない。従って、キャピラリの位置ずれ又は傾斜に起因した擬似信号の発生を防止することができる。

本発明は、キャピラリ電気泳動装置に限定されず、電気泳動路を２枚の板で形成するスラブ式電気泳動装置をはじめ、樹脂もしくはガラス板上に流路を有するマイクロチップ型電気泳動装置にも適用可能である。また、試料の蛍光を回折格子もしくはプリズムなどで波長を分散させる分光光度計にも適用可能である。

以上、本発明の例を説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者に理解される。各実施例を適宜組み合わせることも、本発明の範囲である。

本発明によるキャピラリ電気泳動装置の概略を示す斜視図である。 本発明によるキャピラリ電気泳動装置のキャピラリの照射部の概略を示す斜視図である。 本発明によるキャピラリ電気泳動装置の検出光学ユニットの概略を示す斜視図である。 本発明によるキャピラリ電気泳動装置のマルチバンドパスフィルタの波長透過特性を示す図である。 本発明によるキャピラリ電気泳動装置における基準蛍光スペクトルとマルチバンドパスフィルタを透過した蛍光スペクトルを示す図である。 本発明によるキャピラリ電気泳動装置において、キャピラリの位置ずれに起因した蛍光スペクトルのシフトを説明するための説明図である。 本発明によるキャピラリ電気泳動装置において、マルチバンドパスフィルタを使用することによりキャピラリの交換毎の波長校正データの取得が不要である理由を説明するための説明図である。 本発明によるキャピラリ電気泳動装置において、キャピラリ位置ずれによって生じる蛍光スペクトルのずれ量と擬似信号との間の関係を示す図である。 本発明によるキャピラリ電気泳動装置を使用した分析方法の操作の手順を説明するための説明図である。 本発明によるキャピラリ電気泳動装置のマルチバンドパスフィルタの構成例を示す図である。 本発明によるキャピラリ電気泳動装置の他の例の概略を示す斜視図である。

符号の説明

101…キャピラリアレイ、102…キャピラリ、103…照射部、104…試料導入部、105…試料導入端、106…中空電極、107…ガラス基板、108…キャピラリヘッド、110…電源ユニット、111…高圧電源、112…陽極バッファ容器、113…陽極電極、114…電流計、121…照射光学ユニット、122…励起光、123…光源、124…集光レンズ、125…照明用フィルタ、126…集光レンズ、131…検出光学ユニット、132…第１カメラレンズ、133…マルチバンドパスフィルタ、134…回折格子、135…第２カメラレンズ、136…２次元検出器、141…オートサンプラユニット、143…サンプル容器、144…バッファ容器、145…洗浄容器、146…廃液容器、150…泳動媒体充填ユニット、151…ポリマ充填ブロック、152…シリンジ、153…チューブ、154…電磁弁、155…ポリマ流路、161…温度制御ユニット、181…検出窓、182…プリズム、1001…ノッチフィルタ、1002…バンドパスフィルタ

Claims (6)

1. 交換可能なキャピラリと；
   該キャピラリに励起光を照射する照射光学系と；
   上記キャピラリからの蛍光を分光させる波長分散素子と、該波長分散素子から得られる蛍光スペクトル像を検出する２次元検出器と、を有する検出光学系と；
   を有するキャピラリ電気泳動装置において、
   上記検出光学系は、非連続な複数の波長透過領域を有するマルチバンドパスフィルタを有し、上記マルチバンドパスフィルタは複数のノッチフィルタと１つのバンドパスフィルタを含み、
   上記波長分散素子はキャピラリからの蛍光を該マルチバンドパスフィルタを透過させた後に波長分散させることを特徴とするキャピラリ電気泳動装置。
2. 請求項１記載のキャピラリ電気泳動装置において、上記２次元検出器の信号検出領域は、上記マルチバンドパスフィルタの波長透過領域に対応して複数の領域に分割されていることを特徴とするキャピラリ電気泳動装置。
3. 請求項２記載のキャピラリ電気泳動装置において、上記複数の領域のうち試料の蛍光スペクトルのピークを含む領域において上記蛍光スペクトルの信号の波長についての積算値を求めることを特徴とするキャピラリ電気泳動装置。
4. 請求項２記載のキャピラリ電気泳動装置において、上記複数の領域毎に上記蛍光スペクトルの信号の波長についての積算値を求め、該積算値が最大である領域を上記蛍光スペクトルのピークが存在する領域であると判定することを特徴とするキャピラリ電気泳動装置。
5. 請求項１記載のキャピラリ電気泳動装置において、上記照射光学系は上記キャピラリの軸線に沿った方向から又は上記キャピラリの軸線に対して所定の角度傾斜した方向から上記キャピラリに励起光を照射することを特徴とするキャピラリ電気泳動装置。
6. 請求項１記載のキャピラリ電気泳動装置において、上記照射光学系は励起光源として発光ダイオードを有することを特徴とするキャピラリ電気泳動装置。

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