JP4677033B2 - マイタケ抽出物及びこれを含む皮脂産生を促進するための組成物 - Google Patents
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Description
(1)乾燥マイタケを純エタノールにより抽出して得られるマイタケ抽出物;
(2)乾燥マイタケの水分含量が8重量%以下である、(1)記載のマイタケ抽出物;
(3)純エタノールが99.0容量%以上のエタノールを含有する、(1)又は(2)記載のマイタケ抽出物;
(4)(1)〜(3)のいずれか1項記載のマイタケ抽出物を含有する、皮脂産生を促進するための組成物;
(5)化粧料の形態にある、(4)記載の組成物;
(6)医薬の形態にある、(4)記載の組成物。
溶媒には、水、アルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、液体ポリアルキルシロキサンおよびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
湿潤剤には、グリセリン、プロピレングリコール、ペンチレングリコール、ソルビトール、乳酸、尿素、BG(1,3−ブチレングリコール)、ダイズステロールおよびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
抗酸化剤には、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、アスコルビン酸およびその誘導体、トコフェロールおよびその誘導体、システイン、ならびにそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
疎水性軟膏基剤には、パラフィン、植物油、動物脂、合成グリセリド、ろう、ラノリン、液体ポリアルキルシロキサンおよびそれらの混合物などが挙げられるが、これらに限定されることはない。
マイタケの滅菌乾燥粉末(水分含量:6重量%、ホクト(株)製のマイタケ)1000gに純エタノール(水分量:99.5容量%以上)4000gを加え、20℃の温度にて18時間にわたり攪拌しながら抽出した。残渣を遠心分離により除去し、得られた上澄を濾紙により濾過した。得られた濾液からエタノールを蒸発・除去して、マイタケの純エタノール抽出物(収量43.2g、内固形分37.2g及びエタノール6.0g)を得た。
(方法)
1.In vitro実験法
1−1 ハムスター脂腺細胞の培養方法
1−1−1 ハムスター皮脂腺の単離
雄性ゴールデンハムスター(5週齢:日本エスエルシー社より購入)の左右の耳介部を切除し、ペニシリンG(100units/ml)と硫酸ストレプトマイシン(100μg/ml)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco's modified Eagle's medium、DMEM)(インビトロジェン社製)に浸し、1時間以上4℃にて放置した後にリン酸緩衝液(PBS(−))で洗浄した。耳介部周囲の毛を刈り、5x5mm程度に細切し、2.4units/mlディスパーゼ(dispase)溶液中(合同酒精社製)で4℃、13.5時間静置した。ディスパーゼ処理後、ピンセットにて耳介部より表皮を剥離し、皮脂腺を含む真皮をSebocyte growth(SG)medium[6%(v/v)ウシ胎仔血清((株)ニチレイバイオサイエンス社製)/2%(v/v)ヒト血清(ICNバイオメディカル社製)/0.68mM L−グルタミン/100units/ml ペニシリンG/100μg/ml硫酸ストレプトマイシン/DMEM/F−12]に浸し、実体顕微鏡下で皮脂腺を単離した。
マウス3T3細胞(理研細胞開発銀行より購入)をマイトマイシンCで4時間処理し、1x103cells/cm2の細胞数で60mm培養皿に播種し、ハムスター脂腺細胞を培養するための支持細胞層とした。単離した皮脂腺はピンセットを用いて支持細胞層上に接着させ、37℃、5% CO2条件下でほぼ密集(confluent)になるまで培養した。細胞培養にはSG mediumにEGF(10ng/ml)を添加した培地を使用し、2日ごとに培地交換を行った。
支持細胞層のマウス3T3細胞を0.02%(w/v)EDTA/PBS(−)溶液を用いて除去した後、組織片より増殖・伸展したハムスター脂線細胞を0.25%(w/v)トリプシン/0.02%(w/v)EDTA/PBS(−)溶液を用いて培養皿より剥離し、継代培養した。なお、全ての実験において細胞は継代数3までのものを使用した。
ハムスター脂腺細胞を35mmの培養皿に播種した翌日から、インスリン(10nM)(シグマアルドリッチ社製)の存在または非存在下において実施例1で得られたマイタケ抽出物(100,200および400μg/ml)またはアガリクスエキス(協和発酵グループ、協和のアガリクス)100,200および400μg/ml)を含む培養液(6%ウシ胎仔血清/2%ヒト血清/0.68mM L−グルタミン/100units/ml ペニシリンG/100μg/ml 硫酸ストレプトマイシン/DMEM/F−12)にて細胞を処理した。3日後に同処理を行い、さらに3日間培養した。なお、全ての実験において細胞は継代数3までのものを使用した。
0.3% Oil red O(シグマアルドリッチ社製)を含むイソプロパノール溶液と精製水を3:2(v:v)で混合した後、さらに密閉式超音波細胞破砕装置により15分間、超音波処理を行った。10分間室温に放置後、ろ過した上清をOil red O染色液として使用した。細胞をPBS(−)で洗浄後、固定液[4% パラホルムアルデヒド/PBS(−)]を加えて室温で1時間固定した。固定後、細胞を蒸留水で洗浄し、Oil red O染色液を加えて37℃で15分間染色した。染色後、細胞を流水にて洗浄し、光学顕微鏡により脂肪滴形成を観察した。また、光学顕微鏡下においてOil red O染色した細胞をデジタル画像化し、画像解析・定量化ソフトであるLumina Vision Ver2.2.2(三谷商事社製)を用いて各処理につき異なる3ヶ所において細胞内に蓄積された皮脂量を定量し、その量を示す画像イメージ単位(ユニット)として表した。
1)試料調製法
薬物処理した細胞をPBS(−)で2回洗浄し、0.25% トリプシン/0.02%EDTA/PBS(−)溶液を用いて回収した。得られた細胞懸濁液を氷冷下、超音波処理を行うことで細胞を破砕した。
皮脂の主成分であるトリアシルグリセロール(TGs)量をリキテック TGII(ロッシュ・ダイアグノスティックス社製)を用いて測定した。すなわち、上記1)の細胞粉砕試料に処理液1[1.65IU/ml グリセロールキナーゼ/6IU/ml グリセロール−3−ホスフェートオキダーゼ/カタラーゼ/2.95μmol/ml ジナトリウムアデノシン−5’−トリホスフェート、三水和物(ATP)/0.65μmol/ml ナトリウム N−(3,5−ジメトキシフェニル)−N’−スクシニルエチレンジアミン(DOSE)]を添加し、37℃で10分間反応させて遊離型グリセロールを除去した。直ちに処理液2[0.55IU/ml リポプロテインリパーゼ/ペルオキシダーゼ/0.65μmol/ml 4−アミノアンチピリン(4−AA)]を添加し、さらに37℃で10分間反応させた。反応終了後、590nmにおける吸光度を測定した。TGs量は、同様に実施したトリオレイン標準液(0.6mg/ml)の吸光度より算出した。なお、細胞粉砕試料中のDNA量を3,5−ジアミノ安息香酸二塩酸(DABA)法を用いて測定し、1μg DNA当りのTGs量として算出した。
3週齢の雄性ゴールデンハムスター(日本エスエルシー社より購入)各処理当りn=1)の耳介部(左耳)にマイタケ抽出物またはアガリクスエキスを、1、2および4重量%を含む95%エタノール/5%グリセロールを50μlずつ1日1回塗布した。また、対照群には溶媒のみを同様に塗布した(右耳)。2週間後、ハムスター耳介部の凍結切片を作成し、Oil red O染色を行った。光学顕微鏡下においてOil red O染色した耳介部の組織切片をデジタル画像化し、画像解析・定量化ソフト Lumina Visionを用いてハムスター皮脂腺の皮脂量を定量し、その量を示す画像イメージ単位(ユニット)として表した。
Fisherの多変量分散分析法により各処理間の有意差検定を実施した。
1.In vitro実験
(1)インスリン未処理群のハムスター脂腺細胞(低分化型)において、マイタケ抽出物は細胞内脂肪滴の形成を促進した(図1B,400μg/ml;図Aと対比)。また、このマイタケ抽出物による脂肪滴の形成促進作用は濃度依存的であることが判明した(図2)。一方、アガリクスエキスは弱いながら細胞内脂肪滴の形成を促進したが(図1C,400μg/ml;図1Aとの対比および図2)、その促進作用はマイタケ抽出物に比べ有意に弱いことが判明した(p<0.001)。
(2)インスリン処理したハムスター脂腺細胞(分化型)においても同様に、マイタケ抽出物は細胞内脂肪滴の形成を濃度依存的に促進した(図1E;図1Dとの対比および図2)。一方、同条件下においてアガリクスエキスも細胞内脂肪滴の形成を促進したが(図1F;図1Dとの対比および図2)、その促進作用はマイタケ抽出物に比べ有意に弱いことが判明した(p<0.001)。
(3)インスリン未処理群のハムスター脂腺細胞において、マイタケ抽出物は濃度依存的に細胞内TGs量を増加した(図3)。しかし、同条件下においてアガリクスエキスは細胞内TGs量に影響を及ぼさなかった(図3)。一方、インスリン処理したハムスター脂腺細胞において、マイタケ抽出物は同様に濃度依存的に細胞内TGs量を増加した(図3)。また、アガリクスエキスも細胞内TGs量を増加させたが、400μg/mlの濃度ではマイタケ抽出物と比べてもその量は有意に低値であった(図3)。
(1)マイタケ抽出物およびアガリクスエキス処理前後におけるハムスターの体重変化は以下の通りであった。
マイタケ抽出物はin vivoおよびin vitroにおいて皮脂産生促進作用を有する。また、この促進効果はアガリクスと比べても強力であることが判明した。すなわち、マイタケ抽出物は強力な皮脂産生促進物質であり、乾燥肌の手入れに留まらず、乾皮症など皮脂腺機能低下に起因した皮膚疾患の病態軽減にも有効であると期待される。
マイタケの純エタノール抽出物のトリアシルグリセロール(TGs)特異的産生促進作用
(方法)
1.ハムスター脂腺細胞の培養
ハムスター脂腺細胞を2.35x104cells/cm2の細胞数で35mm培養皿に播種し、翌日から実施例1で得られたマイタケ抽出物(100、200、400μg/ml)単独またはマイタケ抽出物とインスリン(10nM)の両方を含む脂腺細胞用培養液(SBCM)[DMEM/F−12/6%(v/v)牛胎仔血清/2%(v/v)ヒト血清/0.68mM L−グルタミン/ペニシリンG(100units/ml)/硫酸ストレプトマイシン(100μg/ml)]にて3日間培養を行った。3日後に新たに調製した同様のマイタケ抽出物単独またはマイタケ抽出物とインスリンの両方を含むSBCMにてさらに3日間培養した後に細胞を回収した。また、マイタケ抽出物およびインスリンを含まない培養液で培養した細胞をコントロールとした。
マイタケ抽出物存在下または非存在下で培養した脂腺細胞をPBS(−)で2回洗浄し、0.25%(w/v)トリプシン/0.02%(w/v)EDTA/PBS(−)溶液1.5mlを用いて回収した。得られた細胞懸濁液を氷冷下、密閉式超音波細胞破砕装置(Bioruptor、コスモ・バイオ社製)を用いて超音波処理(200W、6秒)を5分間行ない、皮脂組成分析用の試料とした。得られた試料を脱脂済スピッツ管に移し、クロロホルム:メタノール(2:1;v:v)溶液を加えて脂質を抽出した。抽出した脂質の定量および組成分析は薄層クロマトグラフィー自動検出装置(イアトロスキャン、ダイアトロン社製)を用いて実施した。すなわち、抽出した脂質を棒状薄層(クロマトロッド)にスポットし、クロロホルム:メタノール(35:35)溶液にて1次展開(1.5cm)、ベンゼン:クロロホルム:酢酸(50:20:0.7)溶液にて2次展開(8cm)し、さらにヘキサン:ベンゼン(35:35)溶液にて3次展開(11cm)を行った。次にロッド上で分離された脂質成分を水素炎イオン化検出器により室温条件下、30秒/ロッドの速度にて直接検出した。
なお、各脂質の組成は既知量の標準脂質として用いたトリパルミチン(図7のTGに対応する)、パルミチン酸(図7のFFAに対応する)、コレステロール(図7のChoに対応する)、パルミチン酸コレステロール(図7のChoEに対応する)(ドーサン・セルダリ・リサーチ社製)およびパルミチルパルミチン酸(図7のWaxEに対応する)(ヌ・チェック・プレップ社製)に対応するクロマトグラフから解析した。また、各脂質量は内部標準品として用いた酢酸コレステロール(2μg)(ドーサン・セルダリ・リサーチ社製)のピーク面積からそれぞれ算出した。
皮脂組成分析の結果より、マイタケ抽出物(100、200、400μg/ml)は皮脂成分中のトリアシルグリセロール(TG)を優先的かつ濃度依存的に増加させることが判明した(図7)。また、400μg/mlのマイタケ抽出物処理においてコレステロールエステル(ChoE)および遊離脂肪酸(FFA)量も増加したが、それらの量は全皮脂量中の2.2および5.3%であり、81.5%を占めるTGに比べ極めて低値であることが明らかとなった。
以下の配合でマイタケ抽出物を含有する化粧用クリームを作製した。
成分名 配合量(重量%)
マイタケ抽出物 2.0
オリーブ油 10.0
トリ(カプリル/カプリン酸)グリセリル 10.0
トコフェロール 1.0
精製水 77.0
合計 100.0
以下の配合でマイタケ抽出物を含有する医薬用クリームを作製した。
成分名 配合量(重量%)
マイタケ抽出物 10.0
オリーブ油 10.0
トリ(カプリル/カプリン酸)グリセリル 10.0
トコフェロール 1.0
精製水 69.0
合計 100.0
マイタケ抽出物の乾皮症に対するヒトでの効果
実施例2に示す、マイタケ抽出物を2重量%含有するクリームを用いて、乾皮症に対する効果の検討を行った。
被験対象: 老人保健施設「グッドウェル」内の乾皮症、落屑を有する患者(76〜97歳)12名(男性6名女性6名)
実施期間: 2006年12月〜2007年1月
方法: マイタケ抽出物含有クリームを被験者の皮膚に塗布し、落屑(皮膚が角質状となって脱落する症状を意味する)を基準として3段階(3:重症、2:中症、1:軽症)で皮膚状態を評価した。塗布部位は右下腕、左下腕、右下腿、左下腿で評価判定は部位ごとに行った。
以下に、塗布開始から1週間の被験者の皮膚状態の診断評価度(3:重症 2:中症 1:軽症)を示す。なお、診断評価度:0は、完治を示す。
診察日 右下腕 左下腕 右下腿 左下腿
2006/12/4 2 1 2 2
2006/12/6 1 1 1 1
2006/12/8 1 1 1 1
2006/12/11 1 0 1 1
診察日 右下腕 左下腕 右下腿 左下腿
2007/1/17 1 1 2 1
2007/1/19 1 1 1 1
2007/1/22 0 0 1 1
2007/1/24 0 0 1 1
診察日 右下腕 左下腕 右下腿 左下腿
2006/12/6 2 2 2 3
2006/12/11 2 2 1 2
2006/12/13 1 0 0 0
診察日 右下腕 左下腕 右下腿 左下腿
2006/12/15 1 1 1 1
2006/12/18 0 1 0 0
2006/12/20 0 1 0 0
2006/12/22 0 0 0 0
診察日 右下腕 左下腕 右下腿 左下腿
2007/1/5 2 2 3 3
2007/1/8 1 1 2 2
2007/1/10 0 0 2 2
2007/1/12 0 0 2 2
診察日 右下腕 左下腕 右下腿 左下腿
2006/12/18 0 1 3 2
2006/12/20 0 0 2 1
2006/12/25 0 0 1 1
診察日 右下腕 左下腕 右下腿 左下腿
2006/12/18 1 1 1 1
2006/12/20 0 0 1 1
2006/12/22 0 0 1 1
2006/12/25 0 0 0 1
診察日 右下腕 左下腕 右下腿 左下腿
2006/12/29 2 3 3 3
2006/12/30 1 2 2 2
2007/1/4 1 0 2 1
診察日 右下腕 左下腕 右下腿 左下腿
2007/1/5 0 0 2 3
2007/1/8 0 0 2 1
2007/1/10 0 0 2 1
2007/1/12 0 0 1 1
診察日 右下腕 左下腕 右下腿 左下腿
2006/12/20 1 1 2 2
2006/12/22 1 0 2 2
2006/12/25 1 0 1 1
2006/12/26 1 0 1 1
2006/12/27 1 0 1 1
診察日 右下腕 左下腕 右下腿 左下腿
2006/12/4 1 1 2 1
2006/12/6 0 1 1 1
2006/12/8 0 1 1 1
2006/12/11 0 1 0 0
診察日 右下腕 左下腕 右下腿 左下腿
2006/12/18 0 1 2 1
2006/12/20 0 0 1 1
2006/12/22 0 0 1 1
2006/12/25 0 0 1 0
Claims (3)
- 水分含量が6重量%以下である乾燥マイタケの子実体100重量部を、98.0容量%以上のエタノール400〜1000重量部により抽出することを含む皮脂産生促進剤の製造方法。
- 水分含量が6重量%以下である乾燥マイタケの子実体100重量部を、98.0容量%以上のエタノール400〜1000重量部により抽出することを含む、皮脂産生促進のための化粧料の製造方法。
- 水分含量が6重量%以下である乾燥マイタケの子実体100重量部を、98.0容量%以上のエタノール400〜1000重量部により抽出することを含む、皮脂産生促進のための医薬の製造方法。
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