JP4520361B2 - プローブビーズの品質検査方法 - Google Patents

Description

本発明は、軟質樹脂などの上に形成したキャピラリにプローブビーズを配列したキャピラリビーズアレイに係り、特にバッチ法により製作した多数のプローブビーズに対して迅速かつ非破壊的な品質検査を行うための、プローブビーズの品質検査方法に関する。

軟質樹脂などの上に形成したキャピラリに、生体関連分子である核酸やタンパク質などのターゲット分子を検出するためのプローブ分子を固定したプローブビーズを配列したキャピラリビーズアレイに関する従来技術として、下記特許文献１が挙げられる。特許文献１では、ＤＮＡをはじめとするプローブ分子を固体表面に固定化したプローブチップを実用化するためには、少量多品種を安価に作れることや、プローブ分子の固定の均一度が良いことなどが重要であると述べている。特許文献１では、これらの課題を解決するため、「プローブの固体表面への固定と、プローブの配列を別工程にした。これにより、均一に固体表面にＤＮＡプローブを製作することができる」との記載がある。具体的には、「微粒子をプローブを固定する固体として用い、それらを並べることで目的にあった区画サイズのプローブアレイを作製する」ものである。従って、特許文献１に開示された方法では、微粒子の表面にＤＮＡをはじめとするプローブ分子を共有結合により固定化したプローブビーズを製作する必要がある。

特許文献１に開示されているキャピラリビーズアレイにおいて、プローブビーズを製作するための一般的な方法は、反応容器に固体基材であるビーズ、プローブ分子ならびにビーズ表面に対してプローブ分子を固定する化学反応に関与するすべての試薬を一度に仕込んで反応させ、プローブの固定反応が平衡または一定の反応率に到達した後、反応生成物であるプローブビーズを回収するという、いわゆるバッチ法である。バッチ法によるプローブビーズの製作では、反応容器内で多数のビーズを一度に反応させるため、均質なプローブビーズを製作しやすいという非常に大きな利点がある。しかしながら、バッチ法であっても、均一なプローブビーズが製作されるということが完全に保証される訳ではない。実際にバッチ法で均一なプローブビーズが製作されたか否かを確認するための唯一の方法は、製作されたすべてのプローブビーズの品質を１個ずつ検査することである。特許文献１には、キャピラリビーズアレイにおいて、バッチ法により製作された多数のプローブビーズの品質を検査するための方法については記載されていない。

特開２０００−３４６８４２号公報

上述の通り、キャピラリビーズアレイでは、バッチ法により、ビーズの表面にプローブ分子が固定されたプローブビーズを一度に大量に製作する。製作したプローブビーズをキャピラリに配列して、キャピラリビーズアレイを製作する。キャピラリビーズアレイを用いた生化学実験の再現性を高くするためには、すべてのキャピラリビーズアレイが均質であること、すなわち、キャピラリに配列されているすべてのプローブビーズが均質かつ高品質であることが必要である。

キャピラリビーズアレイにおける高品質な良品プローブビーズとは、
（１）ビーズの真球度ならびに球径が基準値を満たす、
（２）ビーズの表面にプローブが均一に固定されており、かつプローブの固定量が基準値を満たす、
という２つの条件を満たすプローブビーズである。

バッチ法は、均一かつ高品質な良品プローブビーズを製作するための非常に良い方法であるが、良品プローブビーズが製作されることを完全に保証する訳ではない。プローブビーズの品質を確認するための唯一の方法は、多数のプローブビーズの品質を１個ずつ検査することである。キャピラリビーズアレイに供するために製造されるプローブビーズの数は膨大である。また、良品プローブビーズはキャピラリに配列され、キャピラリビーズアレイを用いた生化学実験に供される。

従って、ユーザに、均質かつ高品質のキャピラリビーズアレイを提供するためには、バッチ法により製作された多数のプローブビーズの品質を１個ずつ、迅速かつ非破壊的に検査することができる方法が必要であった。上記特許文献１では、プローブビーズの品質検査方法に関しては記述されていない。そこで、プローブビーズの有効な品質検査法の開発が求められていた。

本発明者は、鋭意研究した結果、バッチ法により製作したプローブビーズを、キャピラリに配列する前、またはキャピラリに配列した後で、分光分析法により１個ずつ非破壊的に分析し、プローブビーズの品質を検査することにより上記課題が解決されることを見出し、本発明に到達した。

本発明は、プローブビーズを１個ずつ非破壊的に品質検査するために、分光分析法を使用することを特徴とする。キャピラリビーズアレイにおけるプローブビーズの必要条件は、ビーズの表面に所定量のプローブが固定されているということである。従って、プローブビーズの品質を検査するためには、ビーズの表面に固定されているプローブの量を計測すればよい。これは、固体基材表面に共有結合した分子の定量分析の一種とみなすことができる。プローブビーズの品質検査の検査条件を以下に挙げる。
（１）検査対象は、マイクロメートルサイズの微小なビーズである。
（２）プローブの立体構造や生理活性を保持するため、プローブビーズを緩衝液に懸濁させた状態で検査する必要がある。
（３）プローブビーズの表面の一部だけではなく、プローブビーズの表面全体を検査する必要がある。
（４）多数のビーズすべてを迅速に計測する必要がある。
（５）検査の結果、良品プローブビーズと判定されたものはそのままキャピラリに配列されるため、検査は非破壊的である必要がある。

固体基材表面に吸着または化学結合した分子を定量分析するための分光分析法として、エリプソメトリー、反射赤外分光法、Ｘ線光電子分光法、原子間力顕微鏡、質量分析法などを挙げることができる。しかしながら、いずれの方法も、上述したプローブビーズの品質検査の検査条件をすべて満たすことは困難である。例えば、反射赤外分光法は、プローブビーズが懸濁している緩衝液の主成分である水分子自体が強い吸収を持つため、緩衝液中に懸濁したプローブビーズを分析することは困難である。

そこで本発明では、上述したプローブビーズの品質検査の検査条件をすべて満たす方法として、蛍光分光法とラマン分光法を活用する。

蛍光分光法は、緩衝液中に懸濁しているプローブビーズを非破壊的に分析することが可能な方法である。プローブが蛍光性を有する場合は、プローブビーズ表面に固定されたプローブ自身の蛍光を分析することにより、プローブビーズの品質を検査する。また、プローブが蛍光性を有しない場合は、プローブと特異的に結合することができ、かつ蛍光性を有する標識分子をプローブに結合し、標識分子の蛍光を分析することにより、間接的にプローブを分析し、プローブビーズの品質を検査する。この場合、プローブビーズの品質検査が終了した後、プローブに結合している標識分子を解離させ、プローブビーズを品質検査前の状態に復元することもできる。従って、プローブビーズを非破壊的に検査することができる。

一方、ラマン分光法も、固体基材表面にある生体関連分子の種類や量を測定することができる分光分析法である。特にラマン分光法は、分子の振動に関する情報を得ることができるため、固体基材表面にある生体関連分子に関して、分子構造を含めた詳細な議論を行うことが可能である。また、ラマン分光法は水分子由来のラマン吸収が弱いため、水溶液中の生体関連分子の分析に適している。ラマン分光法の特長を以下に挙げる。
（１）極微量の試料を分析することができる。一般的に液体ならば数μｌ（マイクロリットル）程度、固体ならば数ｎｇ（ナノグラム）程度の試料を分析することができる。
（２）物質の状態（気体、液体、固体）や形状（結晶状、繊維状、薄膜状など）に拠らず、非破壊的に分析することができる。
（３）水溶液や懸濁液を分析することができる。
（４）ガラスなどの透明な容器中の試料を直接分析することができる。

本発明によれば、キャピラリビーズアレイにおいて、バッチ法により製作した多数のプローブビーズを、分光分析法を用いて１個ずつ、迅速かつ非破壊的に検査することができる。プローブビーズのビーズとプローブの結合状況（プローブビーズの品質）を、キャピラリに配列する前に検査すれば、予め不良品プローブビーズを取り除くことにより、キャピラリに良品プローブビーズだけを配列することができる。また。プローブビーズの品質をキャピラリに配列した後に検査すれば、不良品プローブビーズが配列されているキャピラリビーズアレイを不良品として取り除くことができる。従って、本発明により、キャピラリビーズアレイの不良品の発生を検知し、これを除去することにより、ユーザに高品質のキャピラリビーズアレイだけを供給することができる。すなわち、キャピラリビーズアレイを用いた生化学実験の再現性を大幅に向上させ、ユーザにとっての付加価値を大幅に向上させることができる。

本発明において、ビーズはプラスチックやガラス等から成り、粒径が数μｍから数十μｍの球状物である。具体例としてポリスチレンビーズ、ポリプロピレンビーズ、磁気ビーズなどがある。また、プローブビーズは該ビーズの表面に、核酸やタンパク質などのプローブを共有結合により固定したものである。

図１に、プローブが蛍光性を有する場合に、蛍光分析法によりプローブビーズの品質を検査する方法の概念図を示す。プローブビーズ１０１全体に励起光１０２を照射し、プローブビーズ１０１の表面にあるすべてのプローブ１０３を光励起する。励起光１０２の波長は、プローブ１０３の種類に応じて適切な波長を選択する。光励起されたプローブ１０３は蛍光を発する。プローブ１０３が発する蛍光スペクトルの形状や蛍光強度により、プローブビーズ１０１の表面に存在するプローブ１０３の種類ならびに量を検査する。検査の結果、所望の種類のプローブ１０３が所定量だけ固定されていることが確認されたプローブビーズ１０１を良品プローブビーズと判定し、また、所望の種類のプローブ１０３が所定量だけ固定されていることが確認されなかったプローブビーズ１０１を不良品プローブビーズと判定する。

図２に、プローブが蛍光性を有しない場合に、該プローブに特異的に結合し、かつ蛍光性を有する標識分子を用いて、蛍光分析法によりプローブビーズの品質を検査する方法の概念図を示す。プローブビーズ２０１の表面に固定されたプローブ２０２に対して、プローブ２０２に特異的・定量的に結合し、かつ蛍光性を有する標識分子２０３を結合させる。そして、プローブビーズ２０１の表面に固定されたプローブ２０２に結合した標識分子２０３の蛍光分析を行うことにより、プローブビーズ２０１の品質、すなわち、プローブビーズ２０１の表面に存在するプローブ２０２の種類ならびに量を間接的に検査する。また、プローブビーズ２０１の品質検査が終了した後、標識分子２０３が不要ならば、プローブビーズ２０１の表面に固定されたプローブ２０２に結合した標識分子２０３を、該プローブ２０２から解離させる。

プローブ２０２に結合した標識分子２０３を解離させる方法は、
（１）溶媒のｐＨやイオン強度などの物性を変化させて、プローブ２０２と標識分子２０３の相互作用を弱めて解離させる、
（２）酵素などの試薬を用いて、プローブ２０２と標識分子２０３の化学結合を切断する、
などがある。

プローブビーズ２０１の品質を検査した後、プローブビーズ２０１の表面に固定されたプローブ２０２に結合した標識分子２０３を解離することにより、プローブビーズ２０１を品質検査する前の状態に復元する。従って、蛍光分析法により、プローブビーズの品質を非破壊的に検査することができる。

図３に、ラマン分光法によりプローブビーズの品質を検査する方法の概念図を示す。プローブビーズ３０１全体に励起光３０２を照射し、プローブビーズ３０１の表面にあるすべてのプローブ３０３を光励起する。励起光３０２の波長は、プローブ３０３の種類に応じて適切な波長を選択する。光励起されたプローブ３０３はラマン散乱光を発する。プローブ３０３が発するラマン散乱スペクトルの形状や散乱光強度により、プローブビーズ３０１の品質、すなわちプローブビーズ３０１の表面に存在するプローブ３０３の種類ならびに量を検査する。品質検査の結果、所望の種類のプローブ３０３が所定量だけ固定されていることが確認されたプローブビーズ３０１を良品プローブビーズと判定し、また、所望の種類のプローブ３０３が所定量だけ固定されていることが確認できなかったプローブビーズ３０１を不良品プローブビーズと判定する。

図４に、バッチ法により製作した多数のプローブビーズを、一次元または二次元状に整列させ、分光分析法により１個ずつ品質検査するための方法を示す概念図を示す。バッチ法により製作したプローブビーズ４０１を、容器４０２の底面に一次元または二次元状に配列する。プローブビーズ４０１に励起光４０３を照射し、分光分析法により、容器４０２の底面に配列されたプローブビーズ４０１の品質を検査する。このとき、励起光４０３を一次元または二次元状に掃引しながらプローブビーズ４０１の品質を１個ずつ検査してもよい、また励起光４０３の照射範囲を広くして、幾つかのプローブビーズ４０１の品質を一括して検査してもよい。

品質検査の結果、すべてのプローブビーズ４０１の中から、不良品と判定された不良品プローブビーズを取り除き、良品と判定された良品プローブビーズだけを残す。すべてのプローブビーズ４０１の中から不良品プローブビーズだけを選択的に取り除く方法として、微小なエアピンセットを用いる方法や、レーザー光を用いた光ピンセットを用いる方法などがある。すべてのプローブビーズ４０１の中から、不良品プローブビーズを取り除き、容器４０２の中に残った良品プローブビーズのみをキャピラリビーズアレイに供する。

図５に、バッチ法にて製作したプローブビーズを、フローサイトメーターの原理に基づいて、分光分析法により１個ずつ品質検査し、良品プローブビーズと不良品プローブビーズを選別するための方法を概念図で示す。プローブビーズ５０１をフローサイトメーターに導入し、フローサイトメーターのフローセル５０２内にプローブビーズ５０１を１個ずつフローする。プローブビーズ５０１に励起光５０３を照射し、分光分析法によりプローブビーズ５０１の品質を検査する。フローセル５０２の下流に検出器５０４を設置し、プローブビーズ５０１の品質検査の結果を電気的信号として検出する。フローセル５０２の下流は分岐しており、バルブ５０５により流路を切り替えられる。プローブビーズ５０１の品質検査の結果、プローブビーズ５０１が良品プローブビーズと判定された場合は、検出器により電気的信号を検出し、バルブ５０５を切替え、良品プローブビーズ５０６を良品プローブビーズ回収容器５０７に流し入れて回収する。また、プローブビーズ５０１の品質検査の結果、プローブビーズ５０１が不良品プローブビーズ５０８と判定された場合は、検出器５０４により電気的信号を検出し、バルブ５０５を切り替えて、不良品プローブビーズ５０８を不良品プローブビーズ回収容器５０９に流し入れて回収する。良品プローブビーズ回収容器５０７に回収された良品プローブビーズ５０６だけを、キャピラリビーズアレイのプローブビーズとして供する。

図６に、バッチ法により製作したプローブビーズを、軟質樹脂などに形成されたキャピラリに配列した後に、キャピラリの外側から、キャピラリの内側に配列されたプローブビーズを分光分析することにより、プローブビーズの品質検査を行う方法の概念図を示す。キャピラリ６０１にプローブビーズ６０２を配列する。キャピラリ６０１の外側から、キャピラリ６０１の内側に配列されたプローブビーズ６０２に対して励起光６０３を照射し、分光分析法によりプローブビーズ６０２の品質を検査する。キャピラリビーズアレイにおいて、キャピラリ内に不良品プローブビーズがあってはならない。従って、キャピラリビーズアレイの品質検査により、不良品プローブビーズが１個でも発見された場合、該不良品プローブビーズを含むキャピラリビーズアレイを不良品と見なし、ユーザには提供しないものとする。

キャピラリビーズアレイでは、キャピラリ中に配列されたプローブビーズと、実験試料中に含まれるターゲット分子の化学反応を検出する。キャピラリビーズアレイを用いた生化学実験の再現性を高めるためには、キャピラリ中に配列されたプローブビーズが均質かつ高品質である必要がある。従って、バッチ法により製作されたすべてのプローブビーズの品質を検査し、所定の品質基準を満たす良品プローブビーズだけを、キャピラリビーズアレイに供することが必要である。

本発明によれば、バッチ法により製作した多数のプローブビーズを、分光分析法を用いて１個ずつ、迅速かつ非破壊的に検査することができる。プローブビーズの品質をキャピラリに配列する前に検査すれば、予め不良品プローブビーズを取り除くことにより、キャピラリに良品プローブビーズだけを配列することができる。また、プローブビーズの品質をキャピラリに配列した後に検査すれば、不良品プローブビーズが配列されているキャピラリビーズアレイを不良品として取り除くことができる。

従って、本発明によって、不良なキャピラリビーズアレイの発生を検知しこれを取り除くことにより、ユーザに均質かつ高品質のキャピラリビーズアレイだけを供給することができる。従って、キャピラリビーズアレイを用いた生化学実験の再現性を大幅に向上させ、ユーザにとっての付加価値を大幅に向上させることができる。

プローブが蛍光性を有する場合に、蛍光分析法によりプローブビーズの品質を検査する方法の概念図である。 プローブが蛍光性を有しない場合に、該プローブに特異的に結合し、かつ蛍光性を有する標識分子を用いて、蛍光分析法によりプローブビーズの品質を検査する方法の概念図である。 ラマン分光法によりプローブビーズの品質を検査する方法の概念図である。 バッチ法により製作した多数のプローブビーズを、一次元または二次元状に整列し、分光分析法により１個ずつ品質検査するための方法を示す概念図である。 バッチ法にて製作したプローブビーズを、フローサイトメーターの原理に基づいて、分光分析法により１個ずつ品質検査し、良品プローブビーズと不良品プローブビーズを選別するための方法を示す概念図である。 バッチ法により製作したプローブビーズを、軟質樹脂などに形成されたキャピラリに配列した後に、キャピラリの外側から、キャピラリの内側に配列されたプローブビーズを分光分析することにより、プローブビーズの品質検査を行う方法の概念図を示す。

符号の説明

１０１・・・プローブビーズ、１０２・・・励起光、１０３・・・プローブ、
２０１・・・プローブビーズ、２０２・・・プローブ、２０３・・・標識分子、
３０１・・・プローブビーズ、３０２・・・励起光、３０３・・・プローブ、
４０１・・・プローブビーズ、４０２・・・容器、４０３・・・励起光、
５０１・・・プローブビーズ、５０２・・・フローサイトメーターのフローセル、５０３・・・励起光、５０４・・・検出器、５０５・・・バルブ、５０６・・・良品プローブビーズ、５０７・・・良品プローブビーズ回収容器、５０８・・・不良品プローブビーズ、５０９・・・不良品プローブビーズ回収容器、
６０１・・・キャピラリ、６０２・・・プローブビーズ、６０３・・・励起光。

Claims (11)

1. ターゲット分子を捕捉する性質を持つプローブ分子を表面に結合したプローブビーズを、基板の上に形成したキャピラリに一次元状又は二次元状に多数個配列したキャピラリビーズアレイにおける個々のプローブビーズの品質検査方法であって、
   バッチ法により一括して製作した多数のプローブビーズのビーズとプローブの結合状況を、分光分析法を用いて１個ずつ検査することを特徴とする、キャピラリビーズアレイのプローブビーズの品質検査方法。
2. 前記バッチ法により一括して製作した多数のプローブビーズのビーズとプローブの結合状況を、前記キャピラリ内に配列する前に、キャピラリ外で分光分析法により検査することを特徴とする請求項１に記載のキャピラリビーズアレイのプローブビーズの品質検査方法。
3. キャピラリ外で多数のプローブビーズのビーズとプローブの結合状況を検査し、所定の品質基準を満たす際に良品プローブビーズと判定し、所定の品質基準を満たさない際に不良品プローブビーズと判定し、これら良品プローブビーズと不良品プローブビーズを分離することを特徴とする請求項２に記載のキャピラリビーズアレイのプローブビーズの品質検査方法。
4. 前記バッチ法により一括して製作したプローブビーズを、所定の順番で前記キャピラリ内に配列した後、キャピラリ内にあるプローブビーズを分光分析することにより、プローブビーズの品質を検査することを特徴とする請求項１に記載のキャピラリビーズアレイのプローブビーズの品質検査方法。
5. 前記分光分析法が、蛍光分光法であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のキャピラリビーズアレイのプローブビーズの品質検査方法。
6. ビーズ表面に固定されたプローブ自身が蛍光性を有する場合、該プローブを直接蛍光分析することによりプローブビーズの品質を検査することを特徴とする請求項５に記載のキャピラリビーズアレイのプローブビーズの品質検査方法。
7. ビーズ表面に固定されたプローブが蛍光性を有しない場合、該プローブに対して、該プローブに特異的・定量的に結合する性質を持ち、かつ蛍光性を有する標識分子を結合し、該標識分子の蛍光分析により間接的にプローブの分析を行い、プローブビーズの品質を検査することを特徴とする請求項５に記載のキャピラリビーズアレイのプローブビーズの品質検査方法。
8. 表面に固定されたプローブに対して標識分子が結合されたプローブビーズの品質検査が終了した後、該プローブビーズの表面に固定された該プローブに結合した該標識分子を該プローブから解離・除去し、該品質検査を実施する前の状態まで該プローブビーズを復元することを特徴とする請求項７に記載のキャピラリビーズアレイのプローブビーズの品質検査方法。
9. 前記分光分析法が、ラマン分光法であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のキャピラリビーズアレイのプローブビーズの品質検査方法。
10. 前記分光分析法を液相で行なうことを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載のキャピラリビーズアレイのプローブビーズの品質検査方法。
11. バッチ法にて製作したプローブビーズを、分光分析法により１個ずつ品質検査し、良品プローブビーズと不良品プローブビーズを選別する工程をフローサイトメーターの原理に基づいて行なうことを特徴とする請求項１０に記載のキャピラリビーズアレイのプローブビーズの品質検査方法。

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