JP4499141B2

JP4499141B2 - 修飾核酸合成用アミダイド及び修飾核酸合成方法

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Publication number: JP4499141B2
Application number: JP2007230730A
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Inventors: 健志藤原
Original assignee: Fujitsu Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 2007-09-05
Filing date: 2007-09-05
Publication date: 2010-07-07
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Description

本発明は、水酸基含有修飾核酸の製造に好適な修飾核酸合成用アミダイド、及びそれを用いた修飾核酸合成方法に関する。

人間の全遺伝子情報が既に明らかになった。その結果、研究者や科学者の興味の中心は遺伝子産物である蛋白質の解析に移行している。蛋白質の解析においては、対象となる個々の蛋白質に対してアフィニティー（結合性）を有する分子を得ることによって、初めて実質的な解析が可能になるといっても過言ではない。しかしながら、細胞中には非常に多種類の蛋白質が存在し、そのアミノ酸配列や構造が未知であるものも多い。
ある特定の蛋白質に対してアフィニティーを有する分子を得る最も一般的な手法は、動物の免疫系を用い、アフィニティー抗体を作製する方法である。しかし、この方法では動物を用いるため、多量の蛋白質や多大な工程、費用が必要となり、しかもある特定の物質に対するアフィニティー抗体は生成されないという欠点があった。
このような問題を解決するために、生物に依存しないアプタマー法（別名：ＳＥＬＥＸ法）も提案されているが、この方法で得られる分子は、特定の蛋白質に対しては強い相互作用を示すものの、必ずしも全ての蛋白質に応用可能なものではなかった。そこで本発明者らは、前記アプタマー法を改良し、修飾核酸を用いた修飾アプタマー法を提案している（特許文献１参照）。

一方で、核酸の固相合成は、２０年以上も前から行われており、自動合成装置もその時点で販売されている。核酸の固相合成は、例えば、ヌクレオシドを結合させた固相担体（例えば、ＣＰＧ）に核酸原料（アミダイド）を縮合反応させていくことにより行われるが、この縮合反応の際には、前記アミダイドのリン酸部分と他方の水酸基のみを縮合反応に関与させ、それ以外の反応性基は縮合反応に関与させずに行う必要がある。したがって、使用するアミダイドの塩基が有する環外アミノ基等には、保護基を導入して縮合反応への関与を防止し、全縮合反応が終了した後、保護基を脱離する（脱保護する）ことが必要となる。従来から、塩基の環外アミノ基に導入する保護基としては、ベンゾイル基、イソブチリル基等が用いられており、これらの保護基の脱保護には、濃アンモニア水を、５５℃で８〜１５時間、作用させる方法が一般的であった。

しかしながら、前記したような、蛋白質に対してアフィニティー（結合性）を有する修飾核酸の製造においては、このような従来の脱保護条件では、保護基の脱保護とともに、修飾核酸における修飾部分（蛋白質との結合性を有する置換基部分）までもが脱離してしまい、安定して修飾核酸を製造することができないという問題があった。したがって、このような修飾核酸を製造するにあたっては、保護基の脱保護とともに、蛋白質との結合性を有する置換基部分までもが外れてしまわないよう、より緩やかな条件下で保護基の脱保護が可能なアミダイドを用いることが求められている。
例えば、従来の技術において、嵩高い塩基、シアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）で脱保護可能な核酸アミダイドなどが報告されているが（非特許文献１〜２）、これらの核酸合成用アミダイドは、非プロトン性溶媒であるアセトニトリル中で不安定であり（非特許文献５）、実用には向かないものであった。また、ピリジン中、０．５ＭＤＢＵの条件下、１６時間で脱保護可能である核酸合成用アミダイドも報告されている（非特許文献３〜４）が、高濃度のＤＢＵ、長時間による脱保護のため、核酸塩基へのアルキル化が起こるという問題があった。また、メタノール中、Ｋ_２ＣＯ_３を用いた条件下で脱保護可能である核酸合成用アミダイドも報告されている（非特許文献５〜６）が、プロトン性溶媒であるメタノール中で塩基のＫ_２ＣＯ_３を使用するため、エステル等が分解するという問題があった。

したがって、緩やかな条件下での脱保護が可能であり、これにより、蛋白質等の標的物質の解析に好適な修飾核酸を安定して製造することのできる、優れた修飾核酸合成用アミダイド、及び前記修飾核酸合成用アミダイドを用いた修飾核酸合成方法の開発が、未だ望まれているのが現状である。

国際公開第２００３／０７８６２３号パンフレットＡｃｔａＣｈｅｍ，Ｓｃａｎｄ．，Ｂ３７，２６３（１９８３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５４，１６５７（１９８９）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４０，４１７１（１９９２）Ｎｕｃｌｅｏｄｉｅｄ＆Ｎｕｃｌｒｏｔｉｄｅｓ１３，２０５９（１９９４）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ４６，６７２９（１９９０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅｒｃｈ２１，３４９３（１９９３）

本発明は、従来における前記問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、緩やかな条件下での脱保護が可能であり、これにより、水酸基含有修飾核酸を安定して製造することのできる、優れた修飾核酸合成用アミダイド、及び前記修飾核酸合成用アミダイドを用いた修飾核酸合成方法を提供することを目的とする。

前記課題を解決するための手段としては、後述の付記に記載の通りである。即ち、
本発明の修飾核酸合成用アミダイドは、後述する一般式（Ｉ）に示される通り、少なくとも塩基、置換基、及び、前記置換基における水酸基を保護するための保護基を有し、前記保護基が脱保護された際に、前記置換基中に水酸基が発現することを特徴とする。前記修飾核酸合成用アミダイドは、緩やかな条件下での脱保護が可能であるため、置換基を脱離させることなしに、保護基を容易に脱保護することができる。また、保護基が脱保護された際には、脱保護前には置換基中に発現していなかった水酸基が、置換基中に発現する（置換基表面に露出される）こととなる。

本発明の修飾核酸合成方法は、本発明の前記修飾核酸合成用アミダイドを用いることを特徴とする。前記修飾核酸合成方法は、本発明の前記修飾核酸合成用アミダイドを用いるため、置換基を脱離させない程度の、緩やかな条件下で保護基の脱保護を行うことができる。また、保護基の脱保護により、脱保護前には置換基中に発現していなかった水酸基が、置換基中に発現する（置換基表面に露出される）。したがって、前記修飾核酸合成方法によれば、所望の水酸基含有修飾核酸を、安定して製造することができる。

本発明の修飾核酸は、本発明の前記修飾核酸合成方法により得られることを特徴とする。前記修飾核酸は、本発明の前記修飾核酸合成方法により得られるものであるため、水酸基が発現した（水酸基が表面に露出した）置換基を有する、水酸基含有修飾核酸である。前記修飾核酸は、水酸基を介して、蛋白質等の標的物質との結合が可能であり、したがって、前記修飾核酸は、例えば、蛋白質等の標的物質の解析に、好適に利用可能である。

本発明によると、従来における前記問題を解決することができ、緩やかな条件下での脱保護が可能であり、これにより、水酸基含有修飾核酸を安定して製造することのできる、優れた修飾核酸合成用アミダイド、及び前記修飾核酸合成用アミダイドを用いた修飾核酸合成方法を提供することができる。

（修飾核酸合成用アミダイド）
本発明の修飾核酸合成用アミダイドは、下記一般式（Ｉ）で表されるものであり、保護基が非プロトン性溶媒中で脱保護可能であり、かつ、保護基が脱保護された際に、置換基中に水酸基が発現することを特徴とする。

ただし、前記一般式（Ｉ）中、Ｘは塩基を表し、Ｙは置換基を表し、Ｚは前記置換基における水酸基を保護するための保護基を表し、Ｑは水素原子、水酸基、又は保護基で保護された水酸基を表す。

＜置換基における水酸基を保護するための保護基＞
前記一般式（Ｉ）中、Ｚで表される保護基は、置換基における水酸基を保護するための保護基であり、その種類としては、非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護基、即ち、緩やかな条件下で脱保護可能な保護基であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ここで、前記「緩やかな条件下で脱保護可能」とは、例えば、前記保護基が、非プロトン性溶媒中で、嵩高い塩基により脱保護可能であることをいう。前記非プロトン性溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アセトニトリル、ジクロロメタン、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、Ｎ−メチルピロリドンなどが挙げられる。また、前記嵩高い塩基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ[５．４．０]−７−ウンデセン）、ＤＢＮ（１，５−ジアザビシクロ[４．３．０]−５−ノネン）、テトラメチルグアニジンなどが挙げられる。これらの中でも、前記保護基は、前記アセトニトリル中、前記ＤＢＵにより脱保護されることが好ましい。また、この場合、前記保護基の脱保護に要するＤＢＵ濃度としては、０．５Ｍ以下が好ましく、０．１Ｍ以下がより好ましく、０．０１Ｍ以下が特に好ましい。また、前記保護基の脱保護に要する時間としては、８時間以内が好ましく、１時間以内がより好ましく、１５分間以内が特に好ましい。

中でも、前記保護基としては、３−アミノプロピオン酸誘導体、４−アミノ酪酸誘導体、５−アミノ吉草酸誘導体、アミノメチル炭酸誘導体、アミノエチル炭酸誘導体、アミノ安息香酸誘導体、アミノメチル安息香酸誘導体、アミノエチル安息香酸誘導体、アミノフェニル酢酸誘導体、アミノメチルフェニル酢酸誘導体、アミノフェニルプロピオン酸誘導体、及び、アミノメチルフェニルプロピロン酸誘導体のいずれかからなる保護基が好ましい。
このような保護基の具体例としては、例えば、下記一般式（ＩＩ）〜（ＩＩＩ）に示すような保護基などが挙げられる。

＜置換基＞
前記一般式（Ｉ）中、Ｙで表される置換基としては、前記保護基が脱保護された際に、前記置換基中に水酸基が発現する（置換基表面に水酸基が露出される）ような構造を有するものであれば、その他の構造においては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記置換基は、天然又は非天然のアミノ酸、金属錯体、蛍光色素、酸化還元色素、スピンラベル体、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、下記式（１）〜（１０）で表される基などの構造を含むことができる。

前記天然又は非天然のアミノ酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、バリン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、アルギニン、グルタミン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、システイン、スレオニン、メチオニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グリシン、セリンなどが挙げられる。
前記金属錯体としては、金属イオンに配位子が配位した化合物であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｒｕビピリジル錯体、フェロセン錯体、ニッケルイミダゾール錯体などが挙げられる。
前記蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、フルオレセイン系列、ローダミン系列、エオシン系列、ＮＢＤ系列等の蛍光色素などが挙げられる。
前記酸化還元色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ロイコアニリン、ロイコアントシアニン等のロイコ色素などが挙げられる。
前記スピンラベル体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、鉄Ｎ−（ジチオカルボキシ）サルコシン（ｓａｒｃｏｓｉｎｅ）、ＴＥＭＰＯ（テトラメチルピペリジン）誘導体などが挙げられる。
前記炭素数１〜１０のアルキル基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ネオペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、オクチル基、ノニル基、デシル基などが挙げられる。
これらは、置換基で更に置換されていてもよい。

＜塩基＞
前記一般式（Ｉ）中、Ｘで表される塩基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）などが挙げられる。また、前記塩基に前記置換基が導入される位置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、アデニン塩基の６位、シトシン塩基の６位、グアニン塩基の２位などが好ましい。ここで、前記置換基は、前記保護基が緩やかな条件下で脱保護される際に、併せて脱離されてしまわないよう、前記塩基に導入されていることが必要である。

＜水素原子、水酸基、又は保護基で保護された水酸基＞
前記一般式（Ｉ）中、Ｑは、水素原子、水酸基、又は保護基で保護された水酸基であり、前記水酸基の保護基としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、以下に示す保護基などが挙げられる。

また、前記水酸基の保護基は、非プロトン性溶媒中で脱保護可能な保護基、即ち、緩やかな条件下で脱保護可能な保護基であることが好ましく、ここで、前記「緩やかな条件下で脱保護可能」とは、前記した置換基における水酸基を保護するための保護基の項目に記載した通りである。

＜具体例＞
前記修飾核酸合成用アミダイドの具体例としては、例えば、下記構造式（１）〜（２）に示すものなどが挙げられるが、前記修飾核酸合成用アミダイドとしては、これらに限定されるものではない。

＜製造＞
前記修飾核酸合成用アミダイドの合成方法としては、特に制限はなく、例えば、後述する実施例に記載の方法等により、合成することができる。

（修飾核酸合成方法）
本発明の修飾核酸合成方法は、本発明の前記修飾核酸合成用アミダイドを用いることを特徴とする。
前記修飾核酸合成方法は、前記修飾核酸合成用アミダイドを用いて修飾核酸を合成する方法であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジエステル法、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスファイト法等に、固相法を組み合わせた従来の核酸合成方法を利用することができる。また、前記修飾核酸合成方法は、例えば、従来の核酸自動合成装置を用いて行うことができる。

前記修飾核酸合成方法においては、前記修飾核酸合成用アミダイドを、一種単独で使用してもよいし、二種以上を併用してもよい。また、前記修飾核酸合成方法に用いるアミダイド（核酸原料）としては、前記修飾核酸合成用アミダイドのみならず、他のアミダイドを組み合わせて用いてもよい。この場合、前記他のアミダイドとしては、前記したような緩やかな条件下で脱保護可能なアミダイドを用いることが好ましく、このようなアミダイドとしては、例えば、特願２００７−０００５７６号明細書に記載の核酸合成用アミダイドなどを用いることができる。

前記修飾核酸合成方法においては、前記修飾核酸合成用アミダイド（及び、前記他のアミダイド）の縮合反応の後、前記修飾核酸合成用アミダイド（及び、前記他のアミダイド）の保護基の脱保護を行う。前記脱保護の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記したような緩やかな条件下で行われることが好ましく、例えば、非プロトン性溶媒中で、嵩高い塩基により脱保護を行うことが好ましい。前記非プロトン性溶媒、前記嵩高い塩基としては、前記同様である。また、脱保護に要する濃度、時間としても、前記同様である。

前記脱保護は緩やかな条件下で行われるため、前記修飾核酸合成用アミダイドにおける置換基は脱離されない。また、保護基の脱保護により、脱保護前には置換基中に発現していなかった水酸基が、置換基中に発現する（置換基表面に露出される）こととなる。

（修飾核酸）
本発明の修飾核酸は、本発明の前記修飾核酸合成方法により得られることを特徴とする。即ち、前記修飾核酸は、その少なくとも一部に、水酸基が発現した（水酸基が表面に露出した）置換基を有する修飾ヌクレオチド単位を含んでなるものである。
前記修飾核酸を構成するヌクレオチド単位の個数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、１０〜２００個が好ましく、２０〜１００個がより好ましく、３０〜８０個が特に好ましい。なお、前記修飾核酸を構成するヌクレオチド単位のうち、前記修飾核酸合成用アミダイドに由来する修飾ヌクレオチド単位（水酸基が発現した（水酸基が表面に露出した）置換基を有する修飾ヌクレオチド単位）の割合としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記修飾核酸は、ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列のいずれであってもよく、また、前記ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよい。

前記修飾核酸は、水酸基が発現した（水酸基が表面に露出した）置換基を有してなるため、水酸基を介して蛋白質等の標的物質との結合が可能であり、したがって、前記修飾核酸は、例えば、蛋白質等の標的物質の解析に、好適に利用可能である。

以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

（実施例１：修飾核酸合成用アミダイドの合成）
本発明の修飾核酸合成用アミダイドＶ_Ｓｅｒ、Ｖ_Ｔｙｒを以下のようにして合成した。なお、前記修飾核酸合成用アミダイドＶ_Ｓｅｒ、Ｖ_Ｔｙｒは、それぞれ前記した構造式（１）、（２）に対応する修飾核酸合成用アミダイドである。
なお、下記化合物Ｉ及びＩＩＩ_Ａは、それぞれ特願２００７−６９３７８号明細書に示された合成方法に従い合成した。

＜ＩＩの合成＞
Ｉ１３．５８ｇ（４０ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２００ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、ピリジン３．８８ｍＬ（４８ｍｍｏｌ）及び硝酸銀６．７９ｇ（４０ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、塩化ピバロイル４．９３ｍＬ（４０ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１５分間攪拌した。続いて、グリコール酸４．５６ｇ（６０ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（１％酢酸、ジクロロメタン−エタノール１００：０→１９：１）にて精製し、目的物ＩＩ１３．０３ｇ（８２％）を得た。

＜ＩＶ_Ｓｅｒの合成＞
ＩＩＩ_Ａ１０．５８ｇ（１０ｍｍｏｌ）を２０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、トリエチルシラン２．４０ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）及びジアザビシクロウンデセン２．２４ｍＬ（１５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分間攪拌した、反応混合物にトリフロロ酢酸１．２７ｍＬ（１６．５ｍｍｏｌ）、ピリジン１．４５ｍｌ（１８ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン１０ｍＬの混合溶液を加え、反応混合物Ａを得た。
ＩＩ４．９７ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）を脱水トルエンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を３０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミド１．５８ｇ（１３．８ｍｍｏｌ）を加え、氷冷下、ジシクロヘキシルカルボジイミド２．７１ｇ（１３．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を反応混合物Ａに加えた。反応混合物を室温にて１時間攪拌した。続いてメタノール５ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール９７：３→４７：３）にて精製し、目的物ＩＶ_Ｓｅｒ１０．１１ｇ（９５％）を得た。

＜Ｖ_Ｓｅｒの合成＞
ＩＶ_Ｓｅｒ１０．１１ｇ（９．４８ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を３８ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン５７．９ｍｇ（０．４７ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．８７ｍＬ（１１．４ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト２．３３ｍＬ（１０．４ｍｍｏｌ）の９．５ｍＬ塩化メチレン溶液を５分以上かけ滴下した。混合溶液を０℃で１時間攪拌した。続いてメタノール９．５ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（２％ピリジンｉｎ酢酸エチル；ヘキサン＝２：１−２％ピリジン、３％エタノールｉｎ酢酸エチル１：０→０：１）にて精製し、目的物Ｖ_Ｓｅｒ１０．３１ｇ（８６％）を得た。

＜ＩＶ_Ｓｅｒ’の合成＞
ＩＶ_Ｓｅｒ５３３ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、トリエチルシラン０．１２ｍＬ（０．７５ｍｍｏｌ）及びＤＢＵ０．１１ｍＬ（０．７５ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。反応混合物を直接カラムクロマトグラフィー（８→１６％エタノールｉｎジクロロメタン）で精製することにより、ＩＶ_Ｓｅｒ’ ３４７ｍｇ（９３．２％）を得た。

＜Ｘの合成＞
４−（ＦＭＯＣ−アミノメチル）安息香酸３７．３ｇ（１００ｍｍｏｌ）を４００ｍＬの脱水ジクロロメタンに懸濁し、アルゴン雰囲気下、オキサリルクロリド１２．９ｍＬ（１５０ｍｍｏｌ）及びジメチルフォルムアミド０．１５ｍＬ（１．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で７時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、残渣に脱水トルエンを加えた後、減圧濃縮し、４００ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、溶液Ａを得た。
デオキシシチジン塩酸塩２９．０ｇ（１１０ｍｍｏｌ）を脱水ピリジンで懸濁し、減圧濃縮する操作を３回行った。残渣を３７５ｍＬの脱水ピリジンで懸濁し、０℃でトリメチルクロロシラン４６．４ｍＬ（３９６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間攪拌した後、再び０℃に冷却し、本溶液を氷冷下、溶液Ａに導入した。反応混合物を室温で１時間攪拌した。氷冷下１００ｍＬの水を加え、室温で８時間攪拌した。本溶液を減圧濃縮した。残渣に酢酸エチル５００ｍＬ及び水５００ｍＬを加え、よく攪拌し、ろ過することにより粗製の目的物Ｘ６１．６ｇを得た。

＜ＩＩＩ_Ｃの合成＞
粗製のＸ６１．６ｇを脱水ピリジンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を５００ｍＬの脱水ピリジンに溶解し、氷冷下４，４’−ジメトキシトリチルクロリド３３．９２ｇ（１００ｍｍｏｌ）を加え、０℃にて８時間攪拌した。続いてメタノール２０ｍＬを加え、３０分間攪拌した。溶液を減圧濃縮し、酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した。酢酸エチル溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル−エタノール１：０→１９：１）にて精製し、目的物ＩＩＩ_Ｃ７６．２ｇ（９０％２ｓｔｅｐ）を得た。

＜ＸＩの合成＞
ＩＩＩ_Ｃ２３．１１ｇ（２６．１ｍｍｏｌ）を脱水ジオキサンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を１３０ｍＬの脱水ジオキサンに溶解し、ジメチルアミノピリジン２２６ｍｇ（０．２１ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド１０．７８ｇ（５２．２ｍｍｏｌ）及びレブリン酸５．３６ｍＬ（５２．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応溶液に５ｍＬのメタノールを加え、３０分間攪拌した。不溶物をろ過し、濾液を減圧濃縮し、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル−エタノール１：０→１９：１）にて精製し、目的物ＸＩ２５．２ｇ（９８％）を得た。

＜ＸＩＩ_Ｔｙｒの合成＞
ＸＩ１７．８６ｇ（１５ｍｍｏｌ）を３８ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、トリエチルシラン４．５３ｍＬ（２８．３ｍｍｏｌ）及びジアザビシクロウンデセン４．２３ｍＬ（２８．３ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分間攪拌した。反応混合物にトリフロロ酢酸２．３９ｍＬ（３１．１ｍｍｏｌ）、ピリジン２．７４ｍｌ（３４．０ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン１９ｍＬの混合溶液を加え、反応混合物Ａを得た。
ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸５．７４ｇ（３７．７ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシこはく酸イミド５．２１ｇ（４５．３ｍｍｏｌ）をアセトニトリルに溶解し、氷冷下、ジシクロヘキシルカルボジイミド８．１７ｇ（３９．６ｍｍｏｌ）を加え、０℃で１時間攪拌した。不溶物を濾別し、濾液を反応混合物Ａに加えた。反応混合物を室温にて１時間攪拌した。続いてピペリジン３．７ｍＬを加え、３０分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル−エタノール１９：１→９：１）にて精製し、目的物ＸＩＩ_Ｔｙｒ５．０３ｇ（６４％）を得た。

＜ＸＩＩＩの合成＞
ＦＭＯＣ−Ｓｕｃ３３．７４ｇ（１００ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのジクロロメタンに溶解し、氷冷下、２−（メチルアミノ）エタノール８．２５ｍＬ（１０５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて一晩攪拌した。反応溶液を水で洗浄し、ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル−ヘキサン１：１→１：０）にて精製し、目的物ＸＩＩＩ２８．７２ｇ（９７％）を得た。

＜ＸＩＶ_Ｔｙｒの合成＞
ＸＩＩ_Ｔｙｒ１０．３８ｇ（１１．６ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリルに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２６ｍＬの脱水アセトニトリルに溶解し、ピリジン２．３６ｍＬ（２９．２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物Ａを得た。
トリフォスゲン１．３８ｇ（４．６４ｍｍｏｌ）を１６ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下、ピリジン１．２ｍＬ（１４．６ｍｍｏｌ）及びＸＩＩＩ４．１４ｇ（１３．９２ｍｍｏｌ）の１６ｍＬジクロロメタン溶液を滴下した。反応混合物を室温にて１５分間攪拌した。本反応混合物を反応混合物Ａに０℃で加えた。反応混合物を室温にて１５分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（酢酸エチル−エタノール９４：６→９１：９）にて精製し、目的物ＸＩＶ_Ｔｙｒ１２．０ｇ（８５％）を得た。

＜ＩＶ_Ｔｙｒの合成＞
ＸＩＶ_Ｔｙｒ９．１４ｇ（７．５ｍｍｏｌ）を７５ｍＬのピリジンに溶解し、ヒドラジン１水和物３．１１ｍＬ（６４．３ｍｍｏｌ）の希釈溶液９０ｍＬ（ピリジン：酢酸＝２：１）を加え、室温で５分間攪拌した。氷冷下、アセトン５３ｍＬを加え、０℃で１０分間攪拌した後、ジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮した。得られた残渣を中圧クロマトグラフィー（ジクロロメタン−エタノール１：０→１９：１）にて精製し、目的物ＩＶ_Ｔｙｒ６．２６ｇ（７５％）を得た。

＜Ｖ_Ｔｙｒの合成＞
ＩＶ_Ｔｙｒ５．７２ｇ（５．１０ｍｍｏｌ）を脱水アセトニトリル、脱水ジクロロメタンに溶解し、減圧濃縮を３回行った。残渣を２０ｍＬの脱水ジクロロメタンに溶解し、氷冷下ジメチルアミノピリジン３１ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン１．０１ｍＬ（５．８１ｍｍｏｌ）を加え、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジト１．２５ｍＬ（５．６１ｍｍｏｌ）の５．１ｍＬ塩化メチレン溶液を、５分以上かけ滴下した。混合溶液を０℃で９０分間攪拌した。続いてメタノール１．０ｍＬを加え、１５分間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、水で洗浄した。ジクロロメタン溶液を減圧濃縮し、残渣を中圧クロマトグラフィー（２％ピリジンｉｎ酢酸エチル；ヘキサン＝２：１−２％ピリジンｉｎ酢酸エチル０→１００％、続けて２％ピリジン、２０％エタノール２％ピリジンｉｎジクロロメタン１：０→１７：３）にて精製し、目的物Ｖ_Ｔｙｒ５．７２ｇ（８５％）を得た。

＜各化合物の構造確認＞
前記各化合物（ＩＩ、ＩＶ_Ｓｅｒ、ＩＶ_Ｓｅｒ’、Ｖ_Ｓｅｒ、Ｘ、ＩＩＩ_Ｃ、ＸＩ、ＸＩＩ_Ｔｙｒ、ＸＩＶ_Ｔｙｒ、ＩＶ_Ｔｙｒ、Ｖ_Ｔｙｒ）の構造確認を以下のようにして行った。結果を図１〜図１１−３に示す。
［^１Ｈ−ＮＭＲ］
各サンプル約５ｍｇを重溶媒に溶解し、測定した。内部標準は重溶媒ピークを基準とした。
［^３１Ｐ−ＮＭＲ］
外部標準としてＰＰｈ_３を用い、−６．２ｐｐｍを基準として測定した。ＢＣＭにて測定を行った。

（実施例２：脱保護の確認（Ｖ_Ｔｙｒ））
前記実施例１で合成した修飾核酸合成用アミダイド（Ｖ_Ｔｙｒ）が、緩やかな条件下で脱保護可能であり、また脱保護により置換基中に水酸基が発現する（置換基表面に水酸基が露出される）ことを以下のようにして確認した。

まず、実施例１で合成した、Ｖ_Ｔｙｒと同様の置換基及び保護基を有するＸＩＶ_Ｔｙｒ（Ｖ_Ｔｙｒの中間体）（ＨＰＬＣＣｈａｒｔ１、図１２）１．７ｍＭ、及び１０ｍＭＤＢＵ（１０％ＤＭＦ、９０％アセトニトリル）溶液を室温で１５分間静置し、反応混合物を得た（ＨＰＬＣＣｈａｒｔ２、図１３）。また、実施例１で合成したＸＩＩ_Ｔｙｒ（Ｖ_Ｔｙｒと同様の置換基を有するが、保護基は有さない）を準備した（ＨＰＬＣＣｈａｒｔ３、図１４）。
次いで、ＨＰＬＣＣｈａｒｔ２の反応混合物（ＸＩＶ_ＴｙｒのＤＢＵ処理サンプル）と、ＨＰＬＣＣｈａｒｔ３の化合物（ＸＩＩ_Ｔｙｒ）とを混合した溶液について、ＨＰＬＣＣｈａｒｔを確認した（ＨＰＬＣＣｈａｒｔ４、図１５）。

結果、ＨＰＬＣＣｈａｒｔ２の反応混合物（ＸＩＶ_ＴｙｒのＤＢＵ処理サンプル）と、ＨＰＬＣＣｈａｒｔ３の化合物（ＸＩＩ_Ｔｙｒ）とは一致した（ＨＰＬＣＣｈａｒｔ４、図１５）。したがって、本発明の修飾核酸合成用アミダイド（Ｖ_Ｔｙｒ）を用いて修飾核酸を合成する際に、アセトニトリル中でのＤＢＵ処理等の緩やかな条件下で脱保護を行うことにより、保護基が外され、水酸基が発現した（水酸基が表面に露出した）、所望の水酸基含有修飾核酸を得ることができることが確認された。
なお、本実施例２におけるＨＰＬＣ分析条件は以下の通り。
[ＨＰＬＣ分析条件]
流速１ｍＬ／ｍｉｎＡ溶液１００ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸緩衝液ｐＨ＝７．０
Ｂ溶液アセトニトリル
ＨＰＬＣｃｈａｒｔ１〜３
Ｂ：５０→８０％（０→１０ｍｉｎ）→１００％（→２０ｍｉｎ）
ＨＰＬＣｃｈａｒｔ４
Ｂ：５０→８０％（０→２０ｍｉｎ）

（実施例３：脱保護の確認（Ｖ_Ｓｅｒ））
前記実施例１で合成した修飾核酸合成用アミダイド（Ｖ_Ｓｅｒ）が、緩やかな条件下で脱保護可能であり、また脱保護により置換基中に水酸基が発現する（置換基表面に水酸基が露出される）ことを以下のようにして確認した。

まず、実施例１で合成した、Ｖ_Ｓｅｒと同様の置換基及び保護基を有するＩＶ_Ｓｅｒ（Ｖ_Ｓｅｒの中間体）（ＨＰＬＣＣｈａｒｔ５、図１６）０．５ｍＭ、及び１０ｍＭＤＢＵ（１０％ＤＭＦ、９０％アセトニトリル）溶液を室温で１５分間静置し、反応混合物を得た（ＨＰＬＣＣｈａｒｔ６、図１７）。また、実施例１で別途合成したＩＶ_Ｓｅｒ’（Ｖ_Ｓｅｒと同様の置換基を有するが、保護基は有さない）を準備した（ＨＰＬＣＣｈａｒｔ７、図１８）。
次いで、ＨＰＬＣＣｈａｒｔ６の反応混合物（ＩＶ_ＳｅｒのＤＢＵ処理サンプル）と、ＨＰＬＣＣｈａｒｔ７の化合物（ＩＶ_Ｓｅｒ’）とを混合した溶液について、ＨＰＬＣＣｈａｒｔを確認した（ＨＰＬＣＣｈａｒｔ８、図１９）。
また、参考として、ＨＰＬＣＣｈａｒｔ６の反応混合物（ＩＶ_ＳｅｒのＤＢＵ処理サンプル）を酢酸中和したサンプルと、ＩＶ_Ｓｅｒとを混合した溶液についても、ＨＰＬＣＣｈａｒｔを確認した（ＨＰＬＣＣｈａｒｔ９、図２０）。

結果、ＨＰＬＣＣｈａｒｔ６の反応混合物（ＩＶ_ＳｅｒのＤＢＵ処理サンプル）と、ＨＰＬＣＣｈａｒｔ７の化合物（ＩＶ_Ｓｅｒ’）とは一致した（ＨＰＬＣＣｈａｒｔ８）。したがって、本発明の修飾核酸合成用アミダイド（Ｖ_Ｓｅｒ）を用いて修飾核酸を合成する際に、アセトニトリル中でのＤＢＵ処理等の緩やかな条件下で脱保護を行うことにより、保護基が外され、水酸基が発現した（水酸基が表面に露出した）、所望の水酸基含有修飾核酸を得ることができることが確認された。
また、ＨＰＬＣＣｈａｒｔ９（ＩＶ_ＳｅｒのＤＢＵ処理サンプルを酢酸中和したサンプルと、ＩＶ_Ｓｅｒとの重ねうち）の結果からは、ＤＢＵ処理により生じた疎水性産物がＩＶ_Ｓｅｒと異なること、即ち、ＤＢＵ処理によりＩＶ_Ｓｅｒが完全に消失することが確認された。
なお、本実施例３におけるＨＰＬＣ分析条件は以下の通り。
[ＨＰＬＣ分析条件]
流速１ｍＬ／ｍｉｎＡ溶液１００ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸緩衝液ｐＨ＝７．０
Ｂ溶液アセトニトリル
ＨＰＬＣｃｈａｒｔ４〜９
Ｂ：３０→８０％（０→２０ｍｉｎ）

なお、本発明の修飾核酸合成用アミダイドが、アセトニトリル中でのＤＢＵ処理等の緩やかな条件下で脱保護され、これにより、水酸基が発現した（水酸基が表面に露出した）状態の、所望の水酸基含有修飾核酸を生成できる機構としては、例えば、図２１Ａ及び図２１Ｂに示すような機構が推測される。即ち、アセトニトリル中でのＤＢＵ処理により、まず保護基中のフルオレニル基が外され、その後、発現した（表面に露出した）アミンがカルボニル基又はカーボネート基を攻撃することにより、自発的に環を形成して、保護基全体が外されるという機構である。これにより、置換基中に水酸基が発現し（置換基表面に水酸基が露出し）、水酸基含有修飾核酸（本発明の修飾核酸）が生成されることとなる（図２１Ａ、図２１Ｂ）。

本発明の好ましい態様を付記すると、以下の通りである。
（付記１）下記一般式（Ｉ）で表されることを特徴とする修飾核酸合成用アミダイドであって、保護基が非プロトン性溶媒中で脱保護可能であり、かつ、保護基が脱保護された際に、置換基中に水酸基が発現することを特徴とする修飾核酸合成用アミダイド。
ただし、前記一般式（Ｉ）中、Ｘは塩基を表し、Ｙは置換基を表し、Ｚは前記置換基における水酸基を保護するための保護基を表し、Ｑは水素原子、水酸基、又は保護基で保護された水酸基を表す。
（付記２）非プロトン性溶媒が、アセトニトリル、ジクロロメタン、ＤＭＦ、及び、Ｎ−メチルピロリドンからなる群より選択される少なくともいずれかである付記１に記載の修飾核酸合成用アミダイド。
（付記３）保護基が、嵩高い塩基により脱保護可能である付記１から２のいずれかに記載の修飾核酸合成用アミダイド。
（付記４）嵩高い塩基が、ＤＢＵ、ＤＢＮ、及び、テトラメチルグアニジンからなる群より選択される少なくともいずれかである付記３に記載の修飾核酸合成用アミダイド。
（付記５）保護基が、０．０１ＭＤＢＵ濃度以下で脱保護可能である付記１から４のいずれかに記載の修飾核酸合成用アミダイド。
（付記６）保護基が、１５分間以内に脱保護可能である付記１から５のいずれかに記載の修飾核酸合成用アミダイド。
（付記７）置換基における水酸基を保護するための保護基が、３−アミノプロピオン酸誘導体、４−アミノ酪酸誘導体、５−アミノ吉草酸誘導体、アミノメチル炭酸誘導体、アミノエチル炭酸誘導体、アミノ安息香酸誘導体、アミノメチル安息香酸誘導体、アミノエチル安息香酸誘導体、アミノフェニル酢酸誘導体、アミノメチルフェニル酢酸誘導体、アミノフェニルプロピオン酸誘導体、及び、アミノメチルフェニルプロピロン酸誘導体のいずれかからなる保護基である付記１から６のいずれかに記載の修飾核酸合成用アミダイド。
（付記８）置換基における水酸基を保護するための保護基が、下記一般式（ＩＩ）〜（ＩＩＩ）のいずれかで表される保護基である付記１から７のいずれかに記載の修飾核酸合成用アミダイド。
（付記９）置換基が、塩基の環外アミノ基に結合してなる付記１から８のいずれかに記載の修飾核酸合成用アミダイド。
（付記１０）塩基が、アデニン、グアニン、及び、シトシンのいずれかである付記１から９のいずれかに記載の修飾核酸合成用アミダイド。
（付記１１）下記構造式（１）〜（２）のいずれかで表される付記１から１０のいずれかに記載の修飾核酸合成用アミダイド。
（付記１２）付記１から１１のいずれかに記載の修飾核酸合成用アミダイドを用いることを特徴とする修飾核酸合成方法。
（付記１３）修飾核酸合成用アミダイドの縮合反応の後、前記修飾核酸合成用アミダイドの保護基の脱保護が行われる付記１２に記載の修飾核酸合成方法。
（付記１４）非プロトン性溶媒中で脱保護が行われる付記１２から１３のいずれかに記載の修飾核酸合成方法。
（付記１５）嵩高い塩基により脱保護が行われる付記１２から１４のいずれかに記載の修飾核酸合成方法。
（付記１６）０．０１ＭＤＢＵ濃度以下で脱保護が行われる付記１２から１５のいずれかに記載の修飾核酸合成方法。
（付記１７）１５分間以内に脱保護が行われる付記１２から１６のいずれかに記載の修飾核酸合成方法。
（付記１８）核酸自動合成装置を用いて行われる付記１２から１７のいずれかに記載の修飾核酸合成方法。
（付記１９）付記１２から１８のいずれかに記載の修飾核酸合成方法により得られることを特徴とする修飾核酸。
（付記２０）水酸基が発現した置換基を有してなる付記１９に記載の修飾核酸。

本発明の修飾核酸合成用アミダイド、及び本発明の修飾核酸合成方法によれば、水酸基を含有する本発明の修飾核酸を効率的に得ることができる。得られた前記修飾核酸は、水酸基を介して蛋白質等の標的物質との結合が可能であり、したがって、前記修飾核酸は、例えば、蛋白質等の標的物質の解析に、好適に利用可能である。

図１は、実施例１における化合物ＩＩの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図２は、実施例１における化合物ＩＶ_Ｓｅｒの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図３は、実施例１における化合物ＩＶ_Ｓｅｒ’の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図４−１は、実施例１における化合物Ｖ_Ｓｅｒの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図４−２は、実施例１における化合物Ｖ_Ｓｅｒの^３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。図５は、実施例１における化合物Ｘの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図６は、実施例１における化合物ＩＩＩ_Ｃの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図７は、実施例１における化合物ＸＩの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図８は、実施例１における化合物ＸＩＩ_Ｔｙｒの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図９は、実施例１における化合物ＸＩＶ_Ｔｙｒの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図１０は、実施例１における化合物ＩＶ_Ｔｙｒの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図１１−１は、実施例１における化合物Ｖ_Ｔｙｒの^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図１１−２は、実施例１における化合物Ｖ_Ｔｙｒの^３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルである。図１１−３は、実施例１における化合物Ｖ_ＴｙｒのＨＨｃｏｓｙスペクトルである。図１２は、実施例２におけるＨＰＬＣＣｈａｒｔ１である。図１３は、実施例２におけるＨＰＬＣＣｈａｒｔ２である。図１４は、実施例２におけるＨＰＬＣＣｈａｒｔ３である。図１５は、実施例２におけるＨＰＬＣＣｈａｒｔ４である。図１６は、実施例３におけるＨＰＬＣＣｈａｒｔ５である。図１７は、実施例３におけるＨＰＬＣＣｈａｒｔ６である。図１８は、実施例３におけるＨＰＬＣＣｈａｒｔ７である。図１９は、実施例３におけるＨＰＬＣＣｈａｒｔ８である。図２０は、実施例３におけるＨＰＬＣＣｈａｒｔ９である。図２１Ａは、本発明の修飾核酸合成用アミダイド（Ｖ_Ｓｅｒ）における脱保護機構を表した図である。図２１Ｂは、本発明の修飾核酸合成用アミダイド（Ｖ_Ｔｙｒ）における脱保護機構を表した図である。

Claims

下記構造式（１）で表されることを特徴とする修飾核酸合成用アミダイド。
下記構造式（２）で表されることを特徴とする修飾核酸合成用アミダイド。
請求項１から２のいずれかに記載の修飾核酸合成用アミダイドを用いることを特徴とする修飾核酸合成方法。
請求項３に記載の修飾核酸合成方法により得られることを特徴とする修飾核酸。