JP4300324B2

JP4300324B2 - 加齢性眼疾患改善剤、ならびにそれを含む医薬組成物、飲食品、化粧料および飼料

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Publication number: JP4300324B2
Application number: JP2005033913A
Authority: JP
Inventors: 靖雄山下; 圭子伊藤; 邦雄安藤; 友清水
Original assignee: NRL Pharma Inc
Current assignee: NRL Pharma Inc
Priority date: 2005-02-10
Filing date: 2005-02-10
Publication date: 2009-07-22
Anticipated expiration: 2025-02-10
Also published as: JP2006219415A

Description

本発明は、加齢により機能低下または組織損傷した眼を修復・治療し、視力低下または失明を予防するための加齢性眼疾患改善剤、特に、これまで不可避の自然現象と考えられてきた眼の加齢変性（眼の老化現象）を遅らせ、または若返らせ、最終的には眼疾患の治癒をもたらす加齢性眼疾患改善剤に関する。さらに、本発明は、この改善剤を含む医薬組成物、飲食品、化粧料および飼料に関する。

医学の進歩に伴う平均寿命の延長にもかかわらず、先進国における失明率は増大の一途である。視覚は、生活の質（ＱＯＬ）のなかで最重要ファクターであり、寿命が長くなっても、失明しては幸福な人生とはいえない。

米国を始めとする先進諸国は失明を克服するための研究に躍起であるが、それに加え、近年、失明にも増して社会的な関心をひくようになったのが、視力の質（ＱｕａｌｉｔｙｏｆＶｉｓｉｏｎ：ＱＯＶ）である。すなわち、従来は単に見えればよいと考えていた人々も、「もっと快適にものを見たい」、「コンタクトレンズなしでものを見たい」、「老眼鏡はかけたくない」等と考えるようになってきている。

また、ドライアイ患者も増加している。ドライアイになると、眼が乾くために長時間眼を開けておくことができず、ドライアイは眼の疲れの最大原因になっている。こうした眼の疲れに対しては、従来は眼を休める程度の対応で充分な改善効果も見込めたが、近年のコンピューター技術の発達やインターネットの普及によって、仕事中に眼を休めることすらできず、眼の休養による充分な改善効果も見込めなくなってきている。

このような、加齢性網膜黄斑変性症、緑内障、白内障、ドライアイ、老視といった眼疾患の多くが、加齢によるものである。したがって、視力の低下防止（失明対策）またはＱＯＶの向上を図るためには、未だ発展途上の分野ではあるが、加齢を防止するためのアンチエイジング医学が非常に重要である。眼疾患の原因が加齢によるものであれば、加齢そのものに干渉することによって眼の病気を発症させないようにできないものかという観点から、眼の加齢を遅らせる、あるいは安全に修復することができる抗加齢物質、若返り物質が世界的に希求されている。

眼疾患の中でもとりわけ高齢者に多発し、失明に至る疾患として世界的な課題とされているのは、加齢性網膜黄斑変性症（Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄＭａｃｕｌａｒＤｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＡＭＤ）である。ＡＭＤは、６５歳以上の高齢者に多く見られ、失明の原因となる病気であり、厚生労働省の特定疾患に指定されている。この病気にかかると、視野がぼやけ、線が歪んで見え、視野の中央部にいくつかの黒点が現れる。日本では、推定患者数が１万５千人と比較的少ないが、２００４年の米国では初期のＡＭＤが１，５００万人、失明の危険がある重症患者が１６０万人と推定されほど高齢者に多発する眼疾患である。しかも、ＡＭＤは白内障と違って治療法が確立されておらず、現状では有効な治療手段がない。疫学調査ではルテインおよびゼアキサンチンを含む黄緑野菜を多く摂取する結果、これらカロチノイドの血中濃度が高い人は発症リスクが低いことがわかっているが、ルテインおよびゼアキサンチンを摂取してもＡＤＭの発症および進行に影響がないことが大規模な二重盲検試験によって明らかにされている。

ＡＭＤは、その約９割を占める萎縮型と網膜の血管新生を伴う滲出型とに分類される。このうち失明のリスクが高い滲出型では、診断半年後から１年半後に重篤な視力減退が起こり、失明が多発するが、現在、その進行をくい止め、また確実に失明を阻止する治療手段はない。ＡＭＤの危険因子は、年齢、家族歴、青い目、喫煙、血管障害、黄緑野菜の摂取不足、強度の光線に長時間暴露されること等であるが、中でも、年齢は発症と最も強い相関があり、血族に患者が存在する家族歴も１０〜２０％の相関があるとされている。また、虚血性心疾患、高血圧症等の心血管病との高い相関も注目されている。滲出型ＡＭＤにより失明に至る過程には、網膜の炎症および炎症部位を栄養する血管新生が関わっている。そのため、網膜の血管新生を抑制すれば、滲出型ＡＭＤの進行を阻止し、失明を防止できるものと考えられる。

血管新生には、生理的なものと、癌、炎症等で見られる病的なものとがある。生理的血管新生、とりわけ胎生期の血管新生は、炎症、出血、血液凝固を伴なわず、血管内皮細胞に特異的に作用する血管新生因子（ＶＥＧＦ）やアンジオポエチン等の因子によって整然と制御されたプロセスである。それとは対照的に、癌、炎症等で見られる病的な血管新生には、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）やチミジンフォスフォリラーゼ等の内皮細胞に対して非特異的な因子が関与する。しかも、病的な血管新生は、炎症、出血、血液凝固等を必ず伴っており、これが血管新生像を複雑なものとしている。病的な新生血管は、破綻・出血して血栓を生じ、血管から血漿成分がしみ出して周囲の組織にフィブリノイド変性を起こす。このような過程を経て網膜の神経細胞が破壊され、失明に至るのである。

したがって、ＡＭＤを予防または治療するには、少なくとも、（１）安全であること、（２）加齢変性した眼組織を若返らせること、（３）網膜の血管新生を阻止すること、および（４）抗炎症作用があること、の４条件を備えた薬剤が必要である。最近、ＡＭＤ予防・治療薬として血管新生因子（ＶＥＧＦ）の遺伝子発現に干渉するリボ核酸断片（ＲＮＡｉ）が特に注目されている。既に米国ではＲＮＡｉを注射してＡＭＤを治療することを目指し、バイオテクノロジーのベンチャー企業が数社も創立され、熾烈な開発競争を展開している。米国食品薬品局は、医薬品としての承認申請が行われた場合、最優先で審査することを公表している。ＡＭＤの予防・治療薬は緊急度が高いからである。

加齢性眼疾患の予防・治療に従来用いられてきた製品は、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンなどのカロチノイド、視力に関係するビタミンＡ、抗酸化作用があるアスコルビン酸、ビタミンＥ、コエンザイムＱ_１０等々を有効成分として含んでいる。

ラクトフェリン（以下、ＬＦということがある）は、哺乳動物の乳汁中に含まれる可溶性の鉄結合性の糖タンパク質である。その分子量は、ウシで８６，０００、ヒトで８８，０００である。ラクトフェリンは、溶液中から鉄イオンを奪うことによって、抗菌活性を示すことがわかっており（非特許文献１）、従来、健康食品等の成分として利用されてきた。

前記４条件のうち、安全性に関しては、牛乳から抽出したラクトフェリンが高い安全性を示すことが知られている（特許文献１）。すなわち、ラクトフェリンは、雌雄のビーグル犬およびラットに５ｇ／ｋｇを１回経口投与、または２ｇ／ｋｇを１２週間連続経口投与しても何らの毒性も示さない。既に育児用調製粉乳、健康食品およびヨーグルト、飲料などに添加されており、不特定多数の人に摂取されて久しいにもかかわらず、ラクトフェリンの安全性に懸念を抱かせる情報は一切報告されていない。

また、血管新生の阻害効果については、津田等（日本国立がんセンター）により、ラクトフェリンが化学発ガン剤による発ガンを抑制し、移植ガンの転移を抑制するのは、ガン細胞により誘導される血管新生を阻害するのも一因であると報告されている（非特許文献２）。

さらに、抗炎症作用については、ラクトフェリンを慢性炎症の病態モデルであるアジュバント関節炎ラットに経口投与すると、足関節の腫脹を抑制し、細菌リポ多糖を投与した際の血中ＴＮＦ−α上昇を抑え、抗炎症サイトカインであるＩＬ−１０を上昇させるという報告があり（非特許文献３）、ラクトフェリンは慢性炎症に対し消炎作用を呈するものと考えられる。

一方、ラクトフェリンは涙液に多量に含まれるにもかかわらず、その眼に対する作用については充分に明らかになっていない。すなわち、このタンパク質が持つ本来の機能からラクトフェリンが感染防御、抗炎症作用を有することが想像されるものの、眼に対する具体的な薬理効果としては、角膜障害治療作用（特許文献２）および術後乱視予防作用（特許文献３）以外については報告されていない。すなわち、ラクトフェリンが、加齢性眼疾患の予防または治療に有効であることを具体的に示すデータは報告されておらず、ラクトフェリンが加齢性眼疾患を改善することは従来まったく知られていなかった。

特開２００２−１６１０５０号公報国際公開第９２／０８４７７号パンフレット特開平８−３０１７８５号公報特開２００３−１１３１１０号公報特開２００２−０２９９７７号公報特開２００１−２８１２５６号公報特開平１１−０４９６９８号公報特開平９−０３０９６６号公報特開平８−０４０９２５号公報特表２００３−５１８０７２号公報特表２００３−５０３４４２号公報特表２００２−５３３３７９号公報特表２００２−５０８００９号公報生化学辞典第３版、ｐ．１４５７、東京化学同人、１９９８年 H Tsuda, Sekine K, Fujita K. and Iigo M.; Cancer prevention by bovine lactoferrin and underlying mechanisms-a review of experimental and clinical studies. Biochem Cell Biol. 80 (2002) 131-136 Hayashida K, Kaneko T, Takeuchi T, Shimizu H, Ando K and Harada E. Oral administration of lactoferrin inhibits inflammation and nociception in rat adjuvant-induced arthritis. J. Vet. Med. Sci. 66 (2004) 149-154 坪田一男編、「医学のあゆみ」、第２１１巻（１０号）、第９５６〜９６６ページ、２００４年清澤功著、「母乳の栄養学」、金原出版、第８０〜８１ページ Hahn P. et al.: Disruption of ceruliplasmin and hephaestin in mice causes retinal iron overload and etinal degeneration with features of age-related macular degeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 13850-13855, 2004. Seddon, J.M.: Association between C-reactive protein and age-related macular degeneration. JAMA, 291: 704-710, 2004 Miyazaki, M. et al.: Risk factors for age-related maculopathy in a Japanese population: the Hisayama study. Br. J. Ophthalmol., 85: 1153-1157, 2001

本発明は、眼精疲労、加齢性網膜黄斑変性症、緑内障、白内障、ドライアイ、老視等の、加齢に起因または関連する眼疾患（加齢性眼疾患ともいう）を予防または治療するために有効で、安全性の高い薬剤を提供すること、特に、加齢の過程に干渉することによってこれらの眼疾患を発症させない、加齢による機能低下または組織傷害を阻止する、または加齢減少を逆転させて若返らせることができる、眼疾患の予防または治療用薬剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、そのような薬剤を配合した加齢性眼疾患予防または治療用の医薬組成物、飲食品、化粧料および飼料を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記の課題を解決するために、広く天然素材に含まれている加齢性眼疾患予防または治療効果を有する可能性のある物質について、鋭意、探索を進めていたところ、ラクトフェリンが、加齢性眼疾患を予防・治療することができる、すなわち、老化した眼を若返らせる作用があること、そしてラクトフェリンが前記４条件をすべて満たす物質であることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、
〔１〕ラクトフェリンを有効成分として含有する加齢性眼疾患改善剤；
〔２〕加齢性眼疾患が、眼精疲労、加齢性網膜黄斑変性症、緑内障、白内障、ドライアイ、老視のいずれか１以上である、前記〔１〕記載の加齢性眼疾患改善剤；
〔３〕前記〔１〕または〔２〕記載の加齢性眼疾患改善剤を含む医薬組成物；
〔４〕前記〔１〕または〔２〕記載の加齢性眼疾患改善剤を含む飲食品；
〔５〕前記〔１〕または〔２〕記載の加齢性眼疾患改善剤を含む化粧料；
〔６〕前記〔１〕または〔２〕記載の加齢性眼疾患改善剤を含む飼料；
を提供する。

本発明によりラクトフェリンを有効成分とする加齢性眼疾患改善剤、ならびにこれを有効成分として含有する加齢性眼疾患改善用医薬組成物、加齢性眼疾患改善用飲食品、加齢性眼疾患改善用化粧料、および加齢性眼疾患改善用飼料（以下、加齢性眼疾患改善剤等ということがある）が提供される。本発明の加齢性眼疾患改善剤等は、加齢性眼疾患の発症予防および発症後の治療に有用である。

本発明の加齢性眼疾患改善剤等は、加齢性眼疾患の予防・治療に従来用いられてきた化合物と比べ、安全性が高く、確実に加齢性眼疾患を改善する特徴がある。また、ラクトフェリンは乳汁、粘液や好中球の成分であることから、加齢性眼疾患改善剤等は、他の薬物の生物活性を損なうことがなく、それらとの併用が可能である。

本発明の加齢性眼疾患改善剤は、ラクトフェリンを有効成分として含有することを特徴とする。本発明において使用されるラクトフェリンとしては、ヒトおよび種々の動物、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ等から得られる天然のラクトフェリン分子（鉄イオンの有無またはその含量、由来する生物種などを問わない）、遺伝子工学技術により改変されたラクトフェリン遺伝子に基づいて産生される組換え型ラクトフェリン、トランスジェニック動物が泌乳するラクトフェリンなどのラクトフェリンのほか、ラクトフェリンの活性フラグメントなどの機能的等価物のいずれであってもよい。したがって、本発明に関して用語「ラクトフェリン」は、特に示さない限り、これらの種々のラクトフェリンをも包含する意味で用いられる。

本発明においては、これらのラクトフェリンの１種または２種以上を適宜選択して用いることができる。ラクトフェリンは、公知の物質であって、市販されているものであるが、それを製造するには、公知の方法、例えばスルホン化担体を用いてラクトフェリンを精製する方法（特開平３−１０９４００号公報）を工業的に有利に利用することができる。

本発明の加齢性眼疾患改善剤は、ラクトフェリンを唯一の必須成分とするが、所望により、製薬または食品業界で公知の種々の成分などを含んでいてもよい。例えば、ビタミンＡ、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ビタミンＣ、ビタミンＥ等、従来から視力低下の回復に有効な作用を持つと考えられている成分を含むことができる。これらの他の有効成分をさらに含有させることによって、一層の加齢性眼疾患改善作用を期待できる。なお、本発明に関して加齢性眼疾患の「改善」は、予防および治療（軽快、治癒を含む）を包含する意味で用いられる。したがって、本発明の加齢性眼疾患改善剤は、加齢性眼疾患の予防または治療のいずれか一方または両方を目的とすることができる。

本発明の加齢性眼疾患改善剤は、添加剤として、製薬産業において日常的に使用されている賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、流動性促進剤、着色剤、香料等を適宜添加して所望の剤型の医薬組成物とすることができる。本発明の加齢性眼疾患改善剤または医薬組成物の投与経路は、公知のいずれの経路であってもよく、例えば点眼、経口、経皮、注射、経腸、直腸内等の任意の経路を選択することができる。好ましくは点眼および経口投与である。

例えば、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の経口剤は、澱粉、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法によって製剤化される。この種の製剤には、前記賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、着色料、香料等を適宜使用することができる。より具体的には、結合剤としては、例えば、澱粉、デキストリン、アラビアガム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、結晶性セルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンが挙げられる。また、崩壊剤としては、例えば、澱粉、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。界面活性剤としては、大豆レシチン、蔗糖脂肪酸エステル等が、滑沢剤としては、タルク、ロウ、蔗糖脂肪酸エステル、水素添加植物油等が、流動性促進剤としては、無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウム、ケイ酸マグネシウム等が、それぞれ挙げられる。

また、経口投与のほか、本発明の加齢性眼疾患改善剤、またはそれを含む医薬組成物または化粧料は、点眼等の方法で局所適用することによっても、加齢性眼疾患予防または治療効果を発揮する。局所適用剤とするには、その使用目的に応じて、通常用いられる公知の成分に配合することによって、液剤、固形剤、半固形剤等の各種剤形に調製することが可能であり、好ましい組成物としては、軟膏、ゲル、クリーム、スプレー剤、貼付剤、ローション、粉末等が挙げられる。例えば、本発明の加齢性眼疾患改善剤を、ワセリン等の炭化水素、ステアリルアルコール、ミリスチン酸イソプロピル等の高級脂肪酸低級アルキルエステル、ラノリン等の動物性油脂、グリセリン等の多価アルコール、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸ポリエチレングリコール等の界面活性剤、無機塩、ロウ、樹脂、水、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸ブチル等の保存料等の１以上の成分と混合することによって、加齢性眼疾患改善用医薬組成物または化粧料を製造することができる。

このような各種製剤の製造方法は、当業者には充分公知である。なお、本発明に関して「医薬組成物」という場合、人間に対して適用するもののほか、獣医学的に動物に対して適用するもの（獣医薬）をも含む。

また、本発明の加齢性眼疾患改善剤は、経口投与するために、栄養剤や飲食品に添加して、飲食品または飼料としてヒトまたはヒト以外の対象動物に摂取させることもできる。このような飲食品または飼料の製造方法も当業者には公知である。

本発明の加齢性眼疾患改善剤またはそれを含む医薬組成物、飲食品、化粧料もしくは飼料を与えるべき対象となるのは、ヒトをはじめとして、ヒト以外の哺乳類、鳥類などの種々の動物であり、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等の家畜、家禽類やイヌ、ネコ等のペット類が挙げられる。

本発明の加齢性眼疾患改善剤の経口投与による有効量は、その製剤形態、投与方法、使用目的、および投与される対象の種類、年齢、体重、病状等によって異なり、それらに応じて各々に適した量で投与することができる。哺乳類に対して投与する場合、好ましくは体重１ｋｇあたり２ｍｇ／日以上とすることができる。ヒトに投与する場合、一般的には、有効成分量として、１日あたり８０ｍｇ〜１６０ｍｇ、例えば、成人１人当たり１日１２０ｍｇ以上の量であることができる。このような１日あたりの用量を一度にまたは分割して、本発明の加齢性眼疾患改善剤による加齢性眼疾患の予防、治療または状態の改善が必要とされている対象に対し、投与することができる。

本発明の加齢性眼疾患改善剤の点眼による有効量は、製剤形態、使用目的等により異なるが、適用する組成物全量を基準として、好ましくは０．００１〜２重量％となるように、ラクトフェリンを配合すればよい。

本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。

実施例１：加齢性眼疾患改善剤の製造
ナトリウムイオン吸着型スルホン酸陽イオン交換樹脂４００ｇを充填したカラム（直径５ｃｍ×高さ３０ｃｍ）を脱イオン水で十分に洗浄した後、このカラムに未殺菌脱脂乳４０Ｌ（ｐＨ６．７）を流速２５ｍＬ／ｍｉｎで通液した。通液後、カラムを脱イオン水で十分洗浄し、２．０Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。ラクトフェリンを含有する溶出画分をＳ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラムに吸着させ、脱イオン水で十分洗浄し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した後、０〜２．０Ｍ塩化ナトリウムの濃度勾配を溶出し、ラクトフェリンを含む画分を回収した。そして、その画分をゲル濾過クロマトグラフィーで処理し、凍結乾燥してラクトフェリン３．５ｇを得た。なお、このようにして得られたラクトフェリンの純度は９３％であり、そのまま加齢性眼疾患改善剤として使用可能である。

実施例２：ラクトフェリンを含有する加齢性眼疾患改善医薬組成物
株式会社ＮＲＬファーマ製造の腸溶性ラクトフェリン粉末（純ラクトフェリンとして１０％を含有）を本発明の医薬組成物として使用した。

試験例１：ラットにおける眼の加齢現象に及ぼす効果
ラットを実験動物として用い、眼の加齢現象に及ぼす効果を調べるために、生後１年８ヶ月〜２年半のウイスター系雌ラット（老齢）１８頭を無作為に２群に分け、一群を、ラクトフェリンを投与していない群（「老齢対照群」または「対照群」ともいう；ｎ＝９）、他方を、ラクトフェリンを投与した群（「老齢ラクトフェリン（ＬＦ）摂取群」または「老齢ＬＦ摂取群」ともいう；ｎ＝９）として４週間飼育し、涙腺を光学顕微鏡と透過電子顕微鏡で観察した。なお、ラットの寿命は約２年半であるから、実験に使用したラットは、人の７０〜８０歳代に相当する。

両群とも飼料と飲料水は自由摂取とし、対照群には粉末のラット用標準飼料（日本クレア、ＣＥ−２）を与え、ＬＦ摂取群には対照群と同じラット用標準飼料に実施例２記載の医薬組成物粉末を４％添加した飼料（飼料中のＬＦ含量：０．４％）を与え、それぞれ４週間飼育した。同時に、若齢ラット群として、成熟期に達した５頭のラット（１０週齢若齢ラット）もＣＥ−２粉末を与えて４週間飼育した。

実験開始４週間後に各動物を屠殺し、それぞれの標本について涙腺摘出直前の体重および摘出直後の涙腺（左側）の重量を計測した。また、今回の光学顕微鏡および電子顕微鏡による観察には、対照群から６頭、ＬＦ摂取群から５頭をそれぞれ無作為に抽出した標本を用いた。それらの標本を用いて、常法にしたがって固定、脱水、包埋を行った後、準超薄トルイジン青染色切片ならびに超薄電子染色切片を作製し、光学顕微鏡および透過電子顕微鏡で観察した。なお、今回は老齢ラットにおけるラクトフェリン投与実験の評価を行う際に、成熟期に達した直後の若齢ラット（１０週齢若齢ラット）涙腺細胞の構造を参考とした。

涙腺の平均重量に関する所見
老齢ラットの対照群（９匹）における涙腺重量平均値は、０．１５ｇであり、ＬＦ摂取群（９匹）の涙腺重量平均値は、０．１８ｇであった。また、それぞれの個体における涙腺の対体重比を算出し、さらに各群における対体重比の算術平均を求めた結果、老齢対照群の対体重比平均値は０．０４５％であり、老齢ＬＦ摂取群においては０．０４９％であった。この実験では両群の間には統計学的有意差は認められなかったものの、以上のように涙腺の重量平均値および対体重比平均値ともに老齢ＬＦ摂取群が老齢対照群に比して僅かに大きい値となっていた。

涙腺細胞内の構造に関する光学顕微鏡的所見
エポキシ樹脂包埋の準超薄切片にトルイジン青染色を施して観察を行った結果、老齢ラット対照群の涙腺細胞内は、ほぼ均一の大きさでトルイジン青に均質に染色される顆粒状構造物（記載の便宜上、この顆粒を「Ａ顆粒」とする）によって占められている状態が多く認められた（図１；（ａ）は１００倍、（ｂ）は２５０倍）。また、それらの顆粒と同等ないしはやや大きい顆粒であってトルイジン青に淡染する明調顆粒も僅かに観察された。

老齢ＬＦ摂取群の涙腺細胞内には、老齢対照群で多く観察されるＡ顆粒もみられるが、中等度の大きさのトルイジン青に淡染する明調顆粒のほか、特に大型の明調顆粒が多数観察された（この種のトルイジン青に淡染する顆粒を「Ｂ顆粒」とする）（図２および３；図２（ａ）、（ｂ）および図３（ａ）は１００倍、図３（ｂ）は２５０倍）。また、Ｂ顆粒は大きいものほど不規則な外形を示す傾向があった。さらに拡大して観察を行うと、Ｂ顆粒内部の染色性は、近傍にみられる導管内部を満たしている構造物の染色性と類似した状態が認められた（図２（ｂ））。いずれにしても老齢ＬＦ摂取群においては、Ａ顆粒やＢ顆粒のほか、種々の染色性と大きさを示す顆粒状構造物が多数混在しているのが特徴的であった。

若齢ラットにおける涙腺細胞内の顆粒状構造物の分布および形態は、老齢のＬＦ摂取群と極めて類似した特徴を有していた（図４；（ａ）は１００倍、（ｂ）は２５０倍）。若齢ラットにおけるＢ顆粒の出現度を基準（＋＋）として、老齢ラットの涙腺細胞内に認められるＢ顆粒の出現度を評価した結果を表１に示す。

＊若齢ラットにおけるＢ顆粒の出現度を基準（＋＋）として、老齢ラットの各個体におけるＢ顆粒の出現状態を示す。（＋＋）は若齢ラットにおけるＢ顆粒の出現度と同程度、（＋＋＋）はそれより高い出現度を示し、（＋）はやや低く、（−）はかなり低い状態であることを示している。

老齢対照群においても一部の個体（個体番号Ｃ−９）では、若齢ラットと同程度のＢ顆粒の出現度を示す個体も認められたが、他の個体は＋ないし−となっており、Ａ顆粒が主体をなしていることがわかる。一方、ＬＦ摂取老齢ラット群では、いずれの個体も＋＋あるいは＋＋＋となっており、若齢ラットにおけるＢ顆粒の出現度と同等、あるいはそれ以上の結果を示している。

涙腺細胞内の構造に関する透過電子顕微鏡的所見
対照老齢ラットの涙腺細胞内にみられる顆粒の主体をなすＡ顆粒の内部は、電子密度がやや高く、ほぼ均一な大きさを示す微細粒子によって満たされていた（図５；（ａ）は２，９００倍、（ｂ）は５，８００倍）。一方、ＬＦ摂取老齢ラットに多数認められる大型のＢ顆粒の内部には、電子密度の高い羽毛状の構造物とそれらの構造物の間に介在するコロイド状の物質が観察された（図６および図７（ａ）；図６（ａ）は２，９００倍、図６（ｂ）は５，８００倍、図７（ａ）は７，３００倍）。また、これらの顆粒内にみられる羽毛状の構造物とコロイド状の物質は、その近傍の導管内にも認められた（図７（ｂ）；７，３００倍）。中等度の大きさのＢ顆粒は、互いに融合して不規則な外形をした大型のＢ顆粒になると思われる像も観察された。

ラクトフェリンを投与していない若齢ラットの涙腺細胞内にみられる顆粒の形態や顆粒内ならびに導管内の微細構造は、老齢ＬＦ摂取群のものと極めて類似した特徴を有していた（図８および図９；図８（ａ）は２，９００倍、図８（ｂ）、図９（ａ）および（ｂ）は７，３００倍）。

本発明の医薬組成物を経口摂取した老齢ラット（ＬＦ摂取老齢ラット群）においては、これを投与しなかった老齢ラット（対照老齢ラット群）に比して、涙腺細胞内に種々の大きさや構造を有する顆粒が豊富に認められ、それらの顆粒が互いに融合して大型化していくと思われる状態も観察された。また、大型のＢ顆粒内にみられる構造物（顆粒内構造物）は、近傍の導管内に認められる構造物と形態的に極めて類似していることから、大型のＢ顆粒は導管に排出される段階に近い状態にまで成熟した分泌顆粒であると考えられる。

以上の所見によって、比較的均一な大きさと構造を示す顆粒（Ａ顆粒）によって占められている対照老齢ラットの涙腺細胞に比べて、ラクトフェリンを投与した老齢ラットにおいては、分泌顆粒が旺盛に形成されている可能性が示唆された。

すなわち、大型のＢ顆粒がラクトフェリンを投与した老齢ラットの涙腺細胞内において極めて豊富に観察されるのは、ラクトフェリンの投与により、涙腺細胞の分泌機能が亢進していることを示す形態的特徴であると考えられる。

また、ラクトフェリンを投与していない若齢ラットの涙腺細胞における観察でも、ラクトフェリンを投与した老齢ラットとほぼ同様な所見が認められることから、ＬＦ摂取老齢ラット群にみられる構造的特徴は、ラクトフェリン投与の影響で生じた異常所見である可能性はないものと理解される。また、涙腺の重量平均値ならびに対体重比平均値ともに両群の間には統計学的有意差は認められなかったことから、ラクトフェリン投与が特に老齢ラットにおける涙腺の重量増加を促すように作用したのではなく、分泌機能の亢進に作用した可能性があると思われる。すなわち、加齢によって変性した組織の若返り活性をラクトフェリンが有することが確認された。

なお、通常のＬＦ投与実験では、ＬＦを２〜４％の割合で混和した飼料が多用されているが、本実験ではその１／１０に相当する正味０．２〜０．４％のＬＦを投与したにも関わらず、ＬＦの効果を認めることができた。これは、本実験で用いた医薬組成物が腸溶性製剤であることに起因する可能性も高い。本実験から腸溶性粉末ラクトフェリンの経口摂取により、老齢ラットにおける涙腺細胞の分泌機能が亢進すると思われる形態的特徴が認められた。

対照群の老齢ラット涙腺の光学顕微鏡像を示す写真である（（ａ）は１００倍、（ｂ）は２５０倍）。細胞内は殆ど小顆粒（Ａ）のみで占められている。ＬＦ摂取老齢ラット涙腺の光学顕微鏡像を示す写真である（（ａ）および（ｂ）ともに１００倍）。細胞内には小顆粒（Ａ）のほか、多数の大顆粒（Ｂ）が認められる。導管（ＥＤ）内にも大顆粒（Ｂ）の内容物と同様の染色性を示す構造物が認められる。ＬＦ摂取老齢ラット涙腺の光学顕微鏡写真像を示す写真である（（ａ）および（ｂ）ともに２５０倍）。細胞内には小顆粒（Ａ）のほか、多数の大顆粒（Ｂ）が認められる。若齢ラット涙腺の光学顕微鏡像を示す写真である（（ａ）は１００倍、（ｂ）は２５０倍）。ＬＦ摂取老齢ラットと同様に細胞内には小顆粒（Ａ）のほか、多数の大顆粒（Ｂ）が認められる。対照老齢ラット涙腺の透過電子顕微鏡像を示す写真である（（ａ）は２，９００倍、（ｂ）は５，８００倍）。細胞内は殆ど小顆粒（Ａ）のみによって占められている。ＬＦ摂取老齢ラット涙腺の透過電子顕微鏡像を示す写真である（（ａ）は２，９００倍、（ｂ）は５，８００倍）。細胞質には小顆粒（Ａ）のほか、中顆粒や多数の大顆粒（Ｂ）が認められる。ＬＦ摂取老齢ラット涙腺の透過電子顕微鏡像を示す写真である（（ａ）および（ｂ）ともに７，３００倍）。大顆粒（Ｂ）内部の構造物と類似した構造物が導管（ＥＤ）内にも観察される。若齢ラット涙腺の透過電子顕微鏡像を示す写真である（（ａ）は２，９００倍、（ｂ）は７，３００倍）。細胞内には小顆粒（Ａ）のほか、多数の大顆粒（Ｂ）が認められる。若齢ラット涙腺の透過電子顕微鏡像を示す写真である（（ａ）および（ｂ）ともに７，３００倍）。大顆粒（Ｂ）内部の構造物と類似した構造物が導管（ＥＤ）内にも観察される。

Claims

ラクトフェリンを有効成分として含有する経口腸溶性製剤である、涙腺細胞分泌機能亢進剤。
ラクトフェリンを有効成分として含有する経口腸溶性製剤である、眼精疲労、加齢性網膜黄斑変性症、緑内障、白内障又は老視改善剤。