JP4370395B2 - タンナーゼ、その遺伝子及びタンナーゼの製造法 - Google Patents
タンナーゼ、その遺伝子及びタンナーゼの製造法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンナーゼ活性を有する蛋白質(以下、タンナーゼという)、その遺伝子及びタンナーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンナーゼ（タンニンアシルヒドロラーゼ、EC3.1.1.20）は、タンニン酸等のデプシド結合を有するタンニンを加水分解し、例えば、m-ジ没食子酸（2分子の没食子酸がデプシド結合したタンニン酸の一種）を加水分解して2分子の没食子酸を生じる反応を触媒する。食品工業においてタンナーゼは、紅茶のクリームダウン防止剤あるいはビール製造時の清澄化等に使用される有用な酵素である。
【０００３】
従来、タンニンを分解できる各種自然界に存在する微生物又は植物の葉等から、タンナーゼ活性が報告されている。例えば、アスペルギルス属［アスペルギルス・オリゼ（非特許文献１参照）、アスペルギルス・ニガー (非特許文献２参照)、アスペルギルス・フラバス (非特許文献３参照)、アスペルギルス・ジャポニカス（非特許文献３参照）］、ペニシリウム属［ペニシリウム sp. (非特許文献４参照)］、カンジダ属(非特許文献５参照)、ストレプトコッカス・ボヴィス (非特許文献６参照)、バチルス・リケニフォルミス (非特許文献７参照)、ラクトバチルス属(非特許文献８参照)、クレブシエラ・ニューモニエ、コリネバクテリウム sp.(非特許文献９参照J)、ヨーロッパナラ（Quercus robur, syn. Q. pedunculate）の葉(非特許文献10参照)等に由来するタンナーゼが知られている。
【０００４】
従来公知で、諸性質が明らかにされている数種のタンナーゼは、いずれも反応至適温度範囲を40℃付近の中温域に有し、その熱安定性の程度は60℃を越える高温では失活するというものである。また反応至適pH範囲は、ほとんど全てに共通して弱酸性域、特にpH5.0〜5.5付近である。それ以外のタンナーゼは、活性が確認されているものの、タンナーゼの単離及びその詳細な酵素化学的性質の報告はない。すなわち、従来のタンナーゼは、酵素化学的性質からみたバリエーションが極めて少ないものであった。
【０００５】
工業的にタンナーゼを量産するための方法としては、アスペルギルス属に属するタンナーゼ生産菌を培地に培養し、培養物からタンナーゼを採取する方法、例えば、特許文献1及び２等が知られている。この方法により製造された酵素は各種用途に使用可能であるが、当然ながら製造されるタンナーゼは、従来知られたタンナーゼの酵素化学的性質を共通的に有するものであった。
【０００６】
【特許文献１】
特公昭56-8584号公報
【特許文献２】
特公平7-79687号公報
【０００７】
【非特許文献１】
Agric. Biol. Chem. 36, 1553, 1972
【非特許文献２】
J. Biol. Chem. 14, 159, 1913
【非特許文献３】
Leather Sci., 24, 8, 1977
【非特許文献４】
Leather Chem., 11, 93, 1965
【非特許文献５】
Agric. Biol. Chem. 40, p.79-85
【非特許文献６】
Appl. Environ. Microbiol., 56, p.829-831
【非特許文献７】
J. Basic Microbiol., 40(4), p.223-232, 2000
【非特許文献８】
Appl. Environ. Microbiol., Vol. 66, No. 7, p. 3093-3097, 2000
【非特許文献９】
J. Ferment. Technol., Vol. 61, No. 1, p. 55-59, 1983
【非特許文献１０】
Phytochemistry. Vol. 45, No. 8, p. 1555-1560, 1997
【非特許文献１１】
J. Basic Microbiol., 41(6), p.313-318, 2001
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、タンナーゼ、その遺伝子及びタンナーゼの製造法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者等は、鋭意検討の結果、従来報告されていた各種タンナーゼとは酵素化学的性質が顕著に異なる新規なタンナーゼを見出し、タンナーゼ遺伝子を単離することに成功し、更に、このタンナーゼ遺伝子を含有する微生物又は該タンナーゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、得られる培養物からタンナーゼを採取することに成功し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、
１．以下の(a)又は(b)のタンナーゼ活性を有する蛋白質、
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質
２．配列番号1で表されるアミノ酸配列と65％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質、
【００１１】
３．下記の理化学的性質を有し、タンナーゼ活性を有する蛋白質。
i）作用：タンニン酸等のデプシド結合を有するタンニンを加水分解する。
ii）至適pH及び安定pH範囲：至適pHはpH7.0〜pH7.5であり、安定pH範囲は30℃、80分間処理でpH2.5〜pH7.5である。
iii）熱安定性：クエン酸緩衝液（pH5.5）中、65℃で10分間処理後の残存活性は80％以上である。
iv）至適温度範囲：クエン酸緩衝液（pH5.5）中、60℃〜80℃である、
【００１２】
４．上記１、２又は３に記載のタンナーゼ活性を有する蛋白質生産能を有する微生物を培地に培養し、得られる培養物からタンナーゼを採取することを特徴とする前記蛋白質の製造法、
５．以下の(a)又は(b)のタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子、
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質
【００１３】
６．配列番号1で表されるアミノ酸配列と65％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子、
７．以下の(a)又は(b)のＤＮＡからなるタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子、
(a)配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００１４】
８． 上記５、６又は７記載のタンナーゼ遺伝子がベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮＡ、
９． アスペルギルス属に属し、上記８記載の組み換え体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、得られる培養物からタンナーゼ活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする前記蛋白質の製造法、
である。
なお、本明細書において、配列番号１で表されるアミノ酸配列及び配列番号２で表される塩基配列は、先の出願2001-403261号（出願日2001年12月27日）の明細書における配列番号29158及び29157とそれぞれ同一である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、発酵、醸造、酵素生産等に利用されるアスペルギルス属に属する微生物（麹菌）において、従来知られているタンナーゼ遺伝子と異なる塩基配列を有する遺伝子を同定し、該遺伝子を含む組み換えベクターをアスペルギルス属に属する微生物に導入することにより、従来知られているタンナーゼと比較して熱安定性に優れ、至適温度・至適pHが高温・中性域にあるタンナーゼを生産することに成功したものである。本発明のタンナーゼは、従来知られているタンナーゼがその酵素学的性質ゆえに利用できなかった分野にも利用可能であると考えられる。
【００１６】
〔１〕本発明の新規タンナーゼ
特定の実施形態においては、本発明のタンナーゼ（以下、文脈により「本酵素」という。）は、以下の理化学的性質を有する。
(1)作用：タンニン酸等のデプシド結合を有するタンニンを加水分解する。
（反応例：ジ没食子酸 ＋ H2O → 2没食子酸）
(2)至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：本酵素の至適ｐＨは、後述する測定法1で用いる緩衝液のｐＨを変化させ、各ｐＨにおける活性を測定して求めた。その結果は、図１に示す通りであり、本酵素の至適ｐＨはｐＨ6.5〜8.0、特にｐＨ7.0〜7.5付近である。又、安定ｐＨ範囲は、使用する酵素液を、ｐＨ1.5〜10.0の範囲において、30℃で80分間処理した後、残存活性を測定法１により測定して求めた。その結果は図２に示す通りであり、本酵素の安定ｐＨ範囲はｐＨ2.5〜7.5である。
【００１７】
(3)熱安定性：クエン酸緩衝液（ｐＨ5.5）中、各温度で10分間処理後の残存活性を測定法1に従って調べた。その結果は図4に示す通りであり、本酵素は、60℃まで安定であり、それを越えると徐々に失活し始め、80℃の熱処理でほぼ完全に失活する。各温度での残存活性は65℃で82％、70℃で63％、75℃で18％である。 (4)至適温度範囲：本酵素の至適温度は、後記の測定法1において、反応時の温度を変化させ、各温度における活性を測定して求めた。その結果は図3に示す通りであり、本酵素の至適温度は60℃〜80℃である。
(5)ｐＨ、温度等による失活の条件：本酵素はクエン酸緩衝液（ｐＨ5.5）中、30℃で80分間の処理では、前記の如くｐＨ2.5〜7.5で安定であり、それより酸性側及びアルカリ性側では失活が見られ、ｐＨ2.0以下及びｐＨ8.0以上では20％以上失活する(活性測定は、測定法１に従った)。
【００１８】
(6)基質特異性：タンニン酸、メチルガレート、エチルガレート、プロピルガレートに対して作用する。
また、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレートに対して作用する。これらの基質は、例えば、アスペルギルス・オリゼ由来酵素等の公知のタンナーゼで作用が確認されており、本酵素においても作用が確認されたものである。タンニン類には極めて多くの種類があるため、公知のタンナーゼについても、上記基質以外のタンニンに対する基質特異性は明らかでないのと同様に、上記基質以外のその他のタンニン類に対しても本酵素が作用しうる可能性を含んでいる。
(7)分子量：ゲル濾過法により測定した結果、分子量約25万、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した結果、分子量9万〜10万であり、糖鎖を有する。
【００１９】
本酵素と従来公知のタンナーゼとの理化学的性質の相違点を、表１に示す。尚、酵素Ａは、アスペルギルス・オリゼ由来（キッコーマン社酵素カタログ記載）、酵素Ｂは、アスペルギルス・アクレアタス由来(非特許文献11参照)、酵素Ｃは、バチルス・リケニフォルミス由来((非特許文献７参照)、及び酵素Ｄは、ヨーロッパナラの葉(非特許文献10参照)由来のタンナーゼを意味する。
【００２０】
【表１】
【００２１】
本発明のタンナーゼは本明細書記載の理化学的性質を有する限り、その由来により限定されるものではないが、好ましくは微生物由来の蛋白質であり、更に好ましくは糸状菌由来の蛋白質であり、更に好ましくはアスペルギルス属に属する糸状菌由来の蛋白質であり、最も好ましくは黄麹菌（アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ）由来の蛋白質である。更に、本発明のタンナーゼは遺伝子組換え技術により得られるタンナーゼも含むものである。
【００２２】
特定の実施形態においては、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質は配列番号１に表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。しかしながら、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質はタンナーゼ活性を有する限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質に限定されるものではない。すなわち、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数（好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜１０個、より好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質であり得る。ここで、「１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列」とあるのは、目的とするタンナーゼ活性が得られる限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列が、該アミノ酸配列とは異なる配列に付加されてもよく、又、該アミノ酸配列の一部が欠失又は置換されてもよいことを意味する。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１番目のメチオニンが欠失しても、本発明の目的とする熱安定性に優れ、高温・中性域で良く反応するタンナーゼ活性が得られる限り、かかる欠失した配列も本発明に含まれることを意味する。
【００２３】
また、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質は、配列番号１で表わされる全アミノ酸配列の30％以上を占める連続するアミノ酸配列領域と65％以上、好ましくは70％以上、更に好ましくは80％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質であり得る。更には、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質は、配列番号１で表わされる全アミノ酸配列の60％以上を占める連続するアミノ酸配列領域と65％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質であり得る。
【００２４】
更に、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質は、配列番号１で表わされる全アミノ酸配列の90％以上を占める連続するアミノ酸配列領域と65％以上、好ましくは70％以上、更に好ましくは80％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質であり得る。
次に、本酵素の力価の測定法について説明する。本酵素の活性測定は、下記の測定法１に従って行なった。尚、30℃においてタンニン酸中のエステル結合を、１分間に１μmol加水分解する酵素量を、１単位（Ｕ）とする。
【００２５】
〔測定法１〕アグリカルチュアル・バイオロジカル・ケミストリー（31巻、513頁〜518頁、1967年）に記載の方法を一部改変して本酵素の力価を測定する。すなわち、タンニン酸（ジ没食子酸）のエステル結合が加水分解される度合を、310nmの吸光度減少を分光光学的に測定することにより算出する。
【００２６】
具体的には、1.0 ml の基質溶液〔0.35％ タンニン酸(ジ没食子酸)を含有する50mM クエン酸緩衝液（ｐＨ5.5）〕を30℃、5分間平衡化し、適宜希釈したタンナーゼ溶液0.25mlを加え、30℃、15分間反応させる。次いで5.0mlの90％エタノールを混合して反応を停止後、この溶液を0.25ml採取して別の試験管に移し、5.0mlの90％エタノールを混合して希釈を行なう。次いで310nm における吸光度変化を、分光光度計（U-2001, 日立社製）を用いて測定する。酵素の代わりに緩衝液を加えて同様に測定したものをブランク値とし、ブランク値との測定値の差を酵素反応量とする。
【００２７】
〔２〕本発明の新規タンナーゼ遺伝子
特定の実施形態においては、本発明のタンナーゼ遺伝子は上記理化学的性質を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子であり得る。
更には、特定の実施形態においては、本発明のタンナーゼ遺伝子は配列番号２で表される塩基配列からなるタンナーゼ遺伝子であり得る。しかしながら、タンナーゼ活性を有する蛋白質をコードする限り、配列番号２で表される塩基配列からなるタンナーゼ遺伝子に限定されるものではない。すなわち、本発明のタンナーゼ遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子であり得る。
【００２８】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げると共に、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げると共に、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行ない得るものである。
【００２９】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてDNAプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、5 ×SSC 、1.0 %(W/V)核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、0.1 %(W/V)N-ラウロイルサルコシン、0.02 %(W/V)SDSを用い一晩（８〜１６時間程度）で行なう。洗浄は、0.1〜0.5×SSC、0.1%(W/V)SDS、好ましくは0.1×SSC 、0.1%(W/V)SDSを用い、15分間、2回行なう。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行なう温度は65℃以上、好ましくは68℃以上である。
【００３０】
また、本発明のタンナーゼ遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと70%以上、好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上の配列相同性を示し、かつタンナーゼの機能を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子であり得る。
【００３１】
上記のアミノ酸配列又は塩基配列の解析において、２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性を決定するために、先ず配列は、比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行なう。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。
２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
【００３２】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性は、Karlin 及び Altschulのアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990及びProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)により決定される。このようなアルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltschul等によって開発された(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)。更に、Gapped BLASTはBLASTより感度よく配列相同性を決定するプログラムである(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００３３】
ただし、上記BLASTソフトウェアで有意な配列相同性を示す配列が見つからない場合には、更に高感度なFASTAソフトウェア（W.R. Pearson and D.J. Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988）を用いて配列相同性を示す配列をデータベースから検索することもできる。FASTAソフトウェアは、例えば、ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメーターは、デフォルト値を用いる。例えば、塩基配列についての検索を行なう場合は、データベースにnr-ntを用い、ktup値は6を用いる。
【００３４】
上記の各方法は、主にデータベース中から配列相同性を示す配列を検索するために用いられるが、個別の配列の配列相同性を決定する手段として、本発明では、Genetyx Mac Ver（トウエア開発社）のホモロジー解析を用いることができる。この方法は、高速、かつ高感度な方法として多用されているLipman-Pearson法(Science, 227:1435-1441, 1985)に基づくものである。塩基配列の配列相同性を解析する際は、可能であれば蛋白質をコードしている領域（CDS又はORF）を用いる。パラメーターとしては、Unit Size to compare = 2 , Pick up Location = 5とし、結果を％表示させる。最も高いポイントを示したアラインメントの配列相同性を結果として用いるが、問い合わせ配列の30%以上、50%以上、又は70%以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないため、２つの配列間の配列相同性を示す値としては用いない。例えば、数塩基／残基程度の完全一致領域があったとしても、それは偶然の結果に過ぎない可能性が高く、また、全体の数％程度の長さにおける一致では、特定の機能モチーフが含まれていたとしても、全体として同じ機能を果たすと考えることは困難である。
【００３５】
〔３〕微生物を用いた本酵素の生産
本酵素を製造するために使用される微生物としては、本酵素の生産能を有する限り、遺伝子組換えの有無に関わらず、いかなる微生物を使用してもよく、好ましくは糸状菌、更に好ましくはアスペルギルス属に属する糸状菌が使用される。具体的には、例えば、アスペルギルス・オリゼ RIB40(ATCC 42149)等を挙げることができる。また、該菌株の変異株を用いることも可能である。該菌株の変異株を得る方法としては、例えば、ラジオアイソトープ、紫外線、ニトロソグアニジン等を用いて原株に突然変異を起こさせる方法を用いることができる。
【００３６】
当然のことながら、本酵素の生産に使用する微生物は、本酵素の生産能を有すると同時に、例えば従来のタンナーゼの生産能を兼ね備えたものであってもよい。そのような微生物としては、本来両方のタンナーゼの生産能を兼ね備えたものや、本来ある種のタンナーゼの生産能を有する微生物に、別種のタンナーゼをコードする遺伝子を導入して複数種のタンナーゼの生産能を兼ね備えさせたものが含まれる。複数種のタンナーゼの生産能を兼ね備えた微生物を、各種の培養条件下で培養することによって、目的に応じ、各タンナーゼの生産比率を任意に変化させて酵素生産させることも可能である。
【００３７】
上記の微生物を培地に培養し、得られる培養物から本酵素を採取する。培養法は、通常の固体培養法でもよく、液体培養法を採用することが好ましい。培地は、微生物を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。
【００３８】
炭素源としては、資化可能な炭素化合物、例えば、グルコース、マルトース、デンプン加水分解物、グリセリン、フラクトース、糖蜜等が使用される。又、窒素源としては、利用可能な窒素化合物、例えば、酵母エキス、ペプトン、ソイトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、大豆もしくは小麦ふすま侵出液、アミノ酸、硫安、硝酸アンモニウム等が使用される。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等の種々の塩類、ビタミン類、消泡剤等が使用される。これらの培地成分は、単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００３９】
微生物の培養は、使用する微生物の性質及び培地の形状に応じて通気撹拌培養、振盪培養、静置培養等を適宜選択し、培地の初発ｐＨを６〜７程度に調整した後、25〜35℃、好ましくは30℃前後で24〜140時間、好ましくは60〜100時間行えばよい。培養終了後、培養物より本酵素を採取するためには、通常の酵素採取手段を用いることができる。すなわち、酵素が菌体外部に放出される場合には、濾過又は遠心分離等により菌体を分離して、酵素液を含む培養液を回収することができる。また酵素が菌体内部に存在する場合には、超音波破砕機、フレンチプレス、リゾチーム等の細胞壁溶解酵素、界面活性剤等を用いて、濾過又は遠心分離等により分離した菌体から酵素を抽出し、次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去することにより、本酵素を含有する粗酵素液を得ることができる。
【００４０】
このようにして得られた粗酵素液から、本酵素を更に精製するには、通常の蛋白質精製法を使用することができる。具体的には、例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等を単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００４１】
〔４〕遺伝子工学的手法による本酵素遺伝子のクローニング及び本酵素の生産
以下に、本をコードする遺伝子（以下、文脈により「tan遺伝子」という）を含むＤＮＡが挿入された組み換え体ＤＮＡにより宿主細胞を形質転換又は形質導入し、得られた組み換え微生物を用いて本酵素を生産する方法について詳細に説明する。
【００４２】
１．tan遺伝子のクローニング
tan遺伝子を含むＤＮＡは、染色体ＤＮＡ、又はｃＤＮＡ由来の野生型遺伝子をクローニングすることにより得られる。又、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）を行なうことにより該遺伝子を増幅することもできる。更には化学合成法を用いて該遺伝子を構築することも可能である。以下、アスペルギルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型にPCRによりtan遺伝子をクローニングする方法を例にとり、tan遺伝子を含むＤＮＡの単離法について説明する。
【００４３】
PCR法によるtan遺伝子の増幅に鋳型ＤＮＡとして用いる染色体ＤＮＡは、本発明のタンナーゼ遺伝子を有する微生物由来であればいかなる微生物由来の染色体ＤＮＡでも用いることができる。これらの微生物として、例えば、アスペルギルス・オリゼRIB40(ATCC 42149)株等が挙げられる。プライマーとしては、tan遺伝子を含むDNA断片の増幅が可能であればいかなる配列のプライマーを用いてもよい。その例としては、配列番号３、４で表されるプライマー等が挙げられる。
【００４４】
PCR反応に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、TaKaRa Ex Taq（タカラバイオ株式会社製）、KOD DNA Polymerase（東洋紡績株式会社製）等を用いることが可能であるが、PCR反応時における増幅ミスの割合が低いKOD DNA Polymerase（東洋紡績株式会社製）等を用いることが好ましい。
【００４５】
PCRの反応条件は、上記染色体ＤＮＡ、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、tan遺伝子を含む特異的増幅産物を得ることができればいずれの反応条件を用いてもよい。その例としては、実施例１記載のPCR反応条件等が挙げられる。また、本発明のタンナーゼ遺伝子を有する微生物から染色体ＤＮＡを抽出する方法としては、公知のいずれの方法も使用できる。その例としては、飯村等の方法〔Agric. Biol. chem. 323-328, 51 (1987)〕等が挙げられる。
【００４６】
上記染色体ＤＮＡ、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、上記反応条件でPCRを実施することにより約1.8kb特異的増幅産物を得ることができる。該増幅産物の塩基配列は、染色体上の本発明のタンナーゼ遺伝子の塩基配列と同様の配列を有していることが期待される。しかしながら、場合によってはPCR反応中の増幅ミスにより、染色体上の本発明のタンナーゼ遺伝子の塩基配列と異なる塩基を有していることがあり、増幅ミスの有無を確認する必要がある。PCR反応中の増幅ミスの確認は、複数の増幅産物のシークエンスを行なうことにより以下の通り実施することができる。
【００４７】
個別のチューブを用いてPCRを行なうことにより得られた複数の増幅産物を、適当な制限酵素で処理・精製後、あるいは無処理で、ベクターＤＮＡ、例えば、プラスミドpUC18（タカラバイオ株式会社製）、pUC118（タカラバイオ株式会社製）、温度感受性バクテリオファージ（特開昭58-212781 号公報、FERM BP-133 等）の適当な制限酵素ゼ部位に挿入して組み換え体ＤＮＡを作成し、該組み換え体ＤＮＡを用いて、宿主細胞、例えば、大腸菌JM109（タカラバイオ株式会社製）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組み換え体ＤＮＡを、QIAGEN Plasmid Mini Kit（フナコシ社製）等を用いて精製する。
【００４８】
このようにして得られた組み換え体ＤＮＡに挿入されている各増幅産物の塩基配列の決定は、ジデオキシ法(Methods in Enzymology,101,20-78,1983）等により行なうことができる。シークエンスを行なった各増幅産物の塩基配列のうち、全ての塩基について、対応する他の増幅産物の塩基と高い相同性を有している塩基配列を、染色体上の本発明のタンナーゼ遺伝子の塩基配列と同様の配列とみなすことができ、該塩基配列を有する増幅産物をtan遺伝子を含むＤＮＡとすることができる。該塩基配列を配列番号２に、配列番号２に示した塩基配列に基づいて確定した本発明の新規タンナーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００４９】
２．組み換え体ＤＮＡの構築と組み換え微生物の取得
本酵素を得るためには、tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを構築し、該組換え体ＤＮＡにより形質転換され、本酵素を生産し得る組み換え微生物を取得する必要がある。以下に、tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡの構築と、該組換え体ＤＮＡを用いた微生物の形質転換方法について説明する。
【００５０】
形質転換に宿主として用いる微生物としては、tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡによる形質転換により、本酵素を生産することができる微生物であればいかなる微生物も用いることができるが、好ましくは糸状菌、更に好ましくはアスペルギルス属に属する微生物、更に好ましくは黄麹菌、最も好ましくは、アスペルギルス・オリゼが挙げられる。
【００５１】
tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡの構築に用いるベクターＤＮＡは、宿主細胞を形質転換する機能例えば、薬剤耐性、栄養要求性等のマーカー遺伝子、及び、宿主細胞で機能し得るプロモーター、ターミネーター等のtan遺伝子の発現に必要な機能を有している限りいかなるベクターＤＮＡも使用することができる。但し、tan遺伝子の発現に必要な機能については、挿入するtan遺伝子を含むＤＮＡ断片が、その機能を有している場合は必ずしも必要ではない。又、co-transformation法により形質転換を行なう場合には、ベクターＤＮＡ上に必ずしもマーカー遺伝子を有する必要はない。
【００５２】
tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡは、PCR増幅ミスがないことを確認したtan遺伝子を含む増幅産物を上記ベクターＤＮＡとtan遺伝子の発現が可能な形で結合することにより構築することができる。すなわち、シークエンスに用いたtan遺伝子を含むプラスミドより、適当な制限酵素、例えば、EcoRＩ及びSmaＩで切り出したtan遺伝子を含むDNA断片を、実施例２記載のpAP等のベクターＤＮＡの適当な制限酵素部位、例えば、EcoRＩ-SmaＩ部位にtan遺伝子の発現が可能な形で挿入することにより構築することができるる。
【００５３】
tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを用いて微生物を形質転換する方法は、宿主として用いる微生物及びtan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡに用いたマーカー遺伝子により異なるが、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、宿主としてアスペルギルス・オリゼniaD-株を用い、マーカーとしてアスペルギルス・オリゼ由来のniaD遺伝子を用いる場合は、〔Mol.Gen.Genet (1989)218:99-104〕記載の方法を、宿主としてアスペルギルス・オリゼargB-株を用い、マーカーとしてアスペルギルス・オリゼ由来のargB遺伝子を用いる場合は、〔Biosci.Biotechnol.Biochem.,64(4),816-827,2000〕記載の方法を用いることができる。
【００５４】
３．組み換え微生物による本酵素の生産
上記tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを保有する組み換え微生物を培養すれば、本酵素を生産することができる。培養方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好ましい。
【００５５】
組み換え微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、ソイトン、肉エキス、コーンスティープリカー又は大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等から選ばれる１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄又は硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン、tan遺伝子を発現させるプロモーターを誘導するための基質等を適宜添加したものが用いられる。
【００５６】
培地の初発ｐＨは６〜７に調節するのが適当である。培養は、25〜35℃、好ましくは30℃前後で60〜100時間、通気撹拌培養、振盪培養、静置培養等により行なうことが好ましい。培養終了後、培養物より本酵素を採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。すなわち、酵素が菌体外部に放出される場合には、濾過又は遠心分離等により菌体を分離して、酵素液を含む培養液を粗酵素液として回収する。また酵素が菌体内部に存在する場合には、超音波破砕機、フレンチプレス、リゾチーム等の細胞壁溶解酵素、界面活性剤等を用いて、濾過又は遠心分離等により分離した菌体から酵素を抽出し、次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去することにより、本酵素を含有する粗酵素液を得ることができる。本発明では、このようにして得られた粗酵素液をそのままタンナーゼ標品としてもよく、以下の精製手法によりさらに純度を高めてもよい。
【００５７】
上記の粗酵素液から、本酵素を更に精製するには、通常のタンパク質精製法を使用することができる。具体的には、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等が、単独又は適宜組み合わせて用いられる。
【００５８】
本酵素は、広範な安定ｐＨ範囲並びに優れた熱安定性をともに兼ね備えている。従って、本酵素は、例えば、試薬、食品加工用助剤として利用する場合に、ｐＨ又は温度等の使用環境が変化したときの影響を受けにくく、安定性に優れている点で、公知のタンナーゼよりも優れている。また本酵素は、至適pH範囲が公知のものより中性域に存在しており、公知のタンナーゼでは充分な作用効果が期待できなかったpH域における新たな用途、利用できる食品のバリエーションを提供することが期待される。
【００５９】
例えば、弱酸性域でよく作用する公知のタンナーゼは、このpH領域に含まれる緑茶あるいは紅茶、また果汁等の飲料に対して使用する際には、反応至適pH付近で反応するため好適であった一方で、野菜汁や、抽出後に色調を強めるため中性付近までpH調整されたウーロン茶には、反応至適pHを外れていることから、活性が顕著に低下し、充分な効果を示せないか、必要な効果を得るためには多量の酵素を使用しなければならない、あるいは酵素処理のために一時的にpHを変える処理工程を必要とする等の問題を抱えていた。このようなpH領域の飲料・食品に対して本発明のタンナーゼを使用すれば、反応至適pH付近で反応するため、迅速に、より少量の酵素使用で、充分な効果をあげることが可能となる。
【００６０】
更に本酵素は、失活を起こす温度及び至適温度範囲が公知のタンナーゼより高温域に存在しており、食品加工等に使用するにあたり、加熱工程との共存がより容易であるという点でも、公知のタンナーゼでは行なえない使用法のバリエーションを提供する。例えば、茶飲料等は製法上、茶葉を熱湯抽出して製造するが、この茶抽出液にタンナーゼを作用させたい場合、公知のタンナーゼでは、酵素が熱失活しない温度まで充分に茶抽出液の温度を下げる必要があった。この点で、本発明の熱安定性に優れ、高温・中性域で良く反応するタンナーゼを使用する場合には、茶抽出液の温度を下げる工程を大幅に短縮するあるいは省くことが可能になる。
【００６１】
本発明のタンナーゼは、60℃〜80℃という高温で好適に作用するので、熱水抽出工程中に、抽出を行ないながら、酵素反応を行なわせることも可能になる。このことは、抽出及び酵素反応の２工程を1工程で済ませることにつながり、効率よい生産に寄与する。また、タンナーゼの作用の中に、茶抽出物中のタンニンを分解して沈澱や混濁を防止する効果があるが、抽出しながら酵素反応を進めることにより、沈澱・混濁を除去しつつ、より高濃度の茶抽出を実現することも可能になる。なお、本発明のタンナーゼは、実用上高い熱安定性を有しつつも、通常の飲料製造で広く用いられる加熱殺菌条件、例えば、達温95℃等の条件で、迅速に完全に失活するため、製造工程中、失活のために特別の加熱工程を組み入れる必要を生じない。
【００６２】
【実施例】
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６３】
〔実施例１〕
アスペルギルス・オリゼtan遺伝子の取得
アスペルギルス・オリゼ RIB40株(ATCC 42149)の胞子をYPD培地100 mlに植菌し、温度30℃で一晩振盪培養した。その後、飯村〔Argric. Biol. Chem. 323-328, 51 (1987)〕の方法に従ってゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡ断片を鋳型として、アスペルギルス・オリゼのゲノムデータベースを参考に作成した下記のプライマーを用いてPCRを行なった。
5'-cttggaattctctcgaataaaaatgagg-3' （配列番号 3）
5'-ctaaatacccgggctatgacatgacattc-3' （配列番号4 ）
PCR反応は、KOD DNA Polymerase (東洋紡績株式会社製)を使用し、PTC-200 DNA Engine(MJ Research社製)により行なった。反応液の組成は以下の通りである。
【００６４】
（試薬：使用量）
H2O：36μl
10×Reaction Buffer #1：5μl
2 mMdNTP Mix：5μl
20μMプライマー2種類：各1μl
鋳型 (ＤＮＡ 0.5μg)：1μl
KOD DNA Polymerase：1μl
合計液量：50μl
【００６５】
上記の反応液50μlを0.2 ml反応チューブ中で混合してＤＮＡサーマルサイクラーにセットし、以下のような温度設定によりPCRを行なった。PCRにより得られた約1.8kbの増幅産物をエタノール沈殿処理後、EcoRI及びSmaIで消化した。
95℃、2分 ：1サイクル
95℃、30秒、 58℃、30秒 72℃、2分30秒 ：30サイクル
72℃、3分 ：1サイクル。
【００６６】
EcoRI及びSmaI消化後の上記増幅産物をEcoRI及びSmaIで消化後、精製したプラスミドpUC18のEcoRI-SmaI部位に連結し、大腸菌JM109(ATCC 53323)の形質転換及びクローニングを行なった。目的のＤＮＡ断片を有する大腸菌６クローンからプラスミドを調製し、クローニングしたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。各ＤＮＡ断片の塩基配列を比較し、PCR増幅時の増幅ミスを含まないと思われる増幅産物を含むプラスミドをpUCtan-4とした。pUCtan-4に挿入されたPCR増幅産物の塩基配列を配列番号２に示す。
【００６７】
〔実施例２〕
麹菌発現ベクターの構築
アスペルギルス・オリゼのアミラーゼプロモーターを有する発現ベクタープラスミドpMAR5(Biosci. Biotech. Biochem., 56:1674-1675, 1992)のマーカー遺伝子であるargB遺伝子を、アスペルギルス・オリゼのpyrG遺伝子と交換したプラスミドを作成した。pMAR5を制限酵素SphIで消化し、末端平滑化処理後、更にSalIで消化し、0.7%アガロースゲルで電気泳動し、約４kbの断片を回収した。
【００６８】
一方、ppyrG-26(特開2001-46053号公報記載)をBamHIで消化し、末端平滑化処理後、更に、SalIで消化し、0.7%アガロースゲルで電気泳動し、pyrG遺伝子を含む約2.2kbのＤＮＡ断片を回収した。これらの断片をライゲーションし、そのベクターにより大腸菌JM109株を形質転換した。得られたプラスミドをpAPとした。このプラスミドは、pyrG遺伝子を選択マーカーとして有し、アミラーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーターの間にEcoRI-SmaIサイトを有する発現ベクターであり、EcoRI-SmaIサイトにプロモーターと同じ方向で遺伝子のORFを組み込み、麹菌を形質転換することにより、アミラーゼ遺伝子プロモーターの制御下で目的の遺伝子を発現することができるものである。
【００６９】
pUCtan-4をEcoRI-SmaIで消化後、クローニングしたＤＮＡ断片を単離、精製し、pAPのEcoRI-SmaI部位に連結したのち大腸菌JM109の形質転換を行なった。得られた形質転換体より回収したプラスミドのうち、pAPのEcoRI-SmaI部位にクローニングしたＤＮＡ断片が目的通りに連結されたプラスミドをpAPtan-4とした。
【００７０】
〔実施例３〕
麹菌形質転換体の取得
アスペルギルス・オリゼ RIB40株(ATCC 42149)から特開2001-46053号公報記載方法で取得したpyrG欠損株をpAPtan-4で形質転換した。形質転換法は、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Mol. Gen. Genet., 218:99-104, 1989）によって行なった。pAPtan-4を3μg用いて形質転換し、最少培地で形質転換体を選択したところ、約100個のコロニーを得た。
【００７１】
2％デキストリン、1％ポリペプトン、0.5％ KH2PO4、0.05 ％MgSO4を含むアミラーゼプロモーター誘導培地（pH6.0）50mlに、上記各形質転換体の分生子約106個を接種し、温度30℃、50時間、振盪培養した。培養後の上清をUltrafree-MC（MILLIPORE社製）にかけ、菌体を完全に除去した後、各濾過液3μlをタンナーゼ活性アッセイプレート（0.2％ NH4H2PO4、0.2％ KH2PO4、0.1％ MgSO4、1％ Glucose、1％ Tannic acid、2％ agar、pH7.5）に滴下した。30℃で48時間静置培養した後、滴下した培養上清による培地中のタンニン酸の分解が観察された形質転換体RIB40tan-2株を選択した。
該形質転換株、アスペルギルス・オリゼ （RIB40tan-2）は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM BP-8180として寄託されている。
【００７２】
〔実施例４〕
組み換え微生物による本酵素の生産
(1) 種菌（胞子懸濁液）の調製
上記方法により作製した組み換え麹菌アスペルギルス・オリゼ（RIB40tan-2）を、マルツ寒天培地（純正化学社製）上で30℃、7日間培養した。得られたコロニー上に形成された胞子を、スキムミルク溶液（10％スキムミルク、5％サッカロース、1％グルタミン酸ナトリウム）で掻き取り、約107個/mlの胞子懸濁液を調製して凍結保存した。
【００７３】
(2) 微生物の培養
酵素生産用培地（4％デキストリン、2％ポリペプトン、1％酵母エキス、0.5％ KH2PO4、0.05％MgSO4、ｐＨ6.0）400mlを入れた2000ml容三角フラスコ5個に、アスペルギルス・オリゼ(RIB40tan-2)の胞子懸濁液0.8mlを植菌し、30℃で60時間振盪培養した後、濾紙濾過により菌体を除去し、培養液約1.8Ｌを得た。
【００７４】
(3)タンナーゼの精製
得られた培養液に硫安を添加し、飽和硫安濃度60％〜100％で回収される沈澱を緩衝液A［30％飽和硫安含有20mM 酢酸緩衝液（ｐＨ5.0）］にて溶解し、約130mlの酵素溶液を得た。次いで、該酵素溶液を、緩衝液Aで平衡化したフェニル-セファロースCL-4Bカラムに供した。カラムを緩衝液Aで洗浄した後、30%〜0％の飽和硫安含有20mM 酢酸緩衝液（ｐＨ5.0）の直線濃度勾配法により吸着画分を溶出した。溶出液を分取し、各画分のタンナーゼ活性を測定法１に従って調べた。タンナーゼ活性を有する画分を、セントリコン−30（アミコン社製）を用いて限外濃縮・透析し、硫安を除去した。
【００７５】
濃縮処理後の活性画分の一部を、0.1M NaCl含有20mM酢酸緩衝液pH5.5にて平衡化したTSK-gelG3000SWXL（東ソー社製）を用いたゲル濾過ＨＰＬＣに供し、溶出液を280nmの吸光度でモニターし、分取画分の活性を測定した。その結果、本酵素がシングルピークとなるまでに精製されていることを確認した。標準分子量マーカーの溶出位置から推定された本酵素の分子量は約25万であった。
【００７６】
また上記の方法により得られた活性画分の一部を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動終了後にゲルの染色を行ない、本酵素が単一バンドとなるまでに精製されていることを確認した。本酵素のバンドはブロードになり、公知のタンナーゼ、例えば、アスペルギルス・オリゼ由来の酵素と同様に、糖鎖を有していることが確認された。分子量は約9〜10万であった。また、本酵素液の一部をN-グリコシダーゼ（グリコペプチダーゼＦ、タカラバイオ株式会社製）を用いて処理し、糖鎖を除去したものを同様にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したものでは、ブロードなバンドは消失し、代わって分子量約6万のシャープな単一バンドが確認された。このことより、糖鎖のつかない本酵素蛋白質のサブユニット分子量は約6万であることが確認され、この分子量は、本発明中に開示した遺伝子の配列から算出される大きさと一致していた。
【００７７】
(4)タンナーゼの酵素化学的性質
本酵素と公知タンナーゼとの比較結果は、前記表１に示す通りである。表１から明らかなように、本酵素は、至適ｐＨ範囲がいずれの公知酵素よりも中性側にあり、中性条件下で良好に作用する。至適温度は公知酵素が中温域から上限60℃であるのに対し、60℃〜80℃と、顕著に高温域で良好に作用する。安定ｐＨ範囲は酸性域から弱アルカリ性に渡っており、広範囲である。そして、熱安定性についても、65℃で82％、70℃で63％、75℃で18％の活性を保持し、熱安定性に優れている。公知酵素はいずれも至適pHが弱酸性域にあり、本酵素が良好に作用する中性pH域での反応性は低い。
【００７８】
アスペルギルス・オリゼ由来の酵素（酵素Ａ）及びヨーロッパナラ由来の酵素（酵素Ｄ)の至適温度は40℃及び35℃〜40℃である。これらは中温域で良好に反応する一方、本酵素が良好に作用する高温域では反応性が顕著に低い。同時に、このような高温では活性が大きく低下するため、高温域では実用に供することができない。
【００７９】
アスペルギルス・アクレアタス由来の酵素（酵素Ｂ）及びバチルス・リケニフォルミス由来の酵素（酵素Ｃ）の至適温度は、やや高温域の50℃〜60℃にあり、アスペルギルス・オリゼ由来の酵素（酵素Ａ）あるいはヨーロッパナラ由来の酵素（酵素Ｄ)よりは高温域で使用することができる。しかし、茶飲料の熱抽出等に想定される、より高温域での使用は困難である。最も熱安定性の高いアスペルギルス・アクレアタス由来の酵素（酵素Ｂ）の細胞内酵素も、70℃で活性の70％を失うためである。また、その他の公知酵素同様に、至適pHは弱酸性域にあり、本酵素が良好に作用する中性pH域での反応性は低く、中性域で使用したい場合には、多量の酵素を使用しなければならない。更に重要なこととして、公知の全ての酵素は中性域での安定性に問題があるため、中性域で反応中に迅速に失活を起こし、目的の反応を完了することができなくなる恐れを有している。
【００８０】
上述のように本酵素は、至適pH及び至適温度範囲が公知の各種タンナーゼと異なっていることから、異なる用途、使用場面を提供し、特に公知酵素では効果を上げにくかった中性条件及び高温条件下の使用において特に優れていることは明らかである。更に、本酵素は、本酵素自身の至適pH及び至適温度範囲を外れた、例えば、公知酵素の至適pHである弱酸性条件及び公知酵素の至適温度範囲である中温域条件下においても、実用上充分な活性を有しているという点で、従来、公知酵素が用いられる場面においても、充分に使用可能である。
【００８１】
例えば、本酵素は60℃〜80℃でほぼ100％の活性を示すのに対し、40℃で50％、45℃で75％、50℃で80％の活性を示す。これは、本酵素が中温域から高温域まで広範な温度範囲で良好に反応できることを示す。また、本酵素はpH7.0〜7.5で100％の活性を示すのに対し、pH5.0でも38％、pH6.0では60％の活性を示す。これは、本酵素が弱酸性域においても実質的に良好に反応できることを示す。一方、公知のアスペルギルス・オリゼ由来の酵素（酵素Ａ）では60℃以上で酵素活性はなく、またpH7.0での活性は至適pH5.5の時の20％に過ぎない。このことから、本酵素は、その汎用性においても、公知酵素より優れている。即ち、これら各種の公知酵素に対し、本酵素は、各種食品加工の実際の使用工程中に利用するにあたり、優れている、また、公知酵素では好適に使用できなかった新たな使用場面を提供するものと考えられる。
【００８２】
以上より、本酵素は、試薬あるいは食品加工等の用途に利用する場合に、ｐＨ又は温度等の試験環境が変化したときの影響を受けにくく、その取扱いが容易で利用しやすいと考えられることから、公知のタンナーゼよりも優れているといえる。更に、汎用性が高く、公知のタンナーゼでは使用しにくかった新たな用途・使用工程に対しでも好適に使用することができ、タンナーゼの実用化のバリエーション化に貢献するものであるといえる。
【００８３】
【発明の効果】
本発明により、熱安定性に優れ、高温・中性域で良く反応するタンナーゼ及び該タンナーゼをコードする遺伝子が提供され、また、本酵素を効率よく大量に生産することができる。本酵素は熱安定性に優れ、中性域でよく作用し、また高温下でよく作用するという、新規な酵素化学的性質を有しているため、試薬、食品加工を始めとする各種産業分野において好適に使用できる。
【００８４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本酵素の至適pH範囲を示す図。
【図２】本酵素の安定pH範囲を示す図。
【図３】本酵素の至適温度範囲を示す図。
【図４】本酵素の熱安定性範囲を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンナーゼ活性を有する蛋白質(以下、タンナーゼという)、その遺伝子及びタンナーゼの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンナーゼ（タンニンアシルヒドロラーゼ、EC3.1.1.20）は、タンニン酸等のデプシド結合を有するタンニンを加水分解し、例えば、m-ジ没食子酸（2分子の没食子酸がデプシド結合したタンニン酸の一種）を加水分解して2分子の没食子酸を生じる反応を触媒する。食品工業においてタンナーゼは、紅茶のクリームダウン防止剤あるいはビール製造時の清澄化等に使用される有用な酵素である。
【０００３】
従来、タンニンを分解できる各種自然界に存在する微生物又は植物の葉等から、タンナーゼ活性が報告されている。例えば、アスペルギルス属［アスペルギルス・オリゼ（非特許文献１参照）、アスペルギルス・ニガー (非特許文献２参照)、アスペルギルス・フラバス (非特許文献３参照)、アスペルギルス・ジャポニカス（非特許文献３参照）］、ペニシリウム属［ペニシリウム sp. (非特許文献４参照)］、カンジダ属(非特許文献５参照)、ストレプトコッカス・ボヴィス (非特許文献６参照)、バチルス・リケニフォルミス (非特許文献７参照)、ラクトバチルス属(非特許文献８参照)、クレブシエラ・ニューモニエ、コリネバクテリウム sp.(非特許文献９参照J)、ヨーロッパナラ（Quercus robur, syn. Q. pedunculate）の葉(非特許文献10参照)等に由来するタンナーゼが知られている。
【０００４】
従来公知で、諸性質が明らかにされている数種のタンナーゼは、いずれも反応至適温度範囲を40℃付近の中温域に有し、その熱安定性の程度は60℃を越える高温では失活するというものである。また反応至適pH範囲は、ほとんど全てに共通して弱酸性域、特にpH5.0〜5.5付近である。それ以外のタンナーゼは、活性が確認されているものの、タンナーゼの単離及びその詳細な酵素化学的性質の報告はない。すなわち、従来のタンナーゼは、酵素化学的性質からみたバリエーションが極めて少ないものであった。
【０００５】
工業的にタンナーゼを量産するための方法としては、アスペルギルス属に属するタンナーゼ生産菌を培地に培養し、培養物からタンナーゼを採取する方法、例えば、特許文献1及び２等が知られている。この方法により製造された酵素は各種用途に使用可能であるが、当然ながら製造されるタンナーゼは、従来知られたタンナーゼの酵素化学的性質を共通的に有するものであった。
【０００６】
【特許文献１】
特公昭56-8584号公報
【特許文献２】
特公平7-79687号公報
【０００７】
【非特許文献１】
Agric. Biol. Chem. 36, 1553, 1972
【非特許文献２】
J. Biol. Chem. 14, 159, 1913
【非特許文献３】
Leather Sci., 24, 8, 1977
【非特許文献４】
Leather Chem., 11, 93, 1965
【非特許文献５】
Agric. Biol. Chem. 40, p.79-85
【非特許文献６】
Appl. Environ. Microbiol., 56, p.829-831
【非特許文献７】
J. Basic Microbiol., 40(4), p.223-232, 2000
【非特許文献８】
Appl. Environ. Microbiol., Vol. 66, No. 7, p. 3093-3097, 2000
【非特許文献９】
J. Ferment. Technol., Vol. 61, No. 1, p. 55-59, 1983
【非特許文献１０】
Phytochemistry. Vol. 45, No. 8, p. 1555-1560, 1997
【非特許文献１１】
J. Basic Microbiol., 41(6), p.313-318, 2001
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、タンナーゼ、その遺伝子及びタンナーゼの製造法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者等は、鋭意検討の結果、従来報告されていた各種タンナーゼとは酵素化学的性質が顕著に異なる新規なタンナーゼを見出し、タンナーゼ遺伝子を単離することに成功し、更に、このタンナーゼ遺伝子を含有する微生物又は該タンナーゼ生産能を有する微生物を培地に培養し、得られる培養物からタンナーゼを採取することに成功し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、
１．以下の(a)又は(b)のタンナーゼ活性を有する蛋白質、
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質
２．配列番号1で表されるアミノ酸配列と65％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質、
【００１１】
３．下記の理化学的性質を有し、タンナーゼ活性を有する蛋白質。
i）作用：タンニン酸等のデプシド結合を有するタンニンを加水分解する。
ii）至適pH及び安定pH範囲：至適pHはpH7.0〜pH7.5であり、安定pH範囲は30℃、80分間処理でpH2.5〜pH7.5である。
iii）熱安定性：クエン酸緩衝液（pH5.5）中、65℃で10分間処理後の残存活性は80％以上である。
iv）至適温度範囲：クエン酸緩衝液（pH5.5）中、60℃〜80℃である、
【００１２】
４．上記１、２又は３に記載のタンナーゼ活性を有する蛋白質生産能を有する微生物を培地に培養し、得られる培養物からタンナーゼを採取することを特徴とする前記蛋白質の製造法、
５．以下の(a)又は(b)のタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子、
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質
【００１３】
６．配列番号1で表されるアミノ酸配列と65％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列を有する蛋白質であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子、
７．以下の(a)又は(b)のＤＮＡからなるタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子、
(a)配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【００１４】
８． 上記５、６又は７記載のタンナーゼ遺伝子がベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮＡ、
９． アスペルギルス属に属し、上記８記載の組み換え体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、得られる培養物からタンナーゼ活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする前記蛋白質の製造法、
である。
なお、本明細書において、配列番号１で表されるアミノ酸配列及び配列番号２で表される塩基配列は、先の出願2001-403261号（出願日2001年12月27日）の明細書における配列番号29158及び29157とそれぞれ同一である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、発酵、醸造、酵素生産等に利用されるアスペルギルス属に属する微生物（麹菌）において、従来知られているタンナーゼ遺伝子と異なる塩基配列を有する遺伝子を同定し、該遺伝子を含む組み換えベクターをアスペルギルス属に属する微生物に導入することにより、従来知られているタンナーゼと比較して熱安定性に優れ、至適温度・至適pHが高温・中性域にあるタンナーゼを生産することに成功したものである。本発明のタンナーゼは、従来知られているタンナーゼがその酵素学的性質ゆえに利用できなかった分野にも利用可能であると考えられる。
【００１６】
〔１〕本発明の新規タンナーゼ
特定の実施形態においては、本発明のタンナーゼ（以下、文脈により「本酵素」という。）は、以下の理化学的性質を有する。
(1)作用：タンニン酸等のデプシド結合を有するタンニンを加水分解する。
（反応例：ジ没食子酸 ＋ H2O → 2没食子酸）
(2)至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：本酵素の至適ｐＨは、後述する測定法1で用いる緩衝液のｐＨを変化させ、各ｐＨにおける活性を測定して求めた。その結果は、図１に示す通りであり、本酵素の至適ｐＨはｐＨ6.5〜8.0、特にｐＨ7.0〜7.5付近である。又、安定ｐＨ範囲は、使用する酵素液を、ｐＨ1.5〜10.0の範囲において、30℃で80分間処理した後、残存活性を測定法１により測定して求めた。その結果は図２に示す通りであり、本酵素の安定ｐＨ範囲はｐＨ2.5〜7.5である。
【００１７】
(3)熱安定性：クエン酸緩衝液（ｐＨ5.5）中、各温度で10分間処理後の残存活性を測定法1に従って調べた。その結果は図4に示す通りであり、本酵素は、60℃まで安定であり、それを越えると徐々に失活し始め、80℃の熱処理でほぼ完全に失活する。各温度での残存活性は65℃で82％、70℃で63％、75℃で18％である。 (4)至適温度範囲：本酵素の至適温度は、後記の測定法1において、反応時の温度を変化させ、各温度における活性を測定して求めた。その結果は図3に示す通りであり、本酵素の至適温度は60℃〜80℃である。
(5)ｐＨ、温度等による失活の条件：本酵素はクエン酸緩衝液（ｐＨ5.5）中、30℃で80分間の処理では、前記の如くｐＨ2.5〜7.5で安定であり、それより酸性側及びアルカリ性側では失活が見られ、ｐＨ2.0以下及びｐＨ8.0以上では20％以上失活する(活性測定は、測定法１に従った)。
【００１８】
(6)基質特異性：タンニン酸、メチルガレート、エチルガレート、プロピルガレートに対して作用する。
また、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレートに対して作用する。これらの基質は、例えば、アスペルギルス・オリゼ由来酵素等の公知のタンナーゼで作用が確認されており、本酵素においても作用が確認されたものである。タンニン類には極めて多くの種類があるため、公知のタンナーゼについても、上記基質以外のタンニンに対する基質特異性は明らかでないのと同様に、上記基質以外のその他のタンニン類に対しても本酵素が作用しうる可能性を含んでいる。
(7)分子量：ゲル濾過法により測定した結果、分子量約25万、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した結果、分子量9万〜10万であり、糖鎖を有する。
【００１９】
本酵素と従来公知のタンナーゼとの理化学的性質の相違点を、表１に示す。尚、酵素Ａは、アスペルギルス・オリゼ由来（キッコーマン社酵素カタログ記載）、酵素Ｂは、アスペルギルス・アクレアタス由来(非特許文献11参照)、酵素Ｃは、バチルス・リケニフォルミス由来((非特許文献７参照)、及び酵素Ｄは、ヨーロッパナラの葉(非特許文献10参照)由来のタンナーゼを意味する。
【００２０】
【表１】
本発明のタンナーゼは本明細書記載の理化学的性質を有する限り、その由来により限定されるものではないが、好ましくは微生物由来の蛋白質であり、更に好ましくは糸状菌由来の蛋白質であり、更に好ましくはアスペルギルス属に属する糸状菌由来の蛋白質であり、最も好ましくは黄麹菌（アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ）由来の蛋白質である。更に、本発明のタンナーゼは遺伝子組換え技術により得られるタンナーゼも含むものである。
【００２２】
特定の実施形態においては、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質は配列番号１に表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である。しかしながら、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質はタンナーゼ活性を有する限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質に限定されるものではない。すなわち、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数（好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜１０個、より好ましくは数個）のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質であり得る。ここで、「１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列」とあるのは、目的とするタンナーゼ活性が得られる限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列が、該アミノ酸配列とは異なる配列に付加されてもよく、又、該アミノ酸配列の一部が欠失又は置換されてもよいことを意味する。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１番目のメチオニンが欠失しても、本発明の目的とする熱安定性に優れ、高温・中性域で良く反応するタンナーゼ活性が得られる限り、かかる欠失した配列も本発明に含まれることを意味する。
【００２３】
また、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質は、配列番号１で表わされる全アミノ酸配列の30％以上を占める連続するアミノ酸配列領域と65％以上、好ましくは70％以上、更に好ましくは80％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質であり得る。更には、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質は、配列番号１で表わされる全アミノ酸配列の60％以上を占める連続するアミノ酸配列領域と65％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質であり得る。
【００２４】
更に、本発明のタンナーゼ活性を有する蛋白質は、配列番号１で表わされる全アミノ酸配列の90％以上を占める連続するアミノ酸配列領域と65％以上、好ましくは70％以上、更に好ましくは80％以上の配列相同性を示すアミノ酸配列からなる蛋白質又はその部分断片であり、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質であり得る。
次に、本酵素の力価の測定法について説明する。本酵素の活性測定は、下記の測定法１に従って行なった。尚、30℃においてタンニン酸中のエステル結合を、１分間に１μmol加水分解する酵素量を、１単位（Ｕ）とする。
【００２５】
〔測定法１〕アグリカルチュアル・バイオロジカル・ケミストリー（31巻、513頁〜518頁、1967年）に記載の方法を一部改変して本酵素の力価を測定する。すなわち、タンニン酸（ジ没食子酸）のエステル結合が加水分解される度合を、310nmの吸光度減少を分光光学的に測定することにより算出する。
【００２６】
具体的には、1.0 ml の基質溶液〔0.35％ タンニン酸(ジ没食子酸)を含有する50mM クエン酸緩衝液（ｐＨ5.5）〕を30℃、5分間平衡化し、適宜希釈したタンナーゼ溶液0.25mlを加え、30℃、15分間反応させる。次いで5.0mlの90％エタノールを混合して反応を停止後、この溶液を0.25ml採取して別の試験管に移し、5.0mlの90％エタノールを混合して希釈を行なう。次いで310nm における吸光度変化を、分光光度計（U-2001, 日立社製）を用いて測定する。酵素の代わりに緩衝液を加えて同様に測定したものをブランク値とし、ブランク値との測定値の差を酵素反応量とする。
【００２７】
〔２〕本発明の新規タンナーゼ遺伝子
特定の実施形態においては、本発明のタンナーゼ遺伝子は上記理化学的性質を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子であり得る。
更には、特定の実施形態においては、本発明のタンナーゼ遺伝子は配列番号２で表される塩基配列からなるタンナーゼ遺伝子であり得る。しかしながら、タンナーゼ活性を有する蛋白質をコードする限り、配列番号２で表される塩基配列からなるタンナーゼ遺伝子に限定されるものではない。すなわち、本発明のタンナーゼ遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子であり得る。
【００２８】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げると共に、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げると共に、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行ない得るものである。
【００２９】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてDNAプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、5 ×SSC 、1.0 %(W/V)核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、0.1 %(W/V)N-ラウロイルサルコシン、0.02 %(W/V)SDSを用い一晩（８〜１６時間程度）で行なう。洗浄は、0.1〜0.5×SSC、0.1%(W/V)SDS、好ましくは0.1×SSC 、0.1%(W/V)SDSを用い、15分間、2回行なう。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行なう温度は65℃以上、好ましくは68℃以上である。
【００３０】
また、本発明のタンナーゼ遺伝子は、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと70%以上、好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上の配列相同性を示し、かつタンナーゼの機能を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子であり得る。
【００３１】
上記のアミノ酸配列又は塩基配列の解析において、２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性を決定するために、先ず配列は、比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行なう。その後、各部位におけるアミノ酸残基又は塩基が比較される。第一の配列における、ある部位に、第二の配列の相当する部位と同じアミノ酸残基又は塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。
２つの配列における配列相同性は、配列間での同一である部位数の全部位（全アミノ酸又は全塩基）数に対する百分率で示される。
【００３２】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列又は塩基配列における配列相同性は、Karlin 及び Altschulのアルゴリズム(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990及びProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)により決定される。このようなアルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltschul等によって開発された(J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990)。更に、Gapped BLASTはBLASTより感度よく配列相同性を決定するプログラムである(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997)。上記のプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列相同性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば、米国National Center for Biotechnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００３３】
ただし、上記BLASTソフトウェアで有意な配列相同性を示す配列が見つからない場合には、更に高感度なFASTAソフトウェア（W.R. Pearson and D.J. Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988）を用いて配列相同性を示す配列をデータベースから検索することもできる。FASTAソフトウェアは、例えば、ゲノムネットのウェブサイトで利用できる。この場合も、パラメーターは、デフォルト値を用いる。例えば、塩基配列についての検索を行なう場合は、データベースにnr-ntを用い、ktup値は6を用いる。
【００３４】
上記の各方法は、主にデータベース中から配列相同性を示す配列を検索するために用いられるが、個別の配列の配列相同性を決定する手段として、本発明では、Genetyx Mac Ver（トウエア開発社）のホモロジー解析を用いることができる。この方法は、高速、かつ高感度な方法として多用されているLipman-Pearson法(Science, 227:1435-1441, 1985)に基づくものである。塩基配列の配列相同性を解析する際は、可能であれば蛋白質をコードしている領域（CDS又はORF）を用いる。パラメーターとしては、Unit Size to compare = 2 , Pick up Location = 5とし、結果を％表示させる。最も高いポイントを示したアラインメントの配列相同性を結果として用いるが、問い合わせ配列の30%以上、50%以上、又は70%以上のオーバーラップを示さない場合は、機能的に相関しているとは必ずしも推定されないため、２つの配列間の配列相同性を示す値としては用いない。例えば、数塩基／残基程度の完全一致領域があったとしても、それは偶然の結果に過ぎない可能性が高く、また、全体の数％程度の長さにおける一致では、特定の機能モチーフが含まれていたとしても、全体として同じ機能を果たすと考えることは困難である。
【００３５】
〔３〕微生物を用いた本酵素の生産
本酵素を製造するために使用される微生物としては、本酵素の生産能を有する限り、遺伝子組換えの有無に関わらず、いかなる微生物を使用してもよく、好ましくは糸状菌、更に好ましくはアスペルギルス属に属する糸状菌が使用される。具体的には、例えば、アスペルギルス・オリゼ RIB40(ATCC 42149)等を挙げることができる。また、該菌株の変異株を用いることも可能である。該菌株の変異株を得る方法としては、例えば、ラジオアイソトープ、紫外線、ニトロソグアニジン等を用いて原株に突然変異を起こさせる方法を用いることができる。
【００３６】
当然のことながら、本酵素の生産に使用する微生物は、本酵素の生産能を有すると同時に、例えば従来のタンナーゼの生産能を兼ね備えたものであってもよい。そのような微生物としては、本来両方のタンナーゼの生産能を兼ね備えたものや、本来ある種のタンナーゼの生産能を有する微生物に、別種のタンナーゼをコードする遺伝子を導入して複数種のタンナーゼの生産能を兼ね備えさせたものが含まれる。複数種のタンナーゼの生産能を兼ね備えた微生物を、各種の培養条件下で培養することによって、目的に応じ、各タンナーゼの生産比率を任意に変化させて酵素生産させることも可能である。
【００３７】
上記の微生物を培地に培養し、得られる培養物から本酵素を採取する。培養法は、通常の固体培養法でもよく、液体培養法を採用することが好ましい。培地は、微生物を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地又は天然培地のいずれでも使用できる。
【００３８】
炭素源としては、資化可能な炭素化合物、例えば、グルコース、マルトース、デンプン加水分解物、グリセリン、フラクトース、糖蜜等が使用される。又、窒素源としては、利用可能な窒素化合物、例えば、酵母エキス、ペプトン、ソイトン、肉エキス、コーンスチープリカー、大豆粉、大豆もしくは小麦ふすま侵出液、アミノ酸、硫安、硝酸アンモニウム等が使用される。その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等の種々の塩類、ビタミン類、消泡剤等が使用される。これらの培地成分は、単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００３９】
微生物の培養は、使用する微生物の性質及び培地の形状に応じて通気撹拌培養、振盪培養、静置培養等を適宜選択し、培地の初発ｐＨを６〜７程度に調整した後、25〜35℃、好ましくは30℃前後で24〜140時間、好ましくは60〜100時間行えばよい。培養終了後、培養物より本酵素を採取するためには、通常の酵素採取手段を用いることができる。すなわち、酵素が菌体外部に放出される場合には、濾過又は遠心分離等により菌体を分離して、酵素液を含む培養液を回収することができる。また酵素が菌体内部に存在する場合には、超音波破砕機、フレンチプレス、リゾチーム等の細胞壁溶解酵素、界面活性剤等を用いて、濾過又は遠心分離等により分離した菌体から酵素を抽出し、次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去することにより、本酵素を含有する粗酵素液を得ることができる。
【００４０】
このようにして得られた粗酵素液から、本酵素を更に精製するには、通常の蛋白質精製法を使用することができる。具体的には、例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等を単独で、又は適宜組み合わせて用いることができる。
【００４１】
〔４〕遺伝子工学的手法による本酵素遺伝子のクローニング及び本酵素の生産
以下に、本をコードする遺伝子（以下、文脈により「tan遺伝子」という）を含むＤＮＡが挿入された組み換え体ＤＮＡにより宿主細胞を形質転換又は形質導入し、得られた組み換え微生物を用いて本酵素を生産する方法について詳細に説明する。
【００４２】
１．tan遺伝子のクローニング
tan遺伝子を含むＤＮＡは、染色体ＤＮＡ、又はｃＤＮＡ由来の野生型遺伝子をクローニングすることにより得られる。又、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）を行なうことにより該遺伝子を増幅することもできる。更には化学合成法を用いて該遺伝子を構築することも可能である。以下、アスペルギルス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型にPCRによりtan遺伝子をクローニングする方法を例にとり、tan遺伝子を含むＤＮＡの単離法について説明する。
【００４３】
PCR法によるtan遺伝子の増幅に鋳型ＤＮＡとして用いる染色体ＤＮＡは、本発明のタンナーゼ遺伝子を有する微生物由来であればいかなる微生物由来の染色体ＤＮＡでも用いることができる。これらの微生物として、例えば、アスペルギルス・オリゼRIB40(ATCC 42149)株等が挙げられる。プライマーとしては、tan遺伝子を含むDNA断片の増幅が可能であればいかなる配列のプライマーを用いてもよい。その例としては、配列番号３、４で表されるプライマー等が挙げられる。
【００４４】
PCR反応に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、TaKaRa Ex Taq（タカラバイオ株式会社製）、KOD DNA Polymerase（東洋紡績株式会社製）等を用いることが可能であるが、PCR反応時における増幅ミスの割合が低いKOD DNA Polymerase（東洋紡績株式会社製）等を用いることが好ましい。
【００４５】
PCRの反応条件は、上記染色体ＤＮＡ、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、tan遺伝子を含む特異的増幅産物を得ることができればいずれの反応条件を用いてもよい。その例としては、実施例１記載のPCR反応条件等が挙げられる。また、本発明のタンナーゼ遺伝子を有する微生物から染色体ＤＮＡを抽出する方法としては、公知のいずれの方法も使用できる。その例としては、飯村等の方法〔Agric. Biol. chem. 323-328, 51 (1987)〕等が挙げられる。
【００４６】
上記染色体ＤＮＡ、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、上記反応条件でPCRを実施することにより約1.8kb特異的増幅産物を得ることができる。該増幅産物の塩基配列は、染色体上の本発明のタンナーゼ遺伝子の塩基配列と同様の配列を有していることが期待される。しかしながら、場合によってはPCR反応中の増幅ミスにより、染色体上の本発明のタンナーゼ遺伝子の塩基配列と異なる塩基を有していることがあり、増幅ミスの有無を確認する必要がある。PCR反応中の増幅ミスの確認は、複数の増幅産物のシークエンスを行なうことにより以下の通り実施することができる。
【００４７】
個別のチューブを用いてPCRを行なうことにより得られた複数の増幅産物を、適当な制限酵素で処理・精製後、あるいは無処理で、ベクターＤＮＡ、例えば、プラスミドpUC18（タカラバイオ株式会社製）、pUC118（タカラバイオ株式会社製）、温度感受性バクテリオファージ（特開昭58-212781 号公報、FERM BP-133 等）の適当な制限酵素ゼ部位に挿入して組み換え体ＤＮＡを作成し、該組み換え体ＤＮＡを用いて、宿主細胞、例えば、大腸菌JM109（タカラバイオ株式会社製）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組み換え体ＤＮＡを、QIAGEN Plasmid Mini Kit（フナコシ社製）等を用いて精製する。
【００４８】
このようにして得られた組み換え体ＤＮＡに挿入されている各増幅産物の塩基配列の決定は、ジデオキシ法(Methods in Enzymology,101,20-78,1983）等により行なうことができる。シークエンスを行なった各増幅産物の塩基配列のうち、全ての塩基について、対応する他の増幅産物の塩基と高い相同性を有している塩基配列を、染色体上の本発明のタンナーゼ遺伝子の塩基配列と同様の配列とみなすことができ、該塩基配列を有する増幅産物をtan遺伝子を含むＤＮＡとすることができる。該塩基配列を配列番号２に、配列番号２に示した塩基配列に基づいて確定した本発明の新規タンナーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００４９】
２．組み換え体ＤＮＡの構築と組み換え微生物の取得
本酵素を得るためには、tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを構築し、該組換え体ＤＮＡにより形質転換され、本酵素を生産し得る組み換え微生物を取得する必要がある。以下に、tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡの構築と、該組換え体ＤＮＡを用いた微生物の形質転換方法について説明する。
【００５０】
形質転換に宿主として用いる微生物としては、tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡによる形質転換により、本酵素を生産することができる微生物であればいかなる微生物も用いることができるが、好ましくは糸状菌、更に好ましくはアスペルギルス属に属する微生物、更に好ましくは黄麹菌、最も好ましくは、アスペルギルス・オリゼが挙げられる。
【００５１】
tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡの構築に用いるベクターＤＮＡは、宿主細胞を形質転換する機能例えば、薬剤耐性、栄養要求性等のマーカー遺伝子、及び、宿主細胞で機能し得るプロモーター、ターミネーター等のtan遺伝子の発現に必要な機能を有している限りいかなるベクターＤＮＡも使用することができる。但し、tan遺伝子の発現に必要な機能については、挿入するtan遺伝子を含むＤＮＡ断片が、その機能を有している場合は必ずしも必要ではない。又、co-transformation法により形質転換を行なう場合には、ベクターＤＮＡ上に必ずしもマーカー遺伝子を有する必要はない。
【００５２】
tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡは、PCR増幅ミスがないことを確認したtan遺伝子を含む増幅産物を上記ベクターＤＮＡとtan遺伝子の発現が可能な形で結合することにより構築することができる。すなわち、シークエンスに用いたtan遺伝子を含むプラスミドより、適当な制限酵素、例えば、EcoRＩ及びSmaＩで切り出したtan遺伝子を含むDNA断片を、実施例２記載のpAP等のベクターＤＮＡの適当な制限酵素部位、例えば、EcoRＩ-SmaＩ部位にtan遺伝子の発現が可能な形で挿入することにより構築することができるる。
【００５３】
tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを用いて微生物を形質転換する方法は、宿主として用いる微生物及びtan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡに用いたマーカー遺伝子により異なるが、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、宿主としてアスペルギルス・オリゼniaD-株を用い、マーカーとしてアスペルギルス・オリゼ由来のniaD遺伝子を用いる場合は、〔Mol.Gen.Genet (1989)218:99-104〕記載の方法を、宿主としてアスペルギルス・オリゼargB-株を用い、マーカーとしてアスペルギルス・オリゼ由来のargB遺伝子を用いる場合は、〔Biosci.Biotechnol.Biochem.,64(4),816-827,2000〕記載の方法を用いることができる。
【００５４】
３．組み換え微生物による本酵素の生産
上記tan遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡを保有する組み換え微生物を培養すれば、本酵素を生産することができる。培養方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好ましい。
【００５５】
組み換え微生物を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、ペプトン、ソイトン、肉エキス、コーンスティープリカー又は大豆もしくは小麦ふすまの浸出液等から選ばれる１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄又は硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン、tan遺伝子を発現させるプロモーターを誘導するための基質等を適宜添加したものが用いられる。
【００５６】
培地の初発ｐＨは６〜７に調節するのが適当である。培養は、25〜35℃、好ましくは30℃前後で60〜100時間、通気撹拌培養、振盪培養、静置培養等により行なうことが好ましい。培養終了後、培養物より本酵素を採取するには、通常の酵素採取手段を用いることができる。すなわち、酵素が菌体外部に放出される場合には、濾過又は遠心分離等により菌体を分離して、酵素液を含む培養液を粗酵素液として回収する。また酵素が菌体内部に存在する場合には、超音波破砕機、フレンチプレス、リゾチーム等の細胞壁溶解酵素、界面活性剤等を用いて、濾過又は遠心分離等により分離した菌体から酵素を抽出し、次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去することにより、本酵素を含有する粗酵素液を得ることができる。本発明では、このようにして得られた粗酵素液をそのままタンナーゼ標品としてもよく、以下の精製手法によりさらに純度を高めてもよい。
【００５７】
上記の粗酵素液から、本酵素を更に精製するには、通常のタンパク質精製法を使用することができる。具体的には、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等が、単独又は適宜組み合わせて用いられる。
【００５８】
本酵素は、広範な安定ｐＨ範囲並びに優れた熱安定性をともに兼ね備えている。従って、本酵素は、例えば、試薬、食品加工用助剤として利用する場合に、ｐＨ又は温度等の使用環境が変化したときの影響を受けにくく、安定性に優れている点で、公知のタンナーゼよりも優れている。また本酵素は、至適pH範囲が公知のものより中性域に存在しており、公知のタンナーゼでは充分な作用効果が期待できなかったpH域における新たな用途、利用できる食品のバリエーションを提供することが期待される。
【００５９】
例えば、弱酸性域でよく作用する公知のタンナーゼは、このpH領域に含まれる緑茶あるいは紅茶、また果汁等の飲料に対して使用する際には、反応至適pH付近で反応するため好適であった一方で、野菜汁や、抽出後に色調を強めるため中性付近までpH調整されたウーロン茶には、反応至適pHを外れていることから、活性が顕著に低下し、充分な効果を示せないか、必要な効果を得るためには多量の酵素を使用しなければならない、あるいは酵素処理のために一時的にpHを変える処理工程を必要とする等の問題を抱えていた。このようなpH領域の飲料・食品に対して本発明のタンナーゼを使用すれば、反応至適pH付近で反応するため、迅速に、より少量の酵素使用で、充分な効果をあげることが可能となる。
【００６０】
更に本酵素は、失活を起こす温度及び至適温度範囲が公知のタンナーゼより高温域に存在しており、食品加工等に使用するにあたり、加熱工程との共存がより容易であるという点でも、公知のタンナーゼでは行なえない使用法のバリエーションを提供する。例えば、茶飲料等は製法上、茶葉を熱湯抽出して製造するが、この茶抽出液にタンナーゼを作用させたい場合、公知のタンナーゼでは、酵素が熱失活しない温度まで充分に茶抽出液の温度を下げる必要があった。この点で、本発明の熱安定性に優れ、高温・中性域で良く反応するタンナーゼを使用する場合には、茶抽出液の温度を下げる工程を大幅に短縮するあるいは省くことが可能になる。
【００６１】
本発明のタンナーゼは、60℃〜80℃という高温で好適に作用するので、熱水抽出工程中に、抽出を行ないながら、酵素反応を行なわせることも可能になる。このことは、抽出及び酵素反応の２工程を1工程で済ませることにつながり、効率よい生産に寄与する。また、タンナーゼの作用の中に、茶抽出物中のタンニンを分解して沈澱や混濁を防止する効果があるが、抽出しながら酵素反応を進めることにより、沈澱・混濁を除去しつつ、より高濃度の茶抽出を実現することも可能になる。なお、本発明のタンナーゼは、実用上高い熱安定性を有しつつも、通常の飲料製造で広く用いられる加熱殺菌条件、例えば、達温95℃等の条件で、迅速に完全に失活するため、製造工程中、失活のために特別の加熱工程を組み入れる必要を生じない。
【００６２】
【実施例】
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６３】
〔実施例１〕
アスペルギルス・オリゼtan遺伝子の取得
アスペルギルス・オリゼ RIB40株(ATCC 42149)の胞子をYPD培地100 mlに植菌し、温度30℃で一晩振盪培養した。その後、飯村〔Argric. Biol. Chem. 323-328, 51 (1987)〕の方法に従ってゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡ断片を鋳型として、アスペルギルス・オリゼのゲノムデータベースを参考に作成した下記のプライマーを用いてPCRを行なった。
5'-cttggaattctctcgaataaaaatgagg-3' （配列番号 3）
5'-ctaaatacccgggctatgacatgacattc-3' （配列番号4 ）
PCR反応は、KOD DNA Polymerase (東洋紡績株式会社製)を使用し、PTC-200 DNA Engine(MJ Research社製)により行なった。反応液の組成は以下の通りである。
【００６４】
（試薬：使用量）
H2O：36μl
10×Reaction Buffer #1：5μl
2 mMdNTP Mix：5μl
20μMプライマー2種類：各1μl
鋳型 (ＤＮＡ 0.5μg)：1μl
KOD DNA Polymerase：1μl
合計液量：50μl
【００６５】
上記の反応液50μlを0.2 ml反応チューブ中で混合してＤＮＡサーマルサイクラーにセットし、以下のような温度設定によりPCRを行なった。PCRにより得られた約1.8kbの増幅産物をエタノール沈殿処理後、EcoRI及びSmaIで消化した。
95℃、2分 ：1サイクル
95℃、30秒、 58℃、30秒 72℃、2分30秒 ：30サイクル
72℃、3分 ：1サイクル。
【００６６】
EcoRI及びSmaI消化後の上記増幅産物をEcoRI及びSmaIで消化後、精製したプラスミドpUC18のEcoRI-SmaI部位に連結し、大腸菌JM109(ATCC 53323)の形質転換及びクローニングを行なった。目的のＤＮＡ断片を有する大腸菌６クローンからプラスミドを調製し、クローニングしたＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。各ＤＮＡ断片の塩基配列を比較し、PCR増幅時の増幅ミスを含まないと思われる増幅産物を含むプラスミドをpUCtan-4とした。pUCtan-4に挿入されたPCR増幅産物の塩基配列を配列番号２に示す。
【００６７】
〔実施例２〕
麹菌発現ベクターの構築
アスペルギルス・オリゼのアミラーゼプロモーターを有する発現ベクタープラスミドpMAR5(Biosci. Biotech. Biochem., 56:1674-1675, 1992)のマーカー遺伝子であるargB遺伝子を、アスペルギルス・オリゼのpyrG遺伝子と交換したプラスミドを作成した。pMAR5を制限酵素SphIで消化し、末端平滑化処理後、更にSalIで消化し、0.7%アガロースゲルで電気泳動し、約４kbの断片を回収した。
【００６８】
一方、ppyrG-26(特開2001-46053号公報記載)をBamHIで消化し、末端平滑化処理後、更に、SalIで消化し、0.7%アガロースゲルで電気泳動し、pyrG遺伝子を含む約2.2kbのＤＮＡ断片を回収した。これらの断片をライゲーションし、そのベクターにより大腸菌JM109株を形質転換した。得られたプラスミドをpAPとした。このプラスミドは、pyrG遺伝子を選択マーカーとして有し、アミラーゼ遺伝子のプロモーター及びターミネーターの間にEcoRI-SmaIサイトを有する発現ベクターであり、EcoRI-SmaIサイトにプロモーターと同じ方向で遺伝子のORFを組み込み、麹菌を形質転換することにより、アミラーゼ遺伝子プロモーターの制御下で目的の遺伝子を発現することができるものである。
【００６９】
pUCtan-4をEcoRI-SmaIで消化後、クローニングしたＤＮＡ断片を単離、精製し、pAPのEcoRI-SmaI部位に連結したのち大腸菌JM109の形質転換を行なった。得られた形質転換体より回収したプラスミドのうち、pAPのEcoRI-SmaI部位にクローニングしたＤＮＡ断片が目的通りに連結されたプラスミドをpAPtan-4とした。
【００７０】
〔実施例３〕
麹菌形質転換体の取得
アスペルギルス・オリゼ RIB40株(ATCC 42149)から特開2001-46053号公報記載方法で取得したpyrG欠損株をpAPtan-4で形質転換した。形質転換法は、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる方法（Mol. Gen. Genet., 218:99-104, 1989）によって行なった。pAPtan-4を3μg用いて形質転換し、最少培地で形質転換体を選択したところ、約100個のコロニーを得た。
【００７１】
2％デキストリン、1％ポリペプトン、0.5％ KH2PO4、0.05 ％MgSO4を含むアミラーゼプロモーター誘導培地（pH6.0）50mlに、上記各形質転換体の分生子約106個を接種し、温度30℃、50時間、振盪培養した。培養後の上清をUltrafree-MC（MILLIPORE社製）にかけ、菌体を完全に除去した後、各濾過液3μlをタンナーゼ活性アッセイプレート（0.2％ NH4H2PO4、0.2％ KH2PO4、0.1％ MgSO4、1％ Glucose、1％ Tannic acid、2％ agar、pH7.5）に滴下した。30℃で48時間静置培養した後、滴下した培養上清による培地中のタンニン酸の分解が観察された形質転換体RIB40tan-2株を選択した。
該形質転換株、アスペルギルス・オリゼ （RIB40tan-2）は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにFERM BP-8180として寄託されている。
【００７２】
〔実施例４〕
組み換え微生物による本酵素の生産
(1) 種菌（胞子懸濁液）の調製
上記方法により作製した組み換え麹菌アスペルギルス・オリゼ（RIB40tan-2）を、マルツ寒天培地（純正化学社製）上で30℃、7日間培養した。得られたコロニー上に形成された胞子を、スキムミルク溶液（10％スキムミルク、5％サッカロース、1％グルタミン酸ナトリウム）で掻き取り、約107個/mlの胞子懸濁液を調製して凍結保存した。
【００７３】
(2) 微生物の培養
酵素生産用培地（4％デキストリン、2％ポリペプトン、1％酵母エキス、0.5％ KH2PO4、0.05％MgSO4、ｐＨ6.0）400mlを入れた2000ml容三角フラスコ5個に、アスペルギルス・オリゼ(RIB40tan-2)の胞子懸濁液0.8mlを植菌し、30℃で60時間振盪培養した後、濾紙濾過により菌体を除去し、培養液約1.8Ｌを得た。
【００７４】
(3)タンナーゼの精製
得られた培養液に硫安を添加し、飽和硫安濃度60％〜100％で回収される沈澱を緩衝液A［30％飽和硫安含有20mM 酢酸緩衝液（ｐＨ5.0）］にて溶解し、約130mlの酵素溶液を得た。次いで、該酵素溶液を、緩衝液Aで平衡化したフェニル-セファロースCL-4Bカラムに供した。カラムを緩衝液Aで洗浄した後、30%〜0％の飽和硫安含有20mM 酢酸緩衝液（ｐＨ5.0）の直線濃度勾配法により吸着画分を溶出した。溶出液を分取し、各画分のタンナーゼ活性を測定法１に従って調べた。タンナーゼ活性を有する画分を、セントリコン−30（アミコン社製）を用いて限外濃縮・透析し、硫安を除去した。
【００７５】
濃縮処理後の活性画分の一部を、0.1M NaCl含有20mM酢酸緩衝液pH5.5にて平衡化したTSK-gelG3000SWXL（東ソー社製）を用いたゲル濾過ＨＰＬＣに供し、溶出液を280nmの吸光度でモニターし、分取画分の活性を測定した。その結果、本酵素がシングルピークとなるまでに精製されていることを確認した。標準分子量マーカーの溶出位置から推定された本酵素の分子量は約25万であった。
【００７６】
また上記の方法により得られた活性画分の一部を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動終了後にゲルの染色を行ない、本酵素が単一バンドとなるまでに精製されていることを確認した。本酵素のバンドはブロードになり、公知のタンナーゼ、例えば、アスペルギルス・オリゼ由来の酵素と同様に、糖鎖を有していることが確認された。分子量は約9〜10万であった。また、本酵素液の一部をN-グリコシダーゼ（グリコペプチダーゼＦ、タカラバイオ株式会社製）を用いて処理し、糖鎖を除去したものを同様にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したものでは、ブロードなバンドは消失し、代わって分子量約6万のシャープな単一バンドが確認された。このことより、糖鎖のつかない本酵素蛋白質のサブユニット分子量は約6万であることが確認され、この分子量は、本発明中に開示した遺伝子の配列から算出される大きさと一致していた。
【００７７】
(4)タンナーゼの酵素化学的性質
本酵素と公知タンナーゼとの比較結果は、前記表１に示す通りである。表１から明らかなように、本酵素は、至適ｐＨ範囲がいずれの公知酵素よりも中性側にあり、中性条件下で良好に作用する。至適温度は公知酵素が中温域から上限60℃であるのに対し、60℃〜80℃と、顕著に高温域で良好に作用する。安定ｐＨ範囲は酸性域から弱アルカリ性に渡っており、広範囲である。そして、熱安定性についても、65℃で82％、70℃で63％、75℃で18％の活性を保持し、熱安定性に優れている。公知酵素はいずれも至適pHが弱酸性域にあり、本酵素が良好に作用する中性pH域での反応性は低い。
【００７８】
アスペルギルス・オリゼ由来の酵素（酵素Ａ）及びヨーロッパナラ由来の酵素（酵素Ｄ)の至適温度は40℃及び35℃〜40℃である。これらは中温域で良好に反応する一方、本酵素が良好に作用する高温域では反応性が顕著に低い。同時に、このような高温では活性が大きく低下するため、高温域では実用に供することができない。
【００７９】
アスペルギルス・アクレアタス由来の酵素（酵素Ｂ）及びバチルス・リケニフォルミス由来の酵素（酵素Ｃ）の至適温度は、やや高温域の50℃〜60℃にあり、アスペルギルス・オリゼ由来の酵素（酵素Ａ）あるいはヨーロッパナラ由来の酵素（酵素Ｄ)よりは高温域で使用することができる。しかし、茶飲料の熱抽出等に想定される、より高温域での使用は困難である。最も熱安定性の高いアスペルギルス・アクレアタス由来の酵素（酵素Ｂ）の細胞内酵素も、70℃で活性の70％を失うためである。また、その他の公知酵素同様に、至適pHは弱酸性域にあり、本酵素が良好に作用する中性pH域での反応性は低く、中性域で使用したい場合には、多量の酵素を使用しなければならない。更に重要なこととして、公知の全ての酵素は中性域での安定性に問題があるため、中性域で反応中に迅速に失活を起こし、目的の反応を完了することができなくなる恐れを有している。
【００８０】
上述のように本酵素は、至適pH及び至適温度範囲が公知の各種タンナーゼと異なっていることから、異なる用途、使用場面を提供し、特に公知酵素では効果を上げにくかった中性条件及び高温条件下の使用において特に優れていることは明らかである。更に、本酵素は、本酵素自身の至適pH及び至適温度範囲を外れた、例えば、公知酵素の至適pHである弱酸性条件及び公知酵素の至適温度範囲である中温域条件下においても、実用上充分な活性を有しているという点で、従来、公知酵素が用いられる場面においても、充分に使用可能である。
【００８１】
例えば、本酵素は60℃〜80℃でほぼ100％の活性を示すのに対し、40℃で50％、45℃で75％、50℃で80％の活性を示す。これは、本酵素が中温域から高温域まで広範な温度範囲で良好に反応できることを示す。また、本酵素はpH7.0〜7.5で100％の活性を示すのに対し、pH5.0でも38％、pH6.0では60％の活性を示す。これは、本酵素が弱酸性域においても実質的に良好に反応できることを示す。一方、公知のアスペルギルス・オリゼ由来の酵素（酵素Ａ）では60℃以上で酵素活性はなく、またpH7.0での活性は至適pH5.5の時の20％に過ぎない。このことから、本酵素は、その汎用性においても、公知酵素より優れている。即ち、これら各種の公知酵素に対し、本酵素は、各種食品加工の実際の使用工程中に利用するにあたり、優れている、また、公知酵素では好適に使用できなかった新たな使用場面を提供するものと考えられる。
【００８２】
以上より、本酵素は、試薬あるいは食品加工等の用途に利用する場合に、ｐＨ又は温度等の試験環境が変化したときの影響を受けにくく、その取扱いが容易で利用しやすいと考えられることから、公知のタンナーゼよりも優れているといえる。更に、汎用性が高く、公知のタンナーゼでは使用しにくかった新たな用途・使用工程に対しでも好適に使用することができ、タンナーゼの実用化のバリエーション化に貢献するものであるといえる。
【００８３】
【発明の効果】
本発明により、熱安定性に優れ、高温・中性域で良く反応するタンナーゼ及び該タンナーゼをコードする遺伝子が提供され、また、本酵素を効率よく大量に生産することができる。本酵素は熱安定性に優れ、中性域でよく作用し、また高温下でよく作用するという、新規な酵素化学的性質を有しているため、試薬、食品加工を始めとする各種産業分野において好適に使用できる。
【００８４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本酵素の至適pH範囲を示す図。
【図２】本酵素の安定pH範囲を示す図。
【図３】本酵素の至適温度範囲を示す図。
【図４】本酵素の熱安定性範囲を示す図。
Claims (5)
- 以下の(a)又は(b)のタンナーゼ活性を有する蛋白質。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質 - 以下の(a)又は(b)のタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなる蛋白質 - 以下の(a)又は(b)のＤＮＡからなるタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするタンナーゼ遺伝子。
(a)配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ
(b)配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつタンナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ - 請求項２又は３記載のタンナーゼ遺伝子がベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮＡ。
- アスペルギルス属に属し、請求項４記載の組み換え体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、得られる培養物からタンナーゼ活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする前記蛋白質の製造法。
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