JP4283881B1 - 電気化学測定用電極板、および当該電気化学測定用電極板を有する電気化学測定装置、ならびに当該電気化学測定用電極板を用いて目的物質を定量する方法 - Google Patents

Abstract

試料液中に含まれる目的物質の濃度を、精度良くかつ高感度で測定することができる電気化学測定用電極板を提供する。
本発明の電気化学測定用電極板１は、基板３１と、前記基板の上面に設けられた上層４０と、前記基板の下面に設けられた下層１１と、前記基板の上面と前記上層の間に挟まれている第１電極体３２と、前記基板の下面と前記下層の間に挟まれている第２電極体１２と、を備え、前記上層は、複数の上層貫通孔４１を有し、前記第１電極体は、前記第１電極体のうち、前記上層貫通孔を介して前記上層の上面から露出する部分からなる複数の第１電極３２ｄを有し、前記基板は、複数の基板貫通孔３３を有し、前記第２電極体は、前記第２電極体のうち、前記上層貫通孔および前記基板貫通孔を介して前記上層の上面から露出する部分からなる複数の第２電極１２ｄを有する。
【選択図】図２

Description

本発明は生体内に微量に含まれる物質を、感度良く検出および定量する電気化学測定用電極板に関する。

近年、酵素が有する特異的触媒作用と電極反応活性を有する電子メディエータとを組み合わせ、血液中に含まれるスクロース、グルコースなどの糖類を定量する電気化学測定用電極板が開発されている。

このような電気化学測定用電極板では、糖類と酵素との間で反応させた後、電子メディエータを電気化学的に測定することによって、電子メディエータを介して間接的に試料液中に含まれる糖類を定量する。

この方法は糖類に対する特異性が高く、操作時の温度の影響が小さく、定量装置の機構も簡便であるため、この方法を用いることにより、一般の人々が家庭などで簡易に糖類を定量することができる。

電気化学測定用電極板は、生体に含まれる微量溶液サンプルの分析に適している。そのため、電気化学測定用電極板は、様々な有機材料または無機材料と組み合わせてセンサなどへの応用が試みられている。電気化学測定用電極板の電極応答速度は、電気化学測定用電極板が有する微小電極の面積が減少するにしたがって高くなるため、様々な電極形状、電極の微細化が検討されている。

しかし、電極面積の減少に伴い、得られる電流値は減少する。例えば、電極面積を数百μｍ^２程度まで微細化すると、検出できる電流値は数十〜数ｎＡオーダーまで低下する。そのため、測定時にノイズ応答の増加や感度低下が発生する。そこで、これらの不具合を解消するため、複数の微小電極を集積した電気化学測定用電極板が特許文献１〜４で検討されている。

特許文献１〜４では、隣接する微小電極との間の距離を一定に保つ微小電極を、多量に再現性良く基板上に作製する方法が提案されている。

図１７は、特許文献１に記載された従来の電気化学測定用電極板の構成の全体図（図１７（ａ））および部分拡大図（図１７（ｂ））を示している。この電気化学測定用電極板２００は、絶縁性の基板２０１／酸化電極として機能する下部電極体２０２／絶縁層２０３／還元電極として機能する表面電極２０４が積層されてなる。表面電極２０４の表面には円筒形の多数の微細孔５が形成されており、この微細孔５には下部電極体２０２の膜面が露出している。

絶縁性の基板２０１は、例えばシリコン基板２０１ａの主表面に酸化膜２０１ｂが被着された、いわゆる酸化膜付きシリコン基板から成る。下部電極体２０２は、基板２０１上の酸化膜２０１ｂの表面（すなわち、絶縁体の表面）に金属、半金属、炭素材、または半導体で形成された酸化電極である。表面電極２０４は、絶縁層２０３上に、下部電極体２０２と同様、金属、半金属、または半導体から形成された還元電極である。下部電極体２０２の微細孔５からの露出部（以下、酸化電極２０２とする）と表面電極２０４とから、作用電極対が構成されている。すなわち、酸化電極２０２ａおよび表面電極２０４はいずれも作用電極として機能し、より詳細には、上述したように、下部電極体２０２の露出部は酸化電極として、表面電極２０４は還元電極として機能する。なお、図１７において、２０７は下部電極体２０２の一端部に外部リードを接続するために開口された電極引出し用の開口部である。ここで微細孔２０５とは絶縁層２０３と表面電極２０４を完全に貫通し、下部電極体２０２の表面に到達する孔のことを指す。

上記のような電気化学測定用電極板を用いた電気化学測定装置においては、電流応答を得るために、下部電極体２０２と表面電極２０４に電位を印加する。電気化学測定装置が酸化電極２０２ａ、表面電極２０４、対極（図示せず）の３つの電極で構成される場合、対極が試料溶液中で示す電位をゼロとして、酸化電極体２０２ａ−対極間、表面電極２０４−対極間に電位を印加する。なた、電気化学測定装置が酸化電極体２０２ａ、表面電極２０４、参照電極（図示せず）、補助電極（図示せず）の４つの電極で構成される場合、参照電極が試料液中で示す電位をゼロとして、酸化電極２０２ａ−参照電極間、表面電極２０４−参照電極間に電位を印加する。

特許文献４および非特許文献１においては、円筒形の微細孔２０５の間隔を、その径に対して大きく取った電気化学測定用電極板が提案され、それを用いた電気化学測定結果が報告されている。これらの文献においては、マクロ電極である表面電極２０４は、微小電極の集合体である下部電極よりも大きな面積を有する。測定時には、酸化電極２０２ａ上で酸化反応を、そして表面電極２０４上で還元反応を起こしうる電位をそれぞれ印加する。これにより、酸化電極２０２ａと表面電極２０４との間で自己誘発レドックスサイクルが発現し、見かけ上高い電流応答を得ることができると報告されている。

このようにして、試料液に存在する電子メディエータを介して、糖類などの目的物質を定量する。

なお、酸化電極２０２ａに還元反応が起こる電位を印加し、表面電極２０４に酸化反応が起こる電位を印加しても、同様の自己誘発レドックスサイクルが発現する。

ここで、特許文献４、非特許文献１及び２に記載されている自己誘発レドックスサイクルを、図１８を用いて説明する。

図１８における自己誘発レドックスサイクルはふたつの作用電極、すなわち微小電極２２１およびマクロ電極２２２上で進行する。

微小電極２２１の表面では、還元体２２４の酸化反応が生じて酸化体２２５が生成することにより、微小電極２２１に酸化電流が流れる。

マクロ電極２２２のうち微小電極２２１に近い部分２２２ａの表面では、酸化体２２５が還元されて還元体２２６となることにより、マクロ電極２２２に還元電流が流れる。

さらに還元体２２５が拡散して微小電極２２１の表面に到達することにより、還元体２２４から酸化体２２５への酸化反応が再び起こり、微小電極２２１に酸化電流が流れる。結果的にマクロ電極２２２ａの表面では微小電極２２１から生成した酸化体２２５を還元して還元体２２６とすることにより、微小電極２２１表面に還元体２２４を供給することができる。

これにより、微小電極２２１とマクロ電極２２２ａとの間で酸化反応と還元反応が循環するいわゆるレドックスサイクル反応が生じる結果、微小電極２２１に定常的に電流が流れて、試料液中に微量に含まれる目的物質の検出および定量を行うことができる。

そして高感度測定の有効性を高めるために、微小電極２２１を基板上により多数形成してレドックスサイクルが進行する酸化電極と還元電極とからなる電極対を、できる限り多く形成する。
特許第２５５６９９３号公報（第６頁、第１図） 特許第２５６４０３０号公報（第７頁、第２図） 特開２００６−７８４０４号公報（第２５頁、図１） 特許第３２８９０５９号公報（第１６頁、図５） 特開２００７−０１０４２９号公報（図３、図４） Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３８巻，１２号， ３５５１頁 青木幸一ら著 「微小電極を用いる電気化学測定法」 （社）電子情報通信学会編 平成１０年２月１０日発行 ４８−４９，７０−７１頁

図１７に示されるように、還元電極として機能する表面電極２０４の面積が、酸化電極２０２ａの面積よりもずっと大きいと、次のような問題が生じる。

マクロ電極２２２ａ上で生成した還元体２２６は拡散するが、それは微小電極２２１（図１７における酸化電極２０２ａに相当）に到達するだけでなく、図１８の右側に示すように、その一部はマクロ電極２２２（図１７における表面電極２０４に相当）のうち微小電極２２１から遠い部分２２２ｂ上にも到達する。このような還元体２２７は酸化反応により酸化体２２８となる。すなわち、マクロ電極２２２上では酸化反応も起こる（特開平３−２４６４６０号公報の第４図も参照）。

次に、この酸化体２２８は拡散し、マクロ電極２２２のうち微小電極２２１に近い部分２２２ａ上に到達する。そこで還元反応により、還元体２２６となる。還元体２２６は拡散して微小電極２２１表面に到達し再び酸化されて酸化体２２５となる（あるいは、再度、マクロ電極２２２のうち微小電極２２１から遠い部分２２２ｂに到達する）。

すなわち、図１７の表面電極２０４上では酸化反応と還元反応が同時に起こることとなる。その結果、酸化電極２０２ａで検出したい還元体の酸化が表面電極２０４の上でも同時に起こってしまう。

そのため、表面電極２０４で発生した還元体が効率的に酸化電極２０２ａ上で酸化せず、高感度化に課題を生じている。

この他、表面電極２０４はマクロ電極として作用するため電位印加時の充電電流が大きい。そのため、微小電極である酸化電極２０２ａに比べて反応が定常状態に達する時間が長くなるという課題も生じていた。

本発明は上記課題の解決するためになされたものであり、試料液中に含まれる糖類等の目的物質の濃度を、電子メディエータを介して精度良くかつ高感度で定性測定又は定量測定を行うことができる電気化学測定用電極板を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の電気化学測定用電極板は、絶縁体からなる基板と、前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、前記基板の上面と前記上層の間に挟まれている第１電極体と、前記基板の下面と前記下層の間に挟まれている第２電極体と、を備え、前記上層は、複数の上層貫通孔を有し、前記第１電極体は、前記第１電極体のうち、前記上層貫通孔を介して前記上層の上面から露出する部分からなる複数の第１電極を有し、前記基板は、複数の基板貫通孔を有し、前記第２電極体は、前記第２電極体のうち、前記上層貫通孔および前記基板貫通孔を介して前記上層の上面から露出する部分からなる複数の第２電極を有し、平面視において、前記複数の基板貫通孔は、いずれも前記第１電極体とは重なり合わず、前記各第１電極の周囲には、前記第１電極との中心間距離が等しい４つの第２電極が配置されており、前記各第２電極の周囲には、前記第２電極との中心間距離が等しい４つの第１電極が配置されており、前記各第１電極の面積および前記各第２電極の面積は全て実質的に同一である。

本発明の一態様において、前記第１電極体は、前記第１電極を順次連結するように延設されたジグザグ状をなす複数の枝部と、前記複数の枝部の一端が接続される幹部とからなる。

本発明の一態様において、前記第２電極体は、前記第２電極を順次連結するように延設されたジグザグ状をなす複数の枝部と、前記複数の枝部の一端が接続される幹部とからなる。

本発明の一態様において、前記第１電極体は、前記複数の基板貫通孔に対応する領域より一回り大きく欠除されてなる複数の欠除部を有する金属板からなる。

本発明の一態様において、前記第２電極体は、前記複数の第２電極を全て包含する金属板からなる。

本発明の電気化学測定用電極板において、好ましくは、前記各上層貫通孔の断面積は前記各第１電極の面積と実質的に同一であり、前記各基板貫通孔の断面積は前記各第２電極の面積と実質的に同一である。

本発明の一態様において、前記各上層貫通孔の断面形状および前記各基板貫通孔の断面形状は正四角形である。

本発明の一態様において、前記各上層貫通孔の断面形状および前記各基板貫通孔の断面形状は正六角形である。

また、上記電気化学測定用電極板は、参照電極および補助電極と組み合わされるか、または対極と組み合わされ、電気化学測定装置を構成する。この電気化学測定装置もまた、本発明の趣旨に含まれる。

そして、この電気化学測定用装置により、以下のような、電子メディエータを含有する試料液に含まれる目的物質を定量する方法もまた、本発明の趣旨に含まれる。本発明にかかる目的物質を定量する方法は、前記参照電極、前記補助電極、および前記電気化学測定用電極板、または前記対極および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触させる接触工程、前記第１電極体および前記第２電極体の一方に正電位を掃印し、他方に負電位を印加する、あるいは前記第１電極体および前記第２電極体の一方に正電位を印加し、他方に負電位を掃印し、前記第１電極体および前記第２電極体の間に流れる電流値を測定する電流測定工程、前記電流測定工程において得られた電流値から前記目的物質の量を算出する算出工程を包含する。
本発明の上記目的、他の目的、特徴および利点は、添付図面参照の下、以下の好適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。

本発明によれば、試料中に含まれる目的物質の濃度を、精度良くかつ高感度で測定することができる。

以下、本発明の好ましい実施の形態を、図面を参照しながら説明する。
（第１の実施形態）
図１は、第１の実施形態の電気化学測定用電極板を模式的に示す斜視図である。電気化学測定用電極板１は、下側から順に、下層１１、基板３１、上層４０が順に積層され、下層１１と基板３１との間に酸化電極体１２が挟まれ、基板３１と上層４０との間に還元電極体３２が挟まれている構成である。上層４０には、複数の上層貫通孔４１がマトリックス状に形成されている。より詳細には、横方向に８列、縦方向に４行、合計３２個の上層貫通孔４１が形成されている。各上層貫通孔４１はその断面形状が正方形であり、電気化学測定用電極板１の上面に還元電極体３２を露出させる上層貫通孔４１ｂと、電気化学測定用電極板１の上面に酸化電極体１２を露出させる上層貫通孔４１ａとが交互に等間隔で配置されている。上層貫通孔４１ａは、図１には示されない基板３１上の基板貫通孔を介して電気化学測定用電極板１の上面に酸化電極体１２を露出させる。平面視上、上層貫通孔４１が形成されている横方向の位置を順にＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、・・・、Ｈとし、縦方向の位置を順にａ、ｂ、ｃ、ｄとする。そして上層貫通孔４１（Ｘ、ｘ）は、横方向の位置がＸ（Ｘ＝Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、・・・、Ｈ）、縦方向の位置がｘ（ｘ＝ａ、ｂ、ｃ、ｄ）にある上層貫通孔４１を表す。

電気化学測定用電極板１は、酸化電極体１２に設けられている酸化電極リード１２ｃが端部近傍で露出するように形成されている切り欠き部３と、還元電極体３２に設けられている還元電極リード３２ｃが端部近傍で露出するように形成されている切り欠き部４とを有する。

図２は、図１に示す電気化学測定用電極板１の分解斜視図である。図２に示されるように、第１の実施形態にかかる電気化学測定用電極板１は、下側から順に、酸化電極設置層１０、還元電極設置層３０、および上層４０が積層されている。酸化電極設置層１０は、下層１１および下層１１の上面に設けられた酸化電極体１２からなる。還元電極設置層３０は、基板３１および基板３１の上面に設けられた酸化電極体３２からなる。下層１１、基板３１、上層４０はいずれも絶縁体である。

酸化電極体１２は、図２に示すように下層１１と基板３１との間に挟まれている。同様に、還元電極体３２は、基板３１と上層４０との間に挟まれている。

上層４０は、複数の上層貫通孔４１を有している。図２では、３２個の上層貫通孔４１が設けられている。３２個の上層貫通孔４１の内、左上の上層貫通孔４１ａ（ａ、Ａ）の横の上層貫通孔４１ｂ（ａ、Ｂ）およびこの上層貫通孔４１ｂを基点に縦方向および横方向に１個おきの貫通孔４１ｂからは、還元電極体３２の一部分が露出している。還元電極体３２のうち、各上層貫通孔４１ａから露出している部分、すなわち、図２において、酸化電極体３２上で斜線が施されている部分が、試料液と接し、還元電極３２ｄとして機能する。図２では、１６個の還元電極３２ｄが設けられている。還元電極体３２のうち、上層４０が形成されている部分、すなわち、図２において還元電極体３２上で斜線が施されず、白く表されている部分は、試料液と接することがない。よって、この部分は、還元電極としては機能しない。還元電極体３２は、上層貫通孔４１ｂから露出する部分を、隣接する二つの列を行き来して縦方向に順次連結しながら延設されたジグザグ状の形状を有する複数の枝部３２ａと全ての枝部３２ａの一端が接続される幹部３２ｂとからなる。また、還元電極体３２は、その幹部３２ｂの一端に還元電極リード３２ｃを有している。

基板３１は、複数の基板貫通孔３３を有している。図２では、１６個の基板貫通孔３３が設けられている。１６個の基板貫通孔３３は、上層貫通孔４１のうち、還元電極体３２の一部分を露出させない１６個の上層貫通孔４１ａと位置及び形状が一致し重なるように設けられている。上層貫通孔４１のうち、還元電極体３２の一部分を露出させない１６個の上層貫通孔４１ａからは、基板貫通孔３３を介して酸化電極体１２の一部分が露出している。すなわち、図２において、酸化電極体１２上で斜線が施された部分が、試料液と接し、酸化電極１２ｄとして機能する。図２では、１６個の酸化電極１２ｄが設けられている。酸化電極体１２のうち、基板３１が形成されている部分、すなわち、図２において、酸化電極体１２上で斜線が施されず、白く表されている部分は、試料液と接することがない。よって、この部分は、酸化電極としては機能しない。酸化電極体１２は、上層貫通孔４１ａから基板貫通孔３３を介して露出する部分を、隣接する二つの列を行き来して縦方向に順次連結しながら延設されたジグザグ状の形状を有する複数の枝部１２ａと全ての枝部１２ａの一端が接続される幹部１２ｂとからなる。酸化電極体１２は、その幹部１２ｂの一端に還元電極リード１２ｃを有している。

本実施形態の電気化学測定用電極板１における酸化電極体１２及び還元電極体３２の形状について、図３を用いてより具体的に説明する。本実施形態において、それぞれの枝部１２ａ及び３２ａは、「ジグザグ状」をなす。用語「ジグザク状」とは、一般的に直線が左右に何回も折れ曲がっている形状ないしはおよそＺ字型の配線を周期的に配列した形状を指し、本明細書においても同様である。図３は、酸化電極体１２及び還元電極体３２の枝部１２ａ及び３２ａの一部形状を模式的に表す平面図である。図３に示すように、本実施形態における「ジグザグ状」は、長手方向に延び出ている長手方向延設部５１、５３、５５、５７と、異なる列上の最も近接する長手方向延設部同士を接続し、かつ長手方向延設部に対して角度Ｒで配設されている接続部５２、５４、５６とからなる形状である。長手方向延設部５１、５３、５５，５７はそれぞれ酸化電極１２ｄまたは還元電極３２ｄを包含する。

図２に戻る。上層貫通孔４１と基板貫通孔３３とはいずれも鉛直方向に貫通され、鉛直方向に実質的に一定の断面形状及び一定の断面積を有する形状である。各上層貫通孔４１の面積と各基板貫通孔３３の面積とは実質的に同一である。その断面形状は正方形であり、その断面積は、例えば１μｍ^２〜１００００μｍ^２である。１００００μｍ^２を超えると、図１８の右側で示されるような望ましくない反応が生じてしまい、結果的に、高感度化に課題を生じる。下層１１、基板３１、および上層４０の厚みはそれぞれ５μｍ以上１００μｍ以下が好ましい。還元電極３２ｄの面積は上層貫通孔４１ｂの断面積と同じであり、酸化電極１２ｄの面積は基板貫通孔３３の断面積と同じである。

酸化電極体１２と還元電極体３２にはそれぞれ独立して電位を印加することができ、それぞれの電極上で目的物質の電気化学反応、より具体的には酸化反応と還元反応とを進行させることができる。酸化電極１２ｄ上における電気化学反応によって発生した電気信号は酸化電極体１２を伝わり、酸化電極リード１２ｄを介してガルバノメーター等の計測器で定量することができる。同様に還元電極３２ｄ上における電気化学反応によって発生した電気信号は還元電極体３２を伝わり、還元電極リード３２ｄを介してガルバノメーター等の計測器で定量することができる。

各酸化電極１２ｄは、平面視において、上下および左右方向の４方向に中心間距離が同じである４つの還元電極３２ｄと隣接する。同様に、各還元電極３２ｄは、平面視において、上下および左右方向の４方向に中心間距離が同じである４つの酸化電極１２ｄと隣接する。すなわち、各電極３２ｄ、１２ｄは、電気化学的に対となって作用し得る４つの電極３２ｄ、１２ｄが隣接することになり、本実施形態の電気化学測定用電極板１を用いて試料溶液中の酸化還元物質を電気化学法により定量する際は効率的なレドックスサイクルにより前記酸化還元物質を精度良く定量することができる。

次に本実施形態の電気化学測定用電極板１を構成する部材の材料について具体的に述べる。下層１１として、表面或いは全体が絶縁性を有する基板を用いる。例えば、シリコン基板の表面に絶縁層としてのＳｉＯ_２膜が被覆された酸化膜付きシリコン基板、石英ガラス板、酸化アルミニウム基板、ポリエチレンテレフタレートフィルム、ポリエチレンナフタレートフィルム、ポリイミドフィルム等の樹脂材料等からなる基板を用いることができる。

酸化電極体１２及び還元電極体３２は金属、金属酸化物、半導体等の電気伝導性を有する材料で形成されている。電気伝導性を有する材料として、金、白金、パラジウム、銀、クロム、チタン、ニッケル等の金属、ｐ及びｎ型シリコン、ｐ及びｎ型ゲルマニウム、硫化カドミウム、二酸化チタン、酸化亜鉛、ガリウム燐、ガリウム砒素、インジウム燐、カドミウムセレン、カドミウムテルル、二砒化モリブデン、セレン化タングステン、二酸化銅、酸化スズ、酸化インジウム、インジウムスズ酸化物等の半導体、その他ケッシェンブラック等の導電性カーボンを用いることができる。電極材料として安定である金、白金、パラジウムを用いることが好ましい。

基板３１及び上層４０は、ＳｉＯ₂に代表されるシリコン酸化物または窒化シリコンを
用いて、常圧ＣＶＤ、減圧ＣＶＤ、プラズマＣＶＤ、スパッタ等の方法により形成することができる。また、スピンオングラス（東京応化工業株式会社）、エラストジル（旭化成ワッカーシリコーン株式会社製）等のシリコン樹脂、カプトン（東レ・デュポン株式会社製）等のポリイミド及びその誘導体、ジェイイーアール（ジャパンエポキシレジン株式会社製）等のエポキシ樹脂、スミコン（住友ベークライト株式会社製）等の熱硬化製樹脂、ピーエムイーアール（東京応化工業株式会社製）やエスユーエイト（化薬マイクロケム株式会社製）等のフォトレジスト剤または感光性樹脂等の樹脂材料をスピンコート等により塗布し、ベーキング、電子線や紫外線による露光、現像工程等を組み合わせた手法により作製することができる。後述する孔形成工程における加工の容易さから、シリコン酸化物や窒化シリコン、フォトレジスト材または感光性樹脂を用いることが好ましい。

また、電気化学測定用電極板１を製造する際には、下層１１の上面に酸化電極体１２を、基板３１の上面に還元電極体３２を形成すべく、導電性材料のパターニングを行う。電極のパターニングには蒸着、スパッタ等の成膜手法とエッチング手法を組み合わせた方法、成膜手法とメタルマスクを組み合わせて行う手法、フォトレジストを用いて行うリフトオフ法、マスクを用いたスクリーン印刷、レーザアブレーション法、またはインクジェットプリント法による直接描画手法を用いることができる。

下層１１上に順次積層し、還元電極体３２を形成した後、フォトレジストまたは感光性樹脂材料を材料として上層４０の形成を行う場合について説明する。上層４０の形成に用いる感光性樹脂の前駆体材料を還元電極体３２が形成されている基板３１上に塗布し、ベーキング工程を行う。そこに正方形の同一面積を有する複数の孔が横方向及び縦方向において同一の中心間距離で配列されているパターンを有する画像マスクを重ね、電子線、紫外線等によりマスクパターンを露光し、現像してパターンを基板上のフォトレジスト或いは感光性樹脂材料に転写した後、現像、ベーキングを行うことにより上層貫通孔４１を有する上層４０が得られる。これをマスクにして基板３１をエッチングすることにより、基板貫通孔３３を形成する。もしくは上層４０を積層する工程の前に基板貫通孔３３を形成しても良い。

以上の製造方法によれば、同一の断面形状及び同一の断面積を有する上層貫通孔４１と基板貫通孔３３を容易に形成することができ、これにより酸化電極１２ｄと還元電極３２ｄのそれぞれからの反応生成物濃度を揃えることが容易となる。また、対電極の中心間距離を一定に揃えることで各々の対電極間で進行するレドックスサイクル反応の速度を等しくすることができる。これらの作用により、素早く定常状態に達することが可能となる。結果、試料液中に含まれる目的物質の定量を精度良く実施することができる。

本実施形態の電気化学測定用電極板１では、上層貫通孔４１、基板貫通孔３３が試料液の通り道となるため、試料液が水溶液である場合には、上層貫通孔４１、基板貫通孔３３の内壁が親水性であることが望ましい。そのため、上層４０および基板３１としては、シリコン基板、ガラス基板などの親水性表面を有する基板か、または親水性のポリエチレンテレフタレートあるいはポリエチレンナフタレート基板などのポリエステル材からなる基板を選択することが望ましい。疎水性を有する基板を使用する際には、エタノール、イソプロピルアルコールなどによって上層貫通孔４１または基板貫通孔３３の内壁に親水化処理を施すことが望ましい。

［電気化学測定装置の説明］
図４は、第１の実施形態に係る電気化学測定用電極板を有する電気化学測定装置（以下、単に「測定装置」という）を示している。

図４に示すように、測定装置２７において、電気化学測定用電極板１、参照電極２２、および補助電極２３が試料容器２４に満たされた試料液に浸されている。これにより、これらの電極が試料液に接触する。また、電気化学測定用電極板１の表面には、酸化電極１２ｄおよび還元電極３２ｄが横方向および縦方向に交互に複数個形成されて、電極の集合体２１を形成している。参照電極２２は電気化学測定用電極板１に印加する電位の基準となる電極である。参照電極２２が試料液中で示す電位をゼロとして、酸化電極１２ｄ、還元電極３２ｄそれぞれに電位を印加する。

補助電極２３は、測定装置２７においてアンペアの法則を成り立たせるために、電流を補償するための電極である。制御装置２５は、酸化電極リード１２ｃおよび還元電極リード３２ｃを介して電気化学測定用電極板１と電気的に接続されており、同様に参照電極２２、補助電極２３ともに電気的に接続されている。レコーダー２６により、制御装置２５から出力された電流応答が記録される。

［電気化学測定方法の説明］
次に、試料液に含まれる電子メディエータの定量方法を説明する。

サイクリックボルタンメトリー等の手法により、電子メディエータの酸化反応が進行する電位と還元反応が進行する電位を予め調べておいて、後に説明する酸化電極の電位の値と還元電極の電位の値に用いる。なお、電位の基準は参照電極２２が試料液中で示す平衡電位である。すなわち、酸化電極１２ｄおよび還元電極３２ｄにそれぞれ印加される電位は、参照電極２２を０Ｖとした場合における相対的な電位である。

酸化電極１２ｄと還元電極３２ｄの電位を制御装置２５に入力したのち、測定を開始する。後述する実施例では詳細に説明するが、具体的には、酸化電極１２ｄに０Ｖから正電圧をゆっくりと印加する。後述する実施例では、酸化電極１２ｄに印加される電圧を０Ｖから＋０．７Ｖにゆっくりと変化させている。なお、これを「掃印」と呼ぶ。すなわち、本明細書において用いられる用語「掃印」とは、連続的に電位を変化させることを意味している。これとは対照的に、本明細書において用いられる用語「印加」とは、あらかじめ定められた電位に急激に変化させることを意味している。

このとき、還元電極には参照電極と同一の電位（多くの場合、０Ｖ）を印加し続けることが好ましい。酸化電極１２ｄに電圧を印加する速度（以下、「掃印速度」ということがある）は、一般的に５ｍＶ／秒以上５００ｍＶ／秒以下である。後述する実施例では、１００ｍＶ／秒である。

なお、上記の説明では、酸化電極１２ｄに正電位を掃印し、還元電極３２ｄに負電位を印加している。しかし、酸化電極１２ｄに正電位を印加し、還元電極３２ｄに負電位を掃印してもよい。

酸化電極１２ｄにおける酸化反応で得られた電流は酸化電極リード１２ｃを介して制御装置２５によって検出される。同様に還元電極３２ｄにおける還元反応で得られた電流は還元電極リード３２ｃを介して制御装置２５によって検出される。検出された電流はレコーダー２６に出力され、記録された酸化電流値を標準試料の酸化電流測定結果（後述する検量線）と比較して、試料液中の検出対象物質を定量することができる。

レコーダー２６に記録された還元電流値を標準試料の還元電流測定結果と比較して試料液中の検出対象物質を定量することもできる。このためには、予め本実施の形態の検出装置を用いて標準試料の検量線を作成しておくことが望ましい。

ここで、検量線を用いた、試料液中の検出対象物質を定量する方法、すなわち、試料液中の検出対象物質の濃度を算出する方法について説明する。

まず、標準試料を準備する。この標準試料には、濃度既知の還元型電子メディエータ（ここでは、フェロシアン化カリウムと仮定する）が含まれている。この濃度既知の標準試料を試料液として用いて、図４に示すような電気化学測定装置により、還元型電子メディエータの濃度と、電気化学測定装置により測定された反応電流値との間の関係をグラフ化する。このグラフの一例を図５に示す。

図５の上のグラフに示したように、フェロシアン化カリウム濃度に対して反応電流値をプロットし、検量線を作成する。すると、図５の下のグラフに示したように、ある未知濃度の試料について反応電流値が２０μＡ得られた場合、作成した検量線からフェロシアン化カリウム濃度が２００μＭとわかるため、検量線を用いた濃度未知の試料について、フェロシアン化カリウム濃度の定量が可能となる。
図４に示されるように、ここでは、還元型の電子メディエータの濃度が１００μＭである場合には、反応電流値は１０μＡ、還元型の電子メディエータの濃度が３００μＭである場合には、反応電流値は３０μＡ、還元型の電子メディエータの濃度が５００μＭである場合には、反応電流値は５０μＡであったと仮定する。これらをグラフ上にプロットして、検量線を引く。このようにして、濃度既知の標準試料から、検量線を得る。

次に、濃度不知の試料液を用いて、図４に示すような電気化学測定装置により反応電流値を得る。ここで得られた反応電流値が２０μＡであった場合、検量線から、試料液に含まれる還元型の電子メディエータの濃度を知ることができる。この還元型の電子メディエータの濃度から、試料液に含まれる（あるいは、含まれていた）目的物質の量を算出する。

なお、実際には、検量線の作成や目的物質の量の算出などは、すべてコンピュータ上で行われることは言うまでもないであろう。

［参照電極、補助電極に関する説明］
参照電極２２と補助電極２３の二つの電極の代わりに、対極一つを用いて測定を行うことも可能である。しかし参照電極２２と補助電極２３は独立して設けることが好ましい。なぜなら、電位の基準となる参照電極もしくは対極に電流が流れる間には、その表面で電極の反応が進行しており、反応進行に伴う電子メディエータの濃度変化が大きくなると本実施の形態の検出装置の基準としている電位が変動して正確な測定を行うことができないためである。

よって、参照電極２２には電流が流れ込まないように入力インピーダンスを極力大きく設定することが望ましい。望ましくはインピーダンスの値が１０の６乗オーム以上であることが望ましい。参照電極２２には、銀塩化銀電極、飽和カロメル電極等を用いることができる。

補助電極２３の表面積は大きいことが望ましい。補助電極２３の好ましい表面積は電極の集合体２１の１０倍以上である。その理由は、補助電極２３の電極表面積が小さくて十分な電流を流せない場合、電気化学測定用電極板１で得られる電流が制御装置２５に十分流れ込まなくなり、正確な電流値を得られないことや、電流を流すために補助電極２３の電位が大きく変動して水の電気分解等望ましくない反応が進行する場合があるためである。

補助電極２３としては、電極自体の酸化還元反応や腐食反応が起こりにいくい貴金属電極を使用することが望ましい。例えば、白金線に白金黒を析出させて大きな電極面積を持たせた白金電極が好ましい。

図６に、図４に示す電気化学測定装置とは異なる測定装置を構成する電極板を示す。図４に示す電気化学測定用電極板６０は、第１の実施形態の電気化学測定用電極板１に、一体的に参照電極６１及び補助電極６２が形成されている。参照電極６１及び補助電極６２は、上層４０上に形成されている。すなわち、第１の実施形態の電気化学測定用電極板１の表面にレジストを塗布し、そこに参照電極及び対極のパターンを有する画像マスクを重ねた後、紫外線或いは電子線によりパターンを露光し、現像してパターンを基板上のレジストに転写する。その後、スパッタ、蒸着、CVD、スクリーン印刷、インクプリント等の
手法により電極層を形成し、その後レジストを剥離するリフトオフ法により参照電極６１、補助電極６２を作製して作用電極である酸化電極１２ｄ及び還元電極３２ｄ、参照電極６１、補助電極６２が一体化された電極板６０を得ることができる。この場合、参照電極６１を作製するためには、作用電極以外の電極を１本選択し、その上に指示物質となる金属、有機酸化還元性高分子をめっき、電解重合法、印刷法により形成して作製する。また、参照電極６１上の指示物質としては銀、塩化銀、ポリビニルフェロセン等を挙げることができる。

電気化学測定用電極板６０によると、作用電極、参照電極、対極の３電極が平板状の同一電気化学測定用電極板６０内に形成されているため、これを用いて構成した電気化学測定用装置は、少量の試料や微量濃度領域の測定に適しており、生体試料の分析に好適である。

（第２の実施形態）
図７は、第２の実施形態の電気化学測定用電極板７０を模式的に示す分解斜視図である。本実施形態の電気化学測定用電極板７０は、第１の実施形態の電気化学測定用電極板１とは、上層４０および基板３１に形成される貫通孔の形状が正方形ではなく正六角形であり、上層４０および基板３１における貫通孔の配列が異なり、また酸化電極体１２の枝部１２ａおよび還元電極体３２の枝部３２ａの形状が異なる。以下、第１の実施形態の電気化学測定用電極板１と異なる点のみ説明する。

本実施形態の電気化学測定用電極板７０においては、上層貫通孔４１、および基板貫通孔３３の断面形状が正六角形である。まず、上層４０における複数の上層貫通孔４１の配列を説明する。上層貫通孔４１が配置されている横方向の位置にＡ〜Ｐの符号を付し、縦方向の位置にａ〜ｄの符号を付している。縦方向の位置ａとｃにおいて横方向の位置（Ａ，Ｃ，Ｅ，・・・，Ｋ，Ｍ，Ｏ）に上層貫通孔４１が形成される。縦方向の位置ｃとｄにおいて、同様に（Ｂ，Ｄ，Ｆ，・・・，Ｌ，Ｎ，Ｐ）に上層貫通孔４１が形成される。図８は、上層４０における上層貫通孔４１の配列の一部を示す上面図である。図８においては、便宜上、還元電極３２ｄを露出させる上層貫通孔４１ｂのみにハッチングを付して、酸化電極１２ｄを露出させる上層貫通孔４１ａと区別している。また、いくつかの上層貫通孔４１に最近接する上層貫通孔４１との間に直線を付し、最近接する上層貫通孔４１との位置関係を確認しやすいようにしている。上層４０上、各行（縦方向の位置がａ〜ｄ）において行方向に上層貫通孔４１ｂと上層貫通孔４１ａとが交互に同一の中心間距離となるように配列されている。そして、一行置きに同一の配列が繰り返される。１つの上層貫通孔４１ａは、４つの上層貫通孔４１ｂと等間隔で配列される。同様に、１つの上層貫通孔４１ｂは、４つの上層貫通孔４１ａと等間隔で配列される。例えば、１つの上層貫通孔４１ａ（Ｄ，ｂ）に着目すると、周囲には４つの上層貫通孔４１ｂ（Ｅ，ａ）、（Ｂ，ｂ）、（Ｅ，ｃ）、（Ｆ，ｂ）が同一の中心間距離で近接するように構成されている。

基板３１においては、上層貫通孔４１ａに対応するように基板貫通孔３３が形成されている。また、還元電極体３２は、基板貫通孔３３に接触せず、上層貫通孔４１ｂに対応する領域を包含するように形成されている。より具体的には、還元電極体３２の枝部３２ａは、上層貫通孔４１ｂが形成されている隣接する二つの列（ＡとＢ、ＣとＤ、ＥとＦ、・・・、ＭとＮ、ＯとＰ）を一組として、同一組内の上層貫通孔４１ｂに対応する領域を含み、かつこれらを交互に連結するように一方から他方に延設されジグザグ状をなす。そして、幹部３２ｂには、全ての枝部３２ａの一端が接続され、枝部３２ａで得られた電流を集約する。

また、酸化電極体１２は、複数の枝部１２ａと幹部１２ｂにより、還元電極体３２と同様の形状をとる。

上層貫通孔４１および基板貫通孔３３は、いずれも鉛直方向に貫通され、鉛直方向に実質的に一定の断面形状及び一定の断面積を有する形状である。その断面形状は正六角形であり、その断面積は、好ましくは１μｍ^２〜１００００μｍ^２である。

本実施形態の電気化学測定用電極板７０は上記構成を有することにより、第１の実施形態の電気化学測定用電極板１と同様の効果が得られ、本実施形態の電気化学測定用電極板７０を用いて試料溶液中の電子メディエータ濃度を電気化学法により定量する際は効率的なレドックスサイクルにより電子メディエータ濃度を精度良く定量することができる。

（第３の実施形態）
図９は、第３の実施形態の電気化学測定用電極板８０を模式的に示す分解斜視図である。本実施形態の電気化学測定用電極板８０は、第１の実施形態の電気化学測定用電極板１とは、酸化電極体１２の形状が異なる。本実施形態において、酸化電極体１２は、枝部を有さず、基板貫通孔３３に対応する領域の全てを包含するような金属板からなる。本実施形態においては、酸化電極体１２の微細なパターニング工程が不要となる。

（第４の実施形態）
図１０は、第４の実施形態の電気化学測定用電極板８１を模式的に示す分解斜視図である。本実施形態の電気化学測定用電極板８１は、第１の実施形態の電気化学測定用電極１とは、酸化電極体１２の形状と還元電極体３２の形状が異なる。本実施形態における酸化電極体１２は、枝部を有さず、基板貫通孔３３に対応する領域の全てを包含するような金属板からなる。還元電極体３２は、同じく枝部を有さず、基板貫通孔３３が形成されている領域より一回り大きく欠除されてなる複数の欠除部３２ｅを有する金属板からなる。

（第５の実施形態）
図１１は、第５の実施形態の電気化学測定用電極板８２を模式的に示す分解斜視図である。本実施形態の電気化学測定用電極板８２は、図７に示す第２の実施形態の電気化学測定用電極７０とは、酸化電極体１２の形状と還元電極体３２の形状が異なる。酸化電極体１２は、枝部を有さず、基板貫通孔３３に対応する領域の全てを包含するような金属板からなる。さらに、還元電極体３２は、枝部を有さず、基板貫通孔３３が形成されている領域より一回り大きく欠除されてなる複数の欠除部３２ｅを有する金属板からなる。

（第６の実施形態）
図１２は、第６の実施形態の電気化学測定用電極板８３を模式的に示す分解斜視図である。本実施形態の電気化学測定用電極板８３は、第１の実施形態の電気化学測定用電極１とは、還元電極体３２の形状が異なる。本実施形態における還元電極体３２は、枝部を有さず、基板貫通孔３３が形成されている領域より一回り大きく欠除されてなる複数の欠除部３２ｅを有する金属板からなる。

（第７の実施形態）
図１３は、第７の実施形態の電気化学測定用電極板８４を模式的に示す分解斜視図である。本実施形態の電気化学測定用電極板８４は、図７に示す第２の実施形態の電気化学測定用電極７０とは、還元電極体３２の形状が異なる。本実施形態における還元電極体３２は、枝部を有さず、基板貫通孔３３が形成されている領域より一回り大きく欠除されてなる複数の欠除部３２ｅを有する金属板からなる。

以上の実施の形態では作用電極として２つの作用電極（酸化電極、還元電極）が形成されている場合について示したが、本発明はこれに限らず、さらに他の電極が形成されており、作用電極を２つ以上任意に組み合わせて使用するような構成であってもよい。このような構成を有する電気化学測定用電極板を用いて２つの電極間でレドックスサイクル反応を進行し、その他の電極を用いて試料液中に含まれる妨害物質の除去反応を進行することもできる。このような構成を有する電気化学測定用電極板は妨害物質の電流応答を除外することができ、さまざまな成分からなる試料液の分析に適することから、種々の成分から構成される生体試料の分析に好適である。

なお、以上の実施形態と同様の構成の電気化学測定用電極板を用いて、酸化電極体１２及び還元電極体３２においてそれぞれ上記とは逆の化学反応（酸化反応と還元反応）が進行するように使用してもよい。すなわち電極体１２を還元電極体として、電極体３２を酸化電極体として使用してもよい。

また、以上の実施形態では、上層貫通孔４１および基板貫通孔３３の形状が正方形である場合（第１、第３、第４の実施形態）と、正六角形である場合（第２、第５の実施形態）のみについて示したが、本発明はこれに限定されず、各孔の断面形状が同一であれば、長方形、または他の多角形、円形であってもよい。ただし、正方形または正六角形が好ましい。

還元電極体３２のパターンは、上層貫通孔４１ｂに対応する領域を全て包含し、かつ基板貫通孔３３に接触しないパターンであれば上記実施形態に示すパターン以外のパターンであっても良い。また酸化電極体１２のパターンは、基板貫通孔３３に対応する領域を全て包含するパターンであれば、上記実施形態に示すパターン以外のパターンであっても良い。

本発明の電気化学測定用基板は、酸化電極１２ｄ及び還元電極３２ｄを、基質を酸化若しくは還元する酵素等の酸化還元剤、及び電子メディエータを含む試料液に接触させ、酸化電極１２ｄと還元電極３２ｄに電圧を印加し、酸化電極体１２又は還元電極体３２に流れる電流を測定することにより、基質を定性測定することができ、またその電流値が基質の濃度に依存することを利用して、基質を定量測定することができる。

以下、実施例及び比較例の電気化学測定用電極板を製造し、酸化還元物質の電気化学的測定を行った。

（実施例１の電極体）
実施例１として、第１の実施形態の電気化学測定用電極板１を製造した。なお、図１に示す電気化学測定用電極板１とは、上層貫通孔４１の個数が異なる。図１４は、その製造工程を示す断面図である。まず、厚さ１μｍのＳｉＯ_２ 膜を表面に形成した厚さ０．５ｍｍのシリコン基板（信越化学工業株式会社製）を下層１１用の基板として用い（図１４（ａ））、その上にレジスト材の密着性を高めるために下層膜材料（マイクロケム株式会社製：ＭＣＣ ＰＲＩＭＥＲ ８０／２０）をスピンコート法により塗布し、１１０℃で１８０秒間ベーキングを行った。その上にレジスト材（東京応化工業株式会社製:ＴＳＭ
Ｒ−８９００ＬＢ）を２〜３μｍの厚みに塗布した。この基板をオーブン中に入れプレベーキング工程を１００℃, ３０分で行った。次に、クロムマスクを用いて、マスクアライナー（ミカサ株式会社製）により６０秒間密着露光した。次に現像液中にて２５℃１２０秒間現像を行い、水洗、乾燥してマスクパターンをレジストに転写した。その後、ポストベーキング工程を１２０℃, ３０分の条件にて行った。

このレジストパターンが施された基板をスパッタ装置（株式会社 アルバック製）内の所定位置に取り付け、クロム、及び金を順次成膜した。圧力１．３Ｐａ，アルゴン雰囲気で、クロムを１０秒間，金を５０秒間スパッタし全体で１３０ｎｍの膜厚とした。その後、基板をメチルエチルケトン中に浸漬して超音波処理を行い電極形成部分以外のレジストを剥離して酸化電極体１２を得た（図１４（ｂ））。

次に酸化電極体１２の上面にプラズマＣＶＤ装置(株式会社 アルバック製)を用いてＳｉＯ_２の堆積を行った。シランガス流量１０ｓｃｃｍ、Ｎ_２Ｏガス流量２００ｓｃｃｍ、圧力８０Ｐａ，パワー５０Ｗ、基板温度３００℃で５分間堆積を行った結果、４３０ｎｍのＳｉＯ_２膜が形成され、絶縁層である基板３１を得た（図１４（ｃ））。その上に酸化電極体１２のパターンの形成と同様の工程を経て還元電極体３２を得た（図１４（ｃ））。

還元電極体３２を形成した基板表面にスピンコート法により感光性樹脂材料（化薬マイクロケム株式会社製：ＳＵ−８ ２０００）を厚みが１μｍとなるように塗布、７０℃３０分間ベーキングした後、上層貫通孔４１ａ、４１ｂの配列パターンを有するクロムマスクを用いて６０秒間密着露光することにより、マスクパターンを樹脂材料に転写した。転写した後、現像液中にて２０℃、３００秒間現像を行い、水洗、乾燥して還元電極３２ｄを露出させる上層貫通孔４１ｂのパターン（１００μｍ^２、１００００個）及び酸化電極１２ｄを露出させる上層貫通孔４１ａ（１００μｍ^２、１００００個）のパターンを絶縁層である上層４０に形成した（図１４（ｄ））。なお、最近接する上層貫通孔４１ａと４１ｂの中心間距離は１５μｍとした。次に、転写したパターンをマスクとして反応性イオンエッチング装置中にてＣ_２Ｆ_６ガスの流量を２５ｓｃｃｍ、圧力０．２５Ｐａ、１５０Ｗの条件で１５分間SiO₂のエッチングを行い、基板３１における基板貫通孔３３のパターンを得た（図１４（ｅ））。形成した電気化学測定用電極板１の表面積は３ｍｍ^２であった。

以上の工程により、実施例１の電気化学測定用電極板を得た。

(比較例１の電極体)
比較例１として、図１７に示す従来の構造を有する電気化学測定用電極板を製造した。図１５は、比較例１の電極体の製造工程を示す断面図である。図１５（ａ）に示す基板２０１として１μｍのＳｉＯ_２膜を表面に形成した厚さ０．５ｍｍのシリコン基板（信越化学工業株式会社製）を用いた。それをスパッタ装置（株式会社 アルバック製）内の所定位置に取り付け、メタルマスクをセットした後クロム、及び金を順次成膜した。圧力１．３Ｐａ，アルゴン雰囲気で、クロムを１０秒間，金を５０秒間スパッタし、全体で１３０ｎｍの膜厚とすることにより、下部電極体２０２を得た（図１５（ｂ））。次にメタルマスクを外して下部電極体２０２の上層にプラズマＣＶＤ装置(株式会社 アルバック製)を用いて絶縁膜としてのＳｉＯ_２を堆積した。スパッタ条件として、シランガス流量１０ｓｃｃｍ、Ｎ_２Ｏガス流量２００ｓｃｃｍ、圧力８０Ｐａ，パワー５０Ｗ、基板温度３００℃として、５分間堆積を行った。その結果、４３０ｎｍのＳｉＯ_２膜を形成し、絶縁層２０８を得た（図１５（ｃ））。

その上に別のメタルマスクを装着し、下部電極体２０２の形成と同様の条件を用いてクロム―白金を１３０ｎｍ成膜した。それにより、表面電極２０４を形成した（図１５（ｄ））。次にその基板上にレジスト材（東京応化工業株式会社製:ＴＳＭＲ−８９００ＬＢ
）を２〜３μｍの厚みに塗布した。このレジスト塗布成膜済基板をオーブン中に入れプレベーキング工程を１００℃, ３０分で行った。その後、クロムマスクを用いて、マスクアライナー（ミカサ株式会社製）により６０秒間密着露光した。次に現像液中にて２５℃１２０秒間現像を行い、水洗、乾燥してマスクパターンをレジスト２０９に転写した（図１５（ｅ））。ポストベーキング工程を１２０℃, ３０分の条件にて行った。

先ほど作製したマスクパターンを転写したレジスト２０９を有する基板はアルゴンミリング装置に入れ、アルゴンガスの流量１２ｓｃｃｍ、圧力０．０３Ｐａ、ビーム電流９０ｍＡの条件で金、クロムを順次エッチングしたのち、反応性イオンエッチング装置に入れ、Ｃ_２Ｆ_６ガスの流量を２５ｓｃｃｍ、圧力０．２５Ｐａ、１５０Ｗの条件で１５分間ＳｉＯ_２のエッチングを行った。その結果、下部電極体２０２の一部（以下、酸化電極２０２ａ）が底面において露出された多数の微細孔２０５を持つ電極板を得た。形成した微細孔２０５は１００μｍ^２、１００００個、中心間の距離は１１０μｍ、表面電極２０４の形成面積は３００ｍｍ^２であった。

〈実施例１及び比較例１の電気化学測定用電極板を用いた電気化学的測定〉
実施例１で作製した電気化学測定用電極板と比較例１で作製した電気化学測定用電極板とを用いた電気化学測定装置を構成し、電子メディエータの応答電流を測定した。かかる電気化学測定装置において、酸化電極１２ｄと還元電極３２ｄ（比較例１においては、酸化電極２０２ａと表面電極２０４）は、試料液に露出されるように構成されている。フェロシアン化カリウムを1ｍｍｏｌ／ｌ、フェリシアン化カリウムを1ｍｍｏｌ／ｌの合計2ｍｍｏｌ／ｌを電子メディエータとし、５０ｍｍｏｌ／ｌの支持電解質（塩化カリウム）に溶解した水溶液を試料液として用いた。参照電極は銀／塩化銀電極（ＢＡＳ株式会社製）を用いた。補助電極には白金線を用いた。

実施例１の電気化学測定用電極板をバイポテンシオスタット（ＣＨ ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ社製：ＡＬＳ７４０Ａ）にリード線を介して接続し、酸化電極１２ｄの電位を参照電極に対し０から＋０．７Ｖ、還元電極３２ｄの電位を０Ｖに、電位の掃印速度を１００ｍＶ／ｓに設定してサイクリックボルタンメトリー法により酸化電極１２ｄに流れる反応電流を計測した。

また比較例１の電気化学測定用電極板を同じくバイポテンシオスタットにリード線を介して接続し、酸化電極２０２ａの電位を参照電極として用いた銀／塩化銀電極に対して０から+０．７Ｖまで掃印速度１００ｍＶ／ｓで掃引した。このとき、表面電極２０４の電位は参照電極に対して０Ｖに設定した。

その結果、比較例１の電気化学測定用電極板において、酸化電極２０２ａの電位が＋０．６から＋０．７Ｖにかけてフェロシアン化カリウムの酸化反応に伴う定常電流が観測され＋０．７Ｖにおける値は１５．１μＡであった。下記式１にフェロシアン化カリウムの酸化反応式を示す。

一方、実施例１の電気化学測定用電極板においても酸化電極１２ｄの電位が＋０．６から＋０．７Ｖにかけてフェロシアン化カリウムの酸化反応に伴う定常電流が観測された。＋０．７Ｖにおける値は３９．１μＡであった。比較例１の電気化学測定用電極板における値よりも大きな電流値が観測されたのは、図１８の自己誘発レドックスサイクルの説明図に当てはめて考えてみると、比較例１においては表面電極２０４（マクロ電極２２２）で酸化されていたフェロシアン化カリウムが、実施例１においては還元電極３２ｄ（微小電極２２１）上で効率的に酸化されたため、酸化反応の電流値が増加したものと考えられる。このように、本実施例の電気化学測定用電極板においては同一形状と面積を有する微小電極対が基板上に多数配列されていることにより、それぞれの電極対同士で反応面積が揃い、両極間で効率的なレドックスサイクル反応が進行していると考えられる。

また、比較例１の酸化電極２０２ａおよび実施例１の酸化電極１２ｄに対して、自然電位＋０．４Ｖまで電位を急速に掃印して得られる酸化電流の時間依存性を評価した。そのとき、比較例１の表面電極２０４及び実施例１の還元電極３２ｄの電位は０Ｖに保った。その結果、比較例１の酸化電極２０２ａの電流が定常状態に達するのに２６秒を要したのに対し、実施例１の酸化電極１２ｄは６秒で定常状態に達した。このことは、比較例１の酸化電極２０２ａは表面電極２０４が定常状態に達する時間が必要であったのに対し、実施例１の酸化電極１２ｄは同一の面積と形状を有する電極対間で即座に定常状態に達したと考えられる。

以上の結果から、実施例１の電気化学測定用電極板においては、高感度で、迅速な測定が可能であることがわかった。

（実施例２の電気化学測定用電極板）
実施例２において、各孔の断面形状が正六角形である第２の実施形態の電気化学測定用電極板を製造した。製造方法は、実施例１において基板３１の形成にプラズマＣＶＤ法を用いたが、それに代えてスパッタ法により形成した点のみ実施例１の製造方法と異なる。

酸化電極体１２を形成した基板をスパッタ装置（株式会社 アルバック製）内の所定位置に取り付け、酸素ガス流量５ｓｃｃｍ、アルゴンガス流量５ｓｃｃｍ、圧力０．３Ｐａ、パワー５００Ｗ、陽極電流０．３５Ａ、陽極電圧２．２１ｋＶ、ターゲットと基盤間の距離を５０ｍｍとし、２５分間堆積を行い、基板３１を形成した。それ以降は実施例１と同様の工程を経て感光性樹脂材料を還元電極体３２を形成した基板表面に塗布した。次に正六角形の孔のパターンを有するマスクパターンを感光性樹脂材料に転写し、上層貫通孔４１および基板貫通孔３３を形成する工程を経て、本実施例の電気化学測定用電極板を得た。各孔の面積は２１．７μｍ^２、還元電極３２ｄを露出する上層貫通孔４１ｂ及び酸化電極１２ｄを露出させる上層貫通孔４１ａの個数を共に１００００個とした。上層貫通孔４１ａは４つの上層貫通孔４１ｂと最近接するように形成し、その中心間距離を１５μｍとした。同様に、上層貫通孔４１ｂは４つの上層貫通孔４１ａと最近接するように形成し、その中心間距離を１５μｍとした。

〈実施例２の電気化学測定用電極板を用いた電気化学的測定〉
次に、実施例１と同様の条件で実施例２の電気化学測定用電極板を用いた電気化学測定装置を構成し、フェロシアン化カリウムの酸化電流の測定を行い、比較例１に示した電気化学測定用電極板の測定と比較した。本実施例の電気化学測定用電極板において下部電極１２の電位を銀／塩化銀参照電極に対して０から＋０．７Ｖまで掃印したところ、＋０．６から＋０．７Ｖにかけてフェロシアン化カリウム酸化反応の定常電流が観測され＋０．７Ｖにおける値は４０．８μＡであった。本実施例の電気化学測定用電極板においては反応開始１０秒後に定常状態電流が得られた。

以上の結果から、実施例２の電気化学測定用電極板においても、実施例１の電気化学測定用電極板と同じく、高感度で、迅速に測定が可能であることがわかった。

（実施例３の電気化学測定用電極板）
実施例３の電気化学測定用電極板の構成は、実施例１の電気化学測定用電極板の構成と同じである。実施例１において基板３１を形成する際、ＳｉＯ_２層を用いたが、それに代えて本実施例においては感光性樹脂層を用いた点が異なる。以下、本実施例の電気化学測定用電極板の製造方法を説明する。図１６は、実施例３の電気化学測定用電極板の製造工程を示す断面図である。下層１１である基板を用意し（図１６（ａ））、下層１１に実施例１と同様の手法で酸化電極体１２を形成し（図１６（ｂ））、その下層１１に感光性樹脂材料（化薬マイクロケム株式会社製：ＳＵ−８ ２０００）を厚みが４３０ｎｍとなるように塗布、７０℃２５分間ベーキングした後、酸化電極１２ｄを露出させる基板貫通孔３３のパターンを有するクロムマスクを用いてマスクパターンを樹脂材料に転写した。転写した後、現像液中にて２０℃、３００秒間現像を行い、水洗、乾燥して基板貫通孔３３（１００μｍ^２、１０００個）を有する基板３１を形成した（図１６（ｃ））。その上に実施例１と同種のレジスト剤を２μｍの厚みに塗布し、ベーキング工程を経て、還元電極体３２のパターンを有するマスクを用いて、還元電極体３２のパターンの転写を行った。その後洗浄・乾燥工程を経て、還元電極体３２のパターンをもつレジスト１１６を形成した（図１６（ｄ））。次に実施例１と同様の条件にてチタン、金の成膜を行い、リフトオフ法によりの還元電極体３２を得た（図１６（ｅ））。その上に基板３１と同じ感光性樹脂材料をスピンコート法により厚みが１μｍとなるように塗布、７０℃３０分間ベーキングし上層４０を形成した。その後、酸化電極１２ｄを露出させる上層貫通孔４１ａ及び還元電極３２ｄを露出させる上層貫通孔４１ｂのパターンを有するクロムマスクを用いて６０秒間密着露光することによりマスクパターンを樹脂材料に転写した。転写した後、現像液中にて２０℃、４２０秒間現像を行い、水洗、乾燥して上層貫通孔４１ｂ（１００μｍ^２、１００００個）を得た。また、上層貫通孔４１ａ（１００μｍ^２、１００００個）を上層４０に形成し、かつ同一形状の孔を基板３１に形成することにより、上層４０から基板３１に連続する貫通孔を形成した。なお、縦方向及び横方向において隣接する上層貫通孔４１ａと上層貫通孔４１ｂとの中心間距離は１５μｍとした。これにより本実施例の電気化学測定用電極板を得た（図１６（ｆ））。

〈実施例３の電気化学測定用電極板を用いた電気化学的測定〉
次に実施例１の測定と同様の条件で実施例３の電気化学測定用電極板を用いた電気化学測定装置を構成し、フェロシアン化カリウムの酸化電流の測定を行った。実施例３の電気化学測定用電極板において酸化電極体１２の電位を銀／塩化銀参照電極に対して０から＋０．７Ｖまで掃印したところ、＋０．６から＋０．７Ｖにかけてフェロシアン化カリウムの酸化反応の定常電流が観測され＋０．７Ｖにおける値は３９．１μＡであった。本実施例の電気化学測定用電極板においては反応開始７秒後に定常状態電流が得られた。この結果から、実施例３の電気化学測定用電極板においても、実施例１の電気化学測定用電極板と同じく、高感度で、迅速に測定が可能であることがわかった。
上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明らかである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神を逸脱することなく、その構造および／または機能の詳細を実質的に変更できる。

本発明にかかる電気化学測定用電極板はスクロース、グルコース等生体試料中に微量に含まれる、物質を定量する電気化学測定装置に利用することができる。また、飲料水等に微量に含まれる有害成分濃度を定量する電気化学センサ、液体クロマトグラムの検出器を構成する電気化学測定装置に利用することもできる。

第１の実施形態の電気化学測定用電極板を模式的に示す斜視図である。 第１の実施形態の電気化学測定用電極板を模式的に示す分解斜視図である。 酸化電極体及び還元電極体の枝部の一部形状を模式的に表す平面図である。 第１の実施形態にかかる電気化学測定用電極板を有する電気化学測定装置の概略図である。 検量線作成方法の一例を示す図である。 第１の実施形態の電気化学測定用電極板に参照電極および補助電極を形成した電極板を模式的に示す斜視図である。 第２の実施形態の電気化学測定用電極板を模式的に示す分解斜視図である。 図７の電気化学測定用電極板における上層貫通孔の配列の一部を示す上面図である。 第３の実施形態の電気化学測定用電極板を模式的に示す分解斜視図である。 第４の実施形態の電気化学測定用電極板を模式的に示す分解斜視図である。 第５の実施形態の電気化学測定用電極板を模式的に示す分解斜視図である。 第６の実施形態の電気化学測定用電極板を模式的に示す分解斜視図である。 第７の実施形態の電気化学測定用電極板を模式的に示す分解斜視図である。 実施例１の電気化学測定用電極板の製造工程を示す断面図である。 比較例１の電気化学測定用電極板の製造工程を示す断面図である。 実施例３の電気化学測定用電極板の製造工程を示す断面図である。 従来の電気化学測定用電極板の構成を示す斜視図である。 従来の電気化学測定用電極板の電極上で生じる酸化還元反応を模式的に示す図である。

符号の説明

１，６０，７０，８０，８１，８２，８３，８４ 電気化学測定用電極板
３，４ 切り欠き部
１０ 酸化電極設置層
１２ 酸化電極体（第２電極体）
１２ａ 酸化電極体の枝部
１２ｂ 酸化電極体の幹部
１２ｃ 酸化電極リード
１２ｄ 酸化電極
２１ 電極の集合体
２２ 参照電極
２３ 補助電極
２４ 試料液容器
２５ 制御装置
２６ レコーダー
２７ 電気化学測定装置
３０ 還元電極設置層
３１ 基板
３３ 基板貫通孔
３２ 還元電極体（第１電極体）
３２ａ 還元電極体の枝部
３２ｂ 還元電極の幹部
３２ｃ 還元電極リード
３２ｄ 還元電極
４０ 上層
４１ 上層貫通孔
４１ａ 酸化電極を露出させる上層貫通孔
４１ｂ 還元電極を露出させる上層貫通孔
６１ 参照電極
６２ 補助電極

Claims (24)

1. 絶縁体からなる基板と、
   前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
   前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
   前記基板の上面と前記上層の間に挟まれている第１電極体と、
   前記基板の下面と前記下層の間に挟まれている第２電極体と、を備え、
   前記上層は、複数の上層貫通孔を有し、
   前記第１電極体は、前記第１電極体のうち、前記上層貫通孔を介して前記上層の上面から露出する部分からなる複数の第１電極を有し、
   前記基板は、複数の基板貫通孔を有し、
   前記第２電極体は、前記第２電極体のうち、前記上層貫通孔および前記基板貫通孔を介して前記上層の上面から露出する部分からなる複数の第２電極を有し、
   平面視において、
   前記複数の基板貫通孔は、いずれも前記第１電極体とは重なり合わず、
   前記各第１電極の周囲には、前記第１電極との中心間距離が等しい４つの第２電極が配置されており、
   前記各第２電極の周囲には、前記第２電極との中心間距離が等しい４つの第１電極が配置されており、
   前記各第１電極の面積および前記各第２電極の面積は全て実質的に同一である、電気化学測定用電極板。
2. 前記第１電極体は、前記第１電極を順次連結するように延設されたジグザグ状をなす複数の枝部と、前記複数の枝部の一端が接続される幹部とからなる、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
3. 前記第２電極体は、前記第２電極を順次連結するように延設されたジグザグ状をなす複数の枝部と、前記複数の枝部の一端が接続される幹部とからなる、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
4. 前記第１電極体は、前記複数の基板貫通孔に対応する領域より一回り大きく欠除されてなる複数の欠除部を有する金属板からなる、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
5. 前記第２電極体は、前記複数の第２電極を全て包含する金属板からなる、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
6. 前記各上層貫通孔の断面積は前記各第１電極の面積と実質的に同一であり、前記各基板貫通孔の断面積は前記各第２電極の面積と実質的に同一である、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
7. 前記各上層貫通孔の断面形状および前記各基板貫通孔の断面形状は正四角形である、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
8. 前記各上層貫通孔の断面形状および前記各基板貫通孔の断面形状は正六角形である、請求項１に記載の電気化学測定用電極板。
9. 参照電極、補助電極、および電気化学測定用電極板、または対極および電気化学測定用電極板からなる電気化学測定装置であって、
   前記電気化学測定用電極板は、
   絶縁体からなる基板と、 前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、
   前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
   前記基板の上面と前記上層の間に挟まれている第１電極体と、
   前記基板の下面と前記下層の間に挟まれている第２電極体と、を備え、
   前記上層は、複数の上層貫通孔を有し、
   前記第１電極体は、前記第１電極体のうち、前記上層貫通孔を介して前記上層の上面から露出する部分からなる複数の第１電極を有し、
   前記基板は、複数の基板貫通孔を有し、
   前記第２電極体は、前記第２電極体のうち、前記上層貫通孔および前記基板貫通孔を介して前記上層の上面から露出する部分からなる複数の第２電極を有し、
   平面視において、
   前記複数の基板貫通孔は、いずれも前記第１電極体とは重なり合わず、
   前記各第１電極の周囲には、前記第１電極との中心間距離が等しい４つの第２電極が配置されており、
   前記各第２電極の周囲には、前記第２電極との中心間距離が等しい４つの第１電極が配置されており、
   前記各第１電極の面積および前記各第２電極の面積は全て実質的に同一である、電気化学測定装置。
10. 前記第１電極体は、前記第１電極を順次連結するように延設されたジグザグ状をなす複数の枝部と、前記複数の枝部の一端が接続される幹部とからなる、請求項９に記載の電気化学測定装置。
11. 前記第２電極体は、前記第２電極を順次連結するように延設されたジグザグ状をなす複数の枝部と、前記複数の枝部の一端が接続される幹部とからなる、請求項９に記載の電気化学測定装置。
12. 前記第１電極体は、前記複数の基板貫通孔に対応する領域より一回り大きく欠除されてなる複数の欠除部を有する金属板からなる、請求項９に記載の電気化学測定装置。
13. 前記第２電極体は、前記複数の第２電極を全て包含する金属板からなる、請求項９に記載の電気化学測定装置。
14. 前記各上層貫通孔の断面積は前記各第１電極の面積と実質的に同一であり、前記各基板貫通孔の断面積は前記各第２電極の面積と実質的に同一である、請求項９に記載の電気化学測定装置。
15. 前記各上層貫通孔の断面形状および前記各基板貫通孔の断面形状は正四角形である、請求項９に記載の電気化学測定装置。
16. 前記各上層貫通孔の断面形状および前記各基板貫通孔の断面形状は正六角形である、請求項９に記載の電気化学測定装置。
17. 参照電極、補助電極、および電気化学測定用電極板、または対極および電気化学測定用電極板からなる電気化学測定装置により、試料液に含まれる目的物質を定量する方法であって、
    前記試料液は、電子メディエータを含有し、
    前記電気化学測定用電極板は、
    絶縁体からなる基板と、
    前記基板の上面に設けられた絶縁体からなる上層と、 前記基板の下面に設けられた絶縁体からなる下層と、
    前記基板の上面と前記上層の間に挟まれている第１電極体と、
    前記基板の下面と前記下層の間に挟まれている第２電極体と、を備え、
    前記上層は、複数の上層貫通孔を有し、
    前記第１電極体は、前記第１電極体のうち、前記上層貫通孔を介して前記上層の上面から露出する部分からなる複数の第１電極を有し、
    前記基板は、複数の基板貫通孔を有し、
    前記第２電極体は、前記第２電極体のうち、前記上層貫通孔および前記基板貫通孔を介して前記上層の上面から露出する部分からなる複数の第２電極を有し、
    平面視において、
    前記複数の基板貫通孔は、いずれも前記第１電極体とは重なり合わず、
    前記各第１電極の周囲には、前記第１電極との中心間距離が等しい４つの第２電極が配置されており、
    前記各第２電極の周囲には、前記第２電極との中心間距離が等しい４つの第１電極が配置されており、
    前記各第１電極の面積および前記各第２電極の面積は全て実質的に同一であり、
    前記方法は、以下の工程を包含する：
    前記参照電極、前記補助電極、および前記電気化学測定用電極板、または前記対極および前記電気化学測定用電極板を前記試料液に接触させる接触工程、
    前記第１電極体および前記第２電極体の一方に正電位を掃印し、他方に負電位を印加する、あるいは前記第１電極体および前記第２電極体の一方に正電位を印加し、他方に負電位を掃印し、前記第１電極体および前記第２電極体の間に流れる電流値を測定する電流測定工程、
    前記電流測定工程において得られた電流値から前記目的物質の量を算出する算出工程。
18. 前記第１電極体は、前記第１電極を順次連結するように延設されたジグザグ状をなす複数の枝部と、前記複数の枝部の一端が接続される幹部とからなる、請求項１７に記載の方法。
19. 前記第２電極体は、前記第２電極を順次連結するように延設されたジグザグ状をなす複数の枝部と、前記複数の枝部の一端が接続される幹部とからなる、請求項１７に記載の方法。
20. 前記第１電極体は、前記複数の基板貫通孔に対応する領域より一回り大きく欠除されてなる複数の欠除部を有する金属板からなる、請求項１７に記載の方法。
21. 前記第２電極体は、前記複数の第２電極を全て包含する金属板からなる、請求項１７に記載の方法。
22. 前記各上層貫通孔の断面積は前記各第１電極の面積と実質的に同一であり、前記各基板貫通孔の断面積は前記各第２電極の面積と実質的に同一である、請求項１７に記載の方法。
23. 前記各上層貫通孔の断面形状および前記各基板貫通孔の断面形状は正四角形である、請求項１７に記載の方法。
24. 前記各上層貫通孔の断面形状および前記各基板貫通孔の断面形状は正六角形である、請求項１７に記載の方法。

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