JP4009221B2 - 振動子を用いた分析方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、振動子を用い、液体中に含まれる微量物質を分析する技術にかかり、特に、その分析が高精度で行われるようにした分析技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ・タンパク質など生体物質の相互作用を測定する方法として、また抗原抗体反応を応用した測定などにＱＣＭの原理が使われている。
【０００３】
従来ＱＣＭを用いたバイオセンサーは、センサーである圧電素子（水晶振動子など）を発振させて共振周波数を連続で測定するか、インピーダンスアナライザーを用い共振点（インーピーダンスが最小となる点）の周波数を連続で測定し、その周波数変化より、圧電素子表面への吸着した物質の量を測定していた。
【０００４】
ところが液中に浸された圧電素子（水晶振動子）の共振周波数は、質量が変化した場合の他、粘性が変化した場合にも変動する。質量の変化による周波数変動を質量効果と呼び、粘性変化による周波数変動を粘性効果と呼ぶと、周波数変動のうち、質量効果による変動量と粘性効果による変動量は、共振周波数の変動のみを測定している従来方式では分離することができない。
【０００５】
例えば、周波数変動を測定し、ＤＮＡ・タンパク質など生体物質の相互作用を調べようとしたり、周波数変動によって抗原抗体反応を調べようとする場合は、しばしば測定系に注入する試料と、使用されているバッファー液(生化学用緩衝液であり、主な含有物はＮａＣｌとＫＣＬ等である）の粘性が異なるために、測定された周波数変動の値が、ＤＮＡ・タンパク質などの結合または抗原抗体の結合によって生じた質量効果によるものか、温度変化や試料の添加によって生じた粘性効果によるものなのか区別がつかず、正確な測定ができない。
【０００６】
なお、振動子を用いた分析技術は下記のような先行技術がある。
【特許文献１】
特開２００２−１４８２９５
【特許文献２】
特開２００２−１５６３６８
【特許文献３】
特開平４−１５５４
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記従来技術の不都合を解決するために創作されたものであり、その目的は、粘性効果の影響が無く、振動子の重量変化を正確に求める技術を提供する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
先ず、本願のような振動子を使用した分析方法の原理を説明する。下記は、基本文献(Anhong Zhou, et al., Impedance analysis for the investigation of the behaviors of piezoelectric quartz crystal in the liquid at harmonic resonance, Sensors and Actuators B 67(2000)68-75)の概要であり、本願発明の前提となる技術である。
【０００９】
＜概要＞
１．調波共振(harmonic resource)におけるSauerbrey方程式の導出
結晶の発振周波数fは、
【００１０】
【数１】
【００１１】
で表すことができる。ここで、hは調波数（h = 1、3、5...）、(μQおよびρQはそれぞれ水晶のせん断弾性係数および密度、tQは結晶の厚さである。
【００１２】
数式（1）のtQに関する偏導関数f、および結晶表面の質量の少量変化（< 1%）dm,dm = ρQAdtQ,について考えると、周波数変化Δfmと質量変化Δmの間の関係は、簡単に導出することができる。
【００１３】
【数２】
【００１４】
ここで、Aは電極の圧電作用面積、Nは液体と接触している面数である。N = 1且つh = 1であるときに、数式（2）がSauerbrey方程式［4］になることは明らかである。
【００１５】
数式（2）では、電極表面上の異物膜が剛性であり、かつ十分に薄いものと仮定している。
【００１６】
実際には、粘性液体中のPQCの周波数変化は、質量アドレイヤのみに関係するのではなく、例えば液体の密度および粘性など、物理化学的特性［3］にも関係している。
【００１７】
２．調波共振における粘性効果
PQC(piezoelectric quartz crystals)は、図１に示すように、Butterworth-Van Dyke（BVD）等価回路モデル［17、18］で電気的に表すことができる。電極面積をA、調波数をhとすると、インピーダンスZは次のように表すことができる［19］。
【００１８】
【数３】
【００１９】
ここで、
【００２０】
【数４】
【００２１】
である。ここで、Zの実数部はレジスタンス（RL）、虚数部はリアクタンス（XL）であり、ρLおよびηLはそれぞれ液体の絶対密度および絶対粘性である。
【００２２】
結晶が理想粘性液体（ニュートン液体）中にある場合、Mason［20］によれば、（機械的）せん断インピーダンスは、
【００２３】
【数５】
【００２４】
によって与えられる。ここで、mLは結晶にかかる粘性液体負荷の等価振動質量であり、数式（3）と数式（4）を組み合わせることによって得られる。
【００２５】
【数６】
【００２６】
この場合、数式（4a）のmLは、数式（2）のmと同じである。数式（4a）を数式（2）に代入すると、液体負荷による周波数変化ΔfLが得られる（パラメータNを考慮する）。
【００２７】
【数７】
【００２８】
N = 1、h = 1の場合、数式（5）は、KanazawaおよびGordon［7］が水晶中のせん断波と液体中の減衰応力波とを結合するモデルから導出した予測と一致する。
数式（5）は、液相中のPQCの周波数応答に対する粘性効果を表している。したがって、液体負荷および質量効果によるおおよその全周波数変化(Δf)が得られる。
【００２９】
【数８】
【００３０】
この結果は、Martinら［16］によって導出された、連続体電気機械モデルに基づく結果と合致している。
ただし、発振器方式によってモニターされる周波数変化は、ΔfmでもΔfLでもなく、全周波数変化（Δf）のみに限定されていることを強調しておく。
【００３１】
３.ΔfとR1の関係
インピーダンス解析では、Martinらのモデル［16］は、PQCを効果的に同時質量および液体負荷で特徴づけることができる。液体負荷のかかった状態にあるPQCの動抵抗R2は、次のように表される［16］。
【００３２】
【数９】
【００３３】
ここで、L1は真空中の動インダクタンスを表し、
【００３４】
【数１０】
【００３５】
で与えられる。
数式（8）を（7）に代入すると、
【００３６】
【数１１】
【００３７】
が得られる。ここで、K0は、参照［16］で定義されている定数である。K0 2＝ｅ2 26／(ｃ66ε22)であり、ｃ66は、圧電強化(piezoelectrically stiffend)水晶弾性定数、e26およびε22はそれぞれ水晶の圧電応力定数および誘電率である。
【００３８】
液体中の結晶の場合、Martinのモデルでは、動抵抗R1は2つの部分に分割され、R1 = Rq + R2とされた。Rqは、非摂動PQC（すなわち真空中または空気中で共振するPQC）の動抵抗である。例えば、空気中で測定したRqは、既存の9MHz結晶では約15.0Ωである。これに対して、純水（20℃）中の同じ結晶について測定したR1は、約228 Ωである。Δf対R1の関係を簡単に得るために、質量効果および粘性効果のみを考慮する場合には、本研究では、R1とR2とは略等しい(R1≒R2)と見なすことが妥当である。したがって、おおよそのΔf対R1の関係は、数式（6）と数式（7）を組み合わせることによって得ることができる。
【００３９】
【数１２】
【００４０】
数式（8）のL1を考慮すると、数式（10）の傾きは、
【００４１】
【数１３】
【００４２】
で表される。
この傾きは、Nやhではなく、f0、K0、C0（またはL1）にのみ関係している。真空中（または空気中）のL1を測定すれば、この傾きの理論値が得られる。
【００４３】
下記は、参照文献である。
［3］:D.A.Buttry,M.D.Ward, Measurement of interfacial processes at electrode surfaces with the electrochemical quartz crystal microbalance, Chem. Rev. 92 (1992) 1355-1379.
［4］:G.Sauerbrey,Verwendung von schwingquarzen zur wagung dunner schichten und zur mikrowagung, Z. Phys. 155(1959)206-222.［7］:K.K.Kanazawa, J.G. Gordon II, The oscillation frequency of a quartz resonator in contact with a liquid, Anal. Chem. Acta 175 (1985)99-105.
［16］:S.J. Martin, V.E. Granstaff, G.C.Frye, Characterizaiton of a quartz microbalance with simultaneous mass and liquid loading, Anal.Chem. 63 (1991)2272-2281
［17］:W.G.Cady,Piezoelectricity, Dover, New York, 1964.
［18］:V.E. Bottom, in: Introduction to Crystal Unit Design, Van Nostrand-Reinhold, New York, 1982, p, 120.
［19］:W.P. Mason, Piezoelectric Crystals and Their Applications to Ultrasonics, Van Nostrand, Princeton, NJ, p. 339.［20］:W.P. Mason, Electromechanical Transducers and Wave Filters, Van Nostrand-Reinhold, New York, 1948.
＜周波数に関する考察＞
次に、アドミタンスを符号Ｙ、コンダクタンスを符号Ｇ、サセプタンスを符号Ｂで表し(アドミタンスＹ＝コンダクタンスＧ＋ｊ・サセプタンスＢ)、角周波数を符号ωで表したとき、コンダクタンスＧとサセプタンスＢは、図１の等価回路の等価直列レジスタンスＲ1と、等価直列キャパシタンスＣ1と、等価直列インダクタンスＬ1とから、下記(ａ)、(ｂ)式のように表すことができる。
【００４４】
【数１４】
【００４５】
直列共振状態を与える角周波数を共振角周波数ωsとすると、ｈ＝１のときの共振角周波数ωsでは、ωsＬ1−１／(ωsＣ1)＝０が成り立つから、共振角周波数ωsは下記(ｃ)式で表される。
【００４６】
【数１５】
【００４７】
角周波数ωに対応する周波数をｆ(ｆ＝ω／(２π))で表すと、共振周波数ｆsは、下記(ｄ)式で表される。
【００４８】
【数１６】
【００４９】
ｈ＝１の共振状態のときのコンダクタンスＧは１／Ｒ1である。
ここで、共振状態のときのコンダクタンスＧの値を符号Ｇsで表し、その半分の値を半値コンダクタンスＧs／２とし、半値コンダクタンスＧs／２を与える角周波数を半値角周波数とすると、半値角周波数は２個存在する。それぞれω1、ω2(ω1＜ω2)で表すと、各半値角周波数ω1、ω2は下記(ｅ)、(ｆ)式で与えられる。
【００５０】
【数１７】
【００５１】
図２は、ｈ＝１のときの共振角周波数ωs、半値角周波数ω1、ω2とコンダクタンスＧの関係を示すグラフである。
【００５２】
大きい方の半値角周波数ω2に対応する半値周波数ｆ2は、下記(ｇ)式で表すことができる。
【００５３】
【数１８】
【００５４】
上記(ｇ)式の第２項中、Ｃ1の値は小さいからＲ1 2Ｃ1 2は微小量であり、無視できる。従って、(ｇ)式は下記(ｈ)式に書き直すことができる。
【００５５】
【数１９】
【００５６】
上記(ｈ)式の第２項は、共振周波数ｆsに等しいから、結局、半値周波数ｆ2は、下記(ｉ1)式で表される。
【００５７】
【数２０】
【００５８】
粘性変化と質量変化の両方があった場合、等価直列キャパシタンスＣ1は変化せず、等価直列インダクタンスＬ1と等価直列レジスタンスＲ1とが変化するものとすると、Ｒ1とＬ1とｆsは、ΔＲ1とΔＬ1とΔｆsになるので、半値周波数ｆ2の微小変化量Δｆ2は下記(ｉ2)式で表すことができる。
【００５９】
【数２１】
【００６０】
ここで、上記(ｄ)式においてＬ1のみ変化する場合には、Δｆsは、
【００６１】
【数２２】
【００６２】
となるため、上式を用いて、(ｉ2)式を書き換えると、下記(ｉ3)式が得られる。
【００６３】
【数２３】
【００６４】
実際にｆs＝２７ＭＨｚの水晶振動子は液中でＲ１≒２００Ω、Ｌ1≒２×１０-3Ｈの値となるので、(ｉ13)式のＲ1／(８πＬ1ｆs)は下記値となる。
【００６５】
【数２４】
【００６６】
上記値は１よりも十分小さいので、(ｉ3)式は下記(ｊ)式に近似することができる。
【００６７】
【数２５】
【００６８】
質量効果と粘性効果だけを考慮する場合、周波数変動Δｆは、上記(10)式で表されるから、共振周波数ｆsの微小変化量Δｆsは、上記(10)式を用い、直ちに下記(ｋ)式で表すことができる。
【００６９】
【数２６】
【００７０】
(ｋ)式を(ｊ)式に代入すると、(ｊ)式の第１項が(ｋ)式の第２項で消去され、半値周波数ｆ2の微小変化量Δｆ2は、下記(ｌ)式で表すことができる。
【００７１】
【数２７】
【００７２】
上記(ｌ)式には、等価直列抵抗Ｒ1の微小変化量ΔＲ1を含む項が消去され、質量ｍの微小変化量Δｍを変数とする項だけが残っている。即ち、粘性変化による影響の項が消去され、質量負荷のみによる周波数変化となる。
【００７３】
従って共振周波数ｆsを測定するのではなく半値周波数ｆ2を測定することにより、粘性の影響を排除した質量負荷による周波数変化のみを測定することが可能となる。
【００７４】
質量変化により、共振状態のときのコンダクタンスＧの値も変化するため、半値周波数ｆ2を測定する際には、半値周波数ｆ2を測定する直前に共振状態のコンダクタンスＧsを測定し、その値から半値コンダクタンスＧs／２を算出し、半値コンダクタンスＧs／２を与える周波数を半値周波数ｆ2として求めるとよい。
【００７５】
なお、上記はｈ＝１の場合であって、基本共振周波数での直列共振状態のときのコンダクタンスＧの半分の値を用いたが、２以上のｈ場合についても同様である。即ち、図３に示したように、ｈ＝ｎのときの直列共振状態を与える共振周波数をｆ(ｎ)sで表し、ｆ(ｎ)sのときのコンダクタンスＧの値をＧ(n)sで表すと、各ｎに対し、半値コンダクタンスＧ(n)s／２を与える半値周波数ｆ(n)1及びｆ(n)2が決まる。各ｎに関し、大きい方の半値周波数ｆ(n)2の変動を測定して質量変化を求める場合も、粘性変化の影響は消去される。
【００７６】
本発明は上記の原理に基いており、請求項１記載の発明は、結晶板と、前記結晶板の両面に配置された第１、第２の電極を有する振動子を液体中に浸漬し、前記第１、第２の電極間に交流信号を印加し、前記交流信号の周波数と前記振動子の電気的特性の関係から、前記振動子の重量変化を求める分析方法であって、前記振動子が直列共振状態にあるときのコンダクタンスの半分の大きさの半値コンダクタンスを与える半値周波数であって、前記直列共振状態を与える共振周波数に近く、且つ、共振周波数よりも大きな周波数である半値周波数の変化から、前記振動子の重量変化を求める分析方法である。
請求項２記載の発明は、前記振動子に、前記半値周波数を含むと予想される周波数範囲の前記交流信号を繰り返し入力し、時間経過に対する前記振動子の重量変化を求める請求項１項記載の分析方法である。
請求項３記載の発明は、前記液体中に試料を投入する前に、前記半値周波数の初期値を求め、前記半値周波数の前記初期値に対する変動量から、前記振動子の重量変化を求める請求項１又は請求項２のいずれか１項記載の分析方法である。
請求項４記載の発明は、前記振動子のコンダクタンスの極値を測定し、前記極値から前記半値周波数を求める請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の分析方法である。
請求項５記載の発明は、前記極値は、前記振動子のコンダクタンスの最大値を用いる請求項４記載の分析方法である。
請求項６記載の発明は、前記振動子の共振周波数と等価回路の定数から、前記半値周波数を求める請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の分析方法である。
【００７７】
【発明の実施の形態】
本発明の測定方法を、本発明に用いる振動子及び測定装置と共に説明する。
図４(ａ)は、本実施の形態の測定用セル２の断面図、同図(ｂ)は、同測定用セルの水晶振動子３の平面図、同図(ｃ)は断面図である。
【００７８】
振動子３は、図４(ｂ)、(ｃ)に示すように、結晶板３０を有しており、この結晶板３０の表面側と裏面側とは、第１、第２の電極３１、３２がそれぞれ配置されている。結晶板３０は、例えば水晶や石英等の結晶が円板状に成形されて構成されており、第１、第２の電極３１、３２は、金属薄膜が所定形状にパターンニングされて構成されており、第１の電極３１は、一部が裏面側まで回り込んでいる。
【００７９】
第１、第２の電極３１、３２は、結晶板３０の裏面位置で、第１、第２のスプリング２４、２５の一端に接続されている。第１、第２のスプリング２４、２５の他端は、第１、第２の端子ピン２６、２７に接続されている。第１、第２のスプリング２４、２５は金属製であり、第１、第２の電極３１、３２は、第１、第２のスプリング２４、２５によって、第１、第２の端子ピン２６、２７に電気的に接続されている。
【００８０】
符号２３は、絶縁性を有する台座であり、第１、第２の接続ピン２６、２７は、ガラスシール２８によって、この台座２３に固定されている。
【００８１】
次に、セル２は、図４(ａ)に示すように、例えばアクリル樹脂が円筒形に成形されて成るセル本体２０を有している。
【００８２】
セル本体２０の底部よりもやや上の位置には、フランジ部２１が形成されており、振動子３は、セル本体２０の底面側からセル本体２０の内部に挿入されており、振動子３の外周部分がフランジ部２１に当接されている。
【００８３】
その状態では、第１、第２のスプリング２４、２５は圧縮され、その復元力によって振動子３がフランジ部２１に押圧される。
【００８４】
振動子３とフランジ部２１とが接触する部分には、接着剤が配置されており、第１、第２のスプリング２４、２５によって振動子３の外周がフランジ部２１に押圧された状態で、台座２３がセル本体２０の底面に固定されると、振動子３は、接着剤によってフランジ部２１に固定される。
【００８５】
この状態では、振動子３を底面とし、セル本体２０の上部を側面とする液密な有底円筒容器状の収容部２０ａが構成される。
【００８６】
第１、第２の端子ピン２６、２７は、台座２３の底面から、セル本体２０の外部に導出されており、第１、第２の端子ピン２６、２７を測定機器等の外部回路に接続すると、第１、第２の電極３１、３２は、その外部回路に接続される。
【００８７】
第１、第２の電極３１、３２のうち、ここでは、結晶板３０の表面側、即ち、収容部２０ａの底面に露出する位置には第１の電極３１が配置されており、その第１の電極３１の表面には、反応膜３３が配置されている。反応膜３３は、測定対象である特定成分と反応し、又はその特定成分を吸着する材料で構成されている。
【００８８】
そして、図５に示すように、台２９の上にセル２を配置し、測定対象である特定成分を溶解させる溶媒、あるいは特定成分を分散させる液体であって、その特定成分が含まれていない状態の液体を、収容部２０ａ内に注入する。
【００８９】
図５の符号７は、その液体を示しており、この状態では、反応膜３３は液体７に接触する。第１の電極３１の反対側に位置する第２の電極３２は、液体７には接触しない。従って、この例では上記各式((1)〜(10)式)中のＮは１である。
【００９０】
図６の符号１は測定装置であり、上述したセル２と、ネットワークアナライザーやインピーダンスアナライザー等から成る分析装置４と、分析装置４を制御し、その測定値を演算する制御装置５とを有している。
【００９１】
セル２は分析装置４に接続されており、分析装置２は所望周波数の交流信号をセル２に出力し、その周波数下でのセル２のコンダクタンスＧを測定できるように構成されている。
【００９２】
ここで、制御装置５は、分析装置４の動作を制御し、分析装置４がセル２に出力する信号の周波数を変化させると共に、周波数と測定結果とを対応させ、演算結果と共に記憶するように構成されている。
【００９３】
ここで、共振周波数ｆsを含む所定範囲内で周波数を変化させ、周波数とコンダクタンスＧの関係を測定する場合、共振状態では、コンダクタンスＧは極値を取る。特に、ｈ＝１の共振状態は、コンダクタンスＧの極値は最大値を与えるから、測定値中で最大コンダクタンスＧmaxを与える周波数が共振周波数ｆsであることが容易に分かる。試料投入前の共振周波数ｆsの測定値は、共振周波数ｆsの初期値となる。
【００９４】
また、ｈ＝１では、最大コンダクタンスＧmaxの１／２の値、即ち半値コンダクタンスＧs／２を与え、且つ、共振周波数ｆsよりも大きな周波数を測定結果から逆に求めると、その値が半値周波数ｆ2であることが分かる。試料投入前の値は半値周波数ｆ2の初期値ｆM2(ｔ＝０)である。
【００９５】
次に、液体７中に、測定対象である特定成分を含む液体を試料として注入すると、特定成分が反応膜３３と反応又は吸着し、反応膜３３の重量が増加し始める。
【００９６】
ここで、試料を投入した後、セル２に印加する信号の周波数を、共振周波数ｆsの初期値と半値周波数ｆ2の初期値を含む所定範囲で変化させながら印加し、セル２のコンダクタンスＧを測定する。
【００９７】
例えば、１秒おきに半値周波数ｆ2を求める場合、交流信号の周波数を所定範囲で変化させながらコンダクタンスＧの最大値を１秒間隔で測定することになる。
【００９８】
そして、コンダクタンスＧの測定値から、その極値(ｈ＝１では、最大コンダクタンスＧmax)を求め、その値の１／２の半値コンダクタンスを与える半値周波数ｆ2を求める。試料投入後、一定間隔(例えば１秒毎)にこれを繰り返す。
【００９９】
ここで、半値周波数ｆ2の測定値を、ｆM2(ｔ＝１)、ｆM2(ｔ＝２)、……(ｔは時間を表す。)とすると、各測定値ｆM2(ｔ＝１)、ｆM2(ｔ＝２)、ｆM2(ｔ＝１)……と初期値ｆM2(ｔ＝０)の周波数差分から、質量変動を求めることができる。質量変動から、測定対象の液体中の特定成分の濃度が分かる。
【０１００】
なお、１秒ごとに測定結果を記録しておき、測定終了後、半値周波数ｆ2とその変動を求めることもできる。
【０１０１】
次に、実測結果のグラフを用い、本発明が高精度であることを説明する。
【０１０２】
共振周波数ｆs又は半値周波数ｆ2の測定値と初期値の差分を周波数差分Δｆとする。図６は、振動子を水中に浸漬し、水温を２０℃〜３５°まで５℃刻みで上げていった場合の時間経過と周波数差分Δｆの関係を示すグラフである。図６中、符号ａ1は半値周波数ｆ2の周波数差分Δｆの変化を示す曲線であり、符号ａ2は共振周波数ｆsの周波数差分Δｆの変化を示す曲線である。
【０１０３】
液温の上昇とともに液の粘性が減少するため、共振周波数ｆsの周波数差分Δｆの変化は大きい。それに対し、半値周波数ｆ2の周波数差分Δｆの変化はゼロである(僅かな変化は、温度変化による水晶振動子の特性変動である。)。
【０１０４】
図７は、質量効果と粘性効果の両方が生じたときの周波数差分Δｆの経時変化を示すグラフであり、符号ｂ1が半値周波数ｆ2の周波数差分Δｆの変動を示し、ｂ2が共振周波数ｆsの周波数差分Δｆの変動を示している。
【０１０５】
このグラフの場合、先ず、振動子３をバッファー液中に浸漬した時刻を測定開始時間とし、測定開始時間から３００秒経過したときに第１の試料(アビジン)を注入し、次に、１２００秒経過したときに第２の試料（グリセロールとアビジンの混合液(アビジンの濃度は１回目と同じ))を注入し、２４００秒経過したときに、第３の試料(グリセロールのみであり、量は２回目と同じである。)を注入した。
【０１０６】
各試料中、アビジンは反応膜３３に付着し質量効果を与えるが、グリセロールは反応膜３３に付着せず、粘性効果だけを与える。
【０１０７】
第１の試料の投入により、アビジンの付着によって周波数差分Δｆは変化するが、半値周波数ｆ2については一定の傾きで変化するのに対し、共振周波数ｆsの周波数差分Δｆは、グリセロールによる粘性効果で周波数が大きく減少している。
【０１０８】
なお、上記例では、直列共振状態のときにコンダクタンスＧを測定し、その１／２の値から半値周波数ｆ2を求めたが、直列共振状態のときにコンダクタンスＧを測定せず、共振周波数ｆsの測定値や等価回路の定数Ｒ1、Ｌ1、Ｃ1を用いて半値周波数ｆ2を算出することもできる。
【０１０９】
例えば、振動子３のレジスタンスＲ1、インダクタンスＬ1、及び共振周波数ｆsを測定すれば、コンダクタンスＧを測定しなくても、(ｉ1)式から半値周波数ｆ2を算出することができる。
【０１１０】
また、インピーダンスアナライザー等でＱ値(Ｑ＝ｆs／(ｆ2−ｆ1))やＤ値(Ｄ＝１／Ｑ)を測定すれば、ｆ2＝ｆs＋ｆs／(２・Ｑ)から、半値周波数ｆ2を求めることができる。
【０１１１】
要するに、本発明は、コンダクタンスＧを実測し、半値周波数ｆ2を求める場合に限定されるものではなく、コンダクタンスＧ以外の値を測定して半値周波数ｆ2を求める場合も含まれる。
【０１１２】
【発明の効果】
従来方式ではバッファー液と試料の粘性が異なると正確な測定ができなかったが、本発明では、バッファー液と粘性が異なる試料を使用した場合の変性効果や温度変化による変性効果の影響を受けないので、正確な測定をすることが可能となった。
【０１１３】
従って、本発明は、粘性の高い血液の検査や、食品に含まれる菌の検査において高い効果を発揮する。
【０１１４】
また、温度の影響がないことから、装置にバッファー液の入ったセルをセットした後、バッファーの液温が装置でセットした温度になるまで、安定待ちの時間が短縮され、スループットが高くなった。
【０１１５】
更にまた、水を多く含む物質は吸着の際水も一緒に振動するため、従来技術では、真値よりも大きい周波数変動があったならば、本発明によれば正しく測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】振動子の等価回路
【図２】信号の周波数と振動子のコンダクタンスとの関係を示すグラフ
【図３】高次の共振状態を説明するためのグラフ
【図４】(ａ)〜(ｃ)：本発明の用いる振動子、及びその振動子を用いた測定セルを説明するための図
【図５】測定装置全体を説明するための図
【図６】温度変化と周波数変動の関係を説明するためのグラフ
【図７】質量効果及び粘性効果と周波数変動の関係を説明するためのグラフ
【符号の説明】
３……振動子
３０……結晶板
３１……第１の電極
３２……第２の電極
Ｇ……コンダクタンス
ｆ2……半値周波数
ｆs……共振周波数
【発明の属する技術分野】
本発明は、振動子を用い、液体中に含まれる微量物質を分析する技術にかかり、特に、その分析が高精度で行われるようにした分析技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＤＮＡ・タンパク質など生体物質の相互作用を測定する方法として、また抗原抗体反応を応用した測定などにＱＣＭの原理が使われている。
【０００３】
従来ＱＣＭを用いたバイオセンサーは、センサーである圧電素子（水晶振動子など）を発振させて共振周波数を連続で測定するか、インピーダンスアナライザーを用い共振点（インーピーダンスが最小となる点）の周波数を連続で測定し、その周波数変化より、圧電素子表面への吸着した物質の量を測定していた。
【０００４】
ところが液中に浸された圧電素子（水晶振動子）の共振周波数は、質量が変化した場合の他、粘性が変化した場合にも変動する。質量の変化による周波数変動を質量効果と呼び、粘性変化による周波数変動を粘性効果と呼ぶと、周波数変動のうち、質量効果による変動量と粘性効果による変動量は、共振周波数の変動のみを測定している従来方式では分離することができない。
【０００５】
例えば、周波数変動を測定し、ＤＮＡ・タンパク質など生体物質の相互作用を調べようとしたり、周波数変動によって抗原抗体反応を調べようとする場合は、しばしば測定系に注入する試料と、使用されているバッファー液(生化学用緩衝液であり、主な含有物はＮａＣｌとＫＣＬ等である）の粘性が異なるために、測定された周波数変動の値が、ＤＮＡ・タンパク質などの結合または抗原抗体の結合によって生じた質量効果によるものか、温度変化や試料の添加によって生じた粘性効果によるものなのか区別がつかず、正確な測定ができない。
【０００６】
なお、振動子を用いた分析技術は下記のような先行技術がある。
【特許文献１】
特開２００２−１４８２９５
【特許文献２】
特開２００２−１５６３６８
【特許文献３】
特開平４−１５５４
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記従来技術の不都合を解決するために創作されたものであり、その目的は、粘性効果の影響が無く、振動子の重量変化を正確に求める技術を提供する。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
先ず、本願のような振動子を使用した分析方法の原理を説明する。下記は、基本文献(Anhong Zhou, et al., Impedance analysis for the investigation of the behaviors of piezoelectric quartz crystal in the liquid at harmonic resonance, Sensors and Actuators B 67(2000)68-75)の概要であり、本願発明の前提となる技術である。
【０００９】
＜概要＞
１．調波共振(harmonic resource)におけるSauerbrey方程式の導出
結晶の発振周波数fは、
【００１０】
【数１】
で表すことができる。ここで、hは調波数（h = 1、3、5...）、(μQおよびρQはそれぞれ水晶のせん断弾性係数および密度、tQは結晶の厚さである。
【００１２】
数式（1）のtQに関する偏導関数f、および結晶表面の質量の少量変化（< 1%）dm,dm = ρQAdtQ,について考えると、周波数変化Δfmと質量変化Δmの間の関係は、簡単に導出することができる。
【００１３】
【数２】
ここで、Aは電極の圧電作用面積、Nは液体と接触している面数である。N = 1且つh = 1であるときに、数式（2）がSauerbrey方程式［4］になることは明らかである。
【００１５】
数式（2）では、電極表面上の異物膜が剛性であり、かつ十分に薄いものと仮定している。
【００１６】
実際には、粘性液体中のPQCの周波数変化は、質量アドレイヤのみに関係するのではなく、例えば液体の密度および粘性など、物理化学的特性［3］にも関係している。
【００１７】
２．調波共振における粘性効果
PQC(piezoelectric quartz crystals)は、図１に示すように、Butterworth-Van Dyke（BVD）等価回路モデル［17、18］で電気的に表すことができる。電極面積をA、調波数をhとすると、インピーダンスZは次のように表すことができる［19］。
【００１８】
【数３】
ここで、
【００２０】
【数４】
である。ここで、Zの実数部はレジスタンス（RL）、虚数部はリアクタンス（XL）であり、ρLおよびηLはそれぞれ液体の絶対密度および絶対粘性である。
【００２２】
結晶が理想粘性液体（ニュートン液体）中にある場合、Mason［20］によれば、（機械的）せん断インピーダンスは、
【００２３】
【数５】
によって与えられる。ここで、mLは結晶にかかる粘性液体負荷の等価振動質量であり、数式（3）と数式（4）を組み合わせることによって得られる。
【００２５】
【数６】
この場合、数式（4a）のmLは、数式（2）のmと同じである。数式（4a）を数式（2）に代入すると、液体負荷による周波数変化ΔfLが得られる（パラメータNを考慮する）。
【００２７】
【数７】
N = 1、h = 1の場合、数式（5）は、KanazawaおよびGordon［7］が水晶中のせん断波と液体中の減衰応力波とを結合するモデルから導出した予測と一致する。
数式（5）は、液相中のPQCの周波数応答に対する粘性効果を表している。したがって、液体負荷および質量効果によるおおよその全周波数変化(Δf)が得られる。
【００２９】
【数８】
この結果は、Martinら［16］によって導出された、連続体電気機械モデルに基づく結果と合致している。
ただし、発振器方式によってモニターされる周波数変化は、ΔfmでもΔfLでもなく、全周波数変化（Δf）のみに限定されていることを強調しておく。
【００３１】
３.ΔfとR1の関係
インピーダンス解析では、Martinらのモデル［16］は、PQCを効果的に同時質量および液体負荷で特徴づけることができる。液体負荷のかかった状態にあるPQCの動抵抗R2は、次のように表される［16］。
【００３２】
【数９】
ここで、L1は真空中の動インダクタンスを表し、
【００３４】
【数１０】
で与えられる。
数式（8）を（7）に代入すると、
【００３６】
【数１１】
が得られる。ここで、K0は、参照［16］で定義されている定数である。K0 2＝ｅ2 26／(ｃ66ε22)であり、ｃ66は、圧電強化(piezoelectrically stiffend)水晶弾性定数、e26およびε22はそれぞれ水晶の圧電応力定数および誘電率である。
【００３８】
液体中の結晶の場合、Martinのモデルでは、動抵抗R1は2つの部分に分割され、R1 = Rq + R2とされた。Rqは、非摂動PQC（すなわち真空中または空気中で共振するPQC）の動抵抗である。例えば、空気中で測定したRqは、既存の9MHz結晶では約15.0Ωである。これに対して、純水（20℃）中の同じ結晶について測定したR1は、約228 Ωである。Δf対R1の関係を簡単に得るために、質量効果および粘性効果のみを考慮する場合には、本研究では、R1とR2とは略等しい(R1≒R2)と見なすことが妥当である。したがって、おおよそのΔf対R1の関係は、数式（6）と数式（7）を組み合わせることによって得ることができる。
【００３９】
【数１２】
数式（8）のL1を考慮すると、数式（10）の傾きは、
【００４１】
【数１３】
で表される。
この傾きは、Nやhではなく、f0、K0、C0（またはL1）にのみ関係している。真空中（または空気中）のL1を測定すれば、この傾きの理論値が得られる。
【００４３】
下記は、参照文献である。
［3］:D.A.Buttry,M.D.Ward, Measurement of interfacial processes at electrode surfaces with the electrochemical quartz crystal microbalance, Chem. Rev. 92 (1992) 1355-1379.
［4］:G.Sauerbrey,Verwendung von schwingquarzen zur wagung dunner schichten und zur mikrowagung, Z. Phys. 155(1959)206-222.［7］:K.K.Kanazawa, J.G. Gordon II, The oscillation frequency of a quartz resonator in contact with a liquid, Anal. Chem. Acta 175 (1985)99-105.
［16］:S.J. Martin, V.E. Granstaff, G.C.Frye, Characterizaiton of a quartz microbalance with simultaneous mass and liquid loading, Anal.Chem. 63 (1991)2272-2281
［17］:W.G.Cady,Piezoelectricity, Dover, New York, 1964.
［18］:V.E. Bottom, in: Introduction to Crystal Unit Design, Van Nostrand-Reinhold, New York, 1982, p, 120.
［19］:W.P. Mason, Piezoelectric Crystals and Their Applications to Ultrasonics, Van Nostrand, Princeton, NJ, p. 339.［20］:W.P. Mason, Electromechanical Transducers and Wave Filters, Van Nostrand-Reinhold, New York, 1948.
＜周波数に関する考察＞
次に、アドミタンスを符号Ｙ、コンダクタンスを符号Ｇ、サセプタンスを符号Ｂで表し(アドミタンスＹ＝コンダクタンスＧ＋ｊ・サセプタンスＢ)、角周波数を符号ωで表したとき、コンダクタンスＧとサセプタンスＢは、図１の等価回路の等価直列レジスタンスＲ1と、等価直列キャパシタンスＣ1と、等価直列インダクタンスＬ1とから、下記(ａ)、(ｂ)式のように表すことができる。
【００４４】
【数１４】
直列共振状態を与える角周波数を共振角周波数ωsとすると、ｈ＝１のときの共振角周波数ωsでは、ωsＬ1−１／(ωsＣ1)＝０が成り立つから、共振角周波数ωsは下記(ｃ)式で表される。
【００４６】
【数１５】
角周波数ωに対応する周波数をｆ(ｆ＝ω／(２π))で表すと、共振周波数ｆsは、下記(ｄ)式で表される。
【００４８】
【数１６】
ｈ＝１の共振状態のときのコンダクタンスＧは１／Ｒ1である。
ここで、共振状態のときのコンダクタンスＧの値を符号Ｇsで表し、その半分の値を半値コンダクタンスＧs／２とし、半値コンダクタンスＧs／２を与える角周波数を半値角周波数とすると、半値角周波数は２個存在する。それぞれω1、ω2(ω1＜ω2)で表すと、各半値角周波数ω1、ω2は下記(ｅ)、(ｆ)式で与えられる。
【００５０】
【数１７】
図２は、ｈ＝１のときの共振角周波数ωs、半値角周波数ω1、ω2とコンダクタンスＧの関係を示すグラフである。
【００５２】
大きい方の半値角周波数ω2に対応する半値周波数ｆ2は、下記(ｇ)式で表すことができる。
【００５３】
【数１８】
上記(ｇ)式の第２項中、Ｃ1の値は小さいからＲ1 2Ｃ1 2は微小量であり、無視できる。従って、(ｇ)式は下記(ｈ)式に書き直すことができる。
【００５５】
【数１９】
上記(ｈ)式の第２項は、共振周波数ｆsに等しいから、結局、半値周波数ｆ2は、下記(ｉ1)式で表される。
【００５７】
【数２０】
粘性変化と質量変化の両方があった場合、等価直列キャパシタンスＣ1は変化せず、等価直列インダクタンスＬ1と等価直列レジスタンスＲ1とが変化するものとすると、Ｒ1とＬ1とｆsは、ΔＲ1とΔＬ1とΔｆsになるので、半値周波数ｆ2の微小変化量Δｆ2は下記(ｉ2)式で表すことができる。
【００５９】
【数２１】
ここで、上記(ｄ)式においてＬ1のみ変化する場合には、Δｆsは、
【００６１】
【数２２】
となるため、上式を用いて、(ｉ2)式を書き換えると、下記(ｉ3)式が得られる。
【００６３】
【数２３】
実際にｆs＝２７ＭＨｚの水晶振動子は液中でＲ１≒２００Ω、Ｌ1≒２×１０-3Ｈの値となるので、(ｉ13)式のＲ1／(８πＬ1ｆs)は下記値となる。
【００６５】
【数２４】
上記値は１よりも十分小さいので、(ｉ3)式は下記(ｊ)式に近似することができる。
【００６７】
【数２５】
質量効果と粘性効果だけを考慮する場合、周波数変動Δｆは、上記(10)式で表されるから、共振周波数ｆsの微小変化量Δｆsは、上記(10)式を用い、直ちに下記(ｋ)式で表すことができる。
【００６９】
【数２６】
(ｋ)式を(ｊ)式に代入すると、(ｊ)式の第１項が(ｋ)式の第２項で消去され、半値周波数ｆ2の微小変化量Δｆ2は、下記(ｌ)式で表すことができる。
【００７１】
【数２７】
上記(ｌ)式には、等価直列抵抗Ｒ1の微小変化量ΔＲ1を含む項が消去され、質量ｍの微小変化量Δｍを変数とする項だけが残っている。即ち、粘性変化による影響の項が消去され、質量負荷のみによる周波数変化となる。
【００７３】
従って共振周波数ｆsを測定するのではなく半値周波数ｆ2を測定することにより、粘性の影響を排除した質量負荷による周波数変化のみを測定することが可能となる。
【００７４】
質量変化により、共振状態のときのコンダクタンスＧの値も変化するため、半値周波数ｆ2を測定する際には、半値周波数ｆ2を測定する直前に共振状態のコンダクタンスＧsを測定し、その値から半値コンダクタンスＧs／２を算出し、半値コンダクタンスＧs／２を与える周波数を半値周波数ｆ2として求めるとよい。
【００７５】
なお、上記はｈ＝１の場合であって、基本共振周波数での直列共振状態のときのコンダクタンスＧの半分の値を用いたが、２以上のｈ場合についても同様である。即ち、図３に示したように、ｈ＝ｎのときの直列共振状態を与える共振周波数をｆ(ｎ)sで表し、ｆ(ｎ)sのときのコンダクタンスＧの値をＧ(n)sで表すと、各ｎに対し、半値コンダクタンスＧ(n)s／２を与える半値周波数ｆ(n)1及びｆ(n)2が決まる。各ｎに関し、大きい方の半値周波数ｆ(n)2の変動を測定して質量変化を求める場合も、粘性変化の影響は消去される。
【００７６】
本発明は上記の原理に基いており、請求項１記載の発明は、結晶板と、前記結晶板の両面に配置された第１、第２の電極を有する振動子を液体中に浸漬し、前記第１、第２の電極間に交流信号を印加し、前記交流信号の周波数と前記振動子の電気的特性の関係から、前記振動子の重量変化を求める分析方法であって、前記振動子が直列共振状態にあるときのコンダクタンスの半分の大きさの半値コンダクタンスを与える半値周波数であって、前記直列共振状態を与える共振周波数に近く、且つ、共振周波数よりも大きな周波数である半値周波数の変化から、前記振動子の重量変化を求める分析方法である。
請求項２記載の発明は、前記振動子に、前記半値周波数を含むと予想される周波数範囲の前記交流信号を繰り返し入力し、時間経過に対する前記振動子の重量変化を求める請求項１項記載の分析方法である。
請求項３記載の発明は、前記液体中に試料を投入する前に、前記半値周波数の初期値を求め、前記半値周波数の前記初期値に対する変動量から、前記振動子の重量変化を求める請求項１又は請求項２のいずれか１項記載の分析方法である。
請求項４記載の発明は、前記振動子のコンダクタンスの極値を測定し、前記極値から前記半値周波数を求める請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の分析方法である。
請求項５記載の発明は、前記極値は、前記振動子のコンダクタンスの最大値を用いる請求項４記載の分析方法である。
請求項６記載の発明は、前記振動子の共振周波数と等価回路の定数から、前記半値周波数を求める請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の分析方法である。
【００７７】
【発明の実施の形態】
本発明の測定方法を、本発明に用いる振動子及び測定装置と共に説明する。
図４(ａ)は、本実施の形態の測定用セル２の断面図、同図(ｂ)は、同測定用セルの水晶振動子３の平面図、同図(ｃ)は断面図である。
【００７８】
振動子３は、図４(ｂ)、(ｃ)に示すように、結晶板３０を有しており、この結晶板３０の表面側と裏面側とは、第１、第２の電極３１、３２がそれぞれ配置されている。結晶板３０は、例えば水晶や石英等の結晶が円板状に成形されて構成されており、第１、第２の電極３１、３２は、金属薄膜が所定形状にパターンニングされて構成されており、第１の電極３１は、一部が裏面側まで回り込んでいる。
【００７９】
第１、第２の電極３１、３２は、結晶板３０の裏面位置で、第１、第２のスプリング２４、２５の一端に接続されている。第１、第２のスプリング２４、２５の他端は、第１、第２の端子ピン２６、２７に接続されている。第１、第２のスプリング２４、２５は金属製であり、第１、第２の電極３１、３２は、第１、第２のスプリング２４、２５によって、第１、第２の端子ピン２６、２７に電気的に接続されている。
【００８０】
符号２３は、絶縁性を有する台座であり、第１、第２の接続ピン２６、２７は、ガラスシール２８によって、この台座２３に固定されている。
【００８１】
次に、セル２は、図４(ａ)に示すように、例えばアクリル樹脂が円筒形に成形されて成るセル本体２０を有している。
【００８２】
セル本体２０の底部よりもやや上の位置には、フランジ部２１が形成されており、振動子３は、セル本体２０の底面側からセル本体２０の内部に挿入されており、振動子３の外周部分がフランジ部２１に当接されている。
【００８３】
その状態では、第１、第２のスプリング２４、２５は圧縮され、その復元力によって振動子３がフランジ部２１に押圧される。
【００８４】
振動子３とフランジ部２１とが接触する部分には、接着剤が配置されており、第１、第２のスプリング２４、２５によって振動子３の外周がフランジ部２１に押圧された状態で、台座２３がセル本体２０の底面に固定されると、振動子３は、接着剤によってフランジ部２１に固定される。
【００８５】
この状態では、振動子３を底面とし、セル本体２０の上部を側面とする液密な有底円筒容器状の収容部２０ａが構成される。
【００８６】
第１、第２の端子ピン２６、２７は、台座２３の底面から、セル本体２０の外部に導出されており、第１、第２の端子ピン２６、２７を測定機器等の外部回路に接続すると、第１、第２の電極３１、３２は、その外部回路に接続される。
【００８７】
第１、第２の電極３１、３２のうち、ここでは、結晶板３０の表面側、即ち、収容部２０ａの底面に露出する位置には第１の電極３１が配置されており、その第１の電極３１の表面には、反応膜３３が配置されている。反応膜３３は、測定対象である特定成分と反応し、又はその特定成分を吸着する材料で構成されている。
【００８８】
そして、図５に示すように、台２９の上にセル２を配置し、測定対象である特定成分を溶解させる溶媒、あるいは特定成分を分散させる液体であって、その特定成分が含まれていない状態の液体を、収容部２０ａ内に注入する。
【００８９】
図５の符号７は、その液体を示しており、この状態では、反応膜３３は液体７に接触する。第１の電極３１の反対側に位置する第２の電極３２は、液体７には接触しない。従って、この例では上記各式((1)〜(10)式)中のＮは１である。
【００９０】
図６の符号１は測定装置であり、上述したセル２と、ネットワークアナライザーやインピーダンスアナライザー等から成る分析装置４と、分析装置４を制御し、その測定値を演算する制御装置５とを有している。
【００９１】
セル２は分析装置４に接続されており、分析装置２は所望周波数の交流信号をセル２に出力し、その周波数下でのセル２のコンダクタンスＧを測定できるように構成されている。
【００９２】
ここで、制御装置５は、分析装置４の動作を制御し、分析装置４がセル２に出力する信号の周波数を変化させると共に、周波数と測定結果とを対応させ、演算結果と共に記憶するように構成されている。
【００９３】
ここで、共振周波数ｆsを含む所定範囲内で周波数を変化させ、周波数とコンダクタンスＧの関係を測定する場合、共振状態では、コンダクタンスＧは極値を取る。特に、ｈ＝１の共振状態は、コンダクタンスＧの極値は最大値を与えるから、測定値中で最大コンダクタンスＧmaxを与える周波数が共振周波数ｆsであることが容易に分かる。試料投入前の共振周波数ｆsの測定値は、共振周波数ｆsの初期値となる。
【００９４】
また、ｈ＝１では、最大コンダクタンスＧmaxの１／２の値、即ち半値コンダクタンスＧs／２を与え、且つ、共振周波数ｆsよりも大きな周波数を測定結果から逆に求めると、その値が半値周波数ｆ2であることが分かる。試料投入前の値は半値周波数ｆ2の初期値ｆM2(ｔ＝０)である。
【００９５】
次に、液体７中に、測定対象である特定成分を含む液体を試料として注入すると、特定成分が反応膜３３と反応又は吸着し、反応膜３３の重量が増加し始める。
【００９６】
ここで、試料を投入した後、セル２に印加する信号の周波数を、共振周波数ｆsの初期値と半値周波数ｆ2の初期値を含む所定範囲で変化させながら印加し、セル２のコンダクタンスＧを測定する。
【００９７】
例えば、１秒おきに半値周波数ｆ2を求める場合、交流信号の周波数を所定範囲で変化させながらコンダクタンスＧの最大値を１秒間隔で測定することになる。
【００９８】
そして、コンダクタンスＧの測定値から、その極値(ｈ＝１では、最大コンダクタンスＧmax)を求め、その値の１／２の半値コンダクタンスを与える半値周波数ｆ2を求める。試料投入後、一定間隔(例えば１秒毎)にこれを繰り返す。
【００９９】
ここで、半値周波数ｆ2の測定値を、ｆM2(ｔ＝１)、ｆM2(ｔ＝２)、……(ｔは時間を表す。)とすると、各測定値ｆM2(ｔ＝１)、ｆM2(ｔ＝２)、ｆM2(ｔ＝１)……と初期値ｆM2(ｔ＝０)の周波数差分から、質量変動を求めることができる。質量変動から、測定対象の液体中の特定成分の濃度が分かる。
【０１００】
なお、１秒ごとに測定結果を記録しておき、測定終了後、半値周波数ｆ2とその変動を求めることもできる。
【０１０１】
次に、実測結果のグラフを用い、本発明が高精度であることを説明する。
【０１０２】
共振周波数ｆs又は半値周波数ｆ2の測定値と初期値の差分を周波数差分Δｆとする。図６は、振動子を水中に浸漬し、水温を２０℃〜３５°まで５℃刻みで上げていった場合の時間経過と周波数差分Δｆの関係を示すグラフである。図６中、符号ａ1は半値周波数ｆ2の周波数差分Δｆの変化を示す曲線であり、符号ａ2は共振周波数ｆsの周波数差分Δｆの変化を示す曲線である。
【０１０３】
液温の上昇とともに液の粘性が減少するため、共振周波数ｆsの周波数差分Δｆの変化は大きい。それに対し、半値周波数ｆ2の周波数差分Δｆの変化はゼロである(僅かな変化は、温度変化による水晶振動子の特性変動である。)。
【０１０４】
図７は、質量効果と粘性効果の両方が生じたときの周波数差分Δｆの経時変化を示すグラフであり、符号ｂ1が半値周波数ｆ2の周波数差分Δｆの変動を示し、ｂ2が共振周波数ｆsの周波数差分Δｆの変動を示している。
【０１０５】
このグラフの場合、先ず、振動子３をバッファー液中に浸漬した時刻を測定開始時間とし、測定開始時間から３００秒経過したときに第１の試料(アビジン)を注入し、次に、１２００秒経過したときに第２の試料（グリセロールとアビジンの混合液(アビジンの濃度は１回目と同じ))を注入し、２４００秒経過したときに、第３の試料(グリセロールのみであり、量は２回目と同じである。)を注入した。
【０１０６】
各試料中、アビジンは反応膜３３に付着し質量効果を与えるが、グリセロールは反応膜３３に付着せず、粘性効果だけを与える。
【０１０７】
第１の試料の投入により、アビジンの付着によって周波数差分Δｆは変化するが、半値周波数ｆ2については一定の傾きで変化するのに対し、共振周波数ｆsの周波数差分Δｆは、グリセロールによる粘性効果で周波数が大きく減少している。
【０１０８】
なお、上記例では、直列共振状態のときにコンダクタンスＧを測定し、その１／２の値から半値周波数ｆ2を求めたが、直列共振状態のときにコンダクタンスＧを測定せず、共振周波数ｆsの測定値や等価回路の定数Ｒ1、Ｌ1、Ｃ1を用いて半値周波数ｆ2を算出することもできる。
【０１０９】
例えば、振動子３のレジスタンスＲ1、インダクタンスＬ1、及び共振周波数ｆsを測定すれば、コンダクタンスＧを測定しなくても、(ｉ1)式から半値周波数ｆ2を算出することができる。
【０１１０】
また、インピーダンスアナライザー等でＱ値(Ｑ＝ｆs／(ｆ2−ｆ1))やＤ値(Ｄ＝１／Ｑ)を測定すれば、ｆ2＝ｆs＋ｆs／(２・Ｑ)から、半値周波数ｆ2を求めることができる。
【０１１１】
要するに、本発明は、コンダクタンスＧを実測し、半値周波数ｆ2を求める場合に限定されるものではなく、コンダクタンスＧ以外の値を測定して半値周波数ｆ2を求める場合も含まれる。
【０１１２】
【発明の効果】
従来方式ではバッファー液と試料の粘性が異なると正確な測定ができなかったが、本発明では、バッファー液と粘性が異なる試料を使用した場合の変性効果や温度変化による変性効果の影響を受けないので、正確な測定をすることが可能となった。
【０１１３】
従って、本発明は、粘性の高い血液の検査や、食品に含まれる菌の検査において高い効果を発揮する。
【０１１４】
また、温度の影響がないことから、装置にバッファー液の入ったセルをセットした後、バッファーの液温が装置でセットした温度になるまで、安定待ちの時間が短縮され、スループットが高くなった。
【０１１５】
更にまた、水を多く含む物質は吸着の際水も一緒に振動するため、従来技術では、真値よりも大きい周波数変動があったならば、本発明によれば正しく測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】振動子の等価回路
【図２】信号の周波数と振動子のコンダクタンスとの関係を示すグラフ
【図３】高次の共振状態を説明するためのグラフ
【図４】(ａ)〜(ｃ)：本発明の用いる振動子、及びその振動子を用いた測定セルを説明するための図
【図５】測定装置全体を説明するための図
【図６】温度変化と周波数変動の関係を説明するためのグラフ
【図７】質量効果及び粘性効果と周波数変動の関係を説明するためのグラフ
【符号の説明】
３……振動子
３０……結晶板
３１……第１の電極
３２……第２の電極
Ｇ……コンダクタンス
ｆ2……半値周波数
ｆs……共振周波数
Claims (6)
- 結晶板と、前記結晶板の両面に配置された第１、第２の電極を有する振動子を液体中に浸漬し、前記第１、第２の電極間に交流信号を印加し、前記交流信号の周波数と前記振動子の電気的特性の関係から、前記振動子の重量変化を求める分析方法であって、
前記振動子が直列共振状態にあるときのコンダクタンスの半分の大きさの半値コンダクタンスを与える半値周波数であって、前記直列共振状態を与える共振周波数に近く、且つ、共振周波数よりも大きな周波数である半値周波数の変化から、前記振動子の重量変化を求める分析方法。 - 前記振動子に、前記半値周波数を含むと予想される周波数範囲の前記交流信号を繰り返し入力し、時間経過に対する前記振動子の重量変化を求める請求項１項記載の分析方法。
- 前記液体中に試料を投入する前に、前記半値周波数の初期値を求め、前記半値周波数の前記初期値に対する変動量から、前記振動子の重量変化を求める請求項１又は請求項２のいずれか１項記載の分析方法。
- 前記振動子のコンダクタンスの極値を測定し、前記極値から前記半値周波数を求める請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の分析方法。
- 前記極値は、前記振動子のコンダクタンスの最大値を用いる請求項４記載の分析方法。
- 前記振動子の共振周波数と等価回路の定数から、前記半値周波数を求める請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の分析方法。
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