JP4005325B2 - Anticancer drugs and new substances JJ13 - Google Patents

Description

【０００４】
（式中、R₁は水素、水酸基、アルキル基、アルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R₂は水素又はアルキル基を表し、
R₃は水素、水酸基、アルキル基、アルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R₄は水素又はアルキル基を表し、
R₅はヒドロカルビル基を表し、
R₆は水素、水酸基、アルキル基、アルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R₇は水素、アルキル基又はアシル基を表す。）
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明におけるステロイド化合物のうち、下記の式（２）で表されるステロイド化合物が好ましく、
【０００６】
【化５】

【０００７】
（式中、R₁は水素、水酸基、アルキル基、アルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R₂は水素又はアルキル基を表し、
R₃は水素、水酸基、アルキル基、アルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R₄は水素又はアルキル基を表し、
R₅はヒドロカルビル基を表し、
R₆は水素、水酸基、アルキル基、アルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R₇は水素、アルキル基又はアシル基を表す。）
また、R₂が1から18個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
R₃が水酸基、又は1から18個の炭素原子を有するアルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R₄が1から18個の炭素原子を有するアルキル基を表し、
R₅が1から18個の炭素原子を有するヒドロカルビル基を表し、
R₆が水酸基、又は1から18個の炭素原子を有するアルコキシ基又はアシルオキシ基を表し、
R₇が水素、又は1から18個の炭素原子を有するアルキル基又はアシル基を表すものがより好ましい。特に、下記の式（３）で表されるものが最も好ましい。
【０００８】
【化６】

【０００９】
本発明におけるステロイド化合物は、該化合物の生産菌を培養し、培養物より分離生成することにより得ることができ、例えば特開平7-48397に記載される方法により得ることができる。本発明におけるステロイド化合物の生産菌としては、該化合物の生産能を有するものであればいずれも使用できる。好適に使用できるものとしては、ビソクラミス（Byssochlamys）属の菌が挙げられる。さらには、ビソクラミス属ニベア（nivea）種の菌を用いるのが好ましい。本発明においては、特に以下に示すByssochlamys nivea M#5187が有利に使用できる。
【００１０】
本発明におけるステロイド化合物（３）を生産する菌株は新たに桃の缶詰より分離した菌株であり、微生物の名称「Byssochlamys nivea M#5187」及び受託番号「FERM BP-7722」として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている。この菌株の菌学的性状を以下に示す。
（a）ポテトデキストロース寒天培地で、30℃、2週間培養した場合
（集落性状）
発育は速やかで、集落の大きさは75 mmである。表面性状はクリーム色で、一部綿毛状となる。色素産生はしない。裏面は淡褐色から淡黄色である。37℃で発育は良好である。
（形態）
有性世代があり、子のう果は白色で球状であり、大きさは200〜350μmである。子のうは無色で球状であり、大きさは8〜12μmである。子のう胞子は無色で単細胞であり、楕円形であり、表面平滑であり、大きさは4〜5×2.5〜3μmである。
無性世代はPaecilomycesであり、分生子は亜球形で、大きさは3〜5×2.5〜4μmであり、厚膜胞子産生する。
（b）Malt Yeast 寒天培地で30℃、2週間培養した場合
（集落性状）
発育は速やかで、集落の大きさは85 mm以上である。表面性状はクリーム色で疣状隆起があり、平坦である。裏面は無色である。37℃で発育は良好である。
（形態）
有性世代があり、子のう果はクリーム色で球状であり、大きさは260〜290μmである。子のうは無色で球状であり、大きさは8〜12μmである。子のう胞子は無色で単細胞であり、楕円形であり、表面平滑であり、大きさは4〜5×3〜4μmである。
無性世代はPaecilomycesであり、分生子は無色でやや楕円形であり、大きさは3.5から5×4.5μmである。
厚膜胞子を多量に産生し、楕円形であり、大きさは6〜8μm、介在性、連鎖状もある。
（c）生理的性質
（生育温度範囲及び最適温度）
本菌株は、15〜42℃の範囲で生育し、温度は25〜37℃、至適温度は32℃である。なお、使用した倍地はポテトデキストロース寒天培地である。
（生育pH範囲及び最適pH）
pHは6.9〜7.5、至適pHは7.5である。なお、このpH測定は液体培地法（32℃）により行った。基礎培地には、Czapekブロスを緩衝液でpH調整したものを使用した。
（好気性、嫌気性の区別）
好気性である。
【００１１】
以上の形態的特徴及び培養上の性状を、
R. A. Samson & E. S. van Reenenn-Hoekstra:
Introduction to Food Borne Fungi 1988 pp.26-31
Ascomycetes,Byssochlamys
Centraalbureau voor Schimmelkultures,Baarn
に報告されている多くの既知菌株と比較検討した。
その結果、本菌株はByssochlamys niveaであることが明らかとなった。
【００１２】
本発明におけるステロイド化合物は、該化合物の生産菌を好適な培地で好気的に培養し、培養物から目的物を分離、精製することによって得ることができる。培地は、通常の微生物が利用しうる栄養物を含有するものである。栄養源としては、従来から培養に利用されている公知のものが使用できる。具体的には、炭素源としては、グルコース、水飴、デキストリン、澱粉、糖蜜、玄米、油脂類などが使用できる。また、窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、綿実粕、コーンステイープリカー、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、などの有機物ならびに硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機物が利用できる。その他必要に応じて、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオンを生成することができる無機塩類を添加することができる。また、菌の発育を助け、本発明におけるステロイド化合物の生産を促進するような有機および無機物を適当に添加することができる。培養方法としては、好気的液体培養法が最も適している。培養に適当な温度は、２０〜３０℃であるが、多くの場合２７℃付近で培養する。このようにしてステロイド化合物が蓄積した培養物から目的物質を単離精製する。
【００１３】
培養物からの採取にあたっては、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲル濾過法、透析法、沈澱法等を単独で又は適宜組み合わせて抽出精製することができる。例えば、培養液中に蓄積されたステロイド化合物（３）は、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム等で抽出すると有機溶剤層に抽出される。ステロイド化合物（３）を更に精製するには、シリカゲル、アルミナ、等の吸着クロマトグラフィーあるいは合成吸着剤例えばダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学社製）、あるいはゲル濾過等のクロマトグラフィー例えばセファデックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）、あるいはＯＤＳカラムクロマトグラフィーやＨＰＬＣを適宜組み合わせて実施することができる。
さらに、採取されたステロイド化合物、例えば上記の式（３）のステロイド化合物を置換反応又は付加反応等の化学修飾することにより、本発明におけるステロイド化合物を得ることができる。
【００１４】
本発明におけるステロイド化合物は抗がん剤として、任意の投与経路で、また採用投与経路によって決まる剤型、例えば錠剤、カプセル、坐剤、溶液、シロップ、乳液等で投与することができる。薬剤としては、製薬上許容される担体あるいは希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、ラクトース、コンスターチ、アルギン酸、スターチ、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、ポリビニルアセテート等で希釈された形態が普通である。抗がん剤として本発明におけるステロイド化合物を実際に投与する場合には、これらを注射用蒸留水または生理食塩水に溶解して注射する方法が代表的なもののひとつとして挙げられる。具体的には、動物の場合には腹腔内注射、皮下注射、静脈または動脈への血管内注射および注射による局所投与などの方法が、ヒトの場合は静脈または動脈への血管内注射または注射による局所投与などの方法がある。本発明におけるステロイド化合物の投与量は、種々の状況を勘案して、連続的または間欠的に投与したときに総投与量が一定量を越えないように定められる。具体的な投与量は、投与方法、患者または被処理動物の状況、たとえば年齢、体重、性別、感受性、食餌、投与時間、併用する薬剤、患者またはその病気の程度に応じて変化することは言うまでもなく、また一定の条件のもとにおける適量と投与回数は、上記指針のもととして専門医の適量決定試験によって決定されなければならない。具体的には、成人１日あたり0.１〜１ｇ程度である。
【００１５】
【実施例】
（培養）
以下に示す前培養培地15mlを50ml容大型試験管に分注、殺菌後、本菌株を接種し、27℃にて72時間培養したものを種母とした。
グルコース 4 g
酵母エキス 4 g
麦芽エキス 10 g
チアミン塩酸塩 5 mg
リボフラビン 5 mg
ナイアシン 5 mg
ピリドキシン 5 mg
イノシトール 5 mg
パントテン酸カルシウム 5 mg
p-アミノ安息香酸 5 mg
ビオチン 2.5 mg
水 1L
pH 7.3
以下に示す生産培地を500ml容三角フラスコへ分注し、殺菌したものに上記種母2mlを添加し、27℃にて2週間、静置培養を行った。
玄米 9 g
酵母エキス 18 mg
酒石酸ナトリウム 9 mg
りん酸二水素カリウム 9 mg
水27 ml
【００１６】
（単離）
上記で得た菌体（フラスコ6本分）を80%アセトン水（450ml）で抽出し、遠心エバポレータでアセトンを除去した。さらに450mlの酢酸エチルで2回抽出し、濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (Wako C-200)に吸着させ、クロロホルム-メタノール (85 : 1)の混合溶媒で溶出した。得られた画分をゲル濾過クロマトグラフィー（Sephadex LH-20）に供し、100%メタノールにより溶出した。さらに得られた画分を高圧液体クロマトグラフィー (Senshu-Pak ODS)に供し、80%メタノールにより溶出し、新規物質JJ13 を得た(1.2 mg)。得られた化合物は、下記の物理化学的性質を有するものであり、各種スペクトルデータの解析の結果、前記式（３）で示される化学構造を有することがわかった。
【００１７】
（JJ13の理化学的性質）
外観：白色粉末
融点：265〜268℃
比旋光度：[α]_D ²⁵ +53 (c 0.69, CHCl₃)
分子式：C₃₂H₅₀O₇
高分解能FAB-MS 実測値：569.3456 (M+Na)⁺ 計算値：569.3454
溶解性：メタノール、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサンに可溶、水に難溶
紫外線吸収スペクトル λnm (ε) （メタノール中、図１に示す）：204 (3,010), 277 (120)
赤外吸収スペクトルcm^-1（KBrディスク法、図２に示す）：3480, 1730
¹³C and ¹H NMR データ（図３ａ及びｂに示す）：

【００１８】
（抗がん作用の評価）
抗がん作用試験は、ヒトの乳がん細胞株であるHBC-4細胞及びMCF-7細胞、ラットの正常線維芽細胞株3Y1細胞を用いて評価した。
（１）HBC-4細胞
HBC-4細胞を、50 ng/ml IGF-1、100ユニットmlペニシリン、0.1μg/mlストレプトマイシンを含有するRPMI1640培地にて、2×10³ cells/mlになるよう細胞を調製し、96穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）に100μl/wellずつ播種し、37℃、5％CO₂条件で培養した。2時間後、各濃度に調節したJJ13を添加した。対照サンプルとして、JJ13を加えない無添加サンプルも作製した。同条件下で72時間培養を行い、MTTアッセイにより細胞障害活性を評価した。
（２）MCF-7細胞
MCF-7細胞を30 ng/ml IGF-1、100ユニットmlペニシリン、0.05μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ社製）にて、5×10³ cells/mlになるよう細胞を調製し、96穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）に100μl/wellずつ播種し、37℃、5％CO₂条件で培養した。2時間後、各濃度に調節したJJ13を添加した。対照サンプルとして、JJ13を加えない無添加サンプルも作製した。72時間培養を行い、MTTアッセイにより細胞増殖抑制活性を評価した。
（３）3Y1細胞
3Y1細胞を50 ng/ml IGF-1、100ユニットmlペニシリン、0.05μg/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ニッスイ社製）にて、2×10³ cells/mlになるよう細胞を調製し、96穴マイクロプレート（住友ベークライト社製）に100μl/wellずつ播種し、37℃、5％CO₂条件で培養した。2時間後、各濃度に調節したJJ13を添加した。対照サンプルとして、JJ13を加えない無添加サンプルも作製した。72時間培養を行い、MTTアッセイにより細胞増殖抑制活性を評価した。
評価した結果を図４に示す。JJ13はHBC-4細胞に対し、細胞障害活性を示し、MCF-7細胞に対しては細胞増殖阻害活性を示した。一方、3Y1細胞に対してはいずれの活性も示さなかった。
【００１９】
【発明の効果】
本発明のステロイド化合物を有効成分とする抗がん剤及び新規物質JJ13は、がん細胞のみに選択的に作用し、細胞障害活性あるいは細胞増殖抑制活性を示す。特に乳がん細胞に対して高い効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 JJ13の紫外線吸収スペクトルである。
【図２】 JJ13の赤外線吸収スペクトルである。
【図３ａ】 JJ13の¹³C NMRスペクトルである。
【図３ｂ】 JJ13の¹H NMRスペクトルである。
【図４】抗がん作用の評価結果のグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an anticancer agent comprising a steroid compound having a specific structure as an active ingredient and a novel substance JJ13.
[Prior art]
Many anticancer agents have already been put to practical use as pharmaceuticals. However, there are not so many anticancer drugs useful in the clinic, and side effects are a problem even in anticancer drugs that have a therapeutic effect. In general, the physiological activity of a chemical substance largely depends on its chemical structure. Therefore, the appearance of a novel compound having anticancer properties is always desired.
[0002]
[Problems to be solved by the invention]
It aims at providing the novel anticancer agent which acts selectively only on a cancer cell.
[Means for Solving the Problems]
As a result of examining various microbial metabolites for achieving the above object, it was found that a steroid compound having a specific structure has a selective anticancer activity against human breast cancer cells. That is, this invention provides the anticancer agent which uses the steroid compound represented by following formula (1) as an active ingredient.
[0003]
[Formula 4]

[0004]
(Wherein R ₁ represents hydrogen, a hydroxyl group, an alkyl group, an alkoxy group or an acyloxy group;
R ₂ represents hydrogen or an alkyl group,
R ₃ represents hydrogen, a hydroxyl group, an alkyl group, an alkoxy group or an acyloxy group,
R ₄ represents hydrogen or an alkyl group,
R ₅ represents a hydrocarbyl group,
R ₆ represents hydrogen, a hydroxyl group, an alkyl group, an alkoxy group or an acyloxy group,
R ₇ represents hydrogen, an alkyl group or an acyl group. )
[0005]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Of the steroid compounds in the present invention, a steroid compound represented by the following formula (2) is preferred,
[0006]
[Chemical formula 5]

[0007]
(Wherein R ₁ represents hydrogen, a hydroxyl group, an alkyl group, an alkoxy group or an acyloxy group;
R ₂ represents hydrogen or an alkyl group,
R ₃ represents hydrogen, a hydroxyl group, an alkyl group, an alkoxy group or an acyloxy group,
R ₄ represents hydrogen or an alkyl group,
R ₅ represents a hydrocarbyl group,
R ₆ represents hydrogen, a hydroxyl group, an alkyl group, an alkoxy group or an acyloxy group,
R ₇ represents hydrogen, an alkyl group or an acyl group. )
R ₂ represents an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms,
R ₃ represents a hydroxyl group, or an alkoxy group having 1 to 18 carbon atoms or an acyloxy group,
R ₄ represents an alkyl group having 1 to 18 carbon atoms,
R ₅ represents a hydrocarbyl group having 1 to 18 carbon atoms,
R ₆ represents a hydroxyl group, or an alkoxy group having 1 to 18 carbon atoms or an acyloxy group,
More preferably, R ₇ represents hydrogen or an alkyl or acyl group having 1 to 18 carbon atoms. In particular, the one represented by the following formula (3) is most preferable.
[0008]
[Chemical 6]

[0009]
The steroid compound in the present invention can be obtained by culturing a bacterium producing the compound and separating and producing it from the culture. For example, the steroid compound can be obtained by a method described in JP-A-7-48397. Any steroid compound producing bacterium can be used in the present invention as long as it has the ability to produce the compound. Suitable examples include bacteria belonging to the genus Byssochlamys. Furthermore, it is preferable to use a bacterium belonging to the genus Bisoclamis nivea. In the present invention, Byssochlamys nivea M # 5187 shown below can be used particularly advantageously.
[0010]
The strain which produces the steroid compound (3) in the present invention is a strain newly isolated from canned peach, and is named as “Byssochlamys nivea M # 5187” and the accession number “FERM BP-7722”. Deposited at the Research Center for Patent Biology. The bacteriological properties of this strain are shown below.
(A) When cultured on potato dextrose agar medium at 30 ° C for 2 weeks (community characteristics)
Growth is rapid and the village size is 75 mm. The surface texture is creamy and partly fluffy. Does not produce pigment. The back side is light brown to light yellow. Growth is good at 37 ° C.
(Form)
There is a sexual generation, the baby fruit is white and spherical, and the size is 200-350 μm. The baby cubs are colorless and spherical, and the size is 8-12 μm. Ascospores are colorless and single cells, are oval, have a smooth surface, and have a size of 4-5 × 2.5-3 μm.
The asexual generation is Paecilomyces, the conidia are subspherical, the size is 3-5 × 2.5-4 μm, and produce thick spore.
(B) Malt Yeast When cultured at 30 ° C for 2 weeks on agar medium (community characteristics)
Growth is rapid and the village size is 85 mm or more. The surface texture is creamy, wrinkled, and flat. The back side is colorless. Growth is good at 37 ° C.
(Form)
There is a sexual generation, the baby fruit is creamy and spherical, and the size is 260-290 μm. The baby cubs are colorless and spherical, and the size is 8-12 μm. Ascospores are colorless and single cells, are oval, have a smooth surface, and have a size of 4-5 × 3-4 μm.
The asexual generation is Paecilomyces, the conidia are colorless and somewhat oval, and the size is 3.5 to 5 × 4.5 μm.
Produces a large amount of thick film spores, is oval, 6-8 μm in size, intervening, and chained.
(C) Physiological properties (growth temperature range and optimum temperature)
This strain grows in the range of 15 to 42 ° C, the temperature is 25 to 37 ° C, and the optimum temperature is 32 ° C. The medium used was potato dextrose agar medium.
(Growth pH range and optimum pH)
The pH is 6.9 to 7.5, and the optimum pH is 7.5. This pH measurement was performed by the liquid medium method (32 ° C.). As the basal medium, Czapek broth adjusted to pH with a buffer was used.
(Aerobic and anaerobic distinction)
Aerobic.
[0011]
The above morphological characteristics and culture properties
RA Samson & ES van Reenenn-Hoekstra:
Introduction to Food Borne Fungi 1988 pp.26-31
Ascomycetes, Byssochlamys
Centraalbureau voor Schimmelkultures, Baarn
Comparison with many known strains reported in
As a result, it was revealed that this strain was Byssochlamys nivea.
[0012]
The steroid compound in the present invention can be obtained by aerobically culturing a bacterium producing the compound in a suitable medium, and separating and purifying the target product from the culture. The culture medium contains nutrients that can be used by normal microorganisms. As a nutrient source, a well-known thing conventionally utilized for culture | cultivation can be used. Specifically, as the carbon source, glucose, starch syrup, dextrin, starch, molasses, brown rice, fats and the like can be used. As the nitrogen source, organic substances such as soybean flour, wheat germ, cottonseed meal, corn steep liquor, meat extract, peptone, yeast extract, and inorganic substances such as ammonium sulfate and sodium nitrate can be used. In addition, if necessary, inorganic salts capable of generating sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid, sulfuric acid and other ions can be added. In addition, organic and inorganic substances that assist the growth of bacteria and promote the production of steroid compounds in the present invention can be added appropriately. As the culture method, an aerobic liquid culture method is most suitable. The temperature suitable for the culture is 20 to 30 ° C., but in many cases the culture is performed at around 27 ° C. In this way, the target substance is isolated and purified from the culture in which the steroid compound is accumulated.
[0013]
When collecting from the culture, usual separation means utilizing the properties, for example, solvent extraction method, ion exchange resin method, adsorption or distribution column chromatography method, gel filtration method, dialysis method, precipitation method, etc. are used alone or appropriately. It can be extracted and purified in combination. For example, the steroid compound (3) accumulated in the culture solution is extracted into an organic solvent layer when extracted with acetone, ethyl acetate, chloroform or the like. In order to further purify the steroid compound (3), adsorption chromatography such as silica gel or alumina or synthetic adsorbent such as Diaion HP-20 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), or chromatography such as gel filtration such as Sephadex LH- 20 (manufactured by Pharmacia), or an appropriate combination of ODS column chromatography and HPLC.
Furthermore, the steroid compound in the present invention can be obtained by chemically modifying the collected steroid compound, for example, the steroid compound of the above formula (3), such as substitution reaction or addition reaction.
[0014]
The steroid compound in the present invention can be administered as an anticancer agent by any administration route and in a dosage form determined by the adopted administration route, such as tablets, capsules, suppositories, solutions, syrups, and emulsions. The drug is diluted with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, such as calcium carbonate, calcium phosphate, lactose, starch, alginic acid, starch, gelatin, magnesium stearate, talc, carboxymethylcellulose, cellulose acetate phthalate, polyvinyl acetate, etc. The form is normal. When actually administering the steroid compound in the present invention as an anticancer agent, a method of injecting them by dissolving them in distilled water for injection or physiological saline can be mentioned as one of representative examples. Specifically, methods such as intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intravascular injection into veins or arteries in the case of animals and local administration by injection, and intravascular injection or injection into veins or arteries in the case of humans. There are methods such as local administration. In consideration of various situations, the dose of the steroid compound in the present invention is determined so that the total dose does not exceed a certain amount when continuously or intermittently administered. It goes without saying that the specific dose varies depending on the administration method, the condition of the patient or the treated animal, such as age, weight, sex, sensitivity, diet, administration time, concomitant drug, patient or the severity of the disease. In addition, the appropriate dose and the number of doses under certain conditions must be determined by a specialist's dose determination test based on the above guidelines. Specifically, it is about 0.1 to 1 g per day for an adult.
[0015]
【Example】
(culture)
A 15 ml preculture medium shown below was dispensed into a 50 ml large test tube, sterilized, inoculated with this strain, and cultured at 27 ° C. for 72 hours as a seed mother.
Glucose 4 g
Yeast extract 4 g
Malt extract 10 g
Thiamine hydrochloride 5 mg
Riboflavin 5 mg
Niacin 5 mg
Pyridoxine 5 mg
Inositol 5 mg
Calcium pantothenate 5 mg
p-Aminobenzoic acid 5 mg
Biotin 2.5 mg
1L of water
pH 7.3
The production medium shown below was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask, 2 ml of the above seed mother was added to the sterilized product, and stationary culture was performed at 27 ° C. for 2 weeks.
Brown rice 9 g
Yeast extract 18 mg
Sodium tartrate 9 mg
Potassium dihydrogen phosphate 9 mg
27 ml of water
[0016]
(Isolation)
The cells obtained above (for 6 flasks) were extracted with 80% acetone water (450 ml), and acetone was removed with a centrifugal evaporator. The mixture was further extracted twice with 450 ml of ethyl acetate and concentrated. The resulting concentrate was adsorbed on silica gel column chromatography (Wako C-200) and eluted with a mixed solvent of chloroform-methanol (85: 1). The obtained fraction was subjected to gel filtration chromatography (Sephadex LH-20) and eluted with 100% methanol. Further, the obtained fraction was subjected to high pressure liquid chromatography (Senshu-Pak ODS) and eluted with 80% methanol to obtain a novel substance JJ13 (1.2 mg). The obtained compound had the following physicochemical properties, and as a result of analysis of various spectral data, it was found that it had a chemical structure represented by the above formula ( 3 ).
[0017]
(Physical and chemical properties of JJ13)
Appearance: White powder Melting point: 265-268 ° C
Specific rotation: [α] _D ²⁵ +53 (c 0.69, CHCl ₃ )
Molecular formula: C ₃₂ H ₅₀ O ₇
High resolution FAB-MS measured value: 569.3456 (M + Na) ⁺ calculated value: 569.3454
Solubility: Soluble in methanol, chloroform, ethyl acetate, hexane, sparingly soluble in water UV absorption spectrum λnm (ε) (in methanol, as shown in Fig. 1): 204 (3,010), 277 (120)
Infrared absorption spectrum cm ⁻¹ (KBr disk method, shown in FIG. 2): 3480, 1730
¹³ C and ¹ H NMR data (shown in FIGS. 3a and b):

[0018]
(Evaluation of anticancer effect)
The anticancer activity test was evaluated using human breast cancer cell lines, HBC-4 cells and MCF-7 cells, and rat normal fibroblast cell line 3Y1 cells.
(1) HBC-4 cells
Prepare HBC-4 cells at 2 × 10 ³ cells / ml in RPMI1640 medium containing 50 ng / ml IGF-1, 100 unit ml penicillin, 0.1 μg / ml streptomycin. A plate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) was seeded at 100 μl / well and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO ₂ . Two hours later, JJ13 adjusted to each concentration was added. As a control sample, an additive-free sample without JJ13 was also produced. Culturing was performed for 72 hours under the same conditions, and cytotoxic activity was evaluated by MTT assay.
(2) MCF-7 cells
MCF-7 cells in Dulbecco's modified Eagle's medium (Nissui) containing 30 ng / ml IGF-1, 100 units ml penicillin, 0.05 μg / ml streptomycin to give 5 × 10 ³ cells / ml Was prepared, seeded at 100 μl / well in a 96-well microplate (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and cultured at 37 ° C. and 5% CO ₂ . Two hours later, JJ13 adjusted to each concentration was added. As a control sample, an additive-free sample without JJ13 was also produced. The cells were cultured for 72 hours, and the cytostatic activity was evaluated by MTT assay.
(3) 3Y1 cells
Prepare 3Y1 cells in Dulbecco's modified Eagle's medium (Nissui) containing 50 ng / ml IGF-1, 100 unit ml penicillin and 0.05 μg / ml streptomycin to 2 x 10 ³ cells / ml Then, the cells were seeded at 100 μl / well in 96-well microplates (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), and cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO ₂ . Two hours later, JJ13 adjusted to each concentration was added. As a control sample, an additive-free sample without JJ13 was also produced. The cells were cultured for 72 hours, and the cytostatic activity was evaluated by MTT assay.
The evaluation results are shown in FIG. JJ13 showed cytotoxic activity against HBC-4 cells and cell growth inhibitory activity against MCF-7 cells. On the other hand, it did not show any activity against 3Y1 cells.
[0019]
【The invention's effect】
The anticancer agent and the novel substance JJ13 containing the steroid compound of the present invention as an active ingredient selectively act only on cancer cells and exhibit cytotoxic activity or cell growth inhibitory activity. Particularly effective for breast cancer cells.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an ultraviolet absorption spectrum of JJ13.
FIG. 2 is an infrared absorption spectrum of JJ13.
FIG. 3a is a ¹³ C NMR spectrum of JJ13.
FIG. 3b is a ¹ H NMR spectrum of JJ13.
FIG. 4 is a graph showing the evaluation results of anticancer activity.

Claims (4)

New substance JJ13 represented by formula (3).

Anticancer agent comprising as an active ingredient a novel substance JJ13 represented by the formula (3). Byssochlamys (Byssochlamys) genus culturing Nivea (nivea) species bacteria, harvesting from the resulting culture, characterized in method of producing a substance JJ13 of claim 1, wherein. Byssochlamys Nivea (Byssochlamys nivea) FERM BP-7722 strain.

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