JP4093740B2 - 微粒子分別マイクロチップと微粒子分別装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、微粒子分別チップに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、微粒子や細胞を分別するためのマイクロチップとそれを内蔵した微粒子分別装置、さらには、微粒子や細胞を分別する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
半導体産業における微細加工技術の発展により、シリコンやガラス基板上に作製されたマイクロチップが分析機器等において広く用いられるようになった。具体的には、液体クロマトグラフィーの電気化学検出器や医療現場における小型の電気化学センサーなどに、シリコンやガラス基板上に電極や流路などを構成した各種のマイクロチップが利用されている。
【０００３】
近年、化学実験の高速化、高効率化、および集積化、あるいは、分析機器の超小型化を目指したmicro-total-analysis system（μ−ＴＡＳ）やマイクロリアクターの作製・開発などが注目を浴びており、世界的に活発な研究が進められている。
【０００４】
これらのμ−ＴＡＳは、少量の試料で測定、分析が可能なこと、持ち運びが可能となること、低コストが実現されること、使い捨てが可能なこと、など、従来のデバイスに比べて優れている面が多々あり、とくに高価な試薬を使用する実験系や少量多検体の生化学物質のスクリーニング操作において有用性が高い方法として注目されている。
【０００５】
また、μ−ＴＡＳは、微小空間における特異的な分子挙動を解明したり、超高感度検出、超微量分析を応用した単一分子や単一微粒子、あるいは単一細胞の分離、分析を可能にするものとして期待されている。
【０００６】
一方、ヒトゲノム計画等により、膨大な遺伝子情報が明らかにされる中、ゲノム創薬などの製薬分野における大量多品種スクリーニング技術の重要性が高まっている。例えば、ヒト細胞に対する特定物質の影響を評価する場合には、各臓器培養細胞ライブラリを作成し、これらの培養細胞を分離・精製して品質を管理したり、物質投与後の各細胞を分別して状態を観察したりする。
【０００７】
従来、このような細胞の分別には、セルソーターやパーティクルアナライザー等の細胞または微粒子分別装置が用いられている。しかし、従来のセルソーターは、大型で高価なため、実験室や医療現場で手軽に使用できるようなものではなかったのが実情である。また、散乱光や蛍光等の間接的情報に基づいて細胞を分別するため、操作に熟練を要し、汎用性が低いという問題もあった。さらに、セルソーターでは分別細胞を液滴化する必要があるため、分別できる細胞の大きさや種類が限定されるという問題もあった。一方、粉体や細胞等の各種微粒子を大きさや形状に応じて分別する装置としてパーティクルアナライザーが知られているが、これも、装置が高価である、間接的な測定情報に基づいて分別を行うため汎用性が低い、等の問題点があった。
【０００８】
そこで、近年、層流中の微粒子を顕微鏡で直接観察しながら分別する安価なセルソーターが提案されている（Micro Total Analysis'98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998); Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)）が、実際には分離部の要素技術が開発されているにすぎず、未だ実用化には至っていないのが実情である。
【０００９】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、簡便に精度高く細胞等の微粒子を分別する方法と、安価で汎用性の高い微粒子分別装置を提供することを課題としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、基板上に微細な流路を有してなるフロー型微粒子分別マイクロチップであって、基板上に、少なくとも、微粒子含有溶液導入流路と、当該導入路の両側部に配置されたシース流形成溶液流路と、微粒子含有溶液とシース流形成溶液が流入する１本の流路と、当該１本の流路に設けられ、導入された微粒子を計測するための微粒子計測部位と、当該微粒子計測部位の下流に設置され、微粒子を分別回収するための第１の微粒子分別流路とその両側に設置される第２の微粒子分別流路と、第１の微粒子分別流路を挟むように第１の微粒子分別流路と第２の微粒子分別流路の間に設置され、微粒子計測部位から微粒子分別流路への流入口付近に設置された微粒子の移動方向を制御するための一対の電極と、を有しており、電極は鋭角な形状を有していて、その鋭角部が流入口付近に設置されることを特徴とする微粒子分別マイクロチップを提供する。
【００１３】
この出願の発明は、第２には、微粒子含有溶液導入流路、シース流形成溶液流路、微粒子計測部位、および微粒子分別流路の内壁は、微粒子付着防止層により被覆されている前記いずれかの微粒子分別マイクロチップを提供する。
【００１４】
さらに、第３には、この出願の発明は、微粒子含有溶液中の微粒子が、細胞、菌体、微生物、および高分子微粒子からなる群より選択されるものである前記いずれかの微粒子分別マイクロチップを提供する。
【００１５】
この出願の発明は、第４には、微粒子を分別するための微粒子分別装置であって、少なくとも、前記のいずれかの微粒子分別マイクロチップと、微粒子分別マイクロチップ上の微粒子計測部位において微粒子を光学的または電磁気学的に計測する計測手段と、微粒子分別マイクロチップ上の電極に電圧を印加するための電圧印加手段と、微粒子の光学的または電気的情報を出力するための出力手段を有することを特徴とする微粒子分別装置を提供する。
【００１６】
この出願の発明は、また、第５には、計測手段が光学顕微鏡である前記の微粒子分別装置を、および第６には、計測手段が蛍光顕微鏡である前記いずれかの微粒子分別装置を提供する。
【００１７】
さらに、第７には、この出願の発明は、前記いずれかの微粒子分別装置を用いて、微粒子を分別する微粒子分別方法を提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、まず、基板上に微細な流路を有してなるフロー型微粒子分別マイクロチップに関するものである。図１にこの微粒子分別マイクロチップの概要を示した。この出願の発明の微粒子分別マイクロチップは、基板（１）上に、少なくとも、（ａ）微粒子含有溶液導入流路（２）と、（ｂ）当該流路の側部に配置されたシース流形成溶液流路（３）と、（ｃ）導入された微粒子を計測するための微粒子計測部位（４）と、（ｄ）該微粒子計測部位（４）の下流に設置された微粒子を分別回収するための微粒子分別流路（５）と、（ｅ）微粒子計測部位（４）から微粒子分別流路（５）への流入口（５１）付近に設置された微粒子の移動方向を制御するための一対の電極（６）を有することを特徴とする。このとき、基板（１）は、各種の微細加工技術により微細流路や電極を加工、設置できるものであればよく、シリコン、ガラス、石英、プラスチック等各種のものから選択できる。例えば微粒子を光学的手段により計測する場合には、使用する光源の波長領域に吸収を持たない材質を選択する。このような基板（１）の大きさはとくに限定されず、少なくとも上記（ａ）〜（ｅ）の構成部を、分別する細胞等の微粒子の大きさや種類に応じて微細加工できる程度の大きさであればよい。
【００２１】
この出願の発明の微粒子分別マイクロチップにおいて、微粒子含有溶液導入流路（２）は、培養細胞や血液細胞、高分子粉体等の試料微粒子（７）を含有する溶液を導入するための流路であり、その上流には、微粒子含有溶液を貯蔵するタンクやポンプ等の送液手段に接続するためのコネクタ部位を有していてもよい。このようなマイクロチップにおいて、微粒子含有溶液導入流路（２）の内径はとくに限定されない。試料微粒子（７）を安定に導入できる径を有していればよく、例えば、幅約1〜１００μｍ程度とすることができる。形状もとくに限定されないが、矩型であれば、公知の半導体微細加工技術等により容易に形成でき、後述の顕微鏡観察等を行う際にも像の歪みが生じないため好ましい。
【００２２】
また、シース流形成溶液流路（３）は、試料微粒子（７）が微粒子計測部位（４）に導入される際に、試料微粒子（７）の両側を包むような流れ（シース流）を形成するための液（シース液）を導入するための流路であり、前記微粒子含有溶液導入流路（２）の両方の側部に配置されていればよい。シース流形成溶液流路（３）の内径もとくに限定されないが、例えば、幅約１〜１００μｍとすることができる。シース流が形成されるように、微粒子含有溶液導入流路（２）とシース流形成溶液流路（３）の径を設計するか、微粒子含有溶液の流量とシース溶液の流量を調整する。
【００２３】
また、この出願の発明の微粒子分別マイクロチップにおいて、微粒子計測部位（４）は、微粒子を光学的または電磁気学的に計測するための部位である。具体的には、例えば試料微粒子（７）に顕微光学計測系より特定波長領域の光を照射し、試料微粒子（７）の実体像や蛍光像を観察するための部位である。あるいは、試料微粒子（７）の移動速度や泳動速度をＣＣＤカメラ等により観察するための部位としてもよい。さらには、微粒子計測部位（４）に２組以上の微小電極を組み込み、電極間に１００ｍＶ程度の低い交流電圧を印加し、電極間に流れるインピーダンスを計測してもよい。このような微粒子計測部位（４）では、前記の微粒子含有溶液導入流路（２）とシース流形成溶液流路（３）から各溶液が流入し、試料微粒子が導入される。したがって、微粒子計測部位（４）は、前記の微粒子含有溶液導入流路（２）とシース流形成溶液流路（３）が合流した１本の流路であることが望ましく、その場合、これらよりも大きな径、例えば、幅約５〜１５０μｍとすることが好ましい。なお、各流路の高さもとくに限定されない。ただし、チップの底面あるいは上部面から流路までの距離（厚さ）については、微粒子や細胞内の微細構造を顕微鏡で観察する場合、レンズの焦点距離との関係から５０〜５００μｍ程度にまで薄くする必要がある。
【００２４】
さらに、この出願の発明の微粒子分別マイクロチップは、前記微粒子計測部位（４）の下流に設置された微粒子を分別回収するための微粒子分別流路（５）を有するものであり、図１に示すように、中央に第１の微粒子分別流路（５ｂ）とその両側に設置される第２の微粒子分別流路（５ａ，５ｃ）とを有する。また、微粒子分別流路（５）には、１以上の廃液用の流路が含まれていてもよい。
【００２５】
以上のとおりの微粒子含有溶液導入流路（２）、シース流形成溶液流路（３）、微粒子計測部位（４）、および微粒子分別流路（５）は、基板（１）をフォトリソグラフィー等の半導体微細加工技術によって加工した状態のまま使用してもよいが、試料微粒子によっては、これらの流路の内壁に付着しやすく、流路の壁面と中央部での微粒子の移動速度に大きな差が生じるものもあるため、微粒子付着防止層を形成することが好ましい。具体的には、ゲラチンやポリエチレングリコールなどの高分子を被覆し、微粒子付着防止層とすることができる。
【００２６】
この出願の発明の微粒子分別マイクロチップは、また、微粒子計測部位（４）から微粒子分別流路（５）への流入口（５１）付近に設置された微粒子の移動方向を制御するための一対の電極（６）を有するものである。このような電極（６）は、電圧を印加することにより流入口（５１）付近に電界を生じさせ、その電界と微粒子との相互作用により流入口（５１）への微粒子の流入を制御するためのものである。電極（６）の大きさは特に限定されず、形状は、流入口（５１）付近に電界を集中させたり、不均一電界の勾配を最大にしたりできるように、図１に示されるような鋭角な形状を有するものとする。また、電極（６）材料は、金、銀、白金、Ａｌ等各種の一般的な電極材料から適宜選択される。電極（６）の数は、電界を生じるためには少なくとも１対（２個）必要であるが、微粒子分別流路（５）の数に応じて増加できる。これらの電極（６）への電圧の印加は個別に制御できるようにすれば、各流入口（５１）への流入の可・不可を各々制御できる。
【００２７】
以上のとおりの微粒子分別マイクロチップは、どのような方法で製造されるものであってもよいが、半導体リソグラフィー、エッチングをはじめとする公知の各種微細加工技術によって容易に製造できるものである。
【００２８】
この出願の発明は、さらに、微粒子を分別するための微粒子分別装置をも提供する。このような微粒子分別装置は、少なくとも、
（ｉ）前記の微粒子分別マイクロチップと、
（ii）微粒子分別マイクロチップ上の微粒子計測部位において微粒子を光学的あるいは電磁気学的に計測する計測手段と、
（iii）微粒子分別マイクロチップ上の電極に電圧を印加するための電圧印加手段と、
（iv）微粒子の光学的または電気的情報を出力するための出力手段
を有することを特徴とするものである。
【００２９】
この出願の発明の微粒子分別装置において、微粒子分別マイクロチップ上の微粒子計測部位において微粒子を光学的あるいは電磁気学的に計測する計測手段としては、前述の顕微光学計測系やＣＣＤカメラが例示される。例えば、顕微光学計測系を用いる場合には、試料微粒子（７）に特定波長領域の光を照射し、照射光と同一波長で試料微粒子（７）の実体像を観察できる。また、より長波長領域で試料微粒子（７）の蛍光像を観察してもよく、実体像と蛍光像を比較するための機能や画像処理機能を有するものとしてもよい。一方、計測手段としてＣＣＤカメラを用いれば、試料微粒子（７）の移動速度や泳動速度を観察できる。これにより、電圧印加による試料微粒子（７）の泳動速度への影響を測定したり、分離タイミングを決定したりできる。もちろん、計測手段は、これら以外のもの、例えば半導体レーザーを照射し、通過光をフォトダイオードで計測する手段等であってもよい。
【００３０】
この出願の発明の微粒子分別装置において、微粒子分別マイクロチップ上の電極に電圧を印加するための電圧印加手段は、直流・交流の電圧を印加できるものであればよい。流入口（５１）付近に電圧を印加することにより、電界が生じると、微粒子表面に誘電分極により電荷が現れ、微粒子が駆動される。生じる電界の大きさは、電極形状によって異なるため、前記のとおり、不均一電界の勾配が最大となるような形状を選択すればよい。また、電圧は直流でも交流でも同様の現象が見られるが、直流電圧では、誘電泳動と電気泳動の重畳が観察されるのに対し、交流電圧では、電界極性の反転により電気泳動力が平均して０となるため、微粒子の電荷によらない誘電泳動のみが観察される。したがって、交流電圧を印加することが好ましい。さらに、このような電圧は、前記の計測手段によって選られた微粒子に関する情報をもとにオン／オフのタイミングを制御できる機構を設け、電圧の印加を制御してもよい。
【００３１】
また、微粒子の光学的または電気的情報を出力するための出力手段としては、前記のとおりに顕微鏡観察による実体像や蛍光像を画像化、解析するためのソフトやモニター、あるいは電圧印加による試料微粒子（７）の泳動の様子を観察するためのモニター等が例示される。さらには、周波数応答測定装置（インピーダンスアナライザー）や、イオン感応型電界効果型トランジスター（ISFET）、電圧計、電流計等が例示される。
【００３２】
以上のとおりの微粒子分別装置は、少なくとも上記の（ｉ）〜（iv）を有していればよいが、その他にも、微粒子含有溶液を貯蔵するための貯蔵槽やシース溶液を貯蔵するための貯蔵槽、さらにはこれらの溶液を微粒子分別マイクロチップに導入するための送液手段等を有していてもよい。また、分別された微粒子を回収するための回収槽や廃液槽等を有していてもよい。さらに、このような微粒子分別装置は、前記の微粒子分別マイクロチップを複数有し、同条件あるいは複数条件で多段階に分別操作を繰り返すことのできるものであってもよい。
【００３３】
また、この出願の発明の微粒子分別装置においては、公知の微細加工技術により、計測手段、電圧印加手段、出力手段、さらには各貯蔵槽等の各構成部位を微細化することにより、超小型化が可能となり、従来のセルソーターやパーティクルアナライザーでは困難であった医療診断等の現場での微粒子分別を手軽に行うことができるようになる。例えば、この出願の発明者らによって報告されている免疫分析装置（特願２０００−１３１８３３）等の分析系を、この出願の発明の微粒子分別マイクロチップ上に構築し、連結させれば、精度高い細胞の分析・分別システムとしての有用性も高くなる。
【００３４】
この出願の発明では、以上のとおりの微粒子分別装置を用いて、微粒子を分別する微粒子分別方法をも提供する。具体的には、例えば、試料微粒子（７）を含有する溶液を導入流路（２）より導入し、シース流を形成して該微粒子を計測部位（４）へ導入し、微粒子を光学的または電磁気学的に計測した後、電極（６）に交流電圧を印加し、生じる反発性誘電泳動力により、該微粒子を微粒子分別流路（５）に誘導して分別する微粒子分別方法が挙げられる。
【００３５】
以上のとおりのこの出願の発明の微粒子分別方法において、分別される微粒子は、どのようなものであってもよい。形状、大きさ、性質等によって分別できるもの、とくに誘電泳動により分別できるものであればよく、具体的には、高分子等の粉体、血液細胞や培養細胞等の細胞、あるいは菌体や微生物が例示される。
【００３６】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００３７】
【実施例】
＜実施例１＞ 微粒子分別マイクロチップの作成
２０ｍｍ角、厚さ０．５ｍｍの合成石英ウェファ（１１）をHPM（HCl:H2O2:DW=1:1:4、60℃）洗浄１０分、DWリンス、DHF（濃度１０％）洗浄１０分、DWリンス、Ｎ2ブローの工程で洗浄し、マグネトロンスパッタ装置によってＣｒマスクを1.5μｍ堆積させた。
【００３８】
次にフォトリソグラフィー（フォトレジストOMR-85：東京応化工業、コンタクト露光機：MJB3：カールズース）、Crのウェットエッチング（Ce(NH4)2(NO3)6:HClO4:DW=65.8g:17.2ml:400ml、室温）によってキャピラリーパターンをマスク上に転写し、O2プラズマ（ICP=500W、圧力40mTorr、流量100sccm、処理時間2分）でフォトレジストをアッシング処理した。その後、APM（NH4OH:H2O2:H2O=1:1:4、60℃）洗浄１０分、DHF（濃度５％）洗浄５分、DWリンス、N2ブローによって洗浄した。
【００３９】
次に、ドライエッチング（ICP=500W、Substrate bias=15W、圧力10mTorr、沿う流量200sccm）により石英ウェファにキャピラリー溝を形成し、CrマスクをSPM（H2SO4:H2O2=3:1、煮沸）洗浄で除去し、HPM（HCl:H2O2:DW=1:1:4、60℃）洗浄１０分、DWリンス、DHF（濃度５％）洗浄５分、DWリンス、N2ブローで処理した。
【００４０】
キャピラリーの両側に電極を設けるために、マグネトロンスパッタによってCrマスクを0.1μｍ堆積させ、フォトリソグラフィーによるマスク合わせをして電極パターンをレジストに転写した。
【００４１】
Crのウェットエッチング後、SF6による石英ガラスのドライエッチングを行い、電極埋め込み用のトレンチを作製し、Crマスクを除去後、フォトリソグラフィーによるマスク合わせによって電極埋め込み部分のレジストを除去した。
【００４２】
最後にマグネトロンスパッタによってCr、Ptの順に堆積し、リフトオフを行った後、試料注入口と電極のターミナルを設けたもう１枚の石英ガラスと1%フッ酸中で貼り合わせ、取り出し、大気中で1.3MPaの圧力をかけて圧着接合した。
＜実施例２＞ 微粒子分別マイクロチップの動作評価
実施例１の手順に従い、図１のように、基板（１）上に細胞導入用流路（２）とシース流形成溶液流路（３）、その下流に位置する一対の電極（６）に挟まれた細胞収集用流路（５ｂ）とその両側の廃棄用流路（５ａ、５ｃ）を有する微粒子分別マイクロチップを作製した。
【００４３】
このマイクロチップでは、シース流を形成することにより、細胞を効率よく流入口（５１）に送り込み、電極に交番電界を印加して生じる反発性誘電泳動力により、細胞の取り込みを取捨する。
【００４４】
ｐＨ７．４のリン酸希釈生理食塩水（PBS）で1×108/mlに希釈、精製した羊赤血球浮遊溶液を試料とし、微粒子分別マイクロチップの各流路の内壁を、ゲラチンベロナール緩衝液（GVB）によってゲラチンで被覆してこのマイクロチップの動作を確認した。
【００４５】
電極に電圧を印加しない場合には、細胞は収集用流路（５ｂ）へと流れ込む。しかし、細胞が流入口（５１）付近に達する瞬間に同期して、Vp-p=20V、1200kHzの交番電圧を印加したところ、細胞が反発し、収集用流路（５ｂ）の両側にある廃棄用流路（５ａ、５ｃ）へと選択的に送り込まれた。
【００４６】
また、流体シミュレーションにより、細胞導入流路を流れる液体が両脇のシース流によって抑えられ、そのほとんどが収集用流路口へと流れていることが確認された。さらに、廃棄用流路（５ａ、５ｃ）は、電極（６）の周囲に生じる電界の勾配が大きくなる領域よりも広くすることにより動作が安定することが確認された。
【００４７】
これより、本願発明の微粒子分別マイクロチップを細胞の分別に適用することにより、誘電泳動力を受けた細胞が廃棄され、影響を受けない細胞が収集用流路（５ｂ）に取り込まれ、細胞に損傷や刺激を与えずに収集することが可能となる。
【００４８】
以上より、反発性の誘電泳動力を利用した微粒子分別マイクロチップが生体細胞の分別に利用できることが示された。また、このチップを中核技術とすることにより、従来のセルソーターでは不可能であった高度な細胞判定処理系をもつ細胞分収システムが実現されることから、本願発明の微粒子分別マイクロチップは、生物学や医学の研究の場において有用性が高いといえる。
【００４９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、簡便で精度高い微粒子を分別を可能とする微粒子分別マイクロチップと、それを有する安価で汎用性の高い微粒子分別装置が提供される。この発明の微粒子分別装置は、超小型化が可能であり、これを用いることにより、細胞、菌体、微生物、高分子微粒子などの各種微粒子を精度高く簡便に分別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 この発明の微粒子分別マイクロチップを例示した概略模式図である。
【符号の説明】
１ 基板
２ 微粒子含有溶液導入流路、細胞導入流路
３ シース流形成溶液流路
４ 微粒子計測部位
５ 微粒子分別流路
５ａ 微粒子分別流路、廃棄用流路
５ｂ 微粒子分別流路、収集用流路
５ｃ 微粒子分別流路、廃棄用流路
５１ 流入口
６ 電極
７ 試料微粒子
８ 廃液槽
【発明の属する技術分野】
この出願の発明は、微粒子分別チップに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、微粒子や細胞を分別するためのマイクロチップとそれを内蔵した微粒子分別装置、さらには、微粒子や細胞を分別する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術とその課題】
半導体産業における微細加工技術の発展により、シリコンやガラス基板上に作製されたマイクロチップが分析機器等において広く用いられるようになった。具体的には、液体クロマトグラフィーの電気化学検出器や医療現場における小型の電気化学センサーなどに、シリコンやガラス基板上に電極や流路などを構成した各種のマイクロチップが利用されている。
【０００３】
近年、化学実験の高速化、高効率化、および集積化、あるいは、分析機器の超小型化を目指したmicro-total-analysis system（μ−ＴＡＳ）やマイクロリアクターの作製・開発などが注目を浴びており、世界的に活発な研究が進められている。
【０００４】
これらのμ−ＴＡＳは、少量の試料で測定、分析が可能なこと、持ち運びが可能となること、低コストが実現されること、使い捨てが可能なこと、など、従来のデバイスに比べて優れている面が多々あり、とくに高価な試薬を使用する実験系や少量多検体の生化学物質のスクリーニング操作において有用性が高い方法として注目されている。
【０００５】
また、μ−ＴＡＳは、微小空間における特異的な分子挙動を解明したり、超高感度検出、超微量分析を応用した単一分子や単一微粒子、あるいは単一細胞の分離、分析を可能にするものとして期待されている。
【０００６】
一方、ヒトゲノム計画等により、膨大な遺伝子情報が明らかにされる中、ゲノム創薬などの製薬分野における大量多品種スクリーニング技術の重要性が高まっている。例えば、ヒト細胞に対する特定物質の影響を評価する場合には、各臓器培養細胞ライブラリを作成し、これらの培養細胞を分離・精製して品質を管理したり、物質投与後の各細胞を分別して状態を観察したりする。
【０００７】
従来、このような細胞の分別には、セルソーターやパーティクルアナライザー等の細胞または微粒子分別装置が用いられている。しかし、従来のセルソーターは、大型で高価なため、実験室や医療現場で手軽に使用できるようなものではなかったのが実情である。また、散乱光や蛍光等の間接的情報に基づいて細胞を分別するため、操作に熟練を要し、汎用性が低いという問題もあった。さらに、セルソーターでは分別細胞を液滴化する必要があるため、分別できる細胞の大きさや種類が限定されるという問題もあった。一方、粉体や細胞等の各種微粒子を大きさや形状に応じて分別する装置としてパーティクルアナライザーが知られているが、これも、装置が高価である、間接的な測定情報に基づいて分別を行うため汎用性が低い、等の問題点があった。
【０００８】
そこで、近年、層流中の微粒子を顕微鏡で直接観察しながら分別する安価なセルソーターが提案されている（Micro Total Analysis'98, pp.77-80 (Kluwer Academic Publishers, 1998); Analytical Chemistry, 70, pp.1909-1915 (1998)）が、実際には分離部の要素技術が開発されているにすぎず、未だ実用化には至っていないのが実情である。
【０００９】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、簡便に精度高く細胞等の微粒子を分別する方法と、安価で汎用性の高い微粒子分別装置を提供することを課題としている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、まず第１には、基板上に微細な流路を有してなるフロー型微粒子分別マイクロチップであって、基板上に、少なくとも、微粒子含有溶液導入流路と、当該導入路の両側部に配置されたシース流形成溶液流路と、微粒子含有溶液とシース流形成溶液が流入する１本の流路と、当該１本の流路に設けられ、導入された微粒子を計測するための微粒子計測部位と、当該微粒子計測部位の下流に設置され、微粒子を分別回収するための第１の微粒子分別流路とその両側に設置される第２の微粒子分別流路と、第１の微粒子分別流路を挟むように第１の微粒子分別流路と第２の微粒子分別流路の間に設置され、微粒子計測部位から微粒子分別流路への流入口付近に設置された微粒子の移動方向を制御するための一対の電極と、を有しており、電極は鋭角な形状を有していて、その鋭角部が流入口付近に設置されることを特徴とする微粒子分別マイクロチップを提供する。
【００１３】
この出願の発明は、第２には、微粒子含有溶液導入流路、シース流形成溶液流路、微粒子計測部位、および微粒子分別流路の内壁は、微粒子付着防止層により被覆されている前記いずれかの微粒子分別マイクロチップを提供する。
【００１４】
さらに、第３には、この出願の発明は、微粒子含有溶液中の微粒子が、細胞、菌体、微生物、および高分子微粒子からなる群より選択されるものである前記いずれかの微粒子分別マイクロチップを提供する。
【００１５】
この出願の発明は、第４には、微粒子を分別するための微粒子分別装置であって、少なくとも、前記のいずれかの微粒子分別マイクロチップと、微粒子分別マイクロチップ上の微粒子計測部位において微粒子を光学的または電磁気学的に計測する計測手段と、微粒子分別マイクロチップ上の電極に電圧を印加するための電圧印加手段と、微粒子の光学的または電気的情報を出力するための出力手段を有することを特徴とする微粒子分別装置を提供する。
【００１６】
この出願の発明は、また、第５には、計測手段が光学顕微鏡である前記の微粒子分別装置を、および第６には、計測手段が蛍光顕微鏡である前記いずれかの微粒子分別装置を提供する。
【００１７】
さらに、第７には、この出願の発明は、前記いずれかの微粒子分別装置を用いて、微粒子を分別する微粒子分別方法を提供する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
この出願の発明は、まず、基板上に微細な流路を有してなるフロー型微粒子分別マイクロチップに関するものである。図１にこの微粒子分別マイクロチップの概要を示した。この出願の発明の微粒子分別マイクロチップは、基板（１）上に、少なくとも、（ａ）微粒子含有溶液導入流路（２）と、（ｂ）当該流路の側部に配置されたシース流形成溶液流路（３）と、（ｃ）導入された微粒子を計測するための微粒子計測部位（４）と、（ｄ）該微粒子計測部位（４）の下流に設置された微粒子を分別回収するための微粒子分別流路（５）と、（ｅ）微粒子計測部位（４）から微粒子分別流路（５）への流入口（５１）付近に設置された微粒子の移動方向を制御するための一対の電極（６）を有することを特徴とする。このとき、基板（１）は、各種の微細加工技術により微細流路や電極を加工、設置できるものであればよく、シリコン、ガラス、石英、プラスチック等各種のものから選択できる。例えば微粒子を光学的手段により計測する場合には、使用する光源の波長領域に吸収を持たない材質を選択する。このような基板（１）の大きさはとくに限定されず、少なくとも上記（ａ）〜（ｅ）の構成部を、分別する細胞等の微粒子の大きさや種類に応じて微細加工できる程度の大きさであればよい。
【００２１】
この出願の発明の微粒子分別マイクロチップにおいて、微粒子含有溶液導入流路（２）は、培養細胞や血液細胞、高分子粉体等の試料微粒子（７）を含有する溶液を導入するための流路であり、その上流には、微粒子含有溶液を貯蔵するタンクやポンプ等の送液手段に接続するためのコネクタ部位を有していてもよい。このようなマイクロチップにおいて、微粒子含有溶液導入流路（２）の内径はとくに限定されない。試料微粒子（７）を安定に導入できる径を有していればよく、例えば、幅約1〜１００μｍ程度とすることができる。形状もとくに限定されないが、矩型であれば、公知の半導体微細加工技術等により容易に形成でき、後述の顕微鏡観察等を行う際にも像の歪みが生じないため好ましい。
【００２２】
また、シース流形成溶液流路（３）は、試料微粒子（７）が微粒子計測部位（４）に導入される際に、試料微粒子（７）の両側を包むような流れ（シース流）を形成するための液（シース液）を導入するための流路であり、前記微粒子含有溶液導入流路（２）の両方の側部に配置されていればよい。シース流形成溶液流路（３）の内径もとくに限定されないが、例えば、幅約１〜１００μｍとすることができる。シース流が形成されるように、微粒子含有溶液導入流路（２）とシース流形成溶液流路（３）の径を設計するか、微粒子含有溶液の流量とシース溶液の流量を調整する。
【００２３】
また、この出願の発明の微粒子分別マイクロチップにおいて、微粒子計測部位（４）は、微粒子を光学的または電磁気学的に計測するための部位である。具体的には、例えば試料微粒子（７）に顕微光学計測系より特定波長領域の光を照射し、試料微粒子（７）の実体像や蛍光像を観察するための部位である。あるいは、試料微粒子（７）の移動速度や泳動速度をＣＣＤカメラ等により観察するための部位としてもよい。さらには、微粒子計測部位（４）に２組以上の微小電極を組み込み、電極間に１００ｍＶ程度の低い交流電圧を印加し、電極間に流れるインピーダンスを計測してもよい。このような微粒子計測部位（４）では、前記の微粒子含有溶液導入流路（２）とシース流形成溶液流路（３）から各溶液が流入し、試料微粒子が導入される。したがって、微粒子計測部位（４）は、前記の微粒子含有溶液導入流路（２）とシース流形成溶液流路（３）が合流した１本の流路であることが望ましく、その場合、これらよりも大きな径、例えば、幅約５〜１５０μｍとすることが好ましい。なお、各流路の高さもとくに限定されない。ただし、チップの底面あるいは上部面から流路までの距離（厚さ）については、微粒子や細胞内の微細構造を顕微鏡で観察する場合、レンズの焦点距離との関係から５０〜５００μｍ程度にまで薄くする必要がある。
【００２４】
さらに、この出願の発明の微粒子分別マイクロチップは、前記微粒子計測部位（４）の下流に設置された微粒子を分別回収するための微粒子分別流路（５）を有するものであり、図１に示すように、中央に第１の微粒子分別流路（５ｂ）とその両側に設置される第２の微粒子分別流路（５ａ，５ｃ）とを有する。また、微粒子分別流路（５）には、１以上の廃液用の流路が含まれていてもよい。
【００２５】
以上のとおりの微粒子含有溶液導入流路（２）、シース流形成溶液流路（３）、微粒子計測部位（４）、および微粒子分別流路（５）は、基板（１）をフォトリソグラフィー等の半導体微細加工技術によって加工した状態のまま使用してもよいが、試料微粒子によっては、これらの流路の内壁に付着しやすく、流路の壁面と中央部での微粒子の移動速度に大きな差が生じるものもあるため、微粒子付着防止層を形成することが好ましい。具体的には、ゲラチンやポリエチレングリコールなどの高分子を被覆し、微粒子付着防止層とすることができる。
【００２６】
この出願の発明の微粒子分別マイクロチップは、また、微粒子計測部位（４）から微粒子分別流路（５）への流入口（５１）付近に設置された微粒子の移動方向を制御するための一対の電極（６）を有するものである。このような電極（６）は、電圧を印加することにより流入口（５１）付近に電界を生じさせ、その電界と微粒子との相互作用により流入口（５１）への微粒子の流入を制御するためのものである。電極（６）の大きさは特に限定されず、形状は、流入口（５１）付近に電界を集中させたり、不均一電界の勾配を最大にしたりできるように、図１に示されるような鋭角な形状を有するものとする。また、電極（６）材料は、金、銀、白金、Ａｌ等各種の一般的な電極材料から適宜選択される。電極（６）の数は、電界を生じるためには少なくとも１対（２個）必要であるが、微粒子分別流路（５）の数に応じて増加できる。これらの電極（６）への電圧の印加は個別に制御できるようにすれば、各流入口（５１）への流入の可・不可を各々制御できる。
【００２７】
以上のとおりの微粒子分別マイクロチップは、どのような方法で製造されるものであってもよいが、半導体リソグラフィー、エッチングをはじめとする公知の各種微細加工技術によって容易に製造できるものである。
【００２８】
この出願の発明は、さらに、微粒子を分別するための微粒子分別装置をも提供する。このような微粒子分別装置は、少なくとも、
（ｉ）前記の微粒子分別マイクロチップと、
（ii）微粒子分別マイクロチップ上の微粒子計測部位において微粒子を光学的あるいは電磁気学的に計測する計測手段と、
（iii）微粒子分別マイクロチップ上の電極に電圧を印加するための電圧印加手段と、
（iv）微粒子の光学的または電気的情報を出力するための出力手段
を有することを特徴とするものである。
【００２９】
この出願の発明の微粒子分別装置において、微粒子分別マイクロチップ上の微粒子計測部位において微粒子を光学的あるいは電磁気学的に計測する計測手段としては、前述の顕微光学計測系やＣＣＤカメラが例示される。例えば、顕微光学計測系を用いる場合には、試料微粒子（７）に特定波長領域の光を照射し、照射光と同一波長で試料微粒子（７）の実体像を観察できる。また、より長波長領域で試料微粒子（７）の蛍光像を観察してもよく、実体像と蛍光像を比較するための機能や画像処理機能を有するものとしてもよい。一方、計測手段としてＣＣＤカメラを用いれば、試料微粒子（７）の移動速度や泳動速度を観察できる。これにより、電圧印加による試料微粒子（７）の泳動速度への影響を測定したり、分離タイミングを決定したりできる。もちろん、計測手段は、これら以外のもの、例えば半導体レーザーを照射し、通過光をフォトダイオードで計測する手段等であってもよい。
【００３０】
この出願の発明の微粒子分別装置において、微粒子分別マイクロチップ上の電極に電圧を印加するための電圧印加手段は、直流・交流の電圧を印加できるものであればよい。流入口（５１）付近に電圧を印加することにより、電界が生じると、微粒子表面に誘電分極により電荷が現れ、微粒子が駆動される。生じる電界の大きさは、電極形状によって異なるため、前記のとおり、不均一電界の勾配が最大となるような形状を選択すればよい。また、電圧は直流でも交流でも同様の現象が見られるが、直流電圧では、誘電泳動と電気泳動の重畳が観察されるのに対し、交流電圧では、電界極性の反転により電気泳動力が平均して０となるため、微粒子の電荷によらない誘電泳動のみが観察される。したがって、交流電圧を印加することが好ましい。さらに、このような電圧は、前記の計測手段によって選られた微粒子に関する情報をもとにオン／オフのタイミングを制御できる機構を設け、電圧の印加を制御してもよい。
【００３１】
また、微粒子の光学的または電気的情報を出力するための出力手段としては、前記のとおりに顕微鏡観察による実体像や蛍光像を画像化、解析するためのソフトやモニター、あるいは電圧印加による試料微粒子（７）の泳動の様子を観察するためのモニター等が例示される。さらには、周波数応答測定装置（インピーダンスアナライザー）や、イオン感応型電界効果型トランジスター（ISFET）、電圧計、電流計等が例示される。
【００３２】
以上のとおりの微粒子分別装置は、少なくとも上記の（ｉ）〜（iv）を有していればよいが、その他にも、微粒子含有溶液を貯蔵するための貯蔵槽やシース溶液を貯蔵するための貯蔵槽、さらにはこれらの溶液を微粒子分別マイクロチップに導入するための送液手段等を有していてもよい。また、分別された微粒子を回収するための回収槽や廃液槽等を有していてもよい。さらに、このような微粒子分別装置は、前記の微粒子分別マイクロチップを複数有し、同条件あるいは複数条件で多段階に分別操作を繰り返すことのできるものであってもよい。
【００３３】
また、この出願の発明の微粒子分別装置においては、公知の微細加工技術により、計測手段、電圧印加手段、出力手段、さらには各貯蔵槽等の各構成部位を微細化することにより、超小型化が可能となり、従来のセルソーターやパーティクルアナライザーでは困難であった医療診断等の現場での微粒子分別を手軽に行うことができるようになる。例えば、この出願の発明者らによって報告されている免疫分析装置（特願２０００−１３１８３３）等の分析系を、この出願の発明の微粒子分別マイクロチップ上に構築し、連結させれば、精度高い細胞の分析・分別システムとしての有用性も高くなる。
【００３４】
この出願の発明では、以上のとおりの微粒子分別装置を用いて、微粒子を分別する微粒子分別方法をも提供する。具体的には、例えば、試料微粒子（７）を含有する溶液を導入流路（２）より導入し、シース流を形成して該微粒子を計測部位（４）へ導入し、微粒子を光学的または電磁気学的に計測した後、電極（６）に交流電圧を印加し、生じる反発性誘電泳動力により、該微粒子を微粒子分別流路（５）に誘導して分別する微粒子分別方法が挙げられる。
【００３５】
以上のとおりのこの出願の発明の微粒子分別方法において、分別される微粒子は、どのようなものであってもよい。形状、大きさ、性質等によって分別できるもの、とくに誘電泳動により分別できるものであればよく、具体的には、高分子等の粉体、血液細胞や培養細胞等の細胞、あるいは菌体や微生物が例示される。
【００３６】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００３７】
【実施例】
＜実施例１＞ 微粒子分別マイクロチップの作成
２０ｍｍ角、厚さ０．５ｍｍの合成石英ウェファ（１１）をHPM（HCl:H2O2:DW=1:1:4、60℃）洗浄１０分、DWリンス、DHF（濃度１０％）洗浄１０分、DWリンス、Ｎ2ブローの工程で洗浄し、マグネトロンスパッタ装置によってＣｒマスクを1.5μｍ堆積させた。
【００３８】
次にフォトリソグラフィー（フォトレジストOMR-85：東京応化工業、コンタクト露光機：MJB3：カールズース）、Crのウェットエッチング（Ce(NH4)2(NO3)6:HClO4:DW=65.8g:17.2ml:400ml、室温）によってキャピラリーパターンをマスク上に転写し、O2プラズマ（ICP=500W、圧力40mTorr、流量100sccm、処理時間2分）でフォトレジストをアッシング処理した。その後、APM（NH4OH:H2O2:H2O=1:1:4、60℃）洗浄１０分、DHF（濃度５％）洗浄５分、DWリンス、N2ブローによって洗浄した。
【００３９】
次に、ドライエッチング（ICP=500W、Substrate bias=15W、圧力10mTorr、沿う流量200sccm）により石英ウェファにキャピラリー溝を形成し、CrマスクをSPM（H2SO4:H2O2=3:1、煮沸）洗浄で除去し、HPM（HCl:H2O2:DW=1:1:4、60℃）洗浄１０分、DWリンス、DHF（濃度５％）洗浄５分、DWリンス、N2ブローで処理した。
【００４０】
キャピラリーの両側に電極を設けるために、マグネトロンスパッタによってCrマスクを0.1μｍ堆積させ、フォトリソグラフィーによるマスク合わせをして電極パターンをレジストに転写した。
【００４１】
Crのウェットエッチング後、SF6による石英ガラスのドライエッチングを行い、電極埋め込み用のトレンチを作製し、Crマスクを除去後、フォトリソグラフィーによるマスク合わせによって電極埋め込み部分のレジストを除去した。
【００４２】
最後にマグネトロンスパッタによってCr、Ptの順に堆積し、リフトオフを行った後、試料注入口と電極のターミナルを設けたもう１枚の石英ガラスと1%フッ酸中で貼り合わせ、取り出し、大気中で1.3MPaの圧力をかけて圧着接合した。
＜実施例２＞ 微粒子分別マイクロチップの動作評価
実施例１の手順に従い、図１のように、基板（１）上に細胞導入用流路（２）とシース流形成溶液流路（３）、その下流に位置する一対の電極（６）に挟まれた細胞収集用流路（５ｂ）とその両側の廃棄用流路（５ａ、５ｃ）を有する微粒子分別マイクロチップを作製した。
【００４３】
このマイクロチップでは、シース流を形成することにより、細胞を効率よく流入口（５１）に送り込み、電極に交番電界を印加して生じる反発性誘電泳動力により、細胞の取り込みを取捨する。
【００４４】
ｐＨ７．４のリン酸希釈生理食塩水（PBS）で1×108/mlに希釈、精製した羊赤血球浮遊溶液を試料とし、微粒子分別マイクロチップの各流路の内壁を、ゲラチンベロナール緩衝液（GVB）によってゲラチンで被覆してこのマイクロチップの動作を確認した。
【００４５】
電極に電圧を印加しない場合には、細胞は収集用流路（５ｂ）へと流れ込む。しかし、細胞が流入口（５１）付近に達する瞬間に同期して、Vp-p=20V、1200kHzの交番電圧を印加したところ、細胞が反発し、収集用流路（５ｂ）の両側にある廃棄用流路（５ａ、５ｃ）へと選択的に送り込まれた。
【００４６】
また、流体シミュレーションにより、細胞導入流路を流れる液体が両脇のシース流によって抑えられ、そのほとんどが収集用流路口へと流れていることが確認された。さらに、廃棄用流路（５ａ、５ｃ）は、電極（６）の周囲に生じる電界の勾配が大きくなる領域よりも広くすることにより動作が安定することが確認された。
【００４７】
これより、本願発明の微粒子分別マイクロチップを細胞の分別に適用することにより、誘電泳動力を受けた細胞が廃棄され、影響を受けない細胞が収集用流路（５ｂ）に取り込まれ、細胞に損傷や刺激を与えずに収集することが可能となる。
【００４８】
以上より、反発性の誘電泳動力を利用した微粒子分別マイクロチップが生体細胞の分別に利用できることが示された。また、このチップを中核技術とすることにより、従来のセルソーターでは不可能であった高度な細胞判定処理系をもつ細胞分収システムが実現されることから、本願発明の微粒子分別マイクロチップは、生物学や医学の研究の場において有用性が高いといえる。
【００４９】
【発明の効果】
以上詳しく説明したとおり、この発明によって、簡便で精度高い微粒子を分別を可能とする微粒子分別マイクロチップと、それを有する安価で汎用性の高い微粒子分別装置が提供される。この発明の微粒子分別装置は、超小型化が可能であり、これを用いることにより、細胞、菌体、微生物、高分子微粒子などの各種微粒子を精度高く簡便に分別することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 この発明の微粒子分別マイクロチップを例示した概略模式図である。
【符号の説明】
１ 基板
２ 微粒子含有溶液導入流路、細胞導入流路
３ シース流形成溶液流路
４ 微粒子計測部位
５ 微粒子分別流路
５ａ 微粒子分別流路、廃棄用流路
５ｂ 微粒子分別流路、収集用流路
５ｃ 微粒子分別流路、廃棄用流路
５１ 流入口
６ 電極
７ 試料微粒子
８ 廃液槽
Claims (7)
- 基板上に微細な流路を有してなるフロー型微粒子分別マイクロチップであって、基板上に、少なくとも
微粒子含有溶液導入流路と、
当該導入路の両側部に配置されたシース流形成溶液流路と、
微粒子含有溶液とシース流形成溶液が流入する１本の流路と、
当該１本の流路に設けられ、導入された微粒子を計測するための微粒子計測部位と、
当該微粒子計測部位の下流に設置され、微粒子を分別回収するための第１の微粒子分別流路とその両側に設置される第２の微粒子分別流路と、
第１の微粒子分別流路を挟むように第１の微粒子分別流路と第２の微粒子分別流路の間に設置され、微粒子計測部位から微粒子分別流路への流入口付近に設置された微粒子の移動方向を制御するための一対の電極と、
を有しており、電極は鋭角な形状を有していて、その鋭角部が流入口付近に設置されることを特徴とする微粒子分別マイクロチップ。 - 微粒子含有溶液導入流路、シース流形成溶液流路、微粒子計測部位、および微粒子分別流路の内壁は、微粒子付着防止層により被覆されている請求項１の微粒子分別マイクロチップ。
- 微粒子含有溶液中の微粒子は、細胞、菌体、微生物、および高分子微粒子からなる群より選択される請求項１または２の微粒子分別マイクロチップ。
- 微粒子を分別するための微粒子分別装置であって、少なくとも請求項１ないし３のいずれかの微粒子分別マイクロチップと、
微粒子分別マイクロチップ上の微粒子計測部位において微粒子を光学的または電磁気学的に計測する計測手段と、
微粒子分別マイクロチップ上の電極に電圧を印加するための電圧印加手段と、
微粒子の光学的または電気的情報を出力するための出力手段を有することを特徴とする微粒子分別装置。 - 計測手段は、光学顕微鏡である請求項４の微粒子分別装置。
- 計測手段は、蛍光顕微鏡である請求項４の微粒子分別装置。
- 請求項４ないし６のいずれかの微粒子分別装置を用いて、微粒子を分別する微粒子分別方法。
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