JP3971801B2 - 抗腫瘍性アントラサイクリン二糖類 - Google Patents

Description

本発明は、新規な抗腫瘍性アントラサイクリン二糖類、その製造及び該二糖を含有する医薬調整物に関する。これらのアントラサイクリン類は、抗腫瘍剤として有用であり、グラム陽性及びグラム陰性細菌に対して活性である。
本発明の目的とする化合物は、以下の式：

（式中、Rは、
（Ｉ）COCH₃＝4'-O-バンコサミニルダウノマイシン、
（II）CHOHCH₃＝4'-O-バンコサミニル 13-ジヒドロダウノマイシン、
（III）COCH₂OH＝4'-O-バンコサミニルドキソルビシン
を表す）を有すると報告されている。
アントラサイクリン（Ｉ）（式中、R＝COCH₃である）の二糖類は、窒素、炭素及び無機塩などの同化可能な源を含有する液体基質中、好気性条件下で、Streptomyces種の培地の発酵を企図する、微生物学的方法により製造することができる。当該Streptomyces種は、本出願人の株バンクでは番号15105と同定され、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の国際的な受託機関の資格を獲得した、DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（DSMZ），Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，Germanyに、1996年３月20日に寄託され、番号10632号を受けた。
（Ｉ）は、本発明に記載された方法に従い、同一ブロス培地から得られる。
式（Ｉ）の化合物（式中、R＝COCH₃である）は、好適な化学反応により、式（II）の化合物（式中、R＝CHOHCH₃である）及び式（III）の化合物（式中、R＝COCH₂OHである）に転換させることができる。
微生物の特性
顕微鏡的特徴
増殖性菌糸体（vegetative mycelium）は、種々の長さで、直径0.5〜0.9ミクロンの分岐菌糸から形成されており、該菌糸体から誘導される好気性菌糸体は、直径0.9〜1.2ミクロンの、壊れやすい蛇行性の長く柔軟な菌糸から形成されている。
胞子形成は非常に少なく、短鎖で、フック（hook）の状態で停止する。胞子は卵形で寸法は、0.8〜1.1×1.9〜2.2ミクロンである。走査電子顕微鏡による測定では、胞子は、平滑面を有している。
肉眼的特性
株15105の培地特性を表１に示す。生長は、有機及び合成培地のいずれに於いても通常良好である。生長過程を、28℃で14日間培養後に測定した。

株15105の生化学的及び生理学的特徴を表２及び３に報告する。
40℃を超える温度では、生長は全く観察されなかった。
株15105の同定及び分類
株15105により示される全ての特性は、Streptomyces種に関してWaksman及びHenriciにより報告されているものと明瞭に対応した。

試験で使用した培地は、1%K₂HPO₄を補った酵母窒素ベース（Difco製）であった。

株の生長で使用した培地は、ISP3（Difco製）であった。酵素活性の測定には、菌糸体の水中懸濁液を使用した。
発酵
25℃〜33℃の温度範囲、４日〜７日の時間で、撹拌液相中で発酵を実施することができる。培地は、炭素、窒素及び無機塩から構成することができる。炭素源としては、スターチ、デキストリン、グリコース、グリセリン、マンニトール及びマルトースが挙げられる；窒素源としては、コーンスティープリカー（cornsteep liquor）、大豆粉、ドライイースト、ペプトン及びカゼインが挙げられる。硝酸アンモニウム及び硫酸アンモニウムなどのアンモニウム塩を使用しても良好な結果が得られる。製造に使用した無機塩は、培地の機能に依存して変動し得る。種々のタイプの粉または発酵の残渣を含む複合培地では、炭酸カルシウムまたはリン酸カルシウムを添加するのが有用である。発酵は、ビーカー中及び種々の容量の発酵器中で実施することができる。
分析方法
発酵ブロスからの抽出物、粗生成物、クロマトグラフィーカラムからの画分及び化学反応から誘導されたサンプルを、クロロホルム：メタノール：酢酸：水80:20:14:6の混合物中で展開させた、薄層クロマトグラフィー（TLC プレート 60-F-254 Merck）により測定する。化合物（Ｉ）、（II）及び（III）は、各々、0.25、0.15及び0.12のクロマトグラフィーRfを示す。
（Ｉ）、（II）及び（III）の穏和な酸加水分解から得られたサンプルを、同一溶離液を使用してTLCにより測定すると、各々、ダウノマイシン（IV）、13-ジヒドロダウノマイシン（V）及びドキソルビシン（VI）であると同一の、クロマトグラフィーのRf0.5、0.4及び0.35の位置に赤い点が現れる。
n-プロパノール：水：酢酸エチル：30%水酸化アンモニウム（70:30:10:10）の混合物中で展開し、次いで硫酸で検出後、TLCにより測定した水溶性残渣は、バンコサミン（VII）のRfと同一のRf0.55の点を示す。
（Ｉ）、（II）及び（III）の強い酸加水分解により得られた有機抽出物を、クロロホルム：アセトン4:1の混合物を溶離液として使用するTLCにより分析し、ダウノマイシノン（VIII）、13-ジヒドロダウノマイシノン（IX）及びアドリアマイシノン（X）のRfと各々同一である、クロマトグラフィーRf0.5、0.11及び0.15の赤い点を示す。
上記の如くTLCで分析した水溶性残渣中に、Rf0.45のダウノサミン（XI）及びバンコサミンの存在が知見される。
アントラサイクリン成分の総含量をダウノマイシンの特異的な強度をリファレンスとして使用して、495nmで分光光度計で測定する。
発酵から粗生成物の取得
発酵段階の終了時、新規化合物（Ｉ）は、主にブロス濾液中に含まれ、これは、n-ブタノールなどの水に非混和性溶媒でアルカリ性環境で抽出することができる。有機相から、この化合物は、酸性の水中に再抽出することができ、例えば、n-ヘキサンなどの弱い極性溶媒を添加して、アルコール、例えば、n-プロパノールの存在下で濃縮後、他のグリコシド化アントラサイクリン類を一緒に含有する化合物（Ｉ）を含有する粗な赤い沈殿物が得られる。
精製工程
（Ｉ）の連続化学形質転換により得られた化合物（II）及び（III）並びに化合物（Ｉ）を含有する、発酵後に得られた粗な生成物の精製は、例えば、Lichroprep RP-（8）（Merck製）の逆相クロマトグラフィーカラムを使用して実施することができる。精製すべき生成物を含有する水溶液は、水とトリフルオロ酢酸などの酸の酸性にしたアセトニトリルなどの有機溶媒との混合溶離液を使用するクロマトグラフィーにかけて精製することができる。カラムから集め、プールし、次いで濃縮した画分を凍結乾燥することができる。
これらの方法により、本発明の目的物の純粋なサンプルの、新規アントラキノン性二糖類4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）、4'-O-バンコサミニル13-ジヒドロダウノマイシン（II）及び4'-O-バンコサミニルドキソルビシン（III）が得られた。
（Ｉ）、（II）、（III）の物理化学的特性
トリフルオロ酢酸塩の形態で凍結乾燥した赤い生成物として得られた新規化合物（Ｉ）、（II）及び（III）は、水、ジオキサン及びアルコールに溶解性であるが、クロロホルム、エチルエーテル及びn-ヘキサンに不溶性である。
物理化学的特性を表４及び５にまとめる。

化学シフトは、テトラメチルシランを参照として値（ppm）として表現している。
構造のデルシデーション（delucidation）
（Ｉ）、（II）及び（III）の穏和な酸加水分解により、各々ダウノマイシン（IV）、13-ジヒドロダウノマイシン（V）、ドキソルビシン（VI）及びバンコサミン（VII）が得られる。
（Ｉ）、（II）及び（III）の強い酸加水分解により、赤いアグリコン類、ダウノマイシノン（VIII）、13-ジヒドロダウノマイシノン（IX）、アドリアマイシノン（X）、ダウノサミン（XI）及びバンコサミン（VIII）が各々得られる。
分解によって得られた生成物のスペクトルデータを元にして、本出願人は、化合物（Ｉ）、（II）及び（III）が、公知のアントラサイクリン類の新規二糖類、各々、4'位置で糖アミンバンコサミンと結合した、各々ダウノマイシン、13-ジヒドロダウノマイシン及びドキソルビシンであると結論付けた。
本発明で提案する化学構造をスキームＩに報告する。

生物学的活性
a）抗菌活性
4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）の最小阻害濃度MICを、寒天中の表示希釈率方法を使用して数種類の微生物に関して測定した。その結果を表６に示す。

b）抗腫瘍活性
4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）の細胞毒性を、ドキソルビシンに対して感受性または耐性であるLoVo細胞（LoVo/Dxr）でin vitroで試験し、その結果を表７に示す。

4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）の抗白血病活性を、L1210マウス腹水白血病に対しin vivoで試験し、その結果を表８に示す。

L1210マウス腹水白血病に対するネズミにおけるin vivoで試験した生成物（Ｉ）は、表８に示されているような低い毒性のダウノルビシンの活性と匹敵する活性を有することが明らかになった。
以下の実施例は、本発明を説明するものであって、本願を限定するものではない。
実施例１
Streptomyces種15105の培養菌を、CZY寒天培地（3%蔗糖；0.4%酵母抽出物；0.3% NaNO₃；0.1% K₂HPO₄；0.05% MgSO₄.7H₂；0.05% KCl；0.001% FeSO₄.7H₂O； 2% 寒天；脱イオン水100ml； pH 6.7；120℃で20分間の滅菌）上で28℃で12日間生長させた。
このようにして得られた培養菌の胞子を集め、以下の培地：1%カゼイン；2%デキストリン；1%コーンスティープリカー；0.1%（NH₄）₂SO₄；0.01% K₂HPO₄；0.5% CaCO₃；100ml 脱イオン水の30mlを含有する300mlフラスコ中に懸濁させた。
120℃で20分間、滅菌した。滅菌後のpHは、6.8〜7.0の範囲で変動する。接種したフラスコを回転振盪器上で、28℃で２日間、280rpmで7cm偏心で撹拌した。上記培地の2mlに等しい量を、以下の培地：6%スターチ；1.8% コーンスティープリカー；0.1% 酵母抽出物；0.25% NaCl；0.3% CaCO₃；0.001% FeSO₄.7H₂O；0.001% ZnSO₄.7H₂O；0.001% CuSO₄.5H₂O；100ml 脱イオン水の30mlを含有する300mlフラスコ中に接種した。120℃で20分間滅菌した。フラスコを、28℃で７日間、回転振盪器上で280rpmで7cm偏心で培養した。
実施例２
実施例１に従って、アセトニトリル（１リットル）を補ったブロス培地（20リットル）をセライトを使用して濾過した。濾液を真空下、濃縮（６リットル）し、n-ブタノール（2×500ml）でpH8.2で抽出した。化合物（Ｉ）及び他のアントラサイクリンを含有する有機相に、HClの酸性水（100ml pH2.5）を添加し、続いて、エチルエーテル（２リットル）及びn-ヘキサン（２リットル）を添加した。振盪後、水性相を分離し、真空下濃縮し、n-プロパノールで小容量とし、分光光度計で滴定し、２当量のメタノール性HCl及び過剰のn-へキサンを補って、粗な赤い沈殿物の形成を誘導した。沈澱を濾過により集め、真空乾燥させた（600mg）。
TLCにより調べると、新規化合物（Ｉ）と他のグリコシド化アントラサイクリンが含有されていた。
実施例３
実施例２により得られた（Ｉ）を含有する粗な沈澱を小容量の水：アセトニトリル（9:1）に溶解させ、Lichroprep RP-8カラム（310-25mm）上でクロマトグラフィーにかけた。トリフルオロ酢酸でpH3に調節した水：アセトニトリル（8:2）の混合物で溶離を実施した。集めた画分をTLCで分析し、単一のスポットを含むものをプールし、これを真空濃縮して、凍結乾燥させた。
赤い凍結乾燥生成物75mgが得られ、この特性を表４及び５に示す。
0.1N酢酸水溶液（0.2ml）を添加した後、ジオキサン（0.5ml）中に溶解させたアリコート（6mg）を85℃に１時間加熱した。水で希釈した反応混合物をクロロホルムでpH8.2で抽出し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させて、小容量になるまで濃縮し、滴定し、メタノール性HCl１当量を補った。沈澱が形成し、これを集め、乾燥させ（3mg）、TLCで分析すると、純正サンプルと比較してダウノマイシン（IV）であることが同定された。残りの水性相は、TLCで純正サンプルと直接比較して同定された、アミノ糖バンコサミン（VII）を含有していた。
別のアリコート（6mg）を0.2N HCl（2ml）に溶解させ、100℃に１時間加熱した。赤い沈澱を濾過により集め、水で洗浄し、乾燥させ（2mg）、TLC分析すると、純正サンプルと直接比較することによりダウノマイシノン（VIII）であることが同定された。
TLCにより分析した水性残渣は、純正サンプルと直接比較することにより、ダウノサミン（XI）及びバンコサミン（VII）であると同定された２種類のアミノ糖類を含有していた。
発酵により得られた生成物は、4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）であることが同定された。
実施例４
実施例２により得られた純粋な4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）のサンプル（8mg）を水（0.8ml）中に溶解させ、NaHCO₃水溶液でpH9に調節し、NaBH₄（0.6mg）を補い、周囲温度に５分間保持した。メタノール数滴及び0.05N HClを添加してpH4.5にした後、溶液を実施例３に記載のように、RP-8上のクロマトグラフィーにかけ、凍結乾燥後、表４にその特性が記載されている新規な赤い生成物を得た。
実施例３に記載のように穏和な酸加水分解にかけたアリコートから、13-ジヒドロダウノマイシン（V）及びバンコサミン（VII）が得られ、これらは、TLC下、純正サンプルと直接比較して同定した。
実施例３に記載のように強い酸加水分解にかけたアリコートから、13-ジヒドロダウノマイシノン（IX）、ダウノサミン（XI）及びバンコサミン（VIII）が、TLC下、純正サンプルとの比較により同定された。
（Ｉ）の化学的形質転換によってこのように得られた新規生成物は、4'-O-バンコサミニル 13-ジヒドロダウノマイシン（II）と同定された。
実施例５
4'-O-バンコサミニルダウノマイシン（Ｉ）（15mg）を無水メタノール：ジオキサン1:3混合物に溶解させ、エチルオルトギ酸エステル（0.05ml）を補った。15分後、溶液を5℃に冷却し、Br₂（5%CHCl₃中0.15ml）、HCl（メタノール0.02ml中2.5M）を補い、一晩4℃に保持した。
n-ヘキサン5容量を添加すると、赤い沈澱が得られ、これをアセトン（1ml）中に溶解させ、0.25M HBr 水溶液（1ml）を添加し、4℃で一晩放置した。
この溶液を1M NaCOOH水溶液でpH4.3にし、次いで周囲温度で2日間磁気撹拌して保持し、次いで実施例３に記載の如くRP-8カラムのクロマトグラフィーにかけた。
凍結乾燥後に、その特性が表４に記載されている、新規赤い生成物が得られた（6mg）。
実施例３に記載の如く穏和な酸加水分解にかけたアリコートから、ドキソルビシン及びバンコサミンが各々得られ、これをTLCで、純正サンプルと直接比較して同定した。
実施例３に記載の如く強い酸加水分解にかけたアリコートから、TLCで、アドリアマイシノン（X）、バンコサミン（VIII）及びダウノサミン（XI）が、各々、純正サンプルと比較することにより同定された。
（Ｉ）の化学的形質転換によってこのように得られた新規生成物は、4'-O-バンコサミニルドキソルビシン（III）であることが同定された。

Claims (6)

1. 式（Ｉ）：
   

   

   （式中、Ｒは−ＣＯＣＨ₃基を表す）の化合物４’−Ｏ−バンコサミニルダウノルビシン及び医薬的に許容可能なその付加塩。
2. 受託番号１０６３２としてＤＳＭＺに寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物の存在下、炭素及び窒素の同化可能な源を含有する栄養液体培地中、好気性条件下で、発酵を実施することを含む、請求項１に記載の式（Ｉ）の抗生物質を製造する発酵方法。
3. 受託番号１０６３２としてＤＳＭＺに寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物の存在下、炭素及び窒素の同化可能な源を含有する栄養液体培地中、好気性条件下、２５℃〜３７℃の間の温度で、４〜７日間の期間、発酵を実施することを含む、請求項１に記載の式（Ｉ）の抗生物質を製造する発酵方法。
4. 鉱物塩の存在下で発酵を実施する、請求項２または３に記載の方法。
5. 前記抗生物質の精製及び／または医薬的に許容可能なその塩の製造を含む請求項２または３に記載の式（Ｉ）の化合物を製造するための発酵方法。
6. 医薬的に許容可能なキャリアと一緒に請求項１に記載の化合物を含む治療用組成物。