JP3828561B2 - グルコース感受性により改変されたインスリンを分泌する不死化肝細胞株 - Google Patents
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Description
本発明は、グルコース感受性インスリン分泌細胞株に関する。詳しくは、本発明は、可逆的に増殖可能なグルコース感受性インスリン分泌肝細胞株に関する。さらに、本発明は、糖尿病治療に用いる細胞製剤に関する。
２０００年にカナダ、エドモントンのアルバータ大学から臨床膵島移植７症例についての報告がなされた（Ｓｈａｐｉｒｏ ＡＭ，Ｌａｋｅｙ ＪＲ，Ｒｙａｎ ＥＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４３：２３０−２３８，２０００参照）。のちに「エドモントン・プロトコール」と呼ばれる免疫抑制剤の斬新な使用法によって、膵島移植を受けた全ての１型糖尿病症例で日常的なインスリン投与から離脱することができたというものである。膵島移植はインスリン依存型糖尿病患者にとって現在もっとも理想に近い治療法である。
後腹膜に存在する膵臓は、外分泌腺と内分泌腺から構成されている。膵臓全容積の９８％以上を外分泌腺が占め、内分泌腺は２％以下である。１８６９年ランゲルハンスによって見いだされた内分泌腺組織は、膵島と呼ばれる。膵島は内分泌細胞の集団であり、α細胞、β細胞、ＰＰ細胞、δ細胞などからなっている。体内のホルモンで唯一血糖を下げる作用をもつインスリンは膵島のβ細胞から分泌される。この膵島を膵臓から単離し、インスリン依存型糖尿病の患者に移植することにより、一旦廃絶した血糖降下システムの置換再生を目指すのが膵島移植である。
膵島単離成功の是非は、単離に用いる膵臓自体の善し悪しにかかっている。良好な膵島単離のためには外分泌腺組織の状態も良い必要がある。膵島単離を目的とした膵臓摘出には想像以上の繊細さが要求される。例えば、膵臓にさわって圧力をかけるだけでも、膵外分泌細胞はその含有酵素である蛋自分解酵素を放出するため、自己融解がはじまる。また、遠隔地で膵臓が摘出された場合、単離施設までの輸送中の保存についても充分な配慮が必要となる。
糖尿病は、インスリン活性の低下の原因に基づき、１型糖尿病（若年型糖尿病）と２型糖尿病とに大きく分類される。インスリンの分泌がある程度保たれている２型糖尿病に対してインスリンがほとんど分泌されていない１型糖尿病では、インスリン療法による血糖調節が非常に困難であるため、膵島移植が最も有効な治療法と考えられている。２型糖尿病においても病期が進むと糖毒性やβ細胞の疲弊によってインスリンの不足を来すが、２型糖尿病は現在のところ膵島移植の適応とはなっていない。理由は、２型糖尿病はその病態の基盤にインスリン抵抗性をもつため、膵島移植の効果が懸念されるためである。また、２型糖尿病でも血糖の厳格な調節は予後に良好に働くが、移植膵島の不足という厳然たる事実があるため、１型糖尿病のみが膵島移植の対象となっている。将来、移植膵島を多量に供給し得る状況となった場合には、インスリン抵抗性を契機としたインスリン依存型糖尿病もその適応となる可能性は充分にある。
インスリン療法が開発された当時、インスリン療法によって１型糖尿病は完全に制御可能な疾患になったかのように思われたが、網膜症、神経障害、腎症などの長期合併症の存在が判明し、１型糖尿病は慢性疾患という新たなかたちで患者に苦悩をもたらすものとなった。インスリン療法は１型糖尿病において速やかな死という緊急の問題を解決し、現在どの患者に対しても提供され得るものであるという点においてその果たしている役割は非常に大きい。しかし、一方で１型糖尿病に対する根本的治療法とはなりえず、低血糖の危険性、長期合併症といった非常に困難な問題が残っている。
１型糖尿病は自己免疫の異常によって、インスリンを産生する膵β細胞が特異的に破壊されることで発症する（Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＭＡ，Ｍａｃｌａｒｅｎ ＮＫ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３１：１４２８−１４３６，１９９４参照）。その根本的治療には、膵β細胞の再生置換療法のひとつである移植が考えられる。移植には膵臓移植と膵島移植があり、これら二つの移植の目的は、非常に厳格な血糖調節を可能とし、低血糖さらには長期合併症の発症を回避することである。単にインスリン療法による日常の煩わしさから患者を開放し生活の質（ＱＯＬ）を向上させる事だけが目的ではない。移植療法はインスリン依存性糖尿病を治癒という最終目標に向かわせる手段として、インスリン療法よりは遙かに潜在能力を有する治療法である。しかしながら、膵臓移植では手術侵襲が大きいこと、また付随して移植される外分泌腺による合併症が重度となりうるなどの問題がある。膵島移植では、免疫抑制剤の使用による安全性の問題がある。さらに、膵臓・膵島単離に要する脳死体からの摘出膵はそれを必要とする患者数に対して圧倒的に少なく、今後解消される見込みはないという問題もある。
現在、ヒト成熟膵島β細胞にかわる細胞の供給源として、ヒトＥＳ細胞、組織幹細胞などが活発に研究されている。分化誘導で一部の細胞（マウスＥＳ細胞や肝幹細胞）でインスリン発現が認められたとの報告があるが、どの段階で、どの遺伝子を導入すれば効果的にインスリンが分泌されるか未だに不明である。また、こうした幹細胞の使用は多分化能と活発な増殖能をもつこと自体に由来する制御の困難さを本質的に内包しており、実用化には今後かなりの時間を要するものと考えられる。
また、ブタ組織・細胞を利用した研究が進む一方、人畜共通感染症、生体組織適合性や倫理的問題も浮上してきた。とくにウイルスの潜在的危険性が大きな問題となってきた。たとえば、ブタの臓器、細胞が保有するブタ由来のウイルスがレシピエントに感染して病気を起こす危険性（とりわけ、内因性ブタ特異的レトロウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ；ＰＥＲＶ）は、染色体に組み込まれているために排除は不可能である）、それが家族や医療スタッフに感染を広げ、さらに社会に新しいウイルス感染を広げる危険性などである。
したがって現在、ヒト成熟膵島β細胞にかわる、質的および量的（数的）に好ましい細胞の供給源が強く望まれている。
本発明の課題は、従来の問題点を解消することであって、グルコース濃度依存的にインスリンを発現することができ、かつ需要に見合った細胞数を容易に確保することができる細胞株を提供することである。また、糖尿病治療に用いる細胞製剤を提供することも、本発明の課題である。
後腹膜に存在する膵臓は、外分泌腺と内分泌腺から構成されている。膵臓全容積の９８％以上を外分泌腺が占め、内分泌腺は２％以下である。１８６９年ランゲルハンスによって見いだされた内分泌腺組織は、膵島と呼ばれる。膵島は内分泌細胞の集団であり、α細胞、β細胞、ＰＰ細胞、δ細胞などからなっている。体内のホルモンで唯一血糖を下げる作用をもつインスリンは膵島のβ細胞から分泌される。この膵島を膵臓から単離し、インスリン依存型糖尿病の患者に移植することにより、一旦廃絶した血糖降下システムの置換再生を目指すのが膵島移植である。
膵島単離成功の是非は、単離に用いる膵臓自体の善し悪しにかかっている。良好な膵島単離のためには外分泌腺組織の状態も良い必要がある。膵島単離を目的とした膵臓摘出には想像以上の繊細さが要求される。例えば、膵臓にさわって圧力をかけるだけでも、膵外分泌細胞はその含有酵素である蛋自分解酵素を放出するため、自己融解がはじまる。また、遠隔地で膵臓が摘出された場合、単離施設までの輸送中の保存についても充分な配慮が必要となる。
糖尿病は、インスリン活性の低下の原因に基づき、１型糖尿病（若年型糖尿病）と２型糖尿病とに大きく分類される。インスリンの分泌がある程度保たれている２型糖尿病に対してインスリンがほとんど分泌されていない１型糖尿病では、インスリン療法による血糖調節が非常に困難であるため、膵島移植が最も有効な治療法と考えられている。２型糖尿病においても病期が進むと糖毒性やβ細胞の疲弊によってインスリンの不足を来すが、２型糖尿病は現在のところ膵島移植の適応とはなっていない。理由は、２型糖尿病はその病態の基盤にインスリン抵抗性をもつため、膵島移植の効果が懸念されるためである。また、２型糖尿病でも血糖の厳格な調節は予後に良好に働くが、移植膵島の不足という厳然たる事実があるため、１型糖尿病のみが膵島移植の対象となっている。将来、移植膵島を多量に供給し得る状況となった場合には、インスリン抵抗性を契機としたインスリン依存型糖尿病もその適応となる可能性は充分にある。
インスリン療法が開発された当時、インスリン療法によって１型糖尿病は完全に制御可能な疾患になったかのように思われたが、網膜症、神経障害、腎症などの長期合併症の存在が判明し、１型糖尿病は慢性疾患という新たなかたちで患者に苦悩をもたらすものとなった。インスリン療法は１型糖尿病において速やかな死という緊急の問題を解決し、現在どの患者に対しても提供され得るものであるという点においてその果たしている役割は非常に大きい。しかし、一方で１型糖尿病に対する根本的治療法とはなりえず、低血糖の危険性、長期合併症といった非常に困難な問題が残っている。
１型糖尿病は自己免疫の異常によって、インスリンを産生する膵β細胞が特異的に破壊されることで発症する（Ａｔｋｉｎｓｏｎ ＭＡ，Ｍａｃｌａｒｅｎ ＮＫ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３１：１４２８−１４３６，１９９４参照）。その根本的治療には、膵β細胞の再生置換療法のひとつである移植が考えられる。移植には膵臓移植と膵島移植があり、これら二つの移植の目的は、非常に厳格な血糖調節を可能とし、低血糖さらには長期合併症の発症を回避することである。単にインスリン療法による日常の煩わしさから患者を開放し生活の質（ＱＯＬ）を向上させる事だけが目的ではない。移植療法はインスリン依存性糖尿病を治癒という最終目標に向かわせる手段として、インスリン療法よりは遙かに潜在能力を有する治療法である。しかしながら、膵臓移植では手術侵襲が大きいこと、また付随して移植される外分泌腺による合併症が重度となりうるなどの問題がある。膵島移植では、免疫抑制剤の使用による安全性の問題がある。さらに、膵臓・膵島単離に要する脳死体からの摘出膵はそれを必要とする患者数に対して圧倒的に少なく、今後解消される見込みはないという問題もある。
現在、ヒト成熟膵島β細胞にかわる細胞の供給源として、ヒトＥＳ細胞、組織幹細胞などが活発に研究されている。分化誘導で一部の細胞（マウスＥＳ細胞や肝幹細胞）でインスリン発現が認められたとの報告があるが、どの段階で、どの遺伝子を導入すれば効果的にインスリンが分泌されるか未だに不明である。また、こうした幹細胞の使用は多分化能と活発な増殖能をもつこと自体に由来する制御の困難さを本質的に内包しており、実用化には今後かなりの時間を要するものと考えられる。
また、ブタ組織・細胞を利用した研究が進む一方、人畜共通感染症、生体組織適合性や倫理的問題も浮上してきた。とくにウイルスの潜在的危険性が大きな問題となってきた。たとえば、ブタの臓器、細胞が保有するブタ由来のウイルスがレシピエントに感染して病気を起こす危険性（とりわけ、内因性ブタ特異的レトロウイルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ；ＰＥＲＶ）は、染色体に組み込まれているために排除は不可能である）、それが家族や医療スタッフに感染を広げ、さらに社会に新しいウイルス感染を広げる危険性などである。
したがって現在、ヒト成熟膵島β細胞にかわる、質的および量的（数的）に好ましい細胞の供給源が強く望まれている。
本発明の課題は、従来の問題点を解消することであって、グルコース濃度依存的にインスリンを発現することができ、かつ需要に見合った細胞数を容易に確保することができる細胞株を提供することである。また、糖尿病治療に用いる細胞製剤を提供することも、本発明の課題である。
前記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本発明者らにより樹立された可逆的に増殖可能な肝細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８にＣｒｅ組換え酵素の発現ベクターを導入した場合、グルコース濃度依存的にＬ型ピルビン酸キナーゼ（ＬＰＫ）を産生する能力を維持する細胞株が得られることを見出した。このような事実に基づき、ＬＰＫプロモーターの制御下にあるインスリン遺伝子発現ベクターを該細胞株に導入したところ、得られた細胞はグルコース濃度依存的にインスリンを産生することができ、かつ糖尿病に有効な細胞製剤となることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素をコードするヌクレオチド配列およびグルコース感受性プロモーターの制御下にインスリンをコードするヌクレオチド配列を、一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（以下、「ｈＴＥＲＴ遺伝子」と略称する）を含有するヒト不死化肝細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８の染色体に組み込ませることにより得られる、不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株に関する。
本発明はまた、不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７に関する。
本発明は、前記不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株から一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を除去することにより得られるグルコース感受性インスリン分泌肝細胞に関する。
さらに本発明は、前記不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株から一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を除去することにより得られる細胞からなる糖尿病用治療剤に関する。
すなわち本発明は、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素をコードするヌクレオチド配列およびグルコース感受性プロモーターの制御下にインスリンをコードするヌクレオチド配列を、一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたヒトテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（以下、「ｈＴＥＲＴ遺伝子」と略称する）を含有するヒト不死化肝細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８の染色体に組み込ませることにより得られる、不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株に関する。
本発明はまた、不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７に関する。
本発明は、前記不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株から一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を除去することにより得られるグルコース感受性インスリン分泌肝細胞に関する。
さらに本発明は、前記不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株から一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を除去することにより得られる細胞からなる糖尿病用治療剤に関する。
図１は、ノザンブロッティングの結果を示す図である。
図２は、グルコース感受性インスリン分泌肝細胞にグルコースを添加し、グルコース依存的なインスリンの発現を免疫染色法にて検出した結果を示す図である。図２において３は細胞質、４は細胞核を示す。
図３は、腎皮膜下への細胞移植を実施した糖尿病マウスの血糖値を示すグラフである。
図４は、腹腔内への細胞移植を実施した糖尿病マウスの血糖値を示すグラフである。
図２は、グルコース感受性インスリン分泌肝細胞にグルコースを添加し、グルコース依存的なインスリンの発現を免疫染色法にて検出した結果を示す図である。図２において３は細胞質、４は細胞核を示す。
図３は、腎皮膜下への細胞移植を実施した糖尿病マウスの血糖値を示すグラフである。
図４は、腹腔内への細胞移植を実施した糖尿病マウスの血糖値を示すグラフである。
以下、本発明の不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株、および該細胞から一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を除去することにより得られる細胞からなる糖尿病治療剤について詳細に説明する。
本発明の不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株（以下、「不死化インスリン分泌肝細胞」と略称する）は、一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を含有するヒト不死化肝細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８の染色体に、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素をコードするヌクレオチド配列およびグルコース感受性プロモーターの制御下にインスリンをコードするヌクレオチド配列を組み込ませることにより得られる細胞株である。
前記ヒト不死化肝細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８は、一対のＬｏｘＰ配列に挟まれた正常なｈＴＥＲＴ遺伝子を、ヒト肝細胞の染色体に導入することによって不死化された肝細胞株である。ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８は、腫瘍原性が無く、正常肝臓細胞に近い形態を呈し、肝特異的機能を比較的保持し、特別な培養条件を必要とせず短期間に増殖することができる。さらに、ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８は、正常な細胞と同様に、血糖値を感知して血液中のグルコースを細胞内に取り込む能力、およびグルコース濃度依存的にＬ型ピルビン酸キナーゼ（ＬＰＫ）を産生する能力をも維持している。
前記ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ組換え酵素によって認識される公知の部位特異的組換え配列であり、この配列間でＤＮＡ鎖の切断、鎖の交換、および結合という相同組換えを行なう特異的配列である。ＬｏｘＰ配列は、「ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１）」の３４塩基から成る。同一のＤＮＡ分子上に同方向の一対のＬｏｘＰ配列が存在する場合は、その間に挟まれたＤＮＡ配列が切り出されて環状分子となる（切り出し反応）。
前記ｈＴＥＲＴ遺伝子は正常細胞のＴＥＲＴ遺伝子由来である。ｈＴＥＲＴ遺伝子は、血液、皮膚、腸管粘膜、子宮内膜など、生涯にわたり再生を繰り返している臓器の幹・前駆細胞、および特定の抗原に暴露するたびにクローン増殖しているリンパ球では自然と発現増強している遺伝子である。一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を含有するＦＥＲＭＢＰ−７４９８細胞株は、免疫不全マウスに移植しても腫瘍性がない点、無血清培地において培養が可能である点、および、倍化時間が４８時間であるために容易に大量培養ができる点で、非常に優れた細胞株である。
本明細書において、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素は、エストロゲン受容体のホルモン結合ドメイン（ＨＢＤ）とＣｒｅ組換え酵素との融合タンパク質である。タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素において、Ｃｒｅ酵素のアミノ末端側およびカルボキシル末端側の双方にＨＢＤが融合されていることが好ましい。細胞におけるタモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素は、融合タンパク質内のＨＢＤとタモキシフェンとが結合しない条件下では不活性状態にあり、ＨＢＤにタモキシフェンが結合した場合に活性化される。
当該エストロゲン受容体のＨＢＤは、タモキシフェンに結合するエストロゲン受容体内の領域を意味し、タモキシフェンと結合することによってタモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素を活性化し得る領域である限り、限定されるものではない。エストロゲン受容体のＨＢＤとしては、マウスに由来する場合、たとえばアミノ酸２８１残基〜５９９残基の領域を用いることができる。本発明に用いるとくに、５２５番目のグリシンをアルギニンに置換したマウスのエストロゲン受容体のＨＢＤは、生体内に存在する１７β−エストラジオールには結合せず、タモキシフェン特異的に結合するため（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．４，５４３−５４８）、Ｃｒｅ酵素の活性制御が容易となることから、さらに好ましい。
前記タモキシフェンとしては、タモキシフェン（たとえばシグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）およびヒドロキシタモキシフェン（たとえばシグマ社製）などが挙げられる。本発明の不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株からＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を除去するためのヒドロキシタモキシフェンの添加量としては、５０ｎＭ〜５０００ｎＭが好ましく、５００ｎＭがさらに好ましい。ヒドロキシタモキシフェンの添加量が５０ｎＭ未満の場合はｈＴＥＲＴ遺伝子を除去する効果が不充分となる傾向があり、５００ｎＭを超える場合は細胞傷害を引き起こす可能性がある。タモキシフェンの添加量としては、１ｍＭ〜１００ｍＭが好ましく、１０ｍＭがさらに好ましい。タモキシフェンの添加量が１ｍＭ未満の場合はｈＴＥＲＴ遺伝子を除去する効果が不充分となる傾向があり、１００ｍＭを超える場合は細胞傷害を引き起こす可能性がある。
本明細書において、Ｃｒｅ組換え酵素は、ＬｏｘＰ配列を特異的に認識する公知の組換え酵素であり、ＬｏｘＰ配列に挟まれたヌクレオチド配列を切り出すことができる限り限定されるものではない。本発明においては、ヒト不死化肝細胞株の染色体上に存在するＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を切り出すために、Ｃｒｅ組換え酵素を使用する。ＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を不死化肝細胞の染色体上から切り出すことにより得られた細胞は、癌化の危険性がなく安全であり、細胞移植に適する。
本明細書において、グルコース感受性プロモーターは、グルコース濃度に依存してインスリン遺伝子を発現するために用いられる。グルコース感受性プロモーターとしては、たとえば、解糖系および糖新生系において糖濃度に相関して転写レベルでの制御を受けることが知られている酵素遺伝子のプロモーターを用いることが好ましい。具体的には、たとえば、ＬＰＫプロモーター（たとえばラットＬＰＫ遺伝子のプロモーター（−３１９３〜＋１８ヌクレオチド配列））、ホスホエノールピルビン酸カルボキシナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターなどを用いることができる。
前記インスリン遺伝子としては、筋や脂肪組織、肝臓などの細胞膜表面にあるインスリン受容体に特異的に結合してそのチロシン残基特異的な酵素活性を上昇させることで、糖の取り込みおよび利用の促進、グリコーゲンの合成促進、糖新生の抑制などの作用を行うタンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いることができる。肝細胞ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８株にはプロインスリンをインスリンに変換するポロホルモン変換酵素のＰＣ２およびＰＣ１／３が存在しないために、プロインスリンをコードするヌクレオチドを使用した場合は生理活性の低いプロインスリンが分泌されてしまう。したがって、本発明においては、インスリンのＣペプチドをターン形成ペプチド配列（たとえばＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号２））に置換してインスリンのＡ鎖およびＢ鎖を融合させた組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、インスリン遺伝子として使用することが好ましい。そのような組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列としては、配列番号３のヌクレオチド配列が挙げられる。
タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素をコードするヌクレオチド配列およびグルコース感受性プロモーターの制御下にインスリンをコードするヌクレオチド配列を細胞の染色体に組み込ませる方法としては、公知の方法を用いることができる。所望のヌクレオチド配列を細胞内の染色体に導入する方法としては、たとえば、リン酸カルシウム法およびＤＥＡＥデキストラン法などのウイルスを使わない方法、ならびに組換えウイルスベクターまたは膜融合リポソームなどを使用する方法などを挙げることができ、これらに限定されるものではない。
本発明の糖尿病用治療剤は、前記不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株から一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を除去することにより得られる細胞からなる。本発明の糖尿病用治療剤は、ｈＴＥＲＴ遺伝子を除去することにより得られる細胞とともに、薬学的に許容し得る公知の賦形剤などを含有してもよい。
本発明における該治療剤は、たとえば、ハイブリット型人工臓器のソースとして、または細胞移植のソースとして、門脈内に移植することができる。該治療剤の投与量（移植量）は、たとえば１×１０８〜１×１０１１細胞個／個体が好ましく、１×１０９〜１×１０１１細胞個／個体がさらに好ましく、１×１０９〜１×１０１０細胞個／個体が最も好ましい。
以下の実施例によって、本発明のペプチド化合物をさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲に逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。
本発明の不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株（以下、「不死化インスリン分泌肝細胞」と略称する）は、一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を含有するヒト不死化肝細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８の染色体に、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素をコードするヌクレオチド配列およびグルコース感受性プロモーターの制御下にインスリンをコードするヌクレオチド配列を組み込ませることにより得られる細胞株である。
前記ヒト不死化肝細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８は、一対のＬｏｘＰ配列に挟まれた正常なｈＴＥＲＴ遺伝子を、ヒト肝細胞の染色体に導入することによって不死化された肝細胞株である。ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８は、腫瘍原性が無く、正常肝臓細胞に近い形態を呈し、肝特異的機能を比較的保持し、特別な培養条件を必要とせず短期間に増殖することができる。さらに、ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８は、正常な細胞と同様に、血糖値を感知して血液中のグルコースを細胞内に取り込む能力、およびグルコース濃度依存的にＬ型ピルビン酸キナーゼ（ＬＰＫ）を産生する能力をも維持している。
前記ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ組換え酵素によって認識される公知の部位特異的組換え配列であり、この配列間でＤＮＡ鎖の切断、鎖の交換、および結合という相同組換えを行なう特異的配列である。ＬｏｘＰ配列は、「ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１）」の３４塩基から成る。同一のＤＮＡ分子上に同方向の一対のＬｏｘＰ配列が存在する場合は、その間に挟まれたＤＮＡ配列が切り出されて環状分子となる（切り出し反応）。
前記ｈＴＥＲＴ遺伝子は正常細胞のＴＥＲＴ遺伝子由来である。ｈＴＥＲＴ遺伝子は、血液、皮膚、腸管粘膜、子宮内膜など、生涯にわたり再生を繰り返している臓器の幹・前駆細胞、および特定の抗原に暴露するたびにクローン増殖しているリンパ球では自然と発現増強している遺伝子である。一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を含有するＦＥＲＭＢＰ−７４９８細胞株は、免疫不全マウスに移植しても腫瘍性がない点、無血清培地において培養が可能である点、および、倍化時間が４８時間であるために容易に大量培養ができる点で、非常に優れた細胞株である。
本明細書において、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素は、エストロゲン受容体のホルモン結合ドメイン（ＨＢＤ）とＣｒｅ組換え酵素との融合タンパク質である。タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素において、Ｃｒｅ酵素のアミノ末端側およびカルボキシル末端側の双方にＨＢＤが融合されていることが好ましい。細胞におけるタモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素は、融合タンパク質内のＨＢＤとタモキシフェンとが結合しない条件下では不活性状態にあり、ＨＢＤにタモキシフェンが結合した場合に活性化される。
当該エストロゲン受容体のＨＢＤは、タモキシフェンに結合するエストロゲン受容体内の領域を意味し、タモキシフェンと結合することによってタモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素を活性化し得る領域である限り、限定されるものではない。エストロゲン受容体のＨＢＤとしては、マウスに由来する場合、たとえばアミノ酸２８１残基〜５９９残基の領域を用いることができる。本発明に用いるとくに、５２５番目のグリシンをアルギニンに置換したマウスのエストロゲン受容体のＨＢＤは、生体内に存在する１７β−エストラジオールには結合せず、タモキシフェン特異的に結合するため（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，Ｖｏｌ．２４，Ｎｏ．４，５４３−５４８）、Ｃｒｅ酵素の活性制御が容易となることから、さらに好ましい。
前記タモキシフェンとしては、タモキシフェン（たとえばシグマ社（Ｓｉｇｍａ）製）およびヒドロキシタモキシフェン（たとえばシグマ社製）などが挙げられる。本発明の不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株からＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を除去するためのヒドロキシタモキシフェンの添加量としては、５０ｎＭ〜５０００ｎＭが好ましく、５００ｎＭがさらに好ましい。ヒドロキシタモキシフェンの添加量が５０ｎＭ未満の場合はｈＴＥＲＴ遺伝子を除去する効果が不充分となる傾向があり、５００ｎＭを超える場合は細胞傷害を引き起こす可能性がある。タモキシフェンの添加量としては、１ｍＭ〜１００ｍＭが好ましく、１０ｍＭがさらに好ましい。タモキシフェンの添加量が１ｍＭ未満の場合はｈＴＥＲＴ遺伝子を除去する効果が不充分となる傾向があり、１００ｍＭを超える場合は細胞傷害を引き起こす可能性がある。
本明細書において、Ｃｒｅ組換え酵素は、ＬｏｘＰ配列を特異的に認識する公知の組換え酵素であり、ＬｏｘＰ配列に挟まれたヌクレオチド配列を切り出すことができる限り限定されるものではない。本発明においては、ヒト不死化肝細胞株の染色体上に存在するＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を切り出すために、Ｃｒｅ組換え酵素を使用する。ＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を不死化肝細胞の染色体上から切り出すことにより得られた細胞は、癌化の危険性がなく安全であり、細胞移植に適する。
本明細書において、グルコース感受性プロモーターは、グルコース濃度に依存してインスリン遺伝子を発現するために用いられる。グルコース感受性プロモーターとしては、たとえば、解糖系および糖新生系において糖濃度に相関して転写レベルでの制御を受けることが知られている酵素遺伝子のプロモーターを用いることが好ましい。具体的には、たとえば、ＬＰＫプロモーター（たとえばラットＬＰＫ遺伝子のプロモーター（−３１９３〜＋１８ヌクレオチド配列））、ホスホエノールピルビン酸カルボキシナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターなどを用いることができる。
前記インスリン遺伝子としては、筋や脂肪組織、肝臓などの細胞膜表面にあるインスリン受容体に特異的に結合してそのチロシン残基特異的な酵素活性を上昇させることで、糖の取り込みおよび利用の促進、グリコーゲンの合成促進、糖新生の抑制などの作用を行うタンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いることができる。肝細胞ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８株にはプロインスリンをインスリンに変換するポロホルモン変換酵素のＰＣ２およびＰＣ１／３が存在しないために、プロインスリンをコードするヌクレオチドを使用した場合は生理活性の低いプロインスリンが分泌されてしまう。したがって、本発明においては、インスリンのＣペプチドをターン形成ペプチド配列（たとえばＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号２））に置換してインスリンのＡ鎖およびＢ鎖を融合させた組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、インスリン遺伝子として使用することが好ましい。そのような組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列としては、配列番号３のヌクレオチド配列が挙げられる。
タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素をコードするヌクレオチド配列およびグルコース感受性プロモーターの制御下にインスリンをコードするヌクレオチド配列を細胞の染色体に組み込ませる方法としては、公知の方法を用いることができる。所望のヌクレオチド配列を細胞内の染色体に導入する方法としては、たとえば、リン酸カルシウム法およびＤＥＡＥデキストラン法などのウイルスを使わない方法、ならびに組換えウイルスベクターまたは膜融合リポソームなどを使用する方法などを挙げることができ、これらに限定されるものではない。
本発明の糖尿病用治療剤は、前記不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株から一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を除去することにより得られる細胞からなる。本発明の糖尿病用治療剤は、ｈＴＥＲＴ遺伝子を除去することにより得られる細胞とともに、薬学的に許容し得る公知の賦形剤などを含有してもよい。
本発明における該治療剤は、たとえば、ハイブリット型人工臓器のソースとして、または細胞移植のソースとして、門脈内に移植することができる。該治療剤の投与量（移植量）は、たとえば１×１０８〜１×１０１１細胞個／個体が好ましく、１×１０９〜１×１０１１細胞個／個体がさらに好ましく、１×１０９〜１×１０１０細胞個／個体が最も好ましい。
以下の実施例によって、本発明のペプチド化合物をさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲に逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。
５２５番目のグリシンがアルギニンに置換されたマウスエストロゲン受容体の２８１〜５９９アミノ酸残基（ＭｅｒＧ５２５Ｒ）をコードするヌクレオチド配列、Ｃｒｅ組換え酵素の１０５０ｂｐのコーディング配列およびＭｅｒＧ５２５Ｒをコードするヌクレオチド配列の順に融合したタモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素の発現ベクターを、レス（Ｒｅｔｈ）博士の論文（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，ｖｏｌ，２４，Ｎｏ．４）にしたがい作製した。
つぎに、前記ベクターからタモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素をコードするヌクレオチド配列を切りだし、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスのエンハンサー、ニワトリβ−アクチンのプロモーターおよびウサギβ−グロビンのポリＡシグナルを含有するプロモーター）およびピューロマイシン（Ｐｕｒ）耐性遺伝子を有する発現ベクターに挿入することにより、ＣＡＧプロモーターの制御下でタモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素を発現する発現ベクター（ｐＣＡＧ−Ｍｅｒ−Ｃｒｅ−Ｍｅｒ−Ｐｕｒ）を作製した。なお、ｐＣＡＧ−Ｍｅｒ−Ｃｒｅ−Ｍｅｒ−ＰｕｒはＰｕｒ耐性遺伝子を含有しているため、当該ベクターを導入された細胞をピューロマイシンにより選択することができる。
ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクションリージェント（ロッシュ ダイアグノスティクス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製）を使用し、前記ｐＣＡＧ−ＭｅｒＣｒｅ−Ｍｅｒ−ＰｕｒをＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８細胞株に形質導入した。すなわち、
（１）４０μｌの滅菌水および１０μｌのＣＡＧ−ＭｅｒＣｒｅ−Ｍｅｒ−Ｐｕｒ（０．４μｇ／μｌ）を、滅菌した１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加し、合計５０μｌとした（溶液１）。
（２）８８μｌの無血清培地（ダルベッコ改変イーグル基本培地（ＤＭＥＭ））および１２μｌのＦｕＧＥＮＥを、滅菌した１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加し、合計１００μｌとした（溶液２）。
（３）溶液２に溶液１を添加してタッピングにより混合し、得られた混合液を３０分間室温で静置した。
（４）１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）においてＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８細胞株を７０％密集となるまで培養したのち、培養フラスコから培養液を約１ｍｌ残して吸引し、ついで、前記（３）で得られた混合液を細胞表面に均等に滴下した。
（５）フラスコをわずかに傾けることにより混合液を細胞表面に拡散させ、ついで２ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを添加し、細胞を一晩培養した。
つぎに、細胞の選択を行った。すなわち、培地を新鮮な培地に交換し、さらに一日間培養した。ついで、培地を新鮮な５００ｎＭピューロマイシン含有ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに交換し、リングクローニング法を用いて培養を続けることによりＴＴＮＴ−１６−Ｔ−３細胞株を樹立した。
前記ＴＴＮＴ−１６−Ｔ−３細胞株にグルコース感受性のインスリン分泌能を付加するために、前記同様にＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクションリージェントを使用することにより、プラスミドベクターｐＬＰＫ−Ａｌｂ−ＳＩＡ−Ｚｅｏ（Ｌ型ピルビン酸キナーゼプロモーター（−３１９３〜＋１８ヌクレオチド配列）の制御下でインスリン分泌を促進する７２ｂｐのアルブミンリーダーと組換えインスリン遺伝子（ＳＩＡ）との融合タンパク質を発現するベクターであって、かつ薬剤ゼオシン耐性遺伝子（Ｚｅｏ）を含有するベクター（Ｎａｔｕｒｅ，４０８：４８３−４８７，２０００））をＴＴＮＴ−１６−Ｔ−３細胞株に形質導入した。
つぎに、細胞の選択を行った。すなわち、培地を新鮮な培地に交換し、さらに一日間培養した。ついで、培地を新鮮な１００μｇ／ｍｌゼオシン含有ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに交換し、リングクローニング法を用いて培養を続けることにより不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株を樹立した。当該細胞株は、茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７）。
試験例１
（グルコース濃度の変動に伴うＬＰＫ遺伝子の発現）
１０ｃｍシャーレ５枚にＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７細胞株（１×１０６細胞個）を播種し、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したダルベッコ改変イーグル基本培地（ＤＭＥＭ）を用いて、細胞が８０％密集となるまで培養した。ついで、培地を、５００ｎＭタモキシフェン（シグマ社製）、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したＤＭＥＭと交換し、１週間培養した。つぎに、培地を、４００ｍｇ／ｄｌグルコース、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび５００ｎＭタモキシフェンを添加したＤＭＥＭ培地と交換し、さらに２４時間培養した。その結果、シャーレ１枚あたり１×１０７個の細胞が得られた。
培養終了後、細胞を回収し、ついでそれらの細胞から全ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを電気泳動により分離し、ＬＰＫに対するプローブを用いるノザンブロッティングを実施した。なお、コントロール細胞としては、グルコース添加を行わないほかは前記同様の条件で播種および培養を実施した細胞を用いた。また、ノザンブロッティングにおいては２８ＳｒＲＮＡを内性コントロールとし、エチジウムブロマイド染色によって検出した。
ノザンブロッティングの結果を図１に示す。図１において、レーン１はコントロール細胞の結果であり、レーン２はグルコースを添加したグルコース感受性肝細胞の結果である。ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７からタモキシフェン添加にてＴＥＲＴ遺伝子を除去した細胞では、グルコースの添加によりＬＰＫ遺伝子の発現が増強された。一方、コントロール細胞では、ＬＰＫ遺伝子の発現増強はみられなかった。
試験例２
（グルコース濃度の変動に伴うインスリンの発現）
１０ｃｍシャーレ５枚にＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７細胞株（１×１０６細胞個）を播種し、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したダルベッコ改変イーグル基本培地（ＤＭＥＭ）を用いて、細胞が８０％密集となるまで培養した。ついで、培地を、５００ｎＭタモキシフェン（シグマ社製）、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したＤＭＥＭと交換し、１週間培養した。つぎに、培地を、４００ｍｇ／ｄｌグルコース、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび５００ｎＭタモキシフェンを添加したＤＭＥＭ培地と交換し、さらに２４時間培養した。その結果、シャーレ１枚あたり１×１０７個の細胞が得られた。
培養終了後、インスリン抗体を用いる免疫染色法にて、細胞におけるインスリンの発現を検討した。なお、コントロール細胞としては、グルコース添加を行わないほかは前記同様の条件で播種、培養およびＴＥＲＴ遺伝子の除去を実施した細胞を用いた。
その結果、グルコース濃度の増加により、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７からＴＥＲＴ遺伝子を除去した細胞では高濃度のインスリンの発現が確認された（図２）。一方、グルコースを添加されなかったコントロール細胞では、インスリンが検出されなかった。
試験例３
（糖尿病マウスにおけるグルコース感受性インスリン分泌肝細胞の腎皮膜下移植効果）
１０ｃｍシャーレ５枚にＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７細胞株（１×１０６細胞個）を播種し、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したＤＭＥＭを用いて、細胞が８０％密集となるまで培養した。ついで、培地を、５００ｎＭタモキシフェン（シグマ社製）、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したＤＭＥＭと交換し、１週間培養した。つぎに、培地を、４００ｍｇ／ｄｌグルコース、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび５００ｎＭタモキシフェンを添加したＤＭＥＭ培地と交換し、さらに２４時間培養した。その結果、シャーレ１枚あたり１×１０７個の細胞が得られた。
薬剤のストレプトゾシン（２１０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに投与することで糖尿病マウスを作製した。血糖値が４００ｍｇ／ｄｌ以上になった時点で糖尿病と判定し、開腹後腎臓の皮膜下に前記細胞１×１０７個を移植した（ｎ＝５）。細胞移植後血糖値を測定して細胞移植の効果を判定した。なお、本試験においては、細胞移植を実施しなかった糖尿病マウスをコントロールＡとした。
細胞移植の結果を図３に示す。図３において、Ｃ１〜Ｃ５は腎皮膜下細胞移植を実施した各糖尿病マウスを示す。腎皮膜下細胞移植を実施した糖尿病マウスは、いずれも血糖の下降を認めた。細胞移植を施行しなかったコントロールＡは血糖値が常に４００ｍｇ／ｄｌ以上を呈していた。当該結果は、移植された細胞が血糖値に反応してインスリンを分泌していることを示している。
試験例４
（糖尿病マウスにおけるグルコース感受性インスリン分泌肝細胞の腹腔内移植効果）
１０ｃｍシャーレ９枚にＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７細胞株（１×１０６細胞個）を播種し、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したＤＭＥＭを用いて、細胞が８０％密集となるまで培養した。ついで、培地を、５００ｎＭタモキシフェン（シグマ社製）、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したＤＭＥＭと交換し、１週間培養した。つぎに、培地を、４００ｍｇ／ｄｌグルコース、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび５００ｎＭタモキシフェンを添加したＤＭＥＭ培地と交換し、さらに２４時間培養した。その結果、シャーレ１枚あたり１×１０７個の細胞が得られた。
薬剤のストレプトゾシン（２１０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに投与することで糖尿病マウス作製した。血糖値が４００ｍｇ／ｄｌ以上になった時点で糖尿病と判定し、開腹後腹腔内に前記細胞３×１０７個を移植した（ｎ＝２）。細胞移植後血糖値を測定して細胞移植の効果を判定した。なお、本試験においても試験例３と同様に細胞移植を実施しなかった糖尿病マウスをコントロールＡとした。また、前記細胞３×１０７個を用いて腹腔内移植を実施した正常マウスを、コントロールＢとした。
細胞移植の結果を図４に示す。図４において、Ｄ１およびＤ２は腹腔内細胞移植を実施した各糖尿病マウスを示す。腹腔内細胞移植を実施した糖尿病マウスは、いずれも血糖の下降を認めた。細胞移植を施行しなかったコントロールＡは血糖値が常に４００ｍｇ／ｄｌ以上を呈していた。また、コントロールＢにおいては、血糖値が低下することはなかった。当該結果は、移植された細胞が血糖値に反応してインスリンを分泌していることを示している。
つぎに、前記ベクターからタモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素をコードするヌクレオチド配列を切りだし、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスのエンハンサー、ニワトリβ−アクチンのプロモーターおよびウサギβ−グロビンのポリＡシグナルを含有するプロモーター）およびピューロマイシン（Ｐｕｒ）耐性遺伝子を有する発現ベクターに挿入することにより、ＣＡＧプロモーターの制御下でタモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素を発現する発現ベクター（ｐＣＡＧ−Ｍｅｒ−Ｃｒｅ−Ｍｅｒ−Ｐｕｒ）を作製した。なお、ｐＣＡＧ−Ｍｅｒ−Ｃｒｅ−Ｍｅｒ−ＰｕｒはＰｕｒ耐性遺伝子を含有しているため、当該ベクターを導入された細胞をピューロマイシンにより選択することができる。
ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクションリージェント（ロッシュ ダイアグノスティクス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製）を使用し、前記ｐＣＡＧ−ＭｅｒＣｒｅ−Ｍｅｒ−ＰｕｒをＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８細胞株に形質導入した。すなわち、
（１）４０μｌの滅菌水および１０μｌのＣＡＧ−ＭｅｒＣｒｅ−Ｍｅｒ−Ｐｕｒ（０．４μｇ／μｌ）を、滅菌した１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加し、合計５０μｌとした（溶液１）。
（２）８８μｌの無血清培地（ダルベッコ改変イーグル基本培地（ＤＭＥＭ））および１２μｌのＦｕＧＥＮＥを、滅菌した１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加し、合計１００μｌとした（溶液２）。
（３）溶液２に溶液１を添加してタッピングにより混合し、得られた混合液を３０分間室温で静置した。
（４）１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）においてＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８細胞株を７０％密集となるまで培養したのち、培養フラスコから培養液を約１ｍｌ残して吸引し、ついで、前記（３）で得られた混合液を細胞表面に均等に滴下した。
（５）フラスコをわずかに傾けることにより混合液を細胞表面に拡散させ、ついで２ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを添加し、細胞を一晩培養した。
つぎに、細胞の選択を行った。すなわち、培地を新鮮な培地に交換し、さらに一日間培養した。ついで、培地を新鮮な５００ｎＭピューロマイシン含有ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに交換し、リングクローニング法を用いて培養を続けることによりＴＴＮＴ−１６−Ｔ−３細胞株を樹立した。
前記ＴＴＮＴ−１６−Ｔ−３細胞株にグルコース感受性のインスリン分泌能を付加するために、前記同様にＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクションリージェントを使用することにより、プラスミドベクターｐＬＰＫ−Ａｌｂ−ＳＩＡ−Ｚｅｏ（Ｌ型ピルビン酸キナーゼプロモーター（−３１９３〜＋１８ヌクレオチド配列）の制御下でインスリン分泌を促進する７２ｂｐのアルブミンリーダーと組換えインスリン遺伝子（ＳＩＡ）との融合タンパク質を発現するベクターであって、かつ薬剤ゼオシン耐性遺伝子（Ｚｅｏ）を含有するベクター（Ｎａｔｕｒｅ，４０８：４８３−４８７，２０００））をＴＴＮＴ−１６−Ｔ−３細胞株に形質導入した。
つぎに、細胞の選択を行った。すなわち、培地を新鮮な培地に交換し、さらに一日間培養した。ついで、培地を新鮮な１００μｇ／ｍｌゼオシン含有ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに交換し、リングクローニング法を用いて培養を続けることにより不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株を樹立した。当該細胞株は、茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７）。
試験例１
（グルコース濃度の変動に伴うＬＰＫ遺伝子の発現）
１０ｃｍシャーレ５枚にＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７細胞株（１×１０６細胞個）を播種し、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したダルベッコ改変イーグル基本培地（ＤＭＥＭ）を用いて、細胞が８０％密集となるまで培養した。ついで、培地を、５００ｎＭタモキシフェン（シグマ社製）、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したＤＭＥＭと交換し、１週間培養した。つぎに、培地を、４００ｍｇ／ｄｌグルコース、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび５００ｎＭタモキシフェンを添加したＤＭＥＭ培地と交換し、さらに２４時間培養した。その結果、シャーレ１枚あたり１×１０７個の細胞が得られた。
培養終了後、細胞を回収し、ついでそれらの細胞から全ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを電気泳動により分離し、ＬＰＫに対するプローブを用いるノザンブロッティングを実施した。なお、コントロール細胞としては、グルコース添加を行わないほかは前記同様の条件で播種および培養を実施した細胞を用いた。また、ノザンブロッティングにおいては２８ＳｒＲＮＡを内性コントロールとし、エチジウムブロマイド染色によって検出した。
ノザンブロッティングの結果を図１に示す。図１において、レーン１はコントロール細胞の結果であり、レーン２はグルコースを添加したグルコース感受性肝細胞の結果である。ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７からタモキシフェン添加にてＴＥＲＴ遺伝子を除去した細胞では、グルコースの添加によりＬＰＫ遺伝子の発現が増強された。一方、コントロール細胞では、ＬＰＫ遺伝子の発現増強はみられなかった。
試験例２
（グルコース濃度の変動に伴うインスリンの発現）
１０ｃｍシャーレ５枚にＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７細胞株（１×１０６細胞個）を播種し、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したダルベッコ改変イーグル基本培地（ＤＭＥＭ）を用いて、細胞が８０％密集となるまで培養した。ついで、培地を、５００ｎＭタモキシフェン（シグマ社製）、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したＤＭＥＭと交換し、１週間培養した。つぎに、培地を、４００ｍｇ／ｄｌグルコース、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび５００ｎＭタモキシフェンを添加したＤＭＥＭ培地と交換し、さらに２４時間培養した。その結果、シャーレ１枚あたり１×１０７個の細胞が得られた。
培養終了後、インスリン抗体を用いる免疫染色法にて、細胞におけるインスリンの発現を検討した。なお、コントロール細胞としては、グルコース添加を行わないほかは前記同様の条件で播種、培養およびＴＥＲＴ遺伝子の除去を実施した細胞を用いた。
その結果、グルコース濃度の増加により、ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７からＴＥＲＴ遺伝子を除去した細胞では高濃度のインスリンの発現が確認された（図２）。一方、グルコースを添加されなかったコントロール細胞では、インスリンが検出されなかった。
試験例３
（糖尿病マウスにおけるグルコース感受性インスリン分泌肝細胞の腎皮膜下移植効果）
１０ｃｍシャーレ５枚にＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７細胞株（１×１０６細胞個）を播種し、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したＤＭＥＭを用いて、細胞が８０％密集となるまで培養した。ついで、培地を、５００ｎＭタモキシフェン（シグマ社製）、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したＤＭＥＭと交換し、１週間培養した。つぎに、培地を、４００ｍｇ／ｄｌグルコース、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび５００ｎＭタモキシフェンを添加したＤＭＥＭ培地と交換し、さらに２４時間培養した。その結果、シャーレ１枚あたり１×１０７個の細胞が得られた。
薬剤のストレプトゾシン（２１０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに投与することで糖尿病マウスを作製した。血糖値が４００ｍｇ／ｄｌ以上になった時点で糖尿病と判定し、開腹後腎臓の皮膜下に前記細胞１×１０７個を移植した（ｎ＝５）。細胞移植後血糖値を測定して細胞移植の効果を判定した。なお、本試験においては、細胞移植を実施しなかった糖尿病マウスをコントロールＡとした。
細胞移植の結果を図３に示す。図３において、Ｃ１〜Ｃ５は腎皮膜下細胞移植を実施した各糖尿病マウスを示す。腎皮膜下細胞移植を実施した糖尿病マウスは、いずれも血糖の下降を認めた。細胞移植を施行しなかったコントロールＡは血糖値が常に４００ｍｇ／ｄｌ以上を呈していた。当該結果は、移植された細胞が血糖値に反応してインスリンを分泌していることを示している。
試験例４
（糖尿病マウスにおけるグルコース感受性インスリン分泌肝細胞の腹腔内移植効果）
１０ｃｍシャーレ９枚にＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７細胞株（１×１０６細胞個）を播種し、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したＤＭＥＭを用いて、細胞が８０％密集となるまで培養した。ついで、培地を、５００ｎＭタモキシフェン（シグマ社製）、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび１００ｍｇ／ｄｌグルコースを含有したＤＭＥＭと交換し、１週間培養した。つぎに、培地を、４００ｍｇ／ｄｌグルコース、１μｇ／ｍｌゼオシンおよび５００ｎＭタモキシフェンを添加したＤＭＥＭ培地と交換し、さらに２４時間培養した。その結果、シャーレ１枚あたり１×１０７個の細胞が得られた。
薬剤のストレプトゾシン（２１０ｍｇ／ｋｇ）をマウスに投与することで糖尿病マウス作製した。血糖値が４００ｍｇ／ｄｌ以上になった時点で糖尿病と判定し、開腹後腹腔内に前記細胞３×１０７個を移植した（ｎ＝２）。細胞移植後血糖値を測定して細胞移植の効果を判定した。なお、本試験においても試験例３と同様に細胞移植を実施しなかった糖尿病マウスをコントロールＡとした。また、前記細胞３×１０７個を用いて腹腔内移植を実施した正常マウスを、コントロールＢとした。
細胞移植の結果を図４に示す。図４において、Ｄ１およびＤ２は腹腔内細胞移植を実施した各糖尿病マウスを示す。腹腔内細胞移植を実施した糖尿病マウスは、いずれも血糖の下降を認めた。細胞移植を施行しなかったコントロールＡは血糖値が常に４００ｍｇ／ｄｌ以上を呈していた。また、コントロールＢにおいては、血糖値が低下することはなかった。当該結果は、移植された細胞が血糖値に反応してインスリンを分泌していることを示している。
本発明により、グルコース濃度依存的にインスリンを発現することができ、かつ需要に見合った細胞数を容易に確保することができる、不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株を提供した。また、一対のＬｏｘＰに挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を当該細胞株から除去して得られる細胞は、扱いが容易でなく量的にも不足するヒト成熟膵島β細胞にかわり、糖尿病治療において非常に有用である。とくに、本発明の不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７は、免疫不全マウスに移植した際に腫瘍性がみられないうえに、肝細胞特異的遺伝子発現が保たれているため、非常に優れた細胞株である。
さらに、本発明の細胞を基に、拡散チャンバー型、マイクロカプセル型、中空糸型のモジュール（デバイス）と分離・培養細胞を組み合わせたハイブリッド型などのバイオ人工膵臓の開発が可能である。
さらに、本発明の細胞を基に、拡散チャンバー型、マイクロカプセル型、中空糸型のモジュール（デバイス）と分離・培養細胞を組み合わせたハイブリッド型などのバイオ人工膵臓の開発が可能である。
Claims (4)
- タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ組換え酵素をコードするヌクレオチド配列およびグルコース感受性プロモーターの制御下にインスリンをコードするヌクレオチド配列を、一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子によりヒト不死化肝細胞株ＦＥＲＭ ＢＰ−７４９８の染色体に組み込ませることにより得られる、不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株。
- 前記不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株が、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８１２７である請求の範囲第１項記載の不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株。
- 請求の範囲第１項または第２項記載の不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株から一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を除去することにより得られるグルコース感受性インスリン分泌肝細胞。
- 請求の範囲第１項または第２項記載の不死化グルコース感受性インスリン分泌肝細胞株から一対のＬｏｘＰ配列に挟まれたｈＴＥＲＴ遺伝子を除去することにより得られる細胞からなる糖尿病用治療剤。
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