JP3850465B2 - 簡易培地及び微生物の検出方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の微生物の検出、同定、輸送等に有用な簡易培地及びこれを用いた微生物の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の微生物を検出、同定するにあたって、従来から行われている微生物の培養方法としては、平板塗抹法、混釈法、液体培地法などが一般的である。しかし、これらの方法は、培養を行う前に培地や器具類の滅菌が必要であり、また被検試料を培地に接種した後には塗抹や混釈等の熟練を要する操作が必要であった。更に、被検試料接種後の培地の輸送や発育したコロニーを計測したあとの培地の滅菌ではかさばる器具や培地により多大な労力を必要とした。
【０００３】
そのため、手軽に培養できる簡易培地についての多くの研究がなされ、（１）防水性基体の上面部に、接着剤層、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層及びカバーシートを順次積層した培地（特開昭５７−５０２２００号公報）、（２）防水性基体の上面部に、空気透過性膜、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層及びカバーシートを順次積層した培地（特開平３−１５３７９号公報）、（３）濾紙等に菌体栄養成分を含浸させ、その表面をカバーシートで覆ってなる検出紙（特開平２−６５７９８号公報）、（４）防水性平板の表面に冷水可溶性ゲル化剤と微生物培養基、繊維質吸水性シートを順次積層した培地（特開平６−１８１７４１号公報）が報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記（１）及び（２）の簡易培地においては、試料接種後、試料を一定面積に拡散させるためにスプレッダーにより圧力をかける操作を必要とするという問題があった。また、上記（３）の簡易培地においては、可溶性ゲル化剤を用いず保水を濾紙に依存するために、ある程度の濾紙の厚さが必要である。その結果コロニーの形成が濾紙内部で行われるため、コロニーの観察が困難であることから、精度が低下すると共に、釣菌ができないという問題があった。更に、上記（４）の培地においては作製時に繊維質吸水性シートを培地コーティング後に挿入するという手間、またシートの固定の困難さ、検出可能な面積以上に培地をコーティングする必要性等の問題があった。
【０００５】
従って、本発明の目的は試料接種等の操作性に優れ、かつコロニーの観察、釣菌が容易で正確な検出が可能な簡易培地及びこれを用いた微生物の検出方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、簡易培地について、上記操作性とコロニーの検出性との両面から種々検討を行った結果、接着剤、ゲル化剤及び菌体栄養成分の混合物をゲル化剤の粒径よりも大きいメッシュを有する繊維状吸水性シートに担持させれば、被検液を簡易培地上に滴下するのみで容易に拡散し、かつ形成された薄膜上で明確なコロニーが形成され、検出性の良好な簡易培地が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、（ａ）ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びポリエチレンオキサイドから選ばれる水及びアルコールに可溶な接着剤、（ｂ）キサンタンガム、ローカストビーンガム、グアーガム、カラギーナン及びヒドロキシエチルセルロースから選ばれる水に可溶でアルコールに不溶なゲル化剤、及び（ｃ）菌体栄養成分を含有する培地組成物を、該ゲル化剤より大きいメッシュを有する繊維状吸水性シートに担持させたことを特徴とする簡易培地を提供するものである。
【０００８】
更にまた、本発明は、上記簡易培地に被検液を接種して培養し、そこに形成されるコロニーを検出する微生物の検出方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の培地組成物を構成する（ａ）成分の接着剤としては、水及びアルコールに可溶なものであることが必要であり、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキサイド等が挙げられるが、そのうちでもヒドロキシプロピルセルロースが特に好ましい。
【００１０】
（ｂ）成分のゲル化剤は水に可溶でアルコールに不溶であることが必要で、斯かるゲル化剤としては、例えばキサンタンガム、ローカストビーンガム、グアーガム、カラギーナン等の天然ゲル化剤、ヒドロキシエチルセルロース等の合成ゲル化物質が挙げられるが、そのうちでもキサンタンガムが特に好ましい。斯かるゲル化剤は、平均粒径５００μm 以下、好ましくは０．５〜５０μm の粉体が使用される。
【００１１】
また、（ｃ）成分の菌体栄養成分としては、検出しようとする微生物の生育に適し、水可溶性のものが選択される。例えば、多種の微生物を増殖させる場合には、一般的な栄養培地成分が用いられ、特定の微生物を選択的に増殖させる場合には選択培地成分が用いられる。
【００１２】
更に、この培地組成物には、コロニーの観察を容易にするために、種々の発色剤を配合するのが好ましい。かかる発色剤には、コロニーを着色する色素、例えばトリフェニルテトラゾリウムクロライド、３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド等の色素；５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド等の酵素基質；ブロムチモールブルーやニュートラルレッドのようなpH指示薬等が含まれる。
【００１３】
上記培地組成物を担持させる繊維状吸水性シートは、接種された被検液が毛細管現象により容易に拡散し、かつ培地組成物中のゲル化剤をその網目構造中に担持できるものであることが必要である。そのためには、繊維状吸水性シートはゲル化剤の粒径よりも大きいメッシュを有し、かつ厚さも当該粒径より厚いことが必要であり、例えば、網目の大きさが１５〜１００メッシュ、特に２０〜５０メッシュで、厚さが１０〜１０００μm 、特に５０〜６００μm のものが好ましい。
【００１４】
斯かる性質を有するシートとしては、レーヨン不織布に代表される合成繊維不織布、コットン不織布に代表される天然繊維不織布等が挙げられる。これらのシートの形状は、正方形、長方形、円形等の何れであってもよく、特に制限されない。またその大きさも特に制限されないが、微生物の簡易検出用の場合には長径１〜１５cmのものが好ましい。
【００１５】
培地組成物の繊維状吸水性シートへの担持は次のようにして行われる。
まず、（ａ）〜（ｃ）の培地成分をアルコールに添加してアルコール懸濁液を調製する。この際、各成分の濃度が、成分（ａ）は０．１〜５重量％（以下、単に％で示す）、特に０．３〜２％、成分（ｂ）は０．１〜２０％、特に２〜６％、成分（ｃ）は０．５〜２０％、特に１〜５％になるようにするのが好ましい。
次いで、このアルコール懸濁液を繊維状吸水性シートに注下、噴霧又は塗布等によって含浸させた後、乾燥してアルコールを蒸発除去する。アルコール懸濁液はシート１cm3 当り上記濃度のものを０．５〜２ml含浸させるのが好ましい。乾燥は自然乾燥、減圧乾燥、加熱乾燥の何れであってもよい。更にこのものは、ガス、γ線、電子線等によって滅菌するのが好ましい。
【００１６】
このようにして調製した簡易培地は、防水性平板に積層して使用するのが便利である。平板はプラスチック、ガラス等の防水性の材質のものであれば何れでもかまわないが、透明のものが好ましい。また、簡易培地は、汚染及び乾燥を防止するために、その表面をフィルムで覆うか、容器に収納するのが好ましい。
【００１７】
本発明の簡易培地を用いて微生物を検出するには、当該培地表面に被検液を接種する。そうすると、被検液がメッシュ間の立体的な空洞部の毛細管現象によって容易に拡散し、それに続いて膨潤ゲル化が起こって、被検液中の微生物は捕捉され、自由移動が抑制され、培養によってコロニーが形成される。従って、培地形成面を観察すれば、形成したコロニーが容易に観察できる。試料を定量的に簡易培地へ接種すれば、培養後出現したコロニーを計測することにより、容易に菌数を算定することができる。
なお、菌体液の接種は通常ピペット等により一定量を接種する方法が採用されるが、水分の多い個体へスタンプする方法や試料液へ浸す方法でもよい。また、被検液接種後の培養は、静置して行っても、また輸送期間中に行ってもよい。
【００１８】
【実施例】
次に実施例を挙げて説明する。
【００１９】
実施例１
ペプトン１．７ｇ、ダイズペプトン０．３ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、ブドウ糖０．２５ｇ、リン酸一水素カリウム０．２５ｇ、キサンタンガム３ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース０．５ｇ及びトリフェニルテトラゾリウムクロライド０．００２ｇをエタノール１００mlに懸濁し、良く攪拌した。このエタノール懸濁液を１mlずつ防水性平板の上部にある繊維状吸水性シート（４７φmm）に分注し、均一になるように広げて乾燥した後、エチレンオキサイドガスで滅菌し、簡易培地を調製した。
【００２０】
大腸菌をトリプトソーヤブイヨン（日水製薬社製）にて３５℃で２４時間培養後、１０倍段階希釈を行い、それぞれ１mlずつを簡易培地、又はトリプトソーヤ寒天培地（ＴＳＡ、日水製薬社製）に接種し、３５℃で２４時間培養した後、菌数を測定した。その結果、５回の平均で簡易培地が１．８×１０8CFU／ml及びＴＳＡが１．７×１０8CFU／mlであり、ほぼ同様の菌数を示した。また、簡易培地に形成したコロニーを白金線を用いて刺すことにより釣菌し、更にＴＳＡ平板に接種して３５℃、２４時間培養したところコロニーの形成が認められた。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の簡易培地を用いれば、試料の接種及び培養操作が容易であり、更にコロニーの観察及び釣菌が正確かつ容易にできるため、種々の微生物の検査を容易に行うことができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、種々の微生物の検出、同定、輸送等に有用な簡易培地及びこれを用いた微生物の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の微生物を検出、同定するにあたって、従来から行われている微生物の培養方法としては、平板塗抹法、混釈法、液体培地法などが一般的である。しかし、これらの方法は、培養を行う前に培地や器具類の滅菌が必要であり、また被検試料を培地に接種した後には塗抹や混釈等の熟練を要する操作が必要であった。更に、被検試料接種後の培地の輸送や発育したコロニーを計測したあとの培地の滅菌ではかさばる器具や培地により多大な労力を必要とした。
【０００３】
そのため、手軽に培養できる簡易培地についての多くの研究がなされ、（１）防水性基体の上面部に、接着剤層、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層及びカバーシートを順次積層した培地（特開昭５７−５０２２００号公報）、（２）防水性基体の上面部に、空気透過性膜、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層及びカバーシートを順次積層した培地（特開平３−１５３７９号公報）、（３）濾紙等に菌体栄養成分を含浸させ、その表面をカバーシートで覆ってなる検出紙（特開平２−６５７９８号公報）、（４）防水性平板の表面に冷水可溶性ゲル化剤と微生物培養基、繊維質吸水性シートを順次積層した培地（特開平６−１８１７４１号公報）が報告されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記（１）及び（２）の簡易培地においては、試料接種後、試料を一定面積に拡散させるためにスプレッダーにより圧力をかける操作を必要とするという問題があった。また、上記（３）の簡易培地においては、可溶性ゲル化剤を用いず保水を濾紙に依存するために、ある程度の濾紙の厚さが必要である。その結果コロニーの形成が濾紙内部で行われるため、コロニーの観察が困難であることから、精度が低下すると共に、釣菌ができないという問題があった。更に、上記（４）の培地においては作製時に繊維質吸水性シートを培地コーティング後に挿入するという手間、またシートの固定の困難さ、検出可能な面積以上に培地をコーティングする必要性等の問題があった。
【０００５】
従って、本発明の目的は試料接種等の操作性に優れ、かつコロニーの観察、釣菌が容易で正確な検出が可能な簡易培地及びこれを用いた微生物の検出方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、簡易培地について、上記操作性とコロニーの検出性との両面から種々検討を行った結果、接着剤、ゲル化剤及び菌体栄養成分の混合物をゲル化剤の粒径よりも大きいメッシュを有する繊維状吸水性シートに担持させれば、被検液を簡易培地上に滴下するのみで容易に拡散し、かつ形成された薄膜上で明確なコロニーが形成され、検出性の良好な簡易培地が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、（ａ）ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びポリエチレンオキサイドから選ばれる水及びアルコールに可溶な接着剤、（ｂ）キサンタンガム、ローカストビーンガム、グアーガム、カラギーナン及びヒドロキシエチルセルロースから選ばれる水に可溶でアルコールに不溶なゲル化剤、及び（ｃ）菌体栄養成分を含有する培地組成物を、該ゲル化剤より大きいメッシュを有する繊維状吸水性シートに担持させたことを特徴とする簡易培地を提供するものである。
【０００８】
更にまた、本発明は、上記簡易培地に被検液を接種して培養し、そこに形成されるコロニーを検出する微生物の検出方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の培地組成物を構成する（ａ）成分の接着剤としては、水及びアルコールに可溶なものであることが必要であり、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキサイド等が挙げられるが、そのうちでもヒドロキシプロピルセルロースが特に好ましい。
【００１０】
（ｂ）成分のゲル化剤は水に可溶でアルコールに不溶であることが必要で、斯かるゲル化剤としては、例えばキサンタンガム、ローカストビーンガム、グアーガム、カラギーナン等の天然ゲル化剤、ヒドロキシエチルセルロース等の合成ゲル化物質が挙げられるが、そのうちでもキサンタンガムが特に好ましい。斯かるゲル化剤は、平均粒径５００μm 以下、好ましくは０．５〜５０μm の粉体が使用される。
【００１１】
また、（ｃ）成分の菌体栄養成分としては、検出しようとする微生物の生育に適し、水可溶性のものが選択される。例えば、多種の微生物を増殖させる場合には、一般的な栄養培地成分が用いられ、特定の微生物を選択的に増殖させる場合には選択培地成分が用いられる。
【００１２】
更に、この培地組成物には、コロニーの観察を容易にするために、種々の発色剤を配合するのが好ましい。かかる発色剤には、コロニーを着色する色素、例えばトリフェニルテトラゾリウムクロライド、３−（ｐ−ヨードフェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロマイド等の色素；５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド等の酵素基質；ブロムチモールブルーやニュートラルレッドのようなpH指示薬等が含まれる。
【００１３】
上記培地組成物を担持させる繊維状吸水性シートは、接種された被検液が毛細管現象により容易に拡散し、かつ培地組成物中のゲル化剤をその網目構造中に担持できるものであることが必要である。そのためには、繊維状吸水性シートはゲル化剤の粒径よりも大きいメッシュを有し、かつ厚さも当該粒径より厚いことが必要であり、例えば、網目の大きさが１５〜１００メッシュ、特に２０〜５０メッシュで、厚さが１０〜１０００μm 、特に５０〜６００μm のものが好ましい。
【００１４】
斯かる性質を有するシートとしては、レーヨン不織布に代表される合成繊維不織布、コットン不織布に代表される天然繊維不織布等が挙げられる。これらのシートの形状は、正方形、長方形、円形等の何れであってもよく、特に制限されない。またその大きさも特に制限されないが、微生物の簡易検出用の場合には長径１〜１５cmのものが好ましい。
【００１５】
培地組成物の繊維状吸水性シートへの担持は次のようにして行われる。
まず、（ａ）〜（ｃ）の培地成分をアルコールに添加してアルコール懸濁液を調製する。この際、各成分の濃度が、成分（ａ）は０．１〜５重量％（以下、単に％で示す）、特に０．３〜２％、成分（ｂ）は０．１〜２０％、特に２〜６％、成分（ｃ）は０．５〜２０％、特に１〜５％になるようにするのが好ましい。
次いで、このアルコール懸濁液を繊維状吸水性シートに注下、噴霧又は塗布等によって含浸させた後、乾燥してアルコールを蒸発除去する。アルコール懸濁液はシート１cm3 当り上記濃度のものを０．５〜２ml含浸させるのが好ましい。乾燥は自然乾燥、減圧乾燥、加熱乾燥の何れであってもよい。更にこのものは、ガス、γ線、電子線等によって滅菌するのが好ましい。
【００１６】
このようにして調製した簡易培地は、防水性平板に積層して使用するのが便利である。平板はプラスチック、ガラス等の防水性の材質のものであれば何れでもかまわないが、透明のものが好ましい。また、簡易培地は、汚染及び乾燥を防止するために、その表面をフィルムで覆うか、容器に収納するのが好ましい。
【００１７】
本発明の簡易培地を用いて微生物を検出するには、当該培地表面に被検液を接種する。そうすると、被検液がメッシュ間の立体的な空洞部の毛細管現象によって容易に拡散し、それに続いて膨潤ゲル化が起こって、被検液中の微生物は捕捉され、自由移動が抑制され、培養によってコロニーが形成される。従って、培地形成面を観察すれば、形成したコロニーが容易に観察できる。試料を定量的に簡易培地へ接種すれば、培養後出現したコロニーを計測することにより、容易に菌数を算定することができる。
なお、菌体液の接種は通常ピペット等により一定量を接種する方法が採用されるが、水分の多い個体へスタンプする方法や試料液へ浸す方法でもよい。また、被検液接種後の培養は、静置して行っても、また輸送期間中に行ってもよい。
【００１８】
【実施例】
次に実施例を挙げて説明する。
【００１９】
実施例１
ペプトン１．７ｇ、ダイズペプトン０．３ｇ、塩化ナトリウム０．５ｇ、ブドウ糖０．２５ｇ、リン酸一水素カリウム０．２５ｇ、キサンタンガム３ｇ、ヒドロキシプロピルセルロース０．５ｇ及びトリフェニルテトラゾリウムクロライド０．００２ｇをエタノール１００mlに懸濁し、良く攪拌した。このエタノール懸濁液を１mlずつ防水性平板の上部にある繊維状吸水性シート（４７φmm）に分注し、均一になるように広げて乾燥した後、エチレンオキサイドガスで滅菌し、簡易培地を調製した。
【００２０】
大腸菌をトリプトソーヤブイヨン（日水製薬社製）にて３５℃で２４時間培養後、１０倍段階希釈を行い、それぞれ１mlずつを簡易培地、又はトリプトソーヤ寒天培地（ＴＳＡ、日水製薬社製）に接種し、３５℃で２４時間培養した後、菌数を測定した。その結果、５回の平均で簡易培地が１．８×１０8CFU／ml及びＴＳＡが１．７×１０8CFU／mlであり、ほぼ同様の菌数を示した。また、簡易培地に形成したコロニーを白金線を用いて刺すことにより釣菌し、更にＴＳＡ平板に接種して３５℃、２４時間培養したところコロニーの形成が認められた。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の簡易培地を用いれば、試料の接種及び培養操作が容易であり、更にコロニーの観察及び釣菌が正確かつ容易にできるため、種々の微生物の検査を容易に行うことができる。
Claims (4)
- （ａ）ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン及びポリエチレンオキサイドから選ばれる水及びアルコールに可溶な接着剤、（ｂ）キサンタンガム、ローカストビーンガム、グアーガム、カラギーナン及びヒドロキシエチルセルロースから選ばれる水に可溶でアルコールに不溶なゲル化剤、及び（ｃ）菌体栄養成分を含有する培地組成物を、該ゲル化剤より大きいメッシュを有する繊維状吸水性シートに担持させたことを特徴とする簡易培地。
- 培地組成物が、更に発色剤を含有するものである請求項１記載の簡易培地。
- 請求項１の繊維状吸水性シートが防水性平板に積層されている簡易培地。
- 請求項１〜３の何れか１項記載の簡易培地に被検液を接種して培養し、そこに形成されるコロニーを検出することを特徴とする微生物の検出方法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP17166295A JP3850465B2 (ja) | 1995-07-07 | 1995-07-07 | 簡易培地及び微生物の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17166295A JP3850465B2 (ja) | 1995-07-07 | 1995-07-07 | 簡易培地及び微生物の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0919282A JPH0919282A (ja) | 1997-01-21 |
| JP3850465B2 true JP3850465B2 (ja) | 2006-11-29 |
Family
ID=15927378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP17166295A Expired - Lifetime JP3850465B2 (ja) | 1995-07-07 | 1995-07-07 | 簡易培地及び微生物の検出方法 |
Country Status (1)
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- 1995-07-07 JP JP17166295A patent/JP3850465B2/ja not_active Expired - Lifetime
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