JP3761781B2 - 不安定なｄｐｉｖ阻害剤の化合物 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰ ＩＶ）の不安定な阻害剤の化合物に関し、その化合物が一般式Ａ−Ｂ−Ｃ、式中
Ａがアミノ酸、
ＢがＡとＣの間の化学結合またはアミノ酸、
そして
ＣがＤＰ ＩＶの不安定な阻害剤である。
【０００２】
アミノアシルチアゾリジド、アミノアシルピロリジド、Ｎ−ジジペプチジル，Ｏ−アシルヒドロキシルアミンおよび他の化合物は、血清酵素ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰ ＩＶ）および類縁酵素の阻害剤として働くことが知られている［DEMUTH, H.-U., J. Enzyme Inhibition 3, 249 (1990); DEMUTH, H.-U., HEINS, J., Dipeptidyl Peptidase IV (B. Fleischer編)中、R. G. Landes, Biomedical Publishers, Georgetown, 1995, 1-37参照］。
【０００３】
例えば移植の場合におけるＴ細胞仲介(T-cell-mediated)免疫応答はジペプチジルペプチダーゼＩＶ の安定な阻害剤によって影響されることが見い出されている［KOROM, S., DEMEESTER, I., STADLBAUER, T. H. W., CHANDRAKER, A., SCHAUB, M., SAYEGH, M. H., BELYAEV, A., HAEMERS, A., SCHARPE, S., KUPIEC-WEGLINSKI, J. W., インビボの CD26／ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性の阻害が受容ラットの心臓同種移植生存を延長する、 Transplantation 63, 1495(1997)参照］。慢性関節リュマチをまた抑えることができる［TANAKA, S., MURAKAMI, T., HORIKAWA, H., SUGIURA, M., KAWASHIMA, K., SUGITA, T., ジペプチジルペプチダーゼＩＶ の阻害剤による関節炎の抑制、Int. J. Immunopharmacol. 19, 15 (1997)参照］。
【０００４】
また、酵素活性の関連した一時的な減少のため、哺乳動物の血液中のＤＰ ＩＶまたはＤＰ ＩＶ類縁酵素活性の安定な阻害剤（エフェクター）を投与することが、ＤＰ ＩＶおよびＤＰ ＩＶ様酵素による内在性（または付加的に外から投与）インスリン向性(insulinotropic)ペプチドの胃抑制ポリペプチド１−４２（GIP_1-42)およびグルカゴン様ペプチドアミド−１ ７−３６（GLP-1_7-36)（またはGLP-1_7-37またはその類縁体）の分解の軽減を引き起こし、従ってそれらのペプチドホルモンまたはそれらの類縁体の濃度の降下が減じられるか、または遅くされることが見い出されている。インクレチンまたはそれらの類縁体（内在性または外から導入された）のより高い安定性が、ＤＰ ＩＶエフェクターの作用によってもたらされ、これが膵臓のランゲルハンス細胞のインクレチン受容体のインスリン向性刺激のためのそれらの有用性を高め、とりわけ生体自体のインスリンの効果を変え、処理された生物の炭水化物代謝の刺激を生じる。結果として、処理された生物の血清中の血糖レベルが高血糖症に特徴的なブドウ糖濃度よりも下にさがる。従って、ＤＰ ＩＶ阻害剤によって、過剰体重、ブドウ糖尿症、高脂血症、および血中の長期の高ブドウ糖濃度の結果である重症となる代謝性アシドーシスおよび糖尿病等の代謝異常を予防するか又は軽減することが可能である［DE 196 16 486参照]。
【０００５】
ＤＰ ＩＶ阻害剤によって、ＨＩＶによるＣＤ２６（ＰＤ ＩＶ）陽性細胞の侵入を阻止することもまた実験的に可能である［WAKSELMAN, M., NGUYEN, C., MAZALEYRAT, J.-P., CALLEBAUT, C., KRUST, B., HOVANESSIAN, A. G., ＣＤ２６のＤＰＰ ＩＶ活性の強力なシクロペプチド阻害剤によるＣＤ２６＋でＣＤ２６−ではない細胞のＨＩＶ−１感染の阻害、アブストラクト、44頁、the 24th European Peptide Symposium 1996参照］。
【０００６】
ＤＰ ＩＶは、神経ペプチドＹおよびＣＬＩＰ等の神経活性(neuroactive)ペプチドの活性を調節できる［MENTLEIN, R., DAHMS, P., GRANDT, D., KRUGER, R., ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる神経ペプチドＹおよびペプチドＹＹの蛋白分解的プロセッシング、Regul. Pept. 49, 133 (1993): WETZL, W., WAGNER, T., VOGEL, D., DEMUTH, H.-U., BALSCHUN, D.、ＣＬＩＰ断片ＡＣＴＨ ２０−２４のレム睡眠状態の持続への影響、Neuropeptides, 31, 41 (1997)参照]。
【０００７】
ＤＰ ＩＶ阻害剤のこれら種々の作用は、組織の特定の病理学的状態において使用される場合、それらの作用が例えば他の臓器の正常な生理学的状態へ影響をもつこともあり得る。それらの影響は、標的生物に正および負の両方の結果をもち得る。
【０００８】
従って、本発明の課題は、ＤＰ ＩＶ阻害剤の高い生体有用性(bioavailability)および特定の標的組織または標的臓器において正確に決められた作用の持続性を有するＤＰ ＩＶのエフェクターを提供することである。
【０００９】
特に、高い生体有用性と組み合わされた正確に決められた作用の短い持続性を有するＤＰ ＩＶの阻害剤を提供することが本発明の課題であった。
【００１０】
それらの課題は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰ ＩＶ）の不安定な阻害剤の化合物の提供によって解決され、化合物が一般式Ａ−Ｂ−Ｃ、式中
Ａがアミノ酸、
ＢがＡとＣの間の化学結合またはアミノ酸、
および
ＣがＤＰ ＩＶの不安定な阻害剤、である。
【００１１】
Ｂが結合を表わす場合、特にペプチド結合であり；Ｂがアミノ酸である場合、好ましくは、ペプチド結合によってＡおよびＣに連結する。
【００１２】
本発明によれば、それらの化合物はＤＰ ＩＶの阻害剤として使用でき、それらの作用の部位、それらの作用の発現の時間および作用の持続性を正確に決めることが可能である：
【００１３】
投与すると、化合物は、例えば適当な酵素によって、開裂され、従って不安定な「Ｃ」阻害剤が基Ａ−Ｂの除去によって遊離される。阻害剤は化学的および酵素的機構の両方によって遊離される。例えば、エステラーゼ、プロテアーゼおよびペプチダーゼが本発明による化合物から活性な成分を遊離するために働く。そのようなエステラーゼ、プロテアーゼ等は、例えばWO 97/45117、US 5433955、US 5614379およびUS 5624894に開示されている。
【００１４】
遊離された不安定な阻害剤は次いで既に存在するＤＰ ＩＶと相互作用し、それを阻害できる。直接の結果として、例えば上記のインスリン向性ペプチドがより少ない程度に分解され、そしてインスリンの効果がそれによって増大する。
【００１５】
不安定なＤＰ ＩＶの阻害剤自体の投与は、それらがインビボで非常に早く分解され、従って特にヒト体内における阻害剤の均一な分布が不可能であるから、ＤＰ ＩＶを阻害するには不利であることを示していた。特に、経口投与の際、そのような阻害剤は非常に不安定なので、それらは実質的に全く活性をもたない。従って、安定な阻害剤が、これまで特に糖尿病の治療に使用されてきた。
【００１６】
驚くべきことに、不安定な「Ｃ」阻害剤がそれらを式Ａ−Ｂ−Ｃの基としてマスクすることによって十分に安定化できる。
【００１７】
その安定化はまた、カルボニルメチルピリジニウム基を有する式Ａ−Ｂ−Ｃの化合物がピリジニウム窒素原子で正に荷電している限り、意外である。結果として、電子吸引が、Ａ−Ｂ基の除去後阻害剤の活性な求核反応中心を構成する基へメチレン基によって行なわれる。反応中心の生ずる活性化に基づいて、その求核傾向は、求核剤が化合物Ａ−Ｂ−Ｃに非特異的に「入り(dock)」、阻害剤が不活性化される程度に増大されることが期待されるであろう。しかし、驚くべきことに、阻害剤のそのような不活性化は起らないことが見い出された。
【００１８】
標的酵素ＤＰ ＩＶへの短期間の効果のみを要求する生理学的コントロール循環においてＤＰ ＩＶ阻害剤によって介在させるために、本発明によれば、作用の単に短い持続性、そして決まった半減期の後、阻害活性を持たない化合物になる成分Ｃとしての阻害剤が提供される。
【００１９】
例えば、糖尿病におけるインクレチン効果を強めるためには、数分の阻害剤の作用持続で十分であるが、例えば移植の場合におけるＤＰ ＩＶ仲介免疫応答の抑制は、阻害剤による長期間の作用を要求する。
【００２０】
遊離された後、本発明による不安定な阻害剤は、例えばピペラジン誘導体へと環化し、従って不活性化される。その反応は、瞬時に起り、Ｎ末端アミノ窒素のジペプチド誘導体のＣ末端カルボニル官能基へ求核作用に帰され、アミノ酸／イミド結合の周りのシス／トランス異性化によって促進され、その異性化はプロリン含有ペプチドにおいて特に促進される。
【００２１】
さらに、その分解プロセスは、化合物が所望の標的コンパートメント、例えば血液循環へ到達し、そして所望の働きを始めるまで始まらない。
【００２２】
本発明による阻害剤のそれらの性質は、それが遊離された後、分子内環化によるＤＰ ＩＶ阻害剤の所望の時間的に決められた不活性化を起すために異なるＤＰ ＩＶ阻害剤をデザインするために本発明によって使用できる。
【００２３】
特に、本発明によれば、ＣがＣ末端に活性なカルボニル基を有するジペプチド誘導体である化合物が好ましい。好ましくは、Ｃはジペプチジルクロロアルキルケトン、ジペプチジルホウ酸、またはジペプチジルシアニド化合物またはジペプチジルピリジニウムメチルケト化合物である。そのような阻害剤は特に効果的な不安定ＤＰ ＩＶ阻害剤であることが判った。ジペプチド基の例として、例えばIle-Thia、Ile-Pyr、Val-ThiaおよびVal-Pyrが挙げられる。
【００２４】
本発明によれば、阻害剤（成分Ｃ）はまた、塩の形で存在していてもよく、好ましくは酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩またはフマール酸塩等の有機塩、またはリン酸塩または硫酸塩等の無機酸基である。特に好ましくは、フマール酸塩である。
【００２５】
発明の好ましい態様によれば、化合物は、Ｂがプロリン、ヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、ピペコリン酸、アゼチジンカルボン酸またはアジリジンカルボン酸であり、プロリンおよびヒドロキシプロリンが特に好ましい。
【００２６】
特に、本発明に記載の化合物はまた、ＤＰ ＩＶの阻害剤が個々の患者の必要にしたがって遊離される。
【００２７】
本発明に記載の化合物がＤＰ ＩＶ分子と相互作用する場合、それが酵素によって基Ａ−Ｂおよび阻害剤Ｃへ開裂される。阻害剤Ｃは、さらなる化合物を開裂できないようにＤＰ ＩＶ分子を阻害するであろう。さらなるＤＰ ＩＶ分子が存在するならば、化合物は、最後のＤＰ ＩＶ分子が阻害されるまで開裂され続けるであろう（もし充分な量の対応する化合物が投与されていたとすれば）。残りの化合物は分解されず、従ってＤＰ ＩＶ分子の濃度が再び上昇するか、または阻害分子がＤＰ ＩＶによって置き換えられるか、または阻害分子が排泄されるか、または不活性化されるまで阻害剤貯留を構成し、そして本発明に記載の化合物が次いで再び開裂され、従って阻害剤を遊離する。
【００２８】
本発明はまた、各生物が個々の場合によって異なるＤＰ ＩＶの存在量を阻害するために必要な正確な量の阻害剤を遊離するであろうと言うさらなる利点を有する。例えば、患者が高濃度のＤＰ ＩＶを有しているならば、大量の阻害剤が遊離されるであろう；もしほんの少し上昇した濃度のＤＰ ＩＶしかなければ、ほんの少しの量の阻害剤が遊離されるであろう。
【００２９】
特に、Ａ−Ｂが式Ile-ProまたはGly-Proのジペプチドである化合物が特に好ましい。
【００３０】
本発明は従って、セリンペプチダーゼジペプチジルペプチダーゼＩＶの不安定な阻害剤の新規な化合物に関し、化合物が種々の疾患、特に糖尿病と関連する代謝性疾患の治療に使用できる。
【００３１】
驚くべきことに、そのようなマスクされた阻害剤はまた、マスクされていない阻害剤よりもかなり効果的である：マスクされていないＤＰ ＩＶ阻害剤と本発明に記載の化合物の等量を使用するならば、本発明に記載の化合物はウイスターラットにおける耐糖能において顕著な改善をもたらす。
【００３２】
本発明による化合物のさらなる利点は、ＤＰ ＩＶ阻害剤の作用の開始および作用の持続性も、基Ａ−Ｂの適切な選択によって時間的にコントロールできると言うことにある。特に、本発明による化合物から基Ａ−Ｂの遊離はＡのアミノ酸基の性質による：基Ａ の定義に関して、次の順番は、ＤＰ ＩＶ による化合物Ａ−Ｂ−Ｃから基Ａ−Ｂが遊離される速度に対して見い出されている、即ちIle<Val<Phe<Pro<Ala<Gly。対応するＰＤ ＩＶ 触媒による遊離の速度定数は１ｓ^−１から１００ｓ^−１までである。従って、正確に時間的に決まった方法でＤＰ ＩＶ 阻害剤を遊離する手段が利用できる：酵素が、例えばブドウ糖に富む栄養物の摂取で、直ちに作用するべきならば、例えば基Ａとしてアミノ酸Gly をもつ化合物Ａ−Ｂ−Ｃが選択されるであろう；阻害剤の作用が遅くされるべきならば、それでは例えばアミノ酸Ile が基Ａとして選択できる。本発明に記載の化合物によって、従って、ＤＰ ＩＶ 阻害剤が、特に実質的に遅滞なく、例えば栄養物摂取と実質的に同時に小腸の粘膜を通して輸送されることは可能である。
【００３３】
さらに、ＤＰ ＩＶ 阻害剤が遊離され且つそれらが作用するる部位はまた、基Ａ−Ｂの性質によってコントロールできる。
【００３４】
例えば、ピログルタミルアミノペプチダーゼおよびプロリルアミノペプチダーゼは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに加えて哺乳動物の血液中に存在する。基Ａ−Ｂの適切な選択によって、ＤＰ ＩＶ 阻害剤が遊離されるアミノペプチダーゼを決定し、そしてどこで阻害剤の作用が起るのかを決定することが本発明によって可能である。本発明に記載の化合物または対応する医薬組成物が従ってまた、 ＤＰ ＩＶの細胞特異的、組織特異的または臓器特異的な阻害において使用できる。基Ａ−Ｂはまた、血管にのみ存在し、そして阻害剤を充分早い速度で遊離する酵素のみが標的とされるように選択できる。
【００３５】
要約すると、本発明による不安定なＤＰ ＩＶ 阻害剤の化合物によって、全く驚くべき方法で、即ち
１． 阻害剤の増大した作用を達成すること；
２． 阻害剤が患者の必要に応じて遊離されること；
３． 阻害剤が時間的にコントロールされた方法で化合物から遊離されること；
４． 阻害剤が化合物から遊離される部位がコントロールされること；
５． ＤＰ ＩＶ 阻害剤の貯留が提供されること；および
６． 阻害剤の作用の持続および作用の終末がマスクをはずす時から正確に決められること、
が可能であると言える。
【００３６】
本発明によれば、本発明による少なくとも１つの化合物を任意に通常の担体または賦形剤と組み合わせて含むことを特徴とする、特に経口投与のための医薬組成物がまた提供される。
【００３７】
本発明による化合物またはそれらを含む医薬組成物が、例えばヒトの代謝性疾患のような、哺乳動物のＤＰ ＩＶ活性を調整することによって治療できる哺乳動物の疾患の治療または予防に使用できる。
【００３８】
特に、それらは、哺乳動物における損なわれた耐糖能、ブドウ糖尿症、高脂血症、代謝性アシドーシス、糖尿病、糖尿病性の神経疾患および腎疾患、および糖尿病の後遺症の治療に使用できる。
【００３９】
本発明による不安定な阻害剤の好ましい短い持続作用の故に、ＤＰ ＩＶの長期間を要求するようなヒトまたは動物の体のプロセスへの影響を最小限にするか、または予防することが特に可能である。
【００４０】
態様
不安定なＤＰ ＩＶ阻害剤Ｃおよび本発明による不安定なＤＰ ＩＶ阻害剤の化合物（Ａ−Ｂ−Ｃ）の合成
不安定なＤＰ ＩＶ阻害剤Ｃの製造（一般式Ａ−Ｂ−Ｃに対応）が例１．１および１．２に示される。本発明による不安定なＤＰ ＩＶ阻害剤の化合物の合成は例１．３に示される。出発物質、各場合の対応するペプチジルクロロメチルケトンを公知の方法（WEINSTEIN, B., Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, Marcel Dekker, New York, Basle, 1997)によって製造した。Ｎ末端保護ジペプチド誘導体である１．１および１．２の例によって製造されたピリジニウムメチルケトンは、極めて安定であり、完全に確認することができる。通常の空気湿度で、Ｎ末端脱保護ジペプチド誘導体は脱保護後直ちに分子内分解プロセスを始め、従って融点を決めることができない。生成物はHPLCおよび質量分析によって確認される。
【００４１】
１．１ Ｈ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ_２−（Ｎ^＋Ｃ_５Ｈ_５）／Ｃｌ⁻の合成
ａ） Z−Val−Pro−CH₂−(N⁺C₅H₅) Cl⁻
構造式：
【化１】

製造： Z−Val−Pro−クロロメチルケトン10mmolをピリジンに溶かし、２５℃で５日間撹拌する。過剰のピリジンを２ミリバール真空で蒸発させる。Z−Val−Pro−ピリジニウムメチルケトンをHPLC精製に付す。化合物は油である。
実験式： C₂₄H₃₀N₃O₄Cl
分子量： 459.97ダルトン
収率： 理論の45.8%
HPLC： 保持時間：2.3分、LiChrosper 100 RP-18 (125-4)、λ=220 nm、流速0.5 ml/分、水中無勾配の50%アセトニトリル(0.1% TFA)
保持時間：19.3分、Nucleosil 7C₈、λ=220 nm、流速8 ml/分、水中無勾配の50%アセトニトリル(0.1% TFA)
【外１】

【００４２】
ｂ） H−Val−Pro−CH₂−(N⁺C₅H₅) Cl⁻
構造式：
【化２】

製造： Z 保護基をHBr/氷酢酸により、反応時間５分でZ−Val−Pro−CH₂−(N⁺C₅H₅) Cl⁻から除く。HBr/氷酢酸(33%) 2 mlをZ 保護ペプチド1.0mmolへ加え、混合物を２３℃で約１０分間撹拌する。次いで減圧濃縮を行なう。ペプチドをジエチルエーテルによりメタノールからヒドロブロミドの形で沈殿させ、吸引濾過そして減圧で乾燥する。
実験式： C₁₆H₂₄N₃O₂Cl
分子量： 325.84ダルトン
収率： 理論の97.7%
HPLC： 保持時間：7.4分、LiChrosper 100 RP-18 (125-4)、λ=220 nm、流速0.5 ml/分、水中無勾配の50%アセトニトリル(0.1% TFA)
MALDI-TOF-MS m/z： 291.2ダルトン(M+H⁺、塩素アニオン無し）
【００４３】
１．２ Ｈ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ＣＨ_２−（Ｎ^＋Ｃ_５Ｈ_５）／Ｃｌ⁻の合成
ａ） Z−Phe−Pro−CH₂−(N⁺C₅H₅) Cl⁻
構造式：
【化３】

製造： ピリジン2 mlをZ−Phe−Pro−クロロメチルケトン10mmolに加える。混合物を２３℃で４日撹拌する。過剰のピリジンを２ミリバール真空で蒸発させる。粗生成物をシリカゲル６０ｇで精製する。クロロホルム／メタノール溶出液（容量部で９：１）で先ず、生成物を集め、溶離液の極性が上がると、クロロメチルケトンを集める。Z−Phe−Pro−ピリジニウムメチルケトンを最後にHPLC精製に付す。
【００４４】
実験式： C₂₈H₃₀N₃O₄Cl
分子量： 508.01ダルトン
収率： 理論の69.6%
HPLC： 保持時間：17分、LiChrosper RP 8 (Hibar)、λ=220 nm、流速8.0 ml/分、水中無勾配の50%アセトニトリル(0.1% TFA)
保持時間：3.4分、LiChrosper RP-8 (125*4)、λ=220 nm、流速1.5 ml/分、25分で勾配のある水中30-80%アセトニトリル(0.1% TFA)
保持時間：10.2分、Nucleosil 7C₈、λ=220 nm、流速8 ml/分、水中無勾配の50%アセトニトリル(0.1% TFA)
【外２】

【００４５】
ｂ） H−Phe−Pro−CH₂−(N⁺C₅H₅) Cl⁻
構造式：
【化４】

製造： Z 保護基を、反応時間５分の後でZ−Phe−Pro−CH₂−(N⁺C₅H₄) Cl⁻から除く。HBr/氷酢酸(33%)2 mlをZ 保護ペプチド1.0mmolへ加え、混合物を２３℃で約１０分間撹拌する。次いで減圧濃縮を行なう。ペプチドをジエチルエーテルによりメタノールからヒドロブロミドの形で沈殿させ、吸引濾過そして減圧で乾燥する。
実験式： C₂₀H₂₄N₃O₂Cl
分子量： 373.88ダルトン
収率： 理論の98%
HPLC： 保持時間：6.9分、LiChrosper 100 RP-18 (125-4)、λ=220 nm、流速0.5 ml/分、水中無勾配の50%アセトニトリル(0.1% TFA)
MALDI-TOF-MS m/z： 337.2ダルトン(M+H⁺、塩素アニオン無し）
【００４６】
１．３ Ｈ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ｖａｌ-Ｐｒｏ-ＣＨ_２-（Ｎ^＋Ｃ_５Ｈ_５）／Ｃｌ⁻の合成
ａ） Z−Gly−Pro−Val−Pro−CH₂−(N⁺C₅H₅) Cl⁻
構造式：
【化５】

製造： ピリジン2 mlをZ− Gly−Pro−Val−Pro−クロロメチルケトン10mmolに加える。混合物を２３℃で４日間撹拌する。過剰のピリジンを２ミリバール真空で蒸発させる。Z−Gly−Pro−Val−Pro−ピリジニウムメチルケトンをHPLC精製に付す。
実験式： C₃₁H₄₀N₅O₆Cl
分子量： 614.14ダルトン
HPLC： 保持時間：17.4分、LiChrosper RP 8 Hibar、λ=220 nm、流速8 ml/分、水中無勾配の50%アセトニトリル(0.1% TFA)
保持時間：5.4分、LiChroCART 100 RP-18 (250-4)、λ=220 nm、流速0.5 ml/分、無勾配の水中50%アセトニトリル(0.1% TFA)
保持時間：17.7分、Nucleosil 100 7 C₈、λ=220 nm、流速5 ml/分、水中無勾配の50%アセトニトリル(0.1% TFA)
【外３】

【００４７】
ｂ） H−Gly−Pro−Val−Pro−CH₂−(N⁺C₅H₅) Cl⁻
構造式：
【化６】

製造： Z 保護基を、反応時間５分の後Z−Phe−Pro−CH₂−(N⁺C₅H₄) Cl⁻から除く。HBr/氷酢酸(33%)2 mlをZ 保護ペプチド1.0mmolへ加え、混合物を２３℃で約１０分間撹拌する。次いで減圧濃縮を行なう。ペプチドをジエチルエーテルによりメタノールからヒドロブロミドの形で沈殿させ、吸引濾過そして減圧で乾燥する。
実験式： C₂₃H₃₄N₅O₄Cl
分子量： 480.0ダルトン
収率： 理論の95%
MALDI-TOF-MS m/z： 443.9ダルトン(M+H⁺、塩素アニオン無し）
【００４８】
１． 不安定なＤＰ ＩＶ阻害剤およびそれらのマスクされた形のものの水溶液中の分解
１．１および１．２で製造された阻害剤の安定性を分析するために、阻害剤を水性緩衝液中でインキュベートし、それらの分子内環化反応をMALDI-TOF質量分析（図２および３）によってモニターした。その反応の生成物は対応するピラジン誘導体である（図１）。
分子量337.2ダルトンをもつH−Phe−Pro−ピリジニウムメチルケトンの、水の離脱を伴う分子量319.2ダルトンをもつ環状ピラジン誘導体への分解は、３０分の間で定量的に完結する（図２）。
【００４９】
分子量291.2ダルトンをもつH−Val−Pro−ピリジニウムメチルケトンの水の離脱を伴う分子量273.2ダルトンをもつ環状ピラジン誘導体への分解は、６０分の間で定量的に完結する（図３）。
分子内反応中に起きるピラジンの二重結合系の形成は、ＵＶ分光測定によって環化工程の定量的な分析を可能にする（図４）。0.1 M HEPES緩衝液、pH= 7.6、２５℃中の不安定なＤＰ ＩＶ阻害剤の分子内環化のそれから決められた速度定数が表１に示される。
【００５０】
表１： 不安定なＤＰ−ＩＶ阻害剤の環化のパラメター
【表１】

それと対照的に、 本発明による化合物H−Gly−Pro−Val−Pro−CH₂−(N⁺C₅H₅) Clは、同一条件下２４時間の間、完全に安定であることが証明された。
【００５１】
２． 不安定なＤＰ ＩＶ阻害剤または本発明によるジペプチジルペプチダ ーゼＩＶを含む化合物の水溶液における相互作用
ＤＰ ＩＶ標的酵素を基質の存在下に不安定な阻害剤とインキュベートすると、酵素の阻害が初めに観察される；平行して起る阻害剤の分子内環化の結果実験の時間が進むにつれて阻害は再び低下する、何故なら反応溶液中の阻害剤の濃度が自発性に起る化学反応の結果として減少するからである。その効果は図５および６に示される。阻害剤の濃度の時間依存性低下のため、基質の酵素触媒加水分解の速度は時間が進むにつれて再び増大する。
【００５２】
マスクされていないＤＰ ＩＶ阻害剤と対照的に、本発明による化合物H−Gly−Pro−Val−Pro−CH₂−(N⁺C₅H₅)は、酵素の非存在下、緩衝水溶液中２４時間の間安定であることが判った。活性なＤＰ ＩＶ阻害剤H−Val−Pro−CH₂−(N⁺C₅H₅) が、ＤＰ ＩＶ酵素（ここでは、例としてＤＰ ＩＶ阻害剤を遊離するためにも使用される）の添加の結果はじめてＮ末端ペプチドH−Gly−Pro−OHの脱離を伴って遊離される。従って、質量スペクトル（図７）において、明らかに５０％以上の本発明によるインキュベートされた化合物が６０分のインキュベーション時間の後でも検出できる。その遅延した遊離のため、驚くべきことに、標的酵素の所望の効果的な阻害に加えて、不安定なＤＰ ＩＶ阻害剤と比較して本発明による化合物の注目すべき減少濃度と組み合わされた注目すべく延長された活性がまた観察された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 H−Phe−Pro−ピリジニウムメチルケトンの分子内環化の生成物の構造式を示す図である。¹³C NMRおよび¹H NMRによって決定された特性化学変位（ppmで) を対応する原子につける。
【図２】 水性緩衝液pH=7.6中のH−Phe−Pro−ピリジニウムメチルケトンの環化のインキュベーション時間にしたがって記録されたMALDI-TOF質量スペクトルを示す図である。
【図３】 水性緩衝液pH=7.6中のH−Val−Pro−ピリジニウムメチルケトンの環化のインキュベーション時間にしたがって記録されたMALDI-TOF質量スペクトルを示す図である。
【図４】 ：0.1M HEPES緩衝液pH=7.6中３０℃でインキュベートされたH−Phe−Pro−ピリジニウムメチルケトンの水溶液のUVスペクトルを示す図である。この環化反応を４０分の間にわたってモニターした。
【図５】 バッチ中H−Val−Pro−ピリジニウムメチルケトン2.8×10^{− 3}M、ＤＰ ＩＶ 0.06μg/ml、H−Gly−Pro−pNA 4×10^{− 4}Mの存在下、0.1M HEPES緩衝液、pH=7.6、３０℃で基質H−Gly−Pro−pNA のＤＰ ＩＶ 触媒加水分解の進行カーブを示す図である。
【図６】 バッチ中H−Phe−Pro−ピリジニウムメチルケトン2.1×10^{− 4}M、ＤＰ ＩＶ 0.06μg/ml、H−Gly−Pro−pNA 1.0×10^{− 3}モル／リットルの存在下、0.1M HEPES緩衝液、pH=7.6、３０℃でH−Gly−Pro−pNA のＤＰ ＩＶ 触媒加水分解の進行カーブを示す図である。
【図７】 H−Gly−Pro−Val−Pro−ピリジニウムメチルケトン2.6×10^{− 5}モル／リットル、ＤＰ ＩＶ 0.06μg/ml、H−Gly−Pro−pNA 2.0×10^{− 4}Mの存在下、0.1M HEPES緩衝液、pH=7.6、３０℃でH−Gly−Pro−pNA のＤＰ ＩＶ 触媒加水分解のインキュベーションバッチ中のMALDI-TOF質量スペクトルを示す図である。６０分のインキュベーション時間後に記録された。
【図８】 バッチ中H−Gly−Pro−Val−Pro−ピリジニウムメチルケトン2.6×10^{− 5}モル／リットル、ＤＰ ＩＶ 0.06μg/ml、H−Gly−Pro−pNA 2.0×10^{− 4}Mの存在下、0.1M HEPES緩衝液、pH=7.6、３０℃でH−Gly−Pro−pNA のＤＰ ＩＶ 触媒加水分解の進行カーブを示す図である。

Claims (14)

1. ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰ ＩＶ）の阻害剤の化合物であって、一般式Ａ−Ｂ−Ｃ、式中
   Ａがアミノ酸であり、
   Ｂが、ＡとＣの間のペプチド結合またはペプチド結合によってＡおよびＣに連結されたアミノ酸であり、および
   Ｃが、ジペプチジルアルキルケトンからフルオロアルキルケトンが除かれたジペプチジルアルキルケトン、ジペプチジルクロロアルキルケトン、ジペプチジルシアニドまたはジペプチジルピリジニウムメチルケトン基から選択される、ＤＰ ＩＶの阻害剤である、
   を有する、前記化合物。
2. Ｂがプロリン、ヒドロキシプロリン、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、ピペコリン酸、アゼチジンカルボン酸またはアジリジンカルボン酸であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
3. Ｂがプロリンまたはヒドロキシプロリンであることを特徴とする、請求項１または２に記載の化合物。
4. Ｃのジペプチジル基が、 Val-Pro または Phe-Proであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
5. 阻害剤が塩の形で存在することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
6. 阻害剤が酢酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩またはフマール酸塩等の有機塩、またはリン酸塩または硫酸塩等の無機酸基として存在することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
7. Ａ−Ｂが式Ile-ProまたはGly-Proのジペプチドであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
8. 請求項１〜７のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物を任意に通常の担体または賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
9. 経口投与のための、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 時間的にコントロールされたインビボでのＤＰ ＩＶの阻害のための医薬の製造における、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物または医薬組成物の使用。
11. ＤＰ ＩＶの細胞特異的、組織特異的または臓器特異的な阻害のための医薬の製造における、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物または医薬組成物の使用。
12. 哺乳動物のＤＰ ＩＶ活性を調節することによって治療できる哺乳動物の疾患の治療のための医薬の製造における、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物または医薬組成物の使用。
13. 医薬が、ヒトの代謝性疾患の治療のためのものであることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
14. 医薬が、哺乳動物における損なわれた耐糖能、ブドウ糖尿症、高脂血症、代謝性アシドーシス、糖尿病、糖尿病性の神経疾患および腎疾患、および糖尿病の後遺症の治療のためのものであることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。

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