JP3604149B2 - マイコプラズマ・ニューモニエ核酸を標的とする核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブ - Google Patents
マイコプラズマ・ニューモニエ核酸を標的とする核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブ Download PDFInfo
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Description
発明の分野
記載され、クレイムされた発明は、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasmapneumoniae）核酸を標的とするオリゴヌクレオチドの設計および使用に関する。ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブおよび増幅オリゴヌクレオチドを包含する異なるタイプのオリゴヌクレオチドを記載する。詳細には、該オリゴヌクレオチドは、喉の綿棒かきとり物、組織試料、体積、実験溶液および培養物のごとき試験試料中のマイコプラズマ・ニューモニエ種の検出に有用である。
発明の背景
塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアンニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、またはイノシン（Ｉ）を包含するヌクレオチドから生成される１本鎖のデオキシリボ−（「DNA」）またはリボ−（「RNA」）核酸をハイブリダイゼーションさせて、相補的塩基のペアー間の水素結合により保持された２本鎖構造を形成することができる。一般的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧまたはＩはＣと水素結合する。鎖に沿って、典型的な塩基対ATもしくはAU、TAもしくはUA、GC、またはCGが存在する。さらに、いくつかのミスマッチ塩基対（例えば、AG、GU）が存在しうる。
十分な一連の相補的塩基を含む２本の１本鎖核酸は、それらのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、２本鎖核酸を生じる。適当な条件下で、DNA/DNA、RNA/DNA、またはRNA/RNAハイブリッドが生成しうる。
特定の核酸配列を検出するための核酸ハイブリダイゼーションの使用の技術的背景となる記載は、1989年７月25日付与のKohneの米国特許第4,851,330号、および「非ウイルス生物の検出および／または定量のための核酸プローブ」という名称のHoganらの国際特許出願PCT/US87/03009にあり、ともに参照によリ本明細書に記載されているものと見なす。Hoganら（上記）は、試料（例えば、痰、尿、血液および組織片）中の非ウイルス生物または非ウイルス生物群の存在の検出方法を記載している。
マイコプラズマ・ニューモニエは、分類学上モリクテス（Mollicutes）クラスにある原核生物である。モリクテスは細菌性細胞壁を欠き、小さなゲノムサイズを有する。それらは自由生活性微生物のうち最小のもののいくつかであると考えられている。マイコプラズマ・ニューモニエは、急性呼吸器疾患を引き起こすヒトの主要な病原体である。それは最もありふれた不規則な肺炎の原因であり、すべての肺炎のケースの15〜20％の原因である。
マイコプラズマ・ニューモニエを検出するためのゲノム配列に指向されたDNAハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Hyman et al.,J.Clin.Microbiol.25:726〜728（1987）、Buck et al.,J.Clin.Microbiol.30:3280〜3283（1992）、およびBernet et al.,J.Clin.Microbiol.27:2492〜2495（1989）により述べられている。マイコプラズマ・ニューモニエのリボゾームDNA（rRNA）に指向されたプローブは、Tilton,Diagn.Microbiol.Infec.Dis.10:109〜112（1988）、Yogev et al.,J.Clin.Microbiol.26:1198〜1201（1988）、Gobel et al.,J.Gen Microbiol.133:1969〜1974（1987）、Hoganらの上記文献、ZivinおよびMonahanのEPO第305145号（出願第88307793.5号）、およびGobelおよびStanbridgeのEPO第250662号（出願第86304919.3号）、Kai et al.,J.Med.Microbiol.38:166〜170（1993）、van Kuppeveld et al.,Applied and Envir.Microbiol.58:2606〜2615（1992）、van Kuppeveld et al.,Applied and Envir.Microbiol.59:655（1993）により述べられており、Jensen et al.,APMIS 97:1046〜1048（1989）にはマイコプラズマ・ニューモニエの16S rRNA配列に指向されたプライマーが記載されている。WeisburgおよびPelletierのEPO出願第92305126.2号（公開番号0576743A1）には、マイコプラズマ・ニューモニエ、あるいは所望によりマイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマ・ゲニタリウムの核酸に対するプローブが述べられている。ここに述べた引用文献は先行技術となり得ない。
発明の概要
本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエ核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチドであって、マイコプラズマ・ニューモニエの検出を助けることに特に有用なオリゴヌクレオチドを記載する。該オリゴヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、および／または増幅プライマーとして作用することによってマイコプラズマ・ニューモニエ検出の助けとなりうる。ハイブリダイゼーションプローブは優先的にマイコプラズマ・ニューモニエの核酸標的領域にハイブリダイゼーションしてマイコプラズマ・ニューモニエの存在を示す検出可能な２本鎖を形成することができる。ヘルパープローブは、厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下でマイコプラズマ・ニューモニエの核酸標的領域にハイブリダイゼーションでき、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ：標的核酸２本鎖の形成を促進するために用いることができる。増幅プライマーは、増幅条件下でマイコプラズマ・ニューモニエの標的領域にハイブリダイゼーションでき、マイコプラズマ・ニューモニエの核酸を生成する増幅反応においてプライマーとして用いることができる。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブは、標的配列の相補的または実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する標的核酸領域を含んでいる。また、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、マイコプラズマ・ニューモニエの核酸に相補的であるかまたは相補的でない、標的核酸領域の外側の付加的ヌクレオチドを有していてもよい。好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは12〜100ヌクレオチドの長さであり、標的核酸領域は、標的配列に完全に相補的なヌクレオチド配列に実質的に類似している。
実質的に類似のヌクレオチド配列とは、同定されたヌクレオチド配列と同一、あるいはRNAまたはDNA同等物は別として20％未満のヌクレオチド塩基の相違を有するヌクレオチド配列であって、１またはそれ以上の密接に関連した生物のrRNAまたはrDNAよりもマイコプラズマ・ニューモニエのrRNAまたはrDNAに優先的にオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションすることを可能にするものである。マイコプラズマ・ニューモニエに密接に関連した生物は、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・オラレ（Mycoplasma orale）、マイコプラズマ・ブッカレ（Mycoplasma buccale）、マイコプラズマ・ファウシウム（Mycoplasma faucium）、およびマイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivalium）を包含する。優先的ハイブリダイゼーションは厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で起こりうる。一般的には、標的配列に対するオリゴヌクレオチド標的領域の相補性の程度の減少は、標的領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度および速度を低下させる。しかしながら、さらなる非相補的ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの非標的生物識別能を促進しうる。別の具体例において、実質的に類似とは、特定のヌクレオチド配列に対する10％の相違および５％の相違をいう。
「RNAおよびDNA同等物」とは、同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するRNAおよびDNA分子をいう。RNAおよびDNA同等物は異なる糖基（すなわち、デオキシリボース対リボース）を有し、RNA中のウラシルの存在およびDNA中のチミンの存在によって異なっていてもよい。RNAおよびDNA同等物の間の相違は実質的には対応核酸配列における相違の原因とならない。なぜなら、同等物は、特定の配列に対して同程度の相補性を有するからである。
マイコプラズマ・ゲニタリウムは、マイコプラズマ・ニューモニエに最も密接に関連していると思われ、マイコプラズマ・ニューモニエのrRNAと非常に類似したrRNA配列を有する。より離れた生物間で生じるより大きな系統的多様性のため、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、マイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ゲニタリウムとを識別でき、さらにマイコプラズマ・ニューモニエと無関係な微生物および好ましくは他のより遠い関連性を有するマイコプラズマとを識別することができる。よって、マイコプラズマ・ニューモニエの存在とマイコプラズマ・ゲニタリウムの存在とを識別できるハイブリダイゼーションアッセイプローブはマイコプラズマ・ニューモニエの検出に有用である。
ヒトにおいて見出されるマイコプラズマ種は、マイコプラズマ・ニューモニエ、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ブッカレ、マイコプラズマ・ファウシウム、およびマイコプラズマ・サリバリウムを包含する。好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ブッカレ、マイコプラズマ・ファウシウム、およびマイコプラズマ・サリバリウムからなる群より選択される微生物に存在する１またはそれ以上、より好ましくはすべての核酸よりも優先的にマイコプラズマ・ニューモニエの核酸にハイブリダイゼーションする。
よって、本発明の第１の態様は、マイコプラズマ・ニューモニエの標的核酸配列領域に優先的にハイブリダイゼーションすることのできるハイブリダイゼーションアッセイプローブを記載する。該ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、マイコプラズマ・ニューモニエの標的配列のリボゾームRNA（rRNA）またはDNA（rDNA）に相補的な標的核酸配列を有する。該ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、記載された標的配列領域の少なくとも一部分に対して少なくとも90％の相補性、好ましくは完全な相補性を有する。該一部分は少なくとも長さ10ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも長さ18ヌクレオチドである。
「優先的にハイブリダイゼーションする」とは、厳密なアッセイ条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブがそれらの標的核酸にハイブリダイゼーションして、標的核酸の存在を示す安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成することができ、密接に関連した非標的核酸の存在を示すに十分な数のプローブ：非標的ハイブリッドを形成しないことを意味する。よって、該プローブは、非標的核酸よりも十分に高程度に標的核酸にハイブリダイゼーションして、当業者がマイコプラズマ・ニューモニエの存在を検出し、その存在を密接に関連した生物の存在から識別することを可能にする。後で示す実施例中の方法のごとき、当業者に知られた方法および本明細書記載の方法を用いて、優先的ハイブリダイゼーションを測定することができる。好ましくは、標的ハイブリダイゼーションシグナルと非標的ハイブリダイゼーションシグナルとの間に少なくとも100倍の相違、より好ましくは少なくとも1000倍の相違、より好ましくは少なくとも10000倍の相違がある。好ましくは、非標的ハイブリダイゼーションシグナルはバックグラウンドレベル程度である。
マイコプラズマ・ニューモニエの「標的核酸配列領域」とは、マイコプラズマ・ニューモニエの核酸またはそれに相補的な配列に存在する核酸配列であって、密接に関連したマイコプラズマ種の核酸には存在しない核酸配列をいう。標的配列の相補的なヌクレオチド配列を有する核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または転写媒介増幅（transcription mediated amplificarion）（例えば、kacianおよびFultz,Nucleic Acid Amplification Methods、欧州特許出願第90307503.4号）のごとき標的増幅方法により得ることができる。
関連した態様は、下記配列（5'から3'方向へと記載）：
それらに相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号（SEQ.ID.NO.）:21、24、27、30、33、36、39、42、および87）、チミンのかわりにウラシルを有するRNA同等物（SEQ.ID.NO.22、25、28、31、34、37、40、43および88）およびチミンのかわりにウラシルを有していてそれらに相補的なオリゴヌクレオチドのRNA同等物（SEQ.ID.NO.23、26、29、32、35、38、41、44、および89）を含む、あるいはそれらから必然的になる、あるいはそれらに実質的に類似のヌクレオチド配列を有する、長さ18〜100ヌクレオチドのハイブリダイゼーションアッセイプローブを記載する。
これらのプローブは、マイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ゲニタリウムとの間で変化しているrRNAおよび／またはrDNAに存在する標的領域に相補的である。該プローブはマイコプラズマ・ニューモニエの核酸にハイブリダイゼーションし、マイコプラズマ・ニューモニエを密接に関連したマイコプラズマから識別し、マイコプラズマ・ニューモニエの存在の検出に有用である。好ましい具体例において、該プローブを用いて試料中に存在するマイコプラズマ・ニューモニエ量を測定することができる。
もう１つの態様はヘルパーオリゴヌクレオチドを記載する。ヘルパーオリゴヌクレオチドは：
からなる群から選択されるヘルパー標的ヌクレオチド配列中に存在する少なくとも10個の一連の核酸に完全に相補的なヌクレオチド配列を有する領域を標的としうる。ヘルパープローブを用いて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブとその標的核酸配列とのハイブリダイゼーションを容易にすることができる。ヘルパープローブは、標的：ハイブリダイゼーションプローブ２本鎖のキネティクスおよび／またはTmを向上させることによりハイブリダイゼーションを容易にする。一般的には、ヘルパープローブは、HoganおよびMillimanの米国特許第5,030,557号に記載されており、これを参照によリ本明細書に記載されているものと見なす。
好ましい具体例において、ヘルパープローブは、下記ヌクレオチド配列（5'から3'方向へと記載）：
およびそれらに対するRNA同等物（SEQ.ID.NO.46、49、52、55、58、62、65、68、71、74、77および80）
を有する、あるいはこれらから必然的になる、あるいはこれらからなるオリゴヌクレオチドである。ヘルパープローブは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブと同じ標的核酸にハイブリダイゼーションでき、好ましくは長さ12ないし100ヌクレオチド、より好ましくは長さ18ないし50ヌクレオチドである。
これとは別に、いくつかのオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションアッセイプローブまたはヘルパープローブとして用いることができる。かかるオリゴヌクレオチドの例は、SEQ.ID.NO.5、６、または７のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである。
本発明のもう１つの態様は、厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下でマイコプラズマ・ニューモニエを検出するためのプローブミックスを記載する。該プローブミックスはハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび少なくとも１つのヘルパープローブを含む。好ましい具体例において、異なるハイブリダイゼーションアッセイプローブとヘルパープローブの組み合わせを記載する。
本発明のもう１つの態様は、核酸ハイブリッドを含む組成物を記載する。該ハイブリッドは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびそれに実質的に相補的な核酸配列を有する核酸分子からなっている。形成されたハイブリッドの１の使用は標的配列の存在を検出することである。例えば、ハイブリッド中に存在するアクリジニウムエステル（「AE」）はアルカリ溶液中での加水分解に耐性であるが、１本鎖核酸中に存在するアクリジニウムエステルはアルカリ溶液中で加水分解される（「ホモジニアス・プロテクション・アッセイ（Homogeneous Protein Assay）」というタイトルのArnoldらのEPO出願第88308767.8号、参照により本明細書に記載されているものと見なす）。よって、未結合AE−標識プローブの加水分解後、核酸ハイブリッドに残存するアクリジニウムエステルの化学発光を測定することにより、AE−標識プローブの標的への結合を検出することができる。
もう１つの態様において、本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエの標的領域の増幅に有用な増幅オリゴヌクレオチドに関する。好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドは、下記ヌクレオチド配列：
チミンのかわりにウラシルを有するRNA同等物（SEQ.ID.NO.53、61、90、および91）を有し、あるいはこれらを必須としてなる。好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドは長さ12ないし100ヌクレオチド、より好ましくは18ないし50ヌクレオチドである。
増幅オリゴヌクレオチド配列は、ブロックされた3'および／または5'末端、あるいはRNAポリメラーゼにより認識される特定の核酸配列（例えば、T7、T3、またはSP6 RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列）;RNAポリメラーゼによるRNA転写の開始または伸長を促進する配列；または分子内塩基対形成を提供し２次もしくは３次核酸構造の形成を促進する配列を包含する付加のごとき修飾（これらに限らない）を有していてもよい。
増幅オリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応あるいはRNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼおよびRNase Ｈもしくはその同等物を用いる増幅反応のごとき核酸増幅方法（KacianおよびFlutzの上記文献、およびSninskyらの米国特許第5,079,351号により記載されており、これらを参照により本明細書に記載されているものと見なす）において用いることができる。
他の態様において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、および増幅オリゴヌクレオチドの使用方法を記載する。これらの方法は、ヒト標本から得られた試料をマイコプラズマ・ニューモニエの存在に関して試験することにおいて特に有用である。
本明細書記載のオリゴヌクレオチドおよびそれらの使用は、試験試料中のマイコプラズマ・ニューモニエ独自の特定rRNA配列の存在を同定し定量する迅速かつ客観的な方法を提供する。
本発明の他の特徴および利点は、本発明の好ましい具体例の説明および請求の範囲から明らかであろう。
好ましい具体例の説明
ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅オリゴヌクレオチド、および／またはヘルパープローブの設計に有用な標的ヌクレオチド配列を説明する。ハイブリダイゼーションアッセイプローブのための標的ヌクレオチド配列はマイコプラズマ・ニューモニエ核酸中に存在するが、密接に関連した生物には存在しないものである。マイコプラズマ・ニューモニエを検出するプローブの設計に有用であるばかりでなく、標的配列の同定は、マイコプラズマ・ニューモニエの増殖を阻害するオリゴヌクレオチドの設計の基礎をも提供する。例えば、微生物の増殖に必要なマイコプラズマ・ニューモニエ核酸を標的とするリボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドのごときオリゴヌクレオチドは核酸の活性を阻害しうるはずであり、そのことにより、マイコプラズマ・ニューモニエの増殖が阻害される。かかるオリゴヌクレオチドを用いてマイコプラズマ・ニューモニエに感染した患者を治療的に処置することができる。オリゴヌクレオチドのアンチセンス活性についてのより詳細な説明は、Helene,C and Toulme,J.Biochimica et Biophysica Acta 1049:99（1990）、およびUhlmann,E.and Peyman,A.Chemical Reviews 90:543（1990）のごとき刊行物にある。
Ｉ．定義
「標的核酸」とは、標的核酸配列を含む核酸を意味する。
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」または「標的配列」とは、特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列、あるいはそれらに完全に相補的な核酸配列を意味する。
「厳密な」ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが優先的に標的核酸（好ましくは、マイコプラズマ・ニューモニエのrRNAまたはrDNA）とハイブリダイゼーションし、密接に関連した非標的微生物由来の核酸とはハイブリダイゼーションしない条件をいう。ハイブリダイゼーションアッセイプローブヌクレオチドの配列および長さ、密接に関連した非標的配列、および標的配列を包含するファクターにより厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件を変更してもよい。ハイブリダイゼーション条件は、温度、ハイブリダイゼーション試薬もしくは溶液の組成を包含する。
「オリゴヌクレオチド」とは、共有結合した２個またはそれ以上のヌクレオチドサブユニットを意味する。ヌクレオチドサブユニットの糖基はリボース、デオキシリボース、またはＯ−メチルリボースのごときそれらの修飾誘導体であってもよい。ヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合、修飾結合のごとき結合により、あるいはオリゴヌクレオチドの相補的標的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションを妨げる非ヌクレオチド部分により結合されていてもよい。修飾結合は、標準的なホスホジエステル結合が異なる結合、例えばホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合で置き換えられている結合を包含する。
「プローブ」とは、標的核酸配列に十分に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドであって、検出可能なハイブリッドオリゴヌクレオチド：標的２本鎖を厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で形成するオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは単離核酸である。厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションを妨げない限り、そしてハイブリダイゼーションアッセイの場合にプローブが優先的ハイブリダイゼーションを妨げない場合には、プローブが標的領域の外側にさらなるヌクレオチドを有していてもよい。プロモーター配列、RNA転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、または触媒活性部位のような所望の２次もしくは３次構造を付与する配列のごとき非相補的配列を用いて検出および／または増幅を容易にすることができる。化学合成および組み換え核酸分子からのインビトロもしくはインビボ発現のごとき当業者に知られた方法により一定の配列のオリゴヌクレオチドプローブを得ることができる。好ましくは、プローブは長さ12ないし100ヌクレオチド、より好ましくは長さ18ないし50ヌクレオチドである。
「ハイブリダイゼーションアッセイプローブ」とは、マイコプラズマ・ニューモニエの5S、16S、または23S rRNA、あるいは対応リボゾームDNA（「rDNA」）核酸、あるいは厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸に優先的にハイブリダイゼーションしうる単離核酸である。好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションを検出または確認するのに用いることのできるラジオアイソトープ、蛍光部分、化学発光部分、酵素、またはリガンドのごときレポーター基（reporter group）で標識されている。好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは長さ12ないし100ヌクレオチドの間、より好ましくは長さ18ないし50ヌクレオチドの間である。
「単離核酸」とは、人間の介在なしには天然において見いだされない形態で存在するオリゴヌクレオチドまたは核酸分子を意味する（例えば、外来核酸と組み換えられたもの、単離され、あるいはある程度精製されたもの）。
「核酸ハイブイリッド」または「ハイブリッド」とは、２本鎖の、水素結合した領域であって、好ましくは長さ12ないし100ヌクレオチド、より好ましくは長さ18ないし50ヌクレオチドの領域を含む安定な核酸構造を意味する。構造は十分に安定であり、化学発光または蛍光検出、オートラジオグラフィー、またはゲル電気泳動のごとき手段により検出される。かかるハイブリッドはRNA:RNA、RNA:DNA、またはDNA:DNA2本鎖分子を包含する。
「増幅オリゴヌクレオチド」とは、標的核酸にハイブリダイゼーションし、核酸合成のためのプライマーおよび／またはプロモーターとして作用しうる単離核酸を意味する。標的核酸鎖は核酸合成のための鋳型である。T7、T3およびSP6 RNAポリメラーゼのごときRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターを、転写媒介増幅に用いることができる。好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドは長さ12ないし100ヌクレオチド、より好ましくは長さ18ないし50ヌクレオチドである。
「核酸の増幅」または「標的の増幅」とは、少なくとも標的核酸配列を有する核酸分子の数を増加させることを意味する。
「ネガティブセンス」とは、リファレンス（すなわち、センス）核酸分子に完全に相補的な核酸分子を意味する。
「必須としてなる」または「必然的になる」というフレーズは、オリゴヌクレオチドが、特定のヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配列を有し、さらに４個までのさらなるヌクレオチド、あるいは２個までの欠失ヌクレオチドを有していてもよいことを意味する。よって、これらのフレーズは、配列の長さの限定および配列のバリエーションの限定を含む。いずれの付加または欠失も、オリゴヌクレオチドがそのクレイムされた特性、例えば、厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で非標的核酸よりも標的核酸に優先的にハイブリダイゼーションするというような特性を妨げない特定のヌクレオチド配列の実質的でないバリエーションである。オリゴヌクレオチドは、付加または欠失を伴わない特定の核酸配列に実質的に類似のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
「十分に相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸が、厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下において、検出のための安定なハイブリッドを形成する十分量の一連の相補的ヌクレオチドを有することを意味する。
II．マイコプラズマ・ニューモニエの検出
我々は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブおよび増幅オリゴヌクレオチドのための、マイコプラズマ・ニューモニエのrRNAまたはrDNA中の好ましい標的ヌクレオチド配列を同定した。ハイブリダイゼーションアッセイプローブはマイコプラズマ・ニューモニエを検出し、好ましくは、それを、既知でありおそらく最も密接に関連した分類学的または系統的近縁種および関係のあまりない生物から識別することができる。ヘルパープローブを用いて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブのその標的ヌクレオチド配列領域へのハイブリダイゼーションを容易にすることができる。増幅オリゴヌクレオチドはプライマーとして作用することができ、マイコプラズマ・ニューモニエの標的配列を増幅するためのプロモーター−プライマーの組み合わせの一部（すなわち、結合したプロモーター配列を有するプライマー）であってもよい。
原核生物（ウイルスを除く）は、5S rRNA、16S rRNAおよび23S rRNAをコードするrDNA遺伝子を含んでいる。マイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマタセエ（Mycoplasmataceae）科の他のメンバーのrRNA配列の一部または全部を、当業者に知られた核酸配列決定法により得た。配列相同性のある領域に基づいてこれらの配列を並置比較した。次いで、種間の配列バリエーションを並置比較した配列から同定した。次いで、これらの可変領域をハイブリダイゼーションアッセイプローブのための標的配列として用いた。
本発明核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、マイコプラズマ・ニューモニエを密接に関連したマイコプラズマから、好ましくはマイコプラズマ・ニューモニエの最も近い系統上の近縁種マイコプラズマ・ゲニタリウムから識別することができる。好ましい具体例において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブはマイコプラズマ・ニューモニエをマイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ブッカレ、およびマイコプラズマ・サリバリウムから識別することもできる。これらのマイコプラズマはヒトから単離されている。
rRNA配列の取得
実験的に、および公表された方法から配列の情報を得た（Weisburg et al.,J.Bacteriol 171:6455（1989）参照）。当該分野において知られた標準的方法を用いて、種々の生物からrRNAを単離し配列決定することにより、実験的情報を得た。より詳細には、まず、原核生物間において殆ど相違しない保存領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いることによりrRNA配列の情報を得た。次いで、逆転写酵素およびデオキシリボヌクレオチドを用いてプライマーを伸長してcDNAを得た。ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いてcDNA核酸配列を決定した（例えば、Lane et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6955（1985））。
プローブ設計およびハイブリダイゼーション条件
ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、それらの標的配列にハイブリダイゼーションする。マイコプラズマ・ニューモニエの核酸に優先的にハイブリダイゼーションするようにハイブリダイゼーションアッセイプローブが設計され、ヘルパープローブはアッセイプローブのハイブリダイゼーションにおける助けとなりうる。増幅オリゴヌクレオチドは標的配列の増幅における助けとなる。ヘルパープローブまたは増幅オリゴヌクレオチドとして作用するオリゴヌクレオチドは、マイコプラズマ・ニューモニエの核酸に優先的にハイブリダイゼーションできる必要はない。
プローブの設計に用いる核酸配列の同定を容易にするために、まず、異なる生物由来のヌクレオチド配列を並べて相同性を最大にする。２次構造（部分的には分子内水素結合により生じる）と機能との間に密接な関連がrRNA分子中に存在する。この事実は、維持されるべき２次構造を生じる１次ヌクレオチド配列における進化論的変化に制限を課すものである。例えば、２重らせんの一方の「鎖」において塩基が変化している（分子内水素結合により、両方の「鎖」が同じrRNA分子の一部となっている）場合には、通常には補償的な置換が他方の「鎖」の１次配列に生じて相補性を保存し（これをコ−バリアンス（co−variance）という）、かくして、必要な２次構造が保存される。このことにより、２つの非常に異なったrRNA配列を、保存された１次配列ならびに保存された２次構造エレメントの両方に基づいて並置比較することができる。本明細書記載のハイブリダイゼーションアッセイプローブとして可能性のある標的配列を、並置比較された配列の相同性を記録することにより同定した。
各可変領域における配列の進化は最も多様性に富む。多様性のために、より離れたマイコプラズマ・ニューモニエの系統的関連種の対応rRNA可変領域は、系統的に密接な関連種のrRNAよりもマイコプラズマ・ニューモニエのrRNAから大きな隔たりを示す。我々は、好ましい標的部位を同定し、これら２つの生物の核酸間の相違を識別するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計するための、マイコプラズマ・ニューモニエとその密接な系統的関連種マイコプラズマ・ゲニタリウムとの間の十分な変化を観察した。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブのそれらの標的核酸への優先的ハイブリダイゼーションを、適当なハイブリダイゼーションアッセイ条件の選択および正しいプローブの設計により行うことができる。プローブ：標的核酸ハイブリッドの安定性をアッセイならびに洗浄条件に適合するように選択して、安定かつ検出可能なハイブリッドのみが非常に相補的な配列を有する核酸間に形成されるようにすべきである。１またはそれ以上の異なるアッセイパラメーターを操作することは、特定のハイブリダイゼーションアッセイプローブの正確な感度および特異性を決定する。
以下のガイドラインはプローブの設計および特異的かつ厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件の決定に有用である。適当な融解温度（Tm）を有するようにプローブを設計すべきである。プローブ長およびヌクレオチド組成（Ａ＋Ｔに対するＧ＋Ｃ含量）を変化させることにより適当なTmを得ることができる。好ましくは、最終的なアッセイが行われる温度よりも約２〜10℃高いTmに対応するようにプローブ長およびヌクレオチド組成を選択すべきである。
一般的には、オリゴヌクレオチドの最適ハイブリダイゼーション温度は、一定の２本鎖に関する融解温度よりも約５℃低い。最適温度よりも低い温度でのインキュベーションはミスマッチ塩基配列のハイブリダイゼーションを可能にし、それゆえ、特異性を減じる。オリゴヌクレオチドが長いほど塩基対間の水素結合が多くなり、一般的にはTmが高くなる。ＧおよびＣのパーセンテージの増加もまたTmを上昇させる。なぜなら、Ｇ−Ｃ塩基対はさらなる水素結合を示し、それゆえ、Ａ−Ｔ塩基対よりも大きな熱安定性を示すからである。かかる考え方は当該分野において知られている（例えば、Sambrookらの上記文献の第11章参照）。
Tm測定のための好ましい方法は、Arnoldらの上記「ホモジニアス・プロテクション・アッセイ」によるハイブリダイゼーション保護アッセイ（HPA）を用いるハイブリダイゼーションの測定である。以下の方法でHPAを用いてTmを測定することができる。プローブ分子をアクリジニウムエステルで標識する。過剰量の標的を用いて、プローブ：標的ハイブリッドをコハク酸リチウムバッファー（0.1Mコハク酸リチウムバッファー、pH5.0、2mM EDTA、2mM EGTA、10％（w/v）ラウリル硫酸リチウム）中で形成させる。次いで、核酸ハイブリッドを含有する溶液の一部をコハク酸リチウムバッファー溶液で希釈し、予想Tm（典型的には55℃）よりも低い温度から初めて２〜５℃きざみで種々の温度で５分間インキュベーションする。次いで、この溶液を弱アルカリ性ホウ酸バッファー（0.15Mテトラホウ酸ナトリウム、pH7.6、５％（v/v）TRITON▲Ｒ▼Ｘ−100）で希釈し、低温（例えば50℃）で10分間インキュベーションする。
これらの条件下で、１本鎖プローブに結合したアクリジニウムエステルは加水分解されるが、ハイブリダイゼーションしたプローブに結合したアクリジニウムエステルは加水分解から相対的に保護される。かくして、加水分解処理後に残存するアクリジニウムエステル量はハイブリッド分子数に比例する。過酸化水素およびアルカリを溶液に添加することにより残存アクリジニウムエステルから生じる化学発光をモニターすることによって残存アクリジニウムエステルを測定することができる。化学発光をルミノメーター（例えば、Gen−ProbeのLEADER▲Ｒ▼ＩまたはLEADER▲Ｒ▼50）で測定することができる。得られたデータを、温度に対して最大シグナルのパーセント値としてプロットする（通常には最も低温から）。最大シグナルの50％が残存している温度としてTmを決定する。上記方法以外に、当業者に知られたアイソトープ法によってTmを決定してもよい（例えば、Hoganらの上記文献参照）。
一定のハイブリッドのTmは、用いるハイブリダイゼーション溶液の性質に応じて変化する。塩濃度、界面活性剤、および他の溶質のごときファクターは、熱変性を行っている間のハイブリッドの安定性に影響しうる（J.Sambrookらの上記文献参照）。プローブが標的にハイブリダイゼーションするイオン強度および温度のごとき条件を、プローブ構築の際考慮すべきである。ハイブリッド核酸の熱安定性は反応混合物のイオン強度に伴って上昇する。他方では、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアルコール類のごとき水素結合を破壊する化学試薬はハイブリッドの熱安定性を大幅に低下させうる。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブのその標的への特異性を確認するために、非常に厳密な条件下で標的核酸にのみハイブリダイゼーションするプローブを設計することが好ましい。非常に相補的な核酸ハイブリッドは非常に厳密な条件下でハイブリッドを形成する。したがって、アッセイ条件の厳密性は、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間に存在すべき相補性の量を決定する。プローブ：標的ハイブリッドと、生じ得るプローブ：非標的ハイブリッドとの間の安定性の相違が最大となるように厳密性を選択すべきである。
非標的生物の配列に対して完全な相補性を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの長さを最短にし、非標的核酸に相補的なＧおよびＣに富む領域を避け、非標的配列に対する不安定化ミスマッチをできる限り多く含むようにすることにより、正しい特異性を達成することができる。プローブが特定のタイプの生物のみの検出に適したものであるかどうかは、プローブ：非標的ハイブリッドとプローブ：標的ハイブリッドとの間の熱安定性の相違による。プローブの設計において、これらのTm値の相違をできる限り大きくすべきである（好ましくは２℃〜５℃あるいはそれ以上）。
標的核酸配列領域の長さ、そしてそれゆえ標的領域に実質的に相補的なハイブリダイゼーションプローブの長さも重要である。いくつかの場合において、所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブの設計に使用されうる、特定の標的領域由来の位置および長さが異なるいくつかのヌクレオチド配列が存在しうる。他の場合において、１の配列は、たった１個の塩基が異なるだけの他の配列よりも特異性が有意に良好なものであるかもしれない。完全には相補的でない核酸がハイブリダイゼーションすることは可能であるが、一般的には、完全に相補的なヌクレオチドの最長の並びがハイブリッドの安定性を決定する。
ハイブリダイゼーションに対して阻害的な強力な内部構造を形成することが知られているrRNAの領域はあまり好ましくない標的領域である。同様に、自己相補性の強いプローブを避けるべきである。鎖が全体的または部分的に分子内または分子間ハイブリッドに関与する場合、それは新たな分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成にはあまり関与しないであろう。リボゾームRNA分子は水素結合によって非常に安定な分子内らせんおよび２次構造を形成することが知られている。ハイブリダイゼーション条件下で実質的に１本鎖のままである標的核酸の領域に対するプローブを設計することにより、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションの速度および程度を増加させることができる。
ゲノムrDNA標的は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の生成物と同様、本来的には２本鎖形態で存在する。これらの２本鎖標的はハイブリダイゼーション前に変性を必要とする。適当な変性およびハイブリダイゼーション条件は当該分野において知られている（例えば、E.M.Southern,J.Mol.Biol.98:503（1975））。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブ用の特定の厳密なハイブリダイゼーション条件の例を後で説明する。当業者は本発明開示に基づいて厳密なハイブリダイゼーション条件のさらなるセットを決定することができる（例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）第11章参照）。
ヘルパープローブ
HoganおよびMillimanの米国特許第5,030,557に記載のごとく、「ヘルパープローブ（Helper Probes）」を用いることにより、アッセイプローブとその標的核酸との核酸ハイブリダイゼーション速度が促進される。ヘルパープローブはそれらの標的核酸配列に対して十分に相補的であり、ヘルパープローブ：標的２本鎖を厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で形成する。一定のヘルパープローブとともに用いられる厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが標的配列に優先的にハイブリダイゼーションするように用いられる条件によって決定される。
厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下においてさえ、１本鎖RNAおよびDNAの領域を２次および３次構造に含ませることができる。かかる構造は、標的領域へのハイブリダイゼーションアッセイプローブのハイブリダイゼーションを立体的に阻害し、あるいはブロックすることができる。ヘルパープローブのハイブリダイゼーションは標的核酸の２次および３次構造を変化させ、そのことにより、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ標的領域をよりアクセス可能なものとする。結果として、ヘルパープローブは、標的：ハイブリダイゼーションプローブ２本鎖のキネティクスおよび／またはTmを上昇させる。一般的には、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ標的領域の近くに存在する核酸配列にハイブリダイゼーションするようにヘルパープローブを選択する。
本発明ハイブリダイゼーションアッセイプローブとともに用いることのできるヘルパープローブは、SEQ.ID.NO.33、36、39、45、48、51、54、57、60、64、67、70、73、76および79により示される核酸配列を標的とする。好ましくは、プローブは長さ12ないし100ヌクレオチドであり、10ヌクレオチドの標的領域を含み、好ましくは、その10個のヌクレオチドの少なくともうち９個が標的配列に存在する核酸配列に対して完全に相補的である。
本発明における有用なヘルパープローブの例は、下記ヌクレオチド配列（5'から3'方向に記載）：
およびそれらに対するRNA同等物（SEQ.ID.NO.34、37、40、46、49、52、55、58、62、65、68、71、74、77および80）
を有する、あるいはそれらから必然的になる、あるいはそれらからなるものである。
好ましくは、下記ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブの組み合わせを用いる。
増幅オリゴヌクレオチド
プライマーまたはプロモーター−プライマーのセットを用いて観察される増幅の程度は、オリゴヌクレオチドがそれらの特異的標的配列にハイブリダイゼーションする能力およびそれらがRNAポリメラーゼにより伸長されあるいは認識される能力を包含するいくつかのファクターによる。異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドを用いることができるが、より好ましい増幅オリゴヌクレオチドは18〜50塩基の標的結合領域および約65℃の予想Tmを有する。
標的配列の5'側の増幅オリゴヌクレオチドおよび標的配列の3'側の増幅オリゴヌクレオチドを用いて核酸分子上に存在する標的核酸配列を増幅することができる。増幅オリゴヌクレオチドにとり好ましい標的部位は長さが約15塩基よりも長い領域である。増幅オリゴヌクレオチドにより決定される増幅領域は、好ましくは、約350塩基、より好ましくは150塩基以内である。
Tm、相補性および２次構造のごときプローブハイブリダイゼーションに影響するパラメーターはプライマーハイブリダイゼーションにも影響し、それゆえ、増幅オリゴヌクレオチドの性能に影響する。プローブの設計に関する上記セクションで述べたこれらの考慮事項を増幅条件に応じて修飾することができる。例えば、低い厳密性の条件下で増幅を行い、次いで、診断的ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で増幅を行うことができる。
非特異的伸長（プライマー−ダイマーまたは非標的−標的の複製）の程度は増幅効率に影響しうる。好ましくは、特に配列の3'末端において低い自己−または交差−相補性を有するようにプライマーを選択する。好ましくは、長いホモポリマー区域および高いGC含量を避けて見かけ上のプライマー伸長を回避する。コンピュータープログラムが市販されており、この態様の設計に役立つ。
III．オリゴヌクレオチド合成
シアノエチルホスホラミダイト前駆体を用いる自動固相化学合成（Barone et al.,Nucleic Acids Research 12:4051（1984））を包含するいくつかのよく知られた方法のいずれかにより、そしてSambrook et al.,上記文献の第11章記載のごとく、決定されたオリゴヌクレオチドを製造することができる。オリゴヌクレオチドの合成および精製後、いくつかの異なる方法を用いてサイズおよび純度に関してオリゴヌクレオチドの許容性を調べることができる。かかる方法はポリアクリルアミドゲル電気泳動および高圧液体クロマトグラフィーを包含する。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブを、よく知られた方法（J.Sambrookらの例えば上記文献）のいずれかによりレポーター基（reporter group）で標識してもよい。有用な標識は放射性同位元素および非放射性レポーティング基（reporting group）を包含する。アイソトープ標識は、3H、35S、32P、125I、57Coおよび14Cを包含する。ニックトランスレーション、エンドラベリング（end labeling）、セカンドストランド合成（second strand synthesis）、逆転写のごとき当該分野で知られた方法、および化学的方法によりアイソトープ標識をオリゴヌクレオチド中に導入することができる。放射性標識プローブを使用する場合、オートラジオグラフィー、シンチレーションカウンティング、またはガンマカウンティングのごとき方法によりハイブリダイゼーションを検出することができる。選択される検出方法は標識に使用する個々のラジオアイソトープにより異なる。
非アイソトープ材料を標識に使用することもでき、ヌクレオチド間に導入してもよくあるいはオリゴヌクレオチド末端に導入してもよい。修飾ヌクレオチドを酵素的あるいは化学的に導入することができる。当該分野で知られた方法を用いるオリゴヌクレオチド合成中または合成後にオリゴヌクレオチドの化学修飾を行ってもよい。例えば、「ヌクレオチドプローブ用非ヌクレオチド結合試薬（Non−Mucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes）」というタイトルのArnoldらのEPO出願第88308766.0号（公開第313219号）（参照により本明細書に記載されているものと見なす）により記載された非ヌクレオチドリンカー基の使用による。非アイソトープ標識は蛍光分子、化学発光分子、酵素、コファクター、酵素基質、およびハプテンまたは他のリガンドを包含する。
好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブアッセイをアクリジニウムエステルで標識する。「ヌクレオチドプローブのアクリジニウムエステル標識および精製（Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes）」というタイトルの、1993年２月９日付与のArnoldらの米国特許第5,185,439号（参照により本明細に記載されているものと見なす）により記載されたようにしてアクリジニウムエステル標識を行うことができる。
IV．実施例
本発明の異なる態様および具体例を説明する実施例を以下に記載する。実施例は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、または増幅オリゴヌクレオチドの特定のヌクレオチド配列を有する、それらを必須としてなる、および実質的にそれらに類似のオリゴヌクレオチドを得ることのできる方法論を説明する。これらの実施例は開示された発明を何ら限定しない。
まず、マイコプラズマ・ニューモニエ（ATCC番号15531）ならびにマイコプラズマ・ゲニタリウム（ATCC番号33530）、あるいは公表された16S配列由来のrRNAに相補的なプライマーを用いて、予想される標的領域を配列決定することにより、マイコプラズマ・ニューモニエに特異的なプローブを設計した。これらの配列を比較して可変領域を決定した。さらに、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（mycoplasma hyopneumoniae）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Mycoplasma agalactiae）、マイコプラズマ・リフォフィルム（Mycoplasma liphophilium）、マイコプラズマ・カリフォルニクム（Mycoplasma californicum）、マイコプラズマ・ボビゲニタリウム（Mycoplasma bovigenitalium）、マイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivarium）、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、マイコプラズマ・アルトリチジス（Mycoplasma Arthritidis）、マイコプラズマ・アルギニニ（Mycoplasma arginini）、マイコプラズマ・プルモニス（Mycoplasma pulmonis）、マイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）、マイコプラズマ・イミタンス（Mycoplasma imitans）、マイコプラズマ・イオワエ（Mycoplasma iowae）、マイコプラズマ・ムリス（Mycoplasma muris）、マイコプラズマ・ピルム（Mycoplasma pirum）、マイコプラズマ・ガリセプチクム（Mycoplasma gallisepticum）、およびユー・ウレアリチクム（U.urealyticum）を包含する系統的に近い近縁種のrRNA配列をマイコプラズマ・ニューモニエのrRNAと比較して可変領域を決定した。
下記ヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを以下の実施例において特徴づけた：
「ヌクレオチドプローブ用非ヌクレオチド結合試薬」と題されたArnoldらの上記文献により記載されたようにして非ヌクレオチドリンカーを用いてプローブを合成し、次いで、Arnoldらの米国特許第5,185,439号により記載されたようにして化学発光アクリジニウムエステルで標識した。２段階のハイブリダイゼーションおよび分離フォーマット（結果を表３、４および５に示す）または単一段階のホモジニアスアッセイフォーマット（結果を用２、６および７に示す）を用いて、マイコプラズマ・ニューモニエ核酸用プローブの反応性および特異性を示した。これらの方法は、Arnoldらの上記「ホモジニアス・プロテクション・アッセイ（Homogeneous Protection Assay）」;ArnoldらのEPO出願第0281390号「多価カチオン性支持体および核酸精製、分離ならびにハイブリダイゼーション（Poycationic Supports and Nucleic Acid Purifucation,Separation and Hybridization）」、およびArnold et al.,Clin.Chem.,35:1588（1989）（これらすべてを参照により本明細書に記載されているものと見なす）に記載されている。
結果を、ルミノメーターにより検出された光子の測定値である相対光ユニット（relative light unit）（RLU）として示す。細胞溶解物中の核酸にプローブを細胞溶解物中の核酸または精製RNAにハイブリダイゼーションさせた。Sambrookらの上記文献に一般的に説明されているようにして精製RNAを得た。MurphyらのEPO公開第288618号「細胞からのRNAおよびDNAの遊離方法（Method for Releasing RNA and DNA from Cells）」（参照により本明細書に記載されているものと見なす）により記載されたようにして、溶解物、特に、マイコバクテリア、グラム陽性生物、または酵母の溶解物を得ることができる。以下の実施例は、マイコプラズマ・ニューモニエのrRNA配列を標的とするハイブリダイゼーションアッセイプローブ、または対応遺伝子、およびハイブリダイゼーションアッセイにおけるそれらの使用を説明する。
実施例1:マイコプラズマ・ゲニタリウム核酸へのハイブ リダイゼーションに対するマイコプラズマ・ニューモニ エ核酸へのハイブリダイゼーション
マイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマ・ゲニタリウムのrRNAへの個々のアクリジニウムエステル標識プローブのハイブリダイゼーションを評価した。100mlの0.05Mコハク酸リチウム pH5、0.6M LiCl、１％（w/v）ラウリル硫酸リチウム、10mM EDTA、10mM EGTA中、60℃で30分間、精製RNA（50ng）をプローブミックスとハイブリダイゼーションさせ、次いで、300μｌの0.15Mテトラホウ酸ナトリウム pH8.5、１％TRITON▲Ｒ▼Ｘ−100を添加して60℃で８〜９分間置いた。0.16pmolのハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび0.4pmolのヘルパープローブを用いて各試料を２系で試験した。1mM硝酸中0.1％過酸化水素を注入し、次いで、1N水酸化ナトリウム溶液を注入することによりアクリジニウムエステルのシグナル発生をルミノメーターで読んだ。
表２に示すように、マイコプラズマ・ニューモニエ核酸を標的とするプローブは、マイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ゲニタリウムを容易に識別する。この表のデータはRLUで示され、バックグラウンドまたは負の対照値を差し引いていない。２系の実験の結果を報告する。SEQ.ID.NO.1により示されるヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.9および10のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。SEQ.ID.NO.2のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.11および12のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。SEQ.ID.NO.3のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.13および14のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。SEQ.ID.NO.4のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.15および16のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。SEQ.ID.NO.5のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.17のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。SEQ.ID.NO.6のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、ヘルパープローブなしで用いた。SEQ.ID.NO.7のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.18のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。SEQ.ID.NO.8のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.19および20のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。
データは、各プローブがマイコプラズマ・ニューモニエの標的rRNAとよく反応したことを示す。プローブ２、３、４、５、６および７はマイコプラズマ・ゲニタリウム標的についてはバックグラウンドシグナル以上の有意な反応を示さなかった。SEQ.ID.NO.8のヌクレオチド配列を有するプローブを含有するプローブミックスおよびSEQ.ID.NO.1のヌクレオチド配列を有するプローブを含有するプローブミックスは、これらのアッセイ条件下で50ngのマイコプラズマ・ゲニタリウムのrRNAと混合した場合、バックグラウンドよりもわずかに大きいシグナルを示した。この量の精製rRNAは約2x1010コピーのrRNA、または約2000万個の細菌に相当する。
実施例2:マイコプラズマ・ニューモニエ核酸への優先的 ハイブリダイゼーション
この実施例は、ハイブリダイゼーションおよび分離アッセイフォーマットにおける、マイコプラズマ・ニューモニエのrRNAを標的とするアクリジニウムエステル標識プローブを含有するプローブ混合物の、種々のマイコプラズマ・ニューモニエ株を検出するが他の微生物を検出しないという能力を説明する。このフォーマットは、上記ホモジニアス・アッセイ・フォーマット（homogeneous assay format）よりも低いバックグラウンドシグナルを与え、表２に示すデータを得るために用いられる。プローブ混合物は、下記ヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを含んでいた：
および未標識ヘルパープローブ（SEQ.ID.NO.9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19および20）。
表３は、106〜108個の生物を含有する液体ブロス培養物から遊離された過剰のRNAに対するプローブミックスを用いて得られたデータを示す。各試料に関して、0.19Mコハク酸リチウム pH5、0.62Mラウリル硫酸チリウム、3mM EDTA、3mM EGTAおよびプローブミックスを含有するハイブリダイゼーション溶液を、同体積の細胞溶解物（約100ngのrRNA）と混合し、60℃で１時間インキュベーションした。次いで、0.19Mテトラホウ酸ナトリウム pH7.5、６％（v/v）TRITON▲Ｒ▼Ｘ−100を含有する溶液中でハイブリッドをマグネチックアミンマイクロスフェア（magnetic amine microsphere）（Perseptive Biosystems,Inc.,Cambridge,MA）に結合させ、20mMテトラホウ酸ナトリウム pH10.4を含有する溶液で１回洗浄した。微粒子に結合したハイブリダイゼーションしたアクリジニウムエステル標識プローブからの化学発光を実施例１記載のごとくルミノメーターで測定した。表３のデータは、プローブミックスがマイコプラズマ・ニューモニエの存在を示し、いくつかの密接に関連したマイコプラズマ、アコレプラズマ（Acholeplasma）、ウレアプラズマ（Ureaplasma）およびスピロプラズマ（Spiroplasma）からマイコプラズマ・ニューモニエを識別することを示す。
全−細菌／酵母プローブ混合物を陽性対照として用いて細菌核酸の存在を示した（データ示さず）。上記Hoganらの「非ウイルス生物の検出および／または定量のための核酸プローブ（Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non−Viral Organisms）」は、適当なすべての細菌／酵母プローブ混合物を示すものである。
Gen−Probe LEADER▲Ｒ▼Ｉルミノメーターで化学発光を測定し、データを正味の相対光ユニット（シグナルから、1ngの非マイコプラズマrRNAを含有する試料を用いて得られた値を差し引く）で表現する。プローブミックスは、いくつかのマイコプラズマ単離体に対して低レベルの交差反応性を示した。
実施例3:交差反応性の程度の測定
交差反応性の程度を測定するために、RNA量を減少させて、ハイブリダイゼーションおよび分離フォーマットにおける可能なカットオフ値である300RLUより大きいかまたは等しい正味のシグナルを生じるのに必要なRNA量を決定した。実施例２のプローブミックスおよびプロトコールを用いた結果を表４に示す。
マイコプラズマ・ニューモニエのRNAとの反応性とは対照的に、プローブミックスはこれら５種の単離体とは低い反応性を示した。陽性の結果を得るためには10ngより多いマイコプラズマ・ガリセプチクムおよびマイコプラズマ・ピルムのRNAが必要とされた。３種のマイコプラズマ・ゲニタリウムのRNAの交差反応性はいくぶん高かったが、マイコプラズマ・ニューモニエのrRNAとマイコプラズマ・ゲニタリウムのrRNAとの間にはやはり400倍の相違があった。臨床的標本における交差反応性はバックグラウンド以上の検出可能なものとは期待されない。
実施例4:優先的プローブハイブリダイゼーション
表５は、実施例２記載のアッセイフォーマットを用い、実施例２記載のプローブミックスが、微生物の系統上のクロスセクションを示す27の細菌属からマイコプラズマ・ニューモニエを識別することを示す。この実験において対照として用いた全−細菌／酵母プローブ混合物は細菌の存在を示した（データ示さず）。
実施例5:増幅された標的の検出
この実施例は、核酸増幅生成物を検出するためのマイコプラズマ・ニューモニエのハイブリダイゼーションアッセイプローブの使用を説明する。この実施例において、標的rRNA核酸と同じセンスのマイコプラズマ・ニューモニエのハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて標的核酸増幅の生成物を検出した。SEQ.ID.NO.51のヌクレオチド配列を有するプライマーおよびSEQ.ID.NO.82のヌクレオチド配列を有しプロモーター配列5'−AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA−3'（SEQ.ID.NO.92）を5'末端に含むプロモーター−プライマーを用いて、マイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマ・ゲニタリウムのrRNAを別々に増幅した。Perkin−Elmerサーモサイクラーを用いて下記のごとく増幅を行った:0.3μＭのプロモーター−プライマー、0.3μＭのプライマー、50mM Tris−HCl,pH7.6、25mM KCl、17.5mM MgCl2、20mM Ｎ−アセチルシステイン、2.5mM rATP、2.5mM rCTP、2.5mM rGTP、2.5mM rUTP、1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTPおよび1mM dTTPを含有する溶液100μｌ中で標的核酸を95℃で15分加熱し、42℃に冷却した。900ユニットのMMLV逆転写酵素および400UのT7 RNAポリメラーゼをそれぞれの反応液に添加し、混合した（Kacianらの上記「核酸配列増幅法、成分およびキット（Nucleic Acid Sequence Amplification Method,Composition,and Kit）」参照）。42℃で２時間インキュベーション後、実施例１記載の条件を用い、標的rRNAと同じセンスの0.12pmolのアクリジニウムエステル標識プローブ（SEQ.ID.NO.24）を用いるハイブリダイゼーションアッセイにそれぞれの反応混合物を全部供した。各標的核酸に関する結果は５系の同じ反応の平均である。
表６に示すデータは、マイコプラズマ・ニューモニエのrRNAに相補的な核酸配列を標的とするハイブリダイゼーションアッセイプローブの、標的増幅法による生成物を検出する能力および特異性を示す。
実施例6:増幅標的の検出
この実施例もまた、増幅された核酸の検出を説明する。マイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマ・ゲニタリウム由来の核酸を、95℃、その後、55℃（30秒）、60℃（60秒）ついで95℃（60秒）で30ラウンド、次いで、60℃で７分加熱することにより増幅した。50mM塩化カリウム、10mM Tris−HCl pH8.3、1.5mM塩化マグネシウム、0.25mM dATP、0.25mM dTTP、0.25mM dGTP、0.25mM dCTP、2.5UのTaqポリメラーゼ、１μＭのプライマー（SEQ.ID.NO.83）および１μＭのプライマー（SEQ.ID.NO.84）を含有する溶液100μｌ中で増幅を行った。SEQ.ID.NO.85のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブおよびSEQ.ID.NO.9および10のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとのハイブリダイゼーションにより、あるいはマイコプラズマ・ゲニタリウムのrRNAに完全に相補的なヌクレオチドに指向されたプローブ（SEQ.ID.NO.86）とのハイブリダイゼーションにより、最終反応物のうち10μｌをアッセイした。
これらの結果は、SEQ.ID.NO.85のヌクレオチド配列を有するプローブはマイコプラズマ・ニューモニエに特異的であり、そのプローブを用いてRNA標的のみならずDNA標的を検出できることを示す。
上記の種々の実施例において示されたデータは、本明細書記載のハイブリダイゼーションプローブはマイコプラズマ・ニューモニエをその最も近い系統上の近縁種から識別できることを確認するものである。さらにそのうえ、相補的オリゴヌクレオチドプローブは核酸増幅法の生成物を検出することができた。
他の具体例は下記請求の範囲内である。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：ジェン−プローブ・インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：マイコプラズマ・ニューモニエ核酸を標的とする核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブおよび増幅オリゴヌクレオチド
（iii）配列の数:92
（iv）連絡先：
（Ａ）宛て名：ライオン・アンド・ライオン
（Ｂ）通り名：ウェスト・フィフス・ストリート633スイート4700
（Ｃ）都市名：ロサンジェルス
（Ｄ）州名：カリフォルニア
（Ｅ）国名：アメリカ合衆国
（Ｆ）ZIP:90071
（ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：
（Ａ）メディウム・タイプ:3.5インチディスケット、用量1.44Mb
（Ｂ）コンピューター:IBM PC
（Ｃ）オペレーティング・システム:MS DOS（バージョン6.0）
（Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト（バージョン5.1）
（vi）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（vii）先の出願データ：先の出願は下記出願を含めて全部で１つ
（Ａ）出願番号:08/297,299
（Ｂ）1994年８月29日
（viii）代理人等の情報：
（Ａ）氏名：ヘーバー，シェルドン・オー
（Ｂ）登録番号:38,179
（Ｃ）代理人等における処理番号:208/130−PCT
（ix）テレコミュニケーションの情報：
（Ａ）電話番号：（213）489−1600
（Ｂ）ファックス番号：（213）955−0440
（Ｃ）テレックス:67−3510
（２）配列番号:1に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:35塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:1:
（２）配列番号:2に関する情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:2:
（２）配列番号:3に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:22塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:3:
（２）配列番号:4に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:25塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:4:
（２）配列番号:5に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
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（Ｃ）鎖の数:1本
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（xi）配列の記載：配列番号:5:
（２）配列番号:6に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:26塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:6:
（２）配列番号:7に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:20塩基対
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（Ｃ）鎖の数:1本
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（２）配列番号:8に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
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（Ｃ）鎖の数:1本
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（２）配列番号:9に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:10に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:11に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:12に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:13に関する情報：
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（２）配列番号:14に関する情報：
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（２）配列番号:15に関する情報：
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（２）配列番号:16に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:17に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:29塩基対
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（２）配列番号:18に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:41塩基対
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（Ｃ）鎖の数:1本
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（２）配列番号:19に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:42塩基対
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（Ｃ）鎖の数:1本
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（２）配列番号:20に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:21に関する情報：
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（２）配列番号:22に関する情報：
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（２）配列番号:23に関する情報：
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（２）配列番号:24に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:25に関する情報：
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（２）配列番号:26に関する情報：
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（２）配列番号:27に関する情報：
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（２）配列番号:29に関する情報：
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（２）配列番号:34に関する情報：
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（２）配列番号:36に関する情報：
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（２）配列番号:37に関する情報：
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（２）配列番号:38に関する情報：
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（２）配列番号:39に関する情報：
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（２）配列番号:40に関する情報：
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（２）配列番号:41に関する情報：
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（２）配列番号:42に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:43に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
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（２）配列番号:44に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:45に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:53塩基対
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（２）配列番号:46に関する情報：
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（２）配列番号:47に関する情報：
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（２）配列番号:48に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:49に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:45塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
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（２）配列番号:50に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:45塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
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（xi）配列の記載：配列番号:50:
（２）配列番号:51に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:32塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:51:
（２）配列番号:52に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:32塩基対
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（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:52:
（２）配列番号:53に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:32塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:53:
（２）配列番号:54に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:37塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:54:
（２）配列番号:55に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:37塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:55:
（２）配列番号:56に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:37塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:56:
（２）配列番号:57に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:44塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:57:
（２）配列番号:58に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:41塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:58:
（２）配列番号:59に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:44塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:59:
（２）配列番号:60に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:60:
（２）配列番号:61に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:61:
（２）配列番号:62に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:62:
（２）配列番号:63に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:63:
（２）配列番号:64に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:36塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:64:
（２）配列番号:65に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:36塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:65:
（２）配列番号:66に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:36塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:66:
（２）配列番号:67に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
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（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:67:
（２）配列番号:68に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
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（２）配列番号:69に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
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（xi）配列の記載：配列番号:69:
（２）配列番号:70に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:71に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:29塩基対
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（２）配列番号:72に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:29塩基対
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（２）配列番号:73に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:41塩基対
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（xi）配列の記載：配列番号:73:
（２）配列番号:74に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:75に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:76に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（xi）配列の記載：配列番号:76:
（２）配列番号:77に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（xi）配列の記載：配列番号:77:
（２）配列番号:78に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（xi）配列の記載：配列番号:78:
（２）配列番号:79に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:34塩基対
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（２）配列番号:80に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
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（２）配列番号:81に関する情報：
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（２）配列番号:82に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
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（２）配列番号:83に関する情報：
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（２）配列番号:84に関する情報：
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（Ａ）配列の長さ:23塩基対
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（２）配列番号:85に関する情報：
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（２）配列番号:86に関する情報：
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（２）配列番号:87に関する情報：
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（２）配列番号:88に関する情報：
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（２）配列番号:89に関する情報：
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（２）配列番号:90に関する情報：
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（２）配列番号:91に関する情報：
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（２）配列番号:92に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:27塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
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（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:92:
記載され、クレイムされた発明は、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasmapneumoniae）核酸を標的とするオリゴヌクレオチドの設計および使用に関する。ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブおよび増幅オリゴヌクレオチドを包含する異なるタイプのオリゴヌクレオチドを記載する。詳細には、該オリゴヌクレオチドは、喉の綿棒かきとり物、組織試料、体積、実験溶液および培養物のごとき試験試料中のマイコプラズマ・ニューモニエ種の検出に有用である。
発明の背景
塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアンニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、またはイノシン（Ｉ）を包含するヌクレオチドから生成される１本鎖のデオキシリボ−（「DNA」）またはリボ−（「RNA」）核酸をハイブリダイゼーションさせて、相補的塩基のペアー間の水素結合により保持された２本鎖構造を形成することができる。一般的には、ＡはＴまたはＵと水素結合し、ＧまたはＩはＣと水素結合する。鎖に沿って、典型的な塩基対ATもしくはAU、TAもしくはUA、GC、またはCGが存在する。さらに、いくつかのミスマッチ塩基対（例えば、AG、GU）が存在しうる。
十分な一連の相補的塩基を含む２本の１本鎖核酸は、それらのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、２本鎖核酸を生じる。適当な条件下で、DNA/DNA、RNA/DNA、またはRNA/RNAハイブリッドが生成しうる。
特定の核酸配列を検出するための核酸ハイブリダイゼーションの使用の技術的背景となる記載は、1989年７月25日付与のKohneの米国特許第4,851,330号、および「非ウイルス生物の検出および／または定量のための核酸プローブ」という名称のHoganらの国際特許出願PCT/US87/03009にあり、ともに参照によリ本明細書に記載されているものと見なす。Hoganら（上記）は、試料（例えば、痰、尿、血液および組織片）中の非ウイルス生物または非ウイルス生物群の存在の検出方法を記載している。
マイコプラズマ・ニューモニエは、分類学上モリクテス（Mollicutes）クラスにある原核生物である。モリクテスは細菌性細胞壁を欠き、小さなゲノムサイズを有する。それらは自由生活性微生物のうち最小のもののいくつかであると考えられている。マイコプラズマ・ニューモニエは、急性呼吸器疾患を引き起こすヒトの主要な病原体である。それは最もありふれた不規則な肺炎の原因であり、すべての肺炎のケースの15〜20％の原因である。
マイコプラズマ・ニューモニエを検出するためのゲノム配列に指向されたDNAハイブリダイゼーションアッセイプローブは、Hyman et al.,J.Clin.Microbiol.25:726〜728（1987）、Buck et al.,J.Clin.Microbiol.30:3280〜3283（1992）、およびBernet et al.,J.Clin.Microbiol.27:2492〜2495（1989）により述べられている。マイコプラズマ・ニューモニエのリボゾームDNA（rRNA）に指向されたプローブは、Tilton,Diagn.Microbiol.Infec.Dis.10:109〜112（1988）、Yogev et al.,J.Clin.Microbiol.26:1198〜1201（1988）、Gobel et al.,J.Gen Microbiol.133:1969〜1974（1987）、Hoganらの上記文献、ZivinおよびMonahanのEPO第305145号（出願第88307793.5号）、およびGobelおよびStanbridgeのEPO第250662号（出願第86304919.3号）、Kai et al.,J.Med.Microbiol.38:166〜170（1993）、van Kuppeveld et al.,Applied and Envir.Microbiol.58:2606〜2615（1992）、van Kuppeveld et al.,Applied and Envir.Microbiol.59:655（1993）により述べられており、Jensen et al.,APMIS 97:1046〜1048（1989）にはマイコプラズマ・ニューモニエの16S rRNA配列に指向されたプライマーが記載されている。WeisburgおよびPelletierのEPO出願第92305126.2号（公開番号0576743A1）には、マイコプラズマ・ニューモニエ、あるいは所望によりマイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマ・ゲニタリウムの核酸に対するプローブが述べられている。ここに述べた引用文献は先行技術となり得ない。
発明の概要
本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエ核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチドであって、マイコプラズマ・ニューモニエの検出を助けることに特に有用なオリゴヌクレオチドを記載する。該オリゴヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、および／または増幅プライマーとして作用することによってマイコプラズマ・ニューモニエ検出の助けとなりうる。ハイブリダイゼーションプローブは優先的にマイコプラズマ・ニューモニエの核酸標的領域にハイブリダイゼーションしてマイコプラズマ・ニューモニエの存在を示す検出可能な２本鎖を形成することができる。ヘルパープローブは、厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下でマイコプラズマ・ニューモニエの核酸標的領域にハイブリダイゼーションでき、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ：標的核酸２本鎖の形成を促進するために用いることができる。増幅プライマーは、増幅条件下でマイコプラズマ・ニューモニエの標的領域にハイブリダイゼーションでき、マイコプラズマ・ニューモニエの核酸を生成する増幅反応においてプライマーとして用いることができる。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブは、標的配列の相補的または実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する標的核酸領域を含んでいる。また、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、マイコプラズマ・ニューモニエの核酸に相補的であるかまたは相補的でない、標的核酸領域の外側の付加的ヌクレオチドを有していてもよい。好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは12〜100ヌクレオチドの長さであり、標的核酸領域は、標的配列に完全に相補的なヌクレオチド配列に実質的に類似している。
実質的に類似のヌクレオチド配列とは、同定されたヌクレオチド配列と同一、あるいはRNAまたはDNA同等物は別として20％未満のヌクレオチド塩基の相違を有するヌクレオチド配列であって、１またはそれ以上の密接に関連した生物のrRNAまたはrDNAよりもマイコプラズマ・ニューモニエのrRNAまたはrDNAに優先的にオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションすることを可能にするものである。マイコプラズマ・ニューモニエに密接に関連した生物は、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・オラレ（Mycoplasma orale）、マイコプラズマ・ブッカレ（Mycoplasma buccale）、マイコプラズマ・ファウシウム（Mycoplasma faucium）、およびマイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivalium）を包含する。優先的ハイブリダイゼーションは厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で起こりうる。一般的には、標的配列に対するオリゴヌクレオチド標的領域の相補性の程度の減少は、標的領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度および速度を低下させる。しかしながら、さらなる非相補的ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの非標的生物識別能を促進しうる。別の具体例において、実質的に類似とは、特定のヌクレオチド配列に対する10％の相違および５％の相違をいう。
「RNAおよびDNA同等物」とは、同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するRNAおよびDNA分子をいう。RNAおよびDNA同等物は異なる糖基（すなわち、デオキシリボース対リボース）を有し、RNA中のウラシルの存在およびDNA中のチミンの存在によって異なっていてもよい。RNAおよびDNA同等物の間の相違は実質的には対応核酸配列における相違の原因とならない。なぜなら、同等物は、特定の配列に対して同程度の相補性を有するからである。
マイコプラズマ・ゲニタリウムは、マイコプラズマ・ニューモニエに最も密接に関連していると思われ、マイコプラズマ・ニューモニエのrRNAと非常に類似したrRNA配列を有する。より離れた生物間で生じるより大きな系統的多様性のため、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、マイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ゲニタリウムとを識別でき、さらにマイコプラズマ・ニューモニエと無関係な微生物および好ましくは他のより遠い関連性を有するマイコプラズマとを識別することができる。よって、マイコプラズマ・ニューモニエの存在とマイコプラズマ・ゲニタリウムの存在とを識別できるハイブリダイゼーションアッセイプローブはマイコプラズマ・ニューモニエの検出に有用である。
ヒトにおいて見出されるマイコプラズマ種は、マイコプラズマ・ニューモニエ、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ブッカレ、マイコプラズマ・ファウシウム、およびマイコプラズマ・サリバリウムを包含する。好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、マイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ブッカレ、マイコプラズマ・ファウシウム、およびマイコプラズマ・サリバリウムからなる群より選択される微生物に存在する１またはそれ以上、より好ましくはすべての核酸よりも優先的にマイコプラズマ・ニューモニエの核酸にハイブリダイゼーションする。
よって、本発明の第１の態様は、マイコプラズマ・ニューモニエの標的核酸配列領域に優先的にハイブリダイゼーションすることのできるハイブリダイゼーションアッセイプローブを記載する。該ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、マイコプラズマ・ニューモニエの標的配列のリボゾームRNA（rRNA）またはDNA（rDNA）に相補的な標的核酸配列を有する。該ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、記載された標的配列領域の少なくとも一部分に対して少なくとも90％の相補性、好ましくは完全な相補性を有する。該一部分は少なくとも長さ10ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも長さ18ヌクレオチドである。
「優先的にハイブリダイゼーションする」とは、厳密なアッセイ条件下で、ハイブリダイゼーションアッセイプローブがそれらの標的核酸にハイブリダイゼーションして、標的核酸の存在を示す安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成することができ、密接に関連した非標的核酸の存在を示すに十分な数のプローブ：非標的ハイブリッドを形成しないことを意味する。よって、該プローブは、非標的核酸よりも十分に高程度に標的核酸にハイブリダイゼーションして、当業者がマイコプラズマ・ニューモニエの存在を検出し、その存在を密接に関連した生物の存在から識別することを可能にする。後で示す実施例中の方法のごとき、当業者に知られた方法および本明細書記載の方法を用いて、優先的ハイブリダイゼーションを測定することができる。好ましくは、標的ハイブリダイゼーションシグナルと非標的ハイブリダイゼーションシグナルとの間に少なくとも100倍の相違、より好ましくは少なくとも1000倍の相違、より好ましくは少なくとも10000倍の相違がある。好ましくは、非標的ハイブリダイゼーションシグナルはバックグラウンドレベル程度である。
マイコプラズマ・ニューモニエの「標的核酸配列領域」とは、マイコプラズマ・ニューモニエの核酸またはそれに相補的な配列に存在する核酸配列であって、密接に関連したマイコプラズマ種の核酸には存在しない核酸配列をいう。標的配列の相補的なヌクレオチド配列を有する核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）または転写媒介増幅（transcription mediated amplificarion）（例えば、kacianおよびFultz,Nucleic Acid Amplification Methods、欧州特許出願第90307503.4号）のごとき標的増幅方法により得ることができる。
関連した態様は、下記配列（5'から3'方向へと記載）：
これらのプローブは、マイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ゲニタリウムとの間で変化しているrRNAおよび／またはrDNAに存在する標的領域に相補的である。該プローブはマイコプラズマ・ニューモニエの核酸にハイブリダイゼーションし、マイコプラズマ・ニューモニエを密接に関連したマイコプラズマから識別し、マイコプラズマ・ニューモニエの存在の検出に有用である。好ましい具体例において、該プローブを用いて試料中に存在するマイコプラズマ・ニューモニエ量を測定することができる。
もう１つの態様はヘルパーオリゴヌクレオチドを記載する。ヘルパーオリゴヌクレオチドは：
好ましい具体例において、ヘルパープローブは、下記ヌクレオチド配列（5'から3'方向へと記載）：
を有する、あるいはこれらから必然的になる、あるいはこれらからなるオリゴヌクレオチドである。ヘルパープローブは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブと同じ標的核酸にハイブリダイゼーションでき、好ましくは長さ12ないし100ヌクレオチド、より好ましくは長さ18ないし50ヌクレオチドである。
これとは別に、いくつかのオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションアッセイプローブまたはヘルパープローブとして用いることができる。かかるオリゴヌクレオチドの例は、SEQ.ID.NO.5、６、または７のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドである。
本発明のもう１つの態様は、厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下でマイコプラズマ・ニューモニエを検出するためのプローブミックスを記載する。該プローブミックスはハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび少なくとも１つのヘルパープローブを含む。好ましい具体例において、異なるハイブリダイゼーションアッセイプローブとヘルパープローブの組み合わせを記載する。
本発明のもう１つの態様は、核酸ハイブリッドを含む組成物を記載する。該ハイブリッドは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびそれに実質的に相補的な核酸配列を有する核酸分子からなっている。形成されたハイブリッドの１の使用は標的配列の存在を検出することである。例えば、ハイブリッド中に存在するアクリジニウムエステル（「AE」）はアルカリ溶液中での加水分解に耐性であるが、１本鎖核酸中に存在するアクリジニウムエステルはアルカリ溶液中で加水分解される（「ホモジニアス・プロテクション・アッセイ（Homogeneous Protein Assay）」というタイトルのArnoldらのEPO出願第88308767.8号、参照により本明細書に記載されているものと見なす）。よって、未結合AE−標識プローブの加水分解後、核酸ハイブリッドに残存するアクリジニウムエステルの化学発光を測定することにより、AE−標識プローブの標的への結合を検出することができる。
もう１つの態様において、本発明は、マイコプラズマ・ニューモニエの標的領域の増幅に有用な増幅オリゴヌクレオチドに関する。好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドは、下記ヌクレオチド配列：
増幅オリゴヌクレオチド配列は、ブロックされた3'および／または5'末端、あるいはRNAポリメラーゼにより認識される特定の核酸配列（例えば、T7、T3、またはSP6 RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列）;RNAポリメラーゼによるRNA転写の開始または伸長を促進する配列；または分子内塩基対形成を提供し２次もしくは３次核酸構造の形成を促進する配列を包含する付加のごとき修飾（これらに限らない）を有していてもよい。
増幅オリゴヌクレオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応あるいはRNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼおよびRNase Ｈもしくはその同等物を用いる増幅反応のごとき核酸増幅方法（KacianおよびFlutzの上記文献、およびSninskyらの米国特許第5,079,351号により記載されており、これらを参照により本明細書に記載されているものと見なす）において用いることができる。
他の態様において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、および増幅オリゴヌクレオチドの使用方法を記載する。これらの方法は、ヒト標本から得られた試料をマイコプラズマ・ニューモニエの存在に関して試験することにおいて特に有用である。
本明細書記載のオリゴヌクレオチドおよびそれらの使用は、試験試料中のマイコプラズマ・ニューモニエ独自の特定rRNA配列の存在を同定し定量する迅速かつ客観的な方法を提供する。
本発明の他の特徴および利点は、本発明の好ましい具体例の説明および請求の範囲から明らかであろう。
好ましい具体例の説明
ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅オリゴヌクレオチド、および／またはヘルパープローブの設計に有用な標的ヌクレオチド配列を説明する。ハイブリダイゼーションアッセイプローブのための標的ヌクレオチド配列はマイコプラズマ・ニューモニエ核酸中に存在するが、密接に関連した生物には存在しないものである。マイコプラズマ・ニューモニエを検出するプローブの設計に有用であるばかりでなく、標的配列の同定は、マイコプラズマ・ニューモニエの増殖を阻害するオリゴヌクレオチドの設計の基礎をも提供する。例えば、微生物の増殖に必要なマイコプラズマ・ニューモニエ核酸を標的とするリボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドのごときオリゴヌクレオチドは核酸の活性を阻害しうるはずであり、そのことにより、マイコプラズマ・ニューモニエの増殖が阻害される。かかるオリゴヌクレオチドを用いてマイコプラズマ・ニューモニエに感染した患者を治療的に処置することができる。オリゴヌクレオチドのアンチセンス活性についてのより詳細な説明は、Helene,C and Toulme,J.Biochimica et Biophysica Acta 1049:99（1990）、およびUhlmann,E.and Peyman,A.Chemical Reviews 90:543（1990）のごとき刊行物にある。
Ｉ．定義
「標的核酸」とは、標的核酸配列を含む核酸を意味する。
「標的核酸配列」、「標的ヌクレオチド配列」または「標的配列」とは、特定のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列、あるいはそれらに完全に相補的な核酸配列を意味する。
「厳密な」ハイブリダイゼーションアッセイ条件とは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが優先的に標的核酸（好ましくは、マイコプラズマ・ニューモニエのrRNAまたはrDNA）とハイブリダイゼーションし、密接に関連した非標的微生物由来の核酸とはハイブリダイゼーションしない条件をいう。ハイブリダイゼーションアッセイプローブヌクレオチドの配列および長さ、密接に関連した非標的配列、および標的配列を包含するファクターにより厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件を変更してもよい。ハイブリダイゼーション条件は、温度、ハイブリダイゼーション試薬もしくは溶液の組成を包含する。
「オリゴヌクレオチド」とは、共有結合した２個またはそれ以上のヌクレオチドサブユニットを意味する。ヌクレオチドサブユニットの糖基はリボース、デオキシリボース、またはＯ−メチルリボースのごときそれらの修飾誘導体であってもよい。ヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合、修飾結合のごとき結合により、あるいはオリゴヌクレオチドの相補的標的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションを妨げる非ヌクレオチド部分により結合されていてもよい。修飾結合は、標準的なホスホジエステル結合が異なる結合、例えばホスホロチオエート結合またはメチルホスホネート結合で置き換えられている結合を包含する。
「プローブ」とは、標的核酸配列に十分に相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドであって、検出可能なハイブリッドオリゴヌクレオチド：標的２本鎖を厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で形成するオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは単離核酸である。厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションを妨げない限り、そしてハイブリダイゼーションアッセイの場合にプローブが優先的ハイブリダイゼーションを妨げない場合には、プローブが標的領域の外側にさらなるヌクレオチドを有していてもよい。プロモーター配列、RNA転写のための結合部位、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、または触媒活性部位のような所望の２次もしくは３次構造を付与する配列のごとき非相補的配列を用いて検出および／または増幅を容易にすることができる。化学合成および組み換え核酸分子からのインビトロもしくはインビボ発現のごとき当業者に知られた方法により一定の配列のオリゴヌクレオチドプローブを得ることができる。好ましくは、プローブは長さ12ないし100ヌクレオチド、より好ましくは長さ18ないし50ヌクレオチドである。
「ハイブリダイゼーションアッセイプローブ」とは、マイコプラズマ・ニューモニエの5S、16S、または23S rRNA、あるいは対応リボゾームDNA（「rDNA」）核酸、あるいは厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸に優先的にハイブリダイゼーションしうる単離核酸である。好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションを検出または確認するのに用いることのできるラジオアイソトープ、蛍光部分、化学発光部分、酵素、またはリガンドのごときレポーター基（reporter group）で標識されている。好ましくは、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは長さ12ないし100ヌクレオチドの間、より好ましくは長さ18ないし50ヌクレオチドの間である。
「単離核酸」とは、人間の介在なしには天然において見いだされない形態で存在するオリゴヌクレオチドまたは核酸分子を意味する（例えば、外来核酸と組み換えられたもの、単離され、あるいはある程度精製されたもの）。
「核酸ハイブイリッド」または「ハイブリッド」とは、２本鎖の、水素結合した領域であって、好ましくは長さ12ないし100ヌクレオチド、より好ましくは長さ18ないし50ヌクレオチドの領域を含む安定な核酸構造を意味する。構造は十分に安定であり、化学発光または蛍光検出、オートラジオグラフィー、またはゲル電気泳動のごとき手段により検出される。かかるハイブリッドはRNA:RNA、RNA:DNA、またはDNA:DNA2本鎖分子を包含する。
「増幅オリゴヌクレオチド」とは、標的核酸にハイブリダイゼーションし、核酸合成のためのプライマーおよび／またはプロモーターとして作用しうる単離核酸を意味する。標的核酸鎖は核酸合成のための鋳型である。T7、T3およびSP6 RNAポリメラーゼのごときRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターを、転写媒介増幅に用いることができる。好ましくは、増幅オリゴヌクレオチドは長さ12ないし100ヌクレオチド、より好ましくは長さ18ないし50ヌクレオチドである。
「核酸の増幅」または「標的の増幅」とは、少なくとも標的核酸配列を有する核酸分子の数を増加させることを意味する。
「ネガティブセンス」とは、リファレンス（すなわち、センス）核酸分子に完全に相補的な核酸分子を意味する。
「必須としてなる」または「必然的になる」というフレーズは、オリゴヌクレオチドが、特定のヌクレオチド配列に実質的に類似したヌクレオチド配列を有し、さらに４個までのさらなるヌクレオチド、あるいは２個までの欠失ヌクレオチドを有していてもよいことを意味する。よって、これらのフレーズは、配列の長さの限定および配列のバリエーションの限定を含む。いずれの付加または欠失も、オリゴヌクレオチドがそのクレイムされた特性、例えば、厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で非標的核酸よりも標的核酸に優先的にハイブリダイゼーションするというような特性を妨げない特定のヌクレオチド配列の実質的でないバリエーションである。オリゴヌクレオチドは、付加または欠失を伴わない特定の核酸配列に実質的に類似のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
「十分に相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸が、厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下において、検出のための安定なハイブリッドを形成する十分量の一連の相補的ヌクレオチドを有することを意味する。
II．マイコプラズマ・ニューモニエの検出
我々は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブおよび増幅オリゴヌクレオチドのための、マイコプラズマ・ニューモニエのrRNAまたはrDNA中の好ましい標的ヌクレオチド配列を同定した。ハイブリダイゼーションアッセイプローブはマイコプラズマ・ニューモニエを検出し、好ましくは、それを、既知でありおそらく最も密接に関連した分類学的または系統的近縁種および関係のあまりない生物から識別することができる。ヘルパープローブを用いて、ハイブリダイゼーションアッセイプローブのその標的ヌクレオチド配列領域へのハイブリダイゼーションを容易にすることができる。増幅オリゴヌクレオチドはプライマーとして作用することができ、マイコプラズマ・ニューモニエの標的配列を増幅するためのプロモーター−プライマーの組み合わせの一部（すなわち、結合したプロモーター配列を有するプライマー）であってもよい。
原核生物（ウイルスを除く）は、5S rRNA、16S rRNAおよび23S rRNAをコードするrDNA遺伝子を含んでいる。マイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマタセエ（Mycoplasmataceae）科の他のメンバーのrRNA配列の一部または全部を、当業者に知られた核酸配列決定法により得た。配列相同性のある領域に基づいてこれらの配列を並置比較した。次いで、種間の配列バリエーションを並置比較した配列から同定した。次いで、これらの可変領域をハイブリダイゼーションアッセイプローブのための標的配列として用いた。
本発明核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、マイコプラズマ・ニューモニエを密接に関連したマイコプラズマから、好ましくはマイコプラズマ・ニューモニエの最も近い系統上の近縁種マイコプラズマ・ゲニタリウムから識別することができる。好ましい具体例において、ハイブリダイゼーションアッセイプローブはマイコプラズマ・ニューモニエをマイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ブッカレ、およびマイコプラズマ・サリバリウムから識別することもできる。これらのマイコプラズマはヒトから単離されている。
rRNA配列の取得
実験的に、および公表された方法から配列の情報を得た（Weisburg et al.,J.Bacteriol 171:6455（1989）参照）。当該分野において知られた標準的方法を用いて、種々の生物からrRNAを単離し配列決定することにより、実験的情報を得た。より詳細には、まず、原核生物間において殆ど相違しない保存領域に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いることによりrRNA配列の情報を得た。次いで、逆転写酵素およびデオキシリボヌクレオチドを用いてプライマーを伸長してcDNAを得た。ジデオキシヌクレオチド鎖終結法を用いてcDNA核酸配列を決定した（例えば、Lane et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6955（1985））。
プローブ設計およびハイブリダイゼーション条件
ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、それらの標的配列にハイブリダイゼーションする。マイコプラズマ・ニューモニエの核酸に優先的にハイブリダイゼーションするようにハイブリダイゼーションアッセイプローブが設計され、ヘルパープローブはアッセイプローブのハイブリダイゼーションにおける助けとなりうる。増幅オリゴヌクレオチドは標的配列の増幅における助けとなる。ヘルパープローブまたは増幅オリゴヌクレオチドとして作用するオリゴヌクレオチドは、マイコプラズマ・ニューモニエの核酸に優先的にハイブリダイゼーションできる必要はない。
プローブの設計に用いる核酸配列の同定を容易にするために、まず、異なる生物由来のヌクレオチド配列を並べて相同性を最大にする。２次構造（部分的には分子内水素結合により生じる）と機能との間に密接な関連がrRNA分子中に存在する。この事実は、維持されるべき２次構造を生じる１次ヌクレオチド配列における進化論的変化に制限を課すものである。例えば、２重らせんの一方の「鎖」において塩基が変化している（分子内水素結合により、両方の「鎖」が同じrRNA分子の一部となっている）場合には、通常には補償的な置換が他方の「鎖」の１次配列に生じて相補性を保存し（これをコ−バリアンス（co−variance）という）、かくして、必要な２次構造が保存される。このことにより、２つの非常に異なったrRNA配列を、保存された１次配列ならびに保存された２次構造エレメントの両方に基づいて並置比較することができる。本明細書記載のハイブリダイゼーションアッセイプローブとして可能性のある標的配列を、並置比較された配列の相同性を記録することにより同定した。
各可変領域における配列の進化は最も多様性に富む。多様性のために、より離れたマイコプラズマ・ニューモニエの系統的関連種の対応rRNA可変領域は、系統的に密接な関連種のrRNAよりもマイコプラズマ・ニューモニエのrRNAから大きな隔たりを示す。我々は、好ましい標的部位を同定し、これら２つの生物の核酸間の相違を識別するのに有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計するための、マイコプラズマ・ニューモニエとその密接な系統的関連種マイコプラズマ・ゲニタリウムとの間の十分な変化を観察した。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブのそれらの標的核酸への優先的ハイブリダイゼーションを、適当なハイブリダイゼーションアッセイ条件の選択および正しいプローブの設計により行うことができる。プローブ：標的核酸ハイブリッドの安定性をアッセイならびに洗浄条件に適合するように選択して、安定かつ検出可能なハイブリッドのみが非常に相補的な配列を有する核酸間に形成されるようにすべきである。１またはそれ以上の異なるアッセイパラメーターを操作することは、特定のハイブリダイゼーションアッセイプローブの正確な感度および特異性を決定する。
以下のガイドラインはプローブの設計および特異的かつ厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件の決定に有用である。適当な融解温度（Tm）を有するようにプローブを設計すべきである。プローブ長およびヌクレオチド組成（Ａ＋Ｔに対するＧ＋Ｃ含量）を変化させることにより適当なTmを得ることができる。好ましくは、最終的なアッセイが行われる温度よりも約２〜10℃高いTmに対応するようにプローブ長およびヌクレオチド組成を選択すべきである。
一般的には、オリゴヌクレオチドの最適ハイブリダイゼーション温度は、一定の２本鎖に関する融解温度よりも約５℃低い。最適温度よりも低い温度でのインキュベーションはミスマッチ塩基配列のハイブリダイゼーションを可能にし、それゆえ、特異性を減じる。オリゴヌクレオチドが長いほど塩基対間の水素結合が多くなり、一般的にはTmが高くなる。ＧおよびＣのパーセンテージの増加もまたTmを上昇させる。なぜなら、Ｇ−Ｃ塩基対はさらなる水素結合を示し、それゆえ、Ａ−Ｔ塩基対よりも大きな熱安定性を示すからである。かかる考え方は当該分野において知られている（例えば、Sambrookらの上記文献の第11章参照）。
Tm測定のための好ましい方法は、Arnoldらの上記「ホモジニアス・プロテクション・アッセイ」によるハイブリダイゼーション保護アッセイ（HPA）を用いるハイブリダイゼーションの測定である。以下の方法でHPAを用いてTmを測定することができる。プローブ分子をアクリジニウムエステルで標識する。過剰量の標的を用いて、プローブ：標的ハイブリッドをコハク酸リチウムバッファー（0.1Mコハク酸リチウムバッファー、pH5.0、2mM EDTA、2mM EGTA、10％（w/v）ラウリル硫酸リチウム）中で形成させる。次いで、核酸ハイブリッドを含有する溶液の一部をコハク酸リチウムバッファー溶液で希釈し、予想Tm（典型的には55℃）よりも低い温度から初めて２〜５℃きざみで種々の温度で５分間インキュベーションする。次いで、この溶液を弱アルカリ性ホウ酸バッファー（0.15Mテトラホウ酸ナトリウム、pH7.6、５％（v/v）TRITON▲Ｒ▼Ｘ−100）で希釈し、低温（例えば50℃）で10分間インキュベーションする。
これらの条件下で、１本鎖プローブに結合したアクリジニウムエステルは加水分解されるが、ハイブリダイゼーションしたプローブに結合したアクリジニウムエステルは加水分解から相対的に保護される。かくして、加水分解処理後に残存するアクリジニウムエステル量はハイブリッド分子数に比例する。過酸化水素およびアルカリを溶液に添加することにより残存アクリジニウムエステルから生じる化学発光をモニターすることによって残存アクリジニウムエステルを測定することができる。化学発光をルミノメーター（例えば、Gen−ProbeのLEADER▲Ｒ▼ＩまたはLEADER▲Ｒ▼50）で測定することができる。得られたデータを、温度に対して最大シグナルのパーセント値としてプロットする（通常には最も低温から）。最大シグナルの50％が残存している温度としてTmを決定する。上記方法以外に、当業者に知られたアイソトープ法によってTmを決定してもよい（例えば、Hoganらの上記文献参照）。
一定のハイブリッドのTmは、用いるハイブリダイゼーション溶液の性質に応じて変化する。塩濃度、界面活性剤、および他の溶質のごときファクターは、熱変性を行っている間のハイブリッドの安定性に影響しうる（J.Sambrookらの上記文献参照）。プローブが標的にハイブリダイゼーションするイオン強度および温度のごとき条件を、プローブ構築の際考慮すべきである。ハイブリッド核酸の熱安定性は反応混合物のイオン強度に伴って上昇する。他方では、ホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシドおよびアルコール類のごとき水素結合を破壊する化学試薬はハイブリッドの熱安定性を大幅に低下させうる。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブのその標的への特異性を確認するために、非常に厳密な条件下で標的核酸にのみハイブリダイゼーションするプローブを設計することが好ましい。非常に相補的な核酸ハイブリッドは非常に厳密な条件下でハイブリッドを形成する。したがって、アッセイ条件の厳密性は、ハイブリッドを形成する２つの核酸鎖間に存在すべき相補性の量を決定する。プローブ：標的ハイブリッドと、生じ得るプローブ：非標的ハイブリッドとの間の安定性の相違が最大となるように厳密性を選択すべきである。
非標的生物の配列に対して完全な相補性を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブの長さを最短にし、非標的核酸に相補的なＧおよびＣに富む領域を避け、非標的配列に対する不安定化ミスマッチをできる限り多く含むようにすることにより、正しい特異性を達成することができる。プローブが特定のタイプの生物のみの検出に適したものであるかどうかは、プローブ：非標的ハイブリッドとプローブ：標的ハイブリッドとの間の熱安定性の相違による。プローブの設計において、これらのTm値の相違をできる限り大きくすべきである（好ましくは２℃〜５℃あるいはそれ以上）。
標的核酸配列領域の長さ、そしてそれゆえ標的領域に実質的に相補的なハイブリダイゼーションプローブの長さも重要である。いくつかの場合において、所望のハイブリダイゼーション特性を有するプローブの設計に使用されうる、特定の標的領域由来の位置および長さが異なるいくつかのヌクレオチド配列が存在しうる。他の場合において、１の配列は、たった１個の塩基が異なるだけの他の配列よりも特異性が有意に良好なものであるかもしれない。完全には相補的でない核酸がハイブリダイゼーションすることは可能であるが、一般的には、完全に相補的なヌクレオチドの最長の並びがハイブリッドの安定性を決定する。
ハイブリダイゼーションに対して阻害的な強力な内部構造を形成することが知られているrRNAの領域はあまり好ましくない標的領域である。同様に、自己相補性の強いプローブを避けるべきである。鎖が全体的または部分的に分子内または分子間ハイブリッドに関与する場合、それは新たな分子間プローブ：標的ハイブリッドの形成にはあまり関与しないであろう。リボゾームRNA分子は水素結合によって非常に安定な分子内らせんおよび２次構造を形成することが知られている。ハイブリダイゼーション条件下で実質的に１本鎖のままである標的核酸の領域に対するプローブを設計することにより、プローブと標的との間のハイブリダイゼーションの速度および程度を増加させることができる。
ゲノムrDNA標的は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の生成物と同様、本来的には２本鎖形態で存在する。これらの２本鎖標的はハイブリダイゼーション前に変性を必要とする。適当な変性およびハイブリダイゼーション条件は当該分野において知られている（例えば、E.M.Southern,J.Mol.Biol.98:503（1975））。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブ用の特定の厳密なハイブリダイゼーション条件の例を後で説明する。当業者は本発明開示に基づいて厳密なハイブリダイゼーション条件のさらなるセットを決定することができる（例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）第11章参照）。
ヘルパープローブ
HoganおよびMillimanの米国特許第5,030,557に記載のごとく、「ヘルパープローブ（Helper Probes）」を用いることにより、アッセイプローブとその標的核酸との核酸ハイブリダイゼーション速度が促進される。ヘルパープローブはそれらの標的核酸配列に対して十分に相補的であり、ヘルパープローブ：標的２本鎖を厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下で形成する。一定のヘルパープローブとともに用いられる厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブが標的配列に優先的にハイブリダイゼーションするように用いられる条件によって決定される。
厳密なハイブリダイゼーションアッセイ条件下においてさえ、１本鎖RNAおよびDNAの領域を２次および３次構造に含ませることができる。かかる構造は、標的領域へのハイブリダイゼーションアッセイプローブのハイブリダイゼーションを立体的に阻害し、あるいはブロックすることができる。ヘルパープローブのハイブリダイゼーションは標的核酸の２次および３次構造を変化させ、そのことにより、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ標的領域をよりアクセス可能なものとする。結果として、ヘルパープローブは、標的：ハイブリダイゼーションプローブ２本鎖のキネティクスおよび／またはTmを上昇させる。一般的には、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ標的領域の近くに存在する核酸配列にハイブリダイゼーションするようにヘルパープローブを選択する。
本発明ハイブリダイゼーションアッセイプローブとともに用いることのできるヘルパープローブは、SEQ.ID.NO.33、36、39、45、48、51、54、57、60、64、67、70、73、76および79により示される核酸配列を標的とする。好ましくは、プローブは長さ12ないし100ヌクレオチドであり、10ヌクレオチドの標的領域を含み、好ましくは、その10個のヌクレオチドの少なくともうち９個が標的配列に存在する核酸配列に対して完全に相補的である。
本発明における有用なヘルパープローブの例は、下記ヌクレオチド配列（5'から3'方向に記載）：
を有する、あるいはそれらから必然的になる、あるいはそれらからなるものである。
好ましくは、下記ハイブリダイゼーションアッセイプローブおよびヘルパープローブの組み合わせを用いる。
プライマーまたはプロモーター−プライマーのセットを用いて観察される増幅の程度は、オリゴヌクレオチドがそれらの特異的標的配列にハイブリダイゼーションする能力およびそれらがRNAポリメラーゼにより伸長されあるいは認識される能力を包含するいくつかのファクターによる。異なる長さおよび塩基組成のオリゴヌクレオチドを用いることができるが、より好ましい増幅オリゴヌクレオチドは18〜50塩基の標的結合領域および約65℃の予想Tmを有する。
標的配列の5'側の増幅オリゴヌクレオチドおよび標的配列の3'側の増幅オリゴヌクレオチドを用いて核酸分子上に存在する標的核酸配列を増幅することができる。増幅オリゴヌクレオチドにとり好ましい標的部位は長さが約15塩基よりも長い領域である。増幅オリゴヌクレオチドにより決定される増幅領域は、好ましくは、約350塩基、より好ましくは150塩基以内である。
Tm、相補性および２次構造のごときプローブハイブリダイゼーションに影響するパラメーターはプライマーハイブリダイゼーションにも影響し、それゆえ、増幅オリゴヌクレオチドの性能に影響する。プローブの設計に関する上記セクションで述べたこれらの考慮事項を増幅条件に応じて修飾することができる。例えば、低い厳密性の条件下で増幅を行い、次いで、診断的ハイブリダイゼーションアッセイ条件下で増幅を行うことができる。
非特異的伸長（プライマー−ダイマーまたは非標的−標的の複製）の程度は増幅効率に影響しうる。好ましくは、特に配列の3'末端において低い自己−または交差−相補性を有するようにプライマーを選択する。好ましくは、長いホモポリマー区域および高いGC含量を避けて見かけ上のプライマー伸長を回避する。コンピュータープログラムが市販されており、この態様の設計に役立つ。
III．オリゴヌクレオチド合成
シアノエチルホスホラミダイト前駆体を用いる自動固相化学合成（Barone et al.,Nucleic Acids Research 12:4051（1984））を包含するいくつかのよく知られた方法のいずれかにより、そしてSambrook et al.,上記文献の第11章記載のごとく、決定されたオリゴヌクレオチドを製造することができる。オリゴヌクレオチドの合成および精製後、いくつかの異なる方法を用いてサイズおよび純度に関してオリゴヌクレオチドの許容性を調べることができる。かかる方法はポリアクリルアミドゲル電気泳動および高圧液体クロマトグラフィーを包含する。
ハイブリダイゼーションアッセイプローブを、よく知られた方法（J.Sambrookらの例えば上記文献）のいずれかによりレポーター基（reporter group）で標識してもよい。有用な標識は放射性同位元素および非放射性レポーティング基（reporting group）を包含する。アイソトープ標識は、3H、35S、32P、125I、57Coおよび14Cを包含する。ニックトランスレーション、エンドラベリング（end labeling）、セカンドストランド合成（second strand synthesis）、逆転写のごとき当該分野で知られた方法、および化学的方法によりアイソトープ標識をオリゴヌクレオチド中に導入することができる。放射性標識プローブを使用する場合、オートラジオグラフィー、シンチレーションカウンティング、またはガンマカウンティングのごとき方法によりハイブリダイゼーションを検出することができる。選択される検出方法は標識に使用する個々のラジオアイソトープにより異なる。
非アイソトープ材料を標識に使用することもでき、ヌクレオチド間に導入してもよくあるいはオリゴヌクレオチド末端に導入してもよい。修飾ヌクレオチドを酵素的あるいは化学的に導入することができる。当該分野で知られた方法を用いるオリゴヌクレオチド合成中または合成後にオリゴヌクレオチドの化学修飾を行ってもよい。例えば、「ヌクレオチドプローブ用非ヌクレオチド結合試薬（Non−Mucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes）」というタイトルのArnoldらのEPO出願第88308766.0号（公開第313219号）（参照により本明細書に記載されているものと見なす）により記載された非ヌクレオチドリンカー基の使用による。非アイソトープ標識は蛍光分子、化学発光分子、酵素、コファクター、酵素基質、およびハプテンまたは他のリガンドを包含する。
好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブアッセイをアクリジニウムエステルで標識する。「ヌクレオチドプローブのアクリジニウムエステル標識および精製（Acridinium Ester Labeling and Purification of Nucleotide Probes）」というタイトルの、1993年２月９日付与のArnoldらの米国特許第5,185,439号（参照により本明細に記載されているものと見なす）により記載されたようにしてアクリジニウムエステル標識を行うことができる。
IV．実施例
本発明の異なる態様および具体例を説明する実施例を以下に記載する。実施例は、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、または増幅オリゴヌクレオチドの特定のヌクレオチド配列を有する、それらを必須としてなる、および実質的にそれらに類似のオリゴヌクレオチドを得ることのできる方法論を説明する。これらの実施例は開示された発明を何ら限定しない。
まず、マイコプラズマ・ニューモニエ（ATCC番号15531）ならびにマイコプラズマ・ゲニタリウム（ATCC番号33530）、あるいは公表された16S配列由来のrRNAに相補的なプライマーを用いて、予想される標的領域を配列決定することにより、マイコプラズマ・ニューモニエに特異的なプローブを設計した。これらの配列を比較して可変領域を決定した。さらに、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（mycoplasma hyopneumoniae）、マイコプラズマ・アガラクチアエ（Mycoplasma agalactiae）、マイコプラズマ・リフォフィルム（Mycoplasma liphophilium）、マイコプラズマ・カリフォルニクム（Mycoplasma californicum）、マイコプラズマ・ボビゲニタリウム（Mycoplasma bovigenitalium）、マイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivarium）、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、マイコプラズマ・アルトリチジス（Mycoplasma Arthritidis）、マイコプラズマ・アルギニニ（Mycoplasma arginini）、マイコプラズマ・プルモニス（Mycoplasma pulmonis）、マイコプラズマ・ミコイデス（Mycoplasma mycoides）、マイコプラズマ・イミタンス（Mycoplasma imitans）、マイコプラズマ・イオワエ（Mycoplasma iowae）、マイコプラズマ・ムリス（Mycoplasma muris）、マイコプラズマ・ピルム（Mycoplasma pirum）、マイコプラズマ・ガリセプチクム（Mycoplasma gallisepticum）、およびユー・ウレアリチクム（U.urealyticum）を包含する系統的に近い近縁種のrRNA配列をマイコプラズマ・ニューモニエのrRNAと比較して可変領域を決定した。
下記ヌクレオチド配列を有するハイブリダイゼーションアッセイプローブを以下の実施例において特徴づけた：
結果を、ルミノメーターにより検出された光子の測定値である相対光ユニット（relative light unit）（RLU）として示す。細胞溶解物中の核酸にプローブを細胞溶解物中の核酸または精製RNAにハイブリダイゼーションさせた。Sambrookらの上記文献に一般的に説明されているようにして精製RNAを得た。MurphyらのEPO公開第288618号「細胞からのRNAおよびDNAの遊離方法（Method for Releasing RNA and DNA from Cells）」（参照により本明細書に記載されているものと見なす）により記載されたようにして、溶解物、特に、マイコバクテリア、グラム陽性生物、または酵母の溶解物を得ることができる。以下の実施例は、マイコプラズマ・ニューモニエのrRNA配列を標的とするハイブリダイゼーションアッセイプローブ、または対応遺伝子、およびハイブリダイゼーションアッセイにおけるそれらの使用を説明する。
実施例1:マイコプラズマ・ゲニタリウム核酸へのハイブ リダイゼーションに対するマイコプラズマ・ニューモニ エ核酸へのハイブリダイゼーション
マイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマ・ゲニタリウムのrRNAへの個々のアクリジニウムエステル標識プローブのハイブリダイゼーションを評価した。100mlの0.05Mコハク酸リチウム pH5、0.6M LiCl、１％（w/v）ラウリル硫酸リチウム、10mM EDTA、10mM EGTA中、60℃で30分間、精製RNA（50ng）をプローブミックスとハイブリダイゼーションさせ、次いで、300μｌの0.15Mテトラホウ酸ナトリウム pH8.5、１％TRITON▲Ｒ▼Ｘ−100を添加して60℃で８〜９分間置いた。0.16pmolのハイブリダイゼーションアッセイプローブおよび0.4pmolのヘルパープローブを用いて各試料を２系で試験した。1mM硝酸中0.1％過酸化水素を注入し、次いで、1N水酸化ナトリウム溶液を注入することによりアクリジニウムエステルのシグナル発生をルミノメーターで読んだ。
表２に示すように、マイコプラズマ・ニューモニエ核酸を標的とするプローブは、マイコプラズマ・ニューモニエとマイコプラズマ・ゲニタリウムを容易に識別する。この表のデータはRLUで示され、バックグラウンドまたは負の対照値を差し引いていない。２系の実験の結果を報告する。SEQ.ID.NO.1により示されるヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.9および10のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。SEQ.ID.NO.2のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.11および12のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。SEQ.ID.NO.3のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.13および14のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。SEQ.ID.NO.4のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.15および16のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。SEQ.ID.NO.5のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.17のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。SEQ.ID.NO.6のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、ヘルパープローブなしで用いた。SEQ.ID.NO.7のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.18のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。SEQ.ID.NO.8のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを、SEQ.ID.NO.19および20のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとともに用いた。
実施例2:マイコプラズマ・ニューモニエ核酸への優先的 ハイブリダイゼーション
この実施例は、ハイブリダイゼーションおよび分離アッセイフォーマットにおける、マイコプラズマ・ニューモニエのrRNAを標的とするアクリジニウムエステル標識プローブを含有するプローブ混合物の、種々のマイコプラズマ・ニューモニエ株を検出するが他の微生物を検出しないという能力を説明する。このフォーマットは、上記ホモジニアス・アッセイ・フォーマット（homogeneous assay format）よりも低いバックグラウンドシグナルを与え、表２に示すデータを得るために用いられる。プローブ混合物は、下記ヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブを含んでいた：
13、14、15、16、17、18、19および20）。
表３は、106〜108個の生物を含有する液体ブロス培養物から遊離された過剰のRNAに対するプローブミックスを用いて得られたデータを示す。各試料に関して、0.19Mコハク酸リチウム pH5、0.62Mラウリル硫酸チリウム、3mM EDTA、3mM EGTAおよびプローブミックスを含有するハイブリダイゼーション溶液を、同体積の細胞溶解物（約100ngのrRNA）と混合し、60℃で１時間インキュベーションした。次いで、0.19Mテトラホウ酸ナトリウム pH7.5、６％（v/v）TRITON▲Ｒ▼Ｘ−100を含有する溶液中でハイブリッドをマグネチックアミンマイクロスフェア（magnetic amine microsphere）（Perseptive Biosystems,Inc.,Cambridge,MA）に結合させ、20mMテトラホウ酸ナトリウム pH10.4を含有する溶液で１回洗浄した。微粒子に結合したハイブリダイゼーションしたアクリジニウムエステル標識プローブからの化学発光を実施例１記載のごとくルミノメーターで測定した。表３のデータは、プローブミックスがマイコプラズマ・ニューモニエの存在を示し、いくつかの密接に関連したマイコプラズマ、アコレプラズマ（Acholeplasma）、ウレアプラズマ（Ureaplasma）およびスピロプラズマ（Spiroplasma）からマイコプラズマ・ニューモニエを識別することを示す。
全−細菌／酵母プローブ混合物を陽性対照として用いて細菌核酸の存在を示した（データ示さず）。上記Hoganらの「非ウイルス生物の検出および／または定量のための核酸プローブ（Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of Non−Viral Organisms）」は、適当なすべての細菌／酵母プローブ混合物を示すものである。
実施例3:交差反応性の程度の測定
交差反応性の程度を測定するために、RNA量を減少させて、ハイブリダイゼーションおよび分離フォーマットにおける可能なカットオフ値である300RLUより大きいかまたは等しい正味のシグナルを生じるのに必要なRNA量を決定した。実施例２のプローブミックスおよびプロトコールを用いた結果を表４に示す。
実施例4:優先的プローブハイブリダイゼーション
表５は、実施例２記載のアッセイフォーマットを用い、実施例２記載のプローブミックスが、微生物の系統上のクロスセクションを示す27の細菌属からマイコプラズマ・ニューモニエを識別することを示す。この実験において対照として用いた全−細菌／酵母プローブ混合物は細菌の存在を示した（データ示さず）。
この実施例は、核酸増幅生成物を検出するためのマイコプラズマ・ニューモニエのハイブリダイゼーションアッセイプローブの使用を説明する。この実施例において、標的rRNA核酸と同じセンスのマイコプラズマ・ニューモニエのハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて標的核酸増幅の生成物を検出した。SEQ.ID.NO.51のヌクレオチド配列を有するプライマーおよびSEQ.ID.NO.82のヌクレオチド配列を有しプロモーター配列5'−AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA−3'（SEQ.ID.NO.92）を5'末端に含むプロモーター−プライマーを用いて、マイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマ・ゲニタリウムのrRNAを別々に増幅した。Perkin−Elmerサーモサイクラーを用いて下記のごとく増幅を行った:0.3μＭのプロモーター−プライマー、0.3μＭのプライマー、50mM Tris−HCl,pH7.6、25mM KCl、17.5mM MgCl2、20mM Ｎ−アセチルシステイン、2.5mM rATP、2.5mM rCTP、2.5mM rGTP、2.5mM rUTP、1mM dATP、1mM dCTP、1mM dGTPおよび1mM dTTPを含有する溶液100μｌ中で標的核酸を95℃で15分加熱し、42℃に冷却した。900ユニットのMMLV逆転写酵素および400UのT7 RNAポリメラーゼをそれぞれの反応液に添加し、混合した（Kacianらの上記「核酸配列増幅法、成分およびキット（Nucleic Acid Sequence Amplification Method,Composition,and Kit）」参照）。42℃で２時間インキュベーション後、実施例１記載の条件を用い、標的rRNAと同じセンスの0.12pmolのアクリジニウムエステル標識プローブ（SEQ.ID.NO.24）を用いるハイブリダイゼーションアッセイにそれぞれの反応混合物を全部供した。各標的核酸に関する結果は５系の同じ反応の平均である。
実施例6:増幅標的の検出
この実施例もまた、増幅された核酸の検出を説明する。マイコプラズマ・ニューモニエおよびマイコプラズマ・ゲニタリウム由来の核酸を、95℃、その後、55℃（30秒）、60℃（60秒）ついで95℃（60秒）で30ラウンド、次いで、60℃で７分加熱することにより増幅した。50mM塩化カリウム、10mM Tris−HCl pH8.3、1.5mM塩化マグネシウム、0.25mM dATP、0.25mM dTTP、0.25mM dGTP、0.25mM dCTP、2.5UのTaqポリメラーゼ、１μＭのプライマー（SEQ.ID.NO.83）および１μＭのプライマー（SEQ.ID.NO.84）を含有する溶液100μｌ中で増幅を行った。SEQ.ID.NO.85のヌクレオチド配列を有するアクリジニウムエステル標識プローブおよびSEQ.ID.NO.9および10のヌクレオチド配列を有する未標識ヘルパープローブとのハイブリダイゼーションにより、あるいはマイコプラズマ・ゲニタリウムのrRNAに完全に相補的なヌクレオチドに指向されたプローブ（SEQ.ID.NO.86）とのハイブリダイゼーションにより、最終反応物のうち10μｌをアッセイした。
上記の種々の実施例において示されたデータは、本明細書記載のハイブリダイゼーションプローブはマイコプラズマ・ニューモニエをその最も近い系統上の近縁種から識別できることを確認するものである。さらにそのうえ、相補的オリゴヌクレオチドプローブは核酸増幅法の生成物を検出することができた。
他の具体例は下記請求の範囲内である。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：ジェン−プローブ・インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：マイコプラズマ・ニューモニエ核酸を標的とする核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブおよび増幅オリゴヌクレオチド
（iii）配列の数:92
（iv）連絡先：
（Ａ）宛て名：ライオン・アンド・ライオン
（Ｂ）通り名：ウェスト・フィフス・ストリート633スイート4700
（Ｃ）都市名：ロサンジェルス
（Ｄ）州名：カリフォルニア
（Ｅ）国名：アメリカ合衆国
（Ｆ）ZIP:90071
（ｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：
（Ａ）メディウム・タイプ:3.5インチディスケット、用量1.44Mb
（Ｂ）コンピューター:IBM PC
（Ｃ）オペレーティング・システム:MS DOS（バージョン6.0）
（Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト（バージョン5.1）
（vi）現在の出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（vii）先の出願データ：先の出願は下記出願を含めて全部で１つ
（Ａ）出願番号:08/297,299
（Ｂ）1994年８月29日
（viii）代理人等の情報：
（Ａ）氏名：ヘーバー，シェルドン・オー
（Ｂ）登録番号:38,179
（Ｃ）代理人等における処理番号:208/130−PCT
（ix）テレコミュニケーションの情報：
（Ａ）電話番号：（213）489−1600
（Ｂ）ファックス番号：（213）955−0440
（Ｃ）テレックス:67−3510
（２）配列番号:1に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:35塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:1:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:2:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:22塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:3:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:25塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:4:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:5:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:26塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:6:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:20塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:7:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:8:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:53塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:9:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:45塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:10:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:32塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:11:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:37塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:12:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:44塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:13:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:14:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:36塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:15:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:16:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:29塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:17:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:41塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:18:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:42塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:19:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:34塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:20:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:35塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:21:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:35塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:22:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:35塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:23:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:24:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:25:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:26:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:22塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:27:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:22塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:28:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:22塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:29:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:25塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:30:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:25塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:31:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:25塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:32:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:33:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:34:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:35:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:26塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:36:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:26塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:37:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:26塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:38:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:20塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:39:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:20塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:40:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:20塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:41:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:42:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:43:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:44:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:53塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:45:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:53塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:46:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:53塩基対
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（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:47:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:45塩基対
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（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:48:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:45塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:49:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:45塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:50:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:32塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:51:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:32塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:52:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:32塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:53:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:37塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:54:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:37塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:55:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:37塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:56:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:44塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:57:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:41塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:58:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:44塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:59:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:60:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:61:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:62:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:63:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:36塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:64:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:36塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:65:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:36塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:66:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:67:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:68:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:33塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:69:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:28塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:70:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:29塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:71:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:29塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:72:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:41塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:73:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:41塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:74:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:41塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:75:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:42塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:76:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:42塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:77:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:42塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:78:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:34塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:79:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:34塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:80:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:34塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:81:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:30塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:82:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:83:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:23塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:84:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:24塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:85:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:23塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:86:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:24塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:87:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:24塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:88:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:24塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:89:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:31塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:90:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:23塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:91:
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:27塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:1本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列の記載：配列番号:92:
Claims (12)
- マイコプラズマ・ニューモニエが試料中に存在するかどうかを検出するためのプローブであって、そのヌクレオチド塩基配列が配列番号:2または配列番号:26のヌクレオチド塩基配列に対して完全に相補的であり、厳密なハイブリダイゼーション条件下においてマイコプラズマ・ニューモニエ核酸に検出可能にハイブリダイゼーションするがマイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ブッカレまたはマイコプラズマ・サリバリウム中に存在する核酸にはハイブリダイゼーションしないプローブ。
- マイコプラズマ・ニューモニエが試料中に存在するかどうかを検出するためのプローブであって、そのヌクレオチド塩基配列が配列番号:2、配列番号:24およびそれらのRNA同等物からなる群より選択されるヌクレオチド塩基配列からなり、厳密はハイブリダイゼーション条件下においてマイコプラズマ・ニューモニエ核酸に検出可能にハイブリダイゼーションするがマイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ブッカレまたはマイコプラズマ・サリバリウム中に存在する核酸にはハイブリダイゼーションしないプローブ。
- 試料中のマイコプラズマ・ニューモニエ核酸の存在を検出するためのプローブミックスであって、
（ａ）ヌクレオチド塩基配列が配列番号:2または配列番号:26のヌクレオチド塩基配列に対して完全に相補的であり、厳密なハイブリダイゼーション条件下においてマイコプラズマ・ニューモニエ核酸に検出可能にハイブリダイゼーションするがマイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ブッカレまたはマイコプラズマ・サリバリウム中に存在する核酸にはハイブリダイゼーションしないハイブリダイゼーションアッセイプローブ；および
（ｂ）それぞれのヌクレオチド塩基配列が配列番号:53または配列番号:56のヌクレオチド塩基配列に対して完全に相補的であり、それぞれが該厳密なハイブリダイゼーション条件下においてマイコプラズマ・ニューモニエ核酸にハイブリダイゼーションするものである１またはそれ以上のヘルパーオリゴヌクレオチド
を含むプローブミックス。 - 該プローブが標識を含み、該プローブの塩基配列が配列番号:2またはそのRNA同等物の塩基配列からなり、該ヘルパーオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド塩基配列が配列番号:11、配列番号:12およびそれらのRNA同等物からなる群より選択されるヌクレオチド塩基配列からなるものである、請求項３記載のプローブミックス。
- 試料中のマイコプラズマ・ニューモニエ核酸を増幅しその存在を検出するための組成物であって、
（ａ）それぞれのヌクレオチド塩基配列が、配列番号:51、配列番号:82およびそれらのRNA同等物、ならびにRNAポリメラーゼにより認識されるかあるいはRNAポリメラーゼによる反応開始または伸長を促進する存在してもよい核酸配列からなる群より選択されるヌクレオチド塩基配列からなる１またはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド；および
（ｂ）ヌクレオチド塩基配列が配列番号:2、配列番号:24およびそれらのRNA同等物からなる群より選択されるヌクレオチド塩基配列からなり、厳密なハイブリダイゼーション条件下においてマイコプラズマ・ニューモニエ核酸に検出可能にハイブリダイゼーションするがマイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ブッカレまたはマイコプラズマ・サリバリウム中に存在する核酸にはハイブリダイゼーションしないハイブリダイゼーションアッセイプローブ
を含む組成物。 - 該増幅オリゴヌクレオチドの１つが、RNAポリメラーゼにより認識されるかあるいはRNAポリメラーゼによる反応開始または伸長を促進する存在してもよい核酸配列を含むものである、請求項５記載の組成物。
- 該増幅オリゴヌクレオチドが１セットの増幅オリゴヌクレオチドを含むものであり、該セットの第１の増幅オリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基配列が配列番号:51のヌクレオチド塩基配列からなるものであり、該セットの第２の増幅オリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基配列が配列番号:82のヌクレオチド塩基配列からなるものであり、該プローブのヌクレオチド塩基配列が配列番号:24のヌクレオチド塩基配列からなるものである、請求項５記載の組成物。
- 試験試料中のマイコプラズマ・ニューモニエの存在を検出する方法であって、
（ａ）厳密なハイブリダイゼーション条件下で試験試料をハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させること、ここに該プローブのヌクレオチド塩基配列は配列番号:2または配列番号:26のヌクレオチド塩基配列に対して完全に相補的であり、該厳密なハイブリダイゼーション条件下において該プローブがマイコプラズマ・ニューモニエ核酸に検出可能にハイブリダイゼーションするがマイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ブッカレまたはマイコプラズマ・サリバリウム中に存在する核酸にはハイブリダイゼーションしないものであり；ついで
（ｂ）マイコプラズマ・ニューモニエにハイブリダイゼーションした該プローブの存在または量を該試験試料中に存在するマイコプラズマ・ニューモニエの存在または量を示すものとして測定すること
を特徴とする方法。 - 試験試料中のマイコプラズマ・ニューモニエの存在を検出する方法であって、
（ａ）厳密なハイブリダイゼーション条件下で試験試料をハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させること、ここに該プローブのヌクレオチド塩基配列は配列番号:2、配列番号:24およびそれらのRNA同等物からなる群より選択されるヌクレオチド塩基配列からなるものであり、該厳密なハイブリダイゼーション条件下において該プローブがマイコプラズマ・ニューモニエ核酸に検出可能にハイブリダイゼーションするがマイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ブッカレまたはマイコプラズマ・サリバリウム中に存在する核酸にはハイブリダイゼーションしないものであり；ついで
（ｂ）マイコプラズマ・ニューモニエにハイブリダイゼーションした該プローブの存在または量を該試験試料中に存在するマイコプラズマ・ニューモニエの存在または量を示すものとして測定すること
を特徴とする方法。 - 試験試料中のマイコプラズマ・ニューモニエの存在を検出する方法であって、
（ａ）１またはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチドを用いて、試験試料中にマイコプラズマ・ニューモニエ核酸が存在する場合にはこれを増幅すること、ここに該増幅オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド塩基配列は、配列番号:51、配列番号:82およびそれらのRNA同等物、ならびにRNAポリメラーゼにより認識されるかあるいはRNAポリメラーゼによる反応開始または伸長を促進する存在してもよい核酸配列からなる群より選択されるヌクレオチド塩基配列からなるものであり；
（ｂ）工程（ａ）で得られた増幅されたマイコプラズマ・ニューモニエ核酸を、厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションアッセイプローブと接触させること、ここに該プローブのヌクレオチド塩基配列は配列番号:2、配列番号:24およびそれらのRNA同等物からなる群より選択されるヌクレオチド塩基配列からなるものであり、該厳密なハイブリダイゼーション条件下において該プローブはマイコプラズマ・ニューモニエ核酸に検出可能にハイブリダイゼーションするがマイコプラズマ・ゲニタリウム、マイコプラズマ・オラレ、マイコプラズマ・ファウシウム、マイコプラズマ・ブッカレまたはマイコプラズマ・サリバリウム中に存在する核酸にはハイブリダイゼーションしないものであり；ついで
（ｃ）増幅されたマイコプラズマ・ニューモニエ核酸にハイブリダイゼーションした該プローブの存在を該試験試料中のマイコプラズマ・ニューモニエの存在を示すものとして出すること
を含む方法。 - 該増幅オリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基配列が、配列番号:82のヌクレオチド塩基配列ならびにRNAポリメラーゼにより認識されるかあるいはRNAポリメラーゼによる反応開始または伸長を促進する該存在してもよい核酸配列からなるものである請求項10記載の方法。
- 該プローブのヌクレオチド塩基配列が配列番号:24のヌクレオチド塩基配列からなるものである請求項10記載の方法。
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