JP3526844B2 - ２つの外来遺伝子を発現させるためのベクター - Google Patents
２つの外来遺伝子を発現させるためのベクターInfo
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Description
技術分野
本発明は、外来遺伝子を発現させるためのベクターに
関する。 背景技術 研究目的や遺伝子治療などにおいて外来遺伝子を標的
細胞で発現させるために、遺伝子導入用ベクターが用い
られている。このような場合に、２つの遺伝子を同じ標
的細胞内で発現させることが望まれることがある。この
ようなことが可能になれば、例えば、治療用遺伝子と共
に、選択用の遺伝子を発現させることで、治療用遺伝子
を導入した標的細胞を選択的に増殖させたり死滅させた
りすることができる。また、治療用遺伝子と共にマーカ
ー遺伝子（例えばGFPなど）を発現させることで、治療
用遺伝子導入細胞の体内での動態をモニターすることが
可能となる。さらに、レセプターや転写因子など、２種
のサブユニットが複合体を形成して機能を持つタンパク
質を発現させることも可能となる。 従来、２つの遺伝子を発現させるためのベクター系と
しては、複数のプロモーターを組込んだ形のものと、１
つのプロモーターとIRES配列（Internal Ribosomal Ent
ry Site）を組み合わせた形のものが報告されている。
しかしながら、これらのベクターの発現特性は決して満
足できるものではない。 例えば、複数のプロモーターを持つベクターは、プロ
モーター間の干渉により、どちらか一方のプロモーター
からの発現しか効率良く起きないなどの問題点がある。
また、１つのプロモーターとIRESを組み合わせたベクタ
ーは、IRESの3'側の遺伝子が、5'側の遺伝子の1/5〜1/1
0しか発現されないという問題がある。 発明の開示 本発明は、２つの外来遺伝子を同時に発現することが
できるベクターを提供することを課題とする。より詳し
くは、RRE配列の利用により２つの外来遺伝子を発現す
ることができ、その改変により該２つの外来遺伝子の発
現の量比を調整することが可能なベクターを提供するこ
とを課題とする。 該ウイルスベクターの好ましい態様として、ウイルス
由来の発現制御配列が他の発現制御配列に改変され、該
ウイルス由来のタンパク質に対する依存性が解消されて
いるウイルスベクターを提供する。他の好ましい態様と
して、パッケージングシグナルを有するが、遺伝子組換
えによる野生株の出現の危険が減少するように改変さ
れ、さらにウイルス構造タンパク質が発現しないように
改変されたウイルスベクターを提供する。 本発明者らは、遺伝子治療の分野において、従来から
用いられてきたヒト免疫不全ウイルス（HIV）と比較し
て、安全性が高いなど様々な利点を有するサル免疫不全
ウイルス（SIV）において、RREを利用した新規ウイルス
ベクターの構築を行った。 具体的には、まず、非病原性のアフリカミドリザル免
疫不全ウイルスのクローンであるSIVagmTYO1を基本と
し、5'LTR領域、RRE、CMVプロモーター、EGFP遺伝子
（またはベータガラクトシダーゼ遺伝子）、3'LTRを順
に有するベクターをジーントランスファーベクターとし
て構築した。 ジーントランスファーベクターのベクター粒子へのパ
ッケージングには、パッケージング細胞においてジーン
トランスファーベクターにトランスに作用するウイルス
構造タンパク質が必要であるため、本発明者等は、次
に、パッケージング細胞内においてウイルス構造タンパ
ク質を供給するためのパッケージングベクターも構築し
た。即ち、パッケージング細胞内において、ウイルス外
皮タンパク質（VSV-G）を発現させるためのベクターと
ウイルスコアタンパク質（gag）および逆転写酵素（po
l）を発現させるためのベクターを構築した。 レンチウイルスの5'LTRの転写活性は一般にウイルス
由来の因子であるTatタンパク質の存在に依存してい
る。そこで、本発明者等は、次に、構築したジーントラ
ンスファーベクターのTatタンパク質に対する依存性を
解消するため、およびより転写活性の強いプロモーター
配列に置換することでベクター力価を高めるために、5'
LTRのプロモーター配列であるU3領域を他のプロモータ
ー配列に置換したジーントランスファーベクターを作製
した。これによりTat非依存性のベクターを提供した。 レンチウイルスベクターにおいては、3'LTR領域に含
まれるプロモーター配列であるU3領域が、標的細胞中で
逆転写される時に5'LTRのU3プロモーター領域へ組み込
まれるため、標的細胞のゲノム内では、ジーントランス
ファーベクタープラスミドの3'LTR領域に含まれるU3領
域が、遺伝子発現に関与する5'LTRのU3プロモーターと
なることが明らかとなっている。そこで標的細胞中で遺
伝子発現に関与するプロモーターをU3配列以外のプロモ
ーターに置換しうるかを検討するため、ジーントランス
ファーベクターの3'LTRのU3領域を他のプロモーター配
列へ置換したベクターを作成した。また、同時に標的細
胞中で5'LTRに存在するプロモーター配列を欠失させう
るかを検討するため、ジーントランスファーベクターの
3'LTRのU3領域を欠失させたベクターも作成した。 ジーントランスファーベクターのベクター粒子へのパ
ッケージングには、ジーントランスファーベクター上に
存在してシスに作用する因子であるパッケージングシグ
ナルが必要であり、ベクターのパッケージングの効率を
向上させることでベクター力価が高まることが予想され
る。このため、パッケージングシグナル配列により形成
される構造を保持できるようにパッケージングシグナル
を含む領域を可能な限り長くベクターへ組み込む必要が
あるが、その一方、ジーントランスファーベクターのパ
ッケージングシグナルとパッケージングベクターとの配
列の重複を最小限にすることで、両者の間でおこると考
えられる組み換えによる野生型ウイルスの出現頻度を最
小限に抑制する必要がある。このため、ベクター系を構
築するためには、ジーントランスファーベクターを効率
的にパッケージングするために必要な最小限のパッケー
ジングシグナル配列を正確に同定することが必要であ
る。そこで、本発明者等は、5'LTRの下流の異なる長さ
の領域を含むDNA断片をジーントランスファーベクター
へ組み込んだ。これにより安全性およびパッケージング
能をともに有するベクターを提供した。 次ぎに、本発明者等は、２つの外来遺伝子を同時に発
現することができるウイルスベクターの構築を行なっ
た。Rev responsive element（RRE）はウイルス由来のR
evタンパク質の結合部位であり、RNAの核から細胞質へ
の輸送に関与している。このRRE/Revのシステムを利用
して、スプライシングの効率を制御することで単一のプ
ロモーターから同時に異なる２種のタンパク質を発現す
る系を構築することが可能であるかの検討を行なった。 まず、異なる２種のタンパク質の発現をRREにより制
御できるかを検討するため、RREの上流と下流にレポー
ター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子とベータガラク
トシダーゼ遺伝子を組み込み、さらにルシフェラーゼ遺
伝子の上流にスプライシングドナー配列を、RRE配列の
下流にスプライシングアクセプター配列をそれぞれ組み
込んだベクターを構築した。このベクターからはスプラ
イシングを受けたmRNAよりベータガラクトシダーゼタン
パク質が、スプライシングを受けないmRNAよりルシフェ
ラーゼタンパク質が発現されると考えられる。 また、単純に異なる２種の遺伝子を発現するだけでな
く、その量比をRREの配列を変えることで制御すること
が可能であるかを検討するため、６種のRRE配列を組み
込んだベクターを構築し、それぞれのベクターにおける
レポーター遺伝子の発現量を検討した。 その結果、RRE配列を有するベクターより異なる２種
の遺伝子が発現されうること、RRE配列の置換により２
種の遺伝子の発現効率を制御しうることが明らかとなっ
た。また、パッケジングベクター非存在下においても異
なる２種の遺伝子が発現されることから、本遺伝子発現
系はRevタンパク質の存在に非依存的に２種の遺伝子を
発現させうることが明らかとなった。 従来、RREはRevタンパクに依存的に作用すると考えら
れており、また、Rev/RREによる制御は、「全か無か」
的なもので、Rev−ではすべてがスプライシングされた
形となり、Rev＋ではスプライシングされない形でとな
ると考えられていた。即ち、RRE配列を変えてスプライ
シングの割合を変えるという例はなかった。従って、上
記結果によりRRE配列の改変によってスプライシングの
割合を変えることができることが初めて証明された。 さらに、本発明者等は、RREを使用した２種遺伝子の
同時発現系が、5'LTR以外の種々のプロモーターを使用
した発現系に対しても適用しうるかの検討を行なった。
プロモーターとしては、他のヒトサイトメガロウイルス
(CMV)由来のプロモーター、あるいは哺乳類細胞由来の
プロモーター（EF1αプロモーター）を使用した。その
結果、5'LTR以外のプロモーターを使用した場合におい
ても、２種の遺伝子が同時に発現されうることが明らか
となった。また、RRE配列に依存した２種遺伝子の発現
量制御も認められることが明らかとなった。これによ
り、RREによる２種遺伝子の同時発現系は種々のプロモ
ーターを用いた発現系において幅広く使用されうること
が明らかとなった。 また、レポーター遺伝子がRREの上流に組み込まれる
か下流に組み込まれるかによりそれぞれの遺伝子の発現
量がどの程度異なるかを検討した。ジーントランスファ
ーベクターでルシフェラーゼとベータガラクトシダーゼ
の位置を相互に置換したベクターを作製し、両ベクター
における２種のレポーター遺伝子の発現量を比較した。
その結果、RREの上流に組み込まれるか下流に組み込ま
れるかによりレポーター遺伝子の発現量に差は認めらな
かった。 本発明者等は、以上のように、RREは配列の利用によ
り、２つの遺伝子を同時に発現することができ、また、
用いるRRE配列の相違により該２つの遺伝子の発現比を
調節することが可能な新規ウイルスベクターを構築する
ことに成功し、これにより本発明を完成するに至った。 本発明は、より詳しくは、 （１）２つの外来遺伝子を発現させるための下記（ａ）
から（ｆ）； （ａ）発現制御配列、 （ｂ）スプライシング供与配列、 （ｃ）第一の外来遺伝子挿入部位、 （ｄ）RREコア配列、 （ｅ）スプライシング受容配列、 （ｆ）第二の外来遺伝子挿入部位、 の構成要素を5'側から3'側に向けて順に含むベクターDN
A、 （２）２つの外来遺伝子を発現させるための下記（ａ）
から（ｆ）； （ａ）発現制御配列、 （ｂ）スプライシング供与配列、 （ｃ）RREコア配列、 （ｄ）第一の外来遺伝子挿入部位、 （ｅ）スプライシング受容配列、 （ｆ）第二の外来遺伝子挿入部位、 の構成要素を5'側から3'側に向けて順に含むベクターDN
A、 （３）RREコア配列がレトロウイルス由来である、
（１）または（２）に記載のベクターDNA、 （４）RREコア配列がレンチウイルス由来である、
（１）または（２）に記載のベクターDNA、 （５）RREコア配列が免疫不全ウイルス由来である、
（１）または（２）に記載のベクターDNA、 （６）発現制御配列がLTRである、（１）から（５）の
いずれかに記載のベクターDNA、 （７）発現制御配列がLTR以外の発現制御配列を含む配
列である、（１）から（６）のいずれかに記載のベクタ
ーDNA、 （８）LTR以外の発現制御配列が、CMVLプロモーター、C
MVプロモーター、およびEF1αプロモーターからなる群
より選択される、（７）に記載のベクターDNA、 （９）スプライシング供与配列およびスプライシング受
容配列がレトロウイルス由来である、（１）から（８）
のいずれかに記載のベクターDNA、 （１０）スプライシング供与配列およびスプライシング
受容配列がレンチウイルス由来である、（１）から
（８）のいずれかに記載のベクターDNA、 （１１）スプライシング供与配列およびスプライシング
受容配列が免疫不全ウイルス由来である、（１）から
（８）のいずれかに記載のベクターDNA、 （１２）ベクターDNA上の転写されうる領域内にパッケ
ージングシグナルを含む、（１）から（１１）のいずれ
かに記載のベクターDNA、 （１３）パッケージングシグナルがレトロウイルス由来
である、（１２）に記載のベクターDNA、 （１４）パッケージングシグナルがレンチウイルス由来
である、（１２）に記載のベクターDNA、 （１５）パッケージングシグナルが免疫不全ウイルス由
来である、（１２）に記載のベクターDNA、 （１６）完全なgagタンパク質が発現しないように構築
されている（１３）から（１５）のいずれかに記載のベ
クターDNA、 （１７）gagタンパク質の翻訳開始コドンに変異を有す
る、（１３）から（１６）のいずれかに記載のベクター
DNA、 （１８）第一の外来遺伝子および第二の外来遺伝子が挿
入された、（１）から（１７）のいずれかに記載のベク
ターDNA、 （１９）第一の外来遺伝子および第二の外来遺伝子が挿
入された（１２）から（１７）のいずれかに記載のベク
ターDNAからの転写産物をウイルス粒子内部に含むレト
ロウイルスベクター、 （２０）第一の外来遺伝子および第二の外来遺伝子が挿
入された（１２）から（１７）のいずれかに記載のベク
ターDNAからの転写産物をウイルス粒子内部に含むレン
チウイルスベクター、 （２１）第一の外来遺伝子および第二の外来遺伝子が挿
入された（１２）から（１７）のいずれかに記載のベク
ターDNAからの転写産物をウイルス粒子内部に含む免疫
不全ウイルスベクター、 （２２）第一の外来遺伝子および第二の外来遺伝子が挿
入された（１２）から（１７）のいずれかに記載のベク
ターDNAをパッケージング細胞に導入し、該細胞の培養
上清から生産させたウイルス粒子を回収する工程を含
む、ウイルスベクターの調製方法、に関する。 なお、本発明において「ウイルスベクター」とは、宿
主内で外来遺伝子を発現させるための核酸分子をパッケ
ージングしたウイルス粒子を指す。 本発明における、２つの外来遺伝子を発現させるため
のベクターDNAは、構成要素として、（ａ）発現制御配
列、（ｂ）スプライシング供与配列、（ｃ）第一の外来
遺伝子挿入部位、（ｄ）RREコア配列、（ｅ）スプライ
シング受容配列、（ｆ）第二の外来遺伝子挿入部位を順
に含むベクターDNAである（但し、構成要素（ｃ）と構
成要素（ｄ）は入れ替わっていても良い）。 このベクターDNAは、２つの外来遺伝子が挿入される
と、スプライシングの有無により２つの外来遺伝子を同
時に発現することができる。その原理は、下記の如くで
ある。 ２つの外来遺伝子が挿入された該ベクターDNAは、適
当な宿主細胞に導入されると、その発現制御領域の活性
化によりスプライシング供与配列、第一の外来遺伝子、
RREコア配列、スプライシング受容配列、第二の外来遺
伝子を順に含む転写産物が生じる。この転写産物から
は、スプライシング供与配列とスプライシング受容配列
の間でスプライシングが生じなければ、第一の外来遺伝
子のみを翻訳しうるmRNAが生じる。このmRNAにコードさ
れる第１の外来遺伝子を翻訳したリボソームは、第一の
外来遺伝子のストップコドンによりRNAから離れるため
に、第２の遺伝子の翻訳は起きないと考えられる。一
方、スプライシング供与配列とスプライシング受容配列
の間でスプライシングが生じた場合には、第一の外来遺
伝子を含む領域が欠失することにより、第二の外来遺伝
子のみを翻訳しうるmRNAが生じる。従って、該ベクター
DNAが導入された宿主細胞においては、このスプライシ
ングの有無により、２つの遺伝子産物を発現させること
ができる。 本発明のベクターDNAで用いられる発現制御配列の種
類は、LTRに制限されない。ただし、後述のようにウイ
ルスベクターとして使用するためには、ウイルスを標的
細胞に感染後、逆転写されたウイルスゲノムが宿主の染
色体に組込まれる機能を有することが必要である。LTR
以外の発現制御配列でこのような機能を保持するものと
しては、例えば、実施例に示すようなLTRとそれ以外の
プロモーターとのキメラプロモーターが挙げられる。 本発明のベクターDNAに適用されるスプライシング供
与配列およびスプライシング受容配列として、通常のス
プライシング供与配列と受容配列の組み合わせを用いる
と、ほぼ100％の効率でスプライシングが起きると考え
られるので好ましくない。本発明においては、１種のRN
Aからスプライシングの差により２種以上のタンパク質
が発現される場合に使われている配列が適している。一
般に、レトロウイルスではそのような配列が多いことが
知られている（A.B. Rabson and B.J. Graves, "Synthe
sis and Processing of Viral RNA", in "Retroviruse
s", pp.205-262 (1997) eds. J.M. Coffin, S.H. Hughe
s, and H.E. Varmus, Cold Spring Harbor Laboratory
Press）。例としては、配列番号：76に示すSIVagm TYO1
のゲノム配列中6964位〜8177位までの領域が挙げられ
る。 本発明のベクターDNAにおいて第一の外来遺伝子挿入
部位は、スプライシング供与配列とスプライシング受容
配列との間に位置するようにする。第一の外来遺伝子の
挿入部位は、目的遺伝子の翻訳を阻害しない適当な制限
酵素部位を組み込むことで構築できる。第二の外来遺伝
子挿入部位は、スプライシング受容配列とポリＡ付加シ
グナルとの間に位置するように適当な制限酵素部位を組
み込み作製することができる。RRE配列は、第一の外来
遺伝子の発現を阻害しない限り、第一の外来遺伝子の挿
入部位の5'側に配置されていても3'側に配置されていて
もよい。 第一の外来遺伝子と第二の外来遺伝子の組み合わせは
特に制限されない。２種の遺伝子の組み合わせについて
有用と考えられる例を以下に示す。 ａ）治療用遺伝子と薬剤耐性マーカー 治療用遺伝子導入細胞のみをin vivoで薬剤を用いて
選択することで、導入細胞を増やしながら、非導入細胞
を減らしていく。 ｂ）治療用遺伝子と増殖因子或いはそのレセプター 治療用遺伝子導入細胞の増殖を刺激することで、導入
細胞のみを選択的に増殖させ、治療効果を高める。 ｃ）治療用遺伝子とホーミングレセプター 治療用遺伝子導入細胞が目的の部位に特異的に集まる
ように、ホーミングレセプターと共発現させる。例え
ば、AIDS治療用遺伝子とリンパ節に対するホーミングレ
セプターなど。 ｄ）治療用遺伝子とマーカー遺伝子 治療用遺伝子導入細胞にマーカーをつけることで、導
入細胞の動態、半減期を常時モニターすることが可能で
あると考えられる。もし、体外から検出できるタンパク
質があれば、導入細胞を体外から常時モニターすること
ができると考えられる。 ｅ）２種のサブユニットから構成されるタンパク質の発
現 種々のタンパク質がヘテロダイマーを形成しているこ
とが明らかとなっているが、そのようなタンパク質を発
現させることができるので、従来にくらべ治療用遺伝子
の選択の幅が広がる。 ｆ）相互作用する２種遺伝子の発現 リガンドとレセプター、酵素とその基質、シグナル伝
達分子とそのレセプターなどを発現させる。例えば、増
殖因子とそのレセプターを同時発現させれば、遺伝子導
入細胞の数を飛躍的に増やすことができる。 ｇ）相乗効果を持つ２種遺伝子の発現 種々のシグナル伝達系では、例えば、２種のリガンド
による刺激で相乗効果を示すといったように、複数のシ
グナル伝達系の活性化により相乗効果が認められること
が多い。そのような効果を持つ２種の遺伝子の発現で、
治療効果を高めることができると考えられる。 また、本発明のベクターDNAにおいては、そのRRE配列
を変えることで、転写産物のスプライシングの効率を調
節することができ、これにより宿主細胞内において発現
する２つの遺伝子産物の量比を調節することができる。
さらには、遺伝子産物の量自体を調節することも可能で
ある。 例えば、図８に示すように、RRE配列としてc/SA配列
やc/tr配列を用いれば第一の外来遺伝子の発現比率を高
めることができ、逆に、RRE配列としてc/c配列やc/x配
列を用いれば、第二の外来遺伝子の発現比率を高めるこ
とができる。また、図８に示すように、用いるRRE配列
の違いにより、外来遺伝子の発現量自体を変化させるこ
とができる。外来遺伝子の発現量の調節には、様々な利
点が存在する。例えば、遺伝子治療において２種の遺伝
子産物を発現させる場合、両者の発現量の至適発現量が
存在するが、量比を制御できることで、至適発現量に調
節して治療効果を高めることができると考えられる。例
えば、ヘテロダイマーでは、それぞれのサブユニットで
あるポリペプチドが１：１の量比で発現されれば、最も
効率が良いと考えられ、また、酵素と基質であれば、酵
素を少なくして基質を多くすれば効率が高まると考えら
れる。 本発明のベクターの生体への導入法は、例えば以下の
ようにして行うことができる。 ａ）DNA単体での導入 筋細胞への投与は、DNA単独で可能であるので、DNAを
そのままベクターとして投与できると考えられる。 ｂ）非ウイルス系ベクターとしての投与 リボフェクトアミンやポリカチオニックリボソームな
ど、DNAと合成したトランスフェクション用の化合物と
の複合体の形で投与することが可能であると考えられ
る。 ｃ）ウイルスベクターとしての投与 アデノウイルスなどのDNA型ウイルスベクターへ組み
込み、投与することも可能であると考えられる。 本発明のベクターDNAを用いて、これをパッケージン
グしたウイルス粒子を生産するためには、本発明のベク
ターDNAの転写されうる領域内にパッケージングシグナ
ルを含むことが必要である。パッケージングシグナル配
列により形成される構造を保持できるようにパッケージ
ングシグナルを含む領域は、可能な限り長く該ベクター
へ組み込む必要があるが、その一方、該ベクターDNA上
のパッケージングシグナルとパッケージングベクターと
の間で起こる組み換えによる野生型ウイルスの出現頻度
を抑制するためにはこれらベクター間の配列の重複を最
小限にする必要がある。従って、本発明のベクターDNA
の構築においては、パッケージング効率および安全性の
両者を満足させるために、パッケージングに必要な配列
を含むできる限り短い配列を用いることが好ましい。 パッケージングシグナルとしては、パッケージングベ
クターが導入された細胞によりパケージングされる限り
制限はなく、パッケージングベクターの種類に合わせ
て、レトロウイルス由来、レンチウイルス由来、免疫不
全ウイルス由来のシグナルなどが用いられる。 例えば、実施例で用いたSIVagm由来のパッケージング
ベクターの場合は、HIVベクターはパッケージングされ
ないため、用いられるシグナルの由来としてはSIVのみ
に制限されると考えられる。但し、HIV由来のパッケー
ジングベクターを用いた場合、SIV由来のジーントラン
スファーベクターのパッケージングされるので、組換え
ウイルスの出現頻度を低下させるために、異なるレンチ
ウイルス由来のジーントランスファーベクターとパッケ
ージングベクターとを組み合わせてベクター粒子を形成
させることが可能であると考えられる。この場合、霊長
類のレンチウイルスの間の組み合わせ（例えば、HIVとS
IV）であることが好ましい。 本発明のベクターDNAでは、gagタンパク質が発現しな
いように改変されていることが好ましい。ウイルスgag
タンパク質は、生体にとって異物として認識され、抗原
性が現れる可能性がある。また、細胞の機能に影響を及
ぼす可能性もある。従って、本発明のジーントランスフ
ァーベクターにおいては、gagタンパク質は発現しない
ように改変されていることが好ましい。 gagタンパク質を発現しないようにするためには、gag
の開始コドンの下流に塩基の付加や欠失等によりフレー
ムシフトするように改変することができる。また、gag
タンパク質のコード領域の一部を欠失させることが好ま
しい。ウイルスのパッケージングには、gagタンパク質
のコード領域の5'側が必要であるとされている。従っ
て、本発明のジーントランスファーベクターにおいて
は、gagタンパク質コード領域のＣ末側を欠失している
ことが好ましい。パッケージング効率に大きな影響を与
えない範囲でできるだけ広いgagコード領域を欠失させ
ることが好ましい。具体的には、gagコード領域の150bp
を残し、それより3'側を欠失させることができる。ま
た、gagタンパク質の開始コドン（ATG）をATG以外のコ
ドンに置換することも好ましい。置換するコドンは、パ
ッケージング効率に対する影響が少ないものが好まし
い。これにより構築されたパッケージングシグナルを有
する本発明のベクターDNAを、適当なパッケージング細
胞に導入することにより、ウイルスベクターを生産させ
ることができる。生産させたウイルスベクターは、パッ
ケージング細胞の培養上清から回収することができる。 パッケージング細胞に使われる細胞としては、一般的
にウイルスを産生に使用される細胞株であれば制限はな
い。ヒトの遺伝子治療用に用いることを考えると、細胞
の由来としてはヒトまたはサルが適当であると考えられ
る。パッケージング細胞として使用されうるヒト細胞株
としては、例えば293細胞、293T細胞、293EBNA細胞、SW
480細胞、u87MG細胞、HOS細胞、C8166細胞、MT-4細胞、
Molt-4細胞などが挙げられる。サル由来細胞株として
は、例えば、COS1細胞、COS7細胞、CV-1細胞、BMT10細
胞などが挙げられる。 HIV、SIV、およびFIVなどのレンチウイルスを基に作
製した本発明のベクターは非分裂細胞に遺伝子を組み込
むことができるため、既存のレトロウイルスベクターの
遺伝子治療の限界を超えて、有効性を高めることへ貢献
することが考えられる。即ち、本発明のベクターによっ
て、非分裂細胞に多様な治療用遺伝子を染色体にインテ
グレーションすることが可能となる。 本発明により各種遺伝性疾患の遺伝子治療にも応用が
可能である。対象となる疾患とその単一原因遺伝子とし
て、ゴーシェ病においてはβ−セレブロシダーゼ（第２
０染色体）、血友病においては血液凝固第８因子（Ｘ染
色体）および血液凝固第９因子（Ｘ染色体）、アデノシ
ンデアミナーゼ欠損症においてはアデノシンデアミナー
ゼ、フェニルケトン尿症においてはフェニルアラニンヒ
ドロキシラーゼ（第１２染色体）、Duchenne型筋ジスト
ロフィーにおいてはジストロフィン（Ｘ染色体）、家族
性高コレステロール血症においてはLDLレセプター（第
１９染色体）、繊維性嚢ほう症においてはCFTR遺伝子の
染色体への組み込み等が考えられる。それら以外の複数
の遺伝子が関与していると思われている対象疾患として
は、アルツハイマー、パーキンソン病等の神経変性疾
患、虚血性脳障害、痴呆、またエイズ等の難治性の感染
症等が考えられる。エイズ患者の造血幹細胞を細胞外に
とりだしin vitroでSIVベースの本発明のベクターを作
用させて、HIVの感染が起こる前にSIVに由来するゲノム
転写を優勢にして、患者の体に戻し、HIVの転写因子を
無効にする治療方法が考えられる。さらには、慢性疾患
への応用として、虚血性心疾患においてはVEGFならびに
FGF2遺伝子、動脈硬化の遺伝子治療に関しては、細胞増
殖関連遺伝子、例えば細胞増殖因子（PDGF、TGF-β
等）、Cyclin-dependent kinase等の発現抑制への応用
が可能となる。また糖尿病においてはBDNF遺伝子が候補
となりうる。またこの方法により、遺伝子変異が癌化を
引き起こす癌抑制遺伝子p53等の遺伝子を染色体に組み
込む補充治療への応用、多剤耐性遺伝子をin vitroで骨
髄由来造血幹細胞に導入した後、患者の血液に戻すこと
によって、癌の薬物治療の限界を超えた治療が可能とな
る。自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、慢性関節リウ
マチ、SLE、糸球体腎炎等の遺伝子治療に関しては、Ｔ
細胞レセプター、各種接着因子（例えばICAM-1、LFA-
1、VCAM-1、LFA-4等）、サイトカインおよびサイトカイ
ンレセプター（例えばTNF、IL-8、IL-6、IL-1等）細胞
増殖因子（例えばPDGF、TGF-β等）、作用因子（例えば
MMP等）のアンチセンス発現による発現抑制への応用が
可能となる。アレルギー性疾患の遺伝子治療に関して
は、IL-4、FcεR-I等のアンチセンス発現による発現抑
制への応用が可能となる。臓器移植に関連する遺伝子治
療に関しては、ヒト以外の動物ドナーの組織適合性抗原
をヒト型に変えて異種移植の成功率を高める応用が可能
となる。さらにはヒトES細胞の染色体に外来遺伝子を導
入し、胚の段階で欠損する遺伝子を補って、体循環する
酵素、成長因子等の不足を補充する治療が考えられる。 図面の簡単な説明 図１は、サル免疫不全ウイルスクローンSIVagmTYO1を
用いたレンチウイルスベクターシステムの概要を示す図
である。 図２は、5'LTRのプロモーター配列であるU3領域を他
のプロモーター配列に置換したSIVagmジーントランスフ
ァーベクターの構造図である。 図３は、SIVagmジーントランスファーベクターの3'LT
RのU3領域を他のプロモーター配列へ置換したベクター
の構造と、それが標的細胞で逆転写された結果生じると
予想される、5'LTRのU3プロモーター領域の構造を示し
た図である。 図４は、ジーントランスファーベクターのパッケージ
ングシグナルの同定方法の概念図である。 図５は、ジーントランスファーベクターのgagタンパ
ク質の翻訳開始コドンに対する点突然変異体を用いたパ
ッケージングシグナルの同定方法の概念図である。 図６は、RREによる２遺伝子同時発現ベクターの構造
図である。RREの上流と下流にレポーター遺伝子として
ルシフェラーゼ遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が
組み込まれ、更にルシフェラーゼ遺伝子の上流にスプラ
イシングドナー配列を、RRE配列の下流にスプライシン
グアクセプター配列がそれぞれ組み込まれている。ベク
ターからはスプライシングの有無により２種のmRNAが産
生される。 図７は、さまざまなRRE配列を有するベクターの構造
図である。 図８は、プロモーターに5'LTRを持ち、さまざまさRRE
配列を有するベクターより発現される２種の遺伝子の発
現量を測定した結果を示す。 図９は、グラフは、5'LTR以外の種々のプロモーター
を用いて構築した２遺伝子同時発現系における遺伝子発
現を示す。プロモーターとしては、ヒトサイトメガロウ
イルス(CMV)由来のプロモーター、あるいは哺乳類細胞
由来のプロモーター（EF1αプロモーター）を使用し
た。下段にベクターの構造図を示した。 図１０は、SIVagmジーントランスファーベクターでRR
E6/s（6964-7993）配列を含む２遺伝子同時発現ベクタ
ーについて、ルシフェラーゼとβ−ガラクトシダーゼの
位置を相互に置換したベクターを作製し（下段）、両ベ
クターにおける２種のレポーター遺伝子の発現量を比較
した結果を示す（グラフ）。 図１１は、SIVagm SINベクターにより、G2-M期で停止
状態の293T細胞（Ａ）およびレチノイン酸により分化を
誘導したSH-SY5Y細胞（Ｂ）に対してEGFP遺伝子を導入
し、蛍光顕微鏡で発現を確認した写真である。 図１２は、SIVagmベクターによりヒトPBMCに対してEG
FP遺伝子を導入し、フローサイトメーターで発現を解析
した図である。縦軸が細胞数、横軸がEGFPの発現量に対
応する蛍光強度を表す。M1の範囲に含まれる細胞がEGFP
陽性であり、図中の数値がEGFP陽性率（％）を示す。 図１３は、SIVagmベクターによりヒトPBMC由来Ｔ細胞
に対してEGFP遺伝子を導入し、フローサイトメーターで
発現を解析した図である。 図１４は、SIVagmベクターによりヒト骨髄血由来CD34
陽性細胞に対してEGFP遺伝子を導入し、フローサイトメ
ーターで発現を解析した図である。EGFPとPE系統の２カ
ラーにより解析を行い、EGFP陽性率を求めた。R2の領域
に含まれる細胞がEGFP陽性であり、図中の数値がEGFP陽
性率（％）を示す。 図１５は、SIVagmベクターによりヒト臍帯血由来CD34
陽性細胞に対してEGFP遺伝子を導入し、フローサイトメ
ーターで発現を解析した図である。 図１６は、SIVagmベクターによりカニクイザル骨髄由
来CD34陽性細胞に対してEGFP遺伝子を導入し、フローサ
イトメーターで発現を解析した図である。 図１７は、SIVagmベクターによりEGFP遺伝子を導入し
たヒト臍帯血由来CD34陽性細胞をNOD/SCIDマウスに移植
し、５週および６週後の末梢血中におけるヒト細胞の割
合をフローサイトメーターで解析した図である。PE標識
抗ヒトCD45抗体によってマウス末梢血白血球中のヒトリ
ンパ球を染色し、EGFPとの２カラーによる解析を行っ
た。UL、UR、LL、LRはそれぞれ各図の左上、右上、左
下、右下の領域を表し、ULとURの領域に含まれる細胞が
CD45陽性であり、URの領域に含まれる細胞がCD45陽性か
つEGFP陽性である。図中の数値は、各領域に含まれる細
胞数の全細胞数に対する割合（％）を示す。 発明を実施するための最良の形態 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明は、これら実施例に制限されるものではな
い。 ［実施例１］ SIVagmベクターの構築と性能の確認 非病原性のサル免疫不全ウイルスクローンであるSIVa
gmTYO1を用いて、新規レンチウイルスベクターの構築を
下記のように行った。図１にベクターシステムの概要を
示す。 ベクター系の構築には、非病原性のアフリカミドリザ
ル免疫不全ウイルスのクローンであるSIVagmTYO1を用い
た。ヌクレオチドの番号は以下すべてウイルスRNAの転
写開始点を＋１として表記した。SIVagmTYO1を組み込ん
だプラスミドとしてはpSA212（J.Viol.,vol.64,pp307-3
12,1990）を用いた。また、ライゲーション反応は、す
べてLigation High（東洋紡）を用い添付説明書に従っ
て行った。 ａ．パッケージングベクターの構築 まず、vifとtat/revの第１エクソンを含む領域(5337-
5770)に相当するDNA断片をプライマー1F（配列番号：
１）と1R（配列番号：２）を用いてpSA212をテンプレー
トとしたPCRにより得た。PCRプライマーに制限酵素部位
であるEcoRI部位を付加することでDNA断片の3'端にEcoR
I部位をもつ断片を調製した。PCR断片をBgIIIとEcoRIに
より切断した後、アガロースゲル電気泳動とWizard PCR
Preps DNA Purification System (Promega) で精製し
た。以上のようにして得たDNA断片と、gag/pol領域をコ
ードするDNA断片（XhoI（356）部位からBglII（5338）
部位までを含む）を、pBluescript KS+（Stratagene）
のXhoI-EcoRI部位へライゲーションした。次に、Rev re
sponsive element（RRE）とtat/revの第２エクソンを含
む領域（6964-7993）に相当するDNA断片をPCRで増幅し
た。上記のPCR断片と同様にプライマー2F（配列番号：
３）と2R（配列番号：４）を用いてpSA212をテンプレー
トとしたPCRにより3'端にNotI部位を付加し、EcoRIとNo
tIで切断後に精製し、gag-tat/revを組み込んだpBluesc
ript KS＋のEcoRI-NotI部位へ組み込んだ。 さらに、スプライシングドナー（SD）部位を含むDNA
断片を合成した（配列3F（配列番号：５）と3R（配列番
号：６））。合成時に5'端にXhoI部位、3'端にSaII部位
を付加し、上記のgag-RRE-tat/revを組み込んだpBluesc
ript KS＋のXhoI部位へ組み込んだ。得られたプラスミ
ドをXhoIとNotIにより切断し、SD〜tat/revを含む断片
を精製し、pCAGGS（Gene,vol.108,pp193-200, 1991）の
EcoRI部位にXhoI/NotIリンカー（配列4F（配列番号：
７）と4R（配列番号：８））を組み込んだプラスミドの
XhoI-NotI部位へ組み込んだ。以上の方法により得られ
たプラスミドをパッケージングベクター（pCAGGS/SIVag
m gag-tat/rev）として使用した。 ｂ．ジーントランスファーベクターの構築 SIVagmTYO1由来の5'LTR領域（8547-9053＋1-982、5'
端にKpnI部位、3'端にEcoRI部位を付加）はプライマー5
-1F（配列番号：９）と5-1R（配列番号：10）を、RRE
（7380-7993、5'端にEcoRI部位、3'端にSacII部位を付
加）はプライマー5-2F（配列番号：11）と5-2R（配列番
号：12）を、3'LTR（8521-9170、5'端にNotIとBamHI部
位、3'端にSacI部位を付加）はプライマー5-3F（配列番
号：13）と5-3R（配列番号：14）をそれぞれ用いてpSA2
12をテンプレートとしたPCRにより増幅した。pEGFPC2
（Clontech）由来のCMVプロモーター領域とEGFPをコー
ドする領域（1-1330、5'端にSacII部位、3'端にNotI部
位とBamHI部位と翻訳ストップコドンを付加）をプライ
マー6F（配列番号：15）と6R（配列番号：16）を用いて
pEGFPC2をテンプレートとしたPCRにより増幅した。４種
のPCR断片をそれぞれ制限酵素KpnIとEcoRI、EcoRIとSac
II、BamHIとSacI、SacIIとBamHI切断した後に精製し、p
Bluescript KS＋のKpnI-SacIの間に5'LTR→3'LTR→RRE
とCMVプロモーターEGFPの順にライゲーションして組み
込んだ（pBS/5'LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3'LTR）。
レポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼを使用す
る場合には、上記のようにしてPCRにより調製した5'LTR
領域と3'LTR領域を含むDNA断片をそれぞれ制限酵素KpnI
とEcoRI、NotIとSacIで切断した後に精製し、pBluescri
pt KS＋のKpnI-EcoRIとNotI-SacIにそれぞれ組み込んだ
プラスミド（pBS/5' LTR.U3G2/WT3' LTR)NotI部位にpCM
V-beta（Clontech）のβ−ガラクトシダーゼをコードす
る領域を含むNotI断片（820-4294）を組み込んだ（pBS/
5' LTR.U3G2/beta-gal/WT3' LTR）。次にプラスミドpBS
/5' LTR.U3G2/beta-ga1/WT3' LTRのEcoRI-NotI部位に、
プライマー7-1F（配列番号：17）と7-1R（配列番号：1
8）を用いてpSA212をテンプレートとしたPCRにより増幅
したRRE配列（6964-8177、5'端にEcoRI部位、3'端にNot
I部位を付加）を組み込んだ（pBS/5' LTR.U3G2/RRE6/tr
/beta-gal/WT3' LTR）後にRRE配列をEcoRIとNheIで切り
出し、プライマー7-2F（配列番号：19）と7-2R（配列番
号：20）を用いて、pSA212をテンプレートしたPCRによ
り増幅したRRE配列（7380-7993、5'端にEcoRI部位、3'
端にNheI部位を付加）を組み込んだ。以上の方法で得ら
れたプラスミド（pBS/5' LTR.U3G2/REEc/s/beta-gal/WT
3' LTR）をNheIとSmaIで切断し平滑末端化した後、pEGF
PN2(Clontech)由来のCMVプロモーター領域（8-592、Ase
I-NheI断片を平滑末端化）を組み込んだ（pBS/5' LTR.U
3G2/REEc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTR）。平滑末端化反応
はすべてBlunting High（東洋紡）を使用して添付説明
書に従って行った。プラスミドpBS/5' LTR.U3G2/REEc/s
/CMVFEGFP/WT3' LTRとpBS/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVFbet
a-gal/WT3' LTRをそれぞれKpnI-SacIで切断して5' LTR-
3' LTRを含むDNA断片を調製し、pGL3Control（Promeg
a）ベクターのKpnI-SacI部位へ組込み、ジーントランス
ファーベクター（pGL3C/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-
galまたはEGFP/WT3' LTR）として使用した。パッケージ
ングシグナルの同定には、pBS/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMV
Fbeta-gal/WT3' LTRプラスミドの5'LTRをKpnIとEcoRIで
切り出し、種々の長さの異なる領域を含むDNA断片をプ
ライマー8F（配列番号：21）と8-1Rから12R（配列番
号：22から33）を用いてpSA212をテンプレートとしたPC
Rで調製した12種のDNA断片を、KpnI-EcoRI部位へ組み込
んだベクターを使用した。 また、gagポリペプチドをコードする領域にフレーム
シフトを導入したベクターはプライマー8F（配列番号：
21）と8-3R（配列番号：24）用いてpSA212をテンプレー
トとしたPCRで調製したDNA断片をKnpI-EcoRI部位へ組み
込んだベクターのEcoRI部位へ8-FSF（配列番号：34）と
8-FSR（配列番号：35）を用いてpSA212をテンプレート
としたPCRで調製したDNA断片を組み込むことで得た。ga
gポリペプチドの翻訳開始コドン（ATG）に対して点突然
変異を導入したベクターはプライマー8F（配列番号：2
1）と8-PMR1から９（配列番号：36から44）を用いてpSA
212をテンプレートとしたPCRで調製したDNA断片をKpnI-
EcoRI部位へ組み込んだベクターのEcoRI部位へ8-FSF
（配列番号：34）と8-FSR（配列番号：35）を用いてpSA
212をテンプレートとしたPCRで調製したDNA断片を組み
込むことで得た。 ベクターの性能確認の一般的な方法は以下の通りであ
る。293T細胞を６ウェルのプラスチックプレート（住友
ベークライト）へ１ウェルあたり5X105個の細胞密度で
まき、炭酸ガスインキュベーター中（37℃、10%炭酸ガ
ス存在下）で48時間培養する。培養後に培養液を１ウェ
ルあたり800μｌのOptiMEMに置換してトランスフェクシ
ョンに使用する。DNA量は１ウェルあたり300ngのジーン
トランスファーベクターと600ngのパッケージングベク
ターと100ngのVSV-G発現ベクター（pHCMV-G,Methods in
Cell Biology, vol.43,pp99-112,1994）を使用する。D
NAを100μｌのＯｐｔｉＭＥＭに溶解後に６μｌのPLUS
reagentを加えて撹拌後15分室温で静置する。DNAとPLUS
reagentとの混合液に、100μｌのOptiMEMで希釈した４
μｌのLIPOFECTAMINEを添加して撹拌後さらに15分室温
で静置する。以上の方法により調製したDNAとLIPOFECTA
MINEとの複合体を含む溶液をを６ウェルプレートで培養
している293T細胞へ滴下してゆるやかに撹拌した後に炭
酸ガスインキュベーター中（３７℃10%炭酸ガス存在
下）で３時間培養する。培養後１ウェルあたり1mlの20%
非動化ウシ胎児血清を含むD-MEMを添加し、炭酸ガスイ
ンキュベーター中で37℃10%炭酸ガス存在下で12時間培
養した後、１ウェルあたり2mlの10%非動化ウシ胎児血清
を含むD-MEMに培地交換し、さらに24時間培養した後に
細胞の培養上清を0.45μmのポアサイズのフィルター（D
ISMIC-25CSフィルター、ADVANTEC）で濾過してアッセイ
に使用する。 濃縮ストックを調製する場合には、まず293T細胞を15
センチメートルのプラスチックプレート（住友ベークラ
イト）へ１プレートあたり2.5X106個の細胞密度でま
き、炭酸ガスインキュベーター中（37℃、10%炭酸ガス
存在下）で48時間培養後に培養液を１ウェルあたり10ml
のOptiMEMに置換してトランスフェクションに使用す
る。DNA量は１プレートあたり６μｇのジーントランス
ファーベクターと３μｇのパッケージングベクターと１
μｇのVSV-G発現ベクター（pHCMV-G）を使用する。DNA
を1.5mlのOptiMEMに溶解後に40μｌのPLUS reagentを加
えて撹拌後１５分室温で静置する。DNAとPLUS reagent
との混合液に、1mlのOptiMEMで希釈した60μｌのLOPOFE
CTAMINEを添加して撹拌後さらに15分室温で静置する。
以上の方法により調製したDNAとLIPOFECTAMINEとの複合
体を含む溶液を６ウェルプレートで培養している293T細
胞へ滴下してゆるやかに撹拌した後に炭酸ガスインキュ
ベーター中で37℃10％炭酸ガス存在下で３時間培養す
る。培養後１プレートあたり10mlの20％非動化ウシ胎児
血清を含むD-MEMを添加し、炭酸ガスインキュベーター
中で37℃10％炭酸ガス存在下で12時間培養した後培地を
１プレートあたり20mlの10％ウシ胎児血清を含むD-MEM
に交換し、さらに24時間培養した後に培養上清を0.45μ
mのポアサイズのフィルターで濾過後に、セントリプラ
スYM-100（Amicon）を用いて４℃、3000ｇの条件で170
分遠心し限外濾過を行うことで100倍に濃縮する。濃縮
後のサンプルはマイナス80℃で保存してアッセイに使用
する。 これにより調製したSIVagmウイルスベクターは、ヒト
細胞株293Tなどを用いて遺伝子導入効率を決定すること
ができる。また、後述のアフィジコリン処理（G1-S期で
の停止）やＸ線照射（G2-M期での停止）により、特定の
細胞周期における遺伝子導入効率を検討することもでき
る。 また、SIVagmベクターの導入実験を各種細胞を用いて
試行すれば、SIVagmベクターがより生理的状態に近い細
胞に対しても同様に遺伝子導入しうるかを決定すること
ができる。そのような細胞としては、例えば、ヒト神経
芽細胞株RBTM1とSH-SY5Y細胞を全トランス型レチノイン
酸処理により分化誘導させたものや、ラット初代培養脳
細胞（後述）などか挙げられる。 ［実施例２］ 5'LTRの改変 レンチウイルスの5'LTRの転写活性は一般にウイルス
由来の因子であるTatタンパク質の存在に依存してい
る。そこで、Tatに対する依存性を解消するためと、よ
り転写活性の強いプロモーター配列に置換することでベ
クター力価を高めるために、5'LTRのプロモーター配列
であるU3領域を他のプロモーター配列に置換したSIVagm
ジーントランスファーベクターを作製した（図２）。 5'LTRのキメラプロモーターへの置換は、以下のよう
にして行った。5'LTRのTATAボックスの下流〜gag領域
（9039-9170＋1-982）を含む断片をプライマー9-1Fから
3F（配列番号：45から47）と9R（配列番号：48）を用い
てpSA212をテンプレートとしたPCRで増幅した。また、C
MVLプロモーター（pCI（Promega）由来、1-721）、CMV
プロモーター（pEGFPN2（Clontech）由来、1-568）、EF
1アルファプロモーター（pEF-BOS（Nucleic Acids Rese
arch,vol.18,p5322,1990）の2240-2740）、CAプロモー
ター（pCAGGSの5-650）を含む断片をそれぞれプライマ
ー10-1F（配列番号：49）と10-1R（配列番号：50）、10
-2F（配列番号：51）と10-2R（配列番号：52）、10-3F
（配列番号：53）と10-3R（配列番号：54）、10-4F（配
列番号：55）と10-4R（配列番号：56）を用いてそれぞ
れpCI、pEGFPN2、pEF-BOS、pCAGGSをテンプレートとし
たPCRで増幅した。増幅後に5'LTRを含む断片と上記の各
プロモーターを含む断片とを混合し、それぞれのプロモ
ーターの5'側のプライマー（10-1F（配列番号：49）、1
0-2F（配列番号：51）、10-3F（配列番号：53）、10-4F
（配列番号：55））と、5'LTRの3'側のプライマー（9
R）を添加し、更に10サイクルのPCR反応を行うことで、
４種のプロモーターと5'LTRとのキメラプロモーターのD
NA断片を得た。得られたDNA断片は、ジーントランスフ
ァーベクター（pGL3C/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-ga
l/WT3' LTR）のKpnI-EcoRI部位に組み込んだ（pGL3C/CM
VL.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTR、pGL3C/CMV.U3
G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTR、pGL3C/EF1アルフ
ァ．L3G2/RREc/s/CMVFbeta-ga1/WT3' LTR、pGL3/CAG.U3
G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTR）。 ［実施例３］ 3'LTRの改変 レンチウイルスベクターにおいては、3'LTR領域に含
まれるプロモーター配列であるU3領域が、標的細胞中で
逆転写される時に5'LTRのU3プロモーター領域へ組み込
まれるため、標的細胞のゲノム内では、ジーントランス
ファーベクタープラスミドの3'LTR領域に含まれるU3領
域が、遺伝子発現に関与する5'LTRのU3プロモーターと
なることが明らかとなっている（図３）。そこで標的細
胞中で遺伝子発現に関与するプロモーターをU3配列以外
のプロモーターに置換しうるかを検討することが可能
な、SIVagmジーントランスファーベクターの3'LTRのU3
領域を他のプロモーター配列へ置換したベクターを作成
した（図３）。また、同時に標的細胞中で5'LTRに存在
するプロモーター配列を欠失させうるかを検討すること
が可能な、SIVagmジーントランスファーベクターの3'LT
RのU3領域を欠失させたベクターも作成した。 3'LTRのU3プロモーター配列の改変と欠失は、以下の
ように行った。3'LTRのU3を含まないDNA断片をプライマ
ー11F（配列番号：57）と11R（配列番号：58）を用いて
pSA212をテンプレートとしたPCRで増幅した。また、U3
領域を他のプロモーターへ置換した3'LTRはプライマー1
2-1Fから3F（配列番号：59から61）と12R（配列番号：6
2）を用いて、実施例２に記載の方法で得られたキメラ
プロモーターを組み込んだベクタープラスミドであるpG
L3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTR、pGL3C/
EF1アルファ．U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTR、pG
L3C/CAG.U3G2/RREC/S/CMVFbeta-gal/WT3' LTRをそれぞ
れテンプレートとしてPCRで増幅した。PCRにより得られ
たDNA断片はSalIとSacIで切断後に精製し、pGL3C/CMVL.
U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTRのSalI-SacI部位へ
組込み込んだ（pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/
3LTRdeltaU3、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/C
MVL.R、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/EF1アル
ファ．R、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/CAG.
R）。 ［実施例４］ パッケージングシグナルの同定 ジーントランスファーベクターのベクター粒子へのパ
ッケージングには、ジーントランスファーベクター上に
存在してシスに作用する因子であるパッケージングシグ
ナルとパッケージングベクターより供給されトランスに
作用するタンパク質が必要である。ベクターのパッケー
ジングの効率を向上させることでベクター力価が高まる
ことが予想されるため、パッケージングシグナルの配列
により形成される構造を保持出来るようにパッケージン
グシグナルを含む領域を可能な限り長くベクターへ組み
込む必要がある。一方、ジーントランスファーベクター
のパッケージングシグナルとパッケージングベクターと
の配列の重複を最小限にすることで、両者の間でおこる
と考えられる組み換えによる野生型ウイルスの出現頻度
を最小限にする事が可能となることから、パッケージン
グに必要な最小領域を同定することが必要である。従っ
て、ベクター系を構築するためには、ジーントランスフ
ァーベクターを効率的にパッケージングするために必要
な最小限のパッケージングシグナル配列を正確に同定す
ることが必要である。パッケージングシグナルの同定
は、図４に示す方法で行ないうる。 gag領域により発現されるポリペプチドがパッケージ
ングに必要であるのか、あるいはgag領域のDNA配列自身
が必要であるかについては、図５に示すような変異を導
入したジーントランスファーベクターと野生型ジーント
ランスファーベクターのパッケージン効率を比較するこ
とで明らかにしうる。 ［実施例５］ 新規２種遺伝子の同時発現系の開発 Rev responsive element（RRE）はウイルス由来のRev
タンパク質の結合部位であり、RNAの核から細胞質への
輸送に関与している。このRRE/Revのシステムを利用し
て、スプライシングの効率を制御することで単一のプロ
モーターから同時に異なる２種のタンパク質を発現する
系を構築することが可能であるかを検討した。 まず、異なる２種のタンパク質の発現をRREにより制
御できるかを検討するため、図６に示すベクターを構築
した。すなわちRREの上流と下流にレポーター遺伝子と
してルシフェラーゼ遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子を組み込み、更にルシフェラーゼ遺伝子の上流にスプ
ライシングドナー配列を、RRE配列の下流にスプライシ
ングアクセプター配列をそれぞれ組み込んだベクターを
構築した。図６に示すようにこのベクターからはスプラ
イシングの有無により２種のmRNAが産生される事が予想
される。すなわちスプライシングを受けたmRNAよりβ−
ガラクトシダーゼタンパク質が、スプライシングを受け
ないmRNAよりルシフェラーゼタンパク質が発現されると
考えられる。また、単純に異なる２種の遺伝子を発現す
るだけでなく、その量比をRREの配列を変えることで制
御することが可能であるかを検討するため、６種のRRE
配列を組み込んだベクターを構築し、それぞれのベクタ
ーにおけるレポーター遺伝子の発現量を検討した。 ２遺伝子発現系を組み込んだベクターとRRE配列の活
性検討用ベクターの構築は、以下のように行った。ルシ
フェラーゼ、あるいはEGFPをコードする遺伝子断片の5'
と3'の両端にEcoRI部位を付加したDNA断片をプライマー
13-1F（配列番号：63）と13-1R（配列番号：64）、13-2
F（配列番号：65）と13-2R（配列番号：66）を用いpSP-
Iuc+(Promega)とpEGFPN2(Clontech)をそれぞれテンプレ
ートとしたPCRにより増幅した。 プラスミドpBS/5' LTR.U3G2/RRE6/tr/beta-gal/WT3'
LTRをKpnIとEcoRIで切断し、プライマー14F（配列番
号：67）と14R（配列番号：68）を用いてpSA212をテン
プレートとしたPCRにより得た5'LTRを含むDNA断片を組
み込んだ（pBS/5' LTR.U3Met-/RRE6/tr/beta-gal/WT3'
LTR）。プラスミドpBS/5' LTR.U3Met-/RRE6/tr/beta-ga
l/WT3' LTRをEcoRIとNheIで切断してRRE配列を切り出
し、種々のRRE配列を含むDNA断片を３種のプライマー
（15-1F（配列番号：69）と15-2F（配列番号：70））
と、３種のプライマー（15-1R（配列番号：71）、15-2R
（配列番号：72）、15-3R（配列番号：73））を組み合
わせてpSA212をテンプレートとしたPCRにより得た６種
のDNA断片をEcoRIとNheI、あるいはEcoRIとXbaIで切断
後に精製したDNA断片へ置換した。得られたプラスミド
のEcoRI部位に、PCRにより調製したルシフェラーゼ、あ
るいはEGFPをコードする遺伝子断片をEcoRIで切断後に
精製したものを組み込みRRE配列の活性検討用のアッセ
イに使用した（図７）。 レポーター遺伝子の位置の置換は、以下のように行っ
た。RRE6/s（6964-7993）配列を含むプラスミドpBS/5'
LTR.U3Met-/RRE6/s/beta-gal/WT3' LTRをNheIとSalIで
切断し、β−ガラクトシダーゼをコードする領域を含む
断片を切り出した後、ルシフェラーゼをコードする領域
を含むNheI-XhoI断片（pSP-luc+由来、17-1723）を組み
込んだ（pBS/5' LTR.U3Met-/RREc/s/luc+/WT3' LTR）。
次に、pBS/5' LTR.U3Met-/RREc/s/luc+/WT3' LTRをEcoR
I切断後に平滑末端化し、pCMV-beta(Clontech)のβ−ガ
ラクトシダーゼをコードする領域を含むNotI断片（820-
4294）を平滑末端化後に精製したものを組み込み（pBS/
5' LTR.U3Met-/beta-gal/RREc/s/Iuc+/W3' LTR）アッセ
イに使用した。平滑末端化反応はともにBlunting High
（東洋紡）を使用して添付説明書に従って行った。 プラスミドpBS/5' LTR.U3Met-/RREc/s/beta-gal/WT3'
LTRをKpnIとEcoRIで切断して5'LTRをプライマー16F
（配列番号：74）と16R（配列番号：75）を組み合わせ
てpSA212をテンプレートとしたPCRにより得たDNA断片を
組み込んだ（pBS/5' LTR.U3G3/RREc/s/beta-gal/WT3' L
TR）。 pBS/5' LTR.U3G3/RREc/s/beta-gal/WT3' LTRのEcoRI
部位に、PCRにより調製したEGFPをコードする遺伝子断
片をEcoRIで切断後に精製したものを組んだ後に、KpnI-
SacIで切断して5'LTR-3'LTRを含むDNA断片を調製し、pG
L3Control（Promega）ベクターのKpnI-SacI部位へ組込
みin situでの２遺伝子発現系の検定に用いた。 このようにして構築したジーントランスファーベクタ
ーを後述ように293T細胞にトランスフェクションし、β
−ガラクトシダーゼアッセイとルシフェラーゼアッセイ
を行った。その結果、図８のグラフに示すように、RRE
配列を有するベクターより異なる２種の遺伝子が発現さ
れうること、RRE配列の置換により２種の遺伝子の発現
効率を制御しうることが明らかとなった。また、パッケ
ジングベクター非存在下においても異なる２種の遺伝子
が発現されることから、本遺伝子発現系はRevタンパク
質の存在に非依存的に２種の遺伝子を発現させうること
が明らかとなった。 ［実施例６］ ２種遺伝子の同時発現系のプロモーター
に対する特異性 上記実施例ではプロモーターはSIVagmTYO1の5'LTRプ
ロモーターを使用していたが、RREを使用した２種遺伝
子の同時発現系が、5'LTR以外の種々のプロモーターを
使用した発現系に対しても適用しうるかを検討した。プ
ロモーターとしては、他のヒトサイトメガロウイルス
（CMV）由来のプロモーター、あるいは哺乳類細胞由来
のプロモーター（EF1αプロモーター）を使用した（図
９下段）。 その結果、図９のグラフに示すように5'LTR以外のプ
ロモーターを使用した場合においても、２種の遺伝子が
同時に発現されうることが明らかとなった。また、RRE
配列に依存した２種遺伝子の発現量制御も認められるこ
とが明らかとなった。従ってRREによる２種遺伝子の同
時発現系は種々のプロモーターを用いた発現系において
幅広く使用されうることが明らかとなった。 ［実施例７］ レポーター遺伝子の位置効果 レポーター遺伝子がRREの上流に組み込まれるか下流
に組み込まれるかによりそれぞれの遺伝子の発現量がど
の程度異なるかを検討した。SIVagmジーントランスファ
ーベクターでRRE6/s（6964-7993）配列を含むベクター
について、ルシフェラーゼとβ−ガラクトシダーゼの位
置を相互に置換したベクターを作製し（図１０下段）、
両ベクターにおける２種のレポーター遺伝子の発現量を
比較した。 その結果、図１０のグラフに示すようにRREの上流に
組み込まれるか下流に組み込まれるかでレポーター遺伝
子の発現量に差は認めらなかった。すなわちRRE配列を
用いた２種遺伝子の同時発現系は、特に種々のレセプタ
ーや転写因子など１：１のモル比で複合体を形成する事
で機能を有するタンパク質の発現に有用であることが明
らかとなった。 ［実施例８］ SINベクター（Self Inactivating Vecto
r）の性能確認 実施例３において作製したジーントランスファーベク
ターpGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/3' LTRΔU3は
3'LTRのU3領域を欠失しているので、標的細胞から全長
のベクターmRNAが転写されることを防止するSelf Inact
ivating Vector（SINベクター）として安全性が向上し
ていると考えられる。 SIN化により遺伝子導入効率が変化しうるかを検討す
るために、293T細胞に対するSIVagm SINベクターの導入
力価を、同一条件で作製した従来の野生型3'LTRをもつS
IVagmベクターの場合と比較した。その結果、導入力価
は従来型で2.4-2.8 TU/ml、SIVagm SINベクターで2.5-
2.9 TU/mlとなり、従来型の導入力価を100%とした場
合、SIVagm SINベクターでは105%であった。 さらに、放射線照射により細胞周期を停止した293T細
胞およびレチノイン酸により終末分化を誘導したSH-SY5
Y細胞へのSIVagm SINベクターによるEGFP遺伝子の導入
を試みた。細胞周期を停止した293T細胞におけるEGFPの
発現を蛍光顕微鏡で観察したところ、高い効率で遺伝子
の発現が認められた（図１１上段）。また、レチノイン
酸処理したSH-SY5Y細胞については、神経細胞に分化し
ていると考えられる、突起を伸長した細胞においてEGFP
の発現が確認された（図１１下段）。 これらのことから、遺伝子導入効率はSIN化により低
下しないことが明らかになった。 ［実施例９］ 末梢血リンパ球およびCD34陽性細胞への
SIVagm SINベクターによる遺伝子導入 CD34陽性細胞は、近年、造血幹細胞を含む分画として
注目されている（Blood,vol.87, pp1-13, 1996）。した
がって、CD34陽性細胞への遺伝子導入が可能になれば、
造血幹細胞に対する遺伝子導入、およびそこから分化す
るすべての血液細胞への遺伝子導入が可能になると考え
られる。そこで、SIVagm SINベクターによってヒト末梢
血由来単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cells：
PBMC）、ヒトＴ細胞、ヒト骨髄由来および臍帯血由来CD
34陽性細胞、カニクイザル骨髄由来CD34陽性細胞に遺伝
子を導入できるかを検討した。 PBMCの分離は、あらかじめ0.5M EDTA 200μｌを入れ
ておいたシリンジにヒト末梢血液10mlを採血し、Lympho
prep Tube（Nycomed）を添付説明書に従って用いること
により行った。分離した細胞は、96穴のプラスチックカ
ルチャープレートに2-2.5x105/wellでまき、RPMI 1640
培地（Gibco BRL、５％非動化ウシ血清を含む）中、37
℃５％CO2で培養した。Ｔ細胞への誘導は、分離したPBM
CをRPMI 1640 5％FCS、PHA（SIGMA）5mg/mlで３日間培
養し、IL2（シオノギ）40U/mlを加えてさらに３日間培
養することにより行った（Current Protocols in Immun
ology：6.16.4）。ヒト骨髄由来および臍帯血由来CD34
陽性細胞は、PureCell社の凍結細胞を添付説明書に従っ
て解凍し、96穴のプラスチックカルチャープレートに2-
2.5x105／wellでまき、IMDM（Gibco BRL）10％BIT9500
（StemCell）中で培養した。カニクイザル（3-7歳齢、
雌、平均体重3.0kg）骨髄由来CD34陽性細胞は、96穴の
プラスチックカルチャープレートに2-2.5x105／wellで
まき、a(-)MEM(SIGMA)10％非働化ウシ血清（国際試薬レ
ハツイン・プレミアーグレードLot. RB51901）中で培養
した。 ベクターによる遺伝子の導入は、以下のように行っ
た。まず、培養液より上清を一部除去し、実施例１に記
載の方法で濃縮しておいたベクターpGL3C/CMVL.U3G2/RR
Ec/s/CMVF EGFP/3' LTRΔU3（力価1-7x109 TU/ml）を重
層して全量を50μｌとした。その後、PBMCについては、
200G、32℃にて30分間遠心し、37℃ 5％CO2で３時間培
養し、培地200μｌを重層、48時間培養した。CD34陽性
細胞では、ベクター重層後に遠心を行わず、37℃ 5％CO
2で３時間培養し、培地200μｌを重層、48時間培養し
た。 EGFP遺伝子の導入はフローサイトメトリーによって確
認した。まず、培養した細胞をカルチャーウェルより回
収し、PBS3％FCS0.05％NaN3で洗浄後、PE（フィコエリ
スリン）標識抗CD3抗体、PE標識抗CD14抗体、PE標識抗C
D19抗体（Becton Dickinson）を用いて添付説明書に従
い表面抗原を染色した。染色後、細胞を洗浄し、PBS 1
％PFAで固定し、フローサイトメーターにかけた。 その結果、ヒトPBMCでは、m.o.i.90において51.8％の
細胞がEGFP陽性であった。EGFP発現細胞の割合はm.o.i.
依存的に上昇したが、m.o.i.36においてEGFP陽性率が45
％になり、それ以上のm.o.i.でもEGFP陽性率は約50％以
上にはあがらなかった。また、濃縮していないベクター
では、遺伝子導入は認められなかった（図１２）。ヒト
PBMCから誘導したＴ細胞では、ベクター感染48時間後の
解析でm.o.i.50において14.5％の細胞でEGFPの発現が認
められたが、濃縮していないベクターでは、遺伝子導入
は認められなかった（図１３）。ヒト骨髄由来および臍
帯血由来CD34陽性細胞それぞれに対しm.o.i.30で遺伝子
導入を行ったところ、骨髄細胞では26％（図１４）、臍
帯血細胞では11%（図１５）の細胞でEGFPが発現してい
た。サル骨髄由来CD34陽性細胞では、m.o.i.に依存した
導入率の上昇がみられ、m.o.i.100におけるEGFP発現率
は58％であった（図１６）。 以上の結果から、SIVagm SINベクターによりPBMC、Ｔ
細胞、骨髄および臍帯血由来CD34陽性細胞に対し高い効
率での遺伝子導入が可能であることが明らかとなった。 ［実施例１０］ SIVagm SINベクターにより遺伝子導入
されたCD34陽性細胞による造血系の再構築 NOD/SCIDマウスは、IDDM糖尿病マウスであるNOD/Ltマ
ウスと免疫不全マウスであるSCIDマウスの戻し交雑によ
り作成されたマウスで、SCIDマウスのＴ細胞、Ｂ細胞欠
損状態に加え、NK細胞、マクロファージ、補体の活性の
低下が認められる複合免疫不全マウスである（J. Immun
ol., vol.154, pp180-191, 1995）。日本クレアより、
この動物の系統であるNOD/Shi-scid Jicオス６週令を購
入し、２週間飼育後に実験に使用した。 NOD/SCIDマウスに対し多分化能を持つヒト細胞を移植
すると、マウス体内で造血系の再構築が行われヒト血液
細胞が体内を循環するようになる（Nat.Med.,vol.2, pp
1329-1337, 1996）。この系を利用し、遺伝子導入後のC
D34陽性細胞による造血系の再構築と再構築後の血液細
胞におけるEGFP発現を検討した（SCIDre-populating ce
llアッセイ）。 まず、NOD/SCIDマウス ８週令に対し、半致死量の放
射線を照射（300rad）した。放射線照射には日立MBR-15
20Rを使用し、照射条件は管電圧150kv、管電流20mA、0.
5Al, 0.1Cuフィルターとした。放射線照射後数時間以内
に、尾静脈より移植細胞をマイジェクター（テルモ29Gx
1/2"針付きシリンジ）を用いて注入、移植した。 移植のための細胞には、ヒト臍帯血由来CD34細胞（Pu
reCell）を使用した。細胞の培養、およびSIVagm SINベ
クターによる遺伝子導入は実施例９に記載した方法で行
い、m.o.i.100で感染を行った。ベクター感染後６時間
培養した後に細胞を回収し、IMDM（Gibco BRL）で洗
浄、1-3x106/mlでIMDMに浮遊させ、動物１頭あたり1x10
5/100μｌを移植した。 移植後の動物は、P3実験施設内安全キャビネットにお
いて無菌的に飼育した。実験は１群10頭のマウスを用
い、４群に分けて行った。28頭に遺伝子導入細胞を移
植、６頭に無処理の細胞を移植し、６頭は移植を行わず
に飼育した。全40頭の動物のうち、６週後まで生存した
のは25頭であり、生存率は６割であった。ヒト細胞の生
着が成立した個体は生存個体中５頭で、遺伝子導入細胞
を移植した動物が２頭、無処理の細胞を移植した動物が
３頭であった。 ４週から６週にかけて末梢血液を採取した。尾静脈を
カミソリで切断し、末梢血液50-100μｌをとり、0.5M E
DTA 10μｌと混和し、凝血を防止した。採取した血液に
蒸留水700μｌを加え数回ピペッティングして赤血球を
破壊し、2xPBS 700μｌを加えて混和し、遠心（5000rpm
１分間）して末梢血中全白血球を回収した。回収した
白血球を50μｌのPBS 3% FCS 0.05% NaN3に懸濁し、PE
標識抗ヒトCD45抗体（Coulter）２μｌを加え、氷上で3
0分間反応させ、PBS 3% FCS 0.05% NaN3で２回洗浄し、
PBS 1% PFAで固定後フローサイトメーターで解析した。
解析は２カラーで行い、マウス白血球中のヒトCD45陽性
細胞とその中のEGFP発現細胞を見た。 その結果、ヒトCD34陽性細胞を移植したマウス末梢血
では、白血球の10〜50％の細胞においてヒトCD45の発現
が認められた。SIVagm SINベクターによりEGFP遺伝子を
導入したヒトCD34陽性細胞を移植したマウスでは、末梢
血白血球中のヒトCD45陽性細胞の20％においてEGFPの発
現が認められた（図１７）。 ［共通の操作］ 本実施例において、共通する操作を下記（１）から
（７）に示した。 （１） 細胞の培養 ヒト胎児腎細胞由来細胞株293T細胞（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,vol.90,pp8392-8396,1993）は、10％非動化
ウシ胎児血清を含むD-MEM（GibcoBRL）で培養した。ま
た、細胞周期を停止させるためには、293T細胞をアフィ
ジコリン処理（Calbiochem、最終濃度20μg/mlで48時間
処理、G1-Sでの停止）、あるいはＸ線による照射（200
rad/分で20分照射後に48時間培養、G2-Mでの停止）のい
ずれかの処理を行なう。ヒト神経芽細胞株RBTM1とSH-SY
5Y細胞（Cancer Besearch,vol.58,pp2158-2165,1998）
は10％非動化ウシ胎児血清を含むRPMI1640（GibcoBRL）
培地で培養する。神経細胞への分化誘導は全トランス型
レチノイン酸処理（Sigma、最終濃度５μmol/mlで７日
間培養）で行なう。培養はすべてプラスチックプレート
（住友ベークライト）で行なう。 （２） ラット初代培養脳細胞培養の調製のための一般
的な方法 ラット初代培養脳細胞は５％非動化ウシ胎児血清と５
％非動化ウマ血清（Gibco BRL）を含むD-MEM（Gibco BR
L）で培養する。初代細胞の調製は以下の方法で行な
う。妊娠18日目のSDラットをジエチルエーテルにより深
麻酔後に腋窩動脈放血を行い安楽死させる。死亡確認後
に開腹を行い、胎児を含む子宮を摘出する。子宮より無
菌的に摘出した胎児の頭部より脳を摘出し作業液（50％
D-MEM、50％PBS（Gibco BRL）、ペニシリン５Ｘ104U/L
（Gibco BRL）、ストレプトマイシン50mg/L（Gibco BR
L）を含む）中に静置し、実体顕微鏡下で脳幹部分と大
脳半球の髄膜を除去する。脳組織を作業液により１回洗
浄した後手術用メスを用いて細切し、パパイン処理（パ
パイン（Worthington Biochem）1.5U/ml、システイン
（ナカライ）0.2mg/ml、ウシ血清アルブミン（Sigma）
0.2mg/ml、グルコース（和光）５mg/ml、DNase I（Gibc
o BRL）0.1mg/mlを含む溶液中で転倒撹拌、32℃で30分
間処理）後、ピペッティング操作により細胞を懸濁し、
遠心操作（1200rpmで５分間）により細胞を回収する。
回収した脳細胞は、５％非動化ウマ血清、５％非動化ウ
シ胎児血清、ペニシリン５Ｘ104U/L、ストレプトマイシ
ン50mg/Lを含むD-MEMによる洗浄を２回行なう。洗浄後
に細胞数を計測し、１ウェルあたり1-3Ｘ106個の細胞密
度でポリ−Ｌ−リジンコートした６ウェルプレート（セ
ルタイトPL、住友ベークライト）にまき、炭酸ガスイン
キュベーター中（37℃、５％CO2存在下）で培養する。 （３） トランスフェクション トランスフェクションはすべてLIPOFECTAMINEPLUS（G
ibco BRL）を用いて添付説明書に従って行った。293T細
胞を６ウェルのプラスチックプレート（住友ベークライ
ト）へ１ウェルあたり５Ｘ105個の細胞密度でまき、炭
酸ガスインキュベーター中（37℃、10％炭酸ガス存在
下）で48時間培養した。トランスフェクションの30分前
に培養液を１ウェルあたり800μｌのOptiMEM（Gibco BR
L）に培地交換し培養を続けた。トランスフェクション
に使用するDNA量は１ウェルあたり300ngのジーントラン
スファーベクターと、600ngのパッケージングベクター
または空のベクターを使用した。DNAを100μｌのOptiME
Mに溶解後に６μｌのPLUS reagent（Gibco BRL）を加え
て撹拌後１５分室温で静置した。DNAとPLUS reagent（G
ibco BRL）との混合液に、100μｌのOptiMEMで希釈した
４μｌのLIPOFECTAMINEを添加して撹拌後さらに15分室
温で静置した。以上の方法により調製したDNAとLIPOFEC
TAMINEとの複合体を含む溶液を６ウェルプレートで培養
している293T細胞へ滴下してゆるやかに撹拌した後に炭
酸ガスインキュベーター中（37℃10%炭酸ガス存在下）
で３時間培養した。培養後１ウェルあたり１mlの20％非
動化ウシ胎児血清を含むD-MEMを添加し、炭酸ガスイン
キュベーター中（37℃10%炭酸ガス存在下）で48時間培
養した後にβ−ガラクトシダーゼアッセイとルシフェラ
ーゼアッセイに使用した。 （４） β−ガラクトシダーゼアッセイとルシフェラー
ゼアッセイ β−ガラクトシダーゼアッセイとルシフェラーゼアッ
セイはそれぞれLuminescent beta-gal detection kit I
I（Clontech）とLuciferase Assay System（Promega）
を用いて添付説明書に従って行った。サンプルとしては
DNAをトランスフェクションした293T細胞を１ウェルあ
たり800μｌのReporter Lysis Bufferで溶解し、12000
g、４℃で５分間遠心後に上清を分取したものを細胞溶
解液として使用した。β−ガラクトシダーゼアッセイで
は細胞溶解液20μｌと基質液100μｌを混合した後、室
温で１時間静置後にルミノメーター（AutoLumat LB953,
berthold）で10秒間発光強度を測定した。ルシフェラー
ゼアッセイでは細胞溶解液20μｌと基質液100μｌを混
合後、すみやかにルミノメーター（AutoLumat LB953,be
rthold）で10秒間発光強度を測定した。すべてのアッセ
イで、それぞれサンプルについて３検体測定し平均値と
標準偏差を求めた。 （５） PCR PCRはすべてPCR Supermix High Fidelity（Gibco BR
L）を用いて行った。反応液90μｌに、基質として１μ
ｇのテンプレートDNA、プライマーとして２種の合成オ
リゴヌクレオチドを最終濃度１nmol/mlになるように添
加し、蒸留水で100μｌになるように全容量を調整し、
サーマルサイクラー（GeneAmp PCR System 9600、Perki
n Elmer）を用いて反応を行った。サンプルを94℃で１
分間反応後に、94℃30秒、55℃30秒、68℃90秒の反応を
10サイクル行い、最後に68℃で５分間の反応を行った。
反応液はWizard DNA Clean-up System（Promega）で精
製した後に目的の制限酵素で切断し、１％低融点アガロ
ースゲル（SeaPlaque GTG agarose、FMC Boichem、TAE
バッファーに溶解）で分離後に目的のサイズのDNA断片
をゲルより切り出しWizard PCR Preps DNA Purificatio
n System（Promega）で精製した後にライゲーション反
応に使用した。 （６） SIVagmベクターによる遺伝子導入の一般的方法 標的となる293T細胞は６ウェルのプラスチックプレー
ト（住友ベークライト）へ１ウェルあたり5X105個の細
胞密度でまき、炭酸ガスインキュベーター中（37℃、10
%炭酸ガス存在下）で48時間培養後にアッセイに使用す
る。標的細胞にはベクターを含む溶液にポリプレン（Si
gma）を最終濃度８μg/mlになるように添加した溶液を
重層する事でベクターの導入を行なう。ベクター感染後
４８時間後に標的細胞をBeta-Gal Staining Kit（Invit
rogen）を用いてX-galを基質とした染色を行い、倒立顕
微鏡（DMIRB（SLR）、ライカ）で検鏡して標的細胞での
ベーターガラクトシダーゼの発現を検出する。X-galに
より青色に染色された細胞の数を定量し、293T細胞１細
胞に対してベーターガラクトシダーゼを発現させるベク
ター量を１Transuducing Unit（TU）として算出する。 （７） 抗体による遺伝子導入細胞の染色のための一般
的な方法 ベクターを感染後48時間で、標的細胞をPBS（日研生
物医学研究所）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド
（和光）を含むPBSにより室温で30分間固定する。固定
後にPBSで５分間３回の洗浄を行い、その後２％正常ヤ
ギ血清（Gibco BRL）を含むPBSで室温１時間のブロッキ
ングを行なう。一次抗体としては、ラット脳細胞の分化
ニューロンに対しては抗MAP-2モノクローナル抗体（マ
ウスIgG、BOEHRINGER MANHEIM）を２μg/mlの濃度に、
β−ガラクトシダーゼ導入細胞に対しては抗大腸菌β−
ガラクトシダーゼポリクローナル抗体（ウサギ、５prim
e→３prime, Inc.）を8.2μg/mlの濃度にそれぞれ２％
正常ヤギ血清を含むPBSで希釈した溶液を使用し、37℃
で30分間反応させる。一次抗体反応後、細胞をPBSで５
分間３回洗浄した後に２次抗体との反応を行なう。２次
抗体としてはEGFPを導入したラット脳細胞に対しては、
Texus Redでラベルした抗マウスIgGポリクローナル抗体
（ヤギ、EY LABORATORIES, INC.）を10μg/mlか、ある
いはAlexa568でラベルした抗マウスIgGポリクローナル
抗体（ヤギ、Molecular Probes, Inc.）を４μg/mlの濃
度にそれぞれ２％正常ヤギ血清を含むPBSで希釈した溶
液を使用する。また、β−ガラクトシダーゼ導入ラット
脳細胞に対してはAiexa488でラベルした抗マウスIgGポ
リクローナル抗体（ヤギ、Molecular Probes, inc.）と
Alexa568でラベルした抗ウサギIgGポリクローナル抗体
（ヤギ、Molecular Probes, Inc.）をそれぞれ４μg/ml
の濃度に２％正常ヤギ血清を含むPBSで希釈した溶液を
使用し、ラット脳細胞以外のβ−ガラクトシダーゼ導入
細胞に対してはAlexa568でラベルしたヤギ抗ウサギIgG
ポリクローナル抗体を４μg/mlの濃度に２％正常ヤギ血
清を含むPBSで希釈した溶液を使用する。２次抗体との
反応は、すべて37℃で30分間の条件で行なう。２次抗体
反応後に標的細胞をPBSで５分間３回洗浄した後、PBSを
重層して倒立顕微鏡（DMIRB（SLR）、ライカ）により蛍
光を観察する事で目的のタンパク質の発現を検出する。 産業上の利用の可能性 本発明により、RRE配列の利用により２つの外来遺伝
子を発現することができるベクターが提供された。本発
明のベクターにおいては、RRE配列の改変により、２つ
の外来遺伝子の発現の量比を調整することが可能であ
る。また、ウイルス由来の発現制御配列を他の発現制御
配列に改変することにより、ウイルス由来のタンパク質
に対する依存性が解消されている。パッケージングシグ
ナルを有する最小限の領域をベクターに用いることによ
り、遺伝子組換えによる野生株の出現の危険を減少させ
安全性が高められている。本発明のベクターは、遺伝子
治療などに好適に用いられる。
関する。 背景技術 研究目的や遺伝子治療などにおいて外来遺伝子を標的
細胞で発現させるために、遺伝子導入用ベクターが用い
られている。このような場合に、２つの遺伝子を同じ標
的細胞内で発現させることが望まれることがある。この
ようなことが可能になれば、例えば、治療用遺伝子と共
に、選択用の遺伝子を発現させることで、治療用遺伝子
を導入した標的細胞を選択的に増殖させたり死滅させた
りすることができる。また、治療用遺伝子と共にマーカ
ー遺伝子（例えばGFPなど）を発現させることで、治療
用遺伝子導入細胞の体内での動態をモニターすることが
可能となる。さらに、レセプターや転写因子など、２種
のサブユニットが複合体を形成して機能を持つタンパク
質を発現させることも可能となる。 従来、２つの遺伝子を発現させるためのベクター系と
しては、複数のプロモーターを組込んだ形のものと、１
つのプロモーターとIRES配列（Internal Ribosomal Ent
ry Site）を組み合わせた形のものが報告されている。
しかしながら、これらのベクターの発現特性は決して満
足できるものではない。 例えば、複数のプロモーターを持つベクターは、プロ
モーター間の干渉により、どちらか一方のプロモーター
からの発現しか効率良く起きないなどの問題点がある。
また、１つのプロモーターとIRESを組み合わせたベクタ
ーは、IRESの3'側の遺伝子が、5'側の遺伝子の1/5〜1/1
0しか発現されないという問題がある。 発明の開示 本発明は、２つの外来遺伝子を同時に発現することが
できるベクターを提供することを課題とする。より詳し
くは、RRE配列の利用により２つの外来遺伝子を発現す
ることができ、その改変により該２つの外来遺伝子の発
現の量比を調整することが可能なベクターを提供するこ
とを課題とする。 該ウイルスベクターの好ましい態様として、ウイルス
由来の発現制御配列が他の発現制御配列に改変され、該
ウイルス由来のタンパク質に対する依存性が解消されて
いるウイルスベクターを提供する。他の好ましい態様と
して、パッケージングシグナルを有するが、遺伝子組換
えによる野生株の出現の危険が減少するように改変さ
れ、さらにウイルス構造タンパク質が発現しないように
改変されたウイルスベクターを提供する。 本発明者らは、遺伝子治療の分野において、従来から
用いられてきたヒト免疫不全ウイルス（HIV）と比較し
て、安全性が高いなど様々な利点を有するサル免疫不全
ウイルス（SIV）において、RREを利用した新規ウイルス
ベクターの構築を行った。 具体的には、まず、非病原性のアフリカミドリザル免
疫不全ウイルスのクローンであるSIVagmTYO1を基本と
し、5'LTR領域、RRE、CMVプロモーター、EGFP遺伝子
（またはベータガラクトシダーゼ遺伝子）、3'LTRを順
に有するベクターをジーントランスファーベクターとし
て構築した。 ジーントランスファーベクターのベクター粒子へのパ
ッケージングには、パッケージング細胞においてジーン
トランスファーベクターにトランスに作用するウイルス
構造タンパク質が必要であるため、本発明者等は、次
に、パッケージング細胞内においてウイルス構造タンパ
ク質を供給するためのパッケージングベクターも構築し
た。即ち、パッケージング細胞内において、ウイルス外
皮タンパク質（VSV-G）を発現させるためのベクターと
ウイルスコアタンパク質（gag）および逆転写酵素（po
l）を発現させるためのベクターを構築した。 レンチウイルスの5'LTRの転写活性は一般にウイルス
由来の因子であるTatタンパク質の存在に依存してい
る。そこで、本発明者等は、次に、構築したジーントラ
ンスファーベクターのTatタンパク質に対する依存性を
解消するため、およびより転写活性の強いプロモーター
配列に置換することでベクター力価を高めるために、5'
LTRのプロモーター配列であるU3領域を他のプロモータ
ー配列に置換したジーントランスファーベクターを作製
した。これによりTat非依存性のベクターを提供した。 レンチウイルスベクターにおいては、3'LTR領域に含
まれるプロモーター配列であるU3領域が、標的細胞中で
逆転写される時に5'LTRのU3プロモーター領域へ組み込
まれるため、標的細胞のゲノム内では、ジーントランス
ファーベクタープラスミドの3'LTR領域に含まれるU3領
域が、遺伝子発現に関与する5'LTRのU3プロモーターと
なることが明らかとなっている。そこで標的細胞中で遺
伝子発現に関与するプロモーターをU3配列以外のプロモ
ーターに置換しうるかを検討するため、ジーントランス
ファーベクターの3'LTRのU3領域を他のプロモーター配
列へ置換したベクターを作成した。また、同時に標的細
胞中で5'LTRに存在するプロモーター配列を欠失させう
るかを検討するため、ジーントランスファーベクターの
3'LTRのU3領域を欠失させたベクターも作成した。 ジーントランスファーベクターのベクター粒子へのパ
ッケージングには、ジーントランスファーベクター上に
存在してシスに作用する因子であるパッケージングシグ
ナルが必要であり、ベクターのパッケージングの効率を
向上させることでベクター力価が高まることが予想され
る。このため、パッケージングシグナル配列により形成
される構造を保持できるようにパッケージングシグナル
を含む領域を可能な限り長くベクターへ組み込む必要が
あるが、その一方、ジーントランスファーベクターのパ
ッケージングシグナルとパッケージングベクターとの配
列の重複を最小限にすることで、両者の間でおこると考
えられる組み換えによる野生型ウイルスの出現頻度を最
小限に抑制する必要がある。このため、ベクター系を構
築するためには、ジーントランスファーベクターを効率
的にパッケージングするために必要な最小限のパッケー
ジングシグナル配列を正確に同定することが必要であ
る。そこで、本発明者等は、5'LTRの下流の異なる長さ
の領域を含むDNA断片をジーントランスファーベクター
へ組み込んだ。これにより安全性およびパッケージング
能をともに有するベクターを提供した。 次ぎに、本発明者等は、２つの外来遺伝子を同時に発
現することができるウイルスベクターの構築を行なっ
た。Rev responsive element（RRE）はウイルス由来のR
evタンパク質の結合部位であり、RNAの核から細胞質へ
の輸送に関与している。このRRE/Revのシステムを利用
して、スプライシングの効率を制御することで単一のプ
ロモーターから同時に異なる２種のタンパク質を発現す
る系を構築することが可能であるかの検討を行なった。 まず、異なる２種のタンパク質の発現をRREにより制
御できるかを検討するため、RREの上流と下流にレポー
ター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子とベータガラク
トシダーゼ遺伝子を組み込み、さらにルシフェラーゼ遺
伝子の上流にスプライシングドナー配列を、RRE配列の
下流にスプライシングアクセプター配列をそれぞれ組み
込んだベクターを構築した。このベクターからはスプラ
イシングを受けたmRNAよりベータガラクトシダーゼタン
パク質が、スプライシングを受けないmRNAよりルシフェ
ラーゼタンパク質が発現されると考えられる。 また、単純に異なる２種の遺伝子を発現するだけでな
く、その量比をRREの配列を変えることで制御すること
が可能であるかを検討するため、６種のRRE配列を組み
込んだベクターを構築し、それぞれのベクターにおける
レポーター遺伝子の発現量を検討した。 その結果、RRE配列を有するベクターより異なる２種
の遺伝子が発現されうること、RRE配列の置換により２
種の遺伝子の発現効率を制御しうることが明らかとなっ
た。また、パッケジングベクター非存在下においても異
なる２種の遺伝子が発現されることから、本遺伝子発現
系はRevタンパク質の存在に非依存的に２種の遺伝子を
発現させうることが明らかとなった。 従来、RREはRevタンパクに依存的に作用すると考えら
れており、また、Rev/RREによる制御は、「全か無か」
的なもので、Rev−ではすべてがスプライシングされた
形となり、Rev＋ではスプライシングされない形でとな
ると考えられていた。即ち、RRE配列を変えてスプライ
シングの割合を変えるという例はなかった。従って、上
記結果によりRRE配列の改変によってスプライシングの
割合を変えることができることが初めて証明された。 さらに、本発明者等は、RREを使用した２種遺伝子の
同時発現系が、5'LTR以外の種々のプロモーターを使用
した発現系に対しても適用しうるかの検討を行なった。
プロモーターとしては、他のヒトサイトメガロウイルス
(CMV)由来のプロモーター、あるいは哺乳類細胞由来の
プロモーター（EF1αプロモーター）を使用した。その
結果、5'LTR以外のプロモーターを使用した場合におい
ても、２種の遺伝子が同時に発現されうることが明らか
となった。また、RRE配列に依存した２種遺伝子の発現
量制御も認められることが明らかとなった。これによ
り、RREによる２種遺伝子の同時発現系は種々のプロモ
ーターを用いた発現系において幅広く使用されうること
が明らかとなった。 また、レポーター遺伝子がRREの上流に組み込まれる
か下流に組み込まれるかによりそれぞれの遺伝子の発現
量がどの程度異なるかを検討した。ジーントランスファ
ーベクターでルシフェラーゼとベータガラクトシダーゼ
の位置を相互に置換したベクターを作製し、両ベクター
における２種のレポーター遺伝子の発現量を比較した。
その結果、RREの上流に組み込まれるか下流に組み込ま
れるかによりレポーター遺伝子の発現量に差は認めらな
かった。 本発明者等は、以上のように、RREは配列の利用によ
り、２つの遺伝子を同時に発現することができ、また、
用いるRRE配列の相違により該２つの遺伝子の発現比を
調節することが可能な新規ウイルスベクターを構築する
ことに成功し、これにより本発明を完成するに至った。 本発明は、より詳しくは、 （１）２つの外来遺伝子を発現させるための下記（ａ）
から（ｆ）； （ａ）発現制御配列、 （ｂ）スプライシング供与配列、 （ｃ）第一の外来遺伝子挿入部位、 （ｄ）RREコア配列、 （ｅ）スプライシング受容配列、 （ｆ）第二の外来遺伝子挿入部位、 の構成要素を5'側から3'側に向けて順に含むベクターDN
A、 （２）２つの外来遺伝子を発現させるための下記（ａ）
から（ｆ）； （ａ）発現制御配列、 （ｂ）スプライシング供与配列、 （ｃ）RREコア配列、 （ｄ）第一の外来遺伝子挿入部位、 （ｅ）スプライシング受容配列、 （ｆ）第二の外来遺伝子挿入部位、 の構成要素を5'側から3'側に向けて順に含むベクターDN
A、 （３）RREコア配列がレトロウイルス由来である、
（１）または（２）に記載のベクターDNA、 （４）RREコア配列がレンチウイルス由来である、
（１）または（２）に記載のベクターDNA、 （５）RREコア配列が免疫不全ウイルス由来である、
（１）または（２）に記載のベクターDNA、 （６）発現制御配列がLTRである、（１）から（５）の
いずれかに記載のベクターDNA、 （７）発現制御配列がLTR以外の発現制御配列を含む配
列である、（１）から（６）のいずれかに記載のベクタ
ーDNA、 （８）LTR以外の発現制御配列が、CMVLプロモーター、C
MVプロモーター、およびEF1αプロモーターからなる群
より選択される、（７）に記載のベクターDNA、 （９）スプライシング供与配列およびスプライシング受
容配列がレトロウイルス由来である、（１）から（８）
のいずれかに記載のベクターDNA、 （１０）スプライシング供与配列およびスプライシング
受容配列がレンチウイルス由来である、（１）から
（８）のいずれかに記載のベクターDNA、 （１１）スプライシング供与配列およびスプライシング
受容配列が免疫不全ウイルス由来である、（１）から
（８）のいずれかに記載のベクターDNA、 （１２）ベクターDNA上の転写されうる領域内にパッケ
ージングシグナルを含む、（１）から（１１）のいずれ
かに記載のベクターDNA、 （１３）パッケージングシグナルがレトロウイルス由来
である、（１２）に記載のベクターDNA、 （１４）パッケージングシグナルがレンチウイルス由来
である、（１２）に記載のベクターDNA、 （１５）パッケージングシグナルが免疫不全ウイルス由
来である、（１２）に記載のベクターDNA、 （１６）完全なgagタンパク質が発現しないように構築
されている（１３）から（１５）のいずれかに記載のベ
クターDNA、 （１７）gagタンパク質の翻訳開始コドンに変異を有す
る、（１３）から（１６）のいずれかに記載のベクター
DNA、 （１８）第一の外来遺伝子および第二の外来遺伝子が挿
入された、（１）から（１７）のいずれかに記載のベク
ターDNA、 （１９）第一の外来遺伝子および第二の外来遺伝子が挿
入された（１２）から（１７）のいずれかに記載のベク
ターDNAからの転写産物をウイルス粒子内部に含むレト
ロウイルスベクター、 （２０）第一の外来遺伝子および第二の外来遺伝子が挿
入された（１２）から（１７）のいずれかに記載のベク
ターDNAからの転写産物をウイルス粒子内部に含むレン
チウイルスベクター、 （２１）第一の外来遺伝子および第二の外来遺伝子が挿
入された（１２）から（１７）のいずれかに記載のベク
ターDNAからの転写産物をウイルス粒子内部に含む免疫
不全ウイルスベクター、 （２２）第一の外来遺伝子および第二の外来遺伝子が挿
入された（１２）から（１７）のいずれかに記載のベク
ターDNAをパッケージング細胞に導入し、該細胞の培養
上清から生産させたウイルス粒子を回収する工程を含
む、ウイルスベクターの調製方法、に関する。 なお、本発明において「ウイルスベクター」とは、宿
主内で外来遺伝子を発現させるための核酸分子をパッケ
ージングしたウイルス粒子を指す。 本発明における、２つの外来遺伝子を発現させるため
のベクターDNAは、構成要素として、（ａ）発現制御配
列、（ｂ）スプライシング供与配列、（ｃ）第一の外来
遺伝子挿入部位、（ｄ）RREコア配列、（ｅ）スプライ
シング受容配列、（ｆ）第二の外来遺伝子挿入部位を順
に含むベクターDNAである（但し、構成要素（ｃ）と構
成要素（ｄ）は入れ替わっていても良い）。 このベクターDNAは、２つの外来遺伝子が挿入される
と、スプライシングの有無により２つの外来遺伝子を同
時に発現することができる。その原理は、下記の如くで
ある。 ２つの外来遺伝子が挿入された該ベクターDNAは、適
当な宿主細胞に導入されると、その発現制御領域の活性
化によりスプライシング供与配列、第一の外来遺伝子、
RREコア配列、スプライシング受容配列、第二の外来遺
伝子を順に含む転写産物が生じる。この転写産物から
は、スプライシング供与配列とスプライシング受容配列
の間でスプライシングが生じなければ、第一の外来遺伝
子のみを翻訳しうるmRNAが生じる。このmRNAにコードさ
れる第１の外来遺伝子を翻訳したリボソームは、第一の
外来遺伝子のストップコドンによりRNAから離れるため
に、第２の遺伝子の翻訳は起きないと考えられる。一
方、スプライシング供与配列とスプライシング受容配列
の間でスプライシングが生じた場合には、第一の外来遺
伝子を含む領域が欠失することにより、第二の外来遺伝
子のみを翻訳しうるmRNAが生じる。従って、該ベクター
DNAが導入された宿主細胞においては、このスプライシ
ングの有無により、２つの遺伝子産物を発現させること
ができる。 本発明のベクターDNAで用いられる発現制御配列の種
類は、LTRに制限されない。ただし、後述のようにウイ
ルスベクターとして使用するためには、ウイルスを標的
細胞に感染後、逆転写されたウイルスゲノムが宿主の染
色体に組込まれる機能を有することが必要である。LTR
以外の発現制御配列でこのような機能を保持するものと
しては、例えば、実施例に示すようなLTRとそれ以外の
プロモーターとのキメラプロモーターが挙げられる。 本発明のベクターDNAに適用されるスプライシング供
与配列およびスプライシング受容配列として、通常のス
プライシング供与配列と受容配列の組み合わせを用いる
と、ほぼ100％の効率でスプライシングが起きると考え
られるので好ましくない。本発明においては、１種のRN
Aからスプライシングの差により２種以上のタンパク質
が発現される場合に使われている配列が適している。一
般に、レトロウイルスではそのような配列が多いことが
知られている（A.B. Rabson and B.J. Graves, "Synthe
sis and Processing of Viral RNA", in "Retroviruse
s", pp.205-262 (1997) eds. J.M. Coffin, S.H. Hughe
s, and H.E. Varmus, Cold Spring Harbor Laboratory
Press）。例としては、配列番号：76に示すSIVagm TYO1
のゲノム配列中6964位〜8177位までの領域が挙げられ
る。 本発明のベクターDNAにおいて第一の外来遺伝子挿入
部位は、スプライシング供与配列とスプライシング受容
配列との間に位置するようにする。第一の外来遺伝子の
挿入部位は、目的遺伝子の翻訳を阻害しない適当な制限
酵素部位を組み込むことで構築できる。第二の外来遺伝
子挿入部位は、スプライシング受容配列とポリＡ付加シ
グナルとの間に位置するように適当な制限酵素部位を組
み込み作製することができる。RRE配列は、第一の外来
遺伝子の発現を阻害しない限り、第一の外来遺伝子の挿
入部位の5'側に配置されていても3'側に配置されていて
もよい。 第一の外来遺伝子と第二の外来遺伝子の組み合わせは
特に制限されない。２種の遺伝子の組み合わせについて
有用と考えられる例を以下に示す。 ａ）治療用遺伝子と薬剤耐性マーカー 治療用遺伝子導入細胞のみをin vivoで薬剤を用いて
選択することで、導入細胞を増やしながら、非導入細胞
を減らしていく。 ｂ）治療用遺伝子と増殖因子或いはそのレセプター 治療用遺伝子導入細胞の増殖を刺激することで、導入
細胞のみを選択的に増殖させ、治療効果を高める。 ｃ）治療用遺伝子とホーミングレセプター 治療用遺伝子導入細胞が目的の部位に特異的に集まる
ように、ホーミングレセプターと共発現させる。例え
ば、AIDS治療用遺伝子とリンパ節に対するホーミングレ
セプターなど。 ｄ）治療用遺伝子とマーカー遺伝子 治療用遺伝子導入細胞にマーカーをつけることで、導
入細胞の動態、半減期を常時モニターすることが可能で
あると考えられる。もし、体外から検出できるタンパク
質があれば、導入細胞を体外から常時モニターすること
ができると考えられる。 ｅ）２種のサブユニットから構成されるタンパク質の発
現 種々のタンパク質がヘテロダイマーを形成しているこ
とが明らかとなっているが、そのようなタンパク質を発
現させることができるので、従来にくらべ治療用遺伝子
の選択の幅が広がる。 ｆ）相互作用する２種遺伝子の発現 リガンドとレセプター、酵素とその基質、シグナル伝
達分子とそのレセプターなどを発現させる。例えば、増
殖因子とそのレセプターを同時発現させれば、遺伝子導
入細胞の数を飛躍的に増やすことができる。 ｇ）相乗効果を持つ２種遺伝子の発現 種々のシグナル伝達系では、例えば、２種のリガンド
による刺激で相乗効果を示すといったように、複数のシ
グナル伝達系の活性化により相乗効果が認められること
が多い。そのような効果を持つ２種の遺伝子の発現で、
治療効果を高めることができると考えられる。 また、本発明のベクターDNAにおいては、そのRRE配列
を変えることで、転写産物のスプライシングの効率を調
節することができ、これにより宿主細胞内において発現
する２つの遺伝子産物の量比を調節することができる。
さらには、遺伝子産物の量自体を調節することも可能で
ある。 例えば、図８に示すように、RRE配列としてc/SA配列
やc/tr配列を用いれば第一の外来遺伝子の発現比率を高
めることができ、逆に、RRE配列としてc/c配列やc/x配
列を用いれば、第二の外来遺伝子の発現比率を高めるこ
とができる。また、図８に示すように、用いるRRE配列
の違いにより、外来遺伝子の発現量自体を変化させるこ
とができる。外来遺伝子の発現量の調節には、様々な利
点が存在する。例えば、遺伝子治療において２種の遺伝
子産物を発現させる場合、両者の発現量の至適発現量が
存在するが、量比を制御できることで、至適発現量に調
節して治療効果を高めることができると考えられる。例
えば、ヘテロダイマーでは、それぞれのサブユニットで
あるポリペプチドが１：１の量比で発現されれば、最も
効率が良いと考えられ、また、酵素と基質であれば、酵
素を少なくして基質を多くすれば効率が高まると考えら
れる。 本発明のベクターの生体への導入法は、例えば以下の
ようにして行うことができる。 ａ）DNA単体での導入 筋細胞への投与は、DNA単独で可能であるので、DNAを
そのままベクターとして投与できると考えられる。 ｂ）非ウイルス系ベクターとしての投与 リボフェクトアミンやポリカチオニックリボソームな
ど、DNAと合成したトランスフェクション用の化合物と
の複合体の形で投与することが可能であると考えられ
る。 ｃ）ウイルスベクターとしての投与 アデノウイルスなどのDNA型ウイルスベクターへ組み
込み、投与することも可能であると考えられる。 本発明のベクターDNAを用いて、これをパッケージン
グしたウイルス粒子を生産するためには、本発明のベク
ターDNAの転写されうる領域内にパッケージングシグナ
ルを含むことが必要である。パッケージングシグナル配
列により形成される構造を保持できるようにパッケージ
ングシグナルを含む領域は、可能な限り長く該ベクター
へ組み込む必要があるが、その一方、該ベクターDNA上
のパッケージングシグナルとパッケージングベクターと
の間で起こる組み換えによる野生型ウイルスの出現頻度
を抑制するためにはこれらベクター間の配列の重複を最
小限にする必要がある。従って、本発明のベクターDNA
の構築においては、パッケージング効率および安全性の
両者を満足させるために、パッケージングに必要な配列
を含むできる限り短い配列を用いることが好ましい。 パッケージングシグナルとしては、パッケージングベ
クターが導入された細胞によりパケージングされる限り
制限はなく、パッケージングベクターの種類に合わせ
て、レトロウイルス由来、レンチウイルス由来、免疫不
全ウイルス由来のシグナルなどが用いられる。 例えば、実施例で用いたSIVagm由来のパッケージング
ベクターの場合は、HIVベクターはパッケージングされ
ないため、用いられるシグナルの由来としてはSIVのみ
に制限されると考えられる。但し、HIV由来のパッケー
ジングベクターを用いた場合、SIV由来のジーントラン
スファーベクターのパッケージングされるので、組換え
ウイルスの出現頻度を低下させるために、異なるレンチ
ウイルス由来のジーントランスファーベクターとパッケ
ージングベクターとを組み合わせてベクター粒子を形成
させることが可能であると考えられる。この場合、霊長
類のレンチウイルスの間の組み合わせ（例えば、HIVとS
IV）であることが好ましい。 本発明のベクターDNAでは、gagタンパク質が発現しな
いように改変されていることが好ましい。ウイルスgag
タンパク質は、生体にとって異物として認識され、抗原
性が現れる可能性がある。また、細胞の機能に影響を及
ぼす可能性もある。従って、本発明のジーントランスフ
ァーベクターにおいては、gagタンパク質は発現しない
ように改変されていることが好ましい。 gagタンパク質を発現しないようにするためには、gag
の開始コドンの下流に塩基の付加や欠失等によりフレー
ムシフトするように改変することができる。また、gag
タンパク質のコード領域の一部を欠失させることが好ま
しい。ウイルスのパッケージングには、gagタンパク質
のコード領域の5'側が必要であるとされている。従っ
て、本発明のジーントランスファーベクターにおいて
は、gagタンパク質コード領域のＣ末側を欠失している
ことが好ましい。パッケージング効率に大きな影響を与
えない範囲でできるだけ広いgagコード領域を欠失させ
ることが好ましい。具体的には、gagコード領域の150bp
を残し、それより3'側を欠失させることができる。ま
た、gagタンパク質の開始コドン（ATG）をATG以外のコ
ドンに置換することも好ましい。置換するコドンは、パ
ッケージング効率に対する影響が少ないものが好まし
い。これにより構築されたパッケージングシグナルを有
する本発明のベクターDNAを、適当なパッケージング細
胞に導入することにより、ウイルスベクターを生産させ
ることができる。生産させたウイルスベクターは、パッ
ケージング細胞の培養上清から回収することができる。 パッケージング細胞に使われる細胞としては、一般的
にウイルスを産生に使用される細胞株であれば制限はな
い。ヒトの遺伝子治療用に用いることを考えると、細胞
の由来としてはヒトまたはサルが適当であると考えられ
る。パッケージング細胞として使用されうるヒト細胞株
としては、例えば293細胞、293T細胞、293EBNA細胞、SW
480細胞、u87MG細胞、HOS細胞、C8166細胞、MT-4細胞、
Molt-4細胞などが挙げられる。サル由来細胞株として
は、例えば、COS1細胞、COS7細胞、CV-1細胞、BMT10細
胞などが挙げられる。 HIV、SIV、およびFIVなどのレンチウイルスを基に作
製した本発明のベクターは非分裂細胞に遺伝子を組み込
むことができるため、既存のレトロウイルスベクターの
遺伝子治療の限界を超えて、有効性を高めることへ貢献
することが考えられる。即ち、本発明のベクターによっ
て、非分裂細胞に多様な治療用遺伝子を染色体にインテ
グレーションすることが可能となる。 本発明により各種遺伝性疾患の遺伝子治療にも応用が
可能である。対象となる疾患とその単一原因遺伝子とし
て、ゴーシェ病においてはβ−セレブロシダーゼ（第２
０染色体）、血友病においては血液凝固第８因子（Ｘ染
色体）および血液凝固第９因子（Ｘ染色体）、アデノシ
ンデアミナーゼ欠損症においてはアデノシンデアミナー
ゼ、フェニルケトン尿症においてはフェニルアラニンヒ
ドロキシラーゼ（第１２染色体）、Duchenne型筋ジスト
ロフィーにおいてはジストロフィン（Ｘ染色体）、家族
性高コレステロール血症においてはLDLレセプター（第
１９染色体）、繊維性嚢ほう症においてはCFTR遺伝子の
染色体への組み込み等が考えられる。それら以外の複数
の遺伝子が関与していると思われている対象疾患として
は、アルツハイマー、パーキンソン病等の神経変性疾
患、虚血性脳障害、痴呆、またエイズ等の難治性の感染
症等が考えられる。エイズ患者の造血幹細胞を細胞外に
とりだしin vitroでSIVベースの本発明のベクターを作
用させて、HIVの感染が起こる前にSIVに由来するゲノム
転写を優勢にして、患者の体に戻し、HIVの転写因子を
無効にする治療方法が考えられる。さらには、慢性疾患
への応用として、虚血性心疾患においてはVEGFならびに
FGF2遺伝子、動脈硬化の遺伝子治療に関しては、細胞増
殖関連遺伝子、例えば細胞増殖因子（PDGF、TGF-β
等）、Cyclin-dependent kinase等の発現抑制への応用
が可能となる。また糖尿病においてはBDNF遺伝子が候補
となりうる。またこの方法により、遺伝子変異が癌化を
引き起こす癌抑制遺伝子p53等の遺伝子を染色体に組み
込む補充治療への応用、多剤耐性遺伝子をin vitroで骨
髄由来造血幹細胞に導入した後、患者の血液に戻すこと
によって、癌の薬物治療の限界を超えた治療が可能とな
る。自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、慢性関節リウ
マチ、SLE、糸球体腎炎等の遺伝子治療に関しては、Ｔ
細胞レセプター、各種接着因子（例えばICAM-1、LFA-
1、VCAM-1、LFA-4等）、サイトカインおよびサイトカイ
ンレセプター（例えばTNF、IL-8、IL-6、IL-1等）細胞
増殖因子（例えばPDGF、TGF-β等）、作用因子（例えば
MMP等）のアンチセンス発現による発現抑制への応用が
可能となる。アレルギー性疾患の遺伝子治療に関して
は、IL-4、FcεR-I等のアンチセンス発現による発現抑
制への応用が可能となる。臓器移植に関連する遺伝子治
療に関しては、ヒト以外の動物ドナーの組織適合性抗原
をヒト型に変えて異種移植の成功率を高める応用が可能
となる。さらにはヒトES細胞の染色体に外来遺伝子を導
入し、胚の段階で欠損する遺伝子を補って、体循環する
酵素、成長因子等の不足を補充する治療が考えられる。 図面の簡単な説明 図１は、サル免疫不全ウイルスクローンSIVagmTYO1を
用いたレンチウイルスベクターシステムの概要を示す図
である。 図２は、5'LTRのプロモーター配列であるU3領域を他
のプロモーター配列に置換したSIVagmジーントランスフ
ァーベクターの構造図である。 図３は、SIVagmジーントランスファーベクターの3'LT
RのU3領域を他のプロモーター配列へ置換したベクター
の構造と、それが標的細胞で逆転写された結果生じると
予想される、5'LTRのU3プロモーター領域の構造を示し
た図である。 図４は、ジーントランスファーベクターのパッケージ
ングシグナルの同定方法の概念図である。 図５は、ジーントランスファーベクターのgagタンパ
ク質の翻訳開始コドンに対する点突然変異体を用いたパ
ッケージングシグナルの同定方法の概念図である。 図６は、RREによる２遺伝子同時発現ベクターの構造
図である。RREの上流と下流にレポーター遺伝子として
ルシフェラーゼ遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が
組み込まれ、更にルシフェラーゼ遺伝子の上流にスプラ
イシングドナー配列を、RRE配列の下流にスプライシン
グアクセプター配列がそれぞれ組み込まれている。ベク
ターからはスプライシングの有無により２種のmRNAが産
生される。 図７は、さまざまなRRE配列を有するベクターの構造
図である。 図８は、プロモーターに5'LTRを持ち、さまざまさRRE
配列を有するベクターより発現される２種の遺伝子の発
現量を測定した結果を示す。 図９は、グラフは、5'LTR以外の種々のプロモーター
を用いて構築した２遺伝子同時発現系における遺伝子発
現を示す。プロモーターとしては、ヒトサイトメガロウ
イルス(CMV)由来のプロモーター、あるいは哺乳類細胞
由来のプロモーター（EF1αプロモーター）を使用し
た。下段にベクターの構造図を示した。 図１０は、SIVagmジーントランスファーベクターでRR
E6/s（6964-7993）配列を含む２遺伝子同時発現ベクタ
ーについて、ルシフェラーゼとβ−ガラクトシダーゼの
位置を相互に置換したベクターを作製し（下段）、両ベ
クターにおける２種のレポーター遺伝子の発現量を比較
した結果を示す（グラフ）。 図１１は、SIVagm SINベクターにより、G2-M期で停止
状態の293T細胞（Ａ）およびレチノイン酸により分化を
誘導したSH-SY5Y細胞（Ｂ）に対してEGFP遺伝子を導入
し、蛍光顕微鏡で発現を確認した写真である。 図１２は、SIVagmベクターによりヒトPBMCに対してEG
FP遺伝子を導入し、フローサイトメーターで発現を解析
した図である。縦軸が細胞数、横軸がEGFPの発現量に対
応する蛍光強度を表す。M1の範囲に含まれる細胞がEGFP
陽性であり、図中の数値がEGFP陽性率（％）を示す。 図１３は、SIVagmベクターによりヒトPBMC由来Ｔ細胞
に対してEGFP遺伝子を導入し、フローサイトメーターで
発現を解析した図である。 図１４は、SIVagmベクターによりヒト骨髄血由来CD34
陽性細胞に対してEGFP遺伝子を導入し、フローサイトメ
ーターで発現を解析した図である。EGFPとPE系統の２カ
ラーにより解析を行い、EGFP陽性率を求めた。R2の領域
に含まれる細胞がEGFP陽性であり、図中の数値がEGFP陽
性率（％）を示す。 図１５は、SIVagmベクターによりヒト臍帯血由来CD34
陽性細胞に対してEGFP遺伝子を導入し、フローサイトメ
ーターで発現を解析した図である。 図１６は、SIVagmベクターによりカニクイザル骨髄由
来CD34陽性細胞に対してEGFP遺伝子を導入し、フローサ
イトメーターで発現を解析した図である。 図１７は、SIVagmベクターによりEGFP遺伝子を導入し
たヒト臍帯血由来CD34陽性細胞をNOD/SCIDマウスに移植
し、５週および６週後の末梢血中におけるヒト細胞の割
合をフローサイトメーターで解析した図である。PE標識
抗ヒトCD45抗体によってマウス末梢血白血球中のヒトリ
ンパ球を染色し、EGFPとの２カラーによる解析を行っ
た。UL、UR、LL、LRはそれぞれ各図の左上、右上、左
下、右下の領域を表し、ULとURの領域に含まれる細胞が
CD45陽性であり、URの領域に含まれる細胞がCD45陽性か
つEGFP陽性である。図中の数値は、各領域に含まれる細
胞数の全細胞数に対する割合（％）を示す。 発明を実施するための最良の形態 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する
が、本発明は、これら実施例に制限されるものではな
い。 ［実施例１］ SIVagmベクターの構築と性能の確認 非病原性のサル免疫不全ウイルスクローンであるSIVa
gmTYO1を用いて、新規レンチウイルスベクターの構築を
下記のように行った。図１にベクターシステムの概要を
示す。 ベクター系の構築には、非病原性のアフリカミドリザ
ル免疫不全ウイルスのクローンであるSIVagmTYO1を用い
た。ヌクレオチドの番号は以下すべてウイルスRNAの転
写開始点を＋１として表記した。SIVagmTYO1を組み込ん
だプラスミドとしてはpSA212（J.Viol.,vol.64,pp307-3
12,1990）を用いた。また、ライゲーション反応は、す
べてLigation High（東洋紡）を用い添付説明書に従っ
て行った。 ａ．パッケージングベクターの構築 まず、vifとtat/revの第１エクソンを含む領域(5337-
5770)に相当するDNA断片をプライマー1F（配列番号：
１）と1R（配列番号：２）を用いてpSA212をテンプレー
トとしたPCRにより得た。PCRプライマーに制限酵素部位
であるEcoRI部位を付加することでDNA断片の3'端にEcoR
I部位をもつ断片を調製した。PCR断片をBgIIIとEcoRIに
より切断した後、アガロースゲル電気泳動とWizard PCR
Preps DNA Purification System (Promega) で精製し
た。以上のようにして得たDNA断片と、gag/pol領域をコ
ードするDNA断片（XhoI（356）部位からBglII（5338）
部位までを含む）を、pBluescript KS+（Stratagene）
のXhoI-EcoRI部位へライゲーションした。次に、Rev re
sponsive element（RRE）とtat/revの第２エクソンを含
む領域（6964-7993）に相当するDNA断片をPCRで増幅し
た。上記のPCR断片と同様にプライマー2F（配列番号：
３）と2R（配列番号：４）を用いてpSA212をテンプレー
トとしたPCRにより3'端にNotI部位を付加し、EcoRIとNo
tIで切断後に精製し、gag-tat/revを組み込んだpBluesc
ript KS＋のEcoRI-NotI部位へ組み込んだ。 さらに、スプライシングドナー（SD）部位を含むDNA
断片を合成した（配列3F（配列番号：５）と3R（配列番
号：６））。合成時に5'端にXhoI部位、3'端にSaII部位
を付加し、上記のgag-RRE-tat/revを組み込んだpBluesc
ript KS＋のXhoI部位へ組み込んだ。得られたプラスミ
ドをXhoIとNotIにより切断し、SD〜tat/revを含む断片
を精製し、pCAGGS（Gene,vol.108,pp193-200, 1991）の
EcoRI部位にXhoI/NotIリンカー（配列4F（配列番号：
７）と4R（配列番号：８））を組み込んだプラスミドの
XhoI-NotI部位へ組み込んだ。以上の方法により得られ
たプラスミドをパッケージングベクター（pCAGGS/SIVag
m gag-tat/rev）として使用した。 ｂ．ジーントランスファーベクターの構築 SIVagmTYO1由来の5'LTR領域（8547-9053＋1-982、5'
端にKpnI部位、3'端にEcoRI部位を付加）はプライマー5
-1F（配列番号：９）と5-1R（配列番号：10）を、RRE
（7380-7993、5'端にEcoRI部位、3'端にSacII部位を付
加）はプライマー5-2F（配列番号：11）と5-2R（配列番
号：12）を、3'LTR（8521-9170、5'端にNotIとBamHI部
位、3'端にSacI部位を付加）はプライマー5-3F（配列番
号：13）と5-3R（配列番号：14）をそれぞれ用いてpSA2
12をテンプレートとしたPCRにより増幅した。pEGFPC2
（Clontech）由来のCMVプロモーター領域とEGFPをコー
ドする領域（1-1330、5'端にSacII部位、3'端にNotI部
位とBamHI部位と翻訳ストップコドンを付加）をプライ
マー6F（配列番号：15）と6R（配列番号：16）を用いて
pEGFPC2をテンプレートとしたPCRにより増幅した。４種
のPCR断片をそれぞれ制限酵素KpnIとEcoRI、EcoRIとSac
II、BamHIとSacI、SacIIとBamHI切断した後に精製し、p
Bluescript KS＋のKpnI-SacIの間に5'LTR→3'LTR→RRE
とCMVプロモーターEGFPの順にライゲーションして組み
込んだ（pBS/5'LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3'LTR）。
レポーター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼを使用す
る場合には、上記のようにしてPCRにより調製した5'LTR
領域と3'LTR領域を含むDNA断片をそれぞれ制限酵素KpnI
とEcoRI、NotIとSacIで切断した後に精製し、pBluescri
pt KS＋のKpnI-EcoRIとNotI-SacIにそれぞれ組み込んだ
プラスミド（pBS/5' LTR.U3G2/WT3' LTR)NotI部位にpCM
V-beta（Clontech）のβ−ガラクトシダーゼをコードす
る領域を含むNotI断片（820-4294）を組み込んだ（pBS/
5' LTR.U3G2/beta-gal/WT3' LTR）。次にプラスミドpBS
/5' LTR.U3G2/beta-ga1/WT3' LTRのEcoRI-NotI部位に、
プライマー7-1F（配列番号：17）と7-1R（配列番号：1
8）を用いてpSA212をテンプレートとしたPCRにより増幅
したRRE配列（6964-8177、5'端にEcoRI部位、3'端にNot
I部位を付加）を組み込んだ（pBS/5' LTR.U3G2/RRE6/tr
/beta-gal/WT3' LTR）後にRRE配列をEcoRIとNheIで切り
出し、プライマー7-2F（配列番号：19）と7-2R（配列番
号：20）を用いて、pSA212をテンプレートしたPCRによ
り増幅したRRE配列（7380-7993、5'端にEcoRI部位、3'
端にNheI部位を付加）を組み込んだ。以上の方法で得ら
れたプラスミド（pBS/5' LTR.U3G2/REEc/s/beta-gal/WT
3' LTR）をNheIとSmaIで切断し平滑末端化した後、pEGF
PN2(Clontech)由来のCMVプロモーター領域（8-592、Ase
I-NheI断片を平滑末端化）を組み込んだ（pBS/5' LTR.U
3G2/REEc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTR）。平滑末端化反応
はすべてBlunting High（東洋紡）を使用して添付説明
書に従って行った。プラスミドpBS/5' LTR.U3G2/REEc/s
/CMVFEGFP/WT3' LTRとpBS/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVFbet
a-gal/WT3' LTRをそれぞれKpnI-SacIで切断して5' LTR-
3' LTRを含むDNA断片を調製し、pGL3Control（Promeg
a）ベクターのKpnI-SacI部位へ組込み、ジーントランス
ファーベクター（pGL3C/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-
galまたはEGFP/WT3' LTR）として使用した。パッケージ
ングシグナルの同定には、pBS/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMV
Fbeta-gal/WT3' LTRプラスミドの5'LTRをKpnIとEcoRIで
切り出し、種々の長さの異なる領域を含むDNA断片をプ
ライマー8F（配列番号：21）と8-1Rから12R（配列番
号：22から33）を用いてpSA212をテンプレートとしたPC
Rで調製した12種のDNA断片を、KpnI-EcoRI部位へ組み込
んだベクターを使用した。 また、gagポリペプチドをコードする領域にフレーム
シフトを導入したベクターはプライマー8F（配列番号：
21）と8-3R（配列番号：24）用いてpSA212をテンプレー
トとしたPCRで調製したDNA断片をKnpI-EcoRI部位へ組み
込んだベクターのEcoRI部位へ8-FSF（配列番号：34）と
8-FSR（配列番号：35）を用いてpSA212をテンプレート
としたPCRで調製したDNA断片を組み込むことで得た。ga
gポリペプチドの翻訳開始コドン（ATG）に対して点突然
変異を導入したベクターはプライマー8F（配列番号：2
1）と8-PMR1から９（配列番号：36から44）を用いてpSA
212をテンプレートとしたPCRで調製したDNA断片をKpnI-
EcoRI部位へ組み込んだベクターのEcoRI部位へ8-FSF
（配列番号：34）と8-FSR（配列番号：35）を用いてpSA
212をテンプレートとしたPCRで調製したDNA断片を組み
込むことで得た。 ベクターの性能確認の一般的な方法は以下の通りであ
る。293T細胞を６ウェルのプラスチックプレート（住友
ベークライト）へ１ウェルあたり5X105個の細胞密度で
まき、炭酸ガスインキュベーター中（37℃、10%炭酸ガ
ス存在下）で48時間培養する。培養後に培養液を１ウェ
ルあたり800μｌのOptiMEMに置換してトランスフェクシ
ョンに使用する。DNA量は１ウェルあたり300ngのジーン
トランスファーベクターと600ngのパッケージングベク
ターと100ngのVSV-G発現ベクター（pHCMV-G,Methods in
Cell Biology, vol.43,pp99-112,1994）を使用する。D
NAを100μｌのＯｐｔｉＭＥＭに溶解後に６μｌのPLUS
reagentを加えて撹拌後15分室温で静置する。DNAとPLUS
reagentとの混合液に、100μｌのOptiMEMで希釈した４
μｌのLIPOFECTAMINEを添加して撹拌後さらに15分室温
で静置する。以上の方法により調製したDNAとLIPOFECTA
MINEとの複合体を含む溶液をを６ウェルプレートで培養
している293T細胞へ滴下してゆるやかに撹拌した後に炭
酸ガスインキュベーター中（３７℃10%炭酸ガス存在
下）で３時間培養する。培養後１ウェルあたり1mlの20%
非動化ウシ胎児血清を含むD-MEMを添加し、炭酸ガスイ
ンキュベーター中で37℃10%炭酸ガス存在下で12時間培
養した後、１ウェルあたり2mlの10%非動化ウシ胎児血清
を含むD-MEMに培地交換し、さらに24時間培養した後に
細胞の培養上清を0.45μmのポアサイズのフィルター（D
ISMIC-25CSフィルター、ADVANTEC）で濾過してアッセイ
に使用する。 濃縮ストックを調製する場合には、まず293T細胞を15
センチメートルのプラスチックプレート（住友ベークラ
イト）へ１プレートあたり2.5X106個の細胞密度でま
き、炭酸ガスインキュベーター中（37℃、10%炭酸ガス
存在下）で48時間培養後に培養液を１ウェルあたり10ml
のOptiMEMに置換してトランスフェクションに使用す
る。DNA量は１プレートあたり６μｇのジーントランス
ファーベクターと３μｇのパッケージングベクターと１
μｇのVSV-G発現ベクター（pHCMV-G）を使用する。DNA
を1.5mlのOptiMEMに溶解後に40μｌのPLUS reagentを加
えて撹拌後１５分室温で静置する。DNAとPLUS reagent
との混合液に、1mlのOptiMEMで希釈した60μｌのLOPOFE
CTAMINEを添加して撹拌後さらに15分室温で静置する。
以上の方法により調製したDNAとLIPOFECTAMINEとの複合
体を含む溶液を６ウェルプレートで培養している293T細
胞へ滴下してゆるやかに撹拌した後に炭酸ガスインキュ
ベーター中で37℃10％炭酸ガス存在下で３時間培養す
る。培養後１プレートあたり10mlの20％非動化ウシ胎児
血清を含むD-MEMを添加し、炭酸ガスインキュベーター
中で37℃10％炭酸ガス存在下で12時間培養した後培地を
１プレートあたり20mlの10％ウシ胎児血清を含むD-MEM
に交換し、さらに24時間培養した後に培養上清を0.45μ
mのポアサイズのフィルターで濾過後に、セントリプラ
スYM-100（Amicon）を用いて４℃、3000ｇの条件で170
分遠心し限外濾過を行うことで100倍に濃縮する。濃縮
後のサンプルはマイナス80℃で保存してアッセイに使用
する。 これにより調製したSIVagmウイルスベクターは、ヒト
細胞株293Tなどを用いて遺伝子導入効率を決定すること
ができる。また、後述のアフィジコリン処理（G1-S期で
の停止）やＸ線照射（G2-M期での停止）により、特定の
細胞周期における遺伝子導入効率を検討することもでき
る。 また、SIVagmベクターの導入実験を各種細胞を用いて
試行すれば、SIVagmベクターがより生理的状態に近い細
胞に対しても同様に遺伝子導入しうるかを決定すること
ができる。そのような細胞としては、例えば、ヒト神経
芽細胞株RBTM1とSH-SY5Y細胞を全トランス型レチノイン
酸処理により分化誘導させたものや、ラット初代培養脳
細胞（後述）などか挙げられる。 ［実施例２］ 5'LTRの改変 レンチウイルスの5'LTRの転写活性は一般にウイルス
由来の因子であるTatタンパク質の存在に依存してい
る。そこで、Tatに対する依存性を解消するためと、よ
り転写活性の強いプロモーター配列に置換することでベ
クター力価を高めるために、5'LTRのプロモーター配列
であるU3領域を他のプロモーター配列に置換したSIVagm
ジーントランスファーベクターを作製した（図２）。 5'LTRのキメラプロモーターへの置換は、以下のよう
にして行った。5'LTRのTATAボックスの下流〜gag領域
（9039-9170＋1-982）を含む断片をプライマー9-1Fから
3F（配列番号：45から47）と9R（配列番号：48）を用い
てpSA212をテンプレートとしたPCRで増幅した。また、C
MVLプロモーター（pCI（Promega）由来、1-721）、CMV
プロモーター（pEGFPN2（Clontech）由来、1-568）、EF
1アルファプロモーター（pEF-BOS（Nucleic Acids Rese
arch,vol.18,p5322,1990）の2240-2740）、CAプロモー
ター（pCAGGSの5-650）を含む断片をそれぞれプライマ
ー10-1F（配列番号：49）と10-1R（配列番号：50）、10
-2F（配列番号：51）と10-2R（配列番号：52）、10-3F
（配列番号：53）と10-3R（配列番号：54）、10-4F（配
列番号：55）と10-4R（配列番号：56）を用いてそれぞ
れpCI、pEGFPN2、pEF-BOS、pCAGGSをテンプレートとし
たPCRで増幅した。増幅後に5'LTRを含む断片と上記の各
プロモーターを含む断片とを混合し、それぞれのプロモ
ーターの5'側のプライマー（10-1F（配列番号：49）、1
0-2F（配列番号：51）、10-3F（配列番号：53）、10-4F
（配列番号：55））と、5'LTRの3'側のプライマー（9
R）を添加し、更に10サイクルのPCR反応を行うことで、
４種のプロモーターと5'LTRとのキメラプロモーターのD
NA断片を得た。得られたDNA断片は、ジーントランスフ
ァーベクター（pGL3C/5' LTR.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-ga
l/WT3' LTR）のKpnI-EcoRI部位に組み込んだ（pGL3C/CM
VL.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTR、pGL3C/CMV.U3
G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTR、pGL3C/EF1アルフ
ァ．L3G2/RREc/s/CMVFbeta-ga1/WT3' LTR、pGL3/CAG.U3
G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTR）。 ［実施例３］ 3'LTRの改変 レンチウイルスベクターにおいては、3'LTR領域に含
まれるプロモーター配列であるU3領域が、標的細胞中で
逆転写される時に5'LTRのU3プロモーター領域へ組み込
まれるため、標的細胞のゲノム内では、ジーントランス
ファーベクタープラスミドの3'LTR領域に含まれるU3領
域が、遺伝子発現に関与する5'LTRのU3プロモーターと
なることが明らかとなっている（図３）。そこで標的細
胞中で遺伝子発現に関与するプロモーターをU3配列以外
のプロモーターに置換しうるかを検討することが可能
な、SIVagmジーントランスファーベクターの3'LTRのU3
領域を他のプロモーター配列へ置換したベクターを作成
した（図３）。また、同時に標的細胞中で5'LTRに存在
するプロモーター配列を欠失させうるかを検討すること
が可能な、SIVagmジーントランスファーベクターの3'LT
RのU3領域を欠失させたベクターも作成した。 3'LTRのU3プロモーター配列の改変と欠失は、以下の
ように行った。3'LTRのU3を含まないDNA断片をプライマ
ー11F（配列番号：57）と11R（配列番号：58）を用いて
pSA212をテンプレートとしたPCRで増幅した。また、U3
領域を他のプロモーターへ置換した3'LTRはプライマー1
2-1Fから3F（配列番号：59から61）と12R（配列番号：6
2）を用いて、実施例２に記載の方法で得られたキメラ
プロモーターを組み込んだベクタープラスミドであるpG
L3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTR、pGL3C/
EF1アルファ．U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTR、pG
L3C/CAG.U3G2/RREC/S/CMVFbeta-gal/WT3' LTRをそれぞ
れテンプレートとしてPCRで増幅した。PCRにより得られ
たDNA断片はSalIとSacIで切断後に精製し、pGL3C/CMVL.
U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/WT3' LTRのSalI-SacI部位へ
組込み込んだ（pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/
3LTRdeltaU3、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/C
MVL.R、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/EF1アル
ファ．R、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFbeta-gal/CAG.
R）。 ［実施例４］ パッケージングシグナルの同定 ジーントランスファーベクターのベクター粒子へのパ
ッケージングには、ジーントランスファーベクター上に
存在してシスに作用する因子であるパッケージングシグ
ナルとパッケージングベクターより供給されトランスに
作用するタンパク質が必要である。ベクターのパッケー
ジングの効率を向上させることでベクター力価が高まる
ことが予想されるため、パッケージングシグナルの配列
により形成される構造を保持出来るようにパッケージン
グシグナルを含む領域を可能な限り長くベクターへ組み
込む必要がある。一方、ジーントランスファーベクター
のパッケージングシグナルとパッケージングベクターと
の配列の重複を最小限にすることで、両者の間でおこる
と考えられる組み換えによる野生型ウイルスの出現頻度
を最小限にする事が可能となることから、パッケージン
グに必要な最小領域を同定することが必要である。従っ
て、ベクター系を構築するためには、ジーントランスフ
ァーベクターを効率的にパッケージングするために必要
な最小限のパッケージングシグナル配列を正確に同定す
ることが必要である。パッケージングシグナルの同定
は、図４に示す方法で行ないうる。 gag領域により発現されるポリペプチドがパッケージ
ングに必要であるのか、あるいはgag領域のDNA配列自身
が必要であるかについては、図５に示すような変異を導
入したジーントランスファーベクターと野生型ジーント
ランスファーベクターのパッケージン効率を比較するこ
とで明らかにしうる。 ［実施例５］ 新規２種遺伝子の同時発現系の開発 Rev responsive element（RRE）はウイルス由来のRev
タンパク質の結合部位であり、RNAの核から細胞質への
輸送に関与している。このRRE/Revのシステムを利用し
て、スプライシングの効率を制御することで単一のプロ
モーターから同時に異なる２種のタンパク質を発現する
系を構築することが可能であるかを検討した。 まず、異なる２種のタンパク質の発現をRREにより制
御できるかを検討するため、図６に示すベクターを構築
した。すなわちRREの上流と下流にレポーター遺伝子と
してルシフェラーゼ遺伝子とβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子を組み込み、更にルシフェラーゼ遺伝子の上流にスプ
ライシングドナー配列を、RRE配列の下流にスプライシ
ングアクセプター配列をそれぞれ組み込んだベクターを
構築した。図６に示すようにこのベクターからはスプラ
イシングの有無により２種のmRNAが産生される事が予想
される。すなわちスプライシングを受けたmRNAよりβ−
ガラクトシダーゼタンパク質が、スプライシングを受け
ないmRNAよりルシフェラーゼタンパク質が発現されると
考えられる。また、単純に異なる２種の遺伝子を発現す
るだけでなく、その量比をRREの配列を変えることで制
御することが可能であるかを検討するため、６種のRRE
配列を組み込んだベクターを構築し、それぞれのベクタ
ーにおけるレポーター遺伝子の発現量を検討した。 ２遺伝子発現系を組み込んだベクターとRRE配列の活
性検討用ベクターの構築は、以下のように行った。ルシ
フェラーゼ、あるいはEGFPをコードする遺伝子断片の5'
と3'の両端にEcoRI部位を付加したDNA断片をプライマー
13-1F（配列番号：63）と13-1R（配列番号：64）、13-2
F（配列番号：65）と13-2R（配列番号：66）を用いpSP-
Iuc+(Promega)とpEGFPN2(Clontech)をそれぞれテンプレ
ートとしたPCRにより増幅した。 プラスミドpBS/5' LTR.U3G2/RRE6/tr/beta-gal/WT3'
LTRをKpnIとEcoRIで切断し、プライマー14F（配列番
号：67）と14R（配列番号：68）を用いてpSA212をテン
プレートとしたPCRにより得た5'LTRを含むDNA断片を組
み込んだ（pBS/5' LTR.U3Met-/RRE6/tr/beta-gal/WT3'
LTR）。プラスミドpBS/5' LTR.U3Met-/RRE6/tr/beta-ga
l/WT3' LTRをEcoRIとNheIで切断してRRE配列を切り出
し、種々のRRE配列を含むDNA断片を３種のプライマー
（15-1F（配列番号：69）と15-2F（配列番号：70））
と、３種のプライマー（15-1R（配列番号：71）、15-2R
（配列番号：72）、15-3R（配列番号：73））を組み合
わせてpSA212をテンプレートとしたPCRにより得た６種
のDNA断片をEcoRIとNheI、あるいはEcoRIとXbaIで切断
後に精製したDNA断片へ置換した。得られたプラスミド
のEcoRI部位に、PCRにより調製したルシフェラーゼ、あ
るいはEGFPをコードする遺伝子断片をEcoRIで切断後に
精製したものを組み込みRRE配列の活性検討用のアッセ
イに使用した（図７）。 レポーター遺伝子の位置の置換は、以下のように行っ
た。RRE6/s（6964-7993）配列を含むプラスミドpBS/5'
LTR.U3Met-/RRE6/s/beta-gal/WT3' LTRをNheIとSalIで
切断し、β−ガラクトシダーゼをコードする領域を含む
断片を切り出した後、ルシフェラーゼをコードする領域
を含むNheI-XhoI断片（pSP-luc+由来、17-1723）を組み
込んだ（pBS/5' LTR.U3Met-/RREc/s/luc+/WT3' LTR）。
次に、pBS/5' LTR.U3Met-/RREc/s/luc+/WT3' LTRをEcoR
I切断後に平滑末端化し、pCMV-beta(Clontech)のβ−ガ
ラクトシダーゼをコードする領域を含むNotI断片（820-
4294）を平滑末端化後に精製したものを組み込み（pBS/
5' LTR.U3Met-/beta-gal/RREc/s/Iuc+/W3' LTR）アッセ
イに使用した。平滑末端化反応はともにBlunting High
（東洋紡）を使用して添付説明書に従って行った。 プラスミドpBS/5' LTR.U3Met-/RREc/s/beta-gal/WT3'
LTRをKpnIとEcoRIで切断して5'LTRをプライマー16F
（配列番号：74）と16R（配列番号：75）を組み合わせ
てpSA212をテンプレートとしたPCRにより得たDNA断片を
組み込んだ（pBS/5' LTR.U3G3/RREc/s/beta-gal/WT3' L
TR）。 pBS/5' LTR.U3G3/RREc/s/beta-gal/WT3' LTRのEcoRI
部位に、PCRにより調製したEGFPをコードする遺伝子断
片をEcoRIで切断後に精製したものを組んだ後に、KpnI-
SacIで切断して5'LTR-3'LTRを含むDNA断片を調製し、pG
L3Control（Promega）ベクターのKpnI-SacI部位へ組込
みin situでの２遺伝子発現系の検定に用いた。 このようにして構築したジーントランスファーベクタ
ーを後述ように293T細胞にトランスフェクションし、β
−ガラクトシダーゼアッセイとルシフェラーゼアッセイ
を行った。その結果、図８のグラフに示すように、RRE
配列を有するベクターより異なる２種の遺伝子が発現さ
れうること、RRE配列の置換により２種の遺伝子の発現
効率を制御しうることが明らかとなった。また、パッケ
ジングベクター非存在下においても異なる２種の遺伝子
が発現されることから、本遺伝子発現系はRevタンパク
質の存在に非依存的に２種の遺伝子を発現させうること
が明らかとなった。 ［実施例６］ ２種遺伝子の同時発現系のプロモーター
に対する特異性 上記実施例ではプロモーターはSIVagmTYO1の5'LTRプ
ロモーターを使用していたが、RREを使用した２種遺伝
子の同時発現系が、5'LTR以外の種々のプロモーターを
使用した発現系に対しても適用しうるかを検討した。プ
ロモーターとしては、他のヒトサイトメガロウイルス
（CMV）由来のプロモーター、あるいは哺乳類細胞由来
のプロモーター（EF1αプロモーター）を使用した（図
９下段）。 その結果、図９のグラフに示すように5'LTR以外のプ
ロモーターを使用した場合においても、２種の遺伝子が
同時に発現されうることが明らかとなった。また、RRE
配列に依存した２種遺伝子の発現量制御も認められるこ
とが明らかとなった。従ってRREによる２種遺伝子の同
時発現系は種々のプロモーターを用いた発現系において
幅広く使用されうることが明らかとなった。 ［実施例７］ レポーター遺伝子の位置効果 レポーター遺伝子がRREの上流に組み込まれるか下流
に組み込まれるかによりそれぞれの遺伝子の発現量がど
の程度異なるかを検討した。SIVagmジーントランスファ
ーベクターでRRE6/s（6964-7993）配列を含むベクター
について、ルシフェラーゼとβ−ガラクトシダーゼの位
置を相互に置換したベクターを作製し（図１０下段）、
両ベクターにおける２種のレポーター遺伝子の発現量を
比較した。 その結果、図１０のグラフに示すようにRREの上流に
組み込まれるか下流に組み込まれるかでレポーター遺伝
子の発現量に差は認めらなかった。すなわちRRE配列を
用いた２種遺伝子の同時発現系は、特に種々のレセプタ
ーや転写因子など１：１のモル比で複合体を形成する事
で機能を有するタンパク質の発現に有用であることが明
らかとなった。 ［実施例８］ SINベクター（Self Inactivating Vecto
r）の性能確認 実施例３において作製したジーントランスファーベク
ターpGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/3' LTRΔU3は
3'LTRのU3領域を欠失しているので、標的細胞から全長
のベクターmRNAが転写されることを防止するSelf Inact
ivating Vector（SINベクター）として安全性が向上し
ていると考えられる。 SIN化により遺伝子導入効率が変化しうるかを検討す
るために、293T細胞に対するSIVagm SINベクターの導入
力価を、同一条件で作製した従来の野生型3'LTRをもつS
IVagmベクターの場合と比較した。その結果、導入力価
は従来型で2.4-2.8 TU/ml、SIVagm SINベクターで2.5-
2.9 TU/mlとなり、従来型の導入力価を100%とした場
合、SIVagm SINベクターでは105%であった。 さらに、放射線照射により細胞周期を停止した293T細
胞およびレチノイン酸により終末分化を誘導したSH-SY5
Y細胞へのSIVagm SINベクターによるEGFP遺伝子の導入
を試みた。細胞周期を停止した293T細胞におけるEGFPの
発現を蛍光顕微鏡で観察したところ、高い効率で遺伝子
の発現が認められた（図１１上段）。また、レチノイン
酸処理したSH-SY5Y細胞については、神経細胞に分化し
ていると考えられる、突起を伸長した細胞においてEGFP
の発現が確認された（図１１下段）。 これらのことから、遺伝子導入効率はSIN化により低
下しないことが明らかになった。 ［実施例９］ 末梢血リンパ球およびCD34陽性細胞への
SIVagm SINベクターによる遺伝子導入 CD34陽性細胞は、近年、造血幹細胞を含む分画として
注目されている（Blood,vol.87, pp1-13, 1996）。した
がって、CD34陽性細胞への遺伝子導入が可能になれば、
造血幹細胞に対する遺伝子導入、およびそこから分化す
るすべての血液細胞への遺伝子導入が可能になると考え
られる。そこで、SIVagm SINベクターによってヒト末梢
血由来単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cells：
PBMC）、ヒトＴ細胞、ヒト骨髄由来および臍帯血由来CD
34陽性細胞、カニクイザル骨髄由来CD34陽性細胞に遺伝
子を導入できるかを検討した。 PBMCの分離は、あらかじめ0.5M EDTA 200μｌを入れ
ておいたシリンジにヒト末梢血液10mlを採血し、Lympho
prep Tube（Nycomed）を添付説明書に従って用いること
により行った。分離した細胞は、96穴のプラスチックカ
ルチャープレートに2-2.5x105/wellでまき、RPMI 1640
培地（Gibco BRL、５％非動化ウシ血清を含む）中、37
℃５％CO2で培養した。Ｔ細胞への誘導は、分離したPBM
CをRPMI 1640 5％FCS、PHA（SIGMA）5mg/mlで３日間培
養し、IL2（シオノギ）40U/mlを加えてさらに３日間培
養することにより行った（Current Protocols in Immun
ology：6.16.4）。ヒト骨髄由来および臍帯血由来CD34
陽性細胞は、PureCell社の凍結細胞を添付説明書に従っ
て解凍し、96穴のプラスチックカルチャープレートに2-
2.5x105／wellでまき、IMDM（Gibco BRL）10％BIT9500
（StemCell）中で培養した。カニクイザル（3-7歳齢、
雌、平均体重3.0kg）骨髄由来CD34陽性細胞は、96穴の
プラスチックカルチャープレートに2-2.5x105／wellで
まき、a(-)MEM(SIGMA)10％非働化ウシ血清（国際試薬レ
ハツイン・プレミアーグレードLot. RB51901）中で培養
した。 ベクターによる遺伝子の導入は、以下のように行っ
た。まず、培養液より上清を一部除去し、実施例１に記
載の方法で濃縮しておいたベクターpGL3C/CMVL.U3G2/RR
Ec/s/CMVF EGFP/3' LTRΔU3（力価1-7x109 TU/ml）を重
層して全量を50μｌとした。その後、PBMCについては、
200G、32℃にて30分間遠心し、37℃ 5％CO2で３時間培
養し、培地200μｌを重層、48時間培養した。CD34陽性
細胞では、ベクター重層後に遠心を行わず、37℃ 5％CO
2で３時間培養し、培地200μｌを重層、48時間培養し
た。 EGFP遺伝子の導入はフローサイトメトリーによって確
認した。まず、培養した細胞をカルチャーウェルより回
収し、PBS3％FCS0.05％NaN3で洗浄後、PE（フィコエリ
スリン）標識抗CD3抗体、PE標識抗CD14抗体、PE標識抗C
D19抗体（Becton Dickinson）を用いて添付説明書に従
い表面抗原を染色した。染色後、細胞を洗浄し、PBS 1
％PFAで固定し、フローサイトメーターにかけた。 その結果、ヒトPBMCでは、m.o.i.90において51.8％の
細胞がEGFP陽性であった。EGFP発現細胞の割合はm.o.i.
依存的に上昇したが、m.o.i.36においてEGFP陽性率が45
％になり、それ以上のm.o.i.でもEGFP陽性率は約50％以
上にはあがらなかった。また、濃縮していないベクター
では、遺伝子導入は認められなかった（図１２）。ヒト
PBMCから誘導したＴ細胞では、ベクター感染48時間後の
解析でm.o.i.50において14.5％の細胞でEGFPの発現が認
められたが、濃縮していないベクターでは、遺伝子導入
は認められなかった（図１３）。ヒト骨髄由来および臍
帯血由来CD34陽性細胞それぞれに対しm.o.i.30で遺伝子
導入を行ったところ、骨髄細胞では26％（図１４）、臍
帯血細胞では11%（図１５）の細胞でEGFPが発現してい
た。サル骨髄由来CD34陽性細胞では、m.o.i.に依存した
導入率の上昇がみられ、m.o.i.100におけるEGFP発現率
は58％であった（図１６）。 以上の結果から、SIVagm SINベクターによりPBMC、Ｔ
細胞、骨髄および臍帯血由来CD34陽性細胞に対し高い効
率での遺伝子導入が可能であることが明らかとなった。 ［実施例１０］ SIVagm SINベクターにより遺伝子導入
されたCD34陽性細胞による造血系の再構築 NOD/SCIDマウスは、IDDM糖尿病マウスであるNOD/Ltマ
ウスと免疫不全マウスであるSCIDマウスの戻し交雑によ
り作成されたマウスで、SCIDマウスのＴ細胞、Ｂ細胞欠
損状態に加え、NK細胞、マクロファージ、補体の活性の
低下が認められる複合免疫不全マウスである（J. Immun
ol., vol.154, pp180-191, 1995）。日本クレアより、
この動物の系統であるNOD/Shi-scid Jicオス６週令を購
入し、２週間飼育後に実験に使用した。 NOD/SCIDマウスに対し多分化能を持つヒト細胞を移植
すると、マウス体内で造血系の再構築が行われヒト血液
細胞が体内を循環するようになる（Nat.Med.,vol.2, pp
1329-1337, 1996）。この系を利用し、遺伝子導入後のC
D34陽性細胞による造血系の再構築と再構築後の血液細
胞におけるEGFP発現を検討した（SCIDre-populating ce
llアッセイ）。 まず、NOD/SCIDマウス ８週令に対し、半致死量の放
射線を照射（300rad）した。放射線照射には日立MBR-15
20Rを使用し、照射条件は管電圧150kv、管電流20mA、0.
5Al, 0.1Cuフィルターとした。放射線照射後数時間以内
に、尾静脈より移植細胞をマイジェクター（テルモ29Gx
1/2"針付きシリンジ）を用いて注入、移植した。 移植のための細胞には、ヒト臍帯血由来CD34細胞（Pu
reCell）を使用した。細胞の培養、およびSIVagm SINベ
クターによる遺伝子導入は実施例９に記載した方法で行
い、m.o.i.100で感染を行った。ベクター感染後６時間
培養した後に細胞を回収し、IMDM（Gibco BRL）で洗
浄、1-3x106/mlでIMDMに浮遊させ、動物１頭あたり1x10
5/100μｌを移植した。 移植後の動物は、P3実験施設内安全キャビネットにお
いて無菌的に飼育した。実験は１群10頭のマウスを用
い、４群に分けて行った。28頭に遺伝子導入細胞を移
植、６頭に無処理の細胞を移植し、６頭は移植を行わず
に飼育した。全40頭の動物のうち、６週後まで生存した
のは25頭であり、生存率は６割であった。ヒト細胞の生
着が成立した個体は生存個体中５頭で、遺伝子導入細胞
を移植した動物が２頭、無処理の細胞を移植した動物が
３頭であった。 ４週から６週にかけて末梢血液を採取した。尾静脈を
カミソリで切断し、末梢血液50-100μｌをとり、0.5M E
DTA 10μｌと混和し、凝血を防止した。採取した血液に
蒸留水700μｌを加え数回ピペッティングして赤血球を
破壊し、2xPBS 700μｌを加えて混和し、遠心（5000rpm
１分間）して末梢血中全白血球を回収した。回収した
白血球を50μｌのPBS 3% FCS 0.05% NaN3に懸濁し、PE
標識抗ヒトCD45抗体（Coulter）２μｌを加え、氷上で3
0分間反応させ、PBS 3% FCS 0.05% NaN3で２回洗浄し、
PBS 1% PFAで固定後フローサイトメーターで解析した。
解析は２カラーで行い、マウス白血球中のヒトCD45陽性
細胞とその中のEGFP発現細胞を見た。 その結果、ヒトCD34陽性細胞を移植したマウス末梢血
では、白血球の10〜50％の細胞においてヒトCD45の発現
が認められた。SIVagm SINベクターによりEGFP遺伝子を
導入したヒトCD34陽性細胞を移植したマウスでは、末梢
血白血球中のヒトCD45陽性細胞の20％においてEGFPの発
現が認められた（図１７）。 ［共通の操作］ 本実施例において、共通する操作を下記（１）から
（７）に示した。 （１） 細胞の培養 ヒト胎児腎細胞由来細胞株293T細胞（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,vol.90,pp8392-8396,1993）は、10％非動化
ウシ胎児血清を含むD-MEM（GibcoBRL）で培養した。ま
た、細胞周期を停止させるためには、293T細胞をアフィ
ジコリン処理（Calbiochem、最終濃度20μg/mlで48時間
処理、G1-Sでの停止）、あるいはＸ線による照射（200
rad/分で20分照射後に48時間培養、G2-Mでの停止）のい
ずれかの処理を行なう。ヒト神経芽細胞株RBTM1とSH-SY
5Y細胞（Cancer Besearch,vol.58,pp2158-2165,1998）
は10％非動化ウシ胎児血清を含むRPMI1640（GibcoBRL）
培地で培養する。神経細胞への分化誘導は全トランス型
レチノイン酸処理（Sigma、最終濃度５μmol/mlで７日
間培養）で行なう。培養はすべてプラスチックプレート
（住友ベークライト）で行なう。 （２） ラット初代培養脳細胞培養の調製のための一般
的な方法 ラット初代培養脳細胞は５％非動化ウシ胎児血清と５
％非動化ウマ血清（Gibco BRL）を含むD-MEM（Gibco BR
L）で培養する。初代細胞の調製は以下の方法で行な
う。妊娠18日目のSDラットをジエチルエーテルにより深
麻酔後に腋窩動脈放血を行い安楽死させる。死亡確認後
に開腹を行い、胎児を含む子宮を摘出する。子宮より無
菌的に摘出した胎児の頭部より脳を摘出し作業液（50％
D-MEM、50％PBS（Gibco BRL）、ペニシリン５Ｘ104U/L
（Gibco BRL）、ストレプトマイシン50mg/L（Gibco BR
L）を含む）中に静置し、実体顕微鏡下で脳幹部分と大
脳半球の髄膜を除去する。脳組織を作業液により１回洗
浄した後手術用メスを用いて細切し、パパイン処理（パ
パイン（Worthington Biochem）1.5U/ml、システイン
（ナカライ）0.2mg/ml、ウシ血清アルブミン（Sigma）
0.2mg/ml、グルコース（和光）５mg/ml、DNase I（Gibc
o BRL）0.1mg/mlを含む溶液中で転倒撹拌、32℃で30分
間処理）後、ピペッティング操作により細胞を懸濁し、
遠心操作（1200rpmで５分間）により細胞を回収する。
回収した脳細胞は、５％非動化ウマ血清、５％非動化ウ
シ胎児血清、ペニシリン５Ｘ104U/L、ストレプトマイシ
ン50mg/Lを含むD-MEMによる洗浄を２回行なう。洗浄後
に細胞数を計測し、１ウェルあたり1-3Ｘ106個の細胞密
度でポリ−Ｌ−リジンコートした６ウェルプレート（セ
ルタイトPL、住友ベークライト）にまき、炭酸ガスイン
キュベーター中（37℃、５％CO2存在下）で培養する。 （３） トランスフェクション トランスフェクションはすべてLIPOFECTAMINEPLUS（G
ibco BRL）を用いて添付説明書に従って行った。293T細
胞を６ウェルのプラスチックプレート（住友ベークライ
ト）へ１ウェルあたり５Ｘ105個の細胞密度でまき、炭
酸ガスインキュベーター中（37℃、10％炭酸ガス存在
下）で48時間培養した。トランスフェクションの30分前
に培養液を１ウェルあたり800μｌのOptiMEM（Gibco BR
L）に培地交換し培養を続けた。トランスフェクション
に使用するDNA量は１ウェルあたり300ngのジーントラン
スファーベクターと、600ngのパッケージングベクター
または空のベクターを使用した。DNAを100μｌのOptiME
Mに溶解後に６μｌのPLUS reagent（Gibco BRL）を加え
て撹拌後１５分室温で静置した。DNAとPLUS reagent（G
ibco BRL）との混合液に、100μｌのOptiMEMで希釈した
４μｌのLIPOFECTAMINEを添加して撹拌後さらに15分室
温で静置した。以上の方法により調製したDNAとLIPOFEC
TAMINEとの複合体を含む溶液を６ウェルプレートで培養
している293T細胞へ滴下してゆるやかに撹拌した後に炭
酸ガスインキュベーター中（37℃10%炭酸ガス存在下）
で３時間培養した。培養後１ウェルあたり１mlの20％非
動化ウシ胎児血清を含むD-MEMを添加し、炭酸ガスイン
キュベーター中（37℃10%炭酸ガス存在下）で48時間培
養した後にβ−ガラクトシダーゼアッセイとルシフェラ
ーゼアッセイに使用した。 （４） β−ガラクトシダーゼアッセイとルシフェラー
ゼアッセイ β−ガラクトシダーゼアッセイとルシフェラーゼアッ
セイはそれぞれLuminescent beta-gal detection kit I
I（Clontech）とLuciferase Assay System（Promega）
を用いて添付説明書に従って行った。サンプルとしては
DNAをトランスフェクションした293T細胞を１ウェルあ
たり800μｌのReporter Lysis Bufferで溶解し、12000
g、４℃で５分間遠心後に上清を分取したものを細胞溶
解液として使用した。β−ガラクトシダーゼアッセイで
は細胞溶解液20μｌと基質液100μｌを混合した後、室
温で１時間静置後にルミノメーター（AutoLumat LB953,
berthold）で10秒間発光強度を測定した。ルシフェラー
ゼアッセイでは細胞溶解液20μｌと基質液100μｌを混
合後、すみやかにルミノメーター（AutoLumat LB953,be
rthold）で10秒間発光強度を測定した。すべてのアッセ
イで、それぞれサンプルについて３検体測定し平均値と
標準偏差を求めた。 （５） PCR PCRはすべてPCR Supermix High Fidelity（Gibco BR
L）を用いて行った。反応液90μｌに、基質として１μ
ｇのテンプレートDNA、プライマーとして２種の合成オ
リゴヌクレオチドを最終濃度１nmol/mlになるように添
加し、蒸留水で100μｌになるように全容量を調整し、
サーマルサイクラー（GeneAmp PCR System 9600、Perki
n Elmer）を用いて反応を行った。サンプルを94℃で１
分間反応後に、94℃30秒、55℃30秒、68℃90秒の反応を
10サイクル行い、最後に68℃で５分間の反応を行った。
反応液はWizard DNA Clean-up System（Promega）で精
製した後に目的の制限酵素で切断し、１％低融点アガロ
ースゲル（SeaPlaque GTG agarose、FMC Boichem、TAE
バッファーに溶解）で分離後に目的のサイズのDNA断片
をゲルより切り出しWizard PCR Preps DNA Purificatio
n System（Promega）で精製した後にライゲーション反
応に使用した。 （６） SIVagmベクターによる遺伝子導入の一般的方法 標的となる293T細胞は６ウェルのプラスチックプレー
ト（住友ベークライト）へ１ウェルあたり5X105個の細
胞密度でまき、炭酸ガスインキュベーター中（37℃、10
%炭酸ガス存在下）で48時間培養後にアッセイに使用す
る。標的細胞にはベクターを含む溶液にポリプレン（Si
gma）を最終濃度８μg/mlになるように添加した溶液を
重層する事でベクターの導入を行なう。ベクター感染後
４８時間後に標的細胞をBeta-Gal Staining Kit（Invit
rogen）を用いてX-galを基質とした染色を行い、倒立顕
微鏡（DMIRB（SLR）、ライカ）で検鏡して標的細胞での
ベーターガラクトシダーゼの発現を検出する。X-galに
より青色に染色された細胞の数を定量し、293T細胞１細
胞に対してベーターガラクトシダーゼを発現させるベク
ター量を１Transuducing Unit（TU）として算出する。 （７） 抗体による遺伝子導入細胞の染色のための一般
的な方法 ベクターを感染後48時間で、標的細胞をPBS（日研生
物医学研究所）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド
（和光）を含むPBSにより室温で30分間固定する。固定
後にPBSで５分間３回の洗浄を行い、その後２％正常ヤ
ギ血清（Gibco BRL）を含むPBSで室温１時間のブロッキ
ングを行なう。一次抗体としては、ラット脳細胞の分化
ニューロンに対しては抗MAP-2モノクローナル抗体（マ
ウスIgG、BOEHRINGER MANHEIM）を２μg/mlの濃度に、
β−ガラクトシダーゼ導入細胞に対しては抗大腸菌β−
ガラクトシダーゼポリクローナル抗体（ウサギ、５prim
e→３prime, Inc.）を8.2μg/mlの濃度にそれぞれ２％
正常ヤギ血清を含むPBSで希釈した溶液を使用し、37℃
で30分間反応させる。一次抗体反応後、細胞をPBSで５
分間３回洗浄した後に２次抗体との反応を行なう。２次
抗体としてはEGFPを導入したラット脳細胞に対しては、
Texus Redでラベルした抗マウスIgGポリクローナル抗体
（ヤギ、EY LABORATORIES, INC.）を10μg/mlか、ある
いはAlexa568でラベルした抗マウスIgGポリクローナル
抗体（ヤギ、Molecular Probes, Inc.）を４μg/mlの濃
度にそれぞれ２％正常ヤギ血清を含むPBSで希釈した溶
液を使用する。また、β−ガラクトシダーゼ導入ラット
脳細胞に対してはAiexa488でラベルした抗マウスIgGポ
リクローナル抗体（ヤギ、Molecular Probes, inc.）と
Alexa568でラベルした抗ウサギIgGポリクローナル抗体
（ヤギ、Molecular Probes, Inc.）をそれぞれ４μg/ml
の濃度に２％正常ヤギ血清を含むPBSで希釈した溶液を
使用し、ラット脳細胞以外のβ−ガラクトシダーゼ導入
細胞に対してはAlexa568でラベルしたヤギ抗ウサギIgG
ポリクローナル抗体を４μg/mlの濃度に２％正常ヤギ血
清を含むPBSで希釈した溶液を使用する。２次抗体との
反応は、すべて37℃で30分間の条件で行なう。２次抗体
反応後に標的細胞をPBSで５分間３回洗浄した後、PBSを
重層して倒立顕微鏡（DMIRB（SLR）、ライカ）により蛍
光を観察する事で目的のタンパク質の発現を検出する。 産業上の利用の可能性 本発明により、RRE配列の利用により２つの外来遺伝
子を発現することができるベクターが提供された。本発
明のベクターにおいては、RRE配列の改変により、２つ
の外来遺伝子の発現の量比を調整することが可能であ
る。また、ウイルス由来の発現制御配列を他の発現制御
配列に改変することにより、ウイルス由来のタンパク質
に対する依存性が解消されている。パッケージングシグ
ナルを有する最小限の領域をベクターに用いることによ
り、遺伝子組換えによる野生株の出現の危険を減少させ
安全性が高められている。本発明のベクターは、遺伝子
治療などに好適に用いられる。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 速水 正憲
京都府京都市南区東九条明田町13−２
新烏丸日光ハイツ710号
(72)発明者 井戸 栄治
京都府宇治市宇治野神１−32
(56)参考文献 特表2002−530057（ＪＰ，Ａ)
特表2000−530070（ＪＰ，Ａ)
特表2002−508184（ＪＰ，Ａ)
国際公開97／12622（ＷＯ，Ａ１)
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．72，Ｎ
ｏ．11（1998）ｐ．8463−8471
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．72，Ｎ
ｏ．12（1998）ｐ．9873−9880
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (22)
- 【請求項１】 ２つの外来遺伝子を発現させるための下
記（ａ）から（ｆ）； （ａ）発現制御配列、 （ｂ）スプライシング供与配列、 （ｃ）第一の外来遺伝子挿入部位、 （ｄ）RREコア配列、 （ｅ）スプライシング受容配列、 （ｆ）第二の外来遺伝子挿入部位、 の構成要素を5'側から3'側に向けて順に含むベクターDN
A。 - 【請求項２】 ２つの外来遺伝子を発現させるための下
記（ａ）から（ｆ）； （ａ）発現制御配列、 （ｂ）スプライシング供与配列、 （ｃ）RREコア配列、 （ｄ）第一の外来遺伝子挿入部位、 （ｅ）スプライシング受容配列、 （ｆ）第二の外来遺伝子挿入部位、 の構成要素を5'側から3'側に向けて順に含むベクターDN
A。 - 【請求項３】 RREコア配列がレトロウイルス由来であ
る、請求項１または２に記載のベクターDNA。 - 【請求項４】 RREコア配列がレンチウイルス由来であ
る、請求項１または２に記載のベクターDNA。 - 【請求項５】 RREコア配列が免疫不全ウイルス由来で
ある、請求項１または２に記載のベクターDNA。 - 【請求項６】 発現制御配列がLTRである、請求項１か
ら５のいずれかに記載のベクターDNA。 - 【請求項７】 発現制御配列がLTR以外の発現制御配列
を含む配列である、請求項１から６のいずれかに記載の
ベクターDNA。 - 【請求項８】 LTR以外の発現制御配列が、CMVLプロモ
ーター、CMVプロモーター、およびEF1αプロモーターか
らなる群より選択される、請求項７に記載のベクターDN
A。 - 【請求項９】 スプライシング供与配列およびスプライ
シング受容配列がレトロウイルス由来である、請求項１
から８のいずれかに記載のベクターDNA。 - 【請求項１０】 スプライシング供与配列およびスプラ
イシング受容配列がレンチウイルス由来である、請求項
１から８のいずれかに記載のベクターDNA。 - 【請求項１１】 スプライシング供与配列およびスプラ
イシング受容配列が免疫不全ウイルス由来である、請求
項１から８のいずれかに記載のベクターDNA。 - 【請求項１２】 ベクターDNA上の転写されうる領域内
にパッケージングシグナルを含む、請求項１から１１の
いずれかに記載のベクターDNA。 - 【請求項１３】 パッケージングシグナルがレトロウイ
ルス由来である、請求項１２に記載のベクターDNA。 - 【請求項１４】 パッケージングシグナルがレンチウイ
ルス由来である、請求項１２に記載のベクターDNA。 - 【請求項１５】 パッケージングシグナルが免疫不全ウ
イルス由来である、請求項１２に記載のベクターDNA。 - 【請求項１６】 完全なgagタンパク質が発現しないよ
うに構築されている請求項１３から１５のいずれかに記
載のベクターDNA。 - 【請求項１７】 gagタンパク質の翻訳開始コドンに変
異を有する、請求項１３から１６のいずれかに記載のベ
クターDNA。 - 【請求項１８】 第一の外来遺伝子および第二の外来遺
伝子が挿入された、請求項１から１７のいずれかに記載
のベクターDNA。 - 【請求項１９】 第一の外来遺伝子および第二の外来遺
伝子が挿入された請求項１２から１７のいずれかに記載
のベクターDNAからの転写産物をウイルス粒子内部に含
むレトロウイルスベクター。 - 【請求項２０】 第一の外来遺伝子および第二の外来遺
伝子が挿入された請求項１２から１７のいずれかに記載
のベクターDNAからの転写産物をウイルス粒子内部に含
むレンチウイルスベクター。 - 【請求項２１】 第一の外来遺伝子および第二の外来遺
伝子が挿入された請求項１２から１７のいずれかに記載
のベクターDNAからの転写産物をウイルス粒子内部に含
む免疫不全ウイルスベクター。 - 【請求項２２】 第一の外来遺伝子および第二の外来遺
伝子が挿入された請求項１２から１７のいずれかに記載
のベクターDNAをパッケージング細胞に導入し、該細胞
の培養上清から生産させたウイルス粒子を回収する工程
を含む、ウイルスベクターの調製方法。
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