JP3594609B2 - ルシフェラーゼ標識方法 - Google Patents

Description

本発明は、化学的アッセイ、特にバイオアッセイ、より特定的にはイムノアッセイのような特異的結合アッセイ及びハイブリダイゼーションプロービング技術に使用するため、並びに、アッセイフォーマット中で例えばPCRによる特異的増幅産物にラベルを組込むために、化学的材料、特に生物学的材料を標識する方法に関する。
ホタルルシフェラーゼが介在するルシフェリンの開裂（反応式１）は高い量子収率及び安定な光出力を有しており、比較的簡単な計器を用いて極めて低濃度の酵素自体を検出することが可能である（McCapra,“バイオルミネセンス及びケミルミネセンスの潜在的用途（Potential applications of bioluminescence and chemiluminescence）",Turnerら（編）,Biosensors:fundamentals and applications:Oxford University Press,（1988）:617−37参照）。ルシフェラーゼを間接ラベルとして用いる方法は多数開発されている（Wannlund and DeLuca,“バイオルミネセンスイムノアッセイ：メトキシレート及びDNPを定量するためのルシフェラーゼ抗原複合体の使用（Bioluminescence immunoassays:Use of luciferase antigen conjugates for determination of methoxylate and DNP）",Deluca and McElroy（編）,Bioluminescence and Chemiluminescence:Basic chemistry and analytical applications.London:Academic Press,（1981）:693−696;Geiger and Miska,“バイオルミネセンス増強エンザイムイムノアッセイ：エンザイムイムノアッセイ用の新しい超高感度検出システム（Bioluminescence enhanced enzyme immunoassay:New ultrasensitive detection system for enzyme immunoassay）",Clin.Chem.Clin.Biochem.J.（1987）25,31−38;及び、Murakamiら，“アデニル酸キナーゼ及びホタルルシフェラーゼを用いる生物発光検出システムの開発（Development of ａ bioluminescent detection system using adenylate kinase and firefly luciferase）",Szalayら（編）,Bioluminescence and chemiluminescence:Status Report,Chichester:John Wiley and Sons,（1993）296−300参照）。
本発明者らは、ルシフェラーゼを直接ラベルとして使用することによってアッセイの感度を維持しながらアッセイの設計をはるかに簡単にできることに注目した。しかしながら、極めて不安定な酵素活性を有することが判っている物質を失活させることなく検定用結合因子（assay binding agent）に結合させる方法が必要である。グルタルアルデヒド、SMCC及びSMPBのような標準的な共有結合試薬（covalent couplihg reagent）はルシフェラーゼ活性を急速にかつ不可逆的に阻害する。
例えばPhotinus pyralisに由来するルシフェラーゼは４個のシステイン残基を含み（Wetら，（1987）,Molecular and Cellular Biology,7,725−737参照）、その２つは活性部位に接近しているかまたは活性部位の一部を構成している（Deluca and McElroy,（1978）,Methods in Enzymology,57,3−15参照）。本発明者らは、観察された失活の原因は共有結合試薬が上記の残基に結合するためであろうと推測し、不可逆的阻害から酵素を保護するようなルシフェラーゼと検定物質との結合方法を提供した。
従って、本発明の第一の目的によれば、ホタルルシフェラーゼを化学物質、特に抗体、抗原または核酸のような特異的結合因子（binding agent）、より特定的には抗体に結合させる方法が提供される。この方法は、（ａ）Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸のいずれか一種以上とルシフェラーゼとを、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸の濃度が夫々0.2ミリモル／リットル及び0.05ミリモル／リットルよりも大きい値となるように混合する段階と、（ｂ）共有結合試薬を用いてルシフェラーゼと上記化学物質との間に共有結合反応を惹起する段階とを含む。好ましくは、段階（ａ）は、ルシフェラーゼとその基質とを溶液中で混合することによって実施され、また、好ましくは、マグネシウムとアデノシン三リン酸との双方がアデノシン三リン酸マグネシウム（Mg²⁺ATP）の形態で、任意にＤ−ルシフェリンと共に存在する。好ましくは、Mg²⁺ATPまたはＤ−ルシフェリンの一方だけが存在する。Mg²⁺とATPとルシフェリンとが３つとも存在するときは、反応混合物から酸素を排除するのが好ましい。
本発明の第二の目的によれば、本発明の方法によって提供される活性ホタルルシフェラーゼに結合した化学物質を含む標識化学物質（labelled chemical entity）が提供される。好ましくは、化学物質が、特異的結合アッセイでの使用に適した特異的結合因子、好ましくは抗体、抗原または核酸である。結合因子が核酸である場合、核酸は好ましくはオリゴヌクレオチドであるが、ポリヌクレオチドまたはヌクレオチドでもよく、また、該核酸をハイブリダイゼーションプローブもしくは鎖延長プライマー、例えばPCRプライマーとして使用してもよい。該物質が抗体である場合が最も有利であるが、その理由は、抗体をルシフェラーゼに結合させるこれまでの試みはほぼ完全な失活に終わっていたからである。
ルシフェラーゼ標識化学物質、及び、特にルシフェラーゼ標識抗体の提供によって与えられる特別な利点は、光ガイドを組み込んだ捕捉アッセイ（capture assay）の実施が可能になったことである。このようなアッセイの１つの好適例では、標的抗原に対する捕捉抗体が光ガイドに固定化され、例えば光ファイバから成る光ガイドは例えば光電子増倍管から成る光測定デバイスに受容光を導入するように構成されている。測定すべき抗原を液体サンプル中で光ガイドに作用させ、ルシフェラーゼで標識されていることを特徴とする第二抗体を溶液中で光ガイドと接触させる。第二抗体は、既に捕捉されて捕捉抗体に結合している抗原に結合する。
捕捉された抗原の存在及び／または量を決定するためには、溶液中のＤ−ルシフェリン及びMg²⁺ATPを、抗原−抗体複合体が結合した光ガイドの表面に接触させ、例えば光電子増倍管から成る光測定デバイスに伝送された放出光の量を測定するだけでよい。この方法においては、各々が異なる抗原を捕捉し得る複数の光ガイドを単一のサンプルチャンバに配置して使用することによって、より高感度を有する光測定アッセイを複数の特異性を持って実施することが可能となり、従って、同一段階に複数の異なるルシフェラーゼ標識抗体を添加することによって複数の異なるイムノアッセイを同時に実施し得る。
あるいは、一次元または二次元の検出アレイの表面の多数の不連続領域を同時にモニターするために、電荷結合デバイス（charge couple device:CCD）またはダイオードアレイもしくは光電子増倍管のような等価のデバイスを使用してもよく、不連続領域の各々には、異なる抗原に特異的な異なる抗体が固定化されている。その結果として、各々の抗原の存在を光放出の位置によって検出し得る。標的抗体に特異的な抗原または抗免疫グロブリン抗体をこのような光ガイドまたは電荷結合デバイスに固定化し同様にして使用すると、特異的抗体に対する競合結合アッセイが可能であり、このように競合用抗体をサンプルの形態で同時に添加するときには光ガイド上の抗原に結合するルシフェラーゼ標識抗体の量は減少するであろう。
サンプルとルシフェラーゼ標識抗体とを除去し、光ガイドをＤ−ルシフェリン及びMg²⁺ATP基質溶液に浸漬させ、光電子増倍管で光を検出するとき、検出された光の量は、固定化された抗原または抗免疫グロブリン抗体に特異的なサンプル中の抗体の量に関連するであろう。
表面にオリゴヌクレオチドプローブが結合した光ガイドを使用し（本出願人のWO9306241に記載の方法参照）、ルシフェラーゼで標識されたオリゴヌクレオチドを使用するとき、上述の抗体−抗原アッセイと同様の方法でオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドのアッセイも可能であろう。更に、種々の光ガイドまたはアレイ領域を使用すると、単一サンプルから複数の抗原及び核酸の同時アッセイが可能であろう。
二次元型導波路（planar waveguide）または光ファイバ（これらは多重化されていてもよい）のような光ガイドの表面でルシフェラーゼ標識結合アッセイを実施する特別な利点は、光ガイドの表面の数百ナノメーター範囲内で発生する光が検出器によって優先的に検出されながらバルク溶液中で発生する光が検出されないので、検出対象である種、即ち結合した種から試薬を分離する必要性が少なくなることである。従って、このようなフォーマットを使用するアッセイ（通常はエバネッセンス（evanescence）と呼ばれる）は、洗浄段階または試薬の逐次添加を必要とせず、従って、任意にフローセルを用いる液体流中で極めて迅速に実行できる。
次に、本発明の標識物質、その製造方法、及び、その使用方法の代表例を以下の非限定的実施例及び図面に基づいて説明する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１に記載の種々の量のMg²⁺ATPによって保護された共有結合試薬とルシフェラーゼとのインキュベーション後に得られたルミネセンス対時間のプロットを示す。
図２は、実施例１に記載の手順で実施したアッセイにおけるルミネセンス対リシン量のプロットを示す。上部のプロットは1/100に希釈したIgG−ルシフェラーゼ複合体を用いて得られた結果を表しており、下部のプロットは1/1000の希釈度を使用した結果を表している。
反応式1:ホタルルシフェラーゼの反応

式中、LH₂はルシフェリン、Ｅはルシフェラーゼ、AMPはアデノシン一リン酸、PP₁は無機ピロリン酸塩、Ｌはオキシルシフェリンを示す。
実施例１
光測定にはいずれもMultilite（登録商標）光度計（luminometer）及び3.5mlのポリスチレン管（Biotrace Bridgend UK）を使用した。ホタルルシフェラーゼ（Ｌ−5256）、DTT、BSA（Fraction Ｖ）、ATP及びリシン（ricin）はSigma（Poole,UK）から得た。Ｄ−ルシフェリンはFluka（Gillingham,UK）から得た。スルホスクシンアミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−SMCC）はPierce and Warriner（Chester,UK）から得た。ヒツジ抗リシン抗体は慣用の技術によって製造し、他の試薬は分析用グレードであった。
ルシフェラーゼ基質は、0.4ミリモル／リットルのＤ−ルシフェリン、40ミリモル／リットルの硫酸マグネシウム、２ミリモル／リットルのATP、２ミリモル／リットルのEDTA、２ミリモル／リットルのDTT、0.2％のBSA及び2gモル／リットルのピロリン酸ナトリウムを含有するpH7.75の10ミリモル／リットルのHEPES緩衝液であった。基質はストック溶液から毎日新しく調製した。3.5mlのポリスチレン管中で２×10^-6リットルの評価すべきサンプルを200×10^-6リットルの基質（上述）に添加することによってルシフェラーゼ活性アッセイを実施し、５秒の猶予後にルミネセンスを測定し、10秒間にわたって積算した。
基質保護方法:4.2gモル／リットルのルシフェラーゼをpH7.75の10ミリモル／リットルのHEPES緩衝液中の630gモル／リットルのスルホ−SMCCと混合し、混合物を室温で30分間インキュベートした。所定の時間間隔をおいて反応混合物からサンプルを採取し、緩衝液で100倍に希釈し、サンプルのルシフェラーゼ活性を測定した。種々の濃度のMg²⁺ATPまたはＤ−ルシフェリンを混合物に添加し、活性に対するそれらの効果をモニタリングし、阻害に対する最も有効な保護を判定した。
スルホ−SMCCとの共有結合:2−メルカプトエチルアミン−HClと37℃で90分間反応させることによって、リシンに対するヒツジIgGを還元しチオール基を遊離させた（Pierce Warrinerキットの使用説明書参照）。0.5ミリモル／リットルのATPと2.5ミリモル／リットルの硫酸マグネシウムとを含有するpH7.0の1mlのリン酸塩緩衝液中で4mgのルシフェラーゼを調製した。pH6.0のリン酸塩緩衝液中の20ミリモル／リットルの濃度の50μｌのスルホ−SMCCを添加し、混合物を室温で30分間インキュベートした。活性化したルシフェラーゼを、Pierce GF−５脱塩カラムを用いて精製し、0.25ミリモル／リットルのEDTAと0.5ミリモル／リットルのATPと2.5ミリモル／リットルの硫酸マグネシウムとを含有するpH7.0のリン酸塩緩衝液中で活性化ルシフェラーゼと還元IgGとをモル比1:1で混合した。室温で反応を30分間進行させ、次いで１モル／リットルの濃度の10μｌのシステインを20分間添加して反応を停止させた後、ルシフェラーゼ−抗体複合体をPierce GF−５脱塩カラムで精製した。生成物を必要になるまで、0.25ミリモル／リットルのEDTAを含有するpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液中で４℃で保存した。
ELISAアッセイを以下に記載のごとく実施して、結合したルシフェラーゼの残留活性を測定した。
管ベース生物発光ELISA:0.02％のチオマーサル（thiomersal）を含有するpH9.6の炭酸塩−重炭酸塩緩衝液中の100μｌのリシンによってポリスチレン管を４℃で一夜コーティングした。ルシフェラーゼ−抗体複合体をリン酸塩緩衝生理食塩水（PBS）に希釈し、管を200μｌの１％BSAでブロッキングした後、100μｌの標識抗体を添加し、37℃で１時間のインキュベーションを実施した。５％のTween20を含有するPBSで管を５回洗浄した。各管に200μｌの基質を添加し、ルミネセンスを直ちに測定した。
結果:Mg²⁺ATPによる基質保護から得られた結果を図１に示す。図１は、0.63×10^-6モル／リットルのスルホ−SMCCと4.2×10^-6モル／リットルのルシフェラーゼとMg²⁺ATPとを含有する反応混合物から採取したサンプル（各時点毎に３回反復）中の残留活性％を光度計で読取った値を時間の関数としてプロットする。プロットは夫々、Mg²⁺またはATP非含有;0.03ミリモル／リットルのATPと0.2ミリモル／リットルのMg²⁺;0.25ミリモル／リットルのATPと2.0ミリモル／リットルのMg²⁺;0.25ミリモル／リットルのATPと2.5ミリモル／リットルのMG²⁺とを用いた反応を示す。また、Ｄ−ルシフェリンによる保護効果も観察した（結果示さず）。Ｄ−ルシフェリンを用いた場合、活性はある程度維持されるが、Mg²⁺ATPによって維持される活性よりも有意に少ないことが判明した。試験したＤ−ルシフェリンの最大濃度は１ミリモル／リットルであり、スルホ−SMCCに30分間接触させた後に維持されていたルシフェラーゼ活性の初期値に対する割合は11％であった。これに比べて、Mg²⁺ATPを用いた場合には40％を上回る値が得られた。
管ベース生物発光ELISAの結果を図２に示す。Multilite（登録商標）光度計で光測定を直接行うことができるようにポリスチレン管を使用したが、マイクロタイタープレート及びプレート光度計の使用も同様に可能である。結果は、活性ルシフェラーゼ−抗体複合体が産生され、抗体がその結合特性を維持していることを示す。
実施例２
リシンに対するヒツジポリクローナル抗体を、光電子増倍管に接続した光ファイバに共有結合させた。ファイバに結合した抗体を含むファイバの部分は、必要に応じて種々の溶液を充填及び排出し得るチャンバの内部に存在している。以下のサイクルでアッセイを実施した。
（Ｉ）ルシフェラーゼが存在するならば光を放出するようにＤ−ルシフェリンを含有する基質溶液をチャンバに添加した。
（II）基質溶液をリシンを含む試験サンプルによって置換した。
（III）試験サンプル溶液をルシフェラーゼで標識したヒツジ抗リシンIgGを含有する溶液によって置換した。
（IV）ヒツジ抗リシン溶液をＤ−ルシフェリン含有基質溶液によって置換した。
（Ｖ）基質溶液を再生緩衝液によって置換した。
このフォーマットを使用すると、例えば既知量のリシンのシグナル増加を用いて得られた標準曲線に基づいて、段階（IV）で光電子増倍管から発生したシグナルがそれ以前のシグナルに比べたときに示した増加とリシンの量とを関連させることによって、試験サンプル中のリシンの量を決定することが可能である。
本願に記載されたルシフェラーゼと標識化学物質との結合方法はまた、WO9525798に記載されたルシフェラーゼにも適しているであろう。同様に、該方法はまた、他のルシフェラーゼにも適当であろう。

Claims (25)

1. （ａ）（ｉ）Ｄ−ルシフェリン、（ii）マ グネシウムイオン及びアデノシン三リン酸、（iii）Ｄ −ルシフェリン、マグネシウムイオン及びアデノシン三 リン酸からなる群より選択された試薬とルシフェラーゼとを、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸が存 在する場合には、それぞれの濃度が0.2ミリモル／リットル及び0.05ミリモル／リットルよりも大きい値となるように混合する段階と、（ｂ）共有結合試薬を用いてル シフェラーゼと抗体又は核酸との間で共有結合する段階とを含む、ホタルルシフェラーゼと抗体又は核酸との結 合方法。
2. 段階（ａ）が、ルシフェラーゼをＤ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及び／またはアデノシン三リン酸と溶液中で混合させることによって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸の双方が、アデノシン三リン酸マグネシウム（Mg²⁺ATP）の形態で存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 段階（ａ）が、４×10^-6モル／リットルのルシフェラーゼあたり0.2ミリモル／リットルまたはそれ以上のATPを用いて行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 段階（ａ）が、２ミリモル／リットルのマグネシウムイオンの存在下で行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 共有結合試薬がグルタルアルデヒド、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（SMCC）及び／またはスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（SMPB）を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 段階（ｂ）が、ルシフェラーゼをＤ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及び／またはアデノシン三リン酸（ATP）と混合した後に、共有結合試薬によって行われることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 0.5ミリモル／リットルのATPを使用することを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 請求項１から８のいずれか一項に記載の方法によって提供された活性ホタルルシフェラーゼに結合した抗体又は核酸を含む標識化学物質。
10. 抗体又は核酸が、特異的結合アッセイに好適に使用される特異的結合因子であることを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法または標識化学物質。
11. 化学物質が抗体であることを特徴とする請求項10に記載の方法または標識化学物質。
12. 請求項９から11のいずれか一項に記載の標識化学物質の使用を含むことを特徴とする特異的結合アッセイ。
13. 標的化学物質を請求項９に記載の化学物質に特異的に結合させ、結合した物質とＤ−ルシフェリンとをルシフェラーゼがＤ−ルシフェリンを開裂させ光の放出を惹起する条件下で接触させ、放出された光の量と標的化学物質の存在とを関連させることによって標的化学物質の存在及び／または量を決定することを特徴とする請求項12に記載の特異的結合アッセイ。
14. 標的化学物質が抗原であり、前記抗原が、活性ホタルルシフェラーゼに結合した特異的結合因子に結合する前に抗原特異的捕捉抗体によって捕捉されることを特徴とする請求項12または13に記載の特異的結合アッセイ。
15. 活性ホタルルシフェラーゼに結合した特異的結合因子が標的抗原に特異的な抗体であることを特徴とする請求項14に記載の特異的結合アッセイ。
16. 捕捉抗体が光測定デバイスに光を供給する光ガイドに結合していることを特徴とする請求項14または15に記載の特異的結合アッセイ。
17. 光ガイドが光ファイバであることを特徴とする請求項16に記載の特異的結合アッセイ。
18. 光検出デバイスを使用して一次元または二次元の検出アレイ表面上の多数の不連続領域を同時にモニタリングし、該不連続領域の各々が異なる抗原または抗体に夫々特異的な異なる固定化された抗体または抗原を有しており、各々の抗原の存在は検出された光放出の位置によって検出されることを特徴とする請求項14又は15に記載の特異的結合アッセイ。
19. 光検出デバイスが電荷結合デバイスであることを特徴とする請求項18に記載のアッセイ。
20. 請求項１から８のいずれか一項に記載の方法によって活性ホタルルシフェラーゼに結合した抗体又は核酸を含むことを特徴とする検査キット。
21. 活性ホタルルシフェラーゼに結合した抗体を含むことを特徴とする請求項20に記載の検査キット。
22. 結合したホタルルシフェラーゼが、標識抗体の作製に使用されたルシフェラーゼの活性の10％以上の活性を有していることを特徴とする請求項21に記載の検査キット。
23. 抗体または核酸が固定された光ガイドまたは光検出アレイを含むことを特徴とする請求項21または22に記載の検査キット。
24. （ａ）（ｉ）Ｄ−ルシフェリンとルシフェラーゼとを、または（ii）マグネシウムイオンとアデノシン三リン酸との組合わせとルシフェラーゼとを混合 する段階で、（ii）を混合するような場合には、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸の濃度が夫々0.2ミリモル／リットル及び0.0５ミリモル／リットルよりも大きい値となるように混合する段階と、（ｂ）共有結合試薬を用いてルシフェラーゼと化学物質との間の共有結合反応を惹起する段階とを含む、ホタルルシフェラーゼと抗体又は核酸である化学物質との結合方法。
25. （ａ）（ｉ）Ｄ−ルシフェリン、（ii） マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸、（iii） Ｄ−ルシフェリン、マグネシウムイオン及びアデノシン 三リン酸からなる群より選択された試薬とルシフェラーゼとを、マグネシウムイオン及びアデノシン三リン酸が 存在する場合には、それぞれの濃度が0.2ミリモル／リットル及び0.0５ミリモル／リットルよりも大きい値となるように混合する段階と、（ｂ）共有結合試薬を用いてルシフェラーゼと抗体又は核酸との間で共有結合する 段階とを含み、（iii）の試薬を使用する場合には、反応から酵素を排除することを特徴とする、ホタルルシフェラーゼを抗体又は核酸と結合する方法。

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