JP3554355B2 - Ｉｌ−６オートクライン増殖性ヒト骨髄腫細胞株 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はヒト骨髄腫細胞株に関し、さらに詳しくはオートクライン機構によってＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株、該細胞株を移植した実験動物、ならびに該細胞株または該実験動物を用いる骨髄腫治療剤のスクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｂ細胞刺激因子２（ＢＳＦ−２）およびマウスハイブリドーマ／形質細胞腫増殖因子と同一因子であるインターロイキン６（ＩＬ−６）は多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ：以下ＭＭと記載する場合がある）細胞の主要な増殖因子であると考えられている（Ｋａｗａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：８３，１９８８； Ｋｌｅｉｎｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７３：５１７， １９８９）。多発性骨髄腫は、形質細胞が悪性化した腫瘍で、骨髄を増殖の場とし、複数の部位に同時に発生する。ＩＬ−６はこのような細胞上で２種の膜タンパク質を介してその活性を伝達する。その１つは、ＩＬ−６が結合する分子量８０ｋＤのリガンド結合性膜タンパク質（ＩＬ−６受容体）であり、他の１つは非リガンド結合性のシグナル伝達にかかわる膜タンパク質ｇｐ１３０である（Ｔａｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９６：９６７， １９８７）。
【０００３】
１９８８年Ｋａｗａｎｏらは新鮮ヒト骨髄腫細胞が構成的にＩＬ−６を産生し、かつＩＬ−６受容体を発現していること、ならびに抗ＩＬ−６受容体（Ｒ）抗体によりインビトロで増殖が抑制されることから、骨髄腫細胞は成長因子を自ら産生し、自身で受容するというオートクライン機構により増殖する可能性があることを報告し（Ｋａｗａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：８３， １９８８）、一方Ｋｌｅｉｎらは、自ら成長因子を産生しないが、周囲からの成長因子を受容するというパラクライン機構により増殖することを提唱した（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７３：５１７， １９８９）。また、血清中のＩＬ−６濃度は骨髄腫の病勢と相関していることが知られており（Ｂａｔａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８４：２００８， １９８９）、ＩＬ−６が骨髄腫の主要な増殖因子の１つであると考えられている。
【０００４】
また、新鮮分離した骨髄腫細胞の場合、骨髄腫細胞以外の細胞の混入が避けられず、正確なアッセイが困難であることから、現在にいたるまで、骨髄腫細胞がオートクライン機構またはパラクライン機構のいずれによって増殖するのかは定かではない。
【０００５】
ＩＬ−６依存性増殖をするヒト骨髄腫細胞株中にトランスフェクションによってヒトＩＬ−６ ｃＤＮＡを導入すると、自律的に増殖して腫瘍化することが観察され、これはパラクラインＩＬ−６増殖機構を示唆するものである（Ｏｋｕｎｏ ｅｔａｌ．， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２０：３９５， １９９２）。また、ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６はＩＬ−６オートクライン機構によって増殖することが報告されている（Ｊｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ５：２５５， １９９１； Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８８：６９６， １９９１）。しかしながら、Ｕ２６６の増殖は外因性ＩＬ−６によっても（Ｊｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ５：２５５， １９９１）、また抗ＩＬ−６モノクローナル抗体によっても（Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８８：６９６， １９９１）影響を受けなかった、という報告もあり、Ｕ２６６の増殖機構に対するＩＬ−６の関与は不明である。
【０００６】
本発明者らは、多発性骨髄腫患者の腹水から得た１例の新鮮骨髄腫細胞において、腫瘍細胞は明らかなＩＬ−６依存性増殖を示し、かつ、自律的増殖とともに抗ＩＬ−６受容体抗体で強く抑制されることを報告した（Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ７：６５５， １９９３）。
【０００７】
本発明者らはさらに、新鮮ヒト骨髄腫細胞をヒトＩＬ−６遺伝子導入重症複合免疫不全マウス（ＩＬ−６トランスジェニックＳＣＩＤマウス）に移植した腫瘍細胞の性質について検討した（Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， 第５２回日本癌学会総会講演要旨集、４９８頁、１９９３年１０月）。その結果、皮下に移植した３匹にはその移植部位に形質細胞腫を認め、腋窩リンパ節転移も認めた。腹腔内移植では腫瘤形成は認めなかった。移植後の腫瘍細胞は表面抗原やインビトロでのＩＬ−６依存性増殖および抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による増殖抑制効果などに移植前と比べて変化を認めなかった。
【０００８】
【発明が解決すべき課題】
上記したように、骨髄腫細胞の増殖機構には未だ不明な点が多く、これを解明することが求められている。
【０００９】
本発明の目的は骨髄腫のＩＬ−６依存性増殖機構のモデルとなりえる骨髄腫細胞株を樹立することにある。該細胞株は抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体などのＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治療剤による骨髄腫の治療のインビトロモデルとして有用である。
【００１０】
本発明は該細胞株を移植した実験動物を提供することも目的とする。上記実験動物は抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体などのＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治療剤による骨髄腫の治療のインビボモデルとして有用である。
【００１１】
本発明は骨髄腫治療剤のスクリーニング法を提供することも目的とする。上記インビトロモデルにおいては、細胞増殖抑制あるいはＭタンパク（ミエローマタンパク）分泌抑制を指標とする骨髄腫治療剤のスクリーニング法を使用することができる。また、上記インビボモデルにおいては、細胞増殖抑制、Ｍタンパク分泌抑制あるいは骨病変の抑制を指標とする骨髄腫治療剤のスクリーニング法を使用することができる。なお、Ｍタンパクとは、骨髄腫が特異的に産生する免疫グロブリンタンパク質であり、それを産生する骨髄腫によりＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＢｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓタンパクの５種類がある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ＩＬ−６依存性増殖機構を有する骨髄腫のモデルとなりうる細胞株を樹立することに成功し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明はオートクライン機構によりＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を提供する。
【００１４】
また、本発明は該細胞株を移植した実験動物を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は骨髄腫治療剤を上記細胞株に添加して骨髄腫細胞増殖抑制あるいはＭタンパク分泌抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビトロスクリーニング法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は骨髄腫治療剤を上記実験動物に投与して骨髄腫細胞増殖抑制、Ｍタンパク分泌抑制あるいは骨病変の抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法を提供する。
【００１７】
本発明の細胞株は、例えば多発性骨髄腫患者の腹水などから採取した骨髄腫細胞を用いて樹立することができる。本発明では特に、ＩｇＧ、λ型多発性骨髄腫患者の腹水から骨髄腫細胞を採取した。培養開始後１カ月で細胞は安定して増殖し始め、１年以上維持された。このようにして樹立された細胞株はＫＰＭＭ２と命名され、生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに受託番号ＦＩＲＭ：Ｐ−１４１７０で寄託されている（１９９４年２月２２日寄託）。細胞株ＫＰＭＭ２はインビトロでの継代、ならびに実験動物、例えば重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス、ＩＬ−６トランスジェニックＳＣＩＤマウスおよびヌードマウスなどの免疫不全状態にあるマウス中での安定した継代が可能である。
【００１８】
細胞株ＫＰＭＭ２はインビトロでＩＬ−６を産生し、またＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）を発現していることが確認された。また、ＫＰＭＭ２の各種サイトカインに対する反応性を３Ｈ−チミジンの取り込み実験、ＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５−６３， １９８３ 参照）および生細胞の測定で試験した結果、ＩＬ−６とともにインキュベートしたときのみ顕著に刺激され、これはＫＰＭＭ２がＩＬ−６に特異的に反応して増殖することを示している。さらに、ＫＰＭＭ２の増殖は、抗ＩＬ−６ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）および抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂによって用量依存的に顕著に抑制された。また、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメレースチェインリアクション）により、ＫＰＭＭ２がＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒ ｍＲＮＡを発現していることが確認された。なお、ＫＰＭＭ２は各種の接着分子、すなわちＣＤ４４、ＶＬＡ−β、ＩＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ、ＬＦＡ−３およびＶＬＡ−４を発現しており、またインビトロで自律的細胞凝集を示す。
【００１９】
このようなＫＰＭＭ２の各種特徴から、ＫＰＭＭ２がＩＬ−６オートクライン機構により増殖する骨髄腫細胞株であることが示された。本発明の細胞株はその増殖機構がＩＬ−６依存性のオートクライン機構であることが証明された最初の細胞株である。
【００２０】
したがって、本発明の細胞株は抗ＩＬ−６ ｍＡｂあるいは抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂなどのＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治療剤のスクリーニングに有用である。例えば、抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−６受容体抗体を本発明の細胞株に添加して骨髄腫細胞増殖抑制効果を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビトロスクリーニング法が可能である。また、本発明の骨髄腫細胞株は、細胞数の増加に比例してＭタンパクの分泌量が増大することにより、Ｍタンパク分泌抑制を指標として骨髄腫治療剤のインビトロスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の細胞株は、細胞間相互作用やＩＬ−６シグナル伝達を介する骨髄腫細胞の増殖において接着分子の果たす役割を研究するモデルとしても有用である。
【００２１】
本発明は、本発明の細胞株を移植した実験動物も提供する。本発明の細胞株を移植する実験動物としては、マウスの他、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、サルなどが挙げられ、さらには、Ｔ細胞あるいはＢ細胞といった免疫担当細胞の機能に障害が生じ、免疫不全状態にある実験動物に本発明の細胞株を移植するのがよい。既に述べたように、本発明の細胞株はＳＣＩＤマウス、ＩＬ−６トランスジェニックＳＣＩＤマウスおよびヌードマウスなどの免疫不全状態にあるマウス中で安定した継代が可能である。
【００２２】
興味深いことに、本発明の上記細胞株をマウスに移植するには、皮下移植、腹腔内移植の外に、静脈内移植によっても行うことができる。皮下移植および腹腔内移植した場合には、それぞれ移植部位皮下および腹腔内に固形腫瘍が観察されるが、静脈内移植した場合には、骨髄への腫瘍細胞の生着が見られ、これを実際の骨髄腫の病態に近いモデルとして使用することができる。例えば、抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−６受容体抗体といったＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治療剤を本発明の実験動物に投与して骨髄腫細胞増殖抑制効果を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法が可能である。また、本発明の細胞株が生着した実験動物では、腫瘍の増殖に伴って血清中のＭタンパク濃度の上昇が観察されるため、Ｍタンパク濃度の抑制を指標とした骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法も可能である。さらに、本発明の細胞株が実験動物の骨髄へ生着すると骨髄腫細胞の増殖に伴い、血中イオン化カルシウム濃度の上昇、骨破壊、骨融解および骨吸収といった骨病変が観察されることから、これら骨病変の抑制を指標とした骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法が可能である。
【００２３】
以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
実施例１：骨髄腫細胞株の樹立および維持
ＩｇＧ、λ型多発性骨髄腫患者（７６才、女性、ステージＩＩＡ）の腹水から骨髄腫細胞を採取した。腹水は多数の骨髄腫細胞を含んでおり、腹水中のＩＬ−６レベルは９１．０ｐｇ／ｍｌに達していた。採取した腹水をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）を用いた密度勾配遠心法にかけて単核球を分離、プラスチックシャーレにて付着細胞を除去し、さらにヒツジ赤血球にてＴ細胞を除去し、腫瘍細胞を９５％以上に純化した。細胞を２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ：Ｘａｖｉｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｍｅｎｔｓ製、オーストラリア）、組換えヒトＩＬ−６（中外製薬製）４ｎｇ／ｍｌおよびカナマイシン（明治製菓社製）１００μｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０（ギブコ社製）培養液中に１×１０６細胞／ｍｌの濃度で浮遊させた。次いで２５ｍｌフラスコ中で１０ｍｌの培養液中で培養し、湿潤５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。安定した細胞増殖が観察されるまで３日ごとに培地を部分的に新しいものに取り替えた。
【００２５】
培養開始１カ月後で細胞は安定して増殖し始め１年以上維持され、細胞株として樹立された。この細胞株をＫＰＭＭ２と命名した。ＩＬ−６の存在下または非存在下における倍加時間はそれぞれ４８時間および７２時間であった。
【００２６】
ＫＰＭＭ２の形態およびＩｇ分泌は以下の通りである。
ＫＰＭＭ２の形態およびＩｇ分泌
ＫＰＭＭ２細胞は光学顕微鏡下で自律的な細胞凝集を示して増殖することが観察され（図１）、ライト−ギムザ染色では形質細胞様の形態を示した（図２）。ＫＰＭＭ２は酸ホスファターゼが陽性であり、α−ナフチルブチレートエステラーゼがやや陽性であるが、ペルオキシダーゼ、ＡＳ−Ｄクロロアセテートエステラーゼ、パス（過ヨウ素酸シッフ試薬）およびアルカリホスファターゼは陰性であった。細胞質ＩｇＧおよびλＬ鎖が検出されたが、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびκＬ鎖は直接免疫蛍光法で陰性であった。また、細胞（１０６個／ｍｌ）を３日間培養すると、培養上清にはＩｇＧおよびλＬ鎖の分泌が見られた。
【００２７】
実施例２：表面抗原の解析
上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の表面抗原の発現を各種ヒト抗原に対するモノクローナル抗体のパネルを用いて、直接および間接蛍光抗体法（Ｆｒｉｅｄ ｅｔ ａｌ．， Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：５９−７８， １９８９）により検討した。
【００２８】
実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２を、１０６個／チューブとなるように、１００μｌの蛍光活性化細胞選択装置（ＦＡＣＳ）用緩衝液（２％ ＦＣＳおよび０．１％ ＮａＮ３を含むリン酸緩衝化生理食塩溶液（ＰＢＳ）、以下ＦＡＣＳ緩衝液という）に浮遊させた。次いで、直接蛍光抗体法においては、飽和量の下記表１に記載の各種ヒト抗原に対するフルオレシンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）あるいはフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗体を添加し、４℃にて３０分間インキュベートした。細胞を上記ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＰＲＯＦＩＬＥ，コールター社製）で分析した。
【００２９】
一方、間接蛍光抗体法においては、非標識の下記表１に記載の各種ヒト抗原に対する抗体を添加し、４℃にて３０分間インキュベートして、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣあるいはＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体Ｆ（ａｂ’）２断片（ＴＡＧＯ社製）を加え、４℃にて３０分間反応させた。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＰＲＯＦＩＬＥ，コールター社製）で分析した。
【００３０】
ＫＰＭＭ２の表面抗原を以下の表１にまとめて示す。
【００３１】
【表１】
表から明らかなように、ＫＰＭＭ２は形質細胞関連抗原（ＣＤ３８、ＰＣＡ−１およびＢＬ３）、接着分子（ＣＤ４４、ＶＬＡ−β、ＩＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ、ＬＦＡ−３およびＶＬＡ−４）ならびにＣＤ４５、ＣＤ６３、ＣＤ７１、ＩｇＧおよびλなどの抗原が陽性であった。
【００３２】
実施例３：免疫グロブリン遺伝子再構成
上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子再構成をサザンブロット法により分析した。
【００３３】
実施例１に記載の方法により得られたＫＰＭＭ２細胞（１０７個）から、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８６の方法に準じてＤＮＡを調製し、３種類の制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩあるいはＨｉｎｄＩＩＩ（ベーリンガー・マンハイム社製）で別々に処理し、エタノール沈殿としてＤＮＡを回収して、０．８％アガロースゲル（ＳＥＡＫＥＭ ＧＴＧ，ＦＭＣ社製）により２４時間電気泳動を行った。電気泳動したＤＮＡをナイロン膜（ハイボンドＮ＋，アマシャム社製）に移し、これを乾燥させた。次に、タカラランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造社製）を用いて、３２Ｐ標識したヒトＩｇ ＪＨ、ＣκおよびＣλプローブ（オンコア社製）を用い、添付の処方に従ってサザンブロット分析を行った。なお、対照として健常人の末梢血単核球から得た再構成を生じていない染色体ＤＮＡを用いた。その結果、ＩｇＨおよびκ鎖遺伝子が再構成していたが、λ鎖遺伝子は再構成していなかった（図３）。以上のことより、ＫＰＭＭ２がモノクローナルな抗体を産生すること、および細胞の単一性が確認された。
【００３４】
実施例４：細胞遺伝学的分析
上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の染色体の構造異常を分析した。
【００３５】
実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液にて５×１０５個／ｍｌとなるように培養した。培養４８時間後に、ＫＰＭＭ２に０．０５μｇのコルセミド（ギブコ社製）を１５分間処理し、分裂中期で細胞周期が停止したＫＰＭＭ２細胞を回収した。回収したＫＰＭＭ２細胞を０．０７５ＭのＫＣｌで２０分間処理し、メタノール−酢酸で固定した。次いで、ＫＰＭＭ２細胞の染色体をトリプシン−ギムザバンド染色法によって分析した。
【００３６】
その結果、ＫＰＭＭ２は多くの構造異常をもつ二倍体細胞であることが判明した（図４）。分析した１５細胞すべてが４６、ＸＸ、ｄｅｒ（１；１９）（ｑ１０；ｑ１０）、ｔ（３；１４）（ｑ２１；ｑ３２）、−４、ｔ（６；１１）（ｐ１２；ｐ１５）、ｄｅｒ（１０）ａｄｄ（１０）（ｐ１３）ｄｉｃ（９；１０）（ｑ１０；ｑ２６）、＋１６を示した。
【００３７】
実施例５：ＥＢＶおよびマイコプラズマの検出
実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２のエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）およびマイコプラズマ汚染を試験した。
【００３８】
実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２細胞の染色体からエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）を検出するために、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社から購入したＥＢＶ ＢａｍＷ領域増幅プライマーを用いて、添付の処方に従いＰＣＲ（ポリメレース チェイン リアクション）を行った。マイコプラズマ感染の検出はマイコプラズマＤＮＡ検出用Ｍ．Ｔ．Ｃ．キット（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．社製）により、添付の処方に従って実施した。
【００３９】
その結果、ＫＰＭＭ２はＥＢＶゲノムおよびマイコプラズマゲノムに対して陰性であった。
【００４０】
実施例６：サイトカインに対する反応性
実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の各種サイトカインへの反応性を試験した。
【００４１】
実施例１に記載する方法で得られたＫＰＭＭ２を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に浮遊させ、容量が２００μｌで９６穴プレート（ファルコン社製）へ１×１０４個／穴となるように分注した。
【００４２】
９６穴プレートの各穴には、下記の濃度となるように各種サイトカインを別々に加えた。
【００４３】
組換えＩＬ−２、同ＩＬ−３、同腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、同顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、同幹細胞成長因子（ＳＣＦ）（以上、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、同ＩＬ−４、同ＩＬ−７、同ＩＬ−１０、同ＩＬ−１１、同白血病阻害因子（ＬＩＦ）、同オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（以上、Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃ Ｉｎｃ．社製）、同ＩＬ−９、同トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−β（以上、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．社製）、同ＩＬ−１α（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社製）、同ＩＬ−５（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．社製）、同ＩＬ−８（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、同エリスロポエチン（ＥＰＯ）および同顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（以上、中外製薬株式会社より提供）は１００ｎｇ／ｍｌ。
【００４４】
組換えインターフェロン（ＩＦＮ）−γ（塩野義製薬株式会社より提供）および天然型ヒトＩＦＮ−α（住友製薬株式会社より提供）は１０００Ｕ／ｍｌ。
【００４５】
組換えＩＬ−６（中外製薬株式会社より提供）は１ｎｇ／ｍｌ。
【００４６】
なお、対照群は、サイトカインを加えない２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培養液で培養した。
【００４７】
９６穴プレートの各穴に分注したＫＰＭＭ２を、上記サイトカイン存在下あるいは非存在下で湿潤５％ＣＯ２中、３７℃で９６時間培養した。その培養終了４時間前に、各穴に３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を１μＣｉ／穴となるように添加した。ＫＰＭＭ２が取り込んだ３Ｈ−チミジンの量の測定は、液体シンチレーションカウンター（１２０５ ベータプレート、ファルマシア社製）を用いた。
【００４８】
ＫＰＭＭ２の増殖に対する各種サイトカインの効果を図５に示す。図５から明らかなように、ＫＰＭＭ２細胞はＩＬ−６とともにインキュベートしたときのみに３Ｈ−チミジンの取り込みが顕著に刺激された。濃度１ｎｇ／ｍｌにおけるＩＬ−６により、３Ｈ−チミジンの取り込みが２．２倍に上昇した。一方、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γはＫＰＭＭ２細胞の増殖を顕著に阻害した。
【００４９】
また、ＫＰＭＭ２のサイトカインに対する反応性を調べるために、ＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５， １９８３ を参照）および生細胞を直接測定する方法を用いたが、同様の結果が得られた。
【００５０】
実施例７：抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂによる増殖阻害
実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２に対するマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）（ＩｇＧ１クラス：ＰＭ１）およびマウス抗ＩＬ−６ｍＡｂ（ＩｇＧ１クラス：ＳＫ２）の効果を調べた。ＳＫ２は文献（Ｙ． Ｏｈｅ ｅｔａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６７：９３９， １９９３）に記載されており、またＰＭ１は文献（Ｈｉｒａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２９００， １９８９）に記載されている。
【００５１】
実施例１に記載する方法で得たＫＰＭＭ２を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に浮遊させ、容量が２００μｌで９６穴プレート（ファルコン社製）へ１×１０４個／穴となるように分注した。
【００５２】
９６穴プレートの各穴には、各種濃度のＩＬ−６ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）（ＳＫ２）および抗ＩＬ−６Ｒ（受容体）ｍＡｂ（ＰＭ１）を別々に加えた。なお、対照群は、抗体を加えない２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液とした。
【００５３】
９６穴プレートの各穴に分注したＫＰＭＭ２を、抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ存在下あるいは非存在下で湿潤５％ＣＯ２中、３７℃で９６時間培養した。その培養終了４時間前に、各穴に３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を１μＣｉ／穴となるように添加した。ＫＰＭＭ２が取り込んだ３Ｈ−チミジンの量の測定は、液体シンチレーションカウンター（１２０５ ベータプレート、ファルマシア社製）を用いた。
【００５４】
ＫＰＭＭ２の増殖に対する抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂの効果を図６に示す。ＳＫ２およびＰＭ１の添加はいずれも用量依存的に細胞増殖を有意に阻害した。特に、ＰＭ１は１μｇ／ｍｌの濃度でＫＰＭＭ２の増殖を完全に阻害した。
【００５５】
また、ＫＰＭＭ２増殖の抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂに対する効果を調べるために、ＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５， １９８３ を参照）および生細胞を直接測定する方法を用いたが、同様の結果が得られた。
【００５６】
実施例８：ＥＬＩＳＡによるＩＬ−６産生の測定
上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２によるＩＬ−６産生能を試験した。
【００５７】
実施例１に記載する方法で得たＫＰＭＭ２を、２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に１０６個／ｍｌとなるように浮遊させ、ヒトＩＬ−６非存在下で湿潤５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。
【００５８】
培養７２時間後、培養上清中に含まれるＫＰＭＭ２が産生したＩＬ−６の濃度を、ヒトＩＬ−６用ＥＬＩＳＡキット（帝人バイオラボラトリー社製）を用いて添付の処方に従い測定した。なお、陰性対照として、２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培養液を用いた。培養上清には７９．７±１９．６（平均値±Ｓ．Ｄ．）ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６の産生が検出され、対照培養液において検出限界（４．０ｐｇ／ｍｌ）以下であったのに比較すると、培養上清中のＩＬ−６濃度が顕著に増加していることが確認された。
【００５９】
実施例９：フローサイトメトリーによるＩＬ−６Ｒの発現の確認
ＫＰＭＭ２細胞上でのＩＬ−６Ｒ発現を確認するために、ＩＬ−６Ｒに結合し、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒへの結合を阻害しないマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ ｍＡｂであるＭＴ１８抗体（Ｈｉｒａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２９００， １９８９）を用いて、間接蛍光抗体法を実施した。
【００６０】
実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２細胞を１０６個／チューブとなるように、１００μｌの実施例２記載のＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、１０μｇ／ｍｌのＭＴ１８抗体を加え、４℃にて３時間反応させた後、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、さらに、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）を５μｇ／ｍｌ添加し、４℃にて３０分間反応させた。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、同ＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＰＲＯＦＩＬＥ、コールター社製）で蛍光を測定した。
【００６１】
その結果、図７に示すように、ＫＰＭＭ２細胞上にＩＬ−６Ｒの発現が示された。
【００６２】
実施例１０：ＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧ（Ｍタンパク）産生の測定
ＫＰＭＭ２のヒトＩｇＧ（Ｍタンパク）産生能を試験した。
【００６３】
実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２を１０６個／ｍｌとなるように、２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に浮遊させ、容量２ｍｌで１２穴プレート（ファルコン社製）の各穴に分注し、ヒトＩＬ−６非存在下で湿潤５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間培養した。なお、実験は３回行った。その後、培養上清中のヒトＩｇＧ濃度を、ＴＡＧＯ社製ヤギ抗ＩｇＧ抗体（ＮＯ．４１００）およびアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ＩｇＧガンマ鎖特異的抗体（ＮＯ．２４９０）を用いるＥＬＩＳＡにて測定した。なお、スタンダードとしてカッペル社製ヒトＩｇＧ（ＮＯ．０００１−８６０）を用いた。その結果、培養上清中には１０．１μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧが検出され、対照培養液では検出限界以下（５ｎｇ／ｍｌ）であったのに比較して、培養上清中のヒトＩｇＧ濃度が顕著に増加していることが確認された。
【００６４】
実施例１１：ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメレースチェインリアクション）によるＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒ ｍＲＮＡの検出
実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２におけるヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−６Ｒの発現を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメレースチェインリアクション）法によりヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−６ＲのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を検出した。
【００６５】
グアニジウムセシウムクロライド法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）によってＫＰＭＭ２細胞（１０８個）から全ＲＮＡを調製した。陰性対照としてヒトＢ細胞リンパ腫細胞株ＳＫＷ６．４からも同様に全ＲＮＡを調製した。１本鎖ｃＤＮＡ合成はｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の処方に従い全ＲＮＡ５μｇから直接実施した。
【００６６】
陽性対照としてヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−６Ｒ検出用ＰＣＲプライマーを用いた（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．社製）。ＰＣＲ溶液各１００μｌは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ 塩化カリウム、Ａｍｐｌｉｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社製）２．５ユニット、１本鎖ｃＤＮＡ合成反応物１μｌ、各プライマー１００ｐｍｏｌを含む。各ＰＣＲ用チューブに鉱物オイル５０μｌを上層してＰＣＲに付した。最初に９４℃で１分メルトし、６０℃で１分と７２℃で１０分のサイクルを３０サイクル繰り返した。最終サイクルの後、最終的に７２℃で１０分伸長を行った。ヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−６Ｒ検出用プライマーを用いた陽性対照群も同様に増幅し、約５０ｐｇの陽性対照ＰＣＲ産物を得た。
【００６７】
各反応チューブから１０μｌを取って１．５％アガロースゲル上で電気泳動を行った。図８に示すように、ＩＬ−６（６２８ｂｐ）およびＩＬ−６Ｒ（２５１ｂｐ）のＰＣＲ産物はいずれもＫＰＭＭ２のＲＮＡから増幅された。これらの結果は、ＫＰＭＭ２がＩＬ−６のオートクライン機構によって増殖することを遺伝子発現の面から支持する。一方、ＳＫＷ６．４細胞はＩＬ−６に応答してＩｇＭを分泌する。ＩＬ−６ＲのＰＣＲ産物はＳＫＷ６．４ ｍＲＮＡから増幅された。しかし、ＩＬ−６のＰＣＲ産物はこの実験で検出されず、このことはＳＫＷ６．４細胞がＩＬ−６を産生していないことを示唆する。
【００６８】
実施例１２：細胞株ＫＰＭＭ２のＳＣＩＤマウスおよびヌードマウスへの移植（１）ＫＰＭＭ２の可移植性およびインビボでの継代
上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の可移植性およびインビボでの継代を以下のように検討した。
【００６９】
ＫＰＭＭ２を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に１０８個／ｍｌで懸濁し、０．２ｍｇのウサギ抗アシアロＧＭ１抗体（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．０１４−０９８０１、和光純薬工業社製）で処理したＩＬ−６トランスジェニック重症免疫不全マウス（以下ＩＬ−６−ＳＣＩＤ Ｔｍという）（中外製薬製）の腹部皮下に注射針で０．１ｍｌ移植した。その結果、１カ月後には３例全例で移植部位に結節型の腫瘍を形成した。
【００７０】
この腫瘍を無菌的に摘出し、摘出した腫瘍塊を使い捨て注射器のピストンなどでつぶし、ナイロンメッシュ（７０μｍ、ファルコン社製）を通して細胞を回収した。この細胞を上記と同様にＲＰＭＩ１６４０培養液に懸濁し、ＩＬ−６−ＳＣＩＤ Ｔｍ、重症免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウスという）（日本クレア社製）、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（以下ヌードマウスという）（日本クレア社製）に皮下移植したところ、同じように移植部位に結節型の腫瘍を形成し、インビボでの継代が可能であった。また腫瘍塊を３ｍｍ角のブロックにし、移植針を用いてＩＬ−６−ＳＣＩＤ Ｔｍ、ＳＣＩＤマウス、ヌードマウスの皮下に移植しても継代可能であった。
（２）ＫＰＭＭ２の異なる移植経路での可移植性
ＫＰＭＭ２の移植経路を皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）とした場合の可移植性を以下のように検討した。
【００７１】
（１）においてＳＣＩＤマウスにて継代したＫＰＭＭ２腫瘍を無菌的に摘出し、摘出した腫瘍塊を使い捨て注射器のピストンでつぶし、ナイロンメッシュを通して細胞を回収し、１０８個／ｍｌの細胞懸濁液を作成した。この懸濁液をＳＣＩＤマウス、あるいは０．２ｍｇのウサギ抗アシアロＧＭ１抗体および５００ＲのＸ線で処理したヌードマウスに０．１ｍｌずつ皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）の３経路で移植し、４０日後に生着の判定を行った（表２）。その結果、約４０日後には全例で生着が確認され、ｓ．ｃ．移植では移植部位に、ｉ．ｐ．移植では腹腔内に固形腫瘍を形成した。また、ｉ．ｖ．移植ではＫＰＭＭ２は骨髄での生着が認められた。
【００７２】
【表２】
（３）ＫＰＭＭ２移植動物の血清ヒトＩｇＧ（Ｍタンパク：ミエローマタンパク）の濃度
細胞株ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスへ皮下移植し、形成された腫瘍の体積と血清中ヒトＩｇＧ濃度の相関を調べた。上記（２）に記載の方法で細胞株ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスへ皮下移植し、ＫＰＭＭ２移植前、移植後２１日目、４２日目の３回、血清サンプルを採取してＥＬＩＳＡ法にてヒトＩｇＧ濃度を測定した。
【００７３】
その結果、マウス血清中のヒトＩｇＧ濃度はＫＰＭＭ２を移植した動物ではいずれも経時的に上昇した。また図９に示すように、皮下移植した動物では皮下に形成された腫瘍の体積と血清ヒトＩｇＧ濃度に相関が見られ、腫瘍の大きな動物ほど血清ヒトＩｇＧ濃度は高値を示した。このことから、血清ヒトＩｇＧ濃度を指標としても抗腫瘍効果の判定ができると考えられた。
（４）ＫＰＭＭ２の可移植性および移植細胞数の検討
ＳＣＩＤマウスとヌードマウスで移植細胞数を変えたときのＫＰＭＭ２の可移植性を検討した。
【００７４】
特別な前処理を行わない雄のＳＣＩＤマウスおよびヌードマウスに、上記（２）記載の方法で各々ＫＰＭＭ２細胞を１０７、３×１０６、１０６個腹部皮下（ｓ．ｃ．）に移植し、またＳＣＩＤマウスには上記（２）の方法で得たＫＰＭＭ２細胞を３×１０６、１０６個静脈内（ｉ．ｖ．）でも移植した。
【００７５】
その結果、ＳＣＩＤマウスに皮下移植した場合、３×１０６個以上移植すると、２１日までに全例で腫瘍結節を形成し、１０６個移植した場合でも２１日までに２／３、３２日までに全例で腫瘍結節を形成した。ヌードマウスに皮下移植すると、１０７個移植した場合では２１日までに２／３、３２日までには全例で、また３×１０６個移植した場合では４２日までには全例で腫瘍結節が形成された。しかし、１０６個の移植では４２日までに腫瘍の生着は見られなかった。また、ＳＣＩＤマウスに静脈内移植した場合、４２日までに３×１０６個移植で全例、１０６個移植で１／３にＫＰＭＭ２が生着した。これらの結果を以下の表３にまとめて示す。
【００７６】
【表３】
（５）ＫＰＭＭ２移植ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＣＤ３８抗原の発現の解析
ＫＰＭＭ２を移植したＳＣＩＤマウスにおいて、その生着を確認するために、ＫＰＭＭ２の細胞表面上で特徴的に発現している表面抗原であるヒトＣＤ３８抗原の発現を試験した。
【００７７】
ＫＰＭＭ２を上記（１）に記載する方法でＳＣＩＤマウスへ静脈内移植し、移植後３７日目にマウスを屠殺した。屠殺したマウスの大腿骨より骨髄を回収して懸濁し、ステンレスメッシュ（１００μｍ）を通し、蛍光活性化細胞選択装置（ＦＡＣＳ）用緩衝液（２％ＦＣＳおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（−）溶液）にて骨髄細胞の浮遊液を調製した。なお、陰性対照としてＫＰＭＭ２を移植していないＳＣＩＤマウスの骨髄からも同様の方法にて骨髄細胞浮遊液を調製した。
【００７８】
また、本実施例に記載する方法によりＫＰＭＭ２を皮下移植したＳＣＩＤマウスからは、移植後３７日目に皮下腫瘍塊を外科的に摘出し、摘出した腫瘍塊を２枚のスライドグラスの間にはさんですりつぶし、これをステンレスメッシュ（１００μｍ）を通し、ＦＡＣＳ緩衝液にて骨髄細胞の浮遊液を調製した。
【００７９】
陽性対照として、実施例１に記載した方法でインビトロにて培養したＫＰＭＭ２を用いた。インビトロで４日間培養したＫＰＭＭ２をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、同緩衝液中に浮遊させた。
【００８０】
次に、このように調製した細胞浮遊液を用いて、ＦＡＣＳ解析によるヒトＣＤ３８抗原の発現を調べた。
【００８１】
すなわち、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中にて、各群の浮遊細胞１０６個に対し、２．５μｇ／ｍｌのフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ヒトＣＤ３８抗体（Ｌｅｕ−１７、ベクトン・ディッキンソン社製）を添加し、氷上で３０分間反応させた。次いで、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン社製）によりＦＡＣＳ解析を行った。
【００８２】
陽性対照群であるインビトロ培養ＫＰＭＭ２のＦＡＣＳ解析の結果から、蛍光強度４０から２０００までの範囲にある細胞をヒトＣＤ３８抗原発現細胞とした（図１０（ａ）参照）。ＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウスでは、その骨髄細胞のおよそ７１％がヒトＣＤ３８陽性細胞で占められていた（図１０（ｂ）参照）。このことは、ＳＣＩＤマウスに静脈内移植したＫＰＭＭ２がＳＣＩＤマウスの骨髄に生着したことを示している。また、ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスに皮下移植して生じた腫瘍塊から得られた細胞は全てヒトＣＤ３８が陽性であり（図１０（ｃ）参照）、ＫＰＭＭ２を皮下移植して生ずる腫瘍塊は、全てＫＰＭＭ２から構成されていることが示された。なお、ＫＰＭＭ２を移植していない陰性対照群のＳＣＩＤマウスの骨髄細胞にはヒトＣＤ３８陽性細胞は全く検出されなかった（図１０（ｄ）参照）。
【００８３】
実施例１３：抗ヒトＩＬ−６抗体ＳＫ２および抗ヒトＩＬ−６Ｒ再構成ヒト型化抗体ＰＭ１の抗腫瘍効果
ＫＰＭＭ２移植動物における抗ヒトＩＬ−６抗体ＳＫ２および抗ヒトＩＬ−６Ｒ再構成ヒト型化抗体ＰＭ１のインビボ抗腫瘍効果を以下のようにして検討した。
【００８４】
上記実施例１２（１）に記載の方法でＳＣＩＤマウスで継代して得たＫＰＭＭ２骨髄腫腫瘍塊をウサギ抗アシアロＧＭ１抗体／Ｘ線処理ヌードマウス（５週齢、雄）に４ｍｍ角ブロックで皮下移植し、翌日に１回だけＳＫ２抗体を１ｍｇ／マウスの１用量、再構成ヒト型化ＰＭ１抗体（国際公開出願ＷＯ９２−１９７５９参照）を０．１２５、０．５および１ｍｇ／マウスの３用量で静脈内投与した。各抗体は０．２ｍｌ／マウスとなるようにＰＢＳ（−）（ニッスイ製）で調製し、陰性対照群には、ＰＢＳ（−）を０．２ｍｌ／マウス投与した。その後腫瘍の大きさを経時的に観察し、対照群の腫瘍が十分大きくなった３５日目に全採血を行ってから腫瘍を摘出して重量を測定した。
【００８５】
その結果を図１１に示す。陰性対照群の平均腫瘍重量が約１ｇであったのに対し、再構成ヒト型化ＰＭ１抗体投与群においては、１ｍｇ／マウス投与した場合で腫瘍増殖抑制率（Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒａｔｉｏ：ＧＩＲ）は７８％、０．５ｍｇ／マウス投与した場合でのＧＩＲは５３％、０．１２５ｍｇ／マウス投与した場合でのＧＩＲは６６％を示し、強い腫瘍増殖抑制効果が見られた。またＳＫ２においても、１ｍｇ／マウス投与群でＧＩＲ６１％と腫瘍増殖を抑制した。
【００８６】
さらに、腫瘍摘出時に採取した血清サンプルのヒトＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。その結果を図１２に示す。抗体非投与陰性対照群では血清ヒトＩｇＧ濃度が平均２７．６ｍｇ／ｍｌであったものが、再構成ヒト型化ＰＭ１抗体を１、０．５、０．１２５ｍｇ／マウス投与することでそれぞれ７１％、５５％、７５％抑制された、ＳＫ２ １ｍｇ／マウス投与でも４３％抑制された。腫瘍重量と血清ヒトＩｇＧ濃度は各処理群間でも、個体レベルでもよく相関していた。
【００８７】
実施例１４：ＫＰＭＭ２静脈内移植ＳＣＩＤマウスにおけるイオン化カルシウム濃度の上昇および骨吸収の亢進
ＫＰＭＭ２（１０７個）を上記実施例１２（２）に記載する方法でＳＣＩＤマウス（日本クレア社製）へ静脈内移植し、移植後経時的に血中イオン化カルシウム濃度および骨吸収の有無を試験した。
【００８８】
ＫＰＭＭ２移植後９日目、２０日目、３０日目および３７日目にＫＰＭＭ２静脈内移植ＳＣＩＤマウスをエーテル麻酔し、マウス眼窩より６０μｌ容量のキャピラリーカラム（チバ・コーニング社製）で採血し、直ちに血中イオン化カルシウム濃度を６３４自動Ｃａ＋＋／ｐＨアナライザー（チバ・コーニング社製）にて測定した。なお、対照としてＫＰＭＭ２を移植していないＳＣＩＤマウスからも同様の方法で採血し、血中イオン化カルシウム濃度を測定した。
【００８９】
その結果、ＫＰＭＭ２静脈内移植ＳＣＩＤマウスの血中イオン化カルシウム濃度は、移植後３０日目より上昇がみられ、３７日目には対照群のマウスに比べ、約２０％の血中イオン化カルシウム濃度上昇が観察された（図１３）。なお、血中イオン化カルシウム濃度上昇は、ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスへ静脈内移植したときの、マウス骨髄におけるＫＰＭＭ２（ヒトＣＤ３８抗原陽性細胞）が占める増加の割合の経時的増加とよく相関していた（図１４参照）。
【００９０】
また、ＫＰＭＭ２静脈内移植３７日目のＳＣＩＤマウス下肢の骨をＸ線撮影して形態的に観察したところ、対照群のマウスと比較し、顕著な骨吸収像が確認された（図１５参照）。以上の結果は、ＫＰＭＭ２静脈内移植ＳＣＩＤマウスの骨病変が、実際の骨髄腫の病変とよく一致していることを示している。
【００９１】
【発明の効果】
本発明によってＩＬ−６オートクライン依存性で増殖する骨髄腫が存在することが明らかとなった。本発明のオートクライン機構によりＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株は、骨髄腫のＩＬ−６依存性増殖機構モデルとして有用である。また抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体などのＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治療剤の治療モデルとしても使用し得るものである。本発明のオートクライン機構によりＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株はインビトロおよびインビボで細胞増殖抑制を指標とした骨髄腫治療剤の評価系を作成するのに有用であるのはもちろん、Ｍタンパクを産生し、この産生量が骨髄腫の増殖に極めてよく相関することから、Ｍタンパク産生量の抑制を指標とした骨髄腫治療剤の評価系を作成するのに有用である。
【００９２】
さらに、本発明のヒト骨髄腫細胞株を実験動物に静脈内移植して得られる骨髄腫の骨髄生着モデルでは、多発性骨髄腫の増殖に伴い骨髄腫に特徴的な骨病変が観察され、したがってこの骨病変の抑制を指標とした骨髄腫治療剤の評価系を作成することができる。
【００９３】
これらの点から本発明のヒト骨髄腫細胞株の利用価値は極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】液体培養におけるＫＰＭＭ２の自律的凝集を示す図（生物の形態を表す写真）である。
【図２】ＫＰＭＭ２の形態を示す図（生物の形態を表す写真）である。ライト−ギムザ染色では形質細胞の特徴を有する。
【図３】サザンブロット分析によるＫＰＭＭ２のＪＨおよびＣλ遺伝子の再構成を示す図（電気泳動の写真）である。ＫＰＭＭ２から得たＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＪＨおよびＣλ遺伝子プローブを用いてサザンブロット分析を行った。再構成したバンドを（▲）で示す。
【図４】ＫＰＭＭ２の核型を示す図（生物の形質を表す写真）である。検索した１５細胞はすべて４６、ＸＸ、ｄｅｒ（１；１９）（ｑ１０；ｑ１０）、ｔ（３；１４）（ｑ２１；ｑ３２）、−４、ｔ（６；１１）（ｐ１２；ｐ１５）、ｄｅｒ（１０）ａｄｄ（１０）（ｐ１３）ｄｉｃ（９；１０）（ｑ１０；ｑ２６）、＋１６を示した。
【図５】ＫＰＭＭ２の細胞増殖に対する各種サイトカインの効果を示す図である。使用したサイトカインの濃度は以下の通りである：ＩＬ−６、１ｎｇ／ｍｌ；ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γ、１０００Ｕ／ｍｌ；その他のサイトカイン、１００ｎｇ／ｍｌ。各数値は３回の試験の平均＋標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図６】ＫＰＭＭ２の細胞増殖に対する抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂの効果を示す図である。ＳＫ２はマウス抗ＩＬ−６ ｍＡｂ（▲）；ＰＭ１はマウス抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ（●）。破線は対照を示す。各数値は３回の試験の平均を表す。
【図７】ＫＰＭＭ２細胞におけるＩＬ−６Ｒの発現を示す図である。細胞は抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ（ＭＴ１８）で染色した。マウスＩｇＧ２ｂ抗体を対照として用いた。破線はｍＩｇＧ２ｂを、実線はＭＴ１８を表す。
【図８】１．５％アガロースゲル上でのＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）分析により、ＫＰＭＭ２のＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒ ｍＲＮＡの発現を示す図（電気泳動の写真）である。レーン１および４、ＳＫＷ６．４；レーン２および５、ＫＰＭＭ２；レーン３および６、陽性対照。
【図９】ＫＰＭＭ２を皮下移植したマウスにおける腫瘍体積と血清ヒトＩｇＧ濃度の相関を示す図である。
【図１０】（ａ）はインビトロ培養したＫＰＭＭ２におけるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示す図である。ＫＰＭＭ２は４０から２０００までの範囲の蛍光強度を有する。
（ｂ）はＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウスの骨髄細胞におけるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示す図である。７１％の細胞が４０から２０００の範囲の蛍光強度を有する。
（ｃ）はＫＰＭＭ２を皮下移植したＳＣＩＤマウスの腫瘍塊から得た細胞におけるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示す図である。全ての細胞が４０から２０００の範囲の蛍光強度を有する。
（ｄ）はＫＰＭＭ２を移植していないＳＣＩＤマウスの骨髄細胞におけるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示す図である。４０から２０００の範囲の蛍光強度を有する細胞は全くみられない。
【図１１】ＫＰＭＭ２に対する抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂのインビボにおける腫瘍増殖抑制効果を示す図である。ＳＫ２は抗ヒトＩＬ−６ ｍＡｂ；再構成ヒト型化ＰＭ１は抗ヒトＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ。
【図１２】ＫＰＭＭ２移植ヌードマウス中の血清ヒトＩｇＧ濃度に対する抗ＩＬ−６ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂの効果を示す図である。
【図１３】ＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウスの血中イオン化カルシウム濃度（□）の経時的変化を示す図である。（◇）は対照を示す。各数値はＳＣＩＤマウス４匹（３７日目のみ５匹）の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図１４】ＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウスの骨髄中のヒトＣＤ３８抗原陽性細胞の割合（□）の経時的変化を示す図である。（◇）は対照を示す。各数値はＳＣＩＤマウス４匹（３７日目のみ５匹）の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図１５】ＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウスの骨のＸ線撮影像を示す図（生物の形態を示す写真）である。
（ａ）はＫＰＭＭ２を移植していない対照群のＳＣＩＤマウス
（ｂ）はＫＰＭＭ２移植後３７日目のＳＣＩＤマウス
【産業上の利用分野】
本発明はヒト骨髄腫細胞株に関し、さらに詳しくはオートクライン機構によってＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株、該細胞株を移植した実験動物、ならびに該細胞株または該実験動物を用いる骨髄腫治療剤のスクリーニング法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｂ細胞刺激因子２（ＢＳＦ−２）およびマウスハイブリドーマ／形質細胞腫増殖因子と同一因子であるインターロイキン６（ＩＬ−６）は多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ：以下ＭＭと記載する場合がある）細胞の主要な増殖因子であると考えられている（Ｋａｗａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：８３，１９８８； Ｋｌｅｉｎｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７３：５１７， １９８９）。多発性骨髄腫は、形質細胞が悪性化した腫瘍で、骨髄を増殖の場とし、複数の部位に同時に発生する。ＩＬ−６はこのような細胞上で２種の膜タンパク質を介してその活性を伝達する。その１つは、ＩＬ−６が結合する分子量８０ｋＤのリガンド結合性膜タンパク質（ＩＬ−６受容体）であり、他の１つは非リガンド結合性のシグナル伝達にかかわる膜タンパク質ｇｐ１３０である（Ｔａｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９６：９６７， １９８７）。
【０００３】
１９８８年Ｋａｗａｎｏらは新鮮ヒト骨髄腫細胞が構成的にＩＬ−６を産生し、かつＩＬ−６受容体を発現していること、ならびに抗ＩＬ−６受容体（Ｒ）抗体によりインビトロで増殖が抑制されることから、骨髄腫細胞は成長因子を自ら産生し、自身で受容するというオートクライン機構により増殖する可能性があることを報告し（Ｋａｗａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：８３， １９８８）、一方Ｋｌｅｉｎらは、自ら成長因子を産生しないが、周囲からの成長因子を受容するというパラクライン機構により増殖することを提唱した（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７３：５１７， １９８９）。また、血清中のＩＬ−６濃度は骨髄腫の病勢と相関していることが知られており（Ｂａｔａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８４：２００８， １９８９）、ＩＬ−６が骨髄腫の主要な増殖因子の１つであると考えられている。
【０００４】
また、新鮮分離した骨髄腫細胞の場合、骨髄腫細胞以外の細胞の混入が避けられず、正確なアッセイが困難であることから、現在にいたるまで、骨髄腫細胞がオートクライン機構またはパラクライン機構のいずれによって増殖するのかは定かではない。
【０００５】
ＩＬ−６依存性増殖をするヒト骨髄腫細胞株中にトランスフェクションによってヒトＩＬ−６ ｃＤＮＡを導入すると、自律的に増殖して腫瘍化することが観察され、これはパラクラインＩＬ−６増殖機構を示唆するものである（Ｏｋｕｎｏ ｅｔａｌ．， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２０：３９５， １９９２）。また、ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６はＩＬ−６オートクライン機構によって増殖することが報告されている（Ｊｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ５：２５５， １９９１； Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８８：６９６， １９９１）。しかしながら、Ｕ２６６の増殖は外因性ＩＬ−６によっても（Ｊｅｒｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｕｋｅｍｉａ ５：２５５， １９９１）、また抗ＩＬ−６モノクローナル抗体によっても（Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８８：６９６， １９９１）影響を受けなかった、という報告もあり、Ｕ２６６の増殖機構に対するＩＬ−６の関与は不明である。
【０００６】
本発明者らは、多発性骨髄腫患者の腹水から得た１例の新鮮骨髄腫細胞において、腫瘍細胞は明らかなＩＬ−６依存性増殖を示し、かつ、自律的増殖とともに抗ＩＬ−６受容体抗体で強く抑制されることを報告した（Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ７：６５５， １９９３）。
【０００７】
本発明者らはさらに、新鮮ヒト骨髄腫細胞をヒトＩＬ−６遺伝子導入重症複合免疫不全マウス（ＩＬ−６トランスジェニックＳＣＩＤマウス）に移植した腫瘍細胞の性質について検討した（Ｇｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， 第５２回日本癌学会総会講演要旨集、４９８頁、１９９３年１０月）。その結果、皮下に移植した３匹にはその移植部位に形質細胞腫を認め、腋窩リンパ節転移も認めた。腹腔内移植では腫瘤形成は認めなかった。移植後の腫瘍細胞は表面抗原やインビトロでのＩＬ−６依存性増殖および抗ヒトＩＬ−６受容体抗体による増殖抑制効果などに移植前と比べて変化を認めなかった。
【０００８】
【発明が解決すべき課題】
上記したように、骨髄腫細胞の増殖機構には未だ不明な点が多く、これを解明することが求められている。
【０００９】
本発明の目的は骨髄腫のＩＬ−６依存性増殖機構のモデルとなりえる骨髄腫細胞株を樹立することにある。該細胞株は抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体などのＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治療剤による骨髄腫の治療のインビトロモデルとして有用である。
【００１０】
本発明は該細胞株を移植した実験動物を提供することも目的とする。上記実験動物は抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体などのＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治療剤による骨髄腫の治療のインビボモデルとして有用である。
【００１１】
本発明は骨髄腫治療剤のスクリーニング法を提供することも目的とする。上記インビトロモデルにおいては、細胞増殖抑制あるいはＭタンパク（ミエローマタンパク）分泌抑制を指標とする骨髄腫治療剤のスクリーニング法を使用することができる。また、上記インビボモデルにおいては、細胞増殖抑制、Ｍタンパク分泌抑制あるいは骨病変の抑制を指標とする骨髄腫治療剤のスクリーニング法を使用することができる。なお、Ｍタンパクとは、骨髄腫が特異的に産生する免疫グロブリンタンパク質であり、それを産生する骨髄腫によりＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＢｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓタンパクの５種類がある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ＩＬ−６依存性増殖機構を有する骨髄腫のモデルとなりうる細胞株を樹立することに成功し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明はオートクライン機構によりＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を提供する。
【００１４】
また、本発明は該細胞株を移植した実験動物を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は骨髄腫治療剤を上記細胞株に添加して骨髄腫細胞増殖抑制あるいはＭタンパク分泌抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビトロスクリーニング法を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は骨髄腫治療剤を上記実験動物に投与して骨髄腫細胞増殖抑制、Ｍタンパク分泌抑制あるいは骨病変の抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法を提供する。
【００１７】
本発明の細胞株は、例えば多発性骨髄腫患者の腹水などから採取した骨髄腫細胞を用いて樹立することができる。本発明では特に、ＩｇＧ、λ型多発性骨髄腫患者の腹水から骨髄腫細胞を採取した。培養開始後１カ月で細胞は安定して増殖し始め、１年以上維持された。このようにして樹立された細胞株はＫＰＭＭ２と命名され、生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに受託番号ＦＩＲＭ：Ｐ−１４１７０で寄託されている（１９９４年２月２２日寄託）。細胞株ＫＰＭＭ２はインビトロでの継代、ならびに実験動物、例えば重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス、ＩＬ−６トランスジェニックＳＣＩＤマウスおよびヌードマウスなどの免疫不全状態にあるマウス中での安定した継代が可能である。
【００１８】
細胞株ＫＰＭＭ２はインビトロでＩＬ−６を産生し、またＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）を発現していることが確認された。また、ＫＰＭＭ２の各種サイトカインに対する反応性を３Ｈ−チミジンの取り込み実験、ＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５−６３， １９８３ 参照）および生細胞の測定で試験した結果、ＩＬ−６とともにインキュベートしたときのみ顕著に刺激され、これはＫＰＭＭ２がＩＬ−６に特異的に反応して増殖することを示している。さらに、ＫＰＭＭ２の増殖は、抗ＩＬ−６ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）および抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂによって用量依存的に顕著に抑制された。また、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメレースチェインリアクション）により、ＫＰＭＭ２がＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒ ｍＲＮＡを発現していることが確認された。なお、ＫＰＭＭ２は各種の接着分子、すなわちＣＤ４４、ＶＬＡ−β、ＩＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ、ＬＦＡ−３およびＶＬＡ−４を発現しており、またインビトロで自律的細胞凝集を示す。
【００１９】
このようなＫＰＭＭ２の各種特徴から、ＫＰＭＭ２がＩＬ−６オートクライン機構により増殖する骨髄腫細胞株であることが示された。本発明の細胞株はその増殖機構がＩＬ−６依存性のオートクライン機構であることが証明された最初の細胞株である。
【００２０】
したがって、本発明の細胞株は抗ＩＬ−６ ｍＡｂあるいは抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂなどのＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治療剤のスクリーニングに有用である。例えば、抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−６受容体抗体を本発明の細胞株に添加して骨髄腫細胞増殖抑制効果を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビトロスクリーニング法が可能である。また、本発明の骨髄腫細胞株は、細胞数の増加に比例してＭタンパクの分泌量が増大することにより、Ｍタンパク分泌抑制を指標として骨髄腫治療剤のインビトロスクリーニングを行うことができる。さらに、本発明の細胞株は、細胞間相互作用やＩＬ−６シグナル伝達を介する骨髄腫細胞の増殖において接着分子の果たす役割を研究するモデルとしても有用である。
【００２１】
本発明は、本発明の細胞株を移植した実験動物も提供する。本発明の細胞株を移植する実験動物としては、マウスの他、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、サルなどが挙げられ、さらには、Ｔ細胞あるいはＢ細胞といった免疫担当細胞の機能に障害が生じ、免疫不全状態にある実験動物に本発明の細胞株を移植するのがよい。既に述べたように、本発明の細胞株はＳＣＩＤマウス、ＩＬ−６トランスジェニックＳＣＩＤマウスおよびヌードマウスなどの免疫不全状態にあるマウス中で安定した継代が可能である。
【００２２】
興味深いことに、本発明の上記細胞株をマウスに移植するには、皮下移植、腹腔内移植の外に、静脈内移植によっても行うことができる。皮下移植および腹腔内移植した場合には、それぞれ移植部位皮下および腹腔内に固形腫瘍が観察されるが、静脈内移植した場合には、骨髄への腫瘍細胞の生着が見られ、これを実際の骨髄腫の病態に近いモデルとして使用することができる。例えば、抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−６受容体抗体といったＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治療剤を本発明の実験動物に投与して骨髄腫細胞増殖抑制効果を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法が可能である。また、本発明の細胞株が生着した実験動物では、腫瘍の増殖に伴って血清中のＭタンパク濃度の上昇が観察されるため、Ｍタンパク濃度の抑制を指標とした骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法も可能である。さらに、本発明の細胞株が実験動物の骨髄へ生着すると骨髄腫細胞の増殖に伴い、血中イオン化カルシウム濃度の上昇、骨破壊、骨融解および骨吸収といった骨病変が観察されることから、これら骨病変の抑制を指標とした骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法が可能である。
【００２３】
以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
実施例１：骨髄腫細胞株の樹立および維持
ＩｇＧ、λ型多発性骨髄腫患者（７６才、女性、ステージＩＩＡ）の腹水から骨髄腫細胞を採取した。腹水は多数の骨髄腫細胞を含んでおり、腹水中のＩＬ−６レベルは９１．０ｐｇ／ｍｌに達していた。採取した腹水をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ファルマシア社製）を用いた密度勾配遠心法にかけて単核球を分離、プラスチックシャーレにて付着細胞を除去し、さらにヒツジ赤血球にてＴ細胞を除去し、腫瘍細胞を９５％以上に純化した。細胞を２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ：Ｘａｖｉｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｍｅｎｔｓ製、オーストラリア）、組換えヒトＩＬ−６（中外製薬製）４ｎｇ／ｍｌおよびカナマイシン（明治製菓社製）１００μｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ１６４０（ギブコ社製）培養液中に１×１０６細胞／ｍｌの濃度で浮遊させた。次いで２５ｍｌフラスコ中で１０ｍｌの培養液中で培養し、湿潤５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。安定した細胞増殖が観察されるまで３日ごとに培地を部分的に新しいものに取り替えた。
【００２５】
培養開始１カ月後で細胞は安定して増殖し始め１年以上維持され、細胞株として樹立された。この細胞株をＫＰＭＭ２と命名した。ＩＬ−６の存在下または非存在下における倍加時間はそれぞれ４８時間および７２時間であった。
【００２６】
ＫＰＭＭ２の形態およびＩｇ分泌は以下の通りである。
ＫＰＭＭ２の形態およびＩｇ分泌
ＫＰＭＭ２細胞は光学顕微鏡下で自律的な細胞凝集を示して増殖することが観察され（図１）、ライト−ギムザ染色では形質細胞様の形態を示した（図２）。ＫＰＭＭ２は酸ホスファターゼが陽性であり、α−ナフチルブチレートエステラーゼがやや陽性であるが、ペルオキシダーゼ、ＡＳ−Ｄクロロアセテートエステラーゼ、パス（過ヨウ素酸シッフ試薬）およびアルカリホスファターゼは陰性であった。細胞質ＩｇＧおよびλＬ鎖が検出されたが、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびκＬ鎖は直接免疫蛍光法で陰性であった。また、細胞（１０６個／ｍｌ）を３日間培養すると、培養上清にはＩｇＧおよびλＬ鎖の分泌が見られた。
【００２７】
実施例２：表面抗原の解析
上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の表面抗原の発現を各種ヒト抗原に対するモノクローナル抗体のパネルを用いて、直接および間接蛍光抗体法（Ｆｒｉｅｄ ｅｔ ａｌ．， Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：５９−７８， １９８９）により検討した。
【００２８】
実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２を、１０６個／チューブとなるように、１００μｌの蛍光活性化細胞選択装置（ＦＡＣＳ）用緩衝液（２％ ＦＣＳおよび０．１％ ＮａＮ３を含むリン酸緩衝化生理食塩溶液（ＰＢＳ）、以下ＦＡＣＳ緩衝液という）に浮遊させた。次いで、直接蛍光抗体法においては、飽和量の下記表１に記載の各種ヒト抗原に対するフルオレシンイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）あるいはフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗体を添加し、４℃にて３０分間インキュベートした。細胞を上記ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＰＲＯＦＩＬＥ，コールター社製）で分析した。
【００２９】
一方、間接蛍光抗体法においては、非標識の下記表１に記載の各種ヒト抗原に対する抗体を添加し、４℃にて３０分間インキュベートして、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣあるいはＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体Ｆ（ａｂ’）２断片（ＴＡＧＯ社製）を加え、４℃にて３０分間反応させた。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、ＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＰＲＯＦＩＬＥ，コールター社製）で分析した。
【００３０】
ＫＰＭＭ２の表面抗原を以下の表１にまとめて示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
実施例３：免疫グロブリン遺伝子再構成
上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子再構成をサザンブロット法により分析した。
【００３３】
実施例１に記載の方法により得られたＫＰＭＭ２細胞（１０７個）から、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８６の方法に準じてＤＮＡを調製し、３種類の制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩあるいはＨｉｎｄＩＩＩ（ベーリンガー・マンハイム社製）で別々に処理し、エタノール沈殿としてＤＮＡを回収して、０．８％アガロースゲル（ＳＥＡＫＥＭ ＧＴＧ，ＦＭＣ社製）により２４時間電気泳動を行った。電気泳動したＤＮＡをナイロン膜（ハイボンドＮ＋，アマシャム社製）に移し、これを乾燥させた。次に、タカラランダムプライマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造社製）を用いて、３２Ｐ標識したヒトＩｇ ＪＨ、ＣκおよびＣλプローブ（オンコア社製）を用い、添付の処方に従ってサザンブロット分析を行った。なお、対照として健常人の末梢血単核球から得た再構成を生じていない染色体ＤＮＡを用いた。その結果、ＩｇＨおよびκ鎖遺伝子が再構成していたが、λ鎖遺伝子は再構成していなかった（図３）。以上のことより、ＫＰＭＭ２がモノクローナルな抗体を産生すること、および細胞の単一性が確認された。
【００３４】
実施例４：細胞遺伝学的分析
上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の染色体の構造異常を分析した。
【００３５】
実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液にて５×１０５個／ｍｌとなるように培養した。培養４８時間後に、ＫＰＭＭ２に０．０５μｇのコルセミド（ギブコ社製）を１５分間処理し、分裂中期で細胞周期が停止したＫＰＭＭ２細胞を回収した。回収したＫＰＭＭ２細胞を０．０７５ＭのＫＣｌで２０分間処理し、メタノール−酢酸で固定した。次いで、ＫＰＭＭ２細胞の染色体をトリプシン−ギムザバンド染色法によって分析した。
【００３６】
その結果、ＫＰＭＭ２は多くの構造異常をもつ二倍体細胞であることが判明した（図４）。分析した１５細胞すべてが４６、ＸＸ、ｄｅｒ（１；１９）（ｑ１０；ｑ１０）、ｔ（３；１４）（ｑ２１；ｑ３２）、−４、ｔ（６；１１）（ｐ１２；ｐ１５）、ｄｅｒ（１０）ａｄｄ（１０）（ｐ１３）ｄｉｃ（９；１０）（ｑ１０；ｑ２６）、＋１６を示した。
【００３７】
実施例５：ＥＢＶおよびマイコプラズマの検出
実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２のエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）およびマイコプラズマ汚染を試験した。
【００３８】
実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２細胞の染色体からエプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）を検出するために、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社から購入したＥＢＶ ＢａｍＷ領域増幅プライマーを用いて、添付の処方に従いＰＣＲ（ポリメレース チェイン リアクション）を行った。マイコプラズマ感染の検出はマイコプラズマＤＮＡ検出用Ｍ．Ｔ．Ｃ．キット（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．社製）により、添付の処方に従って実施した。
【００３９】
その結果、ＫＰＭＭ２はＥＢＶゲノムおよびマイコプラズマゲノムに対して陰性であった。
【００４０】
実施例６：サイトカインに対する反応性
実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の各種サイトカインへの反応性を試験した。
【００４１】
実施例１に記載する方法で得られたＫＰＭＭ２を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に浮遊させ、容量が２００μｌで９６穴プレート（ファルコン社製）へ１×１０４個／穴となるように分注した。
【００４２】
９６穴プレートの各穴には、下記の濃度となるように各種サイトカインを別々に加えた。
【００４３】
組換えＩＬ−２、同ＩＬ−３、同腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、同顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、同幹細胞成長因子（ＳＣＦ）（以上、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、同ＩＬ−４、同ＩＬ−７、同ＩＬ−１０、同ＩＬ−１１、同白血病阻害因子（ＬＩＦ）、同オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（以上、Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃ Ｉｎｃ．社製）、同ＩＬ−９、同トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−β（以上、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．社製）、同ＩＬ−１α（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ社製）、同ＩＬ−５（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．社製）、同ＩＬ−８（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）、同エリスロポエチン（ＥＰＯ）および同顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（以上、中外製薬株式会社より提供）は１００ｎｇ／ｍｌ。
【００４４】
組換えインターフェロン（ＩＦＮ）−γ（塩野義製薬株式会社より提供）および天然型ヒトＩＦＮ−α（住友製薬株式会社より提供）は１０００Ｕ／ｍｌ。
【００４５】
組換えＩＬ−６（中外製薬株式会社より提供）は１ｎｇ／ｍｌ。
【００４６】
なお、対照群は、サイトカインを加えない２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培養液で培養した。
【００４７】
９６穴プレートの各穴に分注したＫＰＭＭ２を、上記サイトカイン存在下あるいは非存在下で湿潤５％ＣＯ２中、３７℃で９６時間培養した。その培養終了４時間前に、各穴に３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を１μＣｉ／穴となるように添加した。ＫＰＭＭ２が取り込んだ３Ｈ−チミジンの量の測定は、液体シンチレーションカウンター（１２０５ ベータプレート、ファルマシア社製）を用いた。
【００４８】
ＫＰＭＭ２の増殖に対する各種サイトカインの効果を図５に示す。図５から明らかなように、ＫＰＭＭ２細胞はＩＬ−６とともにインキュベートしたときのみに３Ｈ−チミジンの取り込みが顕著に刺激された。濃度１ｎｇ／ｍｌにおけるＩＬ−６により、３Ｈ−チミジンの取り込みが２．２倍に上昇した。一方、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γはＫＰＭＭ２細胞の増殖を顕著に阻害した。
【００４９】
また、ＫＰＭＭ２のサイトカインに対する反応性を調べるために、ＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５， １９８３ を参照）および生細胞を直接測定する方法を用いたが、同様の結果が得られた。
【００５０】
実施例７：抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂによる増殖阻害
実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２に対するマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）（ＩｇＧ１クラス：ＰＭ１）およびマウス抗ＩＬ−６ｍＡｂ（ＩｇＧ１クラス：ＳＫ２）の効果を調べた。ＳＫ２は文献（Ｙ． Ｏｈｅ ｅｔａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６７：９３９， １９９３）に記載されており、またＰＭ１は文献（Ｈｉｒａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２９００， １９８９）に記載されている。
【００５１】
実施例１に記載する方法で得たＫＰＭＭ２を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に浮遊させ、容量が２００μｌで９６穴プレート（ファルコン社製）へ１×１０４個／穴となるように分注した。
【００５２】
９６穴プレートの各穴には、各種濃度のＩＬ−６ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）（ＳＫ２）および抗ＩＬ−６Ｒ（受容体）ｍＡｂ（ＰＭ１）を別々に加えた。なお、対照群は、抗体を加えない２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液とした。
【００５３】
９６穴プレートの各穴に分注したＫＰＭＭ２を、抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ存在下あるいは非存在下で湿潤５％ＣＯ２中、３７℃で９６時間培養した。その培養終了４時間前に、各穴に３Ｈ−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を１μＣｉ／穴となるように添加した。ＫＰＭＭ２が取り込んだ３Ｈ−チミジンの量の測定は、液体シンチレーションカウンター（１２０５ ベータプレート、ファルマシア社製）を用いた。
【００５４】
ＫＰＭＭ２の増殖に対する抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂの効果を図６に示す。ＳＫ２およびＰＭ１の添加はいずれも用量依存的に細胞増殖を有意に阻害した。特に、ＰＭ１は１μｇ／ｍｌの濃度でＫＰＭＭ２の増殖を完全に阻害した。
【００５５】
また、ＫＰＭＭ２増殖の抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂに対する効果を調べるために、ＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）法（Ｊ． Ｉｍｍｕｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５， １９８３ を参照）および生細胞を直接測定する方法を用いたが、同様の結果が得られた。
【００５６】
実施例８：ＥＬＩＳＡによるＩＬ−６産生の測定
上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２によるＩＬ−６産生能を試験した。
【００５７】
実施例１に記載する方法で得たＫＰＭＭ２を、２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に１０６個／ｍｌとなるように浮遊させ、ヒトＩＬ−６非存在下で湿潤５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。
【００５８】
培養７２時間後、培養上清中に含まれるＫＰＭＭ２が産生したＩＬ−６の濃度を、ヒトＩＬ−６用ＥＬＩＳＡキット（帝人バイオラボラトリー社製）を用いて添付の処方に従い測定した。なお、陰性対照として、２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培養液を用いた。培養上清には７９．７±１９．６（平均値±Ｓ．Ｄ．）ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６の産生が検出され、対照培養液において検出限界（４．０ｐｇ／ｍｌ）以下であったのに比較すると、培養上清中のＩＬ−６濃度が顕著に増加していることが確認された。
【００５９】
実施例９：フローサイトメトリーによるＩＬ−６Ｒの発現の確認
ＫＰＭＭ２細胞上でのＩＬ−６Ｒ発現を確認するために、ＩＬ−６Ｒに結合し、ＩＬ−６のＩＬ−６Ｒへの結合を阻害しないマウス抗ヒトＩＬ−６Ｒ ｍＡｂであるＭＴ１８抗体（Ｈｉｒａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２９００， １９８９）を用いて、間接蛍光抗体法を実施した。
【００６０】
実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２細胞を１０６個／チューブとなるように、１００μｌの実施例２記載のＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、１０μｇ／ｍｌのＭＴ１８抗体を加え、４℃にて３時間反応させた後、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、さらに、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ社製）を５μｇ／ｍｌ添加し、４℃にて３０分間反応させた。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、同ＦＡＣＳ緩衝液に浮遊させ、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＰＲＯＦＩＬＥ、コールター社製）で蛍光を測定した。
【００６１】
その結果、図７に示すように、ＫＰＭＭ２細胞上にＩＬ−６Ｒの発現が示された。
【００６２】
実施例１０：ＥＬＩＳＡによるヒトＩｇＧ（Ｍタンパク）産生の測定
ＫＰＭＭ２のヒトＩｇＧ（Ｍタンパク）産生能を試験した。
【００６３】
実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２を１０６個／ｍｌとなるように、２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に浮遊させ、容量２ｍｌで１２穴プレート（ファルコン社製）の各穴に分注し、ヒトＩＬ−６非存在下で湿潤５％ＣＯ２中、３７℃で７２時間培養した。なお、実験は３回行った。その後、培養上清中のヒトＩｇＧ濃度を、ＴＡＧＯ社製ヤギ抗ＩｇＧ抗体（ＮＯ．４１００）およびアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ＩｇＧガンマ鎖特異的抗体（ＮＯ．２４９０）を用いるＥＬＩＳＡにて測定した。なお、スタンダードとしてカッペル社製ヒトＩｇＧ（ＮＯ．０００１−８６０）を用いた。その結果、培養上清中には１０．１μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧが検出され、対照培養液では検出限界以下（５ｎｇ／ｍｌ）であったのに比較して、培養上清中のヒトＩｇＧ濃度が顕著に増加していることが確認された。
【００６４】
実施例１１：ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメレースチェインリアクション）によるＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒ ｍＲＮＡの検出
実施例１に記載の方法で得られたＫＰＭＭ２におけるヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−６Ｒの発現を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメレースチェインリアクション）法によりヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−６ＲのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を検出した。
【００６５】
グアニジウムセシウムクロライド法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）によってＫＰＭＭ２細胞（１０８個）から全ＲＮＡを調製した。陰性対照としてヒトＢ細胞リンパ腫細胞株ＳＫＷ６．４からも同様に全ＲＮＡを調製した。１本鎖ｃＤＮＡ合成はｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の処方に従い全ＲＮＡ５μｇから直接実施した。
【００６６】
陽性対照としてヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−６Ｒ検出用ＰＣＲプライマーを用いた（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．社製）。ＰＣＲ溶液各１００μｌは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ 塩化カリウム、Ａｍｐｌｉｔａｑ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社製）２．５ユニット、１本鎖ｃＤＮＡ合成反応物１μｌ、各プライマー１００ｐｍｏｌを含む。各ＰＣＲ用チューブに鉱物オイル５０μｌを上層してＰＣＲに付した。最初に９４℃で１分メルトし、６０℃で１分と７２℃で１０分のサイクルを３０サイクル繰り返した。最終サイクルの後、最終的に７２℃で１０分伸長を行った。ヒトＩＬ−６およびヒトＩＬ−６Ｒ検出用プライマーを用いた陽性対照群も同様に増幅し、約５０ｐｇの陽性対照ＰＣＲ産物を得た。
【００６７】
各反応チューブから１０μｌを取って１．５％アガロースゲル上で電気泳動を行った。図８に示すように、ＩＬ−６（６２８ｂｐ）およびＩＬ−６Ｒ（２５１ｂｐ）のＰＣＲ産物はいずれもＫＰＭＭ２のＲＮＡから増幅された。これらの結果は、ＫＰＭＭ２がＩＬ−６のオートクライン機構によって増殖することを遺伝子発現の面から支持する。一方、ＳＫＷ６．４細胞はＩＬ−６に応答してＩｇＭを分泌する。ＩＬ−６ＲのＰＣＲ産物はＳＫＷ６．４ ｍＲＮＡから増幅された。しかし、ＩＬ−６のＰＣＲ産物はこの実験で検出されず、このことはＳＫＷ６．４細胞がＩＬ−６を産生していないことを示唆する。
【００６８】
実施例１２：細胞株ＫＰＭＭ２のＳＣＩＤマウスおよびヌードマウスへの移植（１）ＫＰＭＭ２の可移植性およびインビボでの継代
上記実施例１で樹立した細胞株ＫＰＭＭ２の可移植性およびインビボでの継代を以下のように検討した。
【００６９】
ＫＰＭＭ２を２０％ＦＣＳおよび１００μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液に１０８個／ｍｌで懸濁し、０．２ｍｇのウサギ抗アシアロＧＭ１抗体（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．０１４−０９８０１、和光純薬工業社製）で処理したＩＬ−６トランスジェニック重症免疫不全マウス（以下ＩＬ−６−ＳＣＩＤ Ｔｍという）（中外製薬製）の腹部皮下に注射針で０．１ｍｌ移植した。その結果、１カ月後には３例全例で移植部位に結節型の腫瘍を形成した。
【００７０】
この腫瘍を無菌的に摘出し、摘出した腫瘍塊を使い捨て注射器のピストンなどでつぶし、ナイロンメッシュ（７０μｍ、ファルコン社製）を通して細胞を回収した。この細胞を上記と同様にＲＰＭＩ１６４０培養液に懸濁し、ＩＬ−６−ＳＣＩＤ Ｔｍ、重症免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウスという）（日本クレア社製）、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（以下ヌードマウスという）（日本クレア社製）に皮下移植したところ、同じように移植部位に結節型の腫瘍を形成し、インビボでの継代が可能であった。また腫瘍塊を３ｍｍ角のブロックにし、移植針を用いてＩＬ−６−ＳＣＩＤ Ｔｍ、ＳＣＩＤマウス、ヌードマウスの皮下に移植しても継代可能であった。
（２）ＫＰＭＭ２の異なる移植経路での可移植性
ＫＰＭＭ２の移植経路を皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）とした場合の可移植性を以下のように検討した。
【００７１】
（１）においてＳＣＩＤマウスにて継代したＫＰＭＭ２腫瘍を無菌的に摘出し、摘出した腫瘍塊を使い捨て注射器のピストンでつぶし、ナイロンメッシュを通して細胞を回収し、１０８個／ｍｌの細胞懸濁液を作成した。この懸濁液をＳＣＩＤマウス、あるいは０．２ｍｇのウサギ抗アシアロＧＭ１抗体および５００ＲのＸ線で処理したヌードマウスに０．１ｍｌずつ皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）の３経路で移植し、４０日後に生着の判定を行った（表２）。その結果、約４０日後には全例で生着が確認され、ｓ．ｃ．移植では移植部位に、ｉ．ｐ．移植では腹腔内に固形腫瘍を形成した。また、ｉ．ｖ．移植ではＫＰＭＭ２は骨髄での生着が認められた。
【００７２】
【表２】
細胞株ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスへ皮下移植し、形成された腫瘍の体積と血清中ヒトＩｇＧ濃度の相関を調べた。上記（２）に記載の方法で細胞株ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスへ皮下移植し、ＫＰＭＭ２移植前、移植後２１日目、４２日目の３回、血清サンプルを採取してＥＬＩＳＡ法にてヒトＩｇＧ濃度を測定した。
【００７３】
その結果、マウス血清中のヒトＩｇＧ濃度はＫＰＭＭ２を移植した動物ではいずれも経時的に上昇した。また図９に示すように、皮下移植した動物では皮下に形成された腫瘍の体積と血清ヒトＩｇＧ濃度に相関が見られ、腫瘍の大きな動物ほど血清ヒトＩｇＧ濃度は高値を示した。このことから、血清ヒトＩｇＧ濃度を指標としても抗腫瘍効果の判定ができると考えられた。
（４）ＫＰＭＭ２の可移植性および移植細胞数の検討
ＳＣＩＤマウスとヌードマウスで移植細胞数を変えたときのＫＰＭＭ２の可移植性を検討した。
【００７４】
特別な前処理を行わない雄のＳＣＩＤマウスおよびヌードマウスに、上記（２）記載の方法で各々ＫＰＭＭ２細胞を１０７、３×１０６、１０６個腹部皮下（ｓ．ｃ．）に移植し、またＳＣＩＤマウスには上記（２）の方法で得たＫＰＭＭ２細胞を３×１０６、１０６個静脈内（ｉ．ｖ．）でも移植した。
【００７５】
その結果、ＳＣＩＤマウスに皮下移植した場合、３×１０６個以上移植すると、２１日までに全例で腫瘍結節を形成し、１０６個移植した場合でも２１日までに２／３、３２日までに全例で腫瘍結節を形成した。ヌードマウスに皮下移植すると、１０７個移植した場合では２１日までに２／３、３２日までには全例で、また３×１０６個移植した場合では４２日までには全例で腫瘍結節が形成された。しかし、１０６個の移植では４２日までに腫瘍の生着は見られなかった。また、ＳＣＩＤマウスに静脈内移植した場合、４２日までに３×１０６個移植で全例、１０６個移植で１／３にＫＰＭＭ２が生着した。これらの結果を以下の表３にまとめて示す。
【００７６】
【表３】
ＫＰＭＭ２を移植したＳＣＩＤマウスにおいて、その生着を確認するために、ＫＰＭＭ２の細胞表面上で特徴的に発現している表面抗原であるヒトＣＤ３８抗原の発現を試験した。
【００７７】
ＫＰＭＭ２を上記（１）に記載する方法でＳＣＩＤマウスへ静脈内移植し、移植後３７日目にマウスを屠殺した。屠殺したマウスの大腿骨より骨髄を回収して懸濁し、ステンレスメッシュ（１００μｍ）を通し、蛍光活性化細胞選択装置（ＦＡＣＳ）用緩衝液（２％ＦＣＳおよび０．１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（−）溶液）にて骨髄細胞の浮遊液を調製した。なお、陰性対照としてＫＰＭＭ２を移植していないＳＣＩＤマウスの骨髄からも同様の方法にて骨髄細胞浮遊液を調製した。
【００７８】
また、本実施例に記載する方法によりＫＰＭＭ２を皮下移植したＳＣＩＤマウスからは、移植後３７日目に皮下腫瘍塊を外科的に摘出し、摘出した腫瘍塊を２枚のスライドグラスの間にはさんですりつぶし、これをステンレスメッシュ（１００μｍ）を通し、ＦＡＣＳ緩衝液にて骨髄細胞の浮遊液を調製した。
【００７９】
陽性対照として、実施例１に記載した方法でインビトロにて培養したＫＰＭＭ２を用いた。インビトロで４日間培養したＫＰＭＭ２をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、同緩衝液中に浮遊させた。
【００８０】
次に、このように調製した細胞浮遊液を用いて、ＦＡＣＳ解析によるヒトＣＤ３８抗原の発現を調べた。
【００８１】
すなわち、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中にて、各群の浮遊細胞１０６個に対し、２．５μｇ／ｍｌのフィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ヒトＣＤ３８抗体（Ｌｅｕ−１７、ベクトン・ディッキンソン社製）を添加し、氷上で３０分間反応させた。次いで、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄後、５００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン社製）によりＦＡＣＳ解析を行った。
【００８２】
陽性対照群であるインビトロ培養ＫＰＭＭ２のＦＡＣＳ解析の結果から、蛍光強度４０から２０００までの範囲にある細胞をヒトＣＤ３８抗原発現細胞とした（図１０（ａ）参照）。ＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウスでは、その骨髄細胞のおよそ７１％がヒトＣＤ３８陽性細胞で占められていた（図１０（ｂ）参照）。このことは、ＳＣＩＤマウスに静脈内移植したＫＰＭＭ２がＳＣＩＤマウスの骨髄に生着したことを示している。また、ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスに皮下移植して生じた腫瘍塊から得られた細胞は全てヒトＣＤ３８が陽性であり（図１０（ｃ）参照）、ＫＰＭＭ２を皮下移植して生ずる腫瘍塊は、全てＫＰＭＭ２から構成されていることが示された。なお、ＫＰＭＭ２を移植していない陰性対照群のＳＣＩＤマウスの骨髄細胞にはヒトＣＤ３８陽性細胞は全く検出されなかった（図１０（ｄ）参照）。
【００８３】
実施例１３：抗ヒトＩＬ−６抗体ＳＫ２および抗ヒトＩＬ−６Ｒ再構成ヒト型化抗体ＰＭ１の抗腫瘍効果
ＫＰＭＭ２移植動物における抗ヒトＩＬ−６抗体ＳＫ２および抗ヒトＩＬ−６Ｒ再構成ヒト型化抗体ＰＭ１のインビボ抗腫瘍効果を以下のようにして検討した。
【００８４】
上記実施例１２（１）に記載の方法でＳＣＩＤマウスで継代して得たＫＰＭＭ２骨髄腫腫瘍塊をウサギ抗アシアロＧＭ１抗体／Ｘ線処理ヌードマウス（５週齢、雄）に４ｍｍ角ブロックで皮下移植し、翌日に１回だけＳＫ２抗体を１ｍｇ／マウスの１用量、再構成ヒト型化ＰＭ１抗体（国際公開出願ＷＯ９２−１９７５９参照）を０．１２５、０．５および１ｍｇ／マウスの３用量で静脈内投与した。各抗体は０．２ｍｌ／マウスとなるようにＰＢＳ（−）（ニッスイ製）で調製し、陰性対照群には、ＰＢＳ（−）を０．２ｍｌ／マウス投与した。その後腫瘍の大きさを経時的に観察し、対照群の腫瘍が十分大きくなった３５日目に全採血を行ってから腫瘍を摘出して重量を測定した。
【００８５】
その結果を図１１に示す。陰性対照群の平均腫瘍重量が約１ｇであったのに対し、再構成ヒト型化ＰＭ１抗体投与群においては、１ｍｇ／マウス投与した場合で腫瘍増殖抑制率（Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒａｔｉｏ：ＧＩＲ）は７８％、０．５ｍｇ／マウス投与した場合でのＧＩＲは５３％、０．１２５ｍｇ／マウス投与した場合でのＧＩＲは６６％を示し、強い腫瘍増殖抑制効果が見られた。またＳＫ２においても、１ｍｇ／マウス投与群でＧＩＲ６１％と腫瘍増殖を抑制した。
【００８６】
さらに、腫瘍摘出時に採取した血清サンプルのヒトＩｇＧ濃度をＥＬＩＳＡ法にて測定した。その結果を図１２に示す。抗体非投与陰性対照群では血清ヒトＩｇＧ濃度が平均２７．６ｍｇ／ｍｌであったものが、再構成ヒト型化ＰＭ１抗体を１、０．５、０．１２５ｍｇ／マウス投与することでそれぞれ７１％、５５％、７５％抑制された、ＳＫ２ １ｍｇ／マウス投与でも４３％抑制された。腫瘍重量と血清ヒトＩｇＧ濃度は各処理群間でも、個体レベルでもよく相関していた。
【００８７】
実施例１４：ＫＰＭＭ２静脈内移植ＳＣＩＤマウスにおけるイオン化カルシウム濃度の上昇および骨吸収の亢進
ＫＰＭＭ２（１０７個）を上記実施例１２（２）に記載する方法でＳＣＩＤマウス（日本クレア社製）へ静脈内移植し、移植後経時的に血中イオン化カルシウム濃度および骨吸収の有無を試験した。
【００８８】
ＫＰＭＭ２移植後９日目、２０日目、３０日目および３７日目にＫＰＭＭ２静脈内移植ＳＣＩＤマウスをエーテル麻酔し、マウス眼窩より６０μｌ容量のキャピラリーカラム（チバ・コーニング社製）で採血し、直ちに血中イオン化カルシウム濃度を６３４自動Ｃａ＋＋／ｐＨアナライザー（チバ・コーニング社製）にて測定した。なお、対照としてＫＰＭＭ２を移植していないＳＣＩＤマウスからも同様の方法で採血し、血中イオン化カルシウム濃度を測定した。
【００８９】
その結果、ＫＰＭＭ２静脈内移植ＳＣＩＤマウスの血中イオン化カルシウム濃度は、移植後３０日目より上昇がみられ、３７日目には対照群のマウスに比べ、約２０％の血中イオン化カルシウム濃度上昇が観察された（図１３）。なお、血中イオン化カルシウム濃度上昇は、ＫＰＭＭ２をＳＣＩＤマウスへ静脈内移植したときの、マウス骨髄におけるＫＰＭＭ２（ヒトＣＤ３８抗原陽性細胞）が占める増加の割合の経時的増加とよく相関していた（図１４参照）。
【００９０】
また、ＫＰＭＭ２静脈内移植３７日目のＳＣＩＤマウス下肢の骨をＸ線撮影して形態的に観察したところ、対照群のマウスと比較し、顕著な骨吸収像が確認された（図１５参照）。以上の結果は、ＫＰＭＭ２静脈内移植ＳＣＩＤマウスの骨病変が、実際の骨髄腫の病変とよく一致していることを示している。
【００９１】
【発明の効果】
本発明によってＩＬ−６オートクライン依存性で増殖する骨髄腫が存在することが明らかとなった。本発明のオートクライン機構によりＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株は、骨髄腫のＩＬ−６依存性増殖機構モデルとして有用である。また抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体などのＩＬ−６活性阻害剤をはじめとする骨髄腫治療剤の治療モデルとしても使用し得るものである。本発明のオートクライン機構によりＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株はインビトロおよびインビボで細胞増殖抑制を指標とした骨髄腫治療剤の評価系を作成するのに有用であるのはもちろん、Ｍタンパクを産生し、この産生量が骨髄腫の増殖に極めてよく相関することから、Ｍタンパク産生量の抑制を指標とした骨髄腫治療剤の評価系を作成するのに有用である。
【００９２】
さらに、本発明のヒト骨髄腫細胞株を実験動物に静脈内移植して得られる骨髄腫の骨髄生着モデルでは、多発性骨髄腫の増殖に伴い骨髄腫に特徴的な骨病変が観察され、したがってこの骨病変の抑制を指標とした骨髄腫治療剤の評価系を作成することができる。
【００９３】
これらの点から本発明のヒト骨髄腫細胞株の利用価値は極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】液体培養におけるＫＰＭＭ２の自律的凝集を示す図（生物の形態を表す写真）である。
【図２】ＫＰＭＭ２の形態を示す図（生物の形態を表す写真）である。ライト−ギムザ染色では形質細胞の特徴を有する。
【図３】サザンブロット分析によるＫＰＭＭ２のＪＨおよびＣλ遺伝子の再構成を示す図（電気泳動の写真）である。ＫＰＭＭ２から得たＤＮＡをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＪＨおよびＣλ遺伝子プローブを用いてサザンブロット分析を行った。再構成したバンドを（▲）で示す。
【図４】ＫＰＭＭ２の核型を示す図（生物の形質を表す写真）である。検索した１５細胞はすべて４６、ＸＸ、ｄｅｒ（１；１９）（ｑ１０；ｑ１０）、ｔ（３；１４）（ｑ２１；ｑ３２）、−４、ｔ（６；１１）（ｐ１２；ｐ１５）、ｄｅｒ（１０）ａｄｄ（１０）（ｐ１３）ｄｉｃ（９；１０）（ｑ１０；ｑ２６）、＋１６を示した。
【図５】ＫＰＭＭ２の細胞増殖に対する各種サイトカインの効果を示す図である。使用したサイトカインの濃度は以下の通りである：ＩＬ−６、１ｎｇ／ｍｌ；ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γ、１０００Ｕ／ｍｌ；その他のサイトカイン、１００ｎｇ／ｍｌ。各数値は３回の試験の平均＋標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図６】ＫＰＭＭ２の細胞増殖に対する抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂの効果を示す図である。ＳＫ２はマウス抗ＩＬ−６ ｍＡｂ（▲）；ＰＭ１はマウス抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ（●）。破線は対照を示す。各数値は３回の試験の平均を表す。
【図７】ＫＰＭＭ２細胞におけるＩＬ−６Ｒの発現を示す図である。細胞は抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ（ＭＴ１８）で染色した。マウスＩｇＧ２ｂ抗体を対照として用いた。破線はｍＩｇＧ２ｂを、実線はＭＴ１８を表す。
【図８】１．５％アガロースゲル上でのＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）分析により、ＫＰＭＭ２のＩＬ−６およびＩＬ−６Ｒ ｍＲＮＡの発現を示す図（電気泳動の写真）である。レーン１および４、ＳＫＷ６．４；レーン２および５、ＫＰＭＭ２；レーン３および６、陽性対照。
【図９】ＫＰＭＭ２を皮下移植したマウスにおける腫瘍体積と血清ヒトＩｇＧ濃度の相関を示す図である。
【図１０】（ａ）はインビトロ培養したＫＰＭＭ２におけるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示す図である。ＫＰＭＭ２は４０から２０００までの範囲の蛍光強度を有する。
（ｂ）はＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウスの骨髄細胞におけるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示す図である。７１％の細胞が４０から２０００の範囲の蛍光強度を有する。
（ｃ）はＫＰＭＭ２を皮下移植したＳＣＩＤマウスの腫瘍塊から得た細胞におけるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示す図である。全ての細胞が４０から２０００の範囲の蛍光強度を有する。
（ｄ）はＫＰＭＭ２を移植していないＳＣＩＤマウスの骨髄細胞におけるヒトＣＤ３８抗原のＦＡＣＳ解析を示す図である。４０から２０００の範囲の蛍光強度を有する細胞は全くみられない。
【図１１】ＫＰＭＭ２に対する抗ＩＬ−６ ｍＡｂおよび抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂのインビボにおける腫瘍増殖抑制効果を示す図である。ＳＫ２は抗ヒトＩＬ−６ ｍＡｂ；再構成ヒト型化ＰＭ１は抗ヒトＩＬ−６Ｒ ｍＡｂ。
【図１２】ＫＰＭＭ２移植ヌードマウス中の血清ヒトＩｇＧ濃度に対する抗ＩＬ−６ ｍＡｂまたは抗ＩＬ−６Ｒ ｍＡｂの効果を示す図である。
【図１３】ＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウスの血中イオン化カルシウム濃度（□）の経時的変化を示す図である。（◇）は対照を示す。各数値はＳＣＩＤマウス４匹（３７日目のみ５匹）の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図１４】ＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウスの骨髄中のヒトＣＤ３８抗原陽性細胞の割合（□）の経時的変化を示す図である。（◇）は対照を示す。各数値はＳＣＩＤマウス４匹（３７日目のみ５匹）の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。
【図１５】ＫＰＭＭ２を静脈内移植したＳＣＩＤマウスの骨のＸ線撮影像を示す図（生物の形態を示す写真）である。
（ａ）はＫＰＭＭ２を移植していない対照群のＳＣＩＤマウス
（ｂ）はＫＰＭＭ２移植後３７日目のＳＣＩＤマウス
Claims (14)
- オートクライン機構によりＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株であって、ＫＰＭＭ２（生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センター、受託番号ＦＩＲＭ：Ｐ−１４１７０）である前記細胞株。
- 請求項１に記載の細胞株を移植したヒト以外の実験動物。
- 実験動物が免疫不全状態である請求項２に記載のヒト以外の実験動物。
- 実験動物がマウスである請求項２に記載の実験動物。
- 実験動物にオートクライン機構によりＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を静脈内移植して得られる請求項２に記載のヒト以外の実験動物。
- 実験動物にオートクライン機構によりＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を皮下移植して得られる請求項２に記載のヒト以外の実験動物。
- 実験動物にオートクライン機構によりＩＬ−６依存性で増殖するヒト骨髄腫細胞株を腹腔内移植して得られる請求項２に記載のヒト以外の実験動物。
- 骨髄腫治療剤を請求項１に記載の細胞株に添加して骨髄腫細胞増殖抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビトロスクリーニング法。
- 骨髄腫細胞増殖抑制試験をＭタンパク分泌抑制を指標として行うことからなる請求項８に記載のインビトロスクリーニング法。
- 骨髄腫治療剤がＩＬ−６活性阻害剤である請求項８に記載のインビトロスクリーニング法。
- 骨髄腫治療剤を請求項２に記載のヒト以外の実験動物に移植して骨髄腫細胞増殖抑制を試験することからなる骨髄腫治療剤のインビボスクリーニング法。
- 骨髄腫細胞増殖抑制試験をＭタンパク分泌抑制を指標として行うことからなる請求項１１に記載のインビボスクリーニング法。
- 骨髄腫細胞増殖抑制試験を骨病変の抑制を指標として行うことからなる請求項１１に記載のインビボスクリーニング法。
- 骨髄腫治療剤がＩＬ−６活性阻害剤である請求項１１に記載のインビボスクリーニング法。
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