JP3420258B2

JP3420258B2 - イヌコロナウイルスサブユニットワクチン

Info

Publication number: JP3420258B2
Application number: JP10708392A
Authority: JP
Inventors: トーマス・デイビツド・ケイ・ブラウン; ブライアン・コリン・ホースバーグ
Original assignee: Akzo Nobel NV
Current assignee: Akzo Nobel NV
Priority date: 1991-04-25
Filing date: 1992-04-24
Publication date: 2003-06-23
Anticipated expiration: 2018-06-23
Also published as: JPH05260976A; PT510773E; AU645417B2; DE69233270T2; ATE256746T1; EP0510773A1; CA2066940C; CA2066940A1; EP0510773B1; DE69233270D1; AU1513192A; US5661006A; NZ242471A; DK0510773T3; ES2213743T3

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＣＣＶスパイク蛋白質をコード
する核酸配列、このような核酸配列を含む組換えベクタ
ーまたは組換えベクターウイルス、このような組換えベ
クターで形質転換したか若しくは組換えベクターウイル
スで感染した宿主細胞、並びにイヌのＣＣＶ感染に対す
るワクチンに関する。

【０００２】イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）は、コロナ
ウイルス科の中でも独特のウイルスの１種である。この
属に属するウイルスは、ヒトを含む多くの動物に感染す
ることが公知である。これらは、胃腸炎（ブタ、七面
鳥、マウス、子牛、イヌ、ネコ及びヒト）、唾液腺感染
（げっ歯動物）、呼吸器疾患（ヒト、ブタ、トリ及びイ
ヌ）及び脳炎（幼豚）などの種々の疾病を引き起こす。

【０００３】ＣＣＶは、1971年に最初にドイツで軍用犬
から単離され、伝染性が高く、感染し易いイヌの中では
急激に蔓延することが知見された。通常、ＣＣＶは、感
染性の排泄物によって汚染されたものから摂取される。
経口感染により、小腸の上皮細胞でウイルスが複製する
ので、ＣＣＶは腸リンパ節でも発見された。

【０００４】病気の症状は感染後１〜３日して現れ、嘔
吐、下痢、食欲不振、欝状態及び脱水症状を含む。症状
の持続及びその重さは、ストレス及び他のウイルス、寄
生虫またはバクテリアの存在に関与している。腸の症状
が優位であるが、鼻及び目の分泌物を含む呼吸器系の症
状も報告されている。

【０００５】イヌはＣＣＶの唯一公知の宿主である。ネ
コ及びブタにＣＣＶを接種しても、感染はするが、これ
らの種に於いてはＣＣＶにより臨床的な疾病は起きな
い。ヒト、ウシ及びマウスはＣＣＶに対し感染性である
という証拠はない。

【０００６】交差防御研究から、コロナウイルスは互い
に殆どまたは全く免疫を誘発しないことが明らかになっ
た。例えば、イヌを実験的にブタの伝染性胃腸炎ウイル
ス（TGEV）またはネコのネコ感染性腹膜炎ウイルス（FI
PV）で感染させても、続くＣＣＶ感染作用に対してイヌ
を防御しない。

【０００７】コロナウイルスは、約30kbの一本鎖ＲＮＡ
からなるゲノムを含む、エンベロープをもつウイルス群
からなる。このゲノムは特に、３つの重要な構造蛋白
質：スパイク蛋白質（Ｓ）、膜蛋白質（Ｍ）及びヌクレ
オカプシド蛋白質（Ｎ）をコードする。グリコシル化ス
パイク蛋白質Ｓ_oは分解して、幾つかのコロナウイルス
中にＳ₁及びＳ₂を形成する。Ｓ₁及びＳ₂の各々の２つま
たは３つのコピーは、特徴的なＣＣＶ表面構造、スパイ
ク即ちペプロマーを形成する。スパイク蛋白質及びその
構成ポリペプチドは、感染した動物中にウイルスを中和
する免疫応答を誘発することに於いて重要な役割を果た
す。

【０００８】通常のＣＣＶワクチンは、化学的に不活化
したウイルスワクチンまたは変性した生ウイルスワクチ
ンを包含する。しかしながら不活化ワクチンは、追加の
免疫が必要であり、不都合にもアジュバントを含んでお
り且つ製造が高価である。さらに、幾つかの感染性ウイ
ルス粒子が不活化工程でも生存し、動物に投与後発病さ
せ得る。

【０００９】通常、弱毒生ウイルスワクチンは、体液性
及び細胞性の両方の反応に基づいて免疫応答を喚起する
ので、このワクチンが好ましい。今日まで、ＣＣＶ株を
ベースとしたこのようなワクチンは、組織培養物に病毒
性株を継代することによりのみ製造し得る。しかしなが
らこの処理により、未制御の突然変異体がウイルスのゲ
ノム中に導入され、その病毒性及び免疫特性に於いて異
種のウイルス粒子集団ができてしまう。さらに、このよ
うな在来の弱毒生ウイルスワクチンは、病毒性を取り戻
して、接種した動物を発病させ、他の動物にも病原体を
拡散させてしまう可能性がある。

【００１０】組換えＤＮＡ技術をベースとして、ＣＣＶ
病原体に対し免疫応答を誘発し得る必須且つ適切なＣＣ
Ｖ免疫原性物質のみを含むか、または前記物質をコード
する遺伝情報を含み、且つ生ワクチン若しくは不活化ワ
クチンの上述の不都合を示さない改良ワクチンを構築し
得る。

【００１１】本発明は、ＣＣＶ感染に対しイヌを免疫す
るためのワクチンの製造に適用し得る、ＣＣＶスパイク
蛋白質の１種以上の免疫原性抗原決定基を有するポリペ
プチドをコードする単離且つ精製した核酸配列を提供す
る。

【００１２】本明細書中で使用する「核酸配列」という
用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形であ
り、リボ核酸配列及びデオキシリボ核酸配列の両方を意
味する。大体に於いてこの用語は、分子の一次構造を意
味する。従ってこの用語は、二重及び一重鎖ＤＮＡ、二
重及び一重鎖ＲＮＡ並びにその変形物を含む。

【００１３】通常、「ポリペプチド」という用語は、生
物学的活性を備えたアミノ酸の分子鎖を指し、産生物の
特定の長さを指すのではなく、所望によりin vivoまた
はinvitroで修飾（例えば、グリコシル化、アミド化、
カルボキシル化またはリン酸化など）し得る。従ってペ
プチド、オリゴペプチド及び蛋白質が含まれる。

【００１４】「ＣＣＶスパイク蛋白質の１種以上の免疫
原性抗原決定基を有するポリペプチド」という用語は、
ＣＣＶ感染または疾病に対しイヌに防御性免疫応答を誘
発し得る１種以上のエピトープを有するポリペプチドを
指す。

【００１５】特に本発明は、SEQ ID No：２、４または
６に示されたアミノ酸配列を有するＣＣＶスパイク蛋白
質の１種以上の免疫原性抗原決定基を有するポリペプチ
ドをコードする核酸配列を提供する。

【００１６】本発明の範囲内には、SEQ ID No：２、４
または６に示されるポリペプチドの機能性変異体（func
tional variant）をコードする核酸配列も含み得る。こ
れらの機能性変異体は、SEQ ID No：２、４または６に
特定的に記載されたアミノ酸配列から誘導されたアミノ
酸配列を有するポリペプチドであるが、ＣＣＶスパイク
蛋白質の１種以上の免疫原性抗原決定基、即ちＣＣＶ感
染または疾病に対しイヌに防御性免疫応答を誘発し得る
１種以上のエピトープを保有している。

【００１７】本明細書中に包含されるＣＣＶ-6、Insavc
-１またはLiverpool C54株から誘導される特定のポリペ
プチドとしては、イヌコロナウイルスの個々のウイルス
間または株間の天然変異（natural variations）による
ものが存在し得ることが理解されよう。これらの変異
は、全配列内のアミノ酸の違いまたは、前記配列内での
アミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位若しくは付加により
実施され得る。アミノ酸の置換は、報告されているよう
に、生物学的及び免疫学的活性を本質的に変えないと予
想され得る。関連するアミノ酸間でのアミノ酸の置換ま
たは進化中、頻発する置換としては、特に、Ser/Ala、S
er/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn及びIle/Valが挙げられる［D
ayhof,M.D.，Atlas of protein sequence and structur
e，Nat．Biomed．Res．Found.，Washington D,C.，197
8，vol.5，suppl.3参照］。この情報をベースとして、L
ipman及びPearsonは、迅速且つ感度の高い蛋白質比較方
法（Science 227，1435〜1441，1985）を開発し、同種
ポリペプチド間での官能基の類似性を決定した。このよ
うな同種の機能性変異体をコードする核酸配列は、本発
明の範囲内に含まれる。さらに、これらの種々の機能性
変異体をコードする核酸配列を製造するために組換えＤ
ＮＡ技術を使用することも可能である。

【００１８】本発明の核酸配列は、ＣＣＶ株［例えば、
ＣＣＶ-6、Insavc-１（EP396,193）、ＣＣＶ 1-71（ATC
C VR-809）またはＣＣＶ TN449（ATCC VR-2068）な
ど］の単離体から誘導し得る。

【００１９】本発明のもう一つの態様に於いて、FIPV感
染に対しネコを防御するためのワクチンの製造に使用し
得る、上述の核酸配列を提供する。

【００２０】SEQ ID No：１〜６に提供された情報よ
り、当業者は、本明細書中に開示されたＣＣＶスパイク
蛋白質に対応する免疫学的特性を有する上述の種々の機
能性変異体ポリペプチドをコードする核酸配列を単離且
つ識別し得る。通常適用されるサザンブロッティング法
またはコロニーハイブリダイゼーション法をその目的に
使用し得る［Experiments in Molecular Biology,ed．
R.J.Slater，Clifton，U.S.A.，1986；Singer-Sam,J.
ら.，Proc．Natl．Acad．Sci．80，802〜806，1983；Ma
niatis T.ら.，Molecular Cloning，A laboratory Manu
al，second edition，Cold Spring Harbor Laoboratory
Press，USA，1989］。例えば、特定のＣＣＶ株から誘
導したＲＮＡまたはｃＤＮＡを電気泳動し、ニトロセル
ロースフィルターの上に移動させ、「ブロット」する。
特定の標識ＤＮＡフラグメントまたは「プローブ」即
ち、SEQ ID No：１、３または５に示されている核酸配
列の（合成）ポリ−若しくはオリゴヌクレオチド配列フ
ラグメントにハイブリッド形成することにより、フィル
タ上のＣＣＶスパイク蛋白質核酸配列を識別することが
可能である。該フラグメントは、塩濃度及び温度の特定
的条件下でフィルタ上に存在する相同の核酸配列とハイ
ブリダイズする。フィルタを洗浄後、ハイブリダイズさ
れた物質をオートラジオグラフィーにより検出し得る。
対応するＤＮＡフラグメントは、アガロースゲルから溶
離でき、SEQ ID No：２、４または６に開示のポリペプ
チドの機能性変異体の合成に使用することができる。

【００２１】従って本発明の好ましい機能性変異体は、
ＣＣＶスパイク蛋白質の１種以上の免疫原性抗原決定基
を含むポリペプチドであり且つSEQ ID No：１、３また
は５に示されたＤＮＡ配列にハイブリダイズする核酸配
列によりコードされる。

【００２２】もう一つの方法では、ＣＣＶｃＤＮＡ
を、Huynhらにより記載の如くκgt11ファージ中にクロ
ーン化し［D.Glover（ed.），DNA Cloning：A Practica
l Approach，IRL Press Oxford，49〜78，1985］且つバ
クテリア宿主中で発現し得る。次いで、組換えファージ
は、SEQ ID No：２、４または６に開示された精製ＣＣ
Ｖスパイク蛋白質に対するポリクローナル血清を用いて
スクリーニングし得、変形体ポリペプチドの対応する免
疫学的領域の存在を決定する。ＣＣＶスパイク蛋白質に
対し誘発された本明細書中で使用すべきポリクローナル
血清の製造を、以下に記載する。

【００２３】当業界で公知の如く、遺伝暗号の縮重によ
り、１つのコドン中の塩基が置換した結果他のコドンが
生ずるが、それでも同一アミノ酸をコードすることが可
能である。例えばアミノ酸のグルタミン酸用のコドン
は、ＧＡＴ及びＧＡＡの両方である。従って、SEQ ID N
o：２、４または６に示されているアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを発現させるために、それぞれSEQ ID N
o：１、３または５示されている核酸配列とは異なる代
替のコドン組成を有する誘導体核酸配列を使用し得るの
は明らかである。

【００２４】さらに、上述の如く特定的に開示されたＣ
ＣＶスパイク蛋白質またはその機能性変異体をコードす
る核酸配列のフラグメントも、本発明内に含まれる。

【００２５】本明細書中で使用する「フラグメント」と
いう用語は、本発明の核酸配列またはポリペプチドのサ
ブ配列（subsequence）を含むＤＮＡまたはアミノ酸配
列を指す。前記フラグメントは、ＣＣＶスパイク蛋白質
の１種以上の免疫原性抗原決定基を有するポリペプチド
であるか、またはこれをコードする。即ち、前記フラグ
メントは、イヌに於いて防御性免疫応答を誘発し得る１
種以上のエピトープを有する。使用可能なポリペプチド
フラグメントを決定する方法を、以下に概説する。フラ
グメントは、特に、ＤＮＡ用の制限エンドヌクレアーゼ
及びポリペプチド用のプロテアーゼを使用して、前駆体
分子を酵素分解して製造し得る。他の方法としては、フ
ラグメントを化学合成したり、ＤＮＡフラグメントによ
りポリペプチドフラグメントを発現させることが挙げら
れる。

【００２６】ＣＣＶスパイク蛋白質前駆体をコードする
一般的な配列は、SEQ ID No：１、３及び５に示されて
いる。これらのcＤＮＡ配列は、各々約4328、4352及び4
358ヌクレオチドの長さであり、各々1443、1451及び145
3アミノ酸のポリペプチドをコードする。

【００２７】本発明の好ましい核酸配列は、前記配列が
SEQ ID No：１、３または５に開示されているＤＮＡ配
列の少なくとも１部を含むことを特徴とする。

【００２８】本発明の核酸配列は、特定のＣＣＶ株から
単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）方法を含む組換
えＤＮＡ技術により増殖し得るか、当業界で公知の方法
によりin vitroで化学的に合成し得る。

【００２９】得られたポリペプチドがＣＣＶスパイク蛋
白質の１種以上の免疫原性抗原決定基を保有する限り、
あらゆる改変の結果得られた、特定的に例示したポリペ
プチドの上記機能性変異体は本発明の範囲内に含まれ
る。

【００３０】本発明の核酸配列は、天然において該配列
と結合または連結していない種々の複製実施ＤＮＡ配列
と連結して、好適な宿主の形質転換用に使用され得る所
謂組換えベクター分子となる。有用な組換えベクター分
子は、例えばプラスミド、バクテリオファージ、コスミ
ドまたはウイルスから誘導するのが好ましい。

【００３１】本発明の核酸配列をクローン化するのに使
用され得る特定のベクターまたはクローニングビヒクル
は、当業界では公知であり、特にプラスミドベクター
［例えば、pBR322、種々のpUC、pGEM及びBluescriptプ
ラスミドなど］、バクテリオファージ［例えば、κgt-W
es、Charon 28及びＭ13誘導ファージなど］またはウイ
ルスベクター［例えば、SV40、アデノウイルスまたはポ
リオーマウイルスなど］が挙げられる［Rordiquez,R.
L．及びD.T.Denhardt，ed.,Vectors：A survey ofmolec
ular cloning vectors and thier uses，Butterworth
s，1988；Lenstra，J.A.ら，Arch，Virol．110，１〜2
4，1990参照］。本発明の組換えベクター分子の構築に
使用される方法は、当業者には公知であり、特にManiat
is，Tらにより説明されている［Molecular Cloning A L
aboratory Manual，second edition；Cold Spring Harb
or Laboratory，1989］。

【００３２】例えば、本発明の核酸配列のクローニング
ベクターへの挿入は、その遺伝子と所望のクローニング
ビヒクルの両方を、相補的ＤＮＡ末端（termini）を生
成する同一制限酵素で切断すると、容易に実施し得る。

【００３３】あるいは、一本鎖ＤＮＡを消化して、また
は、好適なＤＮＡポリメラーゼを用いてその一本鎖末端
に充填することにより、制限部位を改変して平滑末端化
することが必要である。続いて、酵素（例えば、T4 Ｄ
ＮＡリガーゼなど）を用いて平滑末端の連結を実施し得
る。

【００３４】所望により、ＤＮＡ末端上にリンカーを連
結することにより任意の制限部位を形成し得る。このよ
うなリンカーは、制限部位配列をコードする特定のオリ
ゴヌクレオチド配列からなっていてもよい。制限酵素は
ベクターを切断し、核酸配列は、ホモポリマーをテイリ
ングすること（homopolymeric tailing）により改変さ
れ得る。

【００３５】本明細書中で使用する「形質転換」という
用語は、使用した方法、例えば、直接取り込みまたは形
質導入などに関係なく、異種核酸配列を宿主細胞に導入
することを指す。異種核酸配列は、自律複製を介して維
持され得るか、あるいは宿主ゲノム中に組み込まれ得
る。所望により、組換えベクター分子には、設計した宿
主と適合し得る好適な制御配列が備えられ、挿入した核
酸配列の発現を制御できる。微生物に加えて、多細胞生
物から誘導した細胞の培養物も宿主として使用し得る。

【００３６】本発明の組換えベクター分子は、所望の形
質転換細胞を選択するために使用さ得れる１種以上のマ
ーカー活性（例えば、pBR322中のアンピシリン及びテト
ラサイクリン耐性、pUC8中のアンピシリン耐性及びβ-
ガラクトシダーゼ活性など）を含むのが好ましい。

【００３７】ポリペプチドをコードする核酸配列によ
り、またはこのような核酸配列を含む組換えベクター分
子により形質転換され得且つ、所望により前記核酸配列
によりコードされた前記ポリペプチドを発現させるのに
使用され得る好適な宿主細胞は、微生物または細胞であ
る。宿主細胞は、原核生物起源［例えば、バクテリア
（Escherichia coli，Bacillus subtilis及びPseudomon
as種など）］または真核生物起源｛例えば、酵母（サッ
カロミセス・セレビシアエ）または高等真核生物細胞
［昆虫、植物、若しくはHeLa細胞及びチャイニーズハム
スター卵巣（CHO）細胞を含む哺乳類細胞］など｝であ
り得る。昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaのS
f9細胞系が挙げられる（Luckowら、Bio-technology 6，
47〜55，1988）。真核細胞クローニング系に於ける本発
明の核酸配列のクローニング及び発現に関する情報は、
Esser,K.らにより知見されたものである（Plasmids of
Eukaryotes，Springer-Verlag，1986）。

【００３８】本発明で有用な組換えベクター分子の構築
には、通常、原核生物が好ましい。例えば、E.coli K12
株（DH5αまたはJM101）は特に好ましい。

【００３９】発現させるためには、本発明の核酸配列を
発現ベクターに導入する。即ち、前記配列を発現制御配
列に操作可能に結合する。このような制御配列として
は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、イン
デューサー、リボソーム結合部位などが挙げられる。従
って、本発明は、形質転換した宿主細胞内でベクター内
に含まれるＤＮＡ配列を発現し得る、発現制御配列に操
作可能に結合したＣＣＶスパイク蛋白質をコードする核
酸配列を含む組換えベクター分子を提供する。

【００４０】無論、クローニングベクターの選択された
部位に挿入されるヌクレオチド配列は、所望のポリペプ
チドの実際の構造遺伝子の部分と異なるヌクレオチドを
含んでいてもよく、または形質転換した宿主が、ＣＣＶ
スパイク蛋白質の少なくとも１種以上の免疫原性抗原決
定基を有するポリペプチドを産生する限り所望の蛋白質
の完全構造遺伝子のフラグメントのみを含んでいてもよ
い。

【００４１】宿主細胞がバクテリアであるとき、有用な
発現制御配列としては、Trpプロモーター及びオペレー
ター（Goeddelら，Nucl．Acids Res．8，4057，198
0）；lacプロモーター及びオペレーター（Changら，Nat
ure 275，615，1978）：外膜蛋白質プロモーター（Naka
mura,K．及びInouge,M.，EMBO J．１，771〜775，198
2）；バクテリオファージκプロモーター及びオペレー
ター（Remaut,E.ら.，Nucl.Acids Res.11，4677〜468
8，1983）；α-アミラーゼ（B.subtilis）プロモーター
及びオペレーター、選択された宿主細胞と適合し得る終
結配列並びに他の発現促進及び制御配列が挙げられる。
宿主細胞が酵母であるとき、有用な発現制御配列として
は、例えば、α-接合因子が挙げられる。昆虫細胞に関
しては、バキュロウイルスのポリヘドリンまたはｐ10プ
ロモーターを使用し得る（Smith,G.E.ら.，Mol.Cell.Bi
ol.3，2156〜65，1983）。宿主細胞が哺乳類起源である
とき、有用な発現制御配列としては、例えば、SV-40プ
ロモーター（Berman，P.W.ら.，Science 222，524〜52
7，1983）またはメタロチオネインプロモーター（Brins
ter,R.L.，Nature 296，39〜42，1982）若しくはヒー
トショックプロモーター（Voellmyら.，Proc．Natl．Ac
ad．Sci．USA 82，4949〜53，1985）が挙げられる。遺
伝子発現を最大にするためには、Roberts及びLauerも参
照されたい（Methods inEnzymology 68，473，1979）。

【００４２】従って本発明は、核酸配列の発現によりＣ
ＣＶスパイク蛋白質を産生し得る、上述の核酸配列また
は組換え発現ベクター分子で形質転換した宿主細胞も含
み得る。

【００４３】本発明は、ＣＣＶスパイク蛋白質の免疫学
的特性を表わす精製ポリペプチド（即ち、ポリペプチド
は、ＣＣＶスパイク蛋白質の１種以上の免疫原性抗原決
定基を有し、本質的に、通常該ポリペプチドと結合して
いるウイルス全体または他の蛋白質を含まない。）の製
造法も提供する。

【００４４】特に本発明は、SEQ ID No：２、４若しく
は６に示されているアミノ酸配列の少なくとも１部また
はその機能性変異体を含むポリペプチドの製造法を提供
する。

【００４５】さらに、ＣＣＶ感染に対するイヌの免疫感
作または診断目的に使用し得る、ＣＣＶスパイク蛋白質
の免疫原性フラグメントを実質的に含むポリペプチド
を、本発明により製造する。アミノ酸配列内のこのよう
に使用可能な免疫原性フラグメントを検出するために
は、種々の方法が公知である。

【００４６】エピトープを含む本発明のポリペプチドの
好適な免疫化学的に活性なポリペプチドフラグメント
は、特許出願WO86/06487号、Geysen,H.M.ら（Prod.Nat
l.Acad．Sci.81，3998〜4002，1984）、所謂pepscan法
をベースとするGeysen,H.M.ら（J.Immunol．Meth．10
2，259〜274，1987）中に記載された方法により見いだ
すことが可能であり、この方法では、興味の完全ポリペ
プチドの部分配列に対応する部分的に重なる一連のペプ
チドが合成され、それらと抗体との反応活性が研究され
る。

【００４７】さらに記載のアミノ酸配列を備えたポリペ
プチドの多くの領域は、理論的な考察及び今日公知のエ
ピトープと構造的に一致することに基づいてエピトープ
を設計し得る。これらの領域は、Hopp及びWoods（Pro
c．Natl．Acad．Sci．78，3824〜3828，1981）による親
水性の規準と、Chou及びFasman（Advances in Enzymolo
gy 47，45〜148，1987）による２次構造予測との組み合
わせをベースとして決定される。

【００４８】必要なＴ-細胞エピトープは、さらに、例
えばBerzofskyの両親媒性（amphiphilicity）規準によ
り、同様に理論的な根拠に基づいて誘導し得る（Scienc
e 235，1059〜62，1987）。

【００４９】本発明のもう一つの実施態様に於いては、
上述の核酸配列によりコードされたアミノ酸配列を有す
るポリペプチドを使用する。

【００５０】ＣＣＶ感染に対するイヌの免疫感作は、上
述の本発明により製造したポリペプチドを、所謂サブユ
ニットワクチンとして免疫学的に適切な情況下で動物に
投与して実施する。本発明のサブユニットワクチンは、
場合により医薬的に許容可能なキャリヤの存在下に、純
粋形のポリペプチドを含有していてもよい。ポリペプチ
ドは場合により、その融合産生物の精製に有用であり得
る関連のない蛋白質と共有結合し得る。これらの例とし
ては、β-ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロキモ
シン、血液凝固因子Ｘaなどが挙げられる。

【００５１】幾つかの場合、これらのポリペプチド自体
に対する中和抗体を生じさせる能力は低い。これらの免
疫原性を高めるために、小さなフラグメントをキャリヤ
分子に結合させるのが好ましい。この目的のために好適
なキャリヤは、巨大分子｛例えば、天然ポリマー［アオ
ガイ（key hole limpet）ヘモシアニン、アルブミン、
毒素のような蛋白質］、ポリアミノ酸のような合成ポリ
マー（ポリリシン、ポリアラニン）など｝またはサポニ
ンのような両親媒性化合物のミセルである。あるいはこ
れらのフラグメントは、これらのポリマー、好ましくは
直鎖状ポリマーとして提供され得る。

【００５２】このようなサブユニットワクチンに使用す
べきポリペプチドは、当業界で公知の方法、例えば、前
記ポリペプチドをＣＣＶから単離したり、組換えＤＮＡ
技術または化学合成によって製造し得る。

【００５３】所望により、ワクチンに使用すべきこれら
のポリペプチドは、in vitroまたはin vivoで、例えば
グリコシル化、アミド化、カルボキシル化またはリン酸
化により修飾し得る。

【００５４】サブユニットワクチンに対する代替ワクチ
ンは、生ベクターワクチンである。本発明の核酸配列
は、組換えＤＮＡ技術により微生物（例えば、バクテリ
アまたはウイルスなど）に、組換え微生物が複製でき、
これによって挿入した核酸配列によりコードされたポリ
ペプチドを発現させ且つ感染した宿主動物に免疫応答を
誘発し得るように導入し得る。

【００５５】本発明の好ましい実施態様は、組換えベク
ターウイルスで感染した宿主細胞または宿主動物中でＤ
ＮＡ配列を発現し得る、上述の異種核酸配列を含む組換
えベクターウイルスである。「異種」という用語は、本
発明の核酸配列が、ベクターウイルス中に天然に通常存
在しないということを表す。

【００５６】さらに、本発明は、核酸配列の発現により
ＣＣＶ蛋白質を産生し得る、組換えベクターウイルスで
感染した宿主細胞または培養細胞を包含する。

【００５７】例えば、in vivoでの相同的組換えの公知
方法を使用して、異種核酸配列、例えば本発明の核酸配
列をベクターウイルスのゲノムに導入し得る。

【００５８】第１に、ベクターゲノムの挿入領域、即ち
感染または複製に必要な機能のようなベクターの本質的
な機能を壊さずに異種配列の取り込みに使用し得る領域
に対応するＤＮＡフラグメントを、標準recＤＮＡ方法
によりクローニングベクターに挿入する。挿入領域は、
非常に多くの微生物に関して報告されている（例えば、
欧州特許第80,806号、同第110,385号、同第83,286号、
米国特許第4,769,330号及び同第4,722,848号など）。

【００５９】第２に、所望により、第１段階で得られた
組換えベクター分子中に存在する挿入領域に欠失を導入
し得る。これは、例えば好適なエンドヌクレアーゼIII
による消化または第１段階からの組換えベクター分子の
制限酵素処理により実施し得る。

【００６０】第３に、異種核酸配列を、第１段階の組換
えベクター分子中にある挿入領域に挿入するか、前記組
換えベクター分子から欠失されたＤＮＡの代わりに挿入
する。挿入領域ＤＮＡ配列は、ベクターゲノムと相同的
組換えが起きるように好適な長さのものであるべきであ
る。その後、好適な細胞を野生型ベクターウイルスで感
染させるか、好適なベクターＤＮＡ配列をフランキング
配置した挿入物を含む組換えベクター分子の存在下にベ
クターゲノムＤＮＡで形質転換し、これによって、組換
えベクター分子の対応する領域とベクターゲノムとの間
に組換えが起きる。これで組換えベクター子孫が培養細
胞中に産生し得、且つそれらについて（例えば、ハイブ
リダイゼーションにより）遺伝子型または表現型選択が
でき、異種核酸が同時に組み込まれた遺伝子によりコー
ドされた酵素活性を検出したり、または組換えベクター
により発現された抗原性異種ポリペプチドを免疫学的に
検出し得る。

【００６１】次に、この組換え微生物を、免疫感作のた
めにイヌに投与し、次いでしばらくの時間保持するか、
あるいは、接種動物体内で複製させ、本発明の挿入した
核酸配列によりコードされたポリペプチドをin vivoで
発現させて、接種動物の免疫系を刺激する。本発明の核
酸配列の取り込みに好適なベクターは、例えばポックス
ウイルス｛例えばワクシニアウイルス（欧州特許第110,
385号、同第83,286号、米国特許第4,769,330号及び同第
4,722,848号）、ヘルペスウイルス［ネコヘルペスウイ
ルス、（イヌ）アデノウイルス（WO 91/11525）または
インフルエンザウイルスなど］｝のウイルスまたはバク
テリア（E.Coliまたは特定のサルモネラ属など）から誘
導し得る。この種の組換え微生物を用いて、宿主中に合
成されたポリペプチドは、細胞表面抗原として露出され
得る。この関連に於いて、ＯＭＰ蛋白質または例えばE.
coliの線毛蛋白質または生物により認識されるシグナル
及びアンカー配列の合成物（synthetic provision）と
前記ポリペプチドとの融合が考えられ得る。前記免疫原
性ポリペプチドが、所望により大きな全体の一部として
免疫されるべき動物内で放出されることが可能である。
これらの総ての場合に於いて、１種以上の免疫原性産生
物が発現し得、種々の病原体及び/または所与の病原体
の種々の抗原に対する防御を生じる。

【００６２】本発明のワクチンは、本発明の核酸配列を
含む組換えベクターウイルスで感染した宿主細胞を培養
し、その後、ウイルスを含む細胞及び/または細胞内で
増殖した組換えベクターウイルスを場合により精製形で
収集し、場合により凍結乾燥形でワクチンに形成するこ
とにより製造し得る。

【００６３】本発明の組換えベクター分子で形質転換し
た宿主細胞は、前記核酸配列によりコードされたポリペ
プチドの発現に好ましい条件下でも培養し得る。粗培養
物のサンプル、宿主細胞溶解物または宿主細胞抽出物を
使用してワクチンを製造し得るが、もう一つの実施態様
に於いては本発明のより精製したポリペプチドを、その
使用目的に応じてワクチンに製造し得る。産生したポリ
ペプチドを精製するために、本発明の組換えベクターで
形質転換した宿主細胞を好適な容量で培養し、産生した
ポリペプチドをこのような細胞から、または、蛋白質が
分泌されるならば培地から単離する。培地に分泌された
ポリペプチドは、標準方法（塩分画、遠心分離、限外濾
過、クロマトグラフィー、ゲル濾過または免疫アフィニ
ティークロマトグラフィー）により単離且つ精製し、一
方、細胞内ポリペプチドは、まず前記細胞を収集し、例
えば、超音波処理または他の機械的な破壊手段（例え
ば、フレンチプレス）により細胞を破砕し、次いで他の
細胞内成分から該ポリペプチドを分離することにより単
離し、ポリペプチドをワクチンに製造する。細胞の破砕
は、化学的（例えばEDTA処理など）または酵素的手段
（例えば、リゾチーム消化など）によっても実施し得
る。

【００６４】本発明のワクチンは、慣用の活性免疫感作
方法：投与処方物と適合する方法で一回または繰り返し
投与したり、予防的及び/または治療的に有効で且つ免
疫原性であるような量、即ち、病毒性ＣＣＶによる抗原
投与に対しイヌに免疫を誘導する、抗原または前記抗原
を発現し得る組換え微生物を免疫感作する量で投与し得
る。免疫とは、ワクチン投与後、ワクチンを投与しなか
った群と比較して、イヌの集団への有意レベルの防御の
導入として定義される。

【００６５】生ウイルスベクターワクチンに関しては、
イヌ１匹当たりの用量は、10⁵〜10⁸pfuであり得る。

【００６６】本発明の典型的なサブユニットワクチン
は、本発明のポリペプチド10μg〜１mgを含有する。

【００６７】ワクチンの投与は、皮内、皮下、筋肉内、
腹腔内、静脈内、経口または鼻腔内で実施し得る。

【００６８】さらにこのワクチンは、懸濁液を含む水性
媒体または水も含んでいてもよく、活性を高めたり及び
/または貯蔵期間を延ばすために他の構成成分と混合す
ることもできる。これらの構成成分は、塩、pH緩衝液、
安定剤（例えば、スキムミルクまたはカゼイン加水分解
物など）、免疫応答を促進するための乳化剤アジュバン
ト（例えば、オイル、ムラミルジペプチド、水酸化アル
ミニウム、サポニン、ポリアニオン及び両性物質など）
及び防腐剤であってもよい。

【００６９】本発明のワクチンは、イヌの他の病原体に
関する免疫原も含んでいてもよく、または多価ワクチン
を製造するために、イヌパルボウイルス（CPV）、イヌ
ジステンパーウイルス、イヌアデノウイルスＩ、イヌア
デノウイルスII、イヌパラインフルエンザウイルス、イ
ヌロタウイルスまたはレプトスピラ・カニコーラのウイ
ルス抗原のようなこれらの免疫原をコードする核酸配列
を含んでいてもよい。

【００７０】

【実施例】

実施例１Ａ．１．CCV-6及びLiverpool C54株のゲノムウイルスＲＮＡ
の調製最小イーグル培地（MEM）のWellcome改良物及び10%ウシ
胎児血清を使用してプラスチック製組織培養フラスコ内
で増殖させた融合性A-72細胞をCCV（NationalVeterinar
y Service Laboratory，PO BOX 844，Ames，Iowa 5001
0，USAからのNVSLチャレンジウイルスCCV-6）で、約0.1
の感染多重度（MOI）で感染させた。24時間後、培養物
の上清を回収し、４℃に冷却し、細胞破片を遠心分離
（3000xg，15分）して除去した。ウイルスを、上清から
Beckman型19ローターでペレット化（53,000xg，２時
間）した。ペレットを、Dounceホモジナイザーを使用し
てTNE（10mM Tris-Cl，100mM NaCl，１mM EDTA，pH7.
5）５mlに再懸濁させ、次いでTNE中20〜60%蔗糖直線密
度勾配32ml上に重層した。ウイルスは、Beckman SW28ロ
ーター中遠心分離（100,000xg，一晩）して等密度的に
バンドを形成した。勾配液を分画し、画分のＡ₂₈₀及び
密度を測定した。特徴的密度1.18g/ccにピークを識別し
た。このピーク画分をプールし、TNEで希釈し、推定上
のウイルスをBeckman SW28ローターで遠心分離（100,00
0xg，２時間）してペレット化した。ＲＮＡを、以下の
２つの方法を用いてウイルスペレットから単離した。

【００７１】（Ａ．）ペレットを0.1%SDSを含む0.1M Tr
is-Cl pH8.0に再懸濁させ、プロテアーゼＫ20μg/mlで5
0℃、３時間消化させた。混合物を、TE（10mM Tris-Cl
１mM EDTA）で飽和させたフェノール：クロロホルム：
イソアミルアルコール（50：49：１）により除蛋白し、
核酸を2.5容量のエタノール/0.3Ｍ酢酸ナトリウム（pH
5.2）で沈澱させて回収した。この調製物を0.1%SDSを含
むTris-ホウ酸塩 EDTA１%アガロースゲル上で分析し、
高分子量ＲＮＡバンドを、コロナウイルスゲノムＲＮＡ
の特徴的移動度により識別した。

【００７２】（Ｂ．）ウイルスペレットを、6M グアニ
ジニウムイソチオシアネート/５ｍＭクエン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７．０）/0.1M メルカプトエタノール/0.5% N-
ラウロイルザルコシネートに均一化させ、各ホモジネー
ト2.5mlにCsCl１g/mlを添加した。混合物を、5.7M CsCl
/0.1M EDTAパッド上に重層し、20℃で遠心分離（108,00
0xg，12時間）した。ＲＮＡペレットを0.1%SDSを含むTE
に溶解させた。この調製物を上述の如く分析した。

【００７３】２．CCVゲノムＲＮＡのｃＤＮＡクローニ
ング１Ａに記載の如く調製したCCVゲノムＲＮＡ２μgからの
第１のストランド合成物を、20mM Tris-Cl（pH8.3，42
℃）、0.14M KCl、10mM MgCl₂、１mM dNTP's、４mM ジ
チオスレイトール、ヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤 2
5ユニットを含む反応容量25μl中、AMV逆転写酵素40ユ
ニットを使用して、特異的オリゴヌクレオチド（５’Ｔ
ＴＴＴＣＡＡＡＴＴＧＴＣＴＴＣＴＡＣＴＴ３’）１ng
に組み込んだ。反応混合物を42℃で１時間インキュベー
トした。第２のストランド合成は、7.6mM MgCl₂、0.109
M Tris-Cl pH7.4、16.3mM （NH₄）₂SO₄、1000ユニット/
ml RNaseH、10,000ユニット/ml E.coli ＤＮＡポリメラ
ーゼ１を含む反応混合物46μlを第１のストランド反応
物に添加し、12℃で１時間インキュベートし、次いでさ
らに22℃で１時間インキュベートすることにより実施し
た。反応生成物を、TEで飽和させたフェノール：クロロ
ホルム：イソアミルアルコール（50:49：1）で２回抽出
して除蛋白し、２容量のエタノール/0.3Ｍ酢酸ナトリウ
ムpH5.2で沈澱させた。ｃＤＮＡに、緩衝液及び製造業
者（Bethesda Research Laboratories，Gaithersburg，
Maryland 20877，USA）により供給された条件を使用し
て末端デオキシヌクレオチジル転移酵素を用いてＣ残基
をテイリングした。２mlセファクリルＳ-1000カラム上
でサイズ分画し、500塩基以上の大きさのｃＤＮＡをプ
ールし、エタノール沈澱させ、TEに溶解させた。このｃ
ＤＮＡ50ngを、dG-テイル化PstＩ切断pUC119 250ngでア
ニールした。混合物をE.coli TG-1に形質転換させた。
アンピシリン耐性形質転換体を取り出し、CCVゲノムＲ
ＮＡからの逆転写物をランダムプライマー処理すること
により調製したｃＤＮＡプローブを用いて、CCVｃＤＮ
Ａ挿入物をスクリーニングした。陽性コロニーを、mini
-prepＤＮＡのPstＩ消化によりｃＤＮＡ挿入物のサイズ
をもとにスクリーニングした。挿入物間の関係を、制限
酵素分析により決定した。クローンpBH１を配列分析用
に選択した。pBH１挿入物（4.0kb）のサイズは、完全Ｃ
ＣＶスパイクコード領域をカバーするのには不十分であ
ったので、ｃＤＮＡ合成及びクローニングをさらにもう
１回、別の特異的なプライマー（５’ＣＴＡＧＧＴＡＧ
ＴＡＡＣＡＣ３’）を使用して実施した。使用したＲ
ＮＡを１Ｂの記載通りに単離した。ｃＤＮＡ合成は、製
造業者の説明に従ってBoehringer Mannheim（Boehringe
r Mannheim UK，Bell Lane，Lewes，East Sussex BN7 1
LG）ｃＤＮＡ合成キットを使用して実施した。概略する
と、第１のストランド合成をＡＭＶ逆転写酵素を使用し
て、第２のストランド合成をE.coli ＤＮＡポリメラー
ゼ１及びRNaseHの作用を使用して実施した。ｃＤＮＡ
を、T4 ＤＮＡポリメラーゼの作用により平滑末端化と
した。ｃＤＮＡを、T4 ＤＮＡリガーゼを使用してSmaI-
切断ホスファターゼ処理pUC18に連結し、ＤＮＡをE.col
i TG1中に形質転換した。アンピシリン耐性クローンを
最初にＸ-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-
ガラクトピラノシド）プレート上でブルー/ホワイト選
択を使用して挿入物をスクリーニングした。白いコロニ
ーを拾い出し、上述の通りCCV ｃＤＮＡ挿入物の存在を
スクリーニングした。クローンpBH2（サイズ2.8kb）を
配列分析用に選択した。CCV株CCV6に関する実施例１.
１.Ｂ及び１.２.に概略されたのと同一方法を、CCVC54
株のスパイク遺伝子の単離のために実施した。３つの重
複するクローン、pBH3、pBH4及びpBH11はその平滑末端
にスパイク遺伝子をカバーしていた。

【００７４】３．ＤＮＡ配列決定クローンpBH1、pBH2、pBH3、pBH4及びpBH11からのｃＤ
ＮＡ挿入物を、サンガーのジデオキシ鎖終止方法を使用
して配列決定した。このショットガン法に補足して、必
要により二重鎖プラスミドＤＮＡ鋳型上の特異的オリゴ
ヌクレオチドプライマーからの配列決定を行った。ショ
ットガン分析するためには、挿入物ＤＮＡをベクター配
列から切り出し、環状化し、超音波処理し、アガロース
ゲル上でサイズ選択し、SmaI-切断ホスファターゼ処理M
13mp8にクローン化する。ショットガン配列データを、S
tadenのDBUTIL及びDBAUTOプログラムを使用して整理
し、StadenのANALSEQ/NIPパッケージを使用して解析し
た。VAX 8350及びマイクロVAX3100（Digital Equipment
Corporation）を使用した。配列データを、SEQ ID N
O：１及び５に示した。

【００７５】Ｂ．１．Insavc-１株のゲノムウイルスＲＮＡの調製最小イーグル培地（MEM）のWellcome改良物及び10%F.C.
S.を使用して、プラスチック製培養フラスコ内で増殖さ
せた融合性A-72細胞を、約0.1の感染多重度m.o.i.でCCV
株Insavc-1（Bert）（intervet Labs.）で感染させた。
48時間後、培養上清を回収し、４℃に冷却し、細胞破片
を遠心分離（3000xg，15分）して除去した。ウイルス
を、Beckman型19ローターで上清からペレット化（53000
xg，２時間）した。ウイルスペレットを、6M グアニジ
ニウムイソチオシアネート/５mMクエン酸ナトリウム（p
H7.0）、0.1M メルカプトエタノール、0.5% N-ラウロイ
ルザルコシネート3.5ml中でホモジナイズした。

【００７６】ホモジネートを5.7M CsClパッド（１ml）
上に重層し、18℃で遠心分離（108000g，18時間）し
た。ＲＮＡペレットを0.1%SDSを含むTEに溶解させ、2.5
容量のエタノール/0.3M NaOAc（pH5.2）で２回沈澱させ
た。この調製物を、0.1%SDSを含むTris-ホウ酸塩EDTA１
%アガロースゲル上で分析し、高分子量ＲＮＡバンドを
コロナウイルスゲノムＲＮＡの特徴的移動度で識別し
た。

【００７７】２．CCVゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ及びPCRク
ローニング上記の如く調製したCCVゲノムＲＮＡ２μgからの第１及
び第２のストランド合成物を、製造業者の説明書により
特定された条件下にBoehringerｃＤＮＡ合成キットのオ
リゴｄＴ及びランダムペンタヌクレオチドを用いてプラ
イマー処理した。

【００７８】この反応から得られた平滑末端化ｃＤＮＡ
をT4 ＤＮＡリガーゼを使用してＳma1-切断ホスファタ
ーゼ処理pUC119に連結し、ＤＮＡをE.coli TG-1に形質
転換した。アンピシリン耐性クローンを、x-gal（5-ブ
ロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシ
ド）プレート上でブルー/ホワイト選択を用いて挿入物
についてまずスクリーニングした。白いコロニーを拾い
だし、プローブとしてランダムプライマー処理CCV ＲＮ
Ａを使用してCCVｃＤＮＡ挿入物の存在をスクリーニン
グした。５つの陽性クローンを識別した。

【００７９】ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して
プラスミドpBH6を調製した。pBH5及びpBH7の末端の配列
情報により、プライマーBH7及びBH8の設計が可能であっ
た。クローニングを助長するために、Not１部位をオリ
ゴ体に取り込んだ。上述の如く第１のストランド反応物
約１ngを、TEで飽和させたフェノール：クロロホルム：
イソアミルアルコール（50:49:1）で２回抽出すること
により除蛋白し、G50スピンカラムを通し、２容量のエ
タノール/0.3M 酢酸ナトリウム（pH5.2）で沈澱させ
た。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを、TE 15μlに再懸濁
させた。PCR反応を、Techne programmable Dri-Block P
HC-１で実施した。

【００８０】生成したフラグメントを、前述の如くフェ
ノール/クロロホルム/エタノールで沈澱させ、TE 20μl
に再懸濁させた。ＤＮＡを、酵素製造業者により推奨さ
れた条件下でNot１で切断し、ゲル溶離した。Not１フラ
グメントを、T4 ＤＮＡリガーゼを用いてNot１切断ホス
ファターゼ処理ベクターと連結し、ＤＮＡをE.coliTG-1
中に形質転換した。挿入物を含むクローンを、上述の如
く識別した。

【００８１】３．ＤＮＡ配列決定 pBH5、pBH7、pBH8、pBH9、pBH10及びPCR挿入物pBH6から
のｃＤＮＡ挿入物を、Barrell及びBankier（Methods in
Enzymology 155，51〜93，1987）に記載のサンガーの
ジデオキシ鎖終止法を使用して配列決定した。このショ
ットガン方法に補足して、必要により二重鎖または一重
鎖（pUC119中のf1起源）プラスミドＤＮＡ上の特異的オ
リゴヌクレオチドプライマーからの配列決定を行った。

【００８２】ショットガン分析を実施するために、挿入
ＤＮＡをベクター配列から切り出し、自己連結し、超音
波処理し、末端を修復し、１%アガロースゲル上でサイ
ズ選択し、SmaＩ切断ホスファターゼ処理M13mp18中にク
ローン化した。ショットガン配列データを整理し、Stan
denのSAPプログラムを使用して解析した。Vax 8350及び
MicroVax 3100（Digital Equipment Corporations）を
使用した。配列データをSEQ ID NO：３に示した。

【００８３】実施例２２．１．ワクシニアウイルスVac4b-C6の製造２．１．１．CCV6完全長スパイク蛋白質遺伝子の組み立
て CCV6のＳ遺伝子の完全長コード領域を、２つの重複ｃＤ
ＮＡクローン、BH1及びBH2から再構築した。クローニン
グ方法を図１に示した。pBH1からの3.0kb挿入物は、Ｓ
及び１bを有している。Ｓを発現するために、ポリメラ
ーゼコード配列を除去すべきであった。開始メチオニン
の直接的５’配列、ＣＴＡＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＡＴＣ
ＡＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧを特定部位
の突然変異誘発により改変した。４つの塩基、ＡＴＣＣ
をＴＧＧとＴＴＡ塩基の間でループ形成し、たった一つ
のBamHIサイト、ＧＧＡＴＣＣを作成した。変異株を制
限酵素消化によりスクリーニングした。突然変異誘発反
応に於いて使用したE.coliＤＮＡポリメラーゼのクレノ
ウフラグメントは、非常に低い頻度で非特異的な変異を
導入し得るので、陽性のクローンをこのサイトにわたっ
て配列決定した。導入したBamHIサイトを有する変異株
を選択し、pBHI-bamを設計した。このプラスミドは、約
300bpだけpBH2と重複していた。たった一つのAflIIサイ
トをこの重複領域に配置した。1.5kb AflII-SphIフラグ
メントとして近位のＳコード配列をpBH1-bamから単離
し、AflII-SphIで消化したpBH2と連結してpCCV6を作成
した。完全長Ｓコード配列を、4.4kb BamHＩフラグメン
トとして単離し、トランスファーベクターRK19のBamHＩ
サイトに連結してpRKCCV6を形成した。遺伝子の正しい
向きは、制限酵素消化により確認した。このようにして
プラスミドRKCCV6は、4bプロモーターの下流にCCV6 Ｓ
遺伝子を含み、TKコード配列がフランキング配置してい
る。

【００８４】２．１．２．組換えウイルスの単離組換えワクシニアウイルスを、確立された方法によって
構築した（Mackett＆Smith，J．Gen．Virol．67，2067
〜2082，1986）。pRKCCV6を、ワクシニアウイルスで感
染させた細胞に形質転換し、次いで組換えウイルスを、
プローブとしてランダムプライマー処理³²Ｐ標識CCV6ス
パイク遺伝子を使用して、ドット-ブロットハイブリダ
イゼーションにより識別した。プラークの精製及びスク
リーニングを３回繰り返して、貯蔵物を製造した。pRKC
CV6由来の組換体を、Vac4b-C6と名付けた。

【００８５】２．２．ワクシニアウイルスVac4b-INの製
造２．２．１．CCV Insavc-１完全長スパイク蛋白質遺伝
子の組み立て Insavc-1（Bert）Ｓ遺伝子を、３つの重複するｃＤＮＡ
クローンBH8、BH9及びBH10から組み立てた。クローニン
グ方法を、図２（ａ，ｂ）に示す。Ｓ遺伝子の中間部に
かけてpBH8をPvuII及びHindIIIで消化し、フラグメント
1.4kbを製造した。このフラグメントをPvuII-HindIIIで
切断したベクター、pING14.2に連結し、pINGMSを形成し
た。このプラスミドをHindIIIで直線化し、ホスファタ
ーゼ処理し、次いでゲル溶出した。pBH10からの1.1kb H
indIIIフラグメントとして単離した３’Ｓ遺伝子コード
配列を、HindIIIで切断したpINGMSにサブクローン化し
てpINGGM'3を製造した。クローンしたHindIIIフラグメ
ントの正しい方向を、制限酵素消化により確認した。残
りのコード配列をpBH9から切り出す前に、たった一つの
BamHIサイトを、特定部位の突然変異誘発によりペプロ
マーAUG開始コドンの10bps上流に導入した（図２）。Ｓ
遺伝子の５’コード配列を1.9kb PvuIIフラグメントと
して単離し、pING３’Ｓからの2.5kb PvuII部分-EcoRI
フラグメントとして単離した残りのＳ遺伝子コード配列
を、２フラグメント連結して、BamHI-EcoRI消化pUC118
に連結した。完全Ｓ蛋白質遺伝子コード配列を、4.4kb
BamHIフラグメントとして単離し、BamHI切断トランスフ
ァーベクターpRK19にサブクローンしてpRKINSAVC-1を製
造する。この遺伝子の正しい向きを、制限酵素消化によ
り確認した。このようにしてプラスミドRKINSAVC-１
は、ワクシニア４bプロモーターの下流にCCV-INSAVC-１
Ｓ遺伝子を含み、TKコード配列がフランキング配置して
いる。

【００８６】２．２．２．組換えワクシニアウイルスの
単離プラスミドRKINSAVC-１を使用してＳ遺伝子コード配列
を、トランスフェクションによりワクシニアウイルスに
導入し、TK^-組換体をMackett及びSmithの記載通りに選
択した（1986，上掲）。³²Ｐ標識CCV6 ＳＤＮＡプロー
ブを用いるドットブロットハイブリダイゼーションによ
り識別した組換えウイルス単離体を、３回のプラーク精
製にかけ、ウイルス貯蔵物を製造した。RKINSAVC-１か
ら誘導した組換体をVac4b-INと名付けた。

【００８７】２．３．ワクシニアウイルスVac4b-C54の
製造２．３．１．CCV C54完全長Ｓ蛋白質遺伝子の組み立て C54 Ｓ遺伝子配列を、３つの重複するクローンpBH3、pB
H4及びpBH11から組み立てた。たった一つのBamHＩサイ
トを、近位のクローンpBH3中の特定部位突然変異誘発に
よりペプロマーAUG開始コドンの10bps上流に形成してpB
H-bamを製造した（図３）。2.0kb AflII−EcoRIフラグ
メントをこのプラスミドから単離し、AflII-EcoRI消化p
BH4に連結してpBH5'MSを製造した。このプラスミドをHi
ndIIIで切断しホスファターゼ処理してゲル溶離した。
３’コード配列を、pBH11からの1.1kb HindIIIフラグメ
ントとして切り出し、HindIII消化pBH5'MSに連結してpH
C54を製造した。サブクローン化したHindIIIフラグメン
トの正しい向きを、制限酵素消化により決定した。完全
長C54 Ｓ遺伝子をBamHＩで消化することによりpBHC54か
ら分離し、BamHＩ切断トランスファーベクターRK19に連
結してpRKC54を製造した。同様に、Ｓ遺伝子の向きを、
制限酵素消化により決定した。このようにしてプラスミ
ドRKC54は、４bプロモーターの下流にCCV C54 Ｓ遺伝子
を含み、TKコード配列がフランキング配置されている。
クローニング方法を図３に示す。

【００８８】２．３．２．組換えワクシニアウイルスの
単離プラスミドRKC54をワクシニアウイルスで感染させた細
胞にトランスフェクトした。TK^-組換体をBUdRを使用し
て選択した（Mackett及びSmith，1986,上掲）。組換え
ウイルス単離体を、ドットブロットハイブリダイゼーシ
ョンで識別し、３回のプラーク精製にかけて貯蔵物を製
造した。pRKC54から誘導した組換体を、Vac4b-C54と名
付けた。

【００８９】実施例３生組換えワクシニアワクチンでの免疫感作実験３．１．免疫感作ネコに以下のワクチンを接種した（10⁷pfu/ネコ）：（ａ）４匹のネコ−Vac4b-IN （ｂ）４匹のネコ−Vac4b-C6 （ｃ）２匹のネコ−Vac4b-gB （Vac4b-gBは、４bプロモーターの制御下でサイトメガ
ロウイルス糖蛋白質ｇＢを発現する組換えワクシニアウ
イルスである）（ｄ）２匹のネコ−未接種ワクチン接種前に総てのネコから採血した（採血Ａ）。
接種３週間後、ネコから再び採血（採血Ｂ）し、続いて
上述の如く再びワクチン接種した。

【００９０】再接種２週間後、総てのネコから採血した
（採血Ｃ）。

【００９１】３．２．免疫沈降法イヌA72細胞を、組換えウイルスで約10の感染多重度m.
o.i.で感染させるか、またはmock-感染させ、16時間イ
ンキュベートし、１時間メチオニンを涸渇させた。感染
した細胞を³⁵Ｓメチオニンで標識し、30分間インキュベ
ートし、洗浄し、続いてR.1.P.A.緩衝液中で溶解した。
１μlネコ抗血清（採血Ｃ）を放射標識した溶解物に添
加し、氷上で60分間インキュベートした。プロテインＧ
を添加し、氷上で60分間インキュベートした。プロテイ
ンＧをR.1.P.A.緩衝液及びPBS緩衝液中で洗浄後、結合
蛋白質を2% SDS 2% 2-メルカプトエタノールを用いて回
収した。この蛋白質を10% SDS ポリアクリルアミドゲル
上で分離した。

【００９２】Vac4b-C6及びVac4b-INを与えたネコの場
合、採血Ｃからの血清はスパイク蛋白質を沈降させた。
このように、スパイク遺伝子を含むワクシニア組換えウ
イルスで免疫感作したネコは、スパイク遺伝子に対する
抗体と反応した。

【００９３】配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名前：AKZO N.V．（Ｂ）ストリート：Velperweg 76 （Ｃ）シティ：Arnhem （Ｅ）国：オランダ（Ｆ）郵便番号：6824 BM （ii）発明の名称：イヌコロナウイルスサブユニットワ
クチン（iii）配列数：６（ｖ）コンピューター読取可能な形：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：IBM PC コンパティブル（Ｃ）操作システム：PC-DOS/MS-DOS （Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release ＃1.0，Versio
n ＃1.25 （vii）先願データ：（Ａ）出願番号：EP 91.303.737.0 （Ｂ）出願日：1991年４月25日（Ｃ）分類：（２）SEQ ID NO:1の情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：4500塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ｃＤＮＡ（vi）起源：（Ａ）生物名：イヌコロナウイルス（Ｂ）株名：CCV-6 （ix）特徴：（Ａ）名前/記号：ＣＤＳ（Ｂ）ロケーション：65..4393 （Ｄ）他の情報：／ラベル＝CCV6 スパイク遺伝子（xi）配列：SEQ ID NO:1：

【００９４】

【化１】

【００９５】

【化２】

【００９６】

【化３】

【００９７】

【化４】

【００９８】

【化５】

【００９９】

【化６】

【０１００】

【化７】

【０１０１】

【化８】

【０１０２】

【化９】

【０１０３】

【化１０】

【０１０４】

【化１１】

【０１０５】

【化１２】

【０１０６】

【化１３】

【０１０７】（２）SEQ ID NO:２の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1443アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：蛋白質（vi）起源：（Ａ）生物名：イヌコロナウイルス（Ｂ）株名：CCV-6 （ix）特徴：（Ａ）名前/記号：蛋白質（Ｂ）ロケーション：1..1443 （Ｄ）他の情報：／ラベル＝CCV6 スパイク（xi）配列：SEQ ID NO:２：

【０１０８】

【化１４】

【０１０９】

【化１５】

【０１１０】

【化１６】

【０１１１】

【化１７】

【０１１２】

【化１８】

【０１１３】

【化１９】

【０１１４】

【化２０】

【０１１５】

【化２１】

【０１１６】

【化２２】

【０１１７】

【化２３】

【０１１８】（２）SEQ ID NO:３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：4429塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ｃＤＮＡ（vi）起源：（Ａ）生物名：イヌコロナウイルス（Ｂ）株名：ＣＣＶInSAVC-1 （ix）特徴：（Ａ）名前/記号：ＣＤＳ（Ｂ）ロケーション：60..4412 （Ｄ）他の情報：／ラベル＝CCVInSAVC-1 スパイク遺
伝子（xi）配列：SEQ ID NO:３：

【０１１９】

【化２４】

【０１２０】

【化２５】

【０１２１】

【化２６】

【０１２２】

【化２７】

【０１２３】

【化２８】

【０１２４】

【化２９】

【０１２５】

【化３０】

【０１２６】

【化３１】

【０１２７】

【化３２】

【０１２８】

【化３３】

【０１２９】

【化３４】

【０１３０】

【化３５】

【０１３１】

【化３６】

【０１３２】

【化３７】

【０１３３】（２）SEQ ID NO:４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1451アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：蛋白質（vi）起源：（Ａ）生物名：イヌコロナウイルス（Ｂ）株名：CCVInSAVC-1 （ix）特徴：（Ａ）名前/記号：蛋白質（Ｂ）ロケーション：１..1451 （Ｄ）他の情報：／ラベル＝CCVInSAVC-1 スパイク（xi）配列：SEQ ID NO:４：

【０１３４】

【化３８】

【０１３５】

【化３９】

【０１３６】

【化４０】

【０１３７】

【化４１】

【０１３８】

【化４２】

【０１３９】

【化４３】

【０１４０】

【化４４】

【０１４１】

【化４５】

【０１４２】

【化４６】

【０１４３】

【化４７】

【０１４４】

【化４８】

【０１４５】（２）SEQ ID NO:５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：4435塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ｃＤＮＡ（vi）起源：（Ａ）生物名：イヌコロナウイルス（Ｂ）株名：CCV-V54 （ix）特徴：（Ａ）名前/記号：ＣＤＳ（Ｂ）ロケーション：60..4418 （Ｄ）他の情報：／ラベル＝CCV-C54 スパイク遺伝子（xi）配列：SEQ ID NO:５：

【０１４６】

【化４９】

【０１４７】

【化５０】

【０１４８】

【化５１】

【０１４９】

【化５２】

【０１５０】

【化５３】

【０１５１】

【化５４】

【０１５２】

【化５５】

【０１５３】

【化５６】

【０１５４】

【化５７】

【０１５５】

【化５８】

【０１５６】

【化５９】

【０１５７】

【化６０】

【０１５８】

【化６１】

【０１５９】

【化６２】

【０１６０】（２）SEQ ID NO:６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1453アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：蛋白質（vi）起源：（Ａ）生物名：イヌコロナウイルス（Ｂ）株名：CCV-V54 （ix）特徴：（Ａ）名前/記号：蛋白質（Ｂ）ロケーション：１..1453 （Ｄ）他の情報：／ラベル＝CCV-C54 スパイク（xi）配列：SEQ ID NO:６：

【０１６１】

【化６３】

【０１６２】

【化６４】

【０１６３】

【化６５】

【０１６４】

【化６６】

【０１６５】

【化６７】

【０１６６】

【化６８】

【０１６７】

【化６９】

【０１６８】

【化７０】

【０１６９】

【化７１】

【０１７０】

【化７２】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、プラスミドpBH1及びpBH2からのpRKC
CV6を構築するためのクローニング方法を示す。

【図２】図２ａは、プラスミドpBH8及びpBH10からの
プラスミドpINGM3'Sを構築するためのクローニング方法
を示す。

【図３】図２ｂは、プラスミドpINGM3'S及びpBH9から
のプラスミドpRKINSAVC-1を構築するためのクローニン
グ方法を示す。

【図４】図３は、プラスミドpBH3、pBH4及びpBH11か
らのプラスミドpRKC54を構築するためのクローニング方
法を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ブライアン・コリン・ホースバーグイギリス国、ケンブリツジ・シー・ビイ・３・９・イー・ブイ、シルバー・ストリート、ダーウイン・カレツジ気付 (56)参考文献特開昭63−316739（ＪＰ，Ａ) ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ（1987）Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．４，ｐ. 363−371 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/165 C12N 5/10 C12P 21/00 - 21/02 C12N 7/00 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２、４及び６からなる群から選
択されたアミノ酸配列からなるイヌコロナウイルススパ
イクタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチ
ド。
【請求項２】配列番号１、３及び５からなる群から選
択された核酸配列であることを特徴とする、請求項１に
記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】請求項１または２に記載のポリヌクレオ
チドを含む組換えベクター分子。
【請求項４】ポリヌクレオチドが発現制御配列に作動
的に連結されていることを特徴とする、請求項３に記載
の組換えベクター分子。
【請求項５】請求項１または２に記載の外来核酸配列
を含有する組換えベクターウイルス分子。
【請求項６】請求項１または２に記載のポリヌクレオ
チドまたは請求項３または４に記載の組換えベクター分
子で形質転換したかまたは、請求項５に記載の組換えベ
クターウイルスに感染した宿主細胞。
【請求項７】（ａ）請求項６に記載の宿主細胞を核酸
配列が発現される条件下に培養し、（ｂ）培地からポリペプチドを単離する；ことを包含す
る、請求項１に記載のポリペプチドの製造方法。