JP3324611B2 - タウ蛋白質のリン酸化方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、タウ蛋白質、その部分
ペプチドまたはそれらに類似したペプチドをリン酸化酵
素を触媒としてリン酸化する方法に関するものであり、
タウ蛋白質のリン酸化を阻害または促進する薬剤の探索
に利用できる。

【０００２】

【従来の技術】アルツハイマー病は初老期（４５〜６５
才）に発病する進行性の痴呆で、病理学的にはその脳内
に多数の老人斑と神経原線維変化が認められる。６５才
以上の老年期に発症するいわゆる自然老化による老年痴
呆も、病理学的に何ら本質的な差は認められないので、
アルツハイマー型老年痴呆と呼ばれている。この疾患の
患者数は、高齢者人口の増加とともに増え、社会的に重
要な疾患となっている。しかしこの疾患の原因は諸説あ
るものの結果的にはまだ不明であり、早期解明が望まれ
ている。

【０００３】アルツハイマー病およびアルツハイマー型
老年痴呆に特徴的な二つの病理変化の出現量は、知能障
害の程度とよく相関することが知られている。そこで、
この二つの病理変化を生ずる不溶性の蓄積物質を分子レ
ベルで解明し、この疾患の病因に到達しようという研究
が１９８０年代の前半頃から行われてきた。この病理変
化の一つである神経原線維変化は、神経細胞内にＰＨＦ
（ペアード・ヘリカル・フィラメント：ｐａｉｒｅｄ
ｈｅｌｉｃａｌ ｆｉｌａｍｅｎｔ）と呼ばれる二重ら
せん状の繊維状物質が蓄積してくるものである。近年、
その構成成分として、脳に特異的な微小管付随タンパク
質の一種であるタウ蛋白質とユビキチンが同定された
（井原ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９９，１８０７−１
８１０（１９８６）；Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌら，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
３，４９１３−４９１７（１９８６））。このうちタウ
蛋白質（以下「タウ」と称することもある）は、通常Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量４８〜６
５Ｋに数本のバンドを形成する一群の近縁タンパク質
で、微小管の形成を推進することが知られている。さら
に、ＰＨＦ中に組み込まれたタウは、通常のタウより強
くリン酸化されていることが、ＰＨＦに対するポリクロ
ーナル抗体（抗ｐｔａｕ抗体：井原ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．，９９，１８０７−１８１０（１９８６））や、
タウに対するモノクローナル抗体（ｔａｕ−１抗体：Ｇ
ｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，４９１３−４９１７
（１９８６））を用いて証明された。

【０００４】本発明者らは、この異常なリン酸化を触媒
する酵素を単離し、タウプロテインキナーゼＩと命名し
た（内田ら，生化学，第６４巻，第５号，ｐ．３０８
（１９９２））。しかし、タウプロテインキナーゼＩの
一次構造は不明であり、またタウプロテインキナーゼＩ
の基質となりうる条件や、リン酸化の詳細については明
らかにされていないのが現状であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ＰＨＦ
の蓄積がアルツハイマー病脳でニューロンの変性、引き
続いて死を誘導しているものと考え、ＰＨＦの蓄積の原
因となるタウ蛋白の異常リン酸化に相当する反応を試験
管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で遂行する方法を明らかにす
ることによって、アルツハイマー病の治療および予防の
手段を得ようとするものであり、さらにはこうしたリン
酸化の異常に起因するその他の疾患の治療および予防の
手段を得ようとするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するためにＰＨＦに組み込まれているリン酸化タ
ウと同一のエピトープを持つリン酸化タウのリン酸化部
位を決定し、そのリン酸化を触媒するリン酸化酵素の構
造を明らかにすることによって、かかるリン酸化反応の
必要条件を解明し、本発明に到達した。

【０００７】即ち本発明の要旨は、下記理化学的性質を
有するリン酸化酵素Ｉの作用により、タウ蛋白質または
その部分ペプチドをリン酸化することを特徴とするタウ
蛋白質のリン酸化方法に存する。 （ａ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体として、タウ蛋白質
中のセリンおよびスレオニンをリン酸化し、タウ蛋白質
１分子あたり４残基以下のリン酸基を導入する。 （ｂ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中で、微小管付
随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２を特異的にリ
ン酸化する。ヒストンをリン酸化しない。α−カゼイン
を少しリン酸化する。 （ｃ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下での至適ｐＨは
６．５であり、チューブリン存在下での至適ｐＨは６．
０である。 （ｄ）作用適温：３７℃

【０００８】（ｅ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの
存在下でのゲル濾過により求めた測定値は約５万であ
り、塩化ナトリウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を
作り、そのゲル濾過による測定値は約１０万である。Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により求めた測
定値は約４万５千である。 （ｆ）安定性：２５％グリセロールと０．０２％ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート中、ｐＨ６．
５、温度−２０℃において少なくとも一年間安定であ
る。 （ｇ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ²⁺、カルモジュリンおよびリン脂
質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。 （ｈ）阻害：９０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌで活性が
半減する。

【０００９】以下、本発明につき詳細に説明する。本発
明で使用するリン酸化酵素Ｉ（以下、「タウプロテイン
キナーゼＩ」と略記する）は、例えばラットやウシ等の
哺乳動物の脳抽出液から温度依存性の重合、脱重合等に
より微小管タンパク質画分を得、フォスフォセルロース
カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過、ハイドロキシア
パタイトカラムクロマトグラフィー、Ｓ−セファロース
カラムクロマトグラフィー、ヘパリンカラムクロマトグ
ラフィー等の操作を組み合わせることによって精製する
ことができる（内田ら，生化学，第６４巻，第５号，
ｐ．３０８（１９９２））。精製されたタウプロテイン
キナーゼＩは、上記（ａ）〜（ｈ）に記載の理化学的性
質を有する。この精製蛋白の部分一次構造は、常法によ
りアミノ酸配列分析を行うことにより得ることができる
が、全一次構造は同蛋白のｃＤＮＡをクローニングする
ことにより知ることができる。ｃＤＮＡのクローニング
には、上記の部分一次構造の情報に基づく方法、同蛋白
に特異的な抗体を利用する方法、同蛋白に特異的な機能
や作用の検出を利用する方法等が応用できる。また、部
分アミノ酸配列に相当する合成ヌクレオチドオリゴマー
をプライマーとして、ラット等の脳のｍＲＮＡ画分から
遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）を用いてかかるタウプロテイ
ンキナーゼＩをコードするｍＲＮＡのみを増幅し、対応
するｃＤＮＡをクローニングしてもよい。

【００１０】かくして得られるラット由来のタウプロテ
インキナーゼＩの全一次構造は、例えば、配列表の配列
番号１に記載のアミノ酸配列で表される。なお、かかる
ラット由来のタウプロテインキナーゼＩの全一次構造
は、ＧＳＫ−３β（グリコーゲン シンターゼ キナー
ゼ ３β）として知られる酵素（Ｊ．Ｒ．Ｗｏｏｄｇｅ
ｔｔ，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，９（８），２４３１−
２４３８（１９９０））と一致することが確認された。

【００１１】タウプロテインキナーゼＩは、上記のよう
に哺乳動物の脳抽出液から精製することによって取得す
ることもできるが、より大量かつ安定して取得するため
には、クローニングにより得られたｃＤＮＡを適当なベ
クターに組み込み、そのベクターが作用しうる宿主にか
かるベクターを導入すればタウプロテインキナーゼＩの
産生細胞を作成することができ、その培養物から目的と
する蛋白を精製するのが好ましい。

【００１２】本発明において基質となるタウ蛋白質は、
哺乳動物の脳組織から、例えば井原らの方法（Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，８６，５８７−５９０（１９７９））や
Ｇｒｕｎｄｋｅ−Ｉｑｂａｌらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６１，６０８４─６０８９（１９８
６））に従って抽出、精製することができる。さらにそ
の全一次構造は、上記タウプロテインキナーゼＩと同様
の手法により決定することができる。かくして得られる
タウ蛋白質の全一次構造は、ヒト由来のものとして例え
ば配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される
もの等が挙げられる（Ｇｏｅｄｅｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，
４０５１−４０５５（１９８８））。

【００１３】脳組織から抽出精製したタウ蛋白質は既に
ある程度リン酸化されており、配列表の配列番号２に記
載のアミノ酸配列で１４４番目のセリンおよび／または
３１５番目のセリンが部分的にリン酸化されている（後
述の実施例１参照）。また、タウ蛋白質を下記の理化学
的性質を有する別種のリン酸化酵素ＩＩ（タウプロテイ
ンキナーゼＩＩ：内田ら，生化学，第６４巻，第５号，
ｐ．３０８（１９９２））で部分的にリン酸化すると、
上記の配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で１４
４番目のセリン、３１５番目のセリン以外にも、１４７
番目のスレオニンおよび／または１７７番目のセリンが
リン酸化される（内田ら，生化学，第６４巻，第５号，
ｐ．３０８（１９９２）；石黒ら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅ
ｎｃｅＬｅｔｔｅｒｓ，１２８，１９５（１９９
１））。

【００１４】（ｉ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体とし
て、タウ蛋白質中の、Ｃ末端側の隣にプロリンのあるセ
リンおよびスレオニンをリン酸化し、タウ蛋白質１分子
あたり４残基のリン酸基を導入する。 （ｊ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中で、微小管付
随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２を特異的にリ
ン酸化する。ヒストンＨ１とニューロフィラメントＨサ
ブユニットもリン酸化する。β−カゼインを少しリン酸
化する。 （ｋ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下での至適ｐＨは
６．５であり、チューブリン存在下での至適ｐＨは６．
０である。 （ｌ）作用適温：３７℃ （ｍ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下でのゲ
ル濾過により求めた測定値は約５万であり、塩化ナトリ
ウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を作り、そのゲル
濾過による測定値は約１０万である。ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により求めた測定値は約３万で
あり、その他に２．３万の蛋白質があり、この２種の蛋
白質が結合してゲル濾過では約５万になっている。 （ｎ）安定性：２５％グリセロールと０．０２％ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレート中、ｐＨ６．
５、温度−２０℃において少なくとも一年間安定であ
る。 （ｏ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ²⁺、カルモジュリンおよびリン脂
質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。 （ｐ）阻害：４０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌで活性が
半減する。

【００１５】これは、タウプロテインキナーゼＩＩがＳ
／Ｔ−Ｐ（セリン／スレオニン−プロリン）配列を認識
する酵素であり、プロリンのＮ末端側の隣位に位置する
セリンおよび／またはスレオニンを特異的にリン酸化す
る性質によるものである。ところが、こうして部分的に
リン酸化したタウ蛋白質は、前述の抗ｐｔａｕ抗体とは
反応しなかった。一方、上記のように脳組織から抽出、
精製されたタウ蛋白質をアルカリフォスファターゼで処
理することにより脱リン酸化してしまうと、本発明のリ
ン酸化反応は認められるほどには進行せず、これに対
し、脳組織から抽出、精製したタウ蛋白質またはタウプ
ロテインキナーゼＩＩを用いて部分的にリン酸化したタ
ウ蛋白質を基質とすると、本発明のリン酸化反応が進行
することが確認された（後述の実施例参照）。 以上の
事実から、タウ蛋白質のリン酸化反応は以下のような経
路で進行しているものと考えられた。

【００１６】

【化１】 本発明の基質としては、タウプロテインキナーゼＩの基
質となりうるタウ蛋白質またはその部分ペプチドであれ
ばいずれのものも使用できる。例えば、 一次構造が配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
列で表されるもの、 スプライシングを受けた一次構造が配列表の配列番
号２に記載のアミノ酸配列で表されるもの、 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の部分ペ
プチド 等が挙げられ、セリンおよび／またはスレオニンが部分
的に、より好ましくは１〜４残基リン酸化されているも
のが挙げられる。タウ蛋白質の具体例としては、Ｇｏｅ
ｄｅｒｔ ｅｔ ａｌ のＮｅｕｒｏｎ，３，５１９−
５２６（１９８９）に記載の３５２アミノ酸残基〜４４
１アミノ酸残基の一次構造を有するタウ蛋白質等が挙げ
られる。一次構造が配列表の配列番号２に記載のアミノ
酸配列で表されるタウ蛋白質を基質として使用した場
合、同配列１４１番目のセリン、１７３番目のスレオニ
ン、３０７番目のセリンおよび３２４番目のセリンから
選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸化される。従って本
発明で好ましく用いられるタウ蛋白質の部分ペプチドと
しては、配列表の配列番号３〜２９に記載のアミノ酸配
列を含有してなるものが好ましい。以下に好ましい基質
とそのリン酸化部位を示す。 ・配列表の配列番号３に
記載のアミノ酸配列を含有してなるペプチド４番目のセ
リン、７番目のスレオニン、３７番目のセリンおよび１
７５番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予め
リン酸化されており、１番目のセリン、３３番目のスレ
オニン、１６７番目のセリンおよび１８４番目のセリン
から選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸化される。

【００１７】・配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチド ４番目のセリン、７番目のスレオニン、３７番目のセリ
ンおよび１７５番目のセリンから選ばれる１以上のアミ
ノ酸が予めリン酸化されており、１番目のセリン、３３
番目のスレオニンおよび１６７番目のセリンから選ばれ
る１以上のアミノ酸がリン酸化される。

【００１８】・配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチド ４番目のセリン、７番目のスレオニンおよび３７番目の
セリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸化さ
れており、１番目のセリン、３３番目のスレオニンおよ
び１６７番目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸が
リン酸化される。 ・配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を含有して
なるペプチド ４番目のセリン、７番目のスレオニンおよび３７番目の
セリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸化さ
れており、１番目のセリンおよび／または３３番目のス
レオニンがリン酸化される。

【００１９】・配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチド ４番目のセリンおよび／または７番目のスレオニンが予
めリン酸化されており、１番目のセリンおよび／または
３３番目のスレオニンがリン酸化される。・配列表の配
列番号８に記載のアミノ酸配列を含有してなるペプチド
４番目のセリンおよび／または７番目のスレオニンが予
めリン酸化されており、１番目のセリンがリン酸化され
る。

【００２０】・配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配
列を含有してなるペプチド ４番目のセリンが予めリン酸化されており、１番目のセ
リンがリン酸化される。 ・配列表の配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含有し
てなるペプチド １番目のセリン、４番目のスレオニン、３４番目のセリ
ンおよび１７２番目のセリンから選ばれる１以上のアミ
ノ酸が予めリン酸化されており、３０番目のスレオニ
ン、１６４番目のセリンおよび１８１番目のセリンから
選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸化される。

【００２１】・配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸
配列を含有してなるペプチド １番目のセリン、４番目のスレオニン、３４番目のセリ
ンおよび１７２番目のセリンから選ばれる１以上のアミ
ノ酸が予めリン酸化されており、３０番目のスレオニン
および／または１６４番目のセリンがリン酸化される。 ・配列表の配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含有し
てなるペプチド １番目のセリン、４番目のスレオニンおよび３４番目の
セリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸化さ
れており、３０番目のスレオニンおよび／または１６４
番目のセリンがリン酸化される。

【００２２】・配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸
配列を含有してなるペプチド １番目のセリン、４番目のスレオニンおよび３４番目の
セリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸化さ
れており、３０番目のスレオニンがリン酸化される。 ・配列表の配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含有し
てなるペプチド １番目のセリンおよび／または４番目のスレオニンが予
めリン酸化されており、３０番目のスレオニンがリン酸
化される。

【００２３】・配列表の配列番号１５に記載のアミノ酸
配列を含有してなるペプチド １番目のスレオニン、３１番目のセリンおよび１６９番
目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸
化されており、２７番目のスレオニン、１６１番目のセ
リンおよび１７８番目のセリンから選ばれる１以上のア
ミノ酸がリン酸化される。

【００２４】・配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸
配列を含有してなるペプチド １番目のスレオニン、３１番目のセリンおよび１６９番
目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸が予めリン酸
化されており、２７番目のスレオニンおよび／または１
６１番目のセリンがリン酸化される。 ・配列表の配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含有し
てなるペプチド １番目のスレオニンおよび／または３１番目のセリンが
予めリン酸化されており、２７番目のスレオニンおよび
／または１６１番目のセリンがリン酸化される。

【００２５】・配列表の配列番号１８に記載のアミノ酸
配列を含有してなるペプチド １番目のスレオニンおよび／または３１番目のセリンが
予めリン酸化されており、２７番目のスレオニンがリン
酸化される。 ・配列表の配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含有し
てなるペプチド １番目のスレオニンが予めリン酸化されており、２７番
目のスレオニンがリン酸化される。

【００２６】・配列表の配列番号２０に記載のアミノ酸
配列を含有してなるペプチド ５番目のセリンおよび／または１４３番目のセリンが予
めリン酸化されており、１番目のスレオニン、１３５番
目のセリンおよび１５２番目のセリンから選ばれる１以
上のアミノ酸がリン酸化される。 ・配列表の配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含有し
てなるペプチド ５番目のセリンおよび／または１４３番目のセリンが予
めリン酸化されており、１番目のスレオニンおよび／ま
たは１３５番目のセリンがリン酸化される。

【００２７】・配列表の配列番号２２に記載のアミノ酸
配列を含有してなるペプチド ５番目のセリンが予めリン酸化されており、１番目のス
レオニンおよび／または１３５番目のセリンがリン酸化
される。 ・配列表の配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含有し
てなるペプチド ５番目のセリンが予めリン酸化されており、１番目のス
レオニンがリン酸化される。

【００２８】・配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸
配列を含有してなるペプチド １番目のセリンおよび／または１３９番目のセリンが予
めリン酸化されており、１３１番目のセリンおよび／ま
たは１４８番目のセリンがリン酸化される。 ・配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含有し
てなるペプチド １番目のセリンおよび／または１３９番目のセリンが予
めリン酸化されており、１３１番目のセリンがリン酸化
される。

【００２９】・配列表の配列番号２６に記載のアミノ酸
配列を含有してなるペプチド １番目のセリンが予めリン酸化されており、１３１番目
のセリンがリン酸化される。 ・配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含有し
てなるペプチド ９番目のセリンが予めリン酸化されており、１番目のセ
リンおよび／または１８番目のセリンがリン酸化され
る。

【００３０】・配列表の配列番号２８に記載のアミノ酸
配列を含有してなるペプチド ９番目のセリンが予めリン酸化されており、１番目のセ
リンがリン酸化される。 ・配列表の配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含有し
てなるペプチド １番目のセリンが予めリン酸化されており、１０番目の
セリンがリン酸化される。 さらに本発明においては、
前記のようにタウプロテインキナーゼＩＩでリン酸化さ
れた蛋白質またはそのペプチドもタウプロテインキナー
ゼＩの基質として使用し得る。

【００３１】具体的なタウ蛋白質の調製法としては、例
えばＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６１，６０８４−６０８９（１９
８６）に記載の方法に従い、脳の微小管蛋白質に次の組
成の液を３倍容添加する。

【表１】 １００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ２．７） ０．７５Ｍ ＮａＣｌ ０．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ２ｍＭ ＤＴＴ １ｍＭ ＥＧＴＡ ０．１ｍＭ ＰＭＳＦ ０．１ｍＭ ＥＤＴＡ かかる液を９５℃で５分間加熱し、次いで０℃で１５分
間冷却した後、１００００Ｇで２０分間遠心分離して上
清を得る。この上清をアミコンＰＭ−１０膜等の限外濾
過装置で濃縮し、蛋白質濃度を約７mg/mlにしてＲＢに
透析する。この画分にはほぼ１００％の純度でタウ蛋白
質が含まれる。

【００３２】またタウ蛋白質の部分ペプチドは、メリフ
ィールドらの固相合成法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．，８５，２１４９−２１５４（１９６４））によ
り、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ モデル９５００等のペプチド
合成機等を用いて合成することができる。タウ蛋白質を
脱リン酸化する方法としては、例えばｐＨ８．０の１Ｍ
トリス塩酸緩衝液中で、ウシ小腸アルカリフォスファ
ターゼ（シグマ社 ｔｙｐｅＶＩＩ−ＮＴ）を添加し
て、３７℃で５〜８時間程度反応させ、タウ蛋白質を脱
リン酸化することができる。アルカリフォスファターゼ
は、反応終了後に１０分間程度の加熱処理して失活させ
ればよい。

【００３３】次に、本発明のリン酸化反応について説明
する。本発明に使用する酵素（タウプロテインキナーゼ
Ｉ）は、至適ｐＨが６．４、至適温度が３７℃で、活性
化剤として既知のセカンドメッセンジャーは要求せず、
チューブリンによって活性化され、リン酸供与体として
ヌクレオシド三リン酸を要求する。また、高濃度の塩化
ナトリウムによって反応が阻害され、５０％阻害に相当
する塩化ナトリウム濃度は約１００ｍＭである。従っ
て、本発明におけるリン酸化の反応条件は、上記の性質
を考慮して定められた条件であれば特に制限はされず、
より好ましくは１００ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリン）
エタンスルホン酸ナトリウム、０．９ｍＭ酢酸マグネシ
ウム、０．４ｍＭＡＴＰを含むｐＨ６．４の緩衝液に適
量の酵素と基質を添加して、３７℃でインキュベートす
る。かかる緩衝液の種類、ｐＨ、温度等の条件は、任意
に変更することが可能であり、例えばリン酸供与体とし
てＡＴＰの代わりにグアノシン三リン酸を用いても構わ
ない。即ち、ｐＨ３〜１０、温度０〜７０℃の範囲で、
ヌクレオシド三リン酸の存在下において前述した基質の
酵素を作用させることにより、本発明のリン酸化反応が
進行する。

【００３４】かかるリン酸化反応は、 （１）蛋白質を基質とする場合 （ａ）リン酸化された量の定量 リン酸化反応時に〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰを０．５〜５μＣ
ｉ／mlを加えて、リン酸化された蛋白質を³²Ｐで標識す
る。この反応液を２cm×２cmの正方形の濾紙に吸着さ
せ、５％ＴＣＡ−０．２５％Ｎａ₂ ＷＯ₄ −０．５％ピ
ロリン酸ナトリウム（ｐＨ２）に浸すことにより反応を
停止し、この液で充分洗浄して残存する〔γ−³²Ｐ〕Ａ
ＴＰを除去し、濾紙に残る放射能をシンチレーションカ
ウンターで計測する。これによって蛋白質に取り込まれ
たリン酸基の量が定量できる。

【００３５】（ｂ）リン酸化部位の決定 反応液をＬａｅｍｍｌｉの系で電気泳動し（Ｎａｔｕｒ
ｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））、ニトロセ
ルロース膜に蛋白質を転写し、特定のリン酸化ペプチド
に特異的に反応する抗体を用い、免疫ブロット法で染色
の有無を調べる。（２）ペプチドを基質とする場合 （ａ）リン酸化された量の定量 リン酸化反応時に〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰを０．５〜５μＣ
ｉ／mlを加えて、リン酸化されたペプチドを³²Ｐで標識
する。この反応液にＴＣＡを添加して高分子量の蛋白質
を沈澱させた後、上清中のリン酸化ペプチドを円形の正
方形のフォスフォセルロースペーパーに吸着させ、リン
酸緩衝液で洗浄して残存する〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰを除去
してから、濾紙に残った放射能をシンチレーションカウ
ンターで計測する。これにより、ペプチドに取り込まれ
たリン酸基の量が定量できる。

【００３６】（ｂ）リン酸化部位の決定 反応液にＰＣＡを添加して高分子量の蛋白質を沈澱させ
た後、上清液を逆相高速液体クロマトグラフィーにかけ
る。その保持時間が予め調整した標準リン酸化ペプチド
の保持時間と一致するか否かで、リン酸化部位の標準品
との異同を判断することができる。またピーク画分を分
取し、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１
２８，１９５−１９８（１９９１）に石黒らが報告した
方法に従って蛋白化学的分析を行うことにより、リン酸
化部位を決定することができる。等の方法により、確認
することができる。

【００３７】具体的には、ＲＢ緩衝液（下記参照）中
に、基質となるタウ蛋白質またはその部分ペプチドを２
００〜６００μｇ／ml、ＡＴＰ ０．１〜１ｍＭおよび
タウプロテインキナーゼを含有する組成物を、通常は３
７℃で１〜１６時間インキュベートし、ＴＣＡ処理ある
いは加熱処理によって反応を停止させる。その後上記の
方法により、リン酸化反応を確認する。なお、リン酸化
の量を定量する際には、〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰを０．５〜
５μＣｉ／ml添加して反応を行うことが好ましい。 ま
た、本発明に用いられる基質（タウ蛋白質）をタウプロ
テインキナーゼＩＩ等で予め部分的にリン酸化するに
は、石黒らのＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０４，３１９
（１９８８）に記載の方法に準じて行うことができる。

【００３８】なお、本発明の記載において、記号ＲＢ、
ＲＢＧ、ＭＥＳ、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、ＰＴ
Ｈ−アミノ酸、ＡＴＰ、ＰＣ、ＳＢ、ＤＴＴ、Ｔｗｅｅ
ｎ２０、ＴＣＡ、ＫＬＨはそれぞれ以下の略号である。 ＲＢ：１００ｍＭ ＭＥＳ、０．５ｍＭ 酢酸マグネシ
ウムおよび１ｍＭＥＧＴＡからなる緩衝液（ｐＨ６．
５） ＲＢＧ：ＲＢに１ｍＭ ＧＴＰを添加した緩衝液 ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸 ＥＧＴＡ：エチレングリコール−ビス（β−アミノエチ
ルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸 ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸 ＰＭＳＦ：フェニルメチルスルホニルフルオリド ＰＴＨ−アミノ酸：フェニルチオヒダントインアミノ酸 ＡＴＰ：アデノシントリリン酸 ＰＣ：２０ｍＭ ＭＥＳ、０．５ｍＭ 酢酸マグネシウ
ムおよび１ｍＭ ＥＧＴＡからなる緩衝液（ｐＨ６．
８） ＳＢ：２０ｍＭ Ｎ−［２−ハイドロキシエチル］ピペ
ラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］、０．５ｍＭ
酢酸マグネシウムおよび１ｍＭ ＥＧＴＡからなる緩
衝液（ｐＨ８．２） ＤＴＴ：ジチオスレイトール Ｔｗｅｅｎ２０：ポリオキシエチレンソルビタンモノラ
ウレート ＴＣＡ：トリクロロ酢酸 ＫＬＨ：キーホール・リンペットのヘモシアニン

【００３９】

【実施例】以下、本発明につき参考例および実施例を挙
げて説明するが、その要旨を越えない限り以下に限定さ
れるものではない。 参考例１ タウプロテインキナーゼの調製 （１）微小管蛋白質の調製 成牛１５頭を断頭して直ちに脳を取り出し、血餅を素早
く除去し、脳１ｇに１mlの０．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１
ｍＭ ＥＧＴＡ−ＮａＯＨ（ｐＨ７）を加え、ゆっくり
攪拌して液を捨て、血を洗い去った。

【００４０】次いで、脳１ｇに１mlのＲＢを加えてワー
リングブレンダー（１８０００ｒｐｍ）で５秒間、３回
ホモジナイズした後、３００００Ｇで１時間遠心分離し
て、上清を採取した。この上清（脳抽出液）に１／３容
のグリセロールとＧＴＰを加えて溶液中のＧＴＰ濃度を
合計で１ｍＭとして、３７℃に加温し３０分間保持し、
同温度において１０００００Ｇで３０分間遠心分離して
沈澱物を採取した。

【００４１】この沈澱物を、前記脳抽出液の１／５容の
ＲＢ中に懸濁させて０℃３０分間保持した後、４℃にお
いて１０００００Ｇで３０分間遠心分離し、得られた上
清に、１／４容の５０％グリセロールを含むＲＢを添加
し、更に１２．５ｍＭ フォスフォエノールピルビン
酸、１２．５μｇ／ml ピルビン酸キナーゼおよび２５
０μＭ ＧＴＰを１／２５容加えて３７℃で３０分間加
温した。次いで、この液を２５％グリセロールを含むＲ
Ｂ上に重層し、３０℃において、１０００００Ｇで３０
分間スウィングローターで遠心分離して沈澱物を採取し
た。沈澱物を脳抽出液の１／２５容のＲＢＧ中に懸濁さ
せて０℃で３０分間保持した後、１０００００Ｇで３０
分間遠心分離して微小管蛋白質を上清として得た。

【００４２】以下の操作は、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２
０、１０％グリセロールの存在下で行った。 （２）硫安分画 上記（１）で得た微小管蛋白質をＲＢで希釈して蛋白質
濃度を１０mg／mlとし、硫安の粉末を加えて３５％飽和
硫安液とし３０分間放置した後、２００００Ｇで２０分
間遠心分離して上清を採取した。この上清に再び硫安の
粉末を加えて５０％飽和硫安液として３０分間放置した
後、２００００Ｇで２０分間遠心分離して得られた沈澱
物をＲＢに溶解し、ＲＢに透析して硫安画分を得た。 （３）フォスフォセルロースカラムクロマトグラフィー 上記（２）で得た硫安画分に、５０％グリセロールを含
むＲＢを１／４容加えた。これを硫安画分の蛋白質３０
mg当たり１mlのＰ１１セルロース（ワットマン社製）を
含み、予めＰＣで平衡化した、Ｐ１１セルロースのカラ
ムにチャージし、カラムの５倍容の０．１Ｍ ＮａＣｌ
−ＰＣでカラムを洗い、引き続いて０．１から０．８Ｍ
ＮａＣｌ−ＰＣの直線濃度勾配の展開液をカラムに流
し、０．２から０．４Ｍ ＮａＣｌで溶出するＰＣ画分
を採取した。 （４）ゲル濾過 上記（３）で得たＰＣ画分を、アミコンＰＭ−１０膜の
限外濾過装置で蛋白質濃度５mg／ml以上に濃縮し、これ
を予め０．３Ｍ ＮａＣｌ−ＲＢ緩衝液で平衡化したＧ
３０００ＳＷカラム（東ソー社製；シリカゲルカラム、
２１mm×６０cm）にチャージし、２ml／分の流速で流通
させてゲル濾過を行った。タウプロテインキナーゼ画分
（分子量５万の画分）を採取し、アミコンＰＭ−１０膜
の限外濾過装置で濃縮した。 （５）ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
ー 上記（４）で得た画分を、予め１２ｍＭ リン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．８）で平衡化したハイドロキシア
パタイトカラム（東燃社製；７．５mm×１００mm）にチ
ャージし、１２から４００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝
液の直線濃度勾配１０mlで展開し、１５０ｍＭの濃度で
溶出するＨＡ画分を採取した。 （６）Ｓ−セファロースカラムクロマトグラフィー 上記（５）の画分をＰＣで透析し、予めＰＣで平衡化し
たＳ−セファロースカラム（ファルマシア社製；５mm×
２０mm）にチャージし、ＰＣとＳＢの直線勾配７．５m
l、続いてＳＢ中で０から２００ｍＭ ＮａＣｌの直線
濃度勾配５mlで展開し、１５０ｍＭの濃度で溶出するＳ
１画分および５０ｍＭの濃度で溶出するＳ２画分を採取
した。Ｓ２画分はＲＢで透析して、タウプロテインキナ
ーゼＩＩ画分とした。 （７）ヘパリンカラムクロマトグラフィー 上記Ｓ１の画分を２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．６）で平衡化したＴＳＫゲル ＡＦ−ヘパリ
ンカラム（東ソー社製；４mm×８mm）にチャージし、２
０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）中で、
０から２００ｍＭＮａＣｌの直線濃度勾配４mlで展開
し、８０ｍＭ ＮａＣｌで溶出するヘパリン画分を採取
した。この画分をＲＢに透析して、タウプロテインキナ
ーゼＩ画分とした。

【００４３】かくして得られたタウプロテインキナーゼ
Ｉは、以下の理化学的性質を有するものであった。 （ａ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体として、タウ蛋白質
中のセリンおよびスレオニンをリン酸化し、タウ蛋白質
１分子あたり４残基のリン酸基を導入する。 （ｂ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中で、微小管付
随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２を特異的にリ
ン酸化する。ヒストンをリン酸化しない。α−カゼイン
を少しリン酸化する。

【００４４】（ｃ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下で
の至適ｐＨは６．５であり、チューブリン存在下での至
適ｐＨは６．０である。 （ｄ）作用適温：３７℃ （ｅ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下でのゲ
ル濾過により求めた測定値は約５万であり、塩化ナトリ
ウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を作り、そのゲル
濾過による測定値は約１０万である。ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により求めた測定値は約４万５
千である。

【００４５】（ｆ）安定性：２５％グリセロールと０．
０２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
中、ｐＨ６．５、温度−２０℃において少なくとも一年
間安定である。 （ｇ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ ²⁺、カルモジュリンおよびリン脂
質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。

【００４６】（ｈ）阻害：９０ｍＭのＮａＣｌまたはＫ
Ｃｌで活性が半減する。また、タウプロテインキナーゼ
ＩＩは、以下の理化学的性質を有するものであった。 （ｉ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体として、タウ蛋白質
中の、Ｃ末端側の隣にプロリンのあるセリンおよびスレ
オニンをリン酸化し、タウ蛋白質１分子あたり４残基の
リン酸基を導入する。

【００４７】（ｊ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中
で、微小管付随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２
を特異的にリン酸化する。ヒストンＨ１とニューロフィ
ラメントＨサブユニットもリン酸化する。β−カゼイン
を少しリン酸化する。 （ｋ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下での至適ｐＨは
６．５であり、チューブリン存在下での至適ｐＨは６．
０である。

【００４８】（ｌ）作用適温：３７℃ （ｍ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下でのゲ
ル濾過により求めた測定値は約５万であり、塩化ナトリ
ウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を作り、そのゲル
濾過による測定値は約１０万である。ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により求めた測定値は約３万で
あり、その他に２．３万の蛋白質があり、この２種の蛋
白質が結合してゲル濾過では約５万になっている。

【００４９】（ｎ）安定性：２５％グリセロールと０．
０２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
中、ｐＨ６．５、温度−２０℃において少なくとも一年
間安定である。 （ｏ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ ²⁺、カルモジュリンおよびリン脂
質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。

【００５０】（ｐ）阻害：４０ｍＭのＮａＣｌまたはＫ
Ｃｌで活性が半減する。 参考例２ タウプロテインキナーゼＩのクローニング ウシ１５頭から精製したタウプロテインキナーゼＩ 約
６０ｐｍｏｌｅｓをエンドプロテアーゼ Ｌｙｓ−Ｃ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｇｍｂ
Ｈ）で消化し、Ｃ₈ のカラム（ＲＰ−３００，Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いて逆
相高速液体クロマトグラフィーを行った。０．１％トリ
フルオロ酢酸中、アセトニトリル０％から７０％の濃度
勾配溶出で以下の８個のペプチドを分取し、一部は再度
クロマトグラフィーにより精製して、シーケンサー（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，４７
７Ａ）を用いてアミノ酸配列を決定した。

【００５１】２Ｋ０６：配列表の配列番号３０ ２Ｋ１３：配列表の配列番号３１ ２Ｋ１９：配列表の配列番号３２ ２Ｋ２０：配列表の配列番号３３ ２Ｋ３３：配列表の配列番号３４ ２Ｋ３５：配列表の配列番号３５ ２Ｋ３７：配列表の配列番号３６ 上記８個のペプチドのうち、２Ｋ３５および２Ｋ３７の
アミノ酸配列をもとに、配列表の配列番号３７に記載の
センスプライマーおよび配列番号３８に記載のアンチセ
ンスプライマーを合成し、ウシの脳組織から調製したｃ
ＤＮＡをテンプレートとして、Ｓａｉｋｉらの開発した
ポリメラーゼ チェイン リアクション法（ＰＣＲ法：
Ｎａｔｕｒｅ，３２４，１２６（１９８６））に準じて
遺伝子増幅を行った。その結果、配列表の配列番号３９
に示す主要産物を得た。同産物において、二つのプライ
マーにはさまれた１５ヌクレオチドは、上記のペプチド
から期待される配列であった。

【００５２】更に配列表の配列番号３９に示す配列をも
とに、新たに４１ヌクレオチドーのアンチセンスプライ
マー（配列表の配列番号４０）を合成し、５’末端を³²
Ｐで標識してｃＤＮＡクローンをスクリーニングするた
めのプローブとした。ｃＤＮＡライブラリーは市販のも
の（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）を利用した。これはラット
大脳皮質のｍＲＮＡをランダムプライミング法で合成し
たｃＤＮＡをλｇｔ１１に挿入したものである。常法に
従い、４８℃でハイブリダイズし×１ＳＳＣ（０．３Ｍ
塩化ナトリウム および ０．０３Ｍ クエン酸ナト
リウムからなる緩衝液）、３５℃で洗浄することによ
り、約６０万のクローンから１個の陽性クローン（＃３
１）を得た。＃３１は約１．３ｋｂのインサートを持
ち、それをｐＵＣ１９にサブクローニングしてＤＮＡ配
列を求めた。この配列の同一フレーム上に上記８個のペ
プチド全てのアミノ酸配列が確認されたが、３’末端側
には終止コドンは存在しなかった。そこでこの配列の一
部をプローブとして用い、新たなクローン（＃１１）を
得た。＃１１のインサートは、クローン＃３１の配列の
途中から始まり、約１．２ｋｂの大きさであった。両者
の配列を連結し、約４２０アミノ酸残基のオープン リ
ーディング フレーム（ＯＲＦ）の存在を確認した。か
かるアミノ酸配列および塩基配列を配列表の配列番号１
に、制限酵素地図を図１に示す。 実施例１ウシの脳から抽出精製した タウ蛋白質をタウプロテイン
キナーゼＩＩでリン酸化した後、１Ｍ尿素、２０ｍＭメ
チルアミンおよび５０ｍＭリン酸ナトリウムを含むｐＨ
８．５の緩衝液中で、タウ蛋白質の１／２０（重量比）
のエンドプロテアーゼ Ｌｙｓ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）を添加して、３７
℃で２時間酵素消化した。生成したペプチドは、逆相高
速カラムクロマトグラフィーで分離した。このときカラ
ムはＣ₄ カラム（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ，４．６mm×５c
m）を使用し、溶出液としては０．１％トリフルオロ酢
酸中、アセトニトリルとイソプロパノールの混合溶媒
（混合比３：７）を全溶媒の０％から７０％まで直線勾
配で増加させた。

【００５３】次にタウ蛋白質を〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ共存
下でリン酸化した。³²Ｐで標識されたペプチドのピーク
は３つ検出され、溶出順にｐＫ１、ｐＫ２およびｐＫ３
と名付けた（「ｐ」はリン酸化されたことを示す）。非
放射性のＡＴＰを用いても同様にタウ蛋白質をリン酸化
した。分取されたｐＫ１、ｐＫ２およびｐＫ３のそれぞ
れの画分は、気相プロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７７Ａ）を用いてペプ
チドのアミノ酸配列を分析した。その結果、Ｋ１は配列
表の配列番号２に記載のヒト由来のタウ蛋白質のアミノ
酸配列で１６８番目のバリンから１８２番目のリジンに
至るペプチド、Ｋ２は１３３番目のセリンから１６６番
目のリジンに至るペプチド、Ｋ３は３０７番目のセリン
から３４９番目のリジンに至るペプチドであり（Ｇｏｅ
ｄｅｒｔら、Ｎｅｕｒｏｎ、３、５１９−５２６（１９
８９））、ｐＫ１、ｐＫ２およびｐＫ３のそれぞれにつ
いてリン酸化部位も以下のように決定された。すなわ
ち、アミノ酸配列分析においてリン酸化セリンはＤＴＴ
存在下でＰＴＨ−デヒドロアラニンを経由してＤＴＴ付
加物を生成し、ＰＴＨ−セリンを生じないことが知られ
ている（Ｍｅｙｅｒら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０
４，６１−６６（１９８６））。同様にリン酸化スレオ
ニンでもＤＴＴ付加物を生ずるが、ＰＴＨ−スレオニン
を生成しない。これによってｐＫ１では配列表の配列番
号２に記載のアミノ酸配列における１７７番目のセリン
が、ｐＫ２では１４４番目のセリンと１４７番目のスレ
オニンが、ｐＫ３では３１５番目のセリンがリン酸化さ
れていることが判明した。

【００５４】この結果に基づいて、配列表の配列番号２
に記載のアミノ酸配列で１４０番目のセリンから１５１
番目のアルギニンに至るペプチドにおいて１４４番目の
セリンのみ、１４７番目のスレオニンのみ、および１４
４番目のセリンと１４７番目のスレオニンの両者にリン
酸基を導入した３つのペプチド（それぞれ配列表の配列
番号４１、４２および４３）と、３０６番目のリジンか
ら３１７番目のアルギニンに至るペプチドにおいて３１
５番目のセリンにリン酸基を導入したペプチド（配列表
の配列番号４４）を合成し、それぞれをＫＬＨに結合し
た後ウサギに免役し、得られた抗血清を精製して特異性
を調べることによって、１４４番目のセリンを特異的に
認識する抗ＰＳ１４４抗体、１４７番目のスレオニンを
特異的に認識する抗ＰＴ１４７抗体および３１５番目の
セリンを特異的に認識する抗ＰＳ３１５抗体を取得し
た。

【００５５】一方、タウ蛋白質を脱リン酸化処理したも
の、それをさらにタウプロテインキナーゼＩＩでリン酸
化したものを未処理のものと、電気泳動およびイムノブ
ロッティング（Ｔｏｕｂｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６，４３５０−４３５４
（１９７９））で比較した。その結果、電気泳動では脱
リン酸化タウ蛋白質、未処理のタウ蛋白質、タウプロテ
インキナーゼＩＩでリン酸化したタウ蛋白質の順に移動
度が小さかった。また抗ＰＳ１４４抗体、抗ＰＴ１４７
抗体および抗ＰＳ３１５抗体との反応性については、脱
リン酸化したタウ蛋白質はいずれの抗体とも反応せず、
タウプロテインキナーゼＩＩでリン酸化したタウ蛋白質
はいずれの抗体とも反応し、未処理のタウ蛋白質は抗Ｐ
Ｓ１４４抗体および抗ＰＳ３１５抗体と比較的弱いなが
らも充分に認められる反応を示した。

【００５６】これらの各種タウ蛋白質を基質としてタウ
プロテインキナーゼＩによるリン酸化を以下のように試
みた。まず未処理のタウ蛋白質、脱リン酸化処理したタ
ウ蛋白質および脱リン酸化後にタウプロテインキナーゼ
ＩＩでリン酸化したタウ蛋白質に〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ存
在下および非存在下でタウプロテインキナーゼＩを作用
させたところ、脱リン酸化処理したタウ蛋白質の場合は
電気泳動の移動度に変化はなく、³²Ｐの取り込みも極め
てわずかであったが、他の２つのタウ蛋白質の場合は電
気泳動の移動度が小さくなり、³²Ｐが多量に取り込まれ
てリン酸化が進行したことが明らかであった。次にタウ
プロテインキナーゼＩとＩＩの作用を比較するため、そ
れぞれのキナーゼで未処理のタウ蛋白質をリン酸化した
後に、抗体との反応性をイムノブロッティング法で調べ
た。ここで使用したｔａｕ−１抗体は脳内に存在する正
常なタウ蛋白質との反応は強く、ＰＨＦ中の異常にリン
酸化されたタウ蛋白質との反応は弱いとされている抗体
であり、一方抗ｐｔａｕ抗体はＰＨＦ中の異常リン酸化
タウ蛋白質に特異的に反応する抗体である。イムノブロ
ッティングの結果、ｔａｕ−１抗体との反応性はリン酸
化していないタウ蛋白質で最も強く、タウプロテインキ
ナーゼＩまたはＩＩでリン酸化すると反応が弱くなり、
特にタウプロテインキナーゼＩでリン酸化して電気泳動
の移動度が最も小さくなったバンドは、ｔａｕ−１抗体
と反応しなかった。これに対し抗ｐｔａｕ抗体との反応
性はタウプロテインキナーゼＩによるリン酸化によって
初めて観察された。

【００５７】以上の結果から、配列表の配列番号２に記
載のアミノ酸配列において１４４番目のセリン、１４７
番目のスレオニン、１７７番目のセリンおよび３１５番
目のセリンから選ばれる１以上のアミノ酸がリン酸化さ
れたタウ蛋白質を基質としてタウプロテインキナーゼＩ
を作用させると、ＰＨＦ中の異常リン酸化と同様なリン
酸化が進行することがわかった。 実施例２ 一次構造が配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で
表されるタウ蛋白質をタウプロテインキナーゼＩＩでリ
ン酸化した後、さらに〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ存在下でタウ
プロテインキナーゼＩでリン酸化してから、エンドプロ
テアーゼ Ｌｙｓ−Ｃで酵素消化した。実施例１と同様
にして³²Ｐを取り込んだペプチド・ピークを同定し、さ
らに実施例１と同様にして相当する非標識ペプチドを分
取した。これらのペプチドはアミノ酸配列分析により、
実施例１のｐＫ１、ｐＫ２およびｐＫ３に相当すること
が確認され、これらがタウプロテインキナーゼＩによっ
てさらにリン酸化されたものであると結論した。これら
のペプチドを、それぞれｐｐＫ１、ｐｐＫ２およびｐｐ
Ｋ３と呼ぶ。それぞれのアミノ酸配列分析において、実
施例１と同様にＰＴＨ−アミノ酸がセリンまたはスレオ
ニンの脱水物のＰＴＨ誘導体のＤＴＴ付加物であるか否
かでリン酸化部位を判定したところ、ｐｐＫ１において
は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列における１
７３番目のスレオニン、ｐｐＫ２では１４１番目のセリ
ン、ｐｐＫ３では３０７番目のセリンと３２４番目のセ
リンがタウプロテインキナーゼＩによってリン酸化され
たアミノ酸であることが判明した。 実施例３ 配列表の配列番号４５に記載のアミノ酸配列で表される
ペプチドを合成し、〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ存在下でタウプ
ロテインキナーゼＩでリン酸化したが、該ペプチドには
³²Ｐは取り込まれなかった。しかし、このペプチドをタ
ウプロテインキナーゼＩＩで予めリン酸化することによ
り、タウプロテインキナーゼＩでリン酸化することがで
きた。タウプロテインキナーゼＩによるリン酸化の前後
のペプチドのアミノ酸配列分析を比較したところ、配列
表の配列番号４５に記載のアミノ酸配列において６番目
のスレオニンに相当するＰＴＨ−アミノ酸がリン酸化前
ではＰＴＨ−スレオニンであったのに対し、リン酸化後
ではＰＴＨ−デヒドロ−α−アミノ酪酸のＤＴＴ付加物
であった。なお、同配列において１０番目のセリンに相
当するＰＴＨ−アミノ酸は、いずれもＰＴＨ−デヒドロ
アラニンのＤＴＴ付加物であった。

【００５８】この結果から、配列表の配列番号４５に記
載のアミノ酸配列で表されるペプチドのタウプロテイン
キナーゼＩによるリン酸化には、タウプロテインキナー
ゼＩＩによる１０番目のセリンのリン酸化が必要であ
り、かつタウプロテインキナーゼＩによるリン酸化の部
位は６番目のスレオニンであることがわかった。 実施例４ 配列表の配列番号４６に記載のアミノ酸配列で表される
ペプチドを合成し、〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ存在下でタウプ
ロテインキナーゼＩでリン酸化したが、該ペプチドには
³²Ｐは取り込まれなかった。しかし、このペプチドをタ
ウプロテインキナーゼＩＩで予めリン酸化することによ
り、タウプロテインキナーゼＩでリン酸化することがで
きた。タウプロテインキナーゼＩによるリン酸化の前後
のペプチドのアミノ酸配列分析を比較したところ、配列
表の配列番号４６に記載のアミノ酸配列において９番目
のセリンに相当するＰＴＨ−アミノ酸がリン酸化前では
ＰＴＨ−セリンであったのに対し、リン酸化後ではＰＴ
Ｈ−デヒドロアラニンのＤＴＴ付加物であった。なお、
同配列において１２番目のセリンに相当するＰＴＨ−ア
ミノ酸は、いずれもＰＴＨ−デヒドロアラニンのＤＴＴ
付加物であり、１５番目のスレオニンに相当するＰＴＨ
−アミノ酸は、いずれもＰＴＨ−デヒドロ−α−アミノ
酪酸のＤＴＴ付加物であった。

【００５９】この結果から、配列表の配列番号４６に記
載のアミノ酸配列で表されるペプチドのタウプロテイン
キナーゼＩによるリン酸化には、タウプロテインキナー
ゼＩＩによるリン酸化が必要であり、かつタウプロテイ
ンキナーゼＩによるリン酸化の部位は９番目のセリンで
あることがわかった。 実施例５ 配列表の配列番号４７に記載のアミノ酸配列で表される
ペプチドを合成し、次いでそれをタウプロテインキナー
ゼＩＩでリン酸化したペプチドを合成した。それぞれの
ペプチドについて〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ存在下でタウプロ
テインキナーゼＩでリン酸化を試みたところ、³²Ｐの取
り込みはリン酸化ペプチドの場合にのみ認められた。

【００６０】

【発明の効果】本発明のリン酸化方法は、タウ蛋白質に
対し特異的に作用するものであり、アルツハイマー病お
よびアルツハイマー型老年痴呆の病因の解明、さらには
これを予防または治療する薬物の探索への応用が期待さ
れる。

【００６１】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１９３２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ＲＮＡ 起源 生物名：ラット 配列 GGCCAAGAGA ACGAAGTCTT TTTTTTTTTT TTCTTGCGGG AGAACTTAAT GCTGCATTTA 60 TTATTAACCT AGTACCCTAA CATAAAACAA AAGGAAGAAA AGGATTAAGG AAGGAAAAGG 120 TGAATCGAGA AGAGCCATC ATG TCG GGG CGA CCG AGA ACC ACC TCC TTT GCG 172 Met Ser Gly Arg Pro Arg Thr Thr Ser Phe Ala 1 5 10 GAG AGC TGC AAG CCA GTG CAG CAG CCT TCA GCT TTT GGT AGC ATG AAA 220 Glu Ser Cys Lys Pro Val Gln Gln Pro Ser Ala Phe Gly Ser Met Lys 15 20 25 GTT AGC AGA GAT AAA GAT GGC AGC AAG GTA ACC ACA GTG GTG GCA ACT 268 Val Ser Arg Asp Lys Asp Gly Ser Lys Val Thr Thr Val Val Ala Thr 30 35 40 CCT GGA CAG GGT CCT GAC AGG CCA CAG GAA GTC AGT TAC ACA GAC ACT 316 Pro Gly Gln Gly Pro Asp Arg Pro Gln Glu Val Ser Tyr Thr Asp Thr 45 50 55 AAA GTC ATT GGA AAT GGG TCA TTT GGT GTG GTA TAT CAA GCC AAA CTT 364 Lys Val Ile Gly Asn Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys Leu 60 65 70 75 TGT GAC TCA GGA GAA CTG GTG GCC ATC AAG AAA GTT CTT CAG GAC AAG 412 Cys Asp Ser Gly Glu Leu Val Ala Ile Lys Lys Val Leu Gln Asp Lys 80 85 90 CGA TTT AAG AAC CGA GAG CTC CAG ATC ATG AGA AAG CTA GAT CAC TGT 460 Arg Phe Lys Asn Arg Glu Leu Gln Ile Met Arg Lys Leu Asp His Cys 95 100 105 AAC ATA GTC CGA TTG CGG TAT TTC TTC TAC TCG AGT GGC GAG AAG AAA 508 Asn Ile Val Arg Leu Arg Tyr Phe Phe Tyr Ser Ser Gly Glu Lys Lys 110 115 120 GAT GAG GTC TAC CTT AAC CTG GTG CTG GAC TAT GTT CCG GAA ACA GTG 556 Asp Glu Val Tyr Leu Asn Leu Val Leu Asp Tyr Val Pro Glu Thr Val 125 130 135 TAC AGA GTC GCC AGA CAC TAT AGT CGA GCC AAG CAG ACA CTC CCT GTG 604 Tyr Arg Val Ala Arg His Tyr Ser Arg Ala Lys Gln Thr Leu Pro Val 140 145 150 155 ATC TAT GTC AAG TTG TAT ATG TAC CAG CTG TTC AGA AGT CTA GCC TAT 652 Ile Tyr Val Lys Leu Tyr Met Tyr Gln Leu Phe Arg Ser Leu Ala Tyr 160 165 170 ATC CAT TCC TTT GGG ATC TGC CAT CGA GAC ATT AAA CCA CAG AAC CTC 700 Ile His Ser Phe Gly Ile Cys His Arg Asp Ile Lys Pro Gln Asn Leu 175 180 185 TTG CTG GAT CCT GAT ACA GCT GTA TTA AAA CTC TGC GAC TTT GGA AGT 748 Leu Leu Asp Pro Asp Thr Ala Val Leu Lys Leu Cys Asp Phe Gly Ser 190 195 200 GCA AAG CAG CTG GTC CGA GGA GAG CCC AAT GTT TCA TAT ATC TGT TCT 796 Ala Lys Gln Leu Val Arg Gly Glu Pro Asn Val Ser Tyr Ile Cys Ser 205 210 215 CGG TAC TAC AGG GCA CCA GAG CTG ATC TTT GGA GCC ACC GAT TAC ACG 844 Arg Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Ile Phe Gly Ala Thr Asp Tyr Thr 220 225 230 235 TCT AGT ATA GAT GTA TGG TCT GCA GGC TGT GTG TTG GCT GAA TTG TTG 892 Ser Ser Ile Asp Val Trp Ser Ala Gly Cys Val Leu Ala Glu Leu Leu 240 245 250 CTA GGA CAA CCA ATA TTT CCT GGG GAC AGT GGT GTG GAT CAG TTG GTG 940 Leu Gly Gln Pro Ile Phe Pro Gly Asp Ser Gly Val Asp Gln Leu Val 255 260 265 GAA ATA ATA AAG GTC CTA GGA ACA CCA ACA AGG GAG CAA ATT AGA GAA 988 Glu Ile Ile Lys Val Leu Gly Thr Pro Thr Arg Glu Gln Ile Arg Glu 270 275 280 ATG AAC CCA AAT TAT ACA GAA TTC AAA TTC CCC CAA ATC AAG GCA CAT 1036 Met Asn Pro Asn Tyr Thr Glu Phe Lys Phe Pro Gln Ile Lys Ala His 285 290 295 CCT TGG ACG AAG GTC TTT CGG CCC CGA ACT CCA CCA GAG GCA ATC GCA 1084 Pro Trp Thr Lys Val Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala 300 305 310 315 CTG TGT AGC CGT CTC CTG GAG TAC ACG CCG ACC GCC CGG CTA ACA CCA 1132 Leu Cys Ser Arg Leu Leu Glu Tyr Thr Pro Thr Ala Arg Leu Thr Pro 320 325 330 CTG GAA GCT TGT GCA CAT TCA TTT TTT GAT GAA TTA CGG GAC CCA AAT 1180 Leu Glu Ala Cys Ala His Ser Phe Phe Asp Glu Leu Arg Asp Pro Asn 335 340 345 GTC AAA CTA CCA AAT GGG CGA GAC ACA CCT GCC CTC TTC AAC TTT ACC 1228 Val Lys Leu Pro Asn Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Phe Thr 350 355 360 ACT CAA GAA CTG TCA AGT AAC CCA CCT CTG GCC ACC ATC CTT ATC CCT 1276 Thr Gln Glu Leu Ser Ser Asn Pro Pro Leu Ala Thr Ile Leu Ile Pro 365 370 375 CCT CAC GCT CGG ATT CAG GCA GCT GCT TCA CCG CCT GCA AAC GCC ACA 1324 Pro His Ala Arg Ile Gln Ala Ala Ala Ser Pro Pro Ala Asn Ala Thr 380 385 390 395 GCA GCC TCA GAT ACT AAT GCT GGA GAC CGT GGA CAG ACC AAT AAC GCC 1372 Ala Ala Ser Asp Thr Asn Ala Gly Asp Arg Gly Gln Thr Asn Asn Ala 400 405 410 GCT TCT GCA TCA GCC TCC AAC TCT ACC TGA ACAG CCCCAAGTAG CCAGCTGCGC1426 Ala Ser Ala Ser Ala Ser Asn Ser Thr Stop 415 420 AGGGAAGACC AGCACTTACT TGAGTGCCAC TCAGCAACAC TGGTCACGTT TGGAAAGAAA 1486 ATTAAAAAGA GGAAAACAAA AACAAAAACA AAAAACCCCG GCTTTGGTTT GTTTCTTCTT 1546 TCTTCTTTTC CTCTATTTTC TTTTTTAAAA ATCTGTTTCT CCTTTTAAAA AAATTAAGAT 1606 GAAGTCAAGT CTGATGTCAT GGGTAACCCC ACCTACTTGG AAGGCTGAGT CTAGAGGTTT 1666 ACAGCTCAAG CCCATGCTGG ACTACAGTGG GAGTCCAAGG CCAGCNTGGG CAACTTAAAA 1726 AGAACTTGTT TCAAAAACGA CAAAGTTGGC TGATAATATG GCTCTCCAAG AGCCACAATA 1786 AATAAATATG TAAATAAACT CAAATAAGTC TTGTAATTTA AATTACACTA AACTAGGTTA 1846 ACTTTTAAAC TCTCATCTTT AAGAACTACA GGTTTAAAAA CCCAACGGTT GTTTTATGTA 1906 TTAGGGAAAA ATGAAAAATC TAATATAAAA AGAAGCAGCA ACAGCAGCAG GAGCCAACCA 1966 AAGGAT 1972 N : 未同定

【００６２】配列番号：２ 配列の長さ：３５２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ヒト 配列 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala 35 40 45 Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val 50 55 60 Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp 65 70 75 80 Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro 85 90 95 Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg 100 105 110 Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly 115 120 125 Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser 130 135 140 Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro 145 150 155 160 Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys 165 170 175 Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met 180 185 190 Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu 195 200 205 Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val 210 215 220 Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His 225 230 235 240 His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp 245 250 255 Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr 260 265 270 His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr 275 280 285 Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val 290 295 300 Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser 305 310 315 320 Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu 325 330 335 Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 340 345 350

【００６３】配列番号：３ 配列の長さ：１８４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg 20 25 30 Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala 35 40 45 Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser 50 55 60 Thr Glu Asp Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val 65 70 75 80 Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu 85 90 95 Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser 100 105 110 Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu 115 120 125 Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr 130 135 140 His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly 145 150 155 160 Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro 165 170 175 Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser 180

【００６４】配列番号：４ 配列の長さ：１７６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg 20 25 30 Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala 35 40 45 Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser 50 55 60 Thr Glu Asp Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val 65 70 75 80 Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu 85 90 95 Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser 100 105 110 Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu 115 120 125 Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr 130 135 140 His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly 145 150 155 160 Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro 165 170 175

【００６５】配列番号：５ 配列の長さ：１６７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg 20 25 30 Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala 35 40 45 Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser 50 55 60 Thr Glu Asp Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val 65 70 75 80 Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu 85 90 95 Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser 100 105 110 Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu 115 120 125 Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr 130 135 140 His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly 145 150 155 160 Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser 165

【００６６】配列番号：６ 配列の長さ：３８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg 20 25 30 Thr Pro Pro Lys Ser Pro 35

【００６７】配列番号：７ 配列の長さ：３３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg 20 25 30 Thr

【００６８】配列番号：８ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００６９】配列番号：９ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００７０】配列番号：１０ 配列の長さ：１８１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro 20 25 30 Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro 35 40 45 Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp 50 55 60 Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro 65 70 75 80 Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile 85 90 95 His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu 100 105 110 Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile 115 120 125 Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu 130 135 140 Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu 165 170 175 Ser Asn Val Ser Ser 180

【００７１】配列番号：１１ 配列の長さ：１７３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro 20 25 30 Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro 35 40 45 Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp 50 55 60 Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro 65 70 75 80 Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile 85 90 95 His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu 100 105 110 Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile 115 120 125 Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu 130 135 140 Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro 165 170

【００７２】配列番号：１２ 配列の長さ：１６４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro 20 25 30 Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro 35 40 45 Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp 50 55 60 Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro 65 70 75 80 Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile 85 90 95 His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu 100 105 110 Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile 115 120 125 Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu 130 135 140 Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile 145 150 155 160 Val Tyr Lys Ser

【００７３】配列番号：１３ 配列の長さ：３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro 20 25 30 Lys Ser Pro 35

【００７４】配列番号：１４ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr 1 5 10 15 Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr 20 25 30

【００７５】配列番号：１５ 配列の長さ：１７８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr 1 5 10 15 Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro 20 25 30 Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp 35 40 45 Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu Lys His 50 55 60 Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu 65 70 75 80 Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys 85 90 95 Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys 100 105 110 Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val 115 120 125 Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg 130 135 140 Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val 165 170 175 Ser Ser

【００７６】配列番号：１６ 配列の長さ：１７０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr 1 5 10 15 Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro 20 25 30 Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp 35 40 45 Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu Lys His 50 55 60 Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu 65 70 75 80 Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys 85 90 95 Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys 100 105 110 Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val 115 120 125 Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg 130 135 140 Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys 145 150 155 160 Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro 165 170

【００７７】配列番号：１７ 配列の長さ：１６１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr 1 5 10 15 Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro 20 25 30 Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp 35 40 45 Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu Lys His 50 55 60 Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu 65 70 75 80 Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys 85 90 95 Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys 100 105 110 Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val 115 120 125 Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg 130 135 140 Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys 145 150 155 160 Ser

【００７８】配列番号：１８ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr 1 5 10 15 Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro 20 25 30

【００７９】配列番号：１９ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr 1 5 10 15 Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr 20 25

【００８０】配列番号：２０ 配列の長さ：１５２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala 1 5 10 15 Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser 20 25 30 Thr Glu Asp Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val 35 40 45 Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu 50 55 60 Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser 65 70 75 80 Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu 85 90 95 Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr 100 105 110 His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly 115 120 125 Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro 130 135 140 Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser 145 150

【００８１】配列番号：２１ 配列の長さ：１４４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala 1 5 10 15 Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser 20 25 30 Thr Glu Asp Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val 35 40 45 Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu 50 55 60 Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser 65 70 75 80 Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu 85 90 95 Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr 100 105 110 His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly 115 120 125 Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro 130 135 140

【００８２】配列番号：２２ 配列の長さ：１３５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala 1 5 10 15 Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser 20 25 30 Thr Glu Asp Leu Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val 35 40 45 Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu 50 55 60 Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser 65 70 75 80 Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu 85 90 95 Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr 100 105 110 His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly 115 120 125 Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser 130 135

【００８３】配列番号：２３ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００８４】配列番号：２４ 配列の長さ：１４８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met 1 5 10 15 Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu 20 25 30 Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val 35 40 45 Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His 50 55 60 His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp 65 70 75 80 Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr 85 90 95 His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr 100 105 110 Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val 115 120 125 Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser 130 135 140 Asn Val Ser Ser 145

【００８５】配列番号：２５ 配列の長さ：１４０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met 1 5 10 15 Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu 20 25 30 Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val 35 40 45 Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His 50 55 60 His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp 65 70 75 80 Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr 85 90 95 His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr 100 105 110 Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val 115 120 125 Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro 130 135 140

【００８６】配列番号：２６ 配列の長さ：１３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met 1 5 10 15 Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asp Leu 20 25 30 Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val 35 40 45 Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His 50 55 60 His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp 65 70 75 80 Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr 85 90 95 His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr 100 105 110 Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val 115 120 125 Tyr Lys Ser 130

【００８７】配列番号：２７ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val 1 5 10 15 Ser Ser

【００８８】配列番号：２８ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００８９】配列番号：２９ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００９０】配列番号：３０ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ウシ

【００９１】配列番号：３１ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ウシ 配列 Val Thr Thr Val Val Ala Thr Pro Gly Gln Gly Pro Asp Arg Pro Gln 1 5 10 15 Glu Val Ser Tyr Thr Asp Xaa Xaa Xaa 20 25 Xaa : 未同定のアミノ酸

【００９２】配列番号：３２ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ウシ 配列 Val Ile Gly Asn Gly Ser Phe Gly Val Val Tyr Gln Ala Lys 1 5 10

【００９３】配列番号：３３ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ウシ 配列 Xaa Thr Leu Pro Val Ile Tyr Val Xaa Xaa Xaa Tyr Gln Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 Xaa : 未同定のアミノ酸

【００９４】配列番号：３４ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ウシ 配列 Leu Pro Asn Gly Arg Asp Thr Pro Ala Leu Phe Asn Xaa Thr Thr Gln 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 Xaa : 未同定のアミノ酸

【００９５】配列番号：３５ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ウシ 配列 Val Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Leu Xaa Arg 1 5 10 15 Xaa Leu Glu Tyr Thr Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Thr Pro Xaa 20 25 Xaa : 未同定のアミノ酸

【００９６】配列番号：３６ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 生物名：ウシ 配列 Val Phe Arg Pro Arg Thr Pro Pro Glu Ala Ile Ala Leu Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Leu Leu Glu Tyr Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa : 未同定のアミノ酸

【００９７】配列番号：３７ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（センスプライマー） 配列 ACN CCN CCN GAG GCN ATH GCN YT 23 N : イノシン H : A or C or T Y : C or T

【００９８】配列番号：３８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（アンチセンスプライマー） 配列 CKN GCN GGN GGN GTR TAY TC 20 N : イノシン Y : T or C R : A or G K : G or T

【００９９】配列番号：３９ 配列の長さ：５６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 ACG CCG CCG GAG GCA GTC GCG CTT TGT AGC CGT CTG CTG GAG TAT ACC 48 CCC CCG GC 56

【０１００】配列番号：４０ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（アンチセンスプライマー） 配列 CTY CGN TAG CGN GAA ACA TCG GCA GAC GAC CTC ATA TGN GG 41 N : イノシン Y : T or C

【０１０１】配列番号：４１ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（リン酸
化） 存在位置：５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg 1 5 10

【０１０２】配列番号：４２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（リン酸
化） 存在位置：８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg 1 5 10

【０１０３】配列番号：４３ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（リン酸
化） 存在位置：５，８ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg 1 5 10

【０１０４】配列番号：４４ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ（リン酸
化） 存在位置：１０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg 1 5 10

【０１０５】配列番号：４５ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 1 5 10 15

【０１０６】配列番号：４６ 配列の長さ：３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu 20 25 30 Pro Lys

【０１０７】配列番号：４７ 配列の長さ：５５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val 1 5 10 15 Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly 20 25 30 Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu 35 40 45 Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys 50 55

【図面の簡単な説明】

【図１】タウプロテインキナーゼＩの制限酵素地図を表
す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 今堀 和友 東京都町田市南大谷字11号916番地の２ 株式会社三菱化成生命科学研究所内 (56)参考文献 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．289, Ｎｏ．１（1991），ｐ．37−43 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/48 C12N 9/12 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するリン酸化酵
   素ＩＩでリン酸化し得る蛋白質またはペプチドを該リン
   酸化酵素ＩＩでリン酸化し、更に下記の理化学的性質を
   有するリン酸化酵素Ｉの作用によりリン酸化することを
   特徴とする蛋白質のリン酸化方法。 リン酸化酵素ＩＩ （ｉ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体として、タウ蛋白質
   中の、Ｃ末端側の隣にプロリンのあるセリンおよびスレ
   オニンをリン酸化し、タウ蛋白質１分子あたり４残基の
   リン酸基を導入する。 （ｊ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中で、微小管付
   随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２を特異的にリ
   ン酸化する。ヒストンＨ１とニューロフィラメントＨサ
   ブユニットもリン酸化する。β−カゼインを少しリン酸
   化する。 （ｋ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下での至適ｐＨは
   ６．５であり、チューブリン存在下での至適ｐＨは６．
   ０である。 （ｌ）作用適温：３７℃ （ｍ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下でのゲ
   ル濾過により求めた測定値は約５万であり、塩化ナトリ
   ウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を作り、そのゲル
   濾過による測定値は約１０万である。ＳＤＳ−ポリアク
   リルアミドゲル電気泳動により求めた測定値は約３万で
   あり、その他に２．３万の蛋白質があり、この２種の蛋
   白質が結合してゲル濾過では約５万になっている。 （ｎ）安定性：２５％グリセロールと０．０２％ポリオ
   キシエチレンソルビタンモノラウレート中、ｐＨ６．
   ５、温度−２０℃において少なくとも一年間安定であ
   る。 （ｏ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
   ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ2+、カルモジュリンおよびリン脂
   質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
   タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。 （ｐ）阻害：４０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌで活性が
   半減する。 リン酸化酵素Ｉ （ａ）作用：ＡＴＰをリン酸供与体として、タウ蛋白質
   中のセリンおよびスレオニンをリン酸化し、タウ蛋白質
   １分子あたり４残基のリン酸基を導入する。 （ｂ）基質特異性：脳抽出液の蛋白質の中で、微小管付
   随蛋白質であるタウ蛋白質およびＭＡＰ２を特異的にリ
   ン酸化する。ヒストンをリン酸化しない。α−カゼイン
   を少しリン酸化する。 （ｃ）至適ｐＨ：チューブリン非存在下での至適ｐＨは
   ６．５であり、チューブリン存在下での至適ｐＨは６．
   ０である。 （ｄ）作用適温：３７℃ （ｅ）分子量：０．５Ｍ塩化ナトリウムの存在下でのゲ
   ル濾過により求めた測定値は約５万であり、塩化ナトリ
   ウム非存在下ではタウ蛋白質と複合体を作り、そのゲル
   濾過による測定値は約１０万である。ＳＤＳ−ポリアク
   リルアミドゲル電気泳動により求めた測定値は約４万５
   千である。 （ｆ）安定性：２５％グリセロールと０．０２％ポリオ
   キシエチレンソルビタンモノラウレート中、ｐＨ６．
   ５、温度−２０℃において少なくとも一年間安定であ
   る。 （ｇ）活性化：既知のキナーゼの活性化因子であるｃＡ
   ＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｃａ2+、カルモジュリンおよびリン脂
   質等では活性化されない。チューブリンの重合条件で、
   タウ蛋白質のリン酸化が活性化される。 （ｈ）阻害：９０ｍＭのＮａＣｌまたはＫＣｌで活性が
   半減する。