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JP3348156B2 - 組換えアビポックスウィルス - Google Patents

組換えアビポックスウィルス

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JP3348156B2
JP3348156B2 JP50771588A JP50771588A JP3348156B2 JP 3348156 B2 JP3348156 B2 JP 3348156B2 JP 50771588 A JP50771588 A JP 50771588A JP 50771588 A JP50771588 A JP 50771588A JP 3348156 B2 JP3348156 B2 JP 3348156B2
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promoter
gene
recombinant
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JP50771588A
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パオレッティ、アンツオ
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ヘルス・リサーチ・インク
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Publication date
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Description

【発明の詳細な説明】 本出願は1988年４月25日出願の米国特許出願第186,05
4号のCIP出願であり、このCIP出願はさらに1987年10月2
0日出願の米国特許出願第110,335号のCIP出願であり、
これはさらに1987年８月28日出願の米国特許出願第090,
711号のCIP出願である。
本発明は、合成組換えアビポックスウイルス（avipox
virus）を用いて、非鳥類脊椎動物を含む脊椎動物にお
いて免疫応答を誘起する方法に関する。さらに詳細に言
えば、本発明は脊椎動物、特に哺乳類において、脊椎動
物病原体の抗原決定基をコードしかつ発現させるDNAを
含有する合成組換えアビポックスウイルスを脊椎動物に
接種することによって、脊椎動物病原体に対する免疫学
的応答を誘起する方法、及びかかる修飾アビポックスウ
イルスから成るワクチン類に関する。さらに、本発明
は、修飾アビポックスウイルス、その製造及び使用方
法、修飾アビポックスウイルスの製造において生産され
る、或いは中間体として関与するDNA配列、及びかかる
配列の製造方法に関する。
発明の背景 アビポックス、即ちアビポックスウイルスは、家禽に
感染するポックスウイルスと近縁の属である。アビポッ
クス属には、ファウルポックス（fowl pox）、カナリー
ポックス（canary pox）、ジュンコポックス（junco po
x）、ピビョンポックス（pigeon pox）、クエイルポッ
クス（quail pox）、スパロウポックス（sparrow po
x）、スターリングポックス（starling pox）、及びタ
ーキーポックス（turkey pox）種が含まれる。ファウル
ポックス種はニワトリに感染するもので、水痘とよばれ
るヒトの病気と混同してはならない。アビポックス属は
他のポックスウイルスと多くの特徴が共通しており、脊
椎動物を宿主とするポックスウイルスとしてワクシニア
と同じ亜科に属する。ワクシニアとアビポックスを含む
ポックスウイルス類は、宿主の真核細胞内で複製する。
これらのウイルス類はそれらが大きいこと、複雑である
こと、及び細胞質内の部位で複製されることで特徴付け
られる。しかし、ワクシニアとアビポックスは異なる属
であり、ウイルス分類国際委員会（International Comm
ittee on Taxonomy of Viruses）の第４回報告書、イン
タービロロジー（Intervirology）17巻、42乃至44頁（1
982）に報告されているように、おのおのの分子量、抗
原決定基、及び宿主となる種が異なっている。
アビポックスウイルスは、ヒトを含む哺乳類などの非
鳥類脊椎動物に増殖性の感染はしない。さらに、哺乳類
（ヒトを含む）の培養細胞に接種してもアビポックスは
増殖しない。アビポックスを接種した哺乳類の培養細胞
において、細胞毒性作用のため細胞は死ぬが、ウイルス
の増殖性感染の証拠は見られない。
哺乳類などの非鳥類脊椎動物に生きたアビポックスを
接種すると、接種部分にワクシニアの接種と類似した病
巣が形成される。しかし、ウイルスの増殖性の感染は起
こらない。にもかかわらず、このようにして接種を受け
た哺乳類がアビポックスウイルスに対して免疫学的に応
答することが今回判明した。これは予想外の結果であ
る。
死滅病原体又はかかる病原体の精製抗原成分から成る
ワクチンは、有効な免疫応答を誘起させるためには、ウ
イルス生ワクチンよりも大量に注入しなければならな
い。このことは、生ウイルス接種がはるかに効率的なワ
クチン接種法であることによる。比較的少量の接種で
も、問題の抗原がウイルス複製時に増幅されることか
ら、有効な免疫応答を誘起させることができる。医学的
観点から見れば、ウイルス生ワクチンは死滅病原体又は
精製抗原ワクチンを接種するよりも効果が大きく、しか
もより長時間持続する免疫性を付与する。従って、死滅
病原体又はかかる病原体の精製抗原成分より成るワクチ
ンは、生ウイルスの時よりもワクチン物質を大量に製造
する必要がある。
既に述べてきたことから明らかなように、ウイルス生
ワクチンを使用することは医学的にもまた経済的にも利
点がある。かかるウイルス生ワクチンのひとつとして、
ワクシニアウイルスから成るワクチンが挙げられる。こ
のウイルスは、組換えDNA法を用いて哺乳類病原体の抗
原の遺伝子配列を示すDNAを挿入するのに有用なウイル
スのひとつであることが、従来技術において公知であ
る。
従って、病原性生物の抗原決定基をコードするDNA配
列を含有する、任意の起源の（例えば、ウイルス、原核
生物、真核生物、合成）DNAをワクシニアゲノムの非必
須領域に挿入することによって、組換えワクシニアウイ
ルスを作製することができる方法が従来技術において開
発された。これらの方法で作製されるある種の組換えワ
クシニアウイルスは哺乳類に種々の哺乳類病原体に対す
る特異的免疫を誘起させるために用いられており、これ
らに関しては全て米国特許第4,603,112号に記載されて
おり、本明細書中に引用してある。
非修飾ワクシニアウイルスは、天然痘の予防接種に比
較的安全でかつ有効なものとして使用されてきた長い歴
史がある。しかし、天然痘根絶前の、非修飾ワクシニア
ウイルスが広く投与されていた時は、中程度の危険では
あるが、全身的ワクシニア感染という形で実際に合併症
が起きる危険があり、特に湿疹又は免疫抑制に罹患して
いる者では危険が伴っていた。ワクシニア接種により生
じる可能性のある合併症として、稀ではあるが、ワクチ
ン接種後の脳炎がある。これらの反応のほとんどは、湿
疹のような皮膚疾患、又は免疫系不全の者、又は家族に
湿疹又は免疫反応不全の者がいる人達に接種したことが
原因であった。ワクシニアは生きたウイルスであり、通
常、健常人に対しては無害である。しかし、接種後数週
間にわたり個人間で伝染する。正常の免疫応答が不全で
ある者が接種、又は最近接種を受けた者からの接触伝染
により感染した場合、重大な結果をもたらすことがあ
る。
従って、当技術における生ウイルスの接種の利点を有
しながら既に述べた問題を軽減又は消失させるような方
法は、現行技術の状態をはるかに上回る望ましい利点を
持つことがわかる。このことは、後天性免疫不全症候群
（AIDS）として公知の疾患が発症している現在におい
て、極めて重要となっている。本疾患の犠牲者は重大な
免疫不全に罹患していて、他の者にとっては安全な生ウ
イルスと直接接触、または生ウイルス製剤から成るワク
チン接種を最近受けた人と接触することにより伝染した
場合、かかるウイルス製剤により簡単に傷害を受ける。
発明の目的 本発明の目的は、病原性生物に対して脊椎動物を免疫
することができるワクチンにして、ウイルス生ワクチン
の利点を有しつつ、特に非鳥類脊椎動物を免疫するため
に用いた時、既に列挙したようなウイルス生ワクチンの
欠点も死滅ウイルスワクチンの欠点もほとんど又は全く
有さないワクチンを供することである。
本発明はさらに、かかるワクチンに使用する合成組換
えアビポックスウイルスを供することを目的とする。
本発明はさらに、鳥類及び非鳥類脊椎動物において、
哺乳類のような非鳥類脊椎動物の場合には動物体内にお
いて感染したウイルスの産生を伴った増殖性の複製を行
うことのできない合成組換えアビポックスウイルスを脊
椎動物に接種することによって、免疫応答を誘起させる
方法を供することを目的とする。哺乳類のような非鳥類
脊椎動物に接種した場合、かかるウイルスは、非ワクチ
ン接種宿主に広がる可能性を自己限定し低下させる。
本発明はさらに、脊椎動物において抗原に対する免疫
応答を誘起させる方法にして、該脊椎動物に対する病原
体の抗原決定基を含有しかつ発現させる合成組換えアビ
ポックスウイルスを含有するワクチンを脊椎動物に接種
することを含む方法を供することを目的とする。
また、遺伝子産物をコードし、かつ脊椎動物中でウイ
ルスが増殖的複製をすることなく遺伝子産物を発現させ
るDNAを含有する組換えウイルスを脊椎動物に接種する
ことによって、脊椎動物中で遺伝子産物を発現させる方
法を供することも本発明の目的である。
さらに、抗原をコードし、かつ脊椎動物中でウイルス
が増殖的複製をすることなく抗原を発現させるDNAを含
有する組換えウイルスを脊椎動物に接種することによっ
て、抗原に対する免疫応答を脊椎動物に誘起させる方法
を供することも本発明の目的である。
発明の説明 本発明の一つの態様は、アビポックスゲノムの非必須
領域における病原体の抗原をコードしかつ発現させる任
意の起源のDNAの存在によって、修飾された合成組換え
アビポックスウイルスを脊椎動物に接種することによっ
て、前記病原体に対する免疫応答を脊椎動物中に誘起さ
せる方法に関する。
別の態様においては、本発明は脊椎動物の細胞内では
増殖的複製はしないがかかる細胞中で遺伝子産物又は抗
原を発現する組換えウイルスを用いて、脊椎動物中で遺
伝子産物を発現させる或いは脊椎動物に抗原に対する免
疫応答を誘起させる方法に関する。
もう一つの態様においては、本発明は任意の起源、特
に非アビポックス起源のDNAをアビポックスゲノムの非
必須領域に挿入することによって修飾した合成アビポッ
クスウイルスに関する。
抗原をコードしかつ発現させる外来（即ち、非アビポ
ックス）遺伝子を有する人工的に修飾したアビポックス
ウイルス組換え体は、前記抗原に対する脊椎動物宿主の
免疫応答の発生を誘起させて、外来病原体に対する免疫
応答の発生を誘起させるが、かかる組換え体は、本発明
においては、死滅或いは弱毒化させた生きた生物を用い
ている従来のワクチンの欠点を、特に非鳥類脊椎動物に
接種して用いる時に、有さない新規なワクチンを作製す
るのに用いられる。
アビポックスウイルス類は鳥類又は鳥類の細胞系にお
いてのみ増殖的に複製でき、また継代することができる
ことをここでもまた述べておく必要がある。鳥類宿主細
胞から採取した組換えアビポックスウイルスは、ワクシ
ニアウイルスによる哺乳類の接種と同様の方法で哺乳類
のような非鳥類脊椎動物に接種すると、接種による病変
が生じるが、アビポックスウイルスの増殖的複製は起こ
らない。このような接種を受けた非鳥類脊椎動物でアビ
ポックスウイルスは増殖的複製を行わないにもかかわら
ず、ウイルスの発現は充分に起こり、その結果、接種さ
れた動物はこの組換えアビポックスウイルスの抗原決定
基及び該ウイルスの外来遺伝子にコードされた抗原決定
基に対して免疫学的に応答する。
鳥類に接種すると、かかる合成組換えアビポックスウ
イルスはその中に存在する任意の起源の外来DNAによっ
てコードされる抗原に対する免疫応答を誘起するばかり
でなく、宿主内でこのウイルスの増殖的複製を起こして
アビポックスベクター自体に対する予想された免疫学的
応答を引き起こす。
数人の研究者らが、組換えファルルポックス、詳細に
は家禽を防護するための動物用ワクチンとして使用する
ためのウイルスを作製することを提案して来た。ボイル
（Boyle）及びクーパー（Coupar）、ジャーナル・オブ
・ジェネティック・ビロロジー（J.Gen.Virol.）、67、
1591−1600（1986）及びビンズ（Binns）ら、イスラエ
ル・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・メディスン（Is
r.J.Vet.Med.）42、124−127（1986）。哺乳類に特異的
免疫を誘起させる方法として組換えアビポックスウイル
スを使用することに関し、換言されたことも全くなかっ
たし、また実際に報告されたこともなかった。
スティックル（Stickl）とマイヤー（Mayer）はフォ
ートシュリッテ・デア・メディツィン（Fortschr.Med）
97（40）、1781−1788（1979）で、アビポックス、詳細
にはファウルポックスウイルスのヒトへの注射について
記載している。しかし、これらの研究は、癌の化学療法
の後遺症にかかっている患者における非特異性免疫を増
強するために通常のファウルポックスを使用することだ
けに関している。組換えDNA技術は全く用いられていな
い。脊椎動物病原体の抗原をコードするDNAをアビポッ
クス中に挿入することも、また脊椎動物に特異的免疫を
誘起させる方法についても全く示唆されていない。その
代わり、この先行技術はヒト宿主の一般的かつ非特異的
な強壮効果に基づいている。
遺伝子組換えを基礎としたより完全な検討を加えるこ
とによって、本発明の修飾組換えウイルス類がいかに作
製されるかの理解に役立つであろう。
遺伝子組換えは、一般にデオキシリボ核酸（DNA）の
相同性部分を二つのDNAらせん間で交換することであ
る。（あるウイルスでは、リボ核酸（RNA）がDNAに置き
代わることができる。）核酸の相同性部分は、ヌクレオ
チド塩基の同じ配列を持つ核酸（RNA又はDNA）の部分で
ある。
遺伝子組換えは、感染した宿主細胞内で新規ウイルス
ゲノムの複製或いは産生時に自然に起きることもある。
従って、ウイルス遺伝子間の遺伝的組換えは、二種以上
の異なるウイルス又は他の遺伝子構造体に同時に感染し
た宿主細胞内で起きるウイルス複製サイクル中にも起こ
りうる。第一のゲノムのDNA部分が、第一のウイルスゲ
ノムDNAと相同のDNAを有する同時感染した第二のウイル
スゲノムの部分を組み立てる際に交換して用いられる。
しかし、組換えは、また、完全には相同とは言えない
異なるゲノムにおけるDNA部分間でも起こり得る。例え
ば、このような部分が別のゲノムのある部分と相同な第
一のゲノムに由来するが、ただし第一のゲノム内の相同
DNA部分に遺伝子マーカー又は抗原決定基をコードする
遺伝子が挿入されているような場合にも、組換えは起こ
り得るし、その組換えによる産物もその遺伝子マーカー
又は抗原決定基の存在により検出できる。
挿入DNA遺伝子配列が修飾感染性ウイルスによって良
好に発現されるためには二つの条件が必要となる。
まず第一に、修飾ウイルスが生存可能であり続けるた
めには、挿入は前記ウイルスの非必須領域内でなければ
ならない。ファウルポックスもアビポックスウイルスも
これまで示唆されてきたところによると、ワクシニアウ
イルスに関して記述されて来た非必須領域と類似の領域
を有していない。したがって、本発明のファウルポック
スの非必須領域は、ファウルポックスゲノムを断片に切
断しこの断片を大きさで分離しこれらの断片を増幅させ
るためのプラスミド構造体に挿入することによって発見
された（プラスミドとは、大腸菌を含む多くの細菌で染
色体外要素として見出された小さな環状DNA分子であ
る。抗原決定基遺伝子又は他の遺伝子マーカーのような
DNA配列をプラスミドに挿入する方法は、当技術で周知
であり、マニアチス（Maniatis）ら、モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）：実験マニュアル（A
Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）
ニューヨーク［1982］に詳細に記載されている）。次
に、遺伝マーカー及び／又は抗原をコードする遺伝子を
クローン化されたファウルポックス断片に挿入した。所
定の組換えに成功した断片は遺伝マーカー又は抗原の回
収が良好であることによって実証でき、かかる断片はフ
ァウルポックスゲノムの非必須領域に挿入されたDNAよ
り成る断片であった。
挿入DNA発現のための第二の条件は、挿入されたDNAと
適切な関係にあるプロモーターの存在することである。
プロモーターは、発現させるDNA配列の上流に位置する
ように置かなければならない。アビポックスウイルスの
性質は充分に解明されておらずまたアビポックスプロモ
ーターについてもこれまで当技術で同定されていないの
で、本発明の一部では他のポックスウイルスの公知のプ
ロモーターを発現させるDNAの上流に効果的に挿入す
る。ファウルポックスプロモーターはまた、本発明の方
法を実施しかつ本発明の産物を作るために用いられ成功
している。本発明によって、ファウルポックスプロモー
ター、ワクシニアプロモーター及びエントモポックスプ
ロモーターが組換えポックスウイルスの転写を促進する
ことが判明した。
ボイル（Boyle）とクーパー（Coupar）はジャーナル
・オブ・ジェネティック・ビロロジー（J.Gen.Virol.）
67、1591（1986）で、ワクシニアプロモーターが「（フ
ァウルポックス）ウイルスで作用することが予測され
る」という推測を発表した。この著者らは、ファウルポ
ックスTK遺伝子の場所を確認しクローン化（ボイル（Bo
yle）ら、ビロロジー（Virology）156、355−365［198
7］）して、これをワクシニアウイルスに挿入した。こ
のTK遺伝子は発現したが、恐らくそれは、ワクシニアポ
リメラーゼの機能によってこのファウルポックスTKプロ
モーターの配列が認識されたことによるのだろう。しか
し、彼らの推測にもかかわらず、この著者らはファウル
ポックスウイルスにワクシニアプロモーターを挿入する
ことはしなかったし、またファウルポックスゲノム中で
外来DNA配列が発現することも観察しなかった。他のポ
ックスウイルス由来のプロモーター、例えばワクシニア
プロモーターがアビポックスゲノム中で実際に遺伝子の
転写を促進させることは本発明以前には公知でなかっ
た。
好ましい実施例の説明 ファウルポックス及びカナリーポックスウイルスが、
本発明の外来DNAを取り込み組換えによって修飾される
好ましいアビポックス種として特に用いられた。
ファウルポックスは、特にニワトリに感染するアビポ
ックスの一種であるが、哺乳類には感染しない。本明細
書中でFP−５と呼ばれるファウルポックス株は、アメリ
カン・サイエンティフィック・ラボラトリーズ（Americ
an Scientific Laboratories）（シェーリング社（Sche
ring Corp.）の一部門）、マディソン（Madison）、ワ
イオミング州、米国獣医免許番号165、通し番号30321、
から入手可能なニワトリ胚由来の市販ファウルポックス
ウイルスワクチン株である。
本明細書中でFP−１と呼ばれるファウルポックス株
は、生後１日目のニワトリのワクチンに用いるための改
良ドゥベット（Duvette）株である。この株はO DCEP25/
CEP67/2309オクトーバー1980と呼ばれる市販ファウルポ
ックスウイルスワクチン株であり、インスティチュート
・メリークス社（Institute Merieux、Inc.）から入手
可能である。
カナリーポックスはアビポックスの一つの種である。
ファウルポックスと同様に、カナリーポックスは特にカ
ナリヤに感染するが、哺乳類には感染しない。本明細書
中でCPと呼ばれるカナリーポックス株は、LF2 CEP524 2
4 10 75と呼ばれる市販カナリーポックスワクチン株で
あり、インスティチュート・メリークス社から入手可能
である。
本発明の遺伝子組換えによってこれらのアビポックス
ウイルスに挿入されたDNA遺伝子配列には、原核生物由
来のLac Z遺伝子、非鳥類（特に哺乳類）病原体のひと
つの抗原である狂犬病糖タンパク（Ｇ）遺伝子、アビポ
ックスウイルス以外の病原性鳥類ウイルスの抗原である
ターキーインフルエンザ赤血球凝集素遺伝子、哺乳類ウ
イルスの一つであるウシ白血病ウイルスのgp51,30エン
ベロープ遺伝子、鳥類ウイルスの一つであるニューカッ
スル病ウイルス（テキサス（Texas）株）の融合タンパ
ク質遺伝子、哺乳類ウイルスであるネコ白血病ウイルス
のFeLVエンベロープ遺伝子、鳥類ウイルス／家禽の病気
であるラウス関連ウイルスのRAV−1 env遺伝子、鳥類ウ
イルスであるチキン／ペンシルバニア（Chicken/Pennsy
lvania）/1/83インフルエンザウイルスの核タンパク質
（NP）遺伝子、鳥類ウイルスである感染性気管支炎ウイ
ルス（Mass 41株）のマトリックス遺伝子とペプロマー
遺伝子、哺乳類ウイルスである単純ヘルペスウイルスの
糖タンパクＤ遺伝子（gD）が含まれている。
前記Lac Z遺伝子の単離は、カサダバン（Casadaban）
らがメソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in E
nzymology）100、293−308（1983）に記載している。狂
犬病Ｇ遺伝子の構造は、例えば、アニリオニス（Anilio
nis）ら、ネーチャー（Nature）294、275−278（1981）
に開示されている。
ワクシニアへの組み込み及び本ベクター内での発現
は、キーニィ（Kieny）ら、ネーチャー（Nature）312、
163−166（1984）によって検討されている。ターキーイ
ンフルエンザ赤血球凝集素遺伝子は、カワオカ（Kawaok
a）ら、ビロロジー（Virology）158、218−227（1987）
によって述べられている。ウシ白血病ウイルスgp51,30
env遺伝子は、ライス（Rice）らがビロロジー（Virolog
y）138、82−93（1984）に記載している。ニューカッス
ル病ウイルス（テキサス株）の融合遺伝子は、プラスミ
ドpNDV108としてインスティチュート・メリークス社か
ら入手可能である。ネコ白血病ウイルスenv遺伝子は、
ギルホット（Guilhot）らがビロロジー（Virology）16
1、252−258（1987）に記載している。ラウス関連ウイ
ルス１型は二つのクローン、pen VRVIPTとmp19env（19
0）としてインスティチュート・メリークス社から入手
可能である。チキンインフルエンザNP遺伝子は、プラス
ミドpNP 33としてセイント・ジュード小児研究病院（S
t.Jude Children's Research Hospital）のヨシヒロ・
カワオカ（Yoshihiro Kawaoka）から入手できる。IBV M
ass41マトリックス遺伝子及びペプロマー遺伝子の感染
性気管支炎ウイルスのcDNAクローンは、プラスミドpIBV
M63として、インスティチュート・メリークス社から入
手できる。単純ヘルペスウイルスgD遺伝子は、ワトソン
（Watson）らがサイエンス（Science）218、381−384
（1982）に記載されている。
以下に更に詳細に記載した組換えアビポックスウイル
スは、ワクシニアプロモーター三種のうちのひとつを組
み込む。ワクシニアのAva I H領域由来のPiプロモータ
ーはワックスマン（Wachsman）らがJ.of Inf.Dis.155、
1188−1197（1987）に記載している。さらに詳細に言え
ば、このプロモーターはＬ変異WRワクシニア株のAva I
H（Xho I G）断片に由来し、この中で前記プロモーター
は右から左への転写を指示する。このプロモーターの地
図上での位置はAva I Hの左端からおよそ1.3Kbp（キロ
ベースペア）、ワクシニアゲノムの左端からおよそ12.5
Kbpであり、Hind III C/N結合の約8.5Kbpにある。この
プロモーターの配列は、 であり、上記配列中カッコ内の記号はリンカー配列であ
る。
前記Hind III Hプロモーター（本明細書中で「HH」及
び「H6」とも呼ばれる）は、標準的な転写マッピング法
で明らかとなった。これは、下記の配列を有する。
この配列は、ローゼル（Rosel）ら、ジャーナル・オブ
・ビロロジー（J.Virol.）60、436−449（1986）によっ
て読み取り枠の上流の配列として記載されたものと同一
である。
11Kプロモーターは、ウィテック（Wittek）、ジャー
ナル・オブ・ビロロジー（J.Virol.）49、371−378（19
84）及びバーソレット（Bertholet,C.）他、プロシーデ
ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズUSA（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）82、2096−210
0（1985）に記載の通りである。
本発明の組換えアビポックスウイルス類は、当技術で
公知の合成ワクシニアウイルス組換え体を作製する前述
の米国特許第4,603,112号に開示の方法と同様に二段階
で作製した。
最初に、ウイルスに挿入すべきDNA遺伝子配列を、ア
ビポックスウイルスの非必須領域と相同のDNAを挿入し
た大腸菌（E.coli）プラスミド構造体に入れる。これと
は別に、挿入すべきDNA遺伝子配列をプロモーターに結
合させる。プロモーター・遺伝子結合物を次にプラスミ
ド構造体中に入れ、アビポックスDNAの非必須領域と相
同のDNAに対し両端で隣接させる。得られたプラスミド
構造体を大腸菌内で増殖させて増幅させる。（プラスミ
ドDNAは、外来遺伝物質を保有し増幅するために用いら
れるが、この方法は当技術で周知である。例えば、これ
らのプラスミド技術については、クレウェル（Clewel
l）がジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteri
ol.）110、667−676（1972）に記載している。宿主大腸
菌から増幅プラスミドを単離する技術は、これも当技術
で周知であり、例えば、クレウェルらがプロシーディン
グズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズUSA62、1159−1166（1969）に記載している。） 大腸菌内で増殖後単離した増幅プラスミド物質を次に
第二段階に用いる。即ち、挿入すべきDNA遺伝子配列を
含有するプラスミドをアビポックスウイルス（ファウル
ポックス株FP−１又はFP−５など）と共に例えばニワト
リ胚線維芽細胞（CEF）のような培養細胞にトランスフ
ェクションさせる。プラスミド中の相同ファウルポック
スDNAとウイルスゲノム間の組換えによって、このゲノ
ムの非必須領域において非ファウルポックスDNA配列の
存在によって修飾されたアビポックスウイルスが出来
る。
本発明及び本発明の多くの利点については例示した以
下の実施例でより理解が深まることであろう。
実施例１ ファウルポックスRNA転写因子によるワクシ
ニアプロモーターの認識を示唆する過渡的発現のアッセ
イ ワクシニアウイルスプロモーター配列に結合し、Ｂ型
肝炎ウイルス表面抗原（HBSAg）をコードする配列を含
有するいくつかのプラスミド構造体を作製した。各プラ
スミドの50μｇを、細胞１個当たり10pfuのファウルポ
ックスウイルス又はワクシニアウイルスに感染したCEF
細胞にトランスフェクションさせた。感染を24時間進行
させ、次に、凍結・融解を三回連続繰り返して溶解させ
た。
この溶解質中のHBSAgの量を、アボット・ラボラトリ
ーズ（Abbott Laboratories）の診断薬部（Diagnostic
Pivision）から市販されているオースリア（AUSRIA）II
−125Iキットを用いて評価した。HBSAgの有無を、製造
者が事前に設定した陰性カットオフ値に対する未知検体
の正味計数（バッググラウド値を減じた検体値）の比と
して示す。これを、P/N（陽性／陰性）比として示す。
この結果を表Ｉに示す。
異なるワクシニアプロモーター配列３種、つまり、DN
A複製前のワクシニア感染初期に見られるPiプロモータ
ー、DNA複製開始後のワクシニア感染後期に見られる11K
プロモーター、ワクシニア感染の初期及び後期の両期に
見られるHind III H（HH）プロモーター、を用いた。こ
れらのプロモーターについては、本明細書において既に
記載してある。
上記データから、感染細胞の溶解質中に産生されたHB
SAgが、ファウルポックス又はワクシニア転写因子によ
ってワクシニアプロモーターが認識された結果であるこ
とが示唆される。
実施例２ LAC Z遺伝子含有組換えファウルポックスウ
イルスvFP−１の作製 ファウルポックスウイルスの非必須領域内のひとつの
断片を以下のようにしてその位置を同定して単離した。
ヌクレアーゼBal31を用い、FP−5DNAの一重鎖末端の
ヘアピンループを除去した。DNAポリメラーゼエのクレ
ノウ（大）フラグメントを用いてブラントエンドを生じ
させた。ループ除去後、Bgl IIよる制限酵素消化によっ
て前記断片を作製した。この消化によって一連のFP−５
断片ができたが、これらはアガロースゲル電気泳動で分
離した。
8.8KbpのBgl IIブラントエンドを有する断片を単離
し、Bam H IとSma Iで切断してある市販のプラスミドpU
C9と連結させた。生成したプラスミドをpRW698と命名し
た。
ファウルポックス断片の大きさを小さくするため、こ
のプラスミドをHind IIIで切断してさらに二つの断片を
生じさせた。6.7Kbpの断片を捨て、残る4.7Kbpの断片を
二つ連結し新規プラスミドpRW699を作製した。
このプラスミドに11Kプロモーターで転写促進されるL
ac Z遺伝子を組み込むため、pRW699をEcoR Vで切断し
た。このEcoR Vは前記プラスミドを１ヵ所でのみ切断す
る。この挿入座をF3と名付けた。この11Kプロモーター
で転写促進されるLac ZセグメントをブラントエンドのP
st I−Bam H I断片として挿入し、新規プラスミドpRW70
2を作製した。このLac Zクローンは、前記引用文献中で
カサダバン（Casadaban）らが記載しているようにpMC18
71由来である。前記11Kプロモーターは、Bam H Iリンカ
ーによりLac Z遺伝子の第８コドンに連結された。
米国特許第4,603,112号記載のワクシニアに関する組
換え技術を用い、このpRW702プラスミドを次にニワトリ
胚線維芽細胞（CEF）で増殖させたファルウポックスウ
イルスFP−５に組換えた。この時、vFP−１を作製する
ため以下の操作を用いた。pRW702 DNA50μｇを全ゲノム
ファウルポックスDNA0.5μｇと混合し、最終容量を100
μとした。2.5M CaCl2を10μ、及び40mM Hepes、30
0mMNaCl、1.4mMNa2HPO4、10mM KCl、12mMデキストロー
スから調製した２×HEBS緩衝液（pH7）110μをこれに
添加した。室温に30分間置いた後、5pfu/細胞となるよ
うに希釈したファウルポックスウイルスプール200μ
を添加した後、この混合物を、初代CEF単層を含む60mm
ディシュ上に接種した。この時、２％ウシ胎児血清（FB
S）含有イーグル（Eagles）培地0.7mも添加した。こ
のプレートを37℃で２時間インキュベートした後、２％
FBS含有イーグル培地3mを添加しプレートを３日間イ
ンキュベートした。細胞を、凍結・融解を３回連続的に
繰り返すことによって溶解させた後、新形成ウイルス粒
子を組換え体存在下にアッセイした。
11Kプロモーターで転写促進されるLac Z遺伝子をファ
ウルポックスFP−５ゲノム中に組み換えたことによる挿
入が成功したことの証拠は、Lac Z遺伝子の発現を試験
することによって得られた。Lac Z遺伝子は酵素β−ガ
ラクトシダーゼをコードし、この酵素はクロモゲンであ
る５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
ガラクトシド（Ｘ−gal）を切断し青色のインドリル誘
導体を放出する。青色プラークを陽性組換え体として選
択した。
Lac ZのファウルポックスFP−５ゲノムへの挿入とそ
の発現の成功は、vFP−１感染CEF、BSC（サル腎細胞株
−ATCC CCL26）、VERO（サル腎細胞株−ATCC CCL 8
1）、及びMRC−５（ヒト二倍体肺細胞株−ATCC CCL 17
1）を用いた標準法及び市販の抗血清とのβ−ガラクト
シダーゼの免疫沈降によっても確認した。
組換えウイルスvFP−１によるβ−ガラクトシダーゼ
の発現を、さらに、ウサギ及びマウスにこのウイルスを
接種し、接種動物血清中のβ−ガラクトシダーゼタンパ
クに対して生じた抗体の力価の接種後の上昇を測定しそ
れが良好であることによって、インビボでも確認した。
特に、前記組換えvFP−１を感染宿主細胞から精製
し、ウサギ２匹の両側のそれぞれ２カ所に皮内注射し
た。各ウサギに総計で108pfuを接種した。
一週間おきに動物から採血し、その血清を市販の精製
β−ガラクトシダーゼ標品を抗原として用いたELISAア
ッセイで検出した。
この組換えvFP−１を接種されたウサギとマウスの双
方ともに、β−ガラクトシダーゼタンパクに対する免疫
応答を生じていることがELISA法で検出された。両種に
おいて、接種一週後にこの応答が検出できた。
実施例３ ファウルポックスウイルスFP−５からの狂犬
病Ｇ遺伝子及びLAC Z含有組換えウイルスvFP−２の作製 0.9KbpのPvu II断片をFP−５から得、標準的手法によ
りpUC9の二つのPvu II部間に挿入した。生成した構造物
pRW688.2はHinc II部位を２ヵ所、およそ30bp離れた位
置にPvu II断片内に非対称的に有しており、これによっ
てこの断片から長腕と短腕を形成させる。
オリゴヌクレオチドアダプターを、Pst I及びBam H I
部位を導入するための公知の技術を用いて、これらのHi
nc II部位間に挿入し、プラスミドpRW694を作製した。
これらの挿入座をF1と名付けた。
次に、このプラスミドをPst IとBam H Iで切断し、既
に述べた連結11Kワクシニアプロモーターを有するLac Z
遺伝子を挿入して新規プラスミドpRW700を作製した。
Piプロモーターで転写促進される狂犬病Ｇ遺伝子を作
製するため、狂犬病Ｇ遺伝子の５′末端に近接したBgl
II部位（キーニイ（Kieny）ら、上記引用文献参照）を
ブラントエンドにし、既に述べたPiプロモーターの一重
鎖部分を埋めたEco R I部位に連結した。
この構造体をpRW700のPst I部位に挿入し、その中に
外来遺伝子配列Pi−狂犬病G11K−Lac Zを有するpRW735.
1プラスミドを作製した。この挿入は、FP−５ドナー配
列のPvu II−Hinc II長腕がLac Z遺伝子に対して３′側
になるように、プラスミド中で位置づける。
得られた最終構造体は、既に述べた組換えファウルポ
ックスウイルスvFP−２作製法によってニワトリ胚線維
芽細胞に感染／トランスフェクションさせることによっ
てファウルポックスウイルスFP−５と組み換えた。この
組換えウイルスはＸ−gal染色によって選択した。
前記Lac Z遺伝子と狂犬病Ｇ遺伝子の両者が適切に挿
入されかつ発現されたことを、下記の様々な追加方法で
確認した。
特異抗体を用いた免疫蛍光法によって狂犬病抗原の位
置を決定すると、vFP−２ウイルスに感染した鳥類細胞
又は非鳥類細胞表面上で狂犬病ウイルスが良好に発現し
ていることが示された。
既に述べたように、vFP−２ウイルスに感染した鳥類
又は非鳥類細胞による狂犬病抗原及びβ−ガラクトシダ
ーゼの発現は、免疫沈降法で確認した。
本発明のvFP−２に関する実施態様が狂犬病Ｇ遺伝子
及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保有する組換えウイ
ルスの成功例であることのもうひとつの証拠は、ウサギ
２匹にvFP−２ウイルスを接種することによって得られ
た。二匹のウサギに対して１匹当たり１×108pfuのvFP
−２を皮内に接種した。１週間おきにウサギから採血し
て血清をELISAで試験し、狂犬病糖タンパク質及びβ−
ガラクトシダーゼタンパク質の特異抗体の存在を検出し
た。
下記の表IIに載せたように、ウサギ205は接種１週後
において抗β−ガラクトシダーゼ抗体をELISA試験で検
出可能な量で示した。これは２週目には4000分の１の力
価に上昇し、接種後５週まで持続した。抗原捕獲ELISA
アッセイを用いるとウサギ205の血清は、接種後３週か
ら10週まで検出可能量の抗狂犬病抗体を示した。
実施例4A ファウルポックスウイルスFP−１からの、転
写促進される狂犬病Ｇ遺伝子含有組換えウイルスvFP−
３の作製 本実施例は、前記狂犬病Ｇ遺伝子がFP−５以外のファ
ウルポックス株、特にFP−１と呼ばれるファウルポック
スウイルスの別の株によって完全に発現されることを示
すものである。
実施例３のように、FP−５におけるのと同様に0.9Kbp
のPvu II断片が非必須領域を含有するとの仮定のもと
に、FP−１からこの断片を得た。
この断片をpUC9の二つのPvu II部位に挿入し、pRW73
1.15Rと命名したプラスミドを作製した。
このプラスミドは、Pvu II断片内に約30bP離れた非対
称の位置に二つのHinc II部位を有し、これによって、
本断片の長腕と短腕を形成する。
市販のPstリンカー、（５′）−CCTGCAGG−（３′）
を二つのHinc II部位に挿入してプラスミドpRW741を作
製した。
HHプロモーターで転写促進される狂犬病Ｇ遺伝子をPs
t I部位でこのプラスミドに挿入し、新規プラスミドpRW
742Bを作製した。CEF細胞の感染／トランスフェクショ
ンによってこのプラスミドをFP−１と組み換えることに
よって、ウイルスvFP−３を得た。
前記HHプロモーターによって転写促進される読み取り
枠のATG翻訳開始コドンを、HHプロモーター内のEcoR V
部位と前記狂犬病Ｇ遺伝子内のHind III部位とをつなぐ
合成オリゴヌクレオチドを用いて狂犬病Ｇ遺伝子の開始
コドン上に重ねた。かかるHHプロモーターによって転写
促進される狂犬病Ｇ遺伝子の５′末端を公知の技術を用
いて修飾し、Pst I部位をひとつ含有させた後、この構
造体をpRW741のPst I部位に連結させpRW742Bを作製し
た。このプラスミド中におけるこの構造体の位置は実施
例３で既に述べたpRW735.1におけるものと同じである。
実施例２に述べたように、組換えを行った。生成した
組換え体をvFP−３と呼ぶ。
vFP−３ウイルスに感染した鳥類及び非鳥類細胞の両
者による狂犬病抗原の発現は、既に述べた免疫沈降法及
び免疫蛍光法で確認した。
本発明のvFP−３に関する実施態様が狂犬病Ｇ遺伝子
を発現する組換えウイルスの成功例であることのもうひ
とつの証拠が、組換えウイルスをウサギ２匹に皮内接種
することによって得られた。ウサギ２匹を１匹当たり１
×108pfuのvFP−３で皮内接種した。これらのウサギは
双方ともに、典型的なポックス病巣を生じ、これは接種
５〜６日後に最大の大きさに達した。ウサギから毎週採
血して血清をELISAで試験し、前記狂犬病糖タンパクに
特異的な抗体の存在を検出した。
５匹のラットそれぞれにvFP−３を５×107pfu皮内接
種した。全部の動物に病巣が残った。
ウサギ及びラットともに、接種後２週までに検出可能
なレベルの狂犬病に特異的な抗体を産生した。親のFP−
１ウイルスを皮内接種された対照のウサギ２匹は、検出
可能なレベルの抗狂犬病抗体を全く示さなかった。この
抗体の応答が実験に用いた動物体内における狂犬病抗原
の組換えウイルスによるデノボ合成によって誘起された
のではなくて、接種ウイルスと共に持ち込まれたか又は
組換えファウルポックスウイルス膜に組み込まれたかに
よって偶然に狂犬病抗原が導入されて起こった可能性を
除外するために、このvFP−３ウイルスを化学的に不活
化しウサギに接種した。
精製ウイルスを４℃で一晩、0.001％のβ−プロピオ
ラクトンの存在下に不活化した後、遠心分離によりペレ
ットとした。ペレットにしたウイルスを10mMトリス緩衝
液中に集めて超音波処理し、力価を検定して感染ウイル
スが全く残っていないことを確めた。ウサギ２匹に不活
化vFP−３を皮内接種し、同量の未処理の組換え体を別
の２匹に皮内接種した。病巣の大きさをモニターした。
未処理vFP−３を受けたウサギ２匹共、接種後５日で
４−５＋等級の典型的な病巣を生じた。不活化ウイルス
を接種したウサギもまた病巣を生じたが、これらは接種
後５日で２＋等級であった。
ウサギを一週おきに採血し、血清をELISAで試験し、
狂犬病の特異抗体及びファウルポックスの特異抗体の存
在を調べた。結果を以下の表IIIに示した。
この試験においては、力価終末点（血清希釈の逆数と
して示す）を、抗原投与前の血清の吸収値を差引いた
後、恣意的に0.2と定めた。ウサギ295と318は共に生き
たウイルスを投与され、狂犬病糖タンパク及びファウル
ポックスウイルス抗原に対し免疫応答を生じた。ウサギ
303と320もファウルポックスウイルス抗原に対しては免
疫応答を生じたがその力価は低かった。このウサギはど
ちらも狂犬病糖タンパクに対して検出可能な応答を生じ
なかった。
この知見から、ウサギに生じた免疫応答が組換えウイ
ルスが保有する狂犬病糖タンパク遺伝子のデノボ発現に
起因し、接種ウイルス内に偶然に持ち込まれた糖タンパ
クに対する反応ではないことが示唆される。
実施例4B ファウルポックスウイルスFP−１からの転写
能のない狂犬病Ｇ遺伝子含有組換えウイルスvFP−５の
作製 組換えによってファウルポックスゲノム中に挿入され
た外来遺伝子の発現には、プロモーターの存在が必要で
ある。HHプロモーターを欠いていること以外vFP−３と
同一の組換え体vFP−５を作製してこのことを示した。
この組換え体に狂犬病遺伝子が存在することを核酸のハ
イブリッド形成により確認した。しかし、このウイルス
に感染したCEF細胞培地中に狂犬病抗原は全く検出され
なかった。
実施例５ ファウルポックスウイルスが非鳥類細胞で複
製するか否かを決定するためのインビトロ継代実験 鳥類１種及び非鳥類２種の３種の細胞系に対しFP−１
親株又は組換えvFP−３を接種して実験を行った。CEF、
MRC−５、及びVEROのそれぞれ２枚の皿に、FP−１又はv
FP−３を細胞当り10pfuの接種の多重度で接種した。
３日後に、それぞれについて一枚の皿から細胞を採取
した。凍結・融解を連続三回繰り返し、前記ウイルスを
放出させた後、同細胞系統の新鮮単層に再接種した。こ
れを、６回連続的に継代し、実験の最後に各継代の検体
の力価を検定してCEF単層上におけるウイルス感染性を
調べた。
結果を表IV Aに示した。この結果から、CEF細胞でFP
−１およびvFP−３の双方の連続継代が可能であるこ
と、しかし、前記非鳥類細胞系統２種のいずれにおいて
も不可能であることが示唆された。感染性ウイルスは、
VERO又はMCR−５細胞中において、３又は４継代後には
検出できない。
二番目の皿は直接滴定で検出不能のウイルスが増幅後
に許容CEF細胞で検出できるかどうかを決めるために用
いられた。
３日後に、二番目の皿の細胞をかき取って採取し、こ
の細胞の３分の１を溶解し新鮮CEF単層上に接種した。
細胞変性効果（CPE）が最大となった時又は接種後７日
目に、この細胞を溶解しウイルスの収率を滴定した。結
果を表IV Bに示す。CEF細胞中における継代を用いて存
在るウイルスの全てを増幅した後、このウイルスは４又
は５継代後には検出できなかった。
絶えず感染している細胞を確立しようと試みたが失敗
した。
さらに、非鳥類細胞において連続してウイルスが発現
する証拠を検出することを試みたが、上記のウイルスの
力価の検定に用いた検体を標準イムノドットアッセイに
使用した。このアッセイでは、抗ファウルポックス抗体
及び抗狂犬病抗体を用い、それぞれの抗原の存在を検出
した。これらのアッセイの結果で力価検定の結果を確認
した。
実施例６ 他のファウルポックスFP−１組換え体:vFP−
６、vFP−７、vFP−８及びvFP−９ 組換えウイルスvFP−６とvFP−７を以下の操作で作製
した。
FP−１の5.5kbp Pvu II断片をpUC9の二つのPvu II部
位間に挿入し、プラスミドPRW731.13を作製した。次
に、このプラスミドをその唯一のHinc II部位で切断
し、HH−プロモーターを有しかつブラントエンドとした
狂犬病Ｇ遺伝子を挿入してプラスミドpRW748A及びpRW74
8Bを作製した。これらのプラスミドは、その挿入の向き
が反対であることを示している。プラスミドpRW748Aと
Ｂを次に別々に用いて、FP−１ウイルスと共にCEF細胞
にトランスフェクションさせ、組換えによってそれぞれ
vFP−６及びvFP−７を作製した。この遺伝子座を座f7と
名付けた。
FP−１の10Kbp Pvu−II破片をpUC9の二つのPvu II部
位間に挿入しpRW731.15を作製した。このプラスミドを
次に唯一のBam H I部位で切断し、次に11Kプロモーター
を有するLac Z遺伝子断片を挿入し、この挿入の向きが
逆であるpRW749AとpRW749Bを作製した。これらのドナー
プラスミドをFP−１と組換えて、それぞれvFP−８及びv
FP−９を得た。この遺伝子座を座f8と名付けた。
vFP−８及びvFP−９は、Ｘ−galによって検出されるL
ac Z遺伝子を発現した。vFP−６とvFP−７は、狂犬病特
異抗血清によって検出される狂犬病Ｇ遺伝子を発現し
た。
実施例７ 狂犬病生ウイルスによる攻撃から動物を保護
するためのvFP−３による免疫 メスのSPFマウス（４−６週齢）20匹のグループを、
マウス１匹当たり0.7乃至6.7TCID50の範囲の投与量で足
趾にvFP−3 50μを接種した（TCID50即ち組織培養感
染量は、組織培養細胞の50％が細胞変性効果を受ける量
である）。接種後14日目に各群のマウス10匹を屠殺し、
血清検体をRFFI試験のアッセイ用に採取した。残りの10
匹のマウスに対し、狂犬病CVS株を大脳に、10LD50の量
で接種して攻撃した後、14日目に生存数を数えた。
結果を以下の表V Aに示した。
本実験を12.5LD50の量の狂犬病ウイルスで攻撃して繰
り返した。結果を下記の表V Bに示す。
イヌ、ネコ各２匹に対して、組換えvFP−３のlog10 T
CID50の８倍量を一回静脈接種し免疫した。さらに、年
齢および体重が同等のイヌ２匹とネコ４匹を非ワクチン
接種対照群とした。一週おきに全動物から採血した。94
日目に、各イヌに対してインスティチュート・メリーク
ス社から入手した狂犬病ウイルスNY株の唾液腺ホモジネ
ート0.5mを２回、側頭筋に接種して攻撃した。総投与
量は大脳経路によるマウスLD50の１万倍に相当した。ネ
コ６匹を同様に、同ウイルスサスペンジョンの0.5mを
２回、首の筋肉に接種して攻撃した。ネコ１匹当たりの
総投与量は、大脳経路のマウスLD50の４万倍に相当し
た。動物を毎日観察した。非ワクチン接種の動物は全
て、狂犬病の症状を示して表VIに示した日に死亡した。
ワクチン接種を受けた動物は攻撃に対して生き残り、対
照動物の最後の１匹が死亡した３週間後まで観察した。
結果を以下の表VIに示した。
さらに、組換えウイルスvFP−２とvFP−３を幾つかの
異なる経路でウシに接種する実験を行った。
接種動物に対し、抗狂犬病抗体を６、14、21、28及び
35日に試験した。以下の表VII Aに示すように、全動物
が狂犬病抗原に対し血清学的反応を示した。
ウシはすべて接種して55日目にlog10TCID50の８倍量
を再接種され、この狂犬病抗原に対し既往反応を示し
た。1421番を除くウシ全てに対し、ワクチン再接種によ
る追加免疫を行った。1421番のウシには再度筋注で接種
した。RFFI力価を55、57、63、70、77及び86日後に測定
した。結果を表VII Bに示した。
1423番の動物のデータがvFP−２による以外、全ての
データはvFP−３である。
ウシ、ネコ及びウサギも既知量のファウルポックスウ
イルスを皮内接種し、約１週後に動物からかさぶたを採
取した。これらを破砕後生理的食塩水中に懸濁し、ウイ
ルス量を測定するために力価を検定した。
残存量の感染ウイルスしか回収できなかった。このこ
とから、インビボでは全く増殖性感染が起こらないこと
が示唆される。
実施例８ vFP−３によるニワトリの接種 組換えファウルポックスウイルスvFP−３をニワトリ
に接種し、このベクターの増殖的複製を許容する系にお
ける組換えファウルポックスウイルスによる外来DNAの
発現を示した。
白色レグホーンニワトリに対し、vFP−３をlog10TCID
50の９倍量で筋肉から、又はvFP−３をlog10TCID50の３
倍量で翼に貫通させて接種した。血液検体を採取し、ワ
クチン接種21日後に狂犬病抗体力価をRFFI試験で調べ
た。接種したニワトリの21日目の力価は、対照群の21日
目の力価に比し非常に高かった。すなわち、非感染対照
群の平均力価は0.6であったが、筋肉接種したニワトリ
の平均は1.9、貫通接種したニワトリの平均は1.2であっ
た。
実施例９ ターキーインフルエンザH5 HA抗原を発現す
る組換えファウルポックスvFP−11 本発明の組換えアビポックスウイルスを用いて鳥類病
原体に対して鳥類を免疫させることができる。
したがって、Hind III Hプロモーターで転写促進され
るA/ターキー／アイルランド/1378/83（TYHA）の赤血球
凝集素遺伝子（H5）を含有する、ファウルポックスウイ
ルスFP−１由来の新規プラスミドpRW759（下記に記載）
を用いて、親ウイルスFP−１に同時に感染しているCEF
細胞にトランスフェクトさせた。組換えファウルポック
スウイルスvFP−11を本明細書中で既に述べた技術によ
って得た。
vFP−11感染細胞による赤血球凝集素分子の合成は、
特異的抗H5抗体と標準的手法を用い、代謝により放射性
標識した感染細胞溶菌液からの免疫沈降で確認した。分
子量約63Kd（キロダルトン）の赤血球凝集素前駆体の特
異的免疫沈降と分子量44Kd及び23Kdの２つの分解生成物
が明らかとなった。非感染CEF細胞または親ウイルスFP
−１感染細胞の溶菌液からはこのようなタンパクは全く
沈降しなかった。
組換えファウルポックスvFP−11に感染した細胞中で
産生されるHA分子が細胞表面上で発現されることを調べ
るために、免疫蛍光による研究を行った。組換えファウ
ルポックスウイルスvFP−11に感染したCEF細胞は表面を
強く蛍光染色した。親ウイルスFP−１に感染した細胞で
は、全く蛍光が検出されなかった。
プラスミドpRW759を以下のようにして作製した。pRW7
42B（実施例４参照）をPst Iによる部分消化で直線状と
しこの断片をEcoR Vで再切断し狂犬病Ｇ遺伝子を除去
し、約3.4Kbpの残存断片上にHHプロモーターを残した。
これをアルカリホスファターゼ処理して、ATGにおいて
このHHプロモーターとTYHAを結合するため合成オリゴヌ
クレオチドを挿入しpRW744を作製した。
このプラスミドをDra Iで部分消化し直線状となし、
この直線状断片をSal Iで切断して大きい方の断片を再
び単離しアルカリホスファターゼ処理した。
最後に、カワオカらがビロロジー、158、218−227（1
987）で開示したように、この単離されたTYHAのSal I−
Dra Iコード配列をpRW744ベクターに挿入することによ
ってpRW759を作製した。
実施例10 インフルエンザ生ウイルスによる攻撃から鳥
類を防御するためのvFP−11による免疫 組換えファウルポックスウイルスvFP−11の免疫原性
を調べるため、ニワトリと七面鳥でワクチン接種と攻撃
実験を行った。
無菌白色レグホーンに対し、２日齢および５週齢にお
いて、家禽にファウルポックスウイルスを商業的にワク
チン接種する際に用いられる倍針（double needle）で
翼網穿刺してワクチン接種を行った。vFP−11を６×105
pfu含有する約２μを各ニワトリに投与した。年長の
ニワトリはワクチン接種前に採血し、また、全てのニワ
トリに対し、攻撃前および２週後に採血した。
比較のため、もう一群のニワトリに不活性化H5N2株の
油中水型エマルジョンから成る従来のH5ワクチンを接種
した。
不活性化H5N2ワクチンは、11日齢胚のニワトリ卵で増
殖したA/マラード（Mallard）/NY/189/82（H5N2）から
調製した。HA力価800/0.1mおよび感染力価108.5/0.1m
の感染した漿尿液を0.1％プロピオラクトンで不活性
価し、ストーン（Stone）ら、エビアン・ディジージス
（Avian Dis、22、666−674（1978）およびブルッグ（B
rugh）ら、プロシーディングズ・オブ・セカンド・イン
ターナショナルシンポジウム・オン・エビアン・インフ
ルエンザ（Proc.Second Inter.Sym.on Avian Influenz
a）、283−292（1986）に記載の如く、油中水型エマル
ジョン中に懸濁した。0.2mの容量のワクチンを静脈経
路で２日齢、５週齢のSPF白色レグホーンニワトリの大
腿筋肉内側皮膚に投与した。
３群、４群のニワトリに対しては、親ウイルスFP−１
を投与するか、全くワクチンを投与しなかった。
各ニワトリの外鼻孔に0.1mを投与し、病原性の高い
A/ターキー／アイルランド/1378/83（H5N8）またはA/チ
ック（Chick）／ペン（Pen）/1370/83（H5N2）インフル
エンザウイルスをLD50の約103倍量でニワトリに攻撃さ
せた。２日齢ニワトリはワクチン接種後６週目に攻撃
し、５週齢ニワトリはワクチン接種後５週目に攻撃し
た。ニワトリは、顔面およびトサカの膨潤およびチアノ
ーゼ、さらに足の出血（こうしたニワトリはしばしば立
つことができなかった）などによって示唆される病気の
徴候、麻痺および死亡について毎日観察した。死亡のほ
とんどが感染後４〜７日に起きた。感染後３日目に、各
生存ニワトリの気管および総排出腔から綿棒で検体を取
り、胚発生卵に接種してウイルスのスクリーニングを行
った。野生型または組換えファウルポックスウイルスを
接種したニワトリは、翼網に典型的な病巣を発症した。
針を刺した部位に３日目までに膿疱が形成され、細胞浸
潤がかさぶた形成とともに続き、７日目までに回復し
た。二次的な病巣は形成されず、非ワクチン接種の接触
したニワトリに伝染した証拠は全く見られなかった。攻
撃実験の結果を表VIIIに示し、関連血清学的所見を表IX
に示す。
ファウルポックス−H5組換え体（vFP−11）またはア
ジュバント中不活化H5N2インフルエンザワクチンを接種
したニワトリは、相同のTy/Ire（H5N8）インフルエンザ
ウイルスおよび関連してはいるが明らかに異なるCk/Pen
n（H5N2）インフルエンザウイルスによる攻撃から防御
された。これとは対照的に、親FPVを接種されたニワト
リの大半またはワクチンを全く投与されなかったニワト
リの大半は、病原性の高いインフルエンザの臨床症状を
示し、顔面およびとさかの膨潤およびチアノーゼ、足の
出血および麻痺が含まれていた。これらのニワトリの大
部分は死亡した。ワクチン接種済のニワトリは検出可能
な量のTy/Ireを示さなかったがCk/Pennの場合、検出可
能であった。
不活化および組換えワクチンの双方ともにHIおよびTy
/Ireの中和抗体を誘起したが、攻撃前にファウルポック
ス−H5組換え体vFP−11で誘起した抗体のレベルではHA
を阻害せずまた非相同Ck/Penn H5を中和しなかった。に
もかかわらず、ニワトリは、Ty/IreおよびCk/Pennイン
フルエンザウイルスの双方による攻撃から防御された。
vFP−11ワクチン接種によって誘発されたH5インフル
エンザに対する免疫は少なくとも４から６週間持続し、
かつ、交差反応性であった。さらにこの応答の持続と特
異性を調べるために、４週齢のニワトリの一群に対し
て、既に述べたようにvFP−11を翼網に接種後、１月毎
に交差反応性のCk/Pennウイルスで攻撃した。また、攻
撃前にHI抗体は全く検出できなかった。にもかかわら
ず、４ヵ月以上もニワトリは防御された。
vFP−11により発現されたH5は、また七面鳥において
防御的免疫応答を誘起する。異系交配白色七面鳥を、２
日齢、４週齢において、既に述べたように翼網接種によ
りワクチン接種した。結果を表Ｘに示した。
相同Ty/Ireウイルスによる攻撃に対し、有意の生存が双
方の年齢群で見られた。非ワクチン接種の接触七面鳥を
ワクチン接種七面鳥と一緒に飼い、組飼えウイルスの伝
染を試験した。これらの七面鳥は攻撃に耐え生存するこ
とがなかった。
実施例11 ニワトリインフルエンザ核タンパク質（NP）
遺伝子発現ファウルポックスFP−１組換えvFP−12の作
製 プラスミドpNP33は、インフルエンザウイルス チキ
ン／ペンシルバニア/1/83核タンパク質遺伝子（NP）のc
DNAクローンを含有する。およそ1.6KbpのNP遺伝子の
５′と３′末端のみが決定されていた。NPをブラントエ
ンドの５′Cla I−Xho I 3′断片として、pNP33から、S
ma Iで消化しておいたpUC9に移して、上記断片の３′末
端がpUC9のEcoR I部位に連結するようにして、pRW714を
作製した。NPの翻訳開始コドン（ATG）は下記のアンダ
ーラインを付したAha II部位を有していた:ATGGCGTC。
既に述べたワクシニアH6プロモーターを、二重鎖合成オ
リゴヌクレオチドでこのNPに結合した。この合成オリゴ
ヌクレオチドは、Eco R V部位からそれのATGまでのH6配
列を含有しており、Aha II部位でNPコード配列に入る。
このオリゴヌクレオチドは、BamH I末端とEcoR I末端双
方に適合するように合成されており、これをpUC9に挿入
してpRW755を作製した。Bam H I適合末端から始まる二
重鎖合成オリゴヌクレオチドの配列（ATGはアンダーラ
インを引いた）は： であった。
pRW755のAha IIによる直線型部分消化産物を単離し、
Eco R Iで切断した。かかるATG部位に一つのAha II切断
部位を含有しEco R Iで再切断したpRW755断片を単離し
てホスファターゼで処理した後、以下のpRW714消化産物
のベクターとして用いた。
pRW714のAha II直線部分消化産物をEco R Iで再切断
した。NPコード配列含有の約1.6Kbp Aha II−Eco R I単
離断片を上記のpRW755ベクターに挿入してpRW757を作製
した。完全H6プロモーターは、Eco R V部位の上流
（３′側）の配列を添加することによって形成した。プ
ラスミドpRW742B（実施例４に記載）は、pUC9′のNde I
部位とともに切断されたEco R V部位の下流（３′側）
のH6配列を有していた。pRW742 B Eco R V−Nde I断片
をホスファターゼで処理し、下記のpRW757断片のベクタ
ーとして用いた。pRW757の直線部分Eco R V消化産物を
単離後、Nde Iで消化し再び単離した。このpRW757断片
をpRW742Bベクターに挿入しpRW758を形成した。pRW758
のEco R I断片はH6プロモーターによる全NPを含み、DNA
ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでブラントエン
ドにした後、pRW731.13 Hin c II部位に挿入しpRW760を
作製した。pRW731.3 Hinc II部位は、実施例６でvFP−
６とvFP−７の作製に用いたFP−１座である。
ファウルポックスFP−１を救援ウイルスとして用い、
プラスミドpRW760をインビトロ組換え試験で使用した。
子孫プラークをアッセイし、インシトゥ プラークハイ
ブリッド形成を用いてプラークを精製した。遺伝子の発
現を、ヤギのポリクローナル抗NP抗血清を用いた免疫沈
降実験で確認した。vFP−12に感染したCEF細胞の溶解液
から特異的に沈降したこのタンパク質の大きさはおよそ
55KDであり、報告されたインフルエンザウイルスの核タ
ンパク質の範囲内であった。
実施例12 エビアンインフルエンザ核タンパク質（NP）
と赤血球凝集素（HA）遺伝子を発現するファウルポック
スウイルス二重組換えvFP−15の産生 A/Tyr/Ire/1378/83からの血球凝集素（HA）遺伝子に
ついては、vFP−11（実施例９）の作製で既に述べた。
二重組換え体を作製するのに際し、先ずHA遺伝子をプラ
スミドpRW731.15を用いて、vFP−８の作製のところで定
義した座f8に移した。
vFP−11の作製に用いたプラスミドはpRW759であっ
た。H6プロモーターに結合した赤血球凝集素遺伝子を、
Pst I部分消化によってこのプラスミドから移した。こ
の断片を次にDNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
トでブラントエンドとしpRW731.15ブラントエンドのBam
H I部位に挿入してpRW771を作製した。
プラスミドpRW771を次に、救援ウイルスとしてvFP−1
2を用いるインビトロ組換え試験に用いた。vFP−12組換
えウイルスは、プラスミドpRW731.13において定義した
座f7でH6プロモーターに連結した核タンパク質遺伝子を
含有する。両方の挿入部を有する組換えプラークを選択
し、インシトゥ ハイブリッド形成でプラークを精製し
て赤血球凝集素の表面発現をプロテインＡ−β−ガラク
トシダーゼ結合イムノアッセイで確認した。両方の遺伝
子の発現を二重組換えウイルスvFP−15と感染細胞溶解
液からの免疫沈降によって確認した。
実施例13 組換えカナリーポックスウイルスの作製 以下の実施例では、カナリーポックスゲノムの非必須
挿入座４個の確認と組換えカナリーポックスウイルス４
種vCP−16、vCP−17、vCP−19およびvCP−20の作製につ
いて示す。
組換えカナリーポックスvCP−16を以下のように作製
した。
3.4KbpのPvu IIカナリーポックスDNA断片をpUC9にク
ローン化し、pRW764.2を生じさせた。Eco R I部位がこ
の断片内に非対称に１ヵ所だけ見出され、短腕700bp、
長腕2.7Kbpが生じた。このプラスミドをEco R Iで消化
し、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用い
てブラントエンドとした。ブラントエンドのH6/狂犬病
Ｇ遺伝子を次にこの部位に連結し、大腸菌（E.coli）を
形質転換するのに用いた。生成したプラスミドpRW775を
インビトロ組換え試験に用いた。免疫スクリーニングで
陽性の子孫プラークを選択し、プラークを精製した。生
成した組換え体をvCP−16と命名し、挿入座をC3と名付
けた。
上記の作製に用いたプラスミドpRW764.2は、前記Eco
R I部位からの約2.4Kbp離れた唯一のBgl II部位を含有
していた。同一のクローニング方針を用いて、H6/狂犬
病Ｇ遺伝子をこの部位でプラスミドpRW764.2に連結しpR
W774を作製した。このプラスミドを用いて、C4と命名し
た挿入座を持つ組換え体vCP−17を作製した。
プラスミドpRW764.5は、カナリーポックスDNAの850bp
のPvu II断片を有し、片方の末端から400bpの断片内に
非対称な唯一のBgl II部位を有している。先に述べたク
ローニング手法と同一手法を用いて、H6プロモーターに
連結した狂犬病Ｇ遺伝子をこの部位に挿入しpRW777を作
製した。作製された安定組換えウイルスをvCP−19と命
名し、挿入座をC5と名付けた。
プラスミドpRW764.7は、片方の末端から300塩基離れ
た唯一のBgl II部位を持つ1.2Kbp Pvu II断片を含有す
る。このプラスミドをBgl IIで消化し、DNAポリメラー
ゼＩのクレノウフラグメントでブラントエンドした。ブ
ラントエンドで11Kプロモーターで転写促進されるLac Z
遺伝子を挿入してプラスミドpRW778を作製した。このプ
ラスミドを用いて作製した安定組換えウイルスをvCP−2
0と命名し、挿入座をC6と名付けた。
実施例14 ニューカッスル病ウイルスを発現するファウ
ルポックスウイルス組換えvFP−29の作製 プラスミドpNDV108はNDVテキサス株の融合遺伝子のの
cDNAクローンであり、約3.3KbpのHpa I cDNA断片から成
り、融合タンパク質をコードする配列とpBR322のSca I
部位にクローン化されるNDVをコードしたもう一つの配
列を含有する。下記に、挿入プラスミドの作製段階を述
べる。
（１） プラスミドpCE11の作製 FPV挿入ベクターのpCE11は、pRW731.13のHinc II部位
にポリリンカーを挿入することによって作製した（座f7
と命名）。pRW731.13は、FP−1DNAの5.5Kbp Pvu II断片
を含有する。非必須座は、既に実施例６で述べた安定組
換え体vFP−６の作製においてHinc II部位で定義した。
Hinc II部位に挿入したポリリンカーは以下の制限酵素
部位を有している。つまり、Nru I、Eco R I、Sac I、K
pn I、Sma I、Bam H I、Xba I、Hinc II、Sal I、Acc
I、Pst I、Sph I、Hind IIIおよびHpa Iである。
（２） プラスミドpCE19の作製 このプラスミドは、pCE11をさらに修飾したもので、
ワクシニアウイルス転写終結信号ATTTTTNT（L.ユーエン
（Yuen）およびB.モス（Moss）、ジャーナル・オブ・ビ
ロロジー、60、320−323［1986］）（この場合ＮはＡで
ある）がpCE11のSac IとEco R I部位間に挿入されてお
り、その結果Eco R I部位が消失している。
（３） NDVコード配列の挿入 融合タンパク質遺伝子の５′末端のヌクレオチド22個
以外の全てを含有する1.8Kbpのゲルで精製したBam H I
断片をpUC18のBam H I部位に挿入し、pCE13を形成し
た。このプラスミドを、コード配列の５′末端の上流の
12塩基のところでベクターを切断するSal Iで消化し
た。クレノーフラグメントで末端を埋め、このプラスミ
ドをさらに、Sal I部位の18塩基上流で切断するHind II
Iで消化した。好ましい実施態様のところで既に述べた
ワクシニアウイルスH6プロモーター及び両端にポリリン
カー配列を含有し、かつゲルで精製した146塩基のSma I
−Hind III断片をベクターに連結し、大腸菌細胞に形質
転換した。生成プラスミドをpCE16と命名した。
NDV融合タンパク質遺伝子の開始ATGコドンをH6プロモ
ーターの３′末端に配列させ、かつNDVの５′末端から
欠けているヌクレオチド22個をpCE16に補うため、相補
的合成オリゴヌクレオチドをEco R VとKpn I部位を末端
とするよう設計した。このオリゴヌクレオチド配列は であった。
作製したpCE16を次にEco R VとKpn Iで消化した。Eco
R V部位は、H6プロモーター内で開始ATGの24塩基上流
に生じる。Kpn I部位は、NDVコード配列内で前記ATGの2
9塩基下流に生じる。
オリゴヌクレオチドをアニールし、リン酸化し、前記
の直線型プラスミドに連結させた。得られるDNAを大腸
菌細胞を形質転換するのに用いた。このプラスミドをpC
E18と命名した。
このNDVコード配列をFPV挿入ベクターに挿入するため
に、pCE18（ポリリンカー領域で切断）のゲルで精製し
た1.9Kbp Sma I−Hind III断片を上述のpCE19の7.8Kbp
Sma I−Hind III断片に連結した。転写終結信号は、Sma
I部位の下流16塩基に生じる。得られたプラスミドをpC
E20と命名した。
プラスミドpCE20を、ファウルポックスウイルスFP−
１を救援ウイルスとして用いるインビトロ組換え試験に
使用した。得られた子孫をCEF単層に塗布し、このプラ
ークを、ポリクローナル抗NDVニワトリ血清を用いたβ
ガラクトシダーゼ連結プロテインＡイムノスクリーンに
供した。陽性染色プラークを選択し、プラークの精製を
４回行った後、単一集団とした、この組換え体をvFP−2
9と命名した。
実施例15 ネコ白血病ウイルス（FeLV）エンベロープ
（env）糖タンパクを発現するアビポックスウイルスの
作製 FeLV env遺伝子は、p70＋P15Eポリプロテインをコー
ドする配列を含有する。FeLV遺伝子はまず、この遺伝子
の５′側にワクシニアH6プロモーターを並置させてプラ
スミドpSD467vCに挿入させた。プラスミドpSD467vCは、
ワクシニア赤血球凝集素（HA）遺伝子を含有する1802bp
のSal I/Hind III断片を最初にpUC18ベクターに挿入す
ることによって誘導した。HA遺伝子の位置については既
に明らかにされていた（シダ（Shida）、ビロロジー15
0、451−462、［1988］）。HA遺伝子産物をコードする
読み取り枠の大半は欠損しており（ヌクレオチド443か
らヌクレオチド1311）、Bgl II・Sma I・Pst IおよびEg
a I制限酵素部位を含有する多重クローニング部位を挿
入した。得られるpSD467vCプラスミドは、マルチクロー
ニング部位の442bp上流及びこれらの制限部位の491bp下
流にワクシニア隣接腕を含有している。これらの隣接腕
は遺伝物質をマルチクローニング部位に挿入して、ワク
シニアウイルスコペンハーゲン株のHA部位へ組換えるこ
とができる。得られた組換え子孫はHA陰性であった。
H6プロモーターは好ましい実施態様で既に述べた完全
配列より成る４つのオーバーラップオリゴヌクレオチド
をアニーリングすることによっ合成した。得られた132
塩基より成る断片は、５′末端にBgl II制限部位を有
し、３′末端にSma I部位を持っていた。Bgl IIとSma I
制限部位を介してこれをpSD467vCに挿入した。得られた
プラスミドをpPT15と命名した。H6プロモーターのすぐ
下流にあるpPT15の唯一のPst I部位にこのFeLV env遺伝
子を挿入した。生成したプラスミドをpFeLV1Aと命名し
た。
FP−１組換え体の作製のため、2.4KbpのH6/FeLV env
配列をBgl II消化とPst I部分消化でpFeLV1Aから切り離
した。
Bgl II部位はH6プロモーター配列の５′境界にある。
Pst I部位はエンベロープ糖タンパク質読み取り枠の翻
訳終結信号の420bp下流にある。
この2.4Kbp H6/FeLV env配列をBam H IおよびPst I消
化pCE11に挿入した。FP−１挿入ベクターpCE11は、マル
チクローニング部位を非必須Hinc II部位に挿入するこ
とによりpRW731.13から得た。この挿入ベクターは、FP
−１ゲノムの座f7で外来遺伝子を保有するFP−１組換え
体を産生できる。組換えFP−1/FeLV挿入プラスミドをこ
こでpFeLVFIと命名した。この構造体はATG置換に対して
完全ATGを与えない。
完全ATG:ATG構造体を作るため、約1.4KbpのNru I/Sst
II断片１個をワクシニアウイルス挿入ベクターpFeLV1C
から誘導した。Nru I部位は、ATGから24bp上流の位置の
H6プロモーターに生じる。Sst II部位は、ATGから1.4Kb
p下流で翻訳終結信号の1Kbp上流に位置する。このNru I
/Sst II断片を、Sst II消化とNru I部分消化で作製した
9.9Kbp断片に連結した。この9.9Kbp断片は、pUCベクタ
ー配列である5.5KbpのFP−１隣接腕、env遺伝子の下流
部分に当る1.4KbpのFeLV配列、およびH6プロモーターの
５′側のほとんどの配列（約100bp）を含有している。
得られたプラスミドをpFeFLVF2と命名した。ATG構築の
ためのこのATGをヌクレオチド配列分析で確認した。
もうひとつのFP−１挿入ベクターpFeLVF3は、推定免
疫抑制領域（シアンシオロ（Cianciolo）ら、サイエン
ス（Science）230、453−455［1985］）（コード配列の
ヌクレオチド1548から1628まで）に相当するFeLV env配
列を除去することによって、pFeLVF2から誘導した。こ
れは、約1KbpのSst II/Pst I断片（上述の部位）をワク
シニアウイルス挿入ベクターpFeLV1Dから単離すること
によって完成した。このプラスミドpFeLV1Dは、免疫抑
制領域（ヌクレオチド1548から1628まで）に相当するen
v配列がオリゴヌクレオチドによる突然変異誘発によっ
て欠損していたことを除いては、pFeLV1Cと同様であっ
た（マンデッキ（Mandecki）、プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズUS
A、83、7177−7181［1987］）。ヌクレオチド1548から1
628までを欠損している1KbpのSst II/Pst I断片を、pFe
LVF2から誘導した残りのH6:FeLV env遺伝子を含有する1
0.4KbpのSst II/Pst I断片へ挿入した。
挿入プラスミドpFeLVF2とpFeLVF3は、救援ウイルスFP
−１のインビトロ組換え試験に用いた。この組換え体の
子孫をCEF単層に塗付し、組換えウイルスをCEF単層上の
プラークハイブリッド形成によって選択した。ハイブリ
ッド分析により同定した組換え子孫を選択し、プラーク
精製を４回行い均質集団とした。全FeLV env遺伝子を保
有するFP−１組換え体をvFP−25と命名し、免疫抑制領
域の欠損した全遺伝子を含有するFP−１組換え体をvFP
−32と命名した。この二つの組換え体は共にウシの抗Fe
LVポリクローナル血清（アンチボディーズ社（Antibodi
es、Inc.）、ディービス（Davis）、カリフォルニア）
を用いた免疫沈降によって、適切な遺伝子産物を発現し
ていることが示された。これらのFP−１組換え体がCRFK
細胞株（ATCC＃CCL94）中で前記の外来FeLV env遺伝子
を発現することも重要であり、この細胞株はネコ由来で
ある。
カナリーポックス（CP）組換え体の作製のため、前記
のH6:FeLV env配列を含有する2.2Kbp断片を、Sma IとHp
a I消化によってpFeLVF2から切り離した。このSma I部
位は、H6プロモーター配列の５′境界にある。Hpa I部
位は、エンベロープ糖タンパク質読み取り枠の翻訳終結
信号の下流180bpに位置している。
2.2KbpのH6/FeLV env配列を挿入プラスミドpRW764.2
の非必須Eco R I部位に挿入し、続いてEco R I部位をブ
ラントエンドにした。この挿入ベクターはCPゲノムの座
C4中に外来遺伝子を保有するCP組換え体を産じさせる。
この組換えCP挿入プラスミドをここでpFeLVCP2と命名し
た。この構造体は、ATG置換に対して完全ATGを１個提供
する。
挿入プラスミドpFeLVCP2を、救援ウイルスとしてCPを
用いるインビトロ組換え試験に用いた。この組換え体の
子孫をCEF単層に塗布した後、ウシ抗FeLV市販ポリクロ
ーナル血清（アンチボディーズ社、デービス、カリフォ
ルニア）を用いたβガラクトシダーゼ結合プロテインＡ
イムノスクリーン法により、組換えウイルスを選択し
た。染色陽性プラークを選別し、プラークの精製を４回
行った後、均質集団とした。完全FeLV env遺伝子を発現
する組換え体をvCP−36と命名した。
実施例16 ラウス関連ウイルスタイプ１（RAV−１）エ
ンベロープ（env）遺伝子を発現するファウルポックス
ウイルス組換え体vFP−22の作製 RAV−１エンベロープ遺伝子のクローンpenvRV1PTは、
M13mp8中にKpn I−Sac I断片としてクローン化された配
列をコードする1.1KbpのRAV−1 env DNAを含有してい
る。この断片は５′末端はそのままであるが、３′側の
配列一部を欠損しており、以下の操作に用いられた。ゲ
ルで精製した1.1KbpのpenvRV Iから誘導したEco R I−P
st I断片を、pUC9のEco R IとPst I部位に挿入し、pRW7
56を作製した。このプラスミドをKpn IとHind IIIで消
化し、ベクター中のATGの59塩基上流で切断した。既に
述べたワクシニアH6プロモーターを含有する146塩基対
のKpn I−Hind III断片を挿入し、プラスミドpCE6を作
製した。
RAV env遺伝子の開始ATGが、外来配列の欠損したH6プ
ロモーターの３′末端に隣接していることを確認するた
めに、末端のEco R VとBan II部位で二つの相補的合成
オリゴヌクレオチドを作製した。このオリゴヌクレオチ
ド配列は、 であった。
プラスミドpCE6を、H6プロモーター内でATGの24塩基
上流で切断するEco R V及びRAV envをコードする配列内
でATGの７塩基下流で切断するBan IIで消化した。このD
NA断片を連結し大腸菌細胞の形質転換に用いた。得られ
たプラスミドpCE7は、最終構築のためのH6プロモーター
と正確な５′配列を与えた。
クローンmp19env（190）は、制限酵素によるマッピン
グで全RAV−1 env遺伝子を含有することがわかった。全
遺伝子を含有するmp19env（190）の1.9KbpのKpn I−Sac
I断片をpUC18のKpn IとSac I部位に挿入し、pCE3を形
成した。このプラスミドを、RAV−１をコードする配列
内で開始ATGの132塩基下流で切断するHpa I及びこの遺
伝子の３′末端で切断するSac Iで消化した。既に述べ
たFPV挿入ベクターpCE11をSma IとSac Iで消化し、この
プラスミドをポリリンカー領域で切断した。pCE3のHpa
I−Sac断片でpCE11で連結し、pCE14を作製した。
プラスミドpCE7を次にXho IとHind IIIで消化し、H6
プロモーターと正確な５′配列を含む332塩基対断片を
生じさせた。プラスミドpCE14を、このベクターのポリ
リンカー領域で切断するHind III及びコード配列で切断
するXho Iで消化した。このDNAをpCE7から得たHind III
−Xho I断片と連結し、最終RAV−１エンベロープ遺伝子
構造体のpCE15を形成した。
このプラスミドを、ファウルポックスFP−１を救援ウ
イルスとするインビトロ組換え試験に用いた。組換え体
子孫をCEF単層に塗付し、抗RAV−１ポリクローナル血清
を用いたβ−ガラクトシダーゼ連結プロテインＡイムノ
アッセイでプラークをスクリーニングした。染色陽性プ
ラークを選別後４回プラークの精製を行い、単一集団を
得た。産生された組換え体をvFP−22と命名した。vFP−
22感染CEF溶解液を用いた免疫沈降実験から、エンベロ
ープ遺伝子の遺伝子産物２個に対応する見掛けの分子量
76.5Kdと30Kdを有する２つのタンパクが特異的に沈降し
ていることが示された。前駆体遺伝子産物は全く見られ
なかった。
予備試験で、vFP−22接種ニワトリでこのRAV−１エン
ベロープ遺伝子産物に対する免疫応答が誘起された。
実施例17 ウシ白血病ウイルス（BLV）のgp51,30エンベ
ロープ（env）遺伝子を発現するアビポックスウイルス
組換え体の作製 （１） pBLVF1とpBLVF2の作製 プラスミドpBLVF1とpBLVF2はBLVのgp51,30env遺伝子
を含有する。両プラスミドにおいて、BLV env遺伝子は
ワクシニアウイルスH6プロモーターの転写制御下にあ
り、ファウルポックス隣接腕（座f7）間でクローンされ
る。この二つのプラスミドのヌクレオチド配列は、コド
ン268位と269位を除いて等しい。（pBLVF1はこれらの二
つの位置でアミノ酸Arg−Ser含有タンパクをコードし、
一方、pBLVF2はアミノ酸Gln−Thr含有タンパクをコード
する。） pBLVF1とpBLVF2を以下の手順で作製した。プラスミド
pNS97−１は全BLV env遺伝子を含有するプラスミドであ
るが、これをBam H Iで切断し、Mst IIで部分的に切断
した。gp51,30遺伝子を全て含む2.3Kbp断片をアガロー
スゲル上で単離し、スティッキーエンドを大腸菌DNAポ
リメラーゼＩ（クレノーフラグメント）で埋めた。Pst
Iリンカーを断片の末端に連結し、Pst I消化した後に、
pTP15のPst I部位（実施例15）に連結した。これによっ
て、BLV遺伝子がワクシニアプロモーターH6に隣接して
配置される。（pTP15は、ワクシニアゲノムの非必須座
でクローン化されたワクシニアH6プロモーターを含有す
る。） このプラスミドを次にEco R Vで切断し、Ava IIで部
分切断する。5.2Kbp断片を単離し、オリゴヌクレオチド
５′−ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCAAAGAACGACG−３′
と５′−GACCGTCGTTCTTTGGGCATTACGATACAAACTTAACGGAT
−３′を用いてこのプラスミドを再び環状とした。これ
によって、BLV遺伝子とH6プロモーター間の不要塩基を
除去する。
得られたプラスミドをPst Iで切断しBgl IIで部分切
断し、プロモーターH6で転写促進されるBLV遺伝子を含
有する1.7Kbp断片を、既に述べたファウルポックスウイ
ルス挿入ベクターpCE11のBam H I−Pst I部位に座f7を
用いてクローン化した。これによって、H6プロモーター
を持つBLV遺伝子がファウルポックス隣接腕間に配置さ
れる。このプラスミドをpBLVF1と命名した。
同一の手順を用いてpBLVF2を作製したが、H6プロモー
ターを有するBLV遺伝子をpCE11にクローニングする前に
インビトロ変異導入操作をさらに行った。この変異導入
は、下記の手順で行った。プラスミドpNS97−１をXma I
で切断しStu Iで部分切断した。5.2Kbp断片を単離し、
オリゴヌクレオチド５′−CCGGGTCAGACAAACTCCCGTCGCAG
CCCTGACCTTAGG−３′と５′−CCTAAGGTCAGGGCTGCGACGGG
AGTTTGTCTGAC−３′を用いて、このプラスミドを再び環
化した。これによって、コドン268と269のヌクレオチド
配列がCGC−AGTからCAA−ACTに変化する。
（２） 組換えウイルス類の作製 前記プラスミドpBLVF1とpBLVF2を、FP−１を救援ウイ
ルスとして用いたインビトロ組換え試験に用いた。組換
え子孫はインシトゥ プラークハイブリッド形成で選択
し、この基準で集団が純粋であると判定されたら、プラ
ークをBLVgp特異モノクローナル抗体調製物を用いたβ
ガラクトシダーゼ・プロテインＡイムノアッセイでスク
リーニングした。プラスミドpBLVF1とpBLVF2からそれぞ
れ作られた組換え体vFP23とvFP24は共に、イムノスクリ
ーンで染色陽性を示し、感染細胞表面上で免疫学的に認
識可能な糖タンパクが発現されていることを示唆してい
た。
プラスミドpBLVK4とpBLVK6は、それぞれ、前記のBLV
env gp51,30遺伝子とBLV gp51,30開裂マイナス遺伝子が
含有している。両遺伝子ともに、pRW764.2の唯一のEco
R I部位（座C3）（pRW764.2については、実施例13に述
べられている）にクローン化され、ワクシニアH6プロモ
ーターの転写制御下にある。
このプラスミドは以下の手順で誘導された。pBLVF1と
pBLVF2を制限酵素Hind IIIで切断した。オリゴヌクレオ
チドBKL 1（AGCTTGAATTCA）をこの部位にクローン化
し、BLV遺伝子の３′側にEco R I部位を作製する。この
BLV遺伝子の５′側にもEco R I部位があるので、これら
のプラスミド（pBLVK1とpBLVK2）をEco R Iで切断し、H
6プロモーターで転写促進されるBLV遺伝子を含有する断
片をpRW764.2のEco R I部位にクローン化した。得られ
たプラスミドをそれぞれ、pBLVK4とpBLVK6と命名した。
これらのプラスミドを、カナリーポックスを救援ウイル
スとしたインビトロ組換え試験に用いた。組換え体を選
別し、イムノアッセイで検出されたこの糖タンパクの表
面における発現を基準として精製した。プラスミドpBLV
K4とpBLVK6からのそれぞれの組換え体をvCP27とvCP28と
名付けた。
ファウルポックス組換え体vFP23とvFP24を、さまざま
な経路でヒツジとウシに接種した。動物に二回接種し、
二回目は一回目の45日後とした。血清検体を第一回接種
の５週間後と第二回接種の２週後に採取した。gp51に対
する抗体を競合的ELISA試験で測定し、力価は競合を50
％阻害する血清希釈の逆数として表わした。結果を表XI
に示した。
検査したいずれの種も一回目の接種後には検出可能な
免疫応答を示さなかった。ヒツジもウシも共に第二回接
種後に大幅な抗体上昇を示した。
実施例18 感染性気管支炎ウイルスMass 41マトリック
ス遺伝子を発現するファウルポックスウイルスFP−１組
換えvFP−26の作製 プラスミドpIBVB63は、Mass41株のマトリックス遺伝
子の感染性気管支炎ウイルス（IBV）cDNAクローンを含
有する。pIBVB63の8Kbp Eco R I断片は、上流（５′
側）にペプロマー遺伝子を持つマトリックス遺伝子を含
有し、さらにその上流にEco R V部位がある。プラスミ
ドpRW715は、pUC9の二つのPvu II部位を結合するEco R
Iリンカーを有している。pIBVM63由来の8KbpのEco R I
断片をpRW715Eco R I部位に挿入し、pRW763を作製し
た。プラスミドpRW763の５′側のEco R I部位を欠損し
たプラスミドpRW776を作製し、このマトリックス遺伝子
下流（３′側）の唯一のEco R I部位を残した。単離し
たpRW763のEco R I部分消化直線型産物を、Eco R Vで再
び切断した。最大の断片を単離し、DNAポリメラーゼＩ
のクレノウフラグメントでブラントエンドとし、自己連
結してpRW776を産生した。構造体pRW776は全IBVペプロ
マー遺伝子と全マトリックス遺伝子を持ち、このマトリ
ックス遺伝子のあとに唯一のEco R I部位が続く。
約0.9Kbpのマトリックス遺伝子の５′及び３′末端だ
けの配列が決定されていた。翻訳開始コドン（ATG）に
始まるマトリックス遺伝子の５′配列には、以下のアン
ダーラインを付したRsa I部位を含有する。ATGTCCAACGA
GACAAATTGTAC。既に述べたH6プロモーターを合成オリゴ
ヌクレオチドでこのマトリックス遺伝子に結合した。こ
の合成オリゴヌクレオチドはEco R V部位からATGまでの
H6配列を含有しており、一番目のRsa I部位を介してマ
トリックスコード配列に挿入した。このオリゴヌクレオ
チドは、pUC9に挿入できるようにBam H IとEco R I端を
持つように合成され、pRW772を作製した。Eco R I末端
はRsa I部位の３′側となる。Bam H I適合末端から始ま
る。この二重鎖合成オリゴヌクレオチド（ATGはアンダ
ーラインで示した）の配列は である。
pRW772のRsa I部分消化直線型産物を単離し、Eco R I
で再切断した。このRsa I部位で１回切断しEco R Iで再
切断した箇所を持つpRW772断片をホスファターゼ処理
し、以下のpRW776消化産物のベクターとして用いた。
単離したpRW776の直線状Rsa I部分消化産物をEco R I
で再び切断した。Eco R I部位はマトリックス遺伝子の
３′末端をすぐ越えたところにある。上記のRsa I部位
からのマトリックスをコードする配列を含有する約0.8K
bpのRas I−Eco R I単離断片を上記のpRW772ベクターに
挿入し、pRW783を作製した。完全なH6プロモーターは、
Eco R V部位の５′に配列を添加することによって形成
した。H6プロモーターの５′末端はブラントエンドにし
てpUC9のSal I部位に挿入しEco R I部位を生じさせるHi
nf I部位であったが、このH6プロモーターの５′はpUC9
のHind III部位である。この５′H6プロモーターを含有
するHind III−Eco R V断片をpRW783 Hind IIIとEco R
V部位の間に挿入し、pRW786を作製した。pRW786 Eco R
I断片はH6プロモーターを持つ完全マトリックス遺伝子
を含有しており、DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグ
メントでブラントエンドにし、pRW731.15のブラントエ
ンドのBam H I部位（座f8）へ挿入してpRW789を作製し
た。このpRW731.15 Bam H I部位は、実施例６でvFP−８
の作製に用いたFP−１座である。
プラスミドpRW789をvFP−26の作製に用いた。組換え
プラークを選別しインシトゥ プラークハイブリッド形
成で処理した。
予備試験において、vFP−26を接種したニワトリはIBV
マトリックスタンパクに対する免疫応答が誘起した。
実施例19 感染性気管支炎ウイルス（IBV）ペプロマー
を発現するファウルポックスウイルスFP−１組換えvFP
−31の作製 感染性気管支炎ウイルス（IBV）Mass41のcDNAクロー
ンpIBVM63とそのサブクローンpRW776は、実施例18にお
けるvFP−26の作製に関して既に説明した。サブクロー
ンpRW776は4Kbp IBVペプロマー遺伝子を含有し、この遺
伝子のあとに、３′末端に唯一のEco R I部位を持つマ
トリックス遺伝子を持つ。約4KbpのIBVヘプロマー遺伝
子の５′と３′末端の配列だけが決定されていた。唯一
のXba I部位で二つの遺伝子に分離される。翻訳開始コ
ドン（ATG）で始まるペプロマー遺伝子の５′末端は、
以下のアンダーラインを付したRsa I部位を有する。ATG
TTGGTAACACCTCTTTTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTAC。既に述べ
たH6プロモーターを、合成オリゴヌクレオチドでペプロ
マー遺伝子に結合した。この合成オリゴヌクレオチド
は、Nru I部位からATGに至るH6プロモーター配列を含有
しており、その第一番目のRsa I部位を介してペプロマ
ーコード配列に挿入された。このオリゴヌクレオチド
を、pUC9に挿入するためにBam H I及びEco R Iに適合す
る末端を合成し、pRW768を作製した。Eco R I末端はRsa
I部位の３′となる。Bam H I適合末端で始まる二重鎖
合成オリゴヌクレオチドの配列（ATGはアンダーライン
で示した）は である。単離されたpRW768の直線型Rsa I部分消化産物
をEco R Iで再び切断した。上記のRsa I部位で１ヵ所切
断し、Eco R Iにより再切断された部位を含むpRW768断
片を単離し、ホスファターゼで処理し、以下のpRW776消
化産物のベクターとして用いた。
単離されたpRW776の直線型Rsa I部分消化産物をEco R
Iで再び切断した。上記のRsa I部位で１回切断しEco R
I部位までを含有する5KbpのpRW776断片を単離した。こ
の断片は、上記のペプロマーRsa I部位からマトリック
ス遺伝子の３′末端のEco R I部位に至るIBV配列を含有
する。このpRW776断片を上記のpRW768ベクターに挿入
し、pRW788を作製した。このマトリックス遺伝子を上述
のXba I部位に移した。4KbpのpRW788 Nru I−Bam H Iブ
ラントエンド断片をpRW760 Nru I−Bam H Iブラントエ
ンドベクターに挿入することによって、５′H6プロモー
ターをNru I部位に付加し、pRW790を作製した。ベクタ
ーpRW760については実施例11で述べてあり、簡単に言え
ば、非必須FP−１座f7に隣接するH6プロモーターで転写
促進されるワクシニアインフルエンザ核タンパク質であ
る。このpRW760ベクターは、Nru I部位から核タンパク
質末端のBam H Iまでの３′H6配列を除去することによ
って作製された。pRW790は、pRW731.13 Hinc II部位中
のH6プロモーター保有IBVペプロマーである。ドナープ
ラスミドpRW790をFP−１と組み換え、vFP−31を生成し
た。vFP−31感染細胞から調製したCEF溶解液を用いて免
疫沈降実験を行い、分子量約180Kdの前駆体タンパクが
少量、および90Kdの分解生成物が少量、特異的に沈降し
ていることが示された。
実施例20 単純ヘルペスウイルスgDを発現するファウル
ポックスウイルスFP−１組換えvFP−30の作製 単純ヘルペスウイルス（HSV）１型株KOS糖タンパクＤ
遺伝子（gD）をpUC9のBam H I部位に、５′Bam H I連結
Hpa IIから３′Bam H I連結Nru Iまでの断片としてクロ
ーン化した。５′末端はpUC9 Pst I部位に隣接してい
る。翻訳開始コドン（ATG）で始まるHSVgDの５′配列
は、以下のアンダーラインを付したNco I部位を含有す
る。
既に述べたワクシニアH6プロモーターを合成オリゴヌク
レオチドでHSVgD遺伝子に結合させた。Nru IからATGに
及びさらにgDコード配列のNco I部位に至るH6プロモー
ターの３′部分を含有する。このオリゴヌクレオチド
は、Pst I適合５′末端を持つように合成した。pUC9のg
DクローンをPst IとNco Iで切断し、５′HSV配列を除去
し、合成オリゴヌクレオチドと置き換えることによっ
て、pRW787を得た。この二重鎖合成オリゴヌクレオチド
の配列は、 pRW787をNru IとBam H Iで消化するとNru I部位からHSV
gDコード配列を通りBam H I部位に至る３′H6プロモー
ターを含有する約1.3Kbpの断片ができる。このpRW760ベ
クターをNru IとBam H Iで切断することについては、実
施例11で述べた。この1.3Kbp断片をpRW760ベクターに挿
入しpRW791を作製した。このpRW791ベクターは、pRW73
1.13の非必須FP−1 Hinc II部位（座f7）に、完全ワク
シニワプロモーターで転写促進されるHSVgD遺伝子を含
有する。
ドナープラスミドpRW791をFP−１と組み換えてvFP−3
0を得た。糖タンパクの表面発現が、プロテインＡ−β
−ガラクトシダーゼ連結イムノアッセイ及びHSV−１特
異血清を用いた組換えプラーク中で検出された。
実施例21 ポックスウイルスベクター中における外来遺
伝子の発現制御のためのエントモポックスプロモーター
の使用 （ａ） 背景 昆虫のポックスウイルス（ポックスウイ
ルス）は現在エントモポックスウイルス亜科（Entomo−
poxvirinae）に分類されており、甲虫類（Celeoptet
a）、鱗翅類（Lipidoptera）、直翅類（Orthoptera）の
目に属する昆虫から単離されるエントモポックスウイル
スにそれぞれ対応する三つの属（Ａ、Ｂ、Ｃ）にさらに
細く分類される。本来エントモポックスウイルスは宿主
範囲が狭く、如何なる脊椎動物中でも複製しないことが
知られている。
本研究で用いたエントモポックスウイルスは、元々イ
ンド産の感染したアムサクタ・モーレイ（Amsacta moor
ei）（鱗翅類：アークチルダエ（arctildae））の幼生
から単離したものである（ロバーツ（Roberts）とグラ
ナドス（Granados）、ジャーナル・オブ・インバーテブ
レート・パソロジー（J.Invertebr.Pathol.）12、141−
143［1968］）。このウイルスはAmEPVと命名されてお
り、Ｂ属の種型である。
野生型AmEPVをR.グラナドス（Granados）博士（ボイ
ス・トンプソン・インスティチュート（Boyce Thompson
Institute）、コーネル大学（Cornell University））
から、感染したエスチグメヌ・アクレア（Estigmene ac
rea）の幼生由来感染血リンパとして入手した。このウ
イルスはリマントリア・ジスパー（Lymantria disper）
（マイマイガ）の卵巣組織由来の無脊椎細胞系統である
IPLB−LD652Y中で複製することがわかった（グッドウィ
ル（Goodwill）ら、インビトロ（In Vitro）14、485−4
94［1978］）。この細胞を、４％ウシ胎児血清及び４％
ニワトリ血清を添加したIPL−528培地で28℃で増殖させ
た。
野生型ウイルスをLD652Y細胞でプラークアッセイし、
V1と命名したプラーク１個を以下の実験のため選択し
た。この単離物は、感染サイクル後期の感染細胞の細胞
質において、数多くの閉鎖体（occlusion bodies:OBs）
を産生する。
（ｂ） プロモーター同定 AmEPVプロモーターの同定
とマッピングを以下のようにして完了した。最近感染し
たLD652Y細胞（感染後48時間）の総RNAを単離し、32Pで
標識される最初のcDNA鎖を作製するのに用いた。このcD
NAは、AmEPVの制限消化物含有ブロットのプローブとし
て用いた。このサザンブロットで2.6KbのCla I断片上に
強いシグナルが検出され、この断片が強く発現された遺
伝子をコードすることを示していた。本断片をプラスミ
ドベクターにクローン化し、そのDNA配列を決定した。
配列データの分析は42Kdのポリペプチドをコードする
ことのできる読み取り枠を明らかにした。感染48時間後
における総RNAのインビトロ翻訳とSDS−PAGEによる生成
物の分離によって、約42Kdのポリペプチドが１個明らか
となった。
（ｃ） エントモポックスプロモーター制御下において
外来遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスの作製 エントモポックスプロモーターが脊椎動物ポックスウ
イルス系で機能するか否かを調べるため、以下のプラス
ミドを作製した。５′末端でBgl II部位に隣接する42K
遺伝子翻訳開始シグナル（以下でAmEPV42Kプロモーター
と呼ぶ）の５′側の107塩基及びEco R I部位で終結する
Ｂ型肝炎ウイルスプレS2のコード領域の３′末端の最初
の14塩基を含有するオリゴヌクレオチドを化学的に合成
した。下記にこのAmEPV42Kプロモーター配列を述べる。
このAmEPV42Kプロモーターを以下のようにしてＢ型肝
炎ウイルス表面抗原（HBVsAg）に連結した。赤血球凝集
素（HA）分子をコードするワクシニアウイルスゲノムの
非必須領域におけるワクシニアウイルス腕（HA腕につい
ては、実施例15で記載;HA領域はシダ（Shida）がビロロ
ジー、150、451−462［1986］に記載）に隣接した、プ
レS2コード領域（タイプaywがガリバート（Galibert）
らによって記載、ネーチャー、281、646−650［197
9］）及びＢ型肝炎ウイルス表面抗原を含有するpUCプラ
スミドを作製した。前述のオリゴヌクレオチドを、HBVs
Agのコード領域の唯一のEco R I部位及びHAワクシニア
腕の唯一のBgl II部位を用いてこのプラスミド中に挿入
した。得られた組換えワクシニアウイルスをvP547と命
名した。
エントモポックス42Kプロモーターの制御下における
挿入HBVsAgのコード配列の発現を、イムノアッセイを用
いて確認した。哺乳類細胞系統BSC−40の当量培養液を
親ワクシニアウイルス又は組換えvP547で感染させた。
感染後24時間で細胞を溶解させ、この溶解液を順次希釈
してニトロセルロース膜にのせた。この膜を最初はヤギ
抗HBV血清でインキュベートし、次いで、125Iプロテイ
ンＡとインキュベートした。洗浄後この膜をＸ線フィル
ムに露光させた。陽性シグナルがvP547感染培養液で検
出されたが、親ウイルス感染培養液では検出されず、哺
乳類細胞中のワクシニアウイルスによって、AmEPV42Kプ
ロモーターが認識されることを示唆していた。
上記の結果を、感染哺乳類細胞中でHBVsAgを検出する
ためのオースリアアッセイ（詳細については実施例１を
参照）を用いて確認した。AmEPV42Kまたはワクシニアウ
イルスH6プロモーターに結合したHBsAg含有ワクシニア
ウイルス組換え体を用いてBSC−40細胞を感染させ、sAg
発現レベルをオースリア試験でアッセイした。表XIIに
示すように、42Kプロモーターを用いたHBsAg発現レベル
が顕著であることがデータからわかる。
さらに、脊椎動物ポックスウイルス環境下におけるAm
EPV42Kプロモーター制御の一時的特性を確認するための
実験を行った。後期ウイルス転写を阻害し、これによっ
てDNA複製を阻害するシトシンアラビノシド40μg/mの
存在または非存在下において、BSC−40細胞の当量培養
液をvP547で感染させた。感染24時間後においての発現
レベルをオースリア試験でアッセイした。この結果か
ら、この42Kプロモーターがワクシニアウイルス複製系
中の初期プロモーターとして認識されることが示唆され
た。
哺乳類の系における外来遺伝子の発現にAmEPV42Kプロ
モーターを使用することが無脊椎動物の系における遺伝
子発現にオートグラファ・カリホルニカ（Autographa c
alitornica）NPVポリヘドリンプロモーターを使用する
こと（ラッコウ（Luckow）とサマーズ（Summers）、バ
イオテクノロジー（Biotechnology）６、47−55［198
8］）とは明らかに異なることに注目すべきである。ポ
リヘドリンプロモーターは、哺乳類細胞中の転写機構に
よっては認識されない（ティラ（Tjla）、ビロロジー、
125、107−117［1983］）。哺乳類細胞においてAmEPV42
Kプロモーターを使用することが、昆虫以外のウイルス
ベクター中の外来遺伝子を非無脊椎細胞中で発現させる
のに昆虫ウイルスプロモーターが利用された最初の例で
ある。
アビポックスウイルス類が同様に42Kエントモポック
スプロモーターを認識するかどうかを調べるため、下記
の実験を行った。CEF細胞の同一の培養液に対し、細胞
１個当たり10pfuのファウルポックスウイルス、カナリ
ーポックスウイルス、又はワクシニアウイルスを接種
し、同時に１）42Kプロモーターに連結したHBVプレーS2
＋sAgコード配列を含有するプラスミド42K.17、又は
２）既に述べたワクシニアウイルスH6プロモーターに連
結したHBVsAgのコード配列を含有するプラスミドpMP15.
spsPのどちらかのプラスミド25gで形質転換した。24時
間後に培養液を凍結して細胞を溶解させ、オーストリア
試験を用いて溶解液におけるHBVsAgの存在を分析した。
表XIIIに示した結果を定量的に検討すべきである。こ
の結果、ファウルポックスおよびカナリーポックス双方
の転写機構が42Kプロモーターを認識でき、かつ、連結H
BVsAgコード配列の転写を可能とすることが示唆され
る。発現レベルはワクシニアウイルスH6プロモーターで
得られるよりも低いが、陰性対照で得られたバックグラ
ウンドレベルよりも充分に高い。
実施例22 生狂犬病ウイルス攻撃に対してマウスを防御
するためのVCP−16による免疫処置 ４〜６週齢マウス20匹の群の足蹠に２つの組換え体
（ａ）vFP−６（実施例６に記載したファウルポックス
狂犬病組換え体）及び（ｂ）vCP−16（実施例13に記載
したカナリーポックス狂犬病組換え体）のどちらかの所
定量希釈液50乃至100μを接種した。
14日に各群からマウス10匹を屠殺し血清を採取した。
実施例７に記載したRFFI試験を用いて血清中の抗狂犬病
力価を計算した。各群の残りのマウス10匹に対し、実施
例７で用いた狂犬病ウイルスCVS株を脳内接種して攻撃
した。各マウスは、マウスのLD50の16倍に相当する30μ
を投与された。28日に生存マウスを調べ、50％防御量
（PD50）を計算した。結果を表XIVに示す。
vFP−６の接種から判明したマウスの防御レベルは、
実施例７で検討したファウルポックス組換え体vFP−３
の接種で示された結果を確認するものである。vCP−16
の接種よってもたらされる防御レベルはかなり高い。算
出PD50を基準とした時、狂犬病の攻撃に対する防御にお
いては、ファウルポックス狂犬病組換え体よりもカナリ
ーポックス狂犬病組換え体の方が100倍有効である。
実施例23 外来遺伝子発現のためのファウルポックスプ
ロモーターエレメントの使用 I. 25.8キロダルトン（KD）の遺伝子産物をコードする
ファウルポックス遺伝子の同定 SDSポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルーで染色
してファウルポックス（FP−１）感染CEF溶解液中に存
在するタンパク質種を染色することによって、見掛けの
分子量25.8KDの主要な分子種が明らかとなった。このタ
ンパク質は非感染細胞溶解液中には存在しなかった。感
染後特定の時期に合成されたタンパク質を35S−メチオ
ニンで放射性標識するパルス実験から、FP−１誘発タン
パクが豊富にあることが示され、かつ、このタンパクが
感染後６時間から54時間までに合成されることが示唆さ
れた。ピークレベルでは、このFP−1 25.8KDのタンパク
質は、細胞溶解液中に存在する総タンパクのおよそ５％
から10％までを占める。
FP−１誘発25.8KDタンパク質が多量に存在することか
ら、この遺伝子産物をコードする遺伝子が強力なFP−１
プロモーターエレメントによって制御されていることが
示唆された。ポックスウイルス組換え体内における外来
遺伝子発現への使用に関して、このプロモーターエレメ
ントの位置を決定するために、感染54時間後にFP−１感
染CEF細胞からポリゾーム調製物を得た。RNAをこのポリ
ゾーム調製物から単離して、ウサギ網状赤血球のインビ
トロ翻訳系に用いた時、主に25.8KDのFP−１タンパク質
を産生した。
このポリゾームRNAを、オリゴ（dT）12−18をプライ
マーとして用いる最初のcDNA鎖合成の鋳型として用い
た。この最初のcDNA鎖を、FP−１ゲノム消化産物のサザ
ンブロット分析におけるハイブリッド形成プローブとし
て用いた。これらのハイブリッド形成分析の結果から、
前記25.8KDタンパク質をコードする遺伝子が10.5Kbp Hi
nd III断片に含まれていることが示唆された。次にこの
ゲノムHind III断片を単離して市販ベクターpBS（スト
ラッタジーン（Stratagene）、ラ・ジョラ（La Joll
a）、カリフォルニア）に連結し、このクローンをpFP23
K−１と命名した。pFP23K−１の消化物のプローブとし
て最初のcDNA鎖を用いてハイブリッド形成分析を行った
ところ、25.8KDタンパク質遺伝子が3.2KbpのEco R V小
断片に位置することが判明した。この断片をpBS中でク
ローン化し、pFP23K−２と命名した。
約2.4KbpのこのFP−1 Eco R V断片の塩基配列はサン
ガーのジデオキシチェインターミネーター法（サンガー
（Sanger）等、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズUSA、74、5463−546
7［1977］）で決定した。配列の分析から、分子量25.8K
Dの遺伝子産物をコードする読み取り枠（ORF）が明らか
になった。このORFをpBSベクター中でバクテリオファー
ジT7ポリメラーゼによりインビトロランオフ転写する
と、ウサギ網状赤血球インビトロ翻訳系（プロメガ・バ
イオテック（Promega Biotec）、マジソン（Madiso
n）、ウィスコンシン）に用いた場合見掛けの分子量25.
8KDのポリペプチド種を産生するRNA種が得られた。この
ポリペプチドは、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で、F
P−１感染CEFs溶解液中で観察される豊富な25.8KDのタ
ンパク質と泳動度が同じである。これらの結果から、こ
れが、FP−１が誘発した多量に存在する25.8KD遺伝子産
物をコードする遺伝子であることが示唆される。
II. FP−１およびワクシニア組換え体においてネコ白血
病ウイルス（FeLV）env遺伝子を発現させるためのFP−1
25.8KD遺伝子の上流プロモーターエレメントの使用 FP−1 25.8KD遺伝子制御領域（FP 25.8Kプロモータ
ー）及び21bpの25.8KD遺伝子コード配列を含有する270b
p Eco R V/Eco R I断片をpFP23K−２から単離した。pFe
LV 25.8F1とpFeLV 25.81Aを誘導するために用いたFP 2
5.8Kプロモーター領域のヌクレオチド配列を以下に示
す。この270個のヌクレオチド配列は、25.8KD遺伝子産
物の開始コドン（ATG）の上流の249個のヌクレオチドと
コード配列の最初の21bpを示す。
この断片をブラントエンドとしてFeLV env配列を含有
するSma I消化FP−１挿入ベクター（pFeLVF1:実施例15
参照）へ挿入した。この挿入ベクターは、FP−１ゲノム
のf7座による組換えを可能とした。このFP 25.8Kプロモ
ーター上流配列をFeLV env遺伝子の５′側に挿入しそれ
らが正しい配向であることを配列分析で確認した。この
挿入は、ATG置換に対して完全ATGを付与することはない
が、しかし、前記25.8KD遺伝子によって提供されたATG
はこのFeLV env ATGの枠外にあるので、融合タンパクは
形成されない。FeLV env遺伝子の上流にFP25.8KDプロモ
ーターを含有するFP−１挿入プラスミドをpFeLV25.8F1
と命名した。
ワクシニアウイルス挿入ベクターpFeLV1AはFeLV遺伝
子を保有しており（実施例15参照）、このベクターを用
いて同様の構造体を調製した。このH6プロモーターを、
Bgl IIとSma Iによる消化でpFeLV1Aから切断した。Bgl
II制限部位をブラントエンドとした後、FP25.8Kプロモ
ーターを含有するブラントエンド化Eco R V/Eco R I断
片（270塩基）をFeLV env遺伝子の５′側に隣接するよ
うに挿入した。この構造体を配列分析で確認した。この
組換え体にもATG置換に対して完全なATGはないが、25.8
KD遺伝子のATGがFeLV遺伝子のATGを持つ枠内にはない。
ワクシニア（コペンハーゲン株）挿入ベクターはFeLV遺
伝子の５′側に隣接する25.8KD遺伝子上流領域を保有し
ておりpFeLV25.81Aと命名した。
この挿入プラスミドpFeLV25.8F1とpFeLV25.81Aを、救
援ウイルスとしてのFP−１（pFeLV25.8F1）とワクシニ
アウイルスコペンハーゲン株（pFeLV25.81A）によるイ
ンビトロ組換えに用いた。この組換えの子孫を適当な細
胞単層に塗付後、組換えウイルスをβガラクトシダーゼ
連結プロテインＡイムノスクリーンとウシ抗FeLV血清
（アンチボディーズ社、デービス、カリフォルニア）に
よって選択した。予備的結果から、このFP25.8Kプロモ
ーターがポックスウイルス組換え体中における外来遺伝
子の発現を制御できることが示唆された。
実施例24 家禽中におけるvFP−６とvCP−16の安全性お
よび有効性 アビポックス組換え体２種vFP−６とvCP−16（実施例
６と実施例13に記載）を18日齢ニワトリ胚、１日齢ニワ
トリおよび28日齢ニワトリに接種し、これらのニワトリ
の反応を３つの基準、すなわち１）孵化率、ワクチンに
対する反応および死亡率に及ぼすワクチンの影響、２）
狂犬病糖タンパク質で誘起された免疫応答、３）ファウ
ルポックス抗原で誘起された免疫応答、に基づいて評価
した。以下に実施した実験を記す。
A.安全性試験 18日齢20匹を１群とし、これらの漿膜腔
にvFP−６またはvCP−16のいずれかのlog10TCID50の3.0
または4.0倍量を接種した。孵化後ニワトリを14日間観
察し、血清を採取した。ニワトリ胚に接種した組換え体
２種は卵の孵化率に全く影響を及ぼさず、またニワトリ
は14日の観察期間において健常のままであった。
１日齢のSPFニワトリ10匹からなる群に対し、筋注で
前記組換え体のいずれかのlog10TCID50の3.0倍量を接種
した。ニワトリを28日間観察し、接種後14日と28日にお
いて血清検体を採取した。いずれの組換え体でも接種部
位でワクチン反応は全く見られず、ニワトリは28日の観
察期間中健常であった。
28日齢ニワトリ10匹から成る群に対し、組換えウイル
スのいずれかを接種した。投与量は、筋肉経路で3.0log
10TCID50または皮膚（翼網）経路で3.0log10TCID50のい
ずれかとした。ニワトリを28日間観察し、接種後14日と
28日に血清検体を採取した。いずれの組換え体を筋注し
ても、反応は全く見られなかった。皮膚接種によりファ
ウルポックスは極めて小さいワクチン反応が生じたが、
病巣の大きさは異なっていた。カナリーポックス接種に
よって、接種部位に通常の皮膚病巣が生じた。病巣部は
全て、実験終了時までに退縮した。
B.免疫反応 実施例７で先に述べたRFFI試験を用いて、
狂犬病糖タンパクに対する抗体レベルを評価した。各群
の結果を、23.4IUを含有する標準血清をもととし各血清
の力価幾何平均を国際単位（International Units）（I
U）に換算して表わした。最小陽性レベルを1IUと定め、
陽性ニワトリのパーセントを求めるに用いた。アビポッ
クスウイルス類に対する抗体を、ファウルポックスウイ
ルス株を抗原として用いたELISA法で検査した。各血清
検体を20分の１および80分の１に希釈した。陽性血清と
陰性血清を用いて標準曲線を描いた。最小陽性レベル
は、種々の値の陰性血清の平均プラス２標準偏差で算出
した。
血清学的検査結果を、vFP−６については表XVに、vCP
−16については表XVIに示した。
vFP−６またはvCP−16のいずれかを接種した胚で、狂
犬病抗原またはファウルポックス抗原に対する限定され
た血清学的反応が観察された。前記ファウルポックスベ
クターは、カナリーポックスよりも多くのニワトリにお
いて両方の抗原に対する血清学的反応を誘起したが、こ
の反応もやはりさまざまであった。
１日齢でvFP−６を接種されたニワトリは、良好な血
清学的反応を示し、全てのニワトリが接種後28日までに
狂犬病抗原およびファウルポックス抗原に対し血清陽性
であった。vCP−16接種に対する反応ははるかに低く、2
8日目で狂犬病糖タンパクに対しニワトリの40％が血清
陽性でありアビポックス抗原に対しニワトリの10％が血
清陽性であった。
28日齢で筋肉経路でvFP−６を接種したニワトリは、
接種後14日までに両方の抗原に対して100％のセロコン
バージョンをしていた。皮膚接種後ニワトリの大部分も
セロコンバージョンしていたが、狂犬病抗原およびアビ
ポックス抗原の双方に対し得られた力価は低かった。既
に述べたように、筋肉および皮膚経路の双方でvCP−16
を接種されたニワトリはさまざまな反応を示し、筋肉内
接種の狂犬病に対し、最大70％のセロコンバージョンを
示した。カナリーポックス接種後のアビポックス抗原に
対する低レベルのセロコンバージョンは、このウイルス
類間の血清学的近縁性の程度を反映しているのかもしれ
ない。
前記の結果から、vFP−６およびvCP−16の両方ともに
ある年齢域のニワトリに接種しても安全であることが示
唆された。ファウルポックスベクターvFP−６は、ニワ
トリにおける免疫反応惹起に関しより効果的であるよう
に思われる。しかしアビポックスウイルスであるファウ
ルポックスおよびカナリーポックスの両方の組換え体
は、卵中における免疫化に有効であるということは重要
である。
実施例25 子豚にvFP−６を接種することの安全性と免
疫原性 １群子豚３匹から成る２群に対し、２投与経路のひと
つで組換えvFP−６を接種した。
ａ）子豚３匹に筋肉内接種で8.1log10TCID50を投与し、 ｂ）子豚３匹に経口接種で同量を投与した。
全動物から週間隔で採血後、同経路・同投与量で35日
目に追加接種した。子豚の臨床徴候を毎日観察した。血
清は、ELISA法および血清中和検査で抗ファウルポック
ス抗体を調べた。狂犬病抗体をRFFI試験でアッセイし
た。
子豚は全て良好な健康状態を保ち、接種後病巣部は全
く見られなかった。体温曲線は正常で、接種動物と非接
種動物間で全く違いがなかった。
ELISAおよび血清中和で測定したところ、筋肉内経路
および経口経路で接種を受けた子豚の両方ともが、ファ
ウルポックス抗原に対する血清学的反応を誘起した。二
次接種後において、二次反応が著明であった（結果を示
さず）。RFFI試験で測定すると、全子豚が狂犬病糖タン
パクに対する免疫学的反応を発症し、両経路による追加
効果は顕著である。これらの結果を表XVIIに示す。
前記結果から、ファウルポックス／狂犬病組換え体の
接種が子豚において無害であること、およびこの組換え
体は経口または筋肉内接種による狂犬病糖タンパクに対
し顕著な免疫応答を誘起させることができることが示唆
される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:92 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (31)優先権主張番号 １８６，０５４ (32)優先日 昭和63年４月25日(1988．4．25) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ２３４，３９０ (32)優先日 昭和63年８月23日(1988．8．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (56)参考文献 特開 昭58−129971（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−168279（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−500518（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−502586（ＪＰ，Ａ) 国際公開86／105806（ＷＯ，Ａ１) Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．160，Ｎ ｏ．１，（1987），Ｐ．203−209 Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｖｏ ｌ．30，Ｎｏ．１，Ｐ．24−27 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．156，Ｐ. 355−365（1987年３月)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒト以外の哺乳類において免疫応答を誘起
    させる方法であって、アビポックスウイルスゲノムの非
    必須領域中に前記哺乳類に対する病原体の抗原をコード
    する外来DNAとこのDNAを発現させるためのプロモーター
    とを含み、前記哺乳類において増殖的複製をしない組換
    えアビポックスウイルスを、前記哺乳類に接種すること
    を特徴とする方法。
  2. 【請求項２】前記アビポックスウイルスが、ファウルポ
    ックスウイルス及びカナリーポックスウイルスからなる
    群から選択される、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】前記接種を、皮下、皮内、筋内注射、経口
    又はインオバム（in ovum）で行う、請求項１又は２記
    載の方法。
  4. 【請求項４】前記抗原が、狂犬病抗原、狂犬病Ｇ抗原、
    ウシ白血病ウイルスのgp51、30エンベロープ抗原、ネコ
    白血病ウイルスのFeLVエンベロープ抗原、及び単純ヘル
    ペスウイルスの糖タンパクＤ抗原からなる群から選択さ
    れる、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】前記プロモーターが、Piワクシニアプロモ
    ーター、Hind III（HH及びH6）ワクシニアプロモータ
    ー、11Kワクシニアプロモーター、25.8KD FP−１ファ
    ウルポックスプロモーター及びAmEPV 42Kエントモポッ
    クスプロモーターからなる群から選択される、請求項１
    〜４のいずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】前記組換えアビポックスウイルスが、前記
    外来DNA及びプロモーターが座F1又は座F3に挿入されて
    いるファウルポックスウイルス株５である、請求項１〜
    ５のいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】前記組換えアビポックスウイルスが、前記
    外来DNA及びプロモーターが座F7又は座F8に挿入されて
    いるファウルポックスウイルス株１である、請求項１〜
    ５のいずれか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】前記組換えアビポックスウイルスが、前記
    外来DNA及びプロモーターが座C3、座C4、座C5又は座C6
    に挿入されているカナリーポックスウイルスである、請
    求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
JP50771588A 1987-08-28 1988-08-24 組換えアビポックスウィルス Expired - Lifetime JP3348156B2 (ja)

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US110,335 1987-10-20
US18605488A 1988-04-25 1988-04-25
US186,054 1988-04-25
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US234,390 1988-08-23

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