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JP3345401B2 - 複合した混合物中のタンパク質またはタンパク質機能の迅速定量分析 - Google Patents

複合した混合物中のタンパク質またはタンパク質機能の迅速定量分析

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JP3345401B2
JP3345401B2 JP2000566460A JP2000566460A JP3345401B2 JP 3345401 B2 JP3345401 B2 JP 3345401B2 JP 2000566460 A JP2000566460 A JP 2000566460A JP 2000566460 A JP2000566460 A JP 2000566460A JP 3345401 B2 JP3345401 B2 JP 3345401B2
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マイケル エイチ． ゲルブ，
スティーブン ピー． ジジ，
シー． ロナルド スコット，
フランティセック トゥレセック，
スコット エイ． ガーバー，
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University of Washington
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Publication date
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、米国科学財団科学技術センター
分子生物工学（補助金５Ｔ３２ＨＧおよびＢＩＲ９２１
４８２１）ならびに国立衛生研究所（ＮＩＨ補助金ＲＲ
１１８２３、Ｔ３２ＨＧ０００３５、ＨＤ−０２２７４
およびＧＭ６０１８４）からの資金援助によってなされ
た。合衆国政府は、本発明において特定の権利を有す
る。
【０００２】（関連出願の相互参照） 本出願は、１９９８年８月２５日に出願された米国仮特
許出願第６０／０９７，７８８号および１９９８年９月
３日に出願された同第６０／０９９，１１３号から、米
国特許法１１９（ｅ）項に基づく優先権を有し、これら
両方は、その全体おいて参照として援用される。
【０００３】（発明の背景） ゲノム技術は、原則として、完全なゲノム配列を決定
し、細胞中で発現された各遺伝子についてｍＲＮＡレベ
ルを定量的に測定することが可能な点まで進んでいる。
いくらかの種について、今や完全なゲノム配列が決定さ
れ、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉ
ａｅの一本の鎖について、各発現された遺伝子について
のｍＲＮＡレベルが、種々の増殖条件下で正確に定量化
された（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，１９９７）。比較ｃ
ＤＮＡ配列分析および関連する技術は、ｍＲＮＡレベル
における遺伝子発現における誘導される変化を、調査さ
れる細胞または組織によって発現される多数の遺伝子
（ある場合では、すべての遺伝子）の発現レベルを同時
にモニターすることによって決定するために使用されて
いる（Ｓｈａｌｏｎら、１９９６）。さらに、生物学的
技術およびコンピューター技術が、特定の機能を遺伝子
配列と関連させるために使用されている。生物学的シス
テムの構造、制御および機構において、これらの技術に
よって得られたデータの解釈は、かなりの挑戦として認
識されている。特に、ゲノム分析のみによって生物学的
プロセスの機構を説明するのは非常に困難である。
【０００４】タンパク質は、ほとんどすべての生物学的
プロセスの制御および実行に対して必須である。合成の
速度およびタンパク質の半減期ならびに従ってそれらの
発現レベルはまた転写後に制御される。さらに、タンパ
ク質の活性は、しばしば転写後の修飾（特にタンパク質
リン酸化）によって修飾され、ＤＮＡおよびタンパク質
を含む他の分子とそのタンパク質の関係に依存する。従
って、タンパク質の発現のレベルも、タンパク質の活性
の状態も両方とも、遺伝子配列からも対応するｍＲＮＡ
転写の発現レベルさえからも直接的には明らかではな
い。生物学的システムの完全な記述が、そのシステムを
構成するタンパク質の同定、定量および活性の状態を示
す測定を含むことは必須である。細胞または組織中で発
現されたタンパク質の大規模な（最終的には全体的な）
分析がｐｒｏｔｅｏｍｅ分析と呼ばれている（Ｐｅｎｎ
ｉｎｇｔｏｎら、１９９７）。
【０００５】現在において、タンパク質分析技術は、ゲ
ノム技術の自動化のスループットおよびレベルに達して
いない。ｐｒｏｔｅｏｍｅ分析の最も一般的な実施は、
最も一般的に二次元ゲル電気泳動（２ＤＥ）による複合
したタンパク質のサンプルの分離、および引き続く分離
されたタンパク質種の配列同定に基づく（Ｄｕｃｒｅｔ
ら、１９９８；Ｇａｒｒｅｌｓら、１９９７；Ｌｉｎｋ
ら、１９９７；Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら、１９９６；Ｇ
ｙｇｉら、１９９９；Ｂｏｕｃｈｅｒｉｅら、１９９
６）。このアプローチは、強力な質量分析技術の発展、
ならびタンパク質およびペプチド質量スペクトルデータ
と配列データベースとを関連付け、従って素早く決定的
にタンパク質を同定するコンピューターアルゴリズムの
発展によって大変革された（Ｅｎｇら、１９９４；Ｍａ
ｎｎおよびＷｉｌｍ、１９９４；Ｙａｔｅｓら、１９９
５）。この技術は、銀染色を含む従来のタンパク質染色
法によって検出可能な必須の任意のタンパク質の同定を
現在可能にする感度のレベルに達している（Ｆｉｇｅｙ
ｓおよびＡｅｂｅｒｓｏｌｄ、１９９８；Ｆｉｇｅｙ
ら、１９９６；Ｆｉｇｅｙら、１９９７；Ｓｈｅｖｃｈ
ｅｎｋｏら、１９９６）。しかし、サンプルがプロセス
される引き続く方法は、サンプルのスループットを制限
し、最も敏感な方法は、自動化が困難であり、低量のタ
ンパク質（例えば調節タンパク質）は、前濃縮なしでは
検出を逃れ、従って、技術の動的な範囲を事実上制限す
る。２ＤＥ／（ＭＳ）N法において、タンパク質は、２
ＤＥゲルの染色点の濃度測定によって定量化される。
【０００６】マイクロキャピラリー液体クロマトグラフ
ィー（μＬＣ）およびデータベース検索と組み合わせた
自動化データ依存電気スプレイイオン化（ＥＳＩ）タン
デム型分子質量分析（ＭＳn）のための方法および機器
の発展は、ゲル分離されたタンパク質の同定の感度およ
びスピードを有意に増加した。ｐｒｏｔｅｏｍｅ分析に
対する２ＤＥ／ＭＳnアプローチの代替として、複合し
たタンパク質混合物の消化によって生成されるペプチド
混合物のタンデム型分子質量分析による直接分析が、提
案された（Ｄｏｎｇｒ‘ｅら、１９９７）。μＬＣ−Ｍ
Ｓ／ＭＳはまた、ゲル電気泳動分離なしで混合物から直
接個々のタンパク質の大規模同定に首尾よく使用され
た。（Ｌｉｎｋら、１９９９；Ｏｐｉｔｅｋら１９９
７）。これらのアプローチがタンパク質同定を劇的に加
速しながら、分析されたタンパク質の量は、容易には決
定され得ず、これらの方法は、２ＤＥ／ＭＳ／ＭＳアプ
ローチによっても遭遇する動的な範囲の問題を実質的に
軽減することは示されていない。従って、複合したサン
プルの低量のタンパク質はまた、前の濃縮なしでμＬＣ
／ＭＳ／ＭＳ法によって分析するのは困難である。
【０００７】従って、現在の技術は、タンパク質混合物
の成分を同定するのに適しているが、混合物中のタンパ
ク質の量も、活性の状態も両方とも測定可能ではないこ
とは明らかである。現在のアプローチの進展的な改良で
さえ、慣用的な定量的および機能のｐｒｏｔｅｏｍｅ分
析を実現するのに十分な性能を進歩させそうでない。
【０００８】本発明は、従来の技術に固有の制限を克服
するｐｒｏｔｅｏｍｅ分析において使用され得る方法お
よび試薬を提供する。記載される基本的なアプローチ
は、複合されたサンプル（例えば、細胞、組織およびそ
の機能）におけるタンパク質発現の定量的分析、複合し
たサンプルの特異的タンパク質の検出および定量、およ
び複合したサンプルの特異的酵素活性の定量的測定のた
めに使用され得る。
【０００９】このことについて、正常または疾患状態と
関連するタンパク質またはタンパク質の機能の存在、不
在、欠乏または過剰を検出する臨床的および診断的アッ
セイについて、複数の分析技術が現在得られる。これら
の技術は非常に敏感である一方で、これらは、産物の化
学的種形成を必ずしも提供せず、結果として、単一のサ
ンプルにおいて同時にいくつかのタンパク質または酵素
をアッセイすることにおいて困難であり得る。現在の方
法は、通常のセットの臨床的症状に導く種々の酵素の異
常発現またはそれらの機能不全を区別し得ない。本明細
書において、本方法および試薬は、複数のタンパク質お
よびタンパク質の反応を同時に（複数）モニターするた
めの臨床的および診断的アッセイに使用され得る。
【００１０】（本発明の要旨） 本発明は、タンパク質の混合物においてタンパク質また
はタンパク質の機能の迅速かつ定量的分析のための、分
析試薬およびこれらの試薬を使用する質量分析に基づく
方法を提供する。この分析方法は、定量的に使用され
得、特に細胞および組織の全体的なタンパク質発現プロ
フィールの定量的な分析（すなわち、ｐｒｏｔｅｏｍｅ
の定量的分析）のために使用され得る。この方法はま
た、細胞、組織または生物学的流体の発現レベルが、サ
ンプルが由来する細胞、組織または生物についての、刺
激（例えば、薬剤の投与、または潜在的に毒性の物質と
の接触）によって、環境の変化（例えば、栄養レベル、
温度、時間の経過）によって、あるいは状態または細胞
状態の変化（例えば、疾患状態、悪性腫瘍、位置特異的
変異、遺伝子ノックアウト）によって影響されるタンパ
ク質をスクリーニングし同定するために使用され得る。
このようなスクリーニングで同定されたタンパク質は、
変化した状態に対するマーカーとして機能し得る。例え
ば、正常な細胞および悪性腫瘍細胞のタンパク質発現プ
ロフィールの比較は、存在または不在が、悪性腫瘍の特
徴であり診断であるタンパク質の同定に至り得る。
【００１１】例示的な実施態様において、本明細書にお
いてこの方法は、特定のタンパク質の酵素活性の発現ま
たは状態の変化をスクリーニングするために使用され得
る。これらの変化は、薬学的アゴニストまたはアンタゴ
ニストあるいは潜在的に有害または毒性の物質を含む、
種々の化学物質によって誘導され得る。このような変化
の知識は、酵素に基づく疾患を診断するため、および細
胞の複合調節ネットワークを調査するために有用であり
得る。
【００１２】本明細書においてこの方法は、生物学的流
体（例えば、血液）、または細胞または組織の所定のタ
ンパク質またはタンパク質機能の存在、不在、欠乏、ま
たは過剰を検出するための、種々の臨床的および診断的
分析を実行するために使用され得る。この方法は、タン
パク質の複合した混合物（すなわち、５個以上の別個の
タンパク質またはタンパク質機能を含むもの）の分析に
特に有用である。
【００１３】本発明の方法は、親和性標識タンパク質反
応性試薬を使用し、これは、複合した混合物からペプチ
ドフラグメントまたは所定のタンパク質との反応産物
（例えば、酵素反応の産物）の選択的単離を可能にす
る。単離されたペプチドフラグメントまたは反応産物
は、それらの混合物においてタンパク質の存在またはタ
ンパク質機能（例えば、酵素活性）の存在それぞれの特
徴を有する。単離されたペプチドまたは反応産物は、質
量分析（ＭＳ）技術によって特徴付けられる。特に、単
離されたペプチドの配列は、タンデム型ＭＳ（ＭＳn）
技術を使用し、配列データベース検索技術の適用によっ
て決定され得、配列決定されたペプチドが由来するタン
パク質が同定され得る。この試薬はまた、種々のサンプ
ルにおいてタンパク質の相対的な量の質量分析による定
量的な決定を容易に促進する、単離されたペプチドまた
は反応産物の差次的な同位体標識を提供する。また、内
部標準として差次的に同位体的に標識化された試薬の使
用は、サンプル中に存在する１つ以上のタンパク質また
は反応産物の絶対的な量の定量的な決定を容易にする。
【００１４】一般的に、本発明の親和性標識化タンパク
質反応性試薬は、３つの部分を有する：リンカー基
（Ｌ）によってタンパク質反応性基（ＰＲＧ）に共有結
合された親和性標識（Ａ）： Ａ−Ｌ−ＰＲＧ リンカーは、例えば、リンカーの１つ以上の原子をその
安定な同位体に置換することによって、差次的に同位体
的に標識化され得る。例えば、水素は、重水素で置換さ
れ得、Ｃ12はＣ13で置換され得る。
【００１５】親和性標識Ａは、捕捉試薬（ＣＲ）に共有
結合的または非共有結合的に選択的に結合する分子ハン
ドルとして機能する。ＣＲへの結合は、Ａでタグ化され
たかまたは標識化されたペプチド、基質または反応産物
の単離を容易にする。特定の実施態様において、Ａは、
ストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）またはア
ビジンである。親和性タグ化された物質（そのうちのい
くらかが同位体的に標識化される）の親和性単離の後
に、Ａおよび捕捉試薬の間の相互作用が、単離された物
質のＭＳ分析を可能にするために分裂または切断され
る。親和性標識は、捕捉試薬から、置換リガンド（Ａを
含まないかＡの誘導体であり得る）の添加によって、あ
るいは溶媒の条件（例えば溶媒の種類もしくはｐＨ）ま
たは温度条件を変化させることによって置換されえる
か、あるいはリンカーが、単離された物質をＭＳ分析の
ために放出するために、化学的、酵素的、熱的または光
化学的に切断され得る。
【００１６】ＰＲＧ基の２つのタイプは、本明細書中で
以下に提供される：（ａ）タンパク質官能基と選択的に
反応し、特定の部位にてタンパク質をタグ化する共有結
合または非共有結合を形成する基、および（ｂ）例えば
酵素に対する基質である、タンパク質の作用によって形
質転換されるもの。特定の実施態様において、ＰＲＧ
は、特定のタンパク質の基に対して特異的反応性（例え
ば、スルフヒドリル基に対する特異性）を有する基であ
り、複合した混合物においてタンパク質を選択的にタグ
化するために一般的に有用である。スルフヒドリルに特
異的な試薬は、システインを含むタンパク質をタグ化す
る。他の特定の実施態様では、ＰＲＧは、目的の酵素の
作用によって選択的に切断（Ａ−Ｌを残す）または修飾
（Ａ−Ｌ−ＰＲＧ‘を与える）する酵素基質である。
【００１７】例示的な試薬は、以下の式を有する：
【００１８】
【化３】
【００１９】ここで：Ａは親和性標識である；ＰＲＧ
は、タンパク質反応性基である；Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3および
Ｘ4は、リンカー基において、互いに独立し、Ｘ2は他の
Ｘ2から独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ、ＮＲＲ’+、Ｃ
Ｏ、ＣＯＯ、ＣＯＳ、Ｓ−Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＣＯ−Ｎ
Ｒ’、ＣＳ−ＮＲ’、Ｓｉ−Ｏ、アリールまたはジアリ
ール基から選択され得るか、あるいはＸ1〜Ｘ4は、存在
しなくてもよいが、好ましくは少なくとも１つのＸ1〜
Ｘ4は、存在する；Ｂ1およびＢ2は、互いに独立して、
ＡまたはＰＲＧ基のリンカーへの結合を促進し得るかそ
れらの基のリンカーからの所望でない切断を防ぎ得る任
意の部分であり、そして例えばＣＯＯ、ＣＯ、ＣＯ−Ｎ
Ｒ’、ＣＳ−ＮＲ’から選択され得、そして単独または
他の基（例えば（ＣＨ2）q−ＣＯ−ＮＲ’、（ＣＨ2）q
−ＣＳ−ＮＲ’、または（ＣＨ2）q）と組み合わせて、
１つ以上のＣＨ2基を含み得る；ｎ、ｍ、ｐおよびｑ
は、０〜約１００までの値を有し得るすべての数であ
り、好ましくは、ｎ、ｍ、ｐまたはｑの１つは、０では
なく、そしてｘはまた０〜約１００までの範囲であり得
る整数であり、ここでｎ＋ｘｍ＋ｐ＋ｑは、好ましくは
約１００未満であり、より好ましくは約２０未満であ
る；Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコ
キシ、またはアリール基である；そしてＲ’は、水素、
アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、また
はアリール基である。
【００２０】リンカーのＣＨ2基の１つ以上は、小さな
（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、アルケニル、またはアルコキ
シ基、アリール基で必要に応じて置換され得、例えば酸
性基または塩基性基または永久的な正の電荷または負の
電荷を保持する基のようなイオン化を促進する官能基で
置換され得る。リンカーのＣＨ2基を接続する１つ以上
の単結合は、２重結合または３重結合で置換され得る。
好ましいＲおよびＲ’アルキル、アルケニル、アルキニ
ルまたはアルコキシ基は、１〜６個の炭素原子を有する
小さなものである。
【００２１】リンカーの原子の１つ以上は、安定な同位
体で置換され得、１つ以上の実質的に化学的に同一であ
るが同位体的に区別可能な試薬を生成する。例えば、リ
ンカーの１つ以上の水素は、重水素で置換され得、同位
体的に重い試薬を生成する。
【００２２】例示的な実施態様では、リンカーは、切断
されて親和性タグを除き得る基を含む。切断可能なリン
カー基が使用される場合、親和性タグ化されたペプチ
ド、基質または反応産物がＣＲと一緒に親和性標識化を
使用して単離された後に、これは典型的に切断される。
この場合において、リンカーにおいて標識化する任意の
同位体は、好ましくは、タンパク質、ペプチド、基質ま
たは反応産物に結合したままである。
【００２３】リンカー基は、とりわけ以下を含む：エー
テル、ポリエーテル、エーテルジアミン、ポリエーテル
ジアミン、ジアミン、アミド、ポリアミン、ポリチオエ
ーテル、ジスルフィド、シリルエーテル、アルキルまた
はアルケニル鎖（直鎖または分枝鎖および環でありえる
部分）、アリール、ジアリールまたはアルキル−アリー
ル基。リンカーのアリール基は、１つ以上のヘテロ原子
（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ原子）を含み得る。
【００２４】１つの局面において、本発明は、親和性標
識化された試薬を使用する複合した混合物の１つ以上の
タンパク質の同定および定量のための質量分析方法を提
供し、ここで、ＰＲＧは、ペプチドにおいて典型的に見
出される特定の基（例えば、スルフヒドリル、アミノ、
カルボキシ、ホモセリンラクトン基）と選択的に反応す
る基である。種々のＰＲＧ基を有し、１つ以上の親和性
標識化試薬が、タンパク質を含む混合物に導入され、こ
の試薬がこれらと親和性標識とタグ化するための特定の
タンパク質と反応する。ジスルフィド結合を少なくする
ためにタンパク質混合物を前処理するかまたはそれ以外
で親和性標識化を容易にすることが必要であり得る。親
和性標識化された試薬との反応の後に、複合した混合物
のタンパク質は、例えば酵素的に、多数のペプチドに切
断される。この消化工程は、タンパク質が比較的小さい
場合、必要でなくても良い。親和性標識でタグ化された
ペプチドは、それらのＣＲに対する選択的結合によっ
て、親和性単離法（例えば、アフィニティークロマトグ
ラフィー）によって単離される。単離されたペプチド
は、Ａの置換またはリンカーの切断によってＣＲから放
され、放された物質は、液体クロマトグラフィー／質量
分析（ＬＣ／ＭＳ）によって分析される。次いで、１つ
以上のタグ化されたペプチドの配列は、ＭＳn技術によ
って決定される。タンパク質から誘導される少なくとも
１つのペプチド配列は、そのタンパク質に特徴的であ
り、混合物中におけるその存在を示す。従って、ペプチ
ドの配列は、典型的には、混合物中の１つ以上のタンパ
ク質を同定するのに十分な情報を提供する。
【００２５】タンパク質混合物を含む１つ以上の異なる
サンプル（例えば、生物学的流体、細胞または組織溶解
物など）のタンパク質の定量的な相対量は、化学的に同
一で親和性タグ化され、差次的に同位体的に標識化され
た試薬を使用して決定され得、異なるサンプル中のタン
パク質を、親和性タグ化し、差次的に同位体的に標識化
する。この方法において、比較されるサンプルは、親和
性標識で特定のタンパク質をそこでタグ化するために、
同位体的に異なった標識化試薬で処理される。次いで、
処理されたサンプルは、好ましくは等量で組み合わせら
れ、組み合わせられたサンプル中のタンパク質は、必要
であれば、酵素的に消化され、ペプチドを生成する。ペ
プチドのうちのいくらかは、親和性タグ化され、さらに
異なるサンプル由来のタグ化されたペプチドは、差次的
に同位体的に標識化される。上記のように、親和性標識
化されたペプチドは、単離され、捕捉試薬から放され、
（ＬＣ／ＭＳ）によって分析される。タンパク質由来の
ペプチドの特徴は、サンプル中のタンパク質の同定を可
能にするＭＳn技術を使用して配列決定される。各サン
プル中の所定のタンパク質の相対的量は、そのタンパク
質由来の差次的に同位体的に標識化されたペプチドから
生じるイオンの相対的存在比を比較することによって決
定される。この方法は。異なるサンプル中の既知のタン
パク質の相対的量を評価するために使用され得る。さら
に、この方法がサンプルに存在し得るタンパク質の種類
についての任意の先行知識を必要としないので、この方
法は、試験されるサンプル中において異なるレベルで存
在するタンパク質を同定するために使用され得る。さら
に詳細には、この方法は、細胞、組織または生物学的流
体において異なる発現を示すタンパク質をスクリーニン
グし、同定するために適用され得る。複合した混合物中
の特定のタンパク質の絶対量を決定することもまた可能
である。この場合、既知の量の内部標準（定量化される
混合物中のそれぞれのタンパク質について１つ）が、分
析されるサンプルに添加される。内部標準は、内部標準
がペプチドまたは親和性タグ部分のいずれかにおいて差
次的に同位体的に標識化され、定量化される親和性タグ
化されたペプチドと異なることを除いて、定量化される
親和性タグ化されたペプチドと同一の化学構造である親
和性タグ化されたペプチドである。内部標準は、他の方
法で分析されるサンプルで提供され得る。例えば、特定
のタンパク質またはセットのタンパク質は、同位体標識
化された親和性タグ試薬で化学的にタグ化され得る。こ
の物質の既知の量が、分析されるサンプルに添加され得
る。あるいは、特定のタンパク質またはセットのタンパ
ク質は、重原子同位体で標識化され、次いで、親和性標
識化試薬で誘導され得る。
【００２６】また、単一の分析で複数のサンプル中の特
定のタンパク質のレベルを定量すること（多重化）が可
能である。この場合、異なるサンプルから異なる親和性
タグ化ペプチドに存在するタンパク質を誘導するために
使用される親和性タグ化試薬は、質量分析によって選択
的に定量化され得る。
【００２７】本発明のこの局面において、この方法は、
生物学的流体、細胞または組織中の特定のタンパク質の
定量的測定を提供し、異なる細胞および組織中の全体的
なタンパク質発現プロファイルを決定するために適用さ
れ得る。同じ一般的戦略が、タンパク質との反応性につ
いて異なる特異性を有する親和性試薬を使用することに
よって、タンパク質の修飾の状態の、ｐｒｏｔｅｏｍｅ
ワイドな、定性的なそして定量的な分析を達成するため
に拡張され得る。本発明の方法および試薬は、複合した
混合物中の低存在比タンパク質を同定するために使用さ
れ得、膜、細胞表面タンパク質のような特定の群または
クラスのタンパク質、あるいは小器官、亜細胞（ｓｕｂ
−ｃｅｌｌｕｌａｒ）画分、または免疫沈降のような生
化学的画分内に含まれるタンパク質を選択的に分析する
ために使用され得る。さらに、これらの方法は、異なる
細胞状態において発現されたタンパク質の差を分析する
ために適用され得る。例えば、本明細書中でこの方法お
よび試薬は、癌のような疾患状態を示す１つ以上のタン
パク質の存在または不在の検出のための診断的アッセイ
において使用され得る。
【００２８】第２の局面において、本発明は、サンプル
においてタンパク質の機能（例えば，酵素活性）の存在
または不在の検出のためのＭＳ方法を提供する。この方
法はまた、サンプルにおけるタンパク質の機能の欠乏ま
たは過剰（通常のレベルを超える）を検出するために使
用され得る。分析され得るサンプルには、組織および細
胞を含む、種々の生物学的流体および物質が挙げられ
る。この場合、親和性標識化試薬のＰＲＧは、目的の酵
素に対する基質である。親和性標識化基質は、目的のそ
れぞれの酵素に提供され、目的の酵素がサンプルに存在
する場合、それらが反応して親和性標識化生成物を生成
するサンプルに導入される。親和性標識でタグ化された
未反応の基質または生成物は、ＣＲに対する選択的結合
を介して、親和性単離方法（例えば、アフィニティーク
ロマトグラフィー）によって単離される。単離されたタ
グ化基質および生成物は、質量分析法によって分析され
る。親和標識化生成物には、基質がリンカーから完全に
切断されるもの、または基質が目的のタンパク質との反
応によって修飾されるものが挙げられる。親和性標識化
生成物の検出は、タンパク質機能がサンプルに存在する
ことを示す。親和性標識化生成物の検出がほとんど無い
かまたは無いことは、サンプルにおけるタンパク質の機
能が、それぞれ欠乏または不在であることを示す。
【００２９】サンプル中に存在する、例えば酵素的活性
に関して測定される、選ばれたタンパク質の量は、試薬
基質の酵素反応の期待される生成物の同位体的に標識化
されたアナログである内部標準の既知量を導入すること
によって測定され得る。内部標準は、期待される酵素反
応生成物に対して実質的に化学的に同一であるが、同位
体的に区別可能である。与えられたサンプルにおけるタ
ンパク質機能（例えば、酵素活性）のレベルは、他のサ
ンプルまたはコントロール（ネガティブコントロールま
たはポジティブコントロールのいずれか）での活性レベ
ルと比較され得る。従って、この手順は、サンプルにお
けるタンパク質機能の存在、不在、欠乏または過剰を検
出し得る。この方法は、既知時間に渡って形成される生
成物の量を測定し得るので、酵素反応の速度を定量化す
ることができる。この反応は、種々のタンパク質の機能
に対して選択的な複数の親和性標識化基質の同時使用に
よって、そして定量化が望ましいならば、単一のサンプ
ル中の複数のタンパク質の機能に対して分析するため
に、期待される生成物に対する対応する内部標準を含む
ことによって、多重化され得る。
【００３０】（発明の詳細な説明） 本発明の方法は、親和性タグ化されたタンパク質反応性
試薬を使用し、ここで、この親和性タグは、タンパク質
反応性基にリンカーによって共有結合される。このリン
カーは、実質的に化学的に同一であるが、質量によって
区別可能な試薬の対またはセットを作製するために同位
体的に標識され得る。例えば、一対の試薬（このうちの
１つは、同位体的に重く、そしてこのうちの他方は、同
位体的に軽い）は、２つのサンプル（これらのうちの一
方は、１種以上の公知のタンパク質を既知の量で含有す
る参照サンプルであり得る）の比較のために使用され得
る。例えば、リンカー中の水素、窒素、酸素またはイオ
ウ原子のうちの任意の１つ以上は、それらの同位体的に
安定なアイソトープ：2Ｈ、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、18Ｏま
たは34Ｓと置換され得る。
【００３１】適切な親和性タグは、共有的または非共有
的のいずれか、および高い親和性で選択的に捕捉試薬
（ＣＲ）に結合する。ＣＲ−Ａ相互作用または結合は、
非特異的結合成分を除去するために、種々の溶液による
大規模および多数回、洗浄した後、インタクトなままで
あるべきである。親和性タグは、ＣＲを除いては、最小
限に結合するか、または好ましくはアッセイ系中の成分
に全く結合せず、そして反応容器の表面に著しく結合は
しない。親和性タグの他の成分または表面との任意の非
特異的相互作用は、ＣＲ−Ａをインタクトにしておく多
数回洗浄によって破壊されるべきである。さらに、例え
ば置換リガンドの添加によってまたは温度または溶媒条
件の変化によって、ＡおよびＣＲの相互作用を破壊し、
ペプチド、基質または反応生成物を放出することは可能
でなければならない。好ましくは、ＣＲもＡもいずれも
このアッセイ系における他の成分と化学的に反応せず、
そして両方の基は、アッセイまたは実験の期間にわたっ
て化学的に安定であるべきである。親和性タグは好まし
くは、（ＭＳ）n分析の間、ペプチド様フラグメント化
を起こさない。親和性標識は、好ましくは、分析される
べきサンプル液中に可溶性であり、そしてＣＲは、アガ
ロースのような不溶性樹脂に結合される場合であって
も、サンプル溶液中に可溶性のままであるべきである。
用語、可溶性ＣＲとは、ＣＲが十分に水和されるかまた
は溶媒和され、その結果、これがＡに結合するために適
切に機能することを意味する。ＣＲまたはＣＲ含有結合
体は、Ａを捕獲するために添加される場合を除いては、
分析されるべきサンプル中に存在するべきではない。
【００３２】ＡおよびＣＲの対の例としては以下が挙げ
られる：ｄ−ビオチンまたは構造的に改変されたビオチ
ンベースの試薬（ｄ−イミノビオチンを含み、これは、
アビジン／ストレプトアビジンのタンパク質に結合さ
れ、例えば、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄ
ｉｎｅ）−アガロース、オリゴマー−アビジン−アガロ
ース、またはモノマー−アビジン−アガロースの形態で
使用され得る）；任意の１，２−ジオール（例えば、
１，２−ジヒドロキシエタン（ＨＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｃ
Ｈ））および他の１，２−ジヒドロキシアルカン（環式
アルカンのもの（例えば、１，２−ジヒドロキシシクロ
ヘキサン）を含み、これは、アルキルまたはアリールの
ボロン酸またはボロン酸エステル（例えば、フェニル−
Ｂ（ＯＨ）2またはヘキシル−Ｂ（Ｏエチル）2）に結合
し、これは、アルキルまたはアリール基を介して固体支
持体物質（例えば、アガロース）に結合され得る）；マ
ルトース結合タンパク質に結合するマルトース（および
任意の他の糖／糖結合タンパク質対またはより一般的に
は任意のリガンド／リガンド結合タンパク質対（上記で
議論される特性を有する））；任意の抗体のためのハプ
テン（例えば、ジニトロフェニル基）（ここで、ハプテ
ンは、ハプテンを認識する抗ハプテン抗体に結合し、例
えば、ジニトロフェニル基は、抗ジニトロフェニル−Ｉ
ｇＧに結合する）；遷移金属に結合するリガンド（例え
ば、オリゴマーヒスチジンは、Ｎｉ（ＩＩ）に結合し、
遷移金属ＣＲは、樹脂結合キレート化遷移金属の形態
（例えば、ニトリロ三酢酸−キレート化Ｎｉ（ＩＩ）ま
たはイミノ二酢酸−キレート化Ｎｉ（ＩＩ））で使用さ
れ得る）；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼに結
合するグルタチオン。
【００３３】一般に、上記で議論される適合性基準に合
う親和性富化のために任意のＡ−ＣＲ対が通常使用され
る。ビオチンおよびビオチンベースの親和性タグが好ま
しい。特に関心があるのは、構造的に改変されたビオチ
ン（例えば、ｄ−イミノビオチン）であり、これは、１
０〜２０％の有機溶媒を含有する希釈酸のようなＥＳＩ
−ＭＳ分析に適合の溶媒条件下でアビジンまたはストレ
プトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）カラムから溶
出する。ｄ−イミノビオチンタグ化化合物がｐＨ４未満
の溶媒中で溶出することは予測される。ｄ−イミノビオ
チンタグ化タンパク質反応性試薬は、対応するビオチン
タグ化試薬に関して本明細書中に記載される方法によっ
て合成され得る。
【００３４】置換リガンドであるＤＬは、ＣＲからＡを
置換するために必要に応じて使用される。適切なＤＬ
は、典型的には、添加されなければサンプル中に存在し
ない。ＤＬは、分析されるべきサンプル中で化学的およ
び酵素的に安定であり、そしてサンプル中の化合物（Ｃ
Ｒ以外）と反応しないか、またはサンプル中の化合物
（ＣＲ以外）に結合するべきではないか、あるいは反応
容器壁に非特異的に結合するべきではない。ＤＬは、好
ましくは、ＭＳ分析の間、ペプチド様フラグメント化を
起こさず、そしてサンプル中のその存在は、タグ化ペプ
チド、基質または反応生成物結合体のイオン化を著しく
阻止するべきではない。
【００３５】ＤＬそれ自体は、好ましくは、質量分析の
間、最小限にイオン化され、そしてＤＬクラスターから
構成されるイオンの形成は、好ましくは、最小限であ
る。ＤＬの選択は、使用されるＡおよびＣＲに依存す
る。一般に、ＤＬは、その添加のせいぜい１週間以内
（しかし、より好ましくは、数分以内または１時間ま
で）で、合理的タイムスケールにおいて、ＣＲからＡを
置換するために、選択される。ＣＲに関するＤＬの親和
性は、ＣＲに関してＡを含有するタグ化化合物の親和性
よりも匹敵するかまたは強いはずである。さらに、ＤＬ
は、ＣＲからのＡを含有するタグ化化合物の溶出の間に
使用される溶媒中に可溶性であるべきである。ＤＬは、
好ましくは、ＡあるいはＡの誘導体または構造的改変体
を含まない。ＤＬの例としては、ｄ−ビオチンまたはｄ
−ビオチン誘導体、特に、ＭＳ中のクラスター形成を抑
制するかまたはイオン化を抑制する基を含有するｄ−ビ
オチン誘導体が挙げられる。
【００３６】リンカー基（Ｌ）は、分析されるべきサン
プル液体中に可溶性であるべきであり、そしてそれは、
化学反応に対して安定性（例えば、サンプルの成分なら
びにＡおよびＣＲ基と、実質的に化学的に不活性）であ
るべきである。リンカーは、Ａに結合する場合、リガン
ドの置換によってか、あるいは温度または溶媒における
変化によって、ＡのＣＲとの特異的相互作用を干渉しな
いか、またはＣＲからのＡの置換を干渉するべきではな
い。リンカーは、反応容器表面またはＣＲに対して、そ
の系中の他の成分に、最小限に、または好ましくは少し
も、結合するべきではない。リンカーの任意の非特異的
相互作用は、多回洗浄の後、破壊されるべきであり、こ
れは、Ａ−ＣＲ複合体をインタクトのままにする。リン
カーは、好ましくは、（ＭＳ）n分析の間、ペプチド様
フラグメント化を起こさない。リンカー基中の原子の少
なくともいくつかは、安定な重原子同位体と容易に置換
可能であるべきである。リンカーは、好ましくは、親和
性タグ化試薬、ペプチド、基質または反応生成物のイオ
ン化を容易にする、基あるいは部分を含む。
【００３７】イオン化を促進するために、このリンカー
は、酸性または塩基性基（例えば、ＣＯＯＨ、ＳＯ
3Ｈ、１級、２級または３級アミノ基、窒素−複素環、
エーテル、あるいはこれらの基の組み合わせ）を含み得
る。リンカーはまた、永久的電荷（例えば、ホスホニウ
ム基、４級アンモニウム基、スルホニウム基、キレート
化金属イオン、テトラアルキル（ｔｅｔｒａｌｋｙ）ま
たはテトラアリール（ｔｅｔｒａｒｙｌ）ボレートある
いは安定なカルボアニオン）を有する基を含み得る。
【００３８】リンカーのＡまたはＰＲＧへの共有結合
は、典型的に、アッセイの間、化学的または酵素的反応
によって意図的でなく切断されるべきではない。ある場
合において、例えば、アフィニティーカラムからの放出
を容易にするために、リンカーを、親和性タグＡからま
たはＰＲＧから切断することは、望ましくあり得る。従
って、リンカーは、例えば化学的、熱的または光化学的
反応によって、切断可能であり得る。リンカー中の光切
断可能な基は、１−（２−ニトロフェニル）−エチル基
を含み得る。熱的に不安定なリンカーは、例えば、核酸
の２つの相補体ストランドから形成される二重ストラン
ド化二重鎖、ペプチド核酸の相補的ストランドを有する
核酸のストランド、または加熱すると解離する２つの相
補的ペプチド核酸（ｎｕｃｅｌｉｃ）ストランドであり
得る。切断可能リンカーはまた、ジスルフィド結合、酸
または塩基不安定性基（とりわけ、ジアリールメチルま
たはトリメチルアリールメチル基を含む）、シリルエー
テル、カルバメート、オキシエステル、チオエステル
（ｔｈｉｅｓｔｅｒ）、チオノエステル、ならびにα−
フッ素化アミドおよびエステルを含むものを含む。酵素
的に切断可能なリンカーは、例えば、プロテアーゼ感受
性アミドまたはエステル、β−ラクタマーゼ感受性β−
ラクタムアナログおよびリンカー（これはヌクレアーゼ
切断可能またはグリコシダーゼ切断可能である）を含み
得る。
【００３９】タンパク質反応性基（ＰＲＧ）は、特定の
タンパク質官能性基と選択的に反応するか、または目的
の酵素の基質である基であり得る。任意の選択的に反応
性のタンパク質反応性基は、サンプル中のタンパク質の
少なくとも一部に存在する目的の官能性基と反応するべ
きである。ＰＲＧと、タンパク質上の官能性基との反応
は、分析されるべきサンプル中の化合物の実質的な分解
へとは導かない条件下で、起こるべきである。本発明の
親和性タグ化試薬における使用のために適切な、選択的
反応性のＰＲＧの例は、システインを含むタグタンパク
質に対してスルフヒドリル基と反応するもの、アミノ
基、カルボキシレート基、エステル基、ホスフェート反
応性基、ならびにアルデヒドおよび／またはケトン反応
性基と反応するもの、あるいはＣＨＢｒとのフラグメン
ト化の後にホモセリンラクトンと反応するものを含む。
【００４０】チオール反応性基としては、エポキシド、
α−ハロアシル基、ニトリル、スルホン化アルキルまた
はアリールチオールおよびマレイミドが挙げられる。ア
ミノ反応性基は、タンパク質中のアミノ基をタグ化し、
そしてハロゲン化スルホニル、イソシアネート、イソチ
オシアネート、活性エステル（テトラフルオロフェニル
エステル、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエス
テルを含む）、酸ハライド、ならびに酸無水物が挙げら
れる。さらに、アミノ反応性基としては、ＮａＢＨ4ま
たはＮａＣＮＢＨ3の存在または非存在でのアルデヒド
またはケトンが挙げられる。
【００４１】カルボン酸反応性基としては、カップリン
グ剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたは
２，３，５，６−テトラフルオロフェニルトリフルオロ
アセテート）の存在下での、およびカップリング触媒
（例えば、４−ジメチルアミノピリジン）の存在または
非存在下での、アミンまたはアルコール；ならびにＣｕ
（ＩＩ）フェナントロリンを含む遷移金属−ジアミン複
合体が挙げられる。
【００４２】エステル反応性基としてはアミンが挙げら
れ、これは、例えば、ホモセリンラクトンと反応する。
【００４３】ホスフェート反応性基としてはキレート化
金属が挙げられ、ここで、この金属は、例えばニトリロ
三酢酸またはイミノ二酢酸にキレート化される、例えば
Ｆｅ（ＩＩＩ）またはＧａ（ＩＩＩ）である。
【００４４】アルデヒドまたはケトン反応性基としては
アミンおよびＮａＢＨ4またはＮａＣＨＢＨ3、あるいは
まず炭水化物を過ヨウ素酸塩で処理した後、アルデヒド
またはケトンを生成するこれらの試薬が挙げられる。
【００４５】ＰＲＧ基はまた、目的の選択された酵素に
対する基質であり得る。目的の酵素は、例えば、疾患状
態または奇形児に関連する酵素、あるいは医療目的で慣
用的にアッセイされる酵素であり得る。本発明の方法を
用いて使用するための目的の酵素基質は、酸ホスファタ
ーゼ、アルカリホスファターゼ、アラニンアミノトラン
スフェラーゼ、アミラーゼ、アンギオテンシン転換酵
素、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、クレア
チンキナーゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ、リ
パーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、およびグルコー
ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（これらは、他
の方法によって、現在、慣用的にアッセイされる）が挙
げられる。
【００４６】Ａ、Ｌ、ＰＲＧのための上記に議論された
必要性は、Ａ−Ｌ−ＰＲＧのセグメントおよびこの試薬
を用いて生成される反応生成物の対応物にまで広がる。
【００４７】内部標準（適切に同位体的に標識される）
は、サンプル中のタンパク質の絶対的な定量的量を測定
するために、本発明の方法において使用され得る。内部
標準は、酵素反応の親和性タグ化生成物を定量すること
を意図するアッセイにおいて特に使用される。この適用
において、内部標準は、親和性タグ化酵素基質上の酵素
の作用によって生成されるタグ化酵素生成物に化学的に
同一であるが、2Ｈ、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、18Ｏまたは34
Ｓ（これらはＭＳ技術によって独立して検出されること
が可能である）を含み得る同位体標識を有する。サンプ
ル中の１つまたはいくつかのタンパク質を定量化するた
めの本明細書中の方法における使用のための内部標準
は、タグ化タンパク質の消化から生成される親和性タグ
化ペプチドを生成するための、親和性標識化タンパク質
反応性試薬と公知のタンパク質との反応によって調製さ
れる。親和性タグ化ペプチド内部標準は、実質的に、親
和性タグ化タンパク質の消化から生成される対応する親
和性タグ化ペプチドに実質的に化学的に同一である（こ
れらがＭＳ技術によるそれらの独立的検出を可能にする
ように差次的に同位体的に標識化されることを除いて
は）。
【００４８】本発明の方法はまた、２つ以上のタンパク
質サンプル中の１つ以上のタンパク質（各サンプル中の
タンパク質は、実質的に化学的に同一であるが、差次的
に同位体的に標識化される、親和性タグ化試薬と、反応
される）の相対量を決定するために適用され得る。この
サンプルは、組み合わされ、そして一体としてプロセス
される。そのペプチドが由来するタンパク質の相対量を
反映する各タグ化ペプチドの相対量は、質量分析による
それぞれの同位体ピークの測定によって決定される。
【００４９】本発明の方法は、多数の異なるサンプルの
分析または比較に適用され得る。本発明の方法によって
分析され得るサンプルとしては、細胞ホモジネート；細
胞フラクション；生物流体（尿、血液および脳脊髄液を
含む）；組織ホモジネート；涙；糞；唾液；洗浄液（例
えば、肺または腹膜の洗浄液）；生物学的分子の混合物
（タンパク質、脂質、炭水化物および核酸を含む）（細
胞または組織ホモジネートの部分または完全フラクショ
ン化によって生成される）が挙げられる。
【００５０】本発明の方法は、ＭＳおよび（ＭＳ）n法
を使用する。種々のＭＳおよび（ＭＳ）n法が利用可能
であり、そしてこれらの方法において使用され得るが、
マトリックスアシストレーザ脱離イオン化ＭＳ（ＭＡＬ
ＤＩ／ＭＳ）およびエレクトロスプレーイオン化ＭＳ
（ＥＳＩ／ＭＳ）法が好ましい。
【００５１】（定量タンパク質（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）分
析） 本方法は、サンプルタンパク質混合物および参照タンパ
ク質混合物中の定量的タンパク質プロフィール測定のた
めのビオチン標識化スルフヒドリル−反応性試薬を使用
するスキーム１に概略的に例示される。本方法は、以下
の工程を包含する：還元。サンプルおよび参照混合物中
のタンパク質のジスルフィド結合は、遊離ＳＨ基に還元
される。好ましい還元剤は、トリ−ｎ−ブチルホスフィ
ンであり、これは標準条件下で使用される。あるいは、
還元剤としては、メルカプトエチルアミンおよびジチオ
スレイトールが挙げられる。必要ならば、この反応は、
タンパク質溶解性を維持するための高濃度の界面活性剤
およびウレアを含む可溶化剤の存在下で行われ得る。比
較されるべき参照およびサンプルタンパク質混合物は、
同じ反応条件を適用して、別個にプロセスされる；ＳＨ
基の親和性タグを用いる誘導体化。遊離ＳＨ基は、ビオ
チン化試薬であるビオチニル−ヨードアセチルアミジル
−４，７，１０トリオキサトリデカンジアミンを用いて
誘導体化され、この合成は、以下に記載される。この試
薬は、安定な同位体によるリンカー原子の置換によっ
て、異なる同位体的に標識化された形態で調製され、そ
して各サンプルは、この試薬の異なる同位体的に標識化
された形態で標識化される。ＳＨ基の誘導体化は、好ま
しくは、僅かに塩基性の条件（ｐＨ８．５）下、室温で
９０分間行われる。２つのサンプルの定量的比較分析の
ために、各々１つのサンプル（参照サンプルおよびサン
プルと呼ばれる）は、それぞれ、この試薬の同位体的に
軽い形態および同位体的に重い形態を用いて、スキーム
１に例示されるように誘導体化される。いくつかのサン
プルの比較分析のために、１つのサンプルは、他のサン
プルが関連するものに対する参照として設計される。典
型的に、参照サンプルは、同位体的に重い試薬を用いて
標識化され、そして実験サンプルは、この試薬の同位体
的に軽い形態を用いて標識化されるが、試薬のこの選択
は、任意である。これらの反応はまた、高濃度の可溶化
剤の存在と適合性である；標識化サンプルの組み合わ
せ。親和性タグ化反応の完了後、同位体的に異なる試薬
（例えば、重い試薬および軽い試薬）を用いて標識化さ
れたサンプルの定義されたアリコートは、組み合わせら
れ、そしてすべての引き続く工程は、プールされたサン
プルで行われる。この手順の初期段階にて異なって標識
化されたサンプルの組み合わせは、引き続く反応および
操作に起因する可変性を排除する。好ましくは、各サン
プルの等しい量が組み合わせられる；過剰な親和性タグ
化試薬の除去。過剰な試薬は、例えば、タンパク質ＳＨ
基が完全に誘導体化された後、過剰のＳＨ−含有ビーズ
をこの反応混合物に添加することによって吸着される。
ビーズは、加えられる試薬に対して約５倍モル過剰のＳ
Ｈ基を達成するために、この溶液に添加され、そして室
温で３０分間インキュベートされる。反応後、このビー
ズは、遠心分離によって除去される；タンパク質消化。
サンプル混合物中のタンパク質は、典型的にトリプシン
を用いて消化される。代替のプロテアーゼはまた、事
実、化学的フラグメント化手順のような、この手順に適
合性である。先行工程が高濃度の変性可溶化剤の存在下
で行われた場合、このサンプル混合物は、変性濃度が使
用されるプロテアーゼの活性と適合性となるまで、希釈
される。この工程は、小さなタンパク質の分析において
は省略され得る；捕捉試薬との相互作用による親和性タ
グ化ペプチドの親和性単離。ビオチン化ペプチドは、ア
ビジン−アガロース上で単離される。消化後、ペプチド
サンプルのｐＨは、６．５に下げられ、そしてビオチン
化ペプチドはモノマーアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）でコー
ティングされたビーズ上に固定される。このビーズは、
大規模洗浄される。最後の洗浄溶媒は、残りのＳＤＳを
除去するために、１０％メタノールを含む。ビオチン化
ペプチドは、アビジン−アガロースから、例えば０．３
％ギ酸（ｐＨ２）を用いて溶出される；データ依存性フ
ラグメント化によるμＬＣ−ＭＳnまたはＣＥ−ＭＳnに
よる、単離され、誘導体化されたペプチドの分析。当該
分野で周知であり、そして例えばＤｕｃｒｅｔら、１９
９８；ＦｉｇｅｙｓおよびＡｅｂｅｒｓｏｌｄ、１９９
８；Ｆｉｇｅｙｓら、１９９６；またはＨａｙｎｅｓ
ら、１９９８に記載される方法および機器制御プロトコ
ルが使用される。
【００５２】この最後の工程において、タンパク質（そ
こからタグ化ペプチドが由来する）の定量および引き続
く同定の両方は、自動化多段階ＭＳによって決定され得
る。これは、二重モードの質量分析の操作によって達成
され、ここで、これは、キャピラリーカラムから溶出す
る相対量ペプチドの測定と、選択されたペプチドの配列
情報の記録との間の連続スキャンにおいて交替する。ペ
プチドは、ＭＳモードにおいて、それぞれ試薬の同位体
的に軽いまたは重い形態によってタグ化された、（それ
ゆえ、親和性タグ化試薬内のコードされた質量差によっ
て質量に差がある）同一配列のペプチドイオンの対に関
して相対シグナル強度を測定することによって定量化さ
れる。ペプチド配列情報は、ＭＳnモードでの質量分析
操作における衝突誘導分離（ＣＩＤ）に関する特定の質
量対荷電（ｍ／ｚ）比のペプチドイオンを選択すること
によって自動的に生成される。（Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．ら
（１９９７）、Ｇｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９）、お
よびＧｙｇｉ，Ｓ．Ｐ．ら（１９９９））。次いで、得
られたＣＩＤスペクトルは、配列データベースと自動的
に相関させ、配列決定されたペプチドが由来するタンパ
ク質を同定する。親和性タグ化され、そして差次的に標
識化されたペプチドサンプルのＭＳおよびＭＳn分析に
よって作製された結果を組み合わせることによって、従
って、単一の自動化操作でのタンパク質混合物の成分の
相対量および配列同一性が決定される。
【００５３】ビオチン化スルフヒドリル試薬を使用す
る、合成ペプチドサンプルの定量分析への、タンパク質
中のペプチドの相対量への、本方法の適用の結果は、そ
れぞれ、図１、表１および図２に示されるような誘導体
化ペプチドのタンデム質量スペクトル分析を要約する。
【００５４】本方法はまた、他の親和性タグおよび他の
タンパク質反応性基（アミノ反応性基、カルボキシル反
応性基、またはホモセリンラクトンと反応する基を含
む）を使用して行われ得る。
【００５５】定量的タンパク質分析のための本明細書中
で使用されるアプローチは、２つの原理に基づく。第１
に、タンパク質からの連続するアミノ酸の短い配列（５
〜２５の残基）は、このタンパク質を独自に同定するた
めに十分な情報を含む。ＭＳnによるタンパク質同定
は、高性能コンピュータ検索アルゴリズムを使用して、
ＣＩＤ質量スペクトルに含まれる配列情報を、配列デー
タベースと相関させることによって達成される（Ｅｎ
ｇ，Ｊ．ら（１９９４）；Ｍａｎｎ，Ｍ．ら（１９９
４）；Ｑｉｎ，Ｊ．ら（１９９７）；Ｃｌａｕｓｅｒ，
Ｋ．Ｒ．ら（１９９５））。第２に、それぞれ軽いおよ
び重い親和性タグ化試薬でタグ化された同一ペプチドの
対（または２つより多くのサンプル、同一タグ化ペプチ
ドのセット（各セットのメンバーは差次的に同位体的に
標識化される）において）は、化学的に同一であり、そ
してそれゆえ、正確な定量のための相互の内部標準とし
て働く。ＭＳ測定は、例えば異なる細胞状態を示す異な
るサンプルに由来するペプチド間で容易に区別する。な
ぜならば、ペプチドに結合される同位体的に別個に試薬
間に差異があるからである。ピークのこれらの対または
セットの異なる重量の成分の強度間の比は、もともとの
細胞プール中のペプチド（そしてそれゆえ、タンパク
質）の相対存在比の正確な測定を提供する。なぜなら
ば、所定のペプチドに対するＭＳ強度応答性は、この試
薬の同位体組成に無関係であるからである（Ｄｅ Ｌｅ
ｅｎｈｅｅｒ，Ａ．Ｐ．ら（１９９２））。同位体的に
標識化された内部標準の使用は、定量質量分析法におけ
る標準実行であり、そして例えば体液中の薬物および代
謝物の正確な定量において利点を大きくすることが開発
されてきた（Ｄｅ Ｌｅｅｎｈｅｅｒ，Ａ．Ｐ．ら（１
９９２）。
【００５６】本方法の別の例示において、既知であるが
異なる濃度の同じ６個のタンパク質からなる２つの混合
物が調製され、そして分析された。このタンパク質混合
物は標識化され、組み合わせられ、そしてスキーム１に
概略的に例示されるように処理された。単離され、タグ
化されたペプチドは、定量され、そしてＥＳＩイオント
ラップ質量分析計で単一組み合わせのμＬＣ−ＭＳおよ
びμＬＣ−ＭＳn実験で配列決定された。すべての６個
のタンパク質は、明白に同定され、そして正確に計量さ
れた（表２）。多数のタグ化ペプチドは、各タンパク質
に関して遭遇（ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ）した。６個のタン
パク質に関する観察された量と予測された量との間の差
は、２％と１２％との間の範囲であった。
【００５７】本プロセスは、図３Ａ〜Ｃに単一のペプチ
ド対（ｓｉｎｇｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐａｉｒ）につ
いて、さらに例示される。ＭＳモードで操作した質量分
析計の単回スキャンを図３Ａに示す。親和性タグ化され
た試薬にコードされた質量差によって特徴付けられた４
対のペプチドイオンは、このスキャンにおいて検出さ
れ、そして、それらそれぞれのｍ／ｚ値と共に示され
る。示したスキャンは、１．３秒で得られた。１時間の
クロマトグラフィー溶出勾配の過程にわたって、１２０
０回を超えるこのようなスキャンを自動的に記録した。
図３Ｂは、それぞれ９９３．８および９７７．７のｍ／
ｚ比を有する、イオン対の周囲の質量スペクトルの拡大
図を示す。４つのユニットの同時溶出および検出された
質量差によって、同一配列を有する、２電荷の親和性タ
グ化されたペプチドの対としてイオンが潜在的に同定さ
れる（８の質量差および２つの１電荷状態）。図３Ｃ
は、これら２種について再構成されたイオンクロマトグ
ラムを示す。それぞれのピークの輪郭を積分することに
よって相対量を決定した。比（軽い／重い）を０．５４
として決定した（表１）。再構成されたイオンクロマト
グラムにおけるピークは、鋸歯状のように見える。なぜ
なら、毎秒のスキャンにおいて、質量分析計をＭＳとＭ
Ｓnモードとの間で切り替え、選択されたペプチドイオ
ンの配列情報（ＣＩＤ質量スペクトル）を収集した。こ
れらのＣＩＤスペクトルを使用して、タグ化されたペプ
チドの起源となったタンパク質を同定した。図４Ａは、
ｍ／ｚ＝９９８を有するペプチドイオンから記録された
ＣＩＤスペクトルをを示す（図３Ａにおける矢印に注
目）。このＣＩＤスペクトルとともにデータベース検索
によって、タンパク質をグリセロアルデヒド−３−リン
酸デヒドロゲナーゼ（これは、タンパク質の混合物の１
メンバーであった）（図４Ｂ）と同定した。
【００５８】本方法のいくつかの有益な特徴を示す。第
１に、少なくとも２つのペプチドを、混合物中の各タン
パク質から検出した。従って、定量およびタンパク質同
定はともに重複し得る。第２に、同定したペプチドは全
て、少なくとも１つのタグ化されたシステイニル残基を
含んだ。ペプチドにおいて、比較的稀有であるシステイ
ン残基が存在することによって、データベース検索に関
するさらに強力な拘束が追加される（Ｓｅｃｈｉ，Ｓ．
ら、１９９８）。第３に、システイン含有ペプチドのタ
グ化および選択的富化（ｓｅｌｅｎｔｉｃｅ ｅｎｒｉ
ｃｈｍｅｎｔ）は、６つのタンパク質の同時消化によっ
て生成されるペプチド混合物が有する複雑性を有意に減
少させる。このタンパク質の混合物に関して、この複雑
性は、２９３の強力なトリプシンのペプチドから４４の
トリプシンのペプチド（少なくとも１つのシステイン残
基を含む）まで減少された。第４に、アビジンアフィニ
ティーカラムから溶出されたペプチドサンプルは、μＬ
Ｃ−ＭＳnによる分析に直接適合可能である。
【００５９】（種々の細胞状態におけるタンパク質発現
の定量分析） タンパク質の反応性親和性試薬戦略を、２つの非グルコ
ース抑制状態での酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に
おける定常状態のタンパク質発現の差異を研究するため
に適用した（表３）。細胞を、炭素源として２％ガラク
トースまたは２％エタノールのいずれかを使用して、対
数酵母増殖期から収集した。各細胞状態由来の、１００
μｇの溶解性酵母タンパク質を、異性体が異なる親和性
タグ化された試薬を用いて、独立して標識した。これら
の標識されたサンプルを合せ、そしてスキーム１に記載
される戦略に当てた。サンプルの１／５０（各細胞の状
態由来のタンパク質、約２０μｇ当量）を分析した。
【００６０】グルコース抑制によって、他の炭素源で増
殖するに十分な代謝機能によって多数のタンパク質が最
低限発現される（Ｒｏｎｎ，Ｈ（１９９５；Ｈｏｄｇ
ｅ，Ｐ．Ｅ．ら（１９９９）））。グルコースが存在し
ない、ガラクトースまたはエタノールでの増殖によっ
て、グルコース抑制遺伝子が発現する。表３は、分析中
に遭遇した、３４の酵母遺伝子の選択を示すが、この表
は、同定されたすべて公知のグルコース抑制遺伝子を含
む（Ｍａｎｎ，Ｍ．ら（１９９４））。これらの遺伝子
の各々は、グルコースでの酵母増殖において最小限発現
した。ガラクトースでの増殖（ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０）
ならびにエタノールにでの増殖（ＡＤＨ２、ＡＣＨ１）
の両方に特異的な遺伝子を検出および定量した。
【００６１】本方法の定量的性質は、相対タンパク質レ
ベルにおける小さな変化を正確に測定する能力において
明らかである。測定精度の証拠は、複数のペプチドが定
量された、タンパク質の比を研究することによって発見
された優良な一致によって見受けられ得る。例えば、Ｐ
ＣＫ１から発見された５つのペプチドは、平均比（ｍｅ
ａｎ ｒａｔｉｏ）±９５％、１．５７±０．１５の信
頼区間を有し、そしてパーセント誤差は、１０％未満で
あった。さらに、観測された変化は、文献（Ｒｏｎｎ
ｅ，Ｈ．１９９５；Ｈｏｄｇｅｓ，Ｐ．Ｅ．ら（１９９
９））から予測される変化に一致する。最終的に、観測
された変化は、二次元ゲル電気泳動の後に試験したこれ
らの同一タンパク質に関する染色強度（データは示さな
い）における変化と一致する。
【００６２】酵母におけるイソチームのアルコールデヒ
ドロゲナーゼファミリーは、六炭糖（ＡＤＨ１）および
エタノール（ＡＤＨ２）のいずれも増殖を促進する。遺
伝子ＡＤＨ２は、ともにグルコース抑制され、そしてガ
ラクトース抑制され、ＴＣＡサイクル（図５Ａ）に入る
アセトアルデヒドへとそれを転換することによって酵母
細胞がエタノールで完全に増殖することを可能とする酵
素をコードする。糖存在下、ＡＤＨ１は、アセトアルデ
ヒドをエタノールへと変換する、その逆反応を実施す
る。これらのイソチームの調節は、酵母における炭素利
用にとって重要である（Ｒｏｎｎｅ，Ｈ（１９９
５））。イソチームのファミリーにわたる遺伝子発現に
おける差異を正確に測定する能力は、ｃＤＮＡ配列（ａ
ｒｒａｙ）技術を使用して、クロスハイブリダイゼーシ
ョンが原因で時折困難となる（ＤｅＲｉｓｉ，Ｊ．Ｌ．
ら（１９９７））。スキーム１に例示されるように適用
された本発明の方法は、たとえＡＤＨ１およびＡＤＨ２
が９３％のアミノ酸（８８％のヌクレオチド）配列の類
似性を共有しても、各イソチームに関する遺伝子発現の
測定に成功した。この原因は、各酵素由来の親和性タグ
化されたペプチドが単一のアミノ酸残基（バリンとスレ
オニン）（これは、２分より多くだけ保持時間がシフト
し、そしてＡＤＨ２ペプチドに関して２ダルトンだけ質
量がシフトした（図５Ｂ））によって区別されるからで
あった。ガラクトースがエタノールに匹敵する炭素源で
ある場合、ＡＤＨ１を約２倍の高レベルで発現させた。
ＡＤＨ２発現のエタノール誘発によって、グルコース誘
発と比較して２００倍より多くの増加が生じた。
【００６３】上記の結果は、本発明の方法によって、一
回の自動操作で、タンパク質混合物の定量分析およびそ
の中のタンパク質成分の同定が提供されることを示す。
【００６４】スルフヒドリル反応剤を使用して適用され
る本方法は、ペプチド混合物が有する複雑性を有意に減
少させる。なぜなら、親和性タグ化されたシステイン含
有ペプチドが選択的に単離されるからである。例えば、
全酵母タンパク（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）（６１１３タンパ
ク質）の理論的なトリプシン消化によって、３４４，８
５５ペプチドが産生されるが、これらのパンパク質のう
ち３０，６１９だけがシステイニル残基を含む。従っ
て、この混合物が有する複雑性が減少されると同時に、
タンパク質定量および同定がさらに達成される。スルフ
ヒドリル試薬とタンパク質との化学反応は、尿素、ナト
リウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）、塩、ならびに
反応性チオール基を含まない他の薬品の存在下で実施さ
れ得る。従って、タンパク質は、それらが酵素的に消化
されるまで、溶液中に強力な安定化剤と共に維持され得
る。μＬＣ−ＭＳnシステムの感度はサンプルの質に依
存する。特に、通常使用されるタンパク質安定化剤は、
ＭＳとの適合性に乏しいか、またはＭＳと不適合性であ
る。タグ化されたペプチドの親和性精製によって、ＭＳ
に不適合性の混入物が完全に除去される。低アバンダン
スのタンパク質の従来の方法による定量および同定は、
大量（ミリグラム）の出発タンパク質溶解産物を必要と
し、そしてこれらの低アバンダンスのタンパク質に関し
て富化のいくつかの型を包含する。
【００６５】上記アッセイは、約１００μｇのタンパク
質を使用し、そして分別技術を使用せずに開始する。こ
のために、タンパク質の約１／５０を単一のμＬＣ−Ｍ
Ｓn機器で分析した。このシステムは、１ペプチドあた
り１０〜２０ｆｍｏｌの検出限界を有する（Ｇｙｇｉ、
Ｓ．Ｐ．ら（１９９９））。この原因のために、μＬＣ
−ＭＳnのみを使用する記載のアッセイにおいて、多数
のタンパク質が検出される。しかし、本発明の方法は、
生化学的、免疫学的または細胞生物学的分別方法のいず
れとも適合可能であり、これらの方法によって、混合物
の複雑性が減少され、そして低アバンダンスのタンパク
質が富化され、同時に、定量が維持される。この方法
は、複数のシステインが検出される場合、定量および同
定の両方が冗長され得る。親和性タグ化されたペプチド
の発現レベルにおける差異を同定するこの方法の能力に
関連したダイナミックレンジが存在し、これは、ペプチ
ド対（またはセット）に対応するピークの強度、および
混合物の全体的な複雑性の両方に依存する。さらに、こ
のダイナミックレンジは、使用する質量分析計のそれぞ
れのタイプによって異なる。本明細書中に記載されるア
ッセイにおいてイオントラップが使用された。なぜな
ら、イオントラップの能力は、たとえイオントラップが
さらに制限されたダイナミック定量レンジを提供して
も、データ依存様式で有効量の配列情報（数千のタンパ
ク質が潜在的に同定され得る）を収集するからである。
イオントラップのダイナミックレンジ（シグナル対ノイ
ズ比に基づく）は、ペプチド対のシグナル強度および混
合物の複雑性に依存して変化したが、１００倍までの較
差が一般的に検出され得、そしてさらに大きな較差が、
よりアバンダンスの高いペプチドに関して決定され得
る。さらに、１００〜２００倍より多くのタンパク質発
現レベルの変化によってさらに、最初の２つの細胞状態
の間における表現型の差異に対する主な強力な要因とし
てこれらのタンパク質を同定する。この方法は、他の官
能基に対する反応性を含むとして拡張され得る。低いパ
ーセンテージのタンパク質（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
に対して８％）は、システイニル残基を全く含まず、従
って、スルフヒドロリル基特異性（すなわち、チオール
特異性）を有する試薬を用いた分析では見逃される。ス
ルフヒドリル基以外の官能基に対する特異性を有する親
和性タグ化された試薬によって、また、システインなし
のタンパク質が分析に対して感受性となる。
【００６６】本発明の方法は、低アバンダンスのタンパ
ク質、ならびに特定の物理化学的特性（低溶解度、ラー
ジサイズまたはスモールサイズおよび、極端なｐ／値を
含む）を有するタンパク質のクラスの分析に適用され得
る。
【００６７】この化学および方法のプロトタイプ的な適
用は、複合タンパク質サンプルおよび最終的には上記の
好ましい用法に従う細胞および組織の全溶解産物の定量
的なプロフィールの確立である。これらの試薬に加え
て、本発明の方法は、タンパク質発現プロフィールの決
定をはるかに越える適用を有する。このような適用には
以下が挙げる：アミノ反応性またはスルフヒドリル反応
性の異なる同位体で標識された親和性タグ化された試薬
の、免疫沈降した（ｉｍｍｕｎｏ ｐｒｅｃｉｐｉｔａ
ｔｅｄ）複合体におけるタンパク質の定量分析のための
適用。この技術の好ましい改変において、種々の状態
（例えば、活性化の種々の状態、種々の疾患状態、分化
の種々の状態）を抑制する細胞由来のタンパク質複合体
は、特異的な試薬、好ましくは抗体を使用して沈降され
る。沈降した複合体（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｃｏ
ｍｐｌｅｘ）におけるタンパク質は、次いで、誘導体化
され、そして上記のように分析される。
【００６８】誘発されたタンパク質リン酸化の部位を決
定するための、アミノ反応性の、差次的に同位体で標識
された親和性タグ化された試薬の適用。この方法の好ま
しい改変において、精製したタンパク質（例えば、種々
の刺激条件下での細胞由来の免疫沈降したタンパク質）
はフラグメント化され、そして上記のように誘導体化さ
れる。ホスホペプチドは、ＥＳＩ−ＭＳ機器のイオン源
におけるフラグメンテーションによって、生じたペプチ
ド混合物において同定され、そしてそれらの相対アバン
ダンスは、実験サンプルのイオンシグナル強度を、含ま
れる同位体で標識した基準の強度と比較することによっ
て決定される。
【００６９】アミノ反応性の差次的に同位体で標識され
た親和性タグ化された試薬を使用して、Ｎ−末端イオン
セリンをＭＳnスペクトルで同定する。この適用の好ま
しい改変において、分析されるペプチドを、アミノ基に
対して特異的である、軽い同位体の試薬（ｉｓｏｔｏｐ
ｉｃａｌｌｙ ｌｉｇｈｔ ｒｅａｇｅｎｔ）および重
い同位体の試薬（ｉｓｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ ｈｅａｖ
ｙ ｒｅａｇｅｎｔ）の５０：５０混合物で誘導体化す
る。従って、ＣＩＤによるペプチドのフラグメンテーシ
ョンによって、２つのＮ−末端イオンセリンが生成さ
れ、これらは、使用した試薬の種類の質量差によって、
質量が正確に異なる。この適用によって、誘導体化した
ペプチドのアミノ酸配列決定の際の困難が劇的に減少す
る。
【００７０】（細胞および組織における表面タンパク質
の定量分析） 細胞外部膜およびその結合したタンパク質（細胞表面タ
ンパク質）は、外部シグナルを感知し、環境のキューに
応答する際に沈降する。細胞表面タンパク質のアバンダ
ンスの変化は、特定の細胞の状態またはその変化する環
境に応答する細胞の能力を反映し得る。従って、細胞表
面のタンパク質成分の包括的な定量的特徴付けは、マー
カータンパク質、または特定の細胞状態に特徴的なマー
カータンパク質の型（ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｉｏｎ）を
同定し得るか、あるいは外部刺激に対する細胞応答に関
する分子基底（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ）を説
明し得る。実際、多数の細胞表面レセプター（例えば、
Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｅｒｂＢ、ＩＧＦＩレセプター、お
よびＥＧＦレセプター）発現における変化は発癌が意図
されており、そして乳癌に対する現代の免疫学的な治療
アプローチは、特異的にＨｅｒ２／ｎｅｕレセプターを
認識する抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃ
ｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）の注入（ｉｎｆｕｓｉ
ｏｎ）に基づく。
【００７１】細胞表面タンパク質はまた、実験的にアク
セス可能である。細胞分類、および細胞識別またはパニ
ングなどの方法による特定細胞の分取単離のための診断
アッセイは、細胞表面タンパク質に基づく。従って、正
常な細胞と疾患（例えば、癌）細胞との間の細胞表面タ
ンパク質の種々の分析によって、重要な診断標的または
治療標的が同定され得る。癌の診断および治療のための
細胞表面タンパク質の重要性が認識されてはいるが、膜
タンパク質の分析は困難であった。それらの一般的に低
い溶解性に起因して、これらは、標準的な２Ｄゲル電気
泳動パターンにおいて表される傾向にあり、そして、Ｄ
２電気泳動条件を膜タンパク質の分離に適応させる試み
は、制限した成功を満たす。本発明の方法は、従来技術
における原理的な制限を克服し得る。
【００７２】膜タンパク質の分析は挑戦である。なぜな
ら、それらは、高感度分析機器（例えば、質量分析計）
に適合性である条件下において、溶液中に維持すること
が一般的に困難であるからである。本発明の方法を膜タ
ンパク質の分析に適用することは、膜タンパク質標識お
よび抽出のためのヒトＴ細胞リンパ腫細胞系統Ｊｕｒｋ
ａｔ、ならびに十分に特徴付けられたヒト前立腺上皮細
胞系統Ｐ６９ＳＶ４０Ｔおよび２つのＰ６９ＳＶ４０Ｔ
亜系統（これらは、１０の因子によるＩＧＦ−１レセプ
ター発現が異なるを使用して例証され、膜タンパク質の
定量的な種々の分析を例証する。
【００７３】Ｊｕｒｋａｔ細胞は、適切なモデルシステ
ムである。なぜなら、これらの細胞は容易に数多く増殖
するからであり、そして種々の刺激および実験条件に応
答する細胞表面タンパク質の調節が、Ｔリンパ球におい
て十分に特徴付けされているからである。市販のビオチ
ン化試薬、またはより一般的な親和性タグ化試薬が用い
られ、リシン残基および遊離Ｎ−末端を誘導体化する。
水溶性ビオチン化試薬（例えば、スルホ−ＮＨＳ（Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミド）ビオチン）、および細胞表
面タンパク質を標識するために広く使用されているアナ
ログ（スルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミ
ド）−ヘキサノエート（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒ
ｄ、ＩＬ））が使用され得る。ＮＨＳエステルと一級ア
ミンとの反応は、中性のｐＨ値およびそれを超すｐＨが
最適であり、そしてＤＭＳＯまたはＤＭＦなどの有機溶
媒の存在に適合性である。Ｊｕｒｋａｔ細胞由来の細胞
表面タンパク質のビオチン化は、ｐＨ７．２のＰＢＳ緩
衝液中で実施される。細胞（１×１０7）をＰＢＳ緩衝
液で洗浄して、培養培地から、汚染血清および他のタン
パク質を除去する。細胞を２５×１０6細胞／ｍｌに再
懸濁し、そして０．５ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＮＨＳ−ビ
オチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と３
０分間室温で反応させる。標識化した細胞を、冷ＰＢＳ
で２度洗浄し、未反応のビオチン化試薬を除去する。ビ
オチン化した細胞を、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４
を含有するリシン緩衝液中、５×１０7細胞／ｍｌで可
溶化する。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４は、３０℃で、界
面活性相および水相への相分配特性を有する。相分配に
続いて、界面活性相を３００×ｇでの遠心分離によって
水相から除去する。相分配は、細胞膜を富化するために
使用して以前に成功している。また、この技術は、Ｊｕ
ｒｋａｔ細胞溶解産物からの膜タンパク質を富化するた
めに見出された。Ｔｒｉｔｏｎ相を、５０ｍＭの炭酸水
素アンモニウム緩衝液（ｐＨ８．５）を使用して１：５
（ｖ／ｖ）に希釈し、そして高純度に改変したブタトリ
プシンを１２．５ｎｇ／ｍｌの濃度で添加し、タンパク
質を３７℃で一晩かけて消化する。トリプシンをセリン
プロテアーゼインヒビターのカクテルの添加によって中
和し、そしてトリプシンペプチドを、アビジン親和性ク
ロマトグラフィー技術によって単離する。溶出したペプ
チドを例えばμＬＣ法によって分離し、そして、例え
ば、Ｓｅｑｕｅｓｔプログラムを使用して、ペプチド配
列データベースを検索することによって同定する。
【００７４】ＳＶ４０Ｔ抗原を使用して不朽化したヒト
プロテアーゼ上皮細胞株Ｐ６９ＳＶ４０Ｔは十分に特徴
付けられている。この細胞株は不死であるが、腫瘍形成
性ではなく、そして１型インスリン様増殖因子レセプタ
ー（ＩＧＦ−１Ｒ）を、２×１０4レセプター／細胞で
発現する。Ｍ１２と呼ばれる亜系統を、雄性の胸腺欠陥
ヌードマウスにおいて、逐次継代によってＰ６９ＳＶ４
０Ｔから誘導した。この細株は非常に腫瘍形成性であ
り、かつ転位性であり、そして１細胞あたり１．１×１
０3ＩＧＦ−１Ｒを発現する。細胞株Ｐ６９ＳＶ４０Ｔ
およびＭ１２でのＧＩＦ−１Ｒのアバンダンスにおける
相対的な差異は、膜タンパク質への適用に適した本発明
の方法を使用して定量的に決定され得る。これらの細胞
株に関するＩＧＦ−１Ｒの数は既に決定されているの
で、この十分に特徴付けられたシステムは、本発明の定
量的方法の効率を確証するための基準を提供し得る。
【００７５】Ｐ６９ＳＶ４０Ｔ細胞（１×１０7）は、
重い同位体のビオチンタグ化されたアミノ反応性試薬を
使用してビオチン化され、そしてＭ１２細胞（１×１０
7）は、対応する、軽い同位体のアミン反応性ビオチン
タグ化されたアミノ反応性試薬を用いてビオチン化され
る。ＩＧＦ−１Ｒを次いで、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対する
抗原を使用して両方の細胞株の合わせた溶解産物から免
疫沈降され、そして免疫沈降したタンパク質の全ての塊
をトリプシンで消化する。トリプシンを次いで、例え
ば、インヒビターの添加によって中和し、そしてタグ化
されたペプチドをビオチンアビジンアフィニティークロ
マトグラフィーによって精製する。上記に記載されるよ
うに、ペプチド定量および同定のためそれぞれＬＣ−Ｍ
ＳおよびＬＣ−ＭＳnによって、溶出したペプチドを分
析する。この実験における定量は、ＭＳにおける選択的
イオンモニタリングを使用するオプションによって容易
となる。このモードにおいて、ＩＧＦ−１Ｒから誘導さ
れると予測される、タグ化されたペプチドイオンの質量
のみがモニタリングされるべきである。
【００７６】記載した技術は、親の前立腺細胞株（Ｐ６
９ＳＶ４０Ｔ）とＭ１２細胞との間の細胞表面タンパク
質の相対アバンダンスにおける差異を比較するために適
用され得、これらの細胞表面タンパク質（これらの発現
レベルは２つの細胞株において異なり、そして種々の細
胞状態が有する特徴であり得る）を検出かつ同定する。
本明細書中に記載される方法を使用して、任意の２つ以
上の細胞株における細胞表面タンパク質の一般的な相対
的な定量が分析され得、種々の細胞状態のこれらの細胞
表面タンパク質特性を検出し、そして同定する。結果
は、（適切であれば）１Ｄまたは２Ｄゲルなどの手順、
または定量ウエスタンブロットを使用し、独立して確認
され得、定量結果を確認する。
【００７７】細胞表面タンパク質の定量の実験的変動性
は、現在入手可能なｃＤＮＡ配列技術によって達成され
る定量の精度よりもオンサイドで（ｏｎｓｉｄｅｒａｂ
ｌｙ）良好であることが期待される。相対的なタンパク
質の量および同一性に加えて、この方法はまた、インタ
クトな生細胞がビオチン化試薬を除外するという推論に
基づき、膜内のタンパク質の配向を明らかにするために
使用され得る。
【００７８】細胞表面タンパク質から誘導体化されたタ
グ化されたペプチドに対する選択性を高めるための代替
の方法が適用され得る。例えば、タグ化された細胞表面
タンパク質は、インタクトな細胞上で直接チロシン化さ
れ得、タグ化されたペプチドを生成し、これは、議論し
たように、精製され、そして分析される。さらに、伝統
的な細胞膜調製は、細胞表面タンパク質を富化する最初
の工程として使用され得る。これらの方法は、タンパク
質分解の前に膜タンパク質を単離するために、ダンス型
ホモジナイザーおよび一連の密度勾配遠心分離を用い
た、穏やかな細胞溶解を包含し得る。この方法は、細胞
表面タンパク質が高度に富化された調製物を提供し得
る。親和性タグ化されたタンパク質はまた、タンパク質
分解の前、ならびにタンパク質分解の後に、親和性クロ
マトグラフィーによって単離され得る。このクロマトグ
ラフィーは、タンパク質の溶解度を維持するために界面
活性剤（例えば、ＴＸ−１００、ＮＰ−４０またはＴｗ
ｅｅｎ−２０）の存在下で実施され得る。アフィニティ
ークロマトグラフィー工程（インタクトなタンパク質の
ための工程、およびタグ化されたペプチドフラグメント
のための工程）の逐次適用によって、高度の選択性が提
供される。これらの代替の方法は、低アバンダンスの膜
タンパク質の検出に関して容易に測定可能（ｓｃａｌａ
ｂｌｅ）であり、そしてタグ化された、タグ化されたペ
プチドの相対量は、選択的な富化工程によって維持され
る。
【００７９】本発明の方法の細胞表面タンパク質への適
用において、一旦、タグ化されたタンパク質がフラグメ
ント化されると、これらのタグ化されたペプチドは、よ
り可溶性のサンプルから生成したペプチドとは相違なく
挙動する。
【００８０】（特定のタンパク質群に選択的である、親
和性タグ化されたタンパク質反応性試薬の合成） 本発明の方法の使用において適切である、例示的な親和
性タグ化された薬剤の合成経路をスキーム２〜３に示す
（ここで、周知の合成技術は、重水素化されていない試
薬および重水素化された試薬の合成に使用される）。
【００８１】ビオチニル−ヨードアセチルアミジル−
４，７，１０トリオキサトリデカンジアミン４（スキー
ム３）は、それぞれ、ビオチン基、適切な同位体で同位
体標識され得る化学的に不活性なスペーサー、およびヨ
ードアセトアミジル基からなる。このビオチン基は、試
薬を使用して誘導体化したペプチドの親和性富化（ａｆ
ｆｉｎｉｔｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）に使用され、エ
チレングリコールリンカーは、質量スペクトル分析のた
めに差次的に同位体で標識され、そしてヨードアセトア
ミジル基は、スルフヒドリル含有ペプチドに対する試薬
の特性を提供する。この試薬は、全ての水素の形態（軽
い同位体の形態）、リンカーにおいて１〜２０個、好ま
しくは４〜８個の重水素原子を有する形態（重い同位体
の形態）に合成され得る。
【００８２】（細胞可溶化物における複数の酵素の速度
の分析） 生化学アッセイによる酵素機能のモニタリングは、多数
の分析技術（生成物の分光光度検出、蛍光検出および放
射検出を含む）を用いる不可欠な診断ツールである。し
かし、現在の方法は、単一のサンプル中のいくつかの酵
素を同時にアッセイするのに使用しにくい。生物学的流
体中の代謝産物のコレクションを定量化するための質量
分光法は、出生時欠損の分析のための有力なアプローチ
として現れた（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９４）が、この分
析技術は、個々の酵素的段階の速度の直接分析のために
開発されていない。細胞ホモジネートおよび他の生物学
的サンプル中の酵素活性のモニタリングおよび定量化の
ための、本明細書中に記載される分析方法により、複合
反応の同時（複合）モニタリングが可能になり、そして
これは容易に自動化され得る。
【００８３】酵素アッセイに適用されるような本発明の
方法の特徴は、酵素産物および化学的に同一の内部標準
（これらは、安定同位体（重水素）標識により識別され
る）を同時に検出するための、エレクトロスプレーイオ
ン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）（Ｃｏｌｅら、１９９
７）の使用である。第２の特徴は、親和性精製と組み合
わせた場合に、粗生体学的流体からの酵素産物の容易な
捕捉を提供する、酵素基質を含む親和性標識試薬の使用
である。この親和性標識試薬は、リンカーを介して親和
性標識に共有結合した、目的の酵素の標的基質を含むよ
うに設計される。基質結合における目的の酵素の作用に
より、その分子量を変化させる開裂または他の改変が起
こる（スキーム４）。質量変化は、ＥＳＩ−ＭＳにより
検出される。好ましくは、使用されるリンカーおよび親
和性標識は、ＥＳＩによるイオン化を容易にし、生物学
的流体中の他の酵素の作用を阻害し、そして容易な精製
のために複合体マトリクスからの高い選択性の捕捉を可
能にする。
【００８４】このアプローチの例は、それぞれ、リソソ
ームβ−ガラクトシダーゼおよびＮ−アセチル−α−Ｄ
−グルコシミニダーゼを同時アッセイするための、親和
性標識酵素基質試薬１および２の設計および合成（スキ
ーム５）である。前者の酵素の不足により、リソソーム
蓄積症の１つである、ＧＭ1−ガングリオシドーシスが
生じ、この状態は約５０，０００分の１の頻度で母集団
において生じ、そして発症した子供の早死をもたらす。
Ｎ−アセチル−Ｒ−Ｄ−グルコサミニダーゼの不足によ
り、稀なリソソーム蓄積症であるＢ型サンフィリポ症候
群が生じる。この例は、Ｇｅｒｂｅｒら、（１９９
９）、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１１
０２〜１１０３（これはその全体が本明細書中で参考と
して援用される）に記載されている。
【００８５】結合体１および２は、親和性標識としての
ビオチンからなり、ビオチンはサルコシンに結合され
る。ビオチンは、アガロースビーズに固定されたストレ
プトアビジンへの非共有結合によって、基質結合体を、
高い特異性で捕捉し得る（Ｂａｙｅｒら、１９９０）。
サルコシンは、ビオチンへのＮ−メチル化アミド結合を
提供し、酵素ビオチナーゼ（これはしばしば、細胞流体
中に存在し、アッセイ中に結合体分子の開裂を引き起こ
し得る）を阻害する（Ｗｉｌｂｕｒら、１９９７）。さ
らに、ビオチニル−サルコシン結合体は、ビオチンの付
加によってストレプトアビジンから脱離し得ることが見
出された。Ｎ−ビオチニルサルコシンブロックは、ポリ
エーテルジアミンに結合され、このポリエーテルジアミ
ンの長さは、産物と内部標準の質量／電荷重複を避ける
ように変えられ得る。このリンカーはまた、複数の重水
素原子（すなわち、スキーム５、５における８個の重水
素および６における４個の重水素）の導入を容易にし、
内部標準の合成を可能にし得る。ｄ８−リンカーを、触
媒のＮａＯＤを含むベンゼン中で、ＤＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ
ＣＨ２ＣＨ２ＯＤをＣＤ２ｄＣＤＣＮと反応させること
によって作製し（Ａｓｈｉｋａｇａ，Ｋ．；Ｉｔｏ，
Ｓ．；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ；Ｎｉｓｈｉｊｉｍａ，
Ｙ．Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．１９８８，
６１，２４４３〜２４５０）、そして得られたジニトリ
ルを、Ｒａ−Ｎｉでジアミンに還元した。ｄ４−リンカ
ーを、エチレングリコール、ＣＨ３ＣＮ中のＣＤ２ｄＣ
ＤＣＮおよび触媒のＮａＯＨを使用して、同様に作製し
た。
【００８６】さらに、リンカーは親水性であり、基質結
合体の良好な水溶性を保証し、そしてこれは、ＥＳＩに
よって効果的にプロトン化される塩基性基を有し、従っ
て、質量分析法による高感度の検出を保証する。標的炭
水化物基質は、β−アラニン単位によってポリエーテル
リンカーに結合される（スキーム５）。酵素産物結合体
３および４をまたスキーム５に示す。結合体１および２
を、スキーム５に示されるように調製した。全ての試薬
を、逆相ＨＰＬＣにより均質性になるまで精製し、そし
て高磁場１Ｈ ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＭＳによって同定
した。基質は、後者のｐ−アクリロイルアミドフェニル
グリコシドへのマイケル付加によってジアミンスペーサ
ーに結合され（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋａｅｔら、１９９
４）、その中間体は、Ｎ−ビオチニルサルコシンのテト
ラフルオロフェニルエステルと結合された（Ｗｉｌｂｕ
ｒら、１９９７）。
【００８７】β−ガラクトシダーゼおよびＮ−アセチル
−Ｒ−Ｄ−グルコサミニダーゼのＥＳＩ−ＭＳアッセイ
は結合グリコシドの酵素的開裂に基づき、モノサッカリ
ド、ならびに結合体３および４（質量差は、それぞれ、
１６２Ｄａおよび２０３Ｄａである）を放出する。代表
的な手順において、０．２ｍＭの１および０．３ｍＭの
２を、β−ガラクトシダーゼ欠乏症の別個の患者由来の
超音波処理培養した線維芽細胞、および罹患していない
ヒト由来の培養した線維芽細胞と共にインキュベートし
た。インキュベーション後、標識化された内部標準５お
よび６を添加し、そしてビオチン化成分をストレプトア
ビジン−アガロースビーズ上に捕捉した。細胞ホモジネ
ートからの定量的なストレプトアビジン捕捉効率をモデ
ル試薬で観察した。複数回の洗浄により精製して非特異
的に結合した成分を除去した後、チオビニル化産物を遊
離ビオチンにより放出し、そして溶離液をＥＳＩ−ＭＳ
により分析した。ビオチン化産物の約８５％放出が、過
剰のビオチンで９０分間インキュベートした後に観察さ
れた。時間０に存在する全ての成分でアッセイをクエン
チすることにより、ブランクを得た。
【００８８】代表的な手順において、水（１５μＬ）中
の細胞タンパク質（７５μｇ）を、２（０．３ｍＭ）お
よび１（０．２ｍＭ、細胞タンパク質の添加した５時間
後に添加した）を含む１５μＬの緩衝液（０．１Ｍ ク
エン酸Ｎａ、ｐＨ４．２５）に添加した。３７℃で５．
５時間インキュベートした後、この反応を、０．２Ｍの
グリシンカルボン酸緩衝液（２００μＬ、ｐＨ１０．
３）を添加してクエンチし、そして５および６（それぞ
れ１ｎｍｏｌ）を添加した。遠心分離して細胞片を除去
した後、上清を、小さな濾過装置（ｍｉｃｒｏ Ｂｉｏ
Ｓｐｉｎ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中のストレプトアビジン−
アルガロース床（７ｎｍｏｌのビオチン結合能力、Ｐｉ
ｅｒｃｅ）に充填した。５分後、遠心分離により濾過を
行い、そしてゲル床を０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０（約１分のインキュベーション、次いでスピン）で洗
浄し、次いで精製水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ，Ｍｉｌｌｉｐｏ
ｒｅ）で６回洗浄した。５６ｎｍｏｌの遊離ビオチン
（１〜１０時間のインキュベーション、次いでスピン）
を含む５０％メタノール（２５μＬ）で、溶離した。濾
液を５０％メタノール／水で４倍に希釈し、そして１μ
ＬをＥＳＩ−ＭＳによって分析した。
【００８９】ブランクのＥＳＩ−ＭＳスペクトル（図６
Ａ）は、非常に単純であり、これは試薬１および２（ｍ
／ｚ８４３および８４０）からの（Ｍ＋Ｈ）+イオンの
ピーク、内部標準５および６（ｍ／ｚ６８９および６４
１）のピーク、および微量の産物３および４（ｍ／ｚ６
８１および６３７）のピークを示す。ビオチンのクラス
ターによるイオンもまたスペクトル中に現れるが、分析
を妨げなかった。ブランク中の非重水素化産物の存在
は、サンプルの後処理中の非酵素的基質試薬の加水分
解、または気相中の基質イオンの衝突誘導解離が原因で
あり得る。ｍ／ｚ８４３における（結合体１＋Ｈ）+イ
オンのＭＳ／ＭＳスペクトルは、ｍ／ｚ６８１における
（結合体３＋Ｈ）+（スペクトルは示されず）の顕著な
フラグメントを与える。健康な個体由来の細胞ホモジネ
ートと共にインキュベートしたサンプルのＥＳＩ−ＭＳ
スペクトルは、ｍ／ｚ６８１において、β−ガラクトシ
ダーゼ産物、そしてｍ／ｚ６３７においてＮ−アセチル
−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ産物をはっきりと示す
（図６Ｂ）。健康な患者由来の細胞を使用する３回の酵
素反応は、５１±３ｎｍｏｌ／ｈ（ｍｇ細胞タンパク
質）のβ−ガラクトシダーゼ比活性、および１．４±
０．３ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇのＮ−アセチル−α−Ｄ−グ
ルコサミニダーゼ比活性を生じた。時間経過の研究は、
初期の反応速度が測定されたことを保証した。６人の健
康な個体由来の細胞を用いて得られた値は、β−ガラク
トシダーゼの場合、３６±４〜６８±３ｎｍｏｌ／ｈ／
ｍｇの範囲であり、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミ
ニダーゼの場合、０．９±０．０５〜２．３±０．４ｎ
ｍｏｌ／ｈ／ｍｇの範囲であった。反対に、β−ガラク
トシダーゼ欠乏症の２人の患者由来の細胞を使用した場
合、ブランクレベル（０．９±０．９および０．８±
０．６ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ）より上の酵素産物は、ほん
のわずかしか観察されず、一方、Ｎ−アセチル−α−Ｄ
−グルコサミニダーゼ活性は、はっきりと検出される
（図６Ｃ）。これらのスペクトルは、０．７５μｇの細
胞タンパク質（約１０００個の線維芽細胞に相当する）
を用いて得られた。従って、ＥＳＩ−ＭＳ法は、医用用
途に非常に高い感度を有する。
【００９０】ＥＳＩ−ＭＳを、Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣ
Ｑイオントラップ機器で行った。データを、１．５μＬ
／分での直接注入によって、ｍ／ｚ６２５〜８７５の全
スキャンモードで収集した。比活性を、産物対内部標準
のイオンピーク面積の比から得た（３０回のスキャンを
平均化した）。
【００９１】基質試薬およびＥＳＩ−ＭＳを使用して酵
素をアッセイするための記載されたアプローチは広く適
用され得る。複合技術は、単一の反応における数十個以
上の酵素を同時にアッセイするために広がり得、希な障
害の診断の確認を助ける複数のアッセイの必要性を排除
する。この方法は、特異的な生化学的経路を通る化学的
流動の速度を評価する場合に、いくつかの酵素を同時に
測定するために、または生化学的なシグナル伝達経路を
モニタリングするために、使用され得る。特にビオチン
−ストレプトアビジンが用いられる場合、親和性標識し
た反応産物および基質を複合体混合物から単離するため
の親和性標識捕捉試薬方法は、技術的に単純であり、そ
して容易に自動化され得る。用いられるＥＳＩ−ＭＳ検
出が高感度であるため、これはアッセイにつき、サブマ
イクログラム量の基質試薬を必要とするのみであり、少
ないグラムスケールでの数百個の基質試薬の合成が実用
的および経済的になる。ほとんどの酵素活性部位は溶媒
に曝されているため、酵素活性を維持したまま、親和性
標識リンカーをほとんどの酵素基質に結合することが可
能である。スキーム６は、この方法における使用に適切
ないくつかのさらなる酵素基質の構造を提供し、標識結
合部位に許容な位置を矢印で示している。さらなる酵素
基質に許容な標的部位は、酵素−基質または酵素−基質
アナログ構造のＸ線結晶構造を調べることによって決定
され得る。標準的なコンピューターグラフィックプログ
ラムおよび有効なＸ線データを使用し、そして伸長した
鎖のブチル基（親和性標識リンカーのためのモデルとし
て）を潜在的な標識結合部位に結合することによって、
モデル標識とのファンデルワールスオーバーラップ中に
酵素原子が存在しないことを示す適切な結合部位が予測
され得る。
【００９２】上記の方法と類似した方法が、他のサンフ
ィリポ症候群（Ａ、ＣおよびＤ）と関連する酵素の分析
に適用され得る。ＳＦＡはヘパランスルファミダーゼと
関係し、ＳＦＣはアセチル−ＣｏＡ−α−グルコサミニ
ド（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ）Ｎ−アセチルトラン
スフェラーゼと関係しそしてＳＦＤはＮ−アセチルグル
コサミン６−スルファターゼと関係する。これらの酵素
およびこれらの障害の診断の分析に有用な代表的な親和
性標識酵素基質試薬は、以下で提供される。これらの方
法はまた、酸スフィンゴミエリナーゼについてアッセイ
することによって、Ａ型およびＢ型ニーマン−ピック病
の診断に適用され得、そしてガラクトセレブロシドβ−
ガラクトシダーゼについてアッセイすることによって、
クラッベ病の診断に適用され得る。これらの酵素は、現
在、スキーム７に記載されるように、蛍光団誘導体化試
薬を使用してアッセイされる。本明細書中の方法でこれ
らの試薬をアッセイするための酵素基質試薬は、蛍光団
を本明細書中のＡ−Ｌ基で置換することによって容易に
調製され得る。親和性標識酵素基質を調製するためにこ
のアプローチは、一般に、任意の公知の蛍光団誘導体化
酵素基質または基質アナログに適用可能である。
【００９３】表４は、特定の出生児欠損または疾患状態
に関与する代表的な酵素を示す。これらの酵素は、本明
細書中に記載される方法によってアッセイされ得る。
【００９４】（炭水化物−欠乏性糖蛋白質症候群（ＣＤ
ＧＳ）についての酵素的経路のアッセイ） 本発明の方法および試薬は、ＣＤＧＳ疾患の診断に適切
な複数の酵素の速度を定量化するために用いられ得る。
【００９５】Ｉａ型およびＩｂ型ＣＤＧＳは、酵素、ホ
スホマンノイソメラーゼ（ＰＭＩｂ）（Ｉｂ型）および
ホスホマンノムターゼ（ＰＭＭ２）（Ｉａ型）（これら
は、グルコースからマンノース−１−ホスフェートへの
変換のための多段階経路（スキーム８）（Ｆｒｅｅｚ
ｅ、１９９８）の一部である）の不足または欠如によっ
て生じる。この経路に関与する単糖類基質は、フルクト
ース−６−ホスフェート、マンノース−６−ホスフェー
ト、およびマンノース−１−ホスフェートである。これ
らの単糖類は、基質結合体に変換することがいくぶん困
難であり得る。なぜなら、糖上のどの原子が、酵素活性
を損なうことなくリンカーと結合するかべきが推測的に
明らかではないからである。しかし、ＰＭＩｂおよびＰ
ＭＭ２は、間接的にアッセイされ得る。哺乳動物細胞の
ミクロソームは、ドリコール−Ｐ−マンノースシンター
ゼを含み、このドリコール−Ｐ−マンノースシンターゼ
は、ドリコールホスフェートとＧＤＰ−マンノースとの
反応を触媒してドリコール−Ｐ−マンノースおよびＧＤ
Ｐを形成する（スキーム８，Ｃｈａｍｐａｎら、１９８
０）。このシンターゼは、本発明の方法を使用し、特に
ビオチン−リンカー基質を使用してアッセイされ得る。
微生物ＰＭＭ、およびＧＴＰとマンノース−１−Ｐから
ＧＤＰ−マンノースを作製する酵素である、ＧＤＰ−マ
ンノースピロホスホリラーゼは、細菌および酵母から容
易に精製され（Ｇｌａｓｅｒ、１９６６、Ｐｒｅｉｓ
ｓ、１９６６）、そしてこれらの酵素は、外因的に酵素
アッセイに供給され得る。ＰＭＩｂ活性が不十分である
場合、マンノース−６−Ｐはほとんどまたは全く作られ
ず、その場合、この反応順序は、フルクトース−６−Ｐ
の添加によって開始される。マンノース−６−Ｐがない
場合、マンノース−１−ＰおよびＧＤＰ−マンノースは
作られず、その結果、結合したドリコール−Ｐ−マンノ
ースはＥＳＩ−ＭＳで検出されない。外因性ＧＴＰは、
必要ならば、ＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼ工
程に供給され、そしてＡＴＰは省かれ、その結果、マン
ノース−６−Ｐはマンノースからは作られ得ない。ＰＭ
Ｍ２をアッセイするために、反応順序はマンノース−６
−Ｐで開始され、そしてＰＭＭ２の欠乏の結果として、
結合したドリコール−Ｐ−マンノースは作られない。
【００９６】キャリアドリコールは、約６０〜１０５炭
素イソプレノイドである。ドリコール鎖に結合した炭水
化物で作用する多くの酵素は、ドリコール鎖の有意な短
縮に対して耐性である；１０および１５炭素ドリコール
でさえ耐性である、という証拠が集められている（Ｒｕ
ｓｈおよびＷａｃｈｔｅｒ、１９９５）。このような酵
素は、ドリコール結合体の水溶性炭水化物部分で作用
し、従ってドリコールアンカーを結合する必要性はほと
んどまたは全くないようである。このことに基づいて、
ドリコール−Ｐ−マンノースシンターゼの直接アッセ
イ、ならびにＰＭＩｂおよびＰＭＭ２の関節アッセイの
ための親和性標識基質は、親和性標識リンカーをショー
トドリコール（例えば、１０−炭素ドリコールアナログ
のシトロネロール）の非極性末端に結合することによっ
て調製される。
【００９７】サルコシニルリンカーを含有するビオチン
化ドリコール10−基質結合体（Ｂ−Ｓ−Ｄｏｌ10−Ｐ）
の合成は、スキーム９に示される。保護されたシトロネ
ロール（Ｒ＝ｔ−ＢｕＳｉＭｅ2）は、末端アリルメチ
ル基で位置選択的に酸化され（ＭｃＭｕｒｒｙおよびＫ
ｏｃｏｖｓｋｙ、１９８４）、そしてアリルアルコール
はビオチンサルコシン活性エステル（Ｒ＝ＣＨ3）と結
合される。シトロネロールの１−ヒドロキシ基は、ＰＯ
Ｃｌ3で連続的に脱保護およびリン酸化される（Ｒｕｓ
ｈおよびＷａｃｈｔｅｒ、１９９５）。パラレル合成に
おいて、ｄ5−サルコシン（ＣＤ3ＮＨＣＤ2ＤＯＯＨ）
は、内部標準として使用するため同位体標識（重）試薬
を調製するために使用される。ｄ5−サルコシンは、市
販の物質（ＢｒＣＤ2ＣＯＯＤおよびＣＤ3ＮＨ2）か
ら、標準的な合成技術を使用して容易に調製される。
【００９８】重水素化内部標準である、Ｂ−ｄ5−Ｓ−
Ｄｏｌ10−Ｐ−マンノースは、雌鳥の卵管ミクロソーム
を、ＧＤＰ−マンノースおよび合成Ｂ−ｄ5−Ｓ−Ｄｏ
ｌ10−Ｐ基質結合体と共にインキュベートすることによ
って酵素的に合成される（ＲｕｓｈおよびＷｅａｃｈｌ
ｅｒ、１９９５）。Ｂ−Ｓ−結合体のさらなる利点は、
アガロース−ストレプトアビジンビーズ上での特異的な
捕捉、続いて遊離ビオチンでの溶離によって、ミクロソ
ームのマンノシル化産物の親和性精製が容易になり得る
ことである。
【００９９】親和性標識ショートドリコールアナログを
使用するこの方法は、一般に、炭水化物に固定されたド
リコールで作用する他の酵素をアッセイするのに適用可
能である。このようなアプローチは、まだ同定されてい
ない他のタイプのＣＤＧＳ中に存在する酵素欠乏症の後
に続く同定に有用である。
【０１００】ＩＩ型ＣＤＧＳは欠陥のあるＧｌｃＮＡｃ
トランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ ＩＩ）か
ら生じ、このＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩは、
ジシアロ−２アンテナ（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）鎖の
構築プロセス中、ＧｌｃＮＡｃを、中間体の分枝オリゴ
糖中のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからマンノース残基の２位
（コア領域（Ｃｏｒｅ Ｒｅｇｉｏｎ）に移動させる
（スキーム１０）（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ、１９８６、Ｂ
ｒｏｃｋｈａｕｓｅｎら、１９８９）。ＧｌｃＮＡｃト
ランスフェラーゼＩＩは、コア領域中のマンノース残基
の高い位置特異的なグリコシル化を媒介する６種の公知
の酵素のうちの１つである。コア領域は、還元末端でチ
トビオシルアスパラギンに固定され、ここでアスパラギ
ン残基は、グリコシル化タンパク質のペプチド鎖の一部
である。基質中の後者の構造単位は、酵素活性を損失す
ることなく、疎水性鎖によって置換され得る（Ｋａｕｒ
ら、１９９１）。従って、ＩＩ型ＣＤＧＳのための基質
結合体は、親和性標識リンカー基をチトビオシルアスパ
ラギンの還元末端（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｅｎｄ）に結合
され、ここで、アスパラギン残基は、グリコシル化タン
パク質のペプチド鎖の一部である。基質における後者の
構造ユニットは、酵素活性を損失することなく、疎水性
基によって置換され得る（Ｋａｕｒら、１９９１）。従
って、ＩＩ型ＣＤＧＳの基質結合体は、親和性標識リン
カー基をキトビオシルアスパラギンの還元末端に結合す
ることによって構築される。しかし、この基質の後者の
構造単位は、酵素活性を損失することなく、疎水性鎖に
よって置換され得る（Ｋａｕｒら、１９９１）。例え
ば、市販のα−Ｄ−マンノ−ピラノシルフェニルイソチ
オシアネートは、ビオチン−標識リンカーに結合され
得、そして５，６−ヒドロキシルは、スキーム１１に例
示されるように選択的に保護される（Ｐａｕｌｓｅｎお
よびＭｅｉｎｊｏｈａｎｎｓ、１９９２）。エクアトリ
アルな３−ＯＨとペル−Ｏ−アセチルマンノシル−１−
トリクロロアセトアミダート（ａｍｉｄａｔｅ）の結合
（Ｐａｕｌｓｅｎら、１９９３）は、二糖類結合体を与
える（スキーム１２）。少量の結合がアキシアルな２−
ＯＨ基で起こる場合、その生成物はＨＰＬＣで分離され
得る。脱保護の後、１級６−ＯＨは、１／２当量のペル
−Ｏ−アセチルマンノシル−１−トリクロロアセトアミ
ドと結合し、コア領域結合体が生成する。Ｏ−アセチル
基の脱保護により、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ
のための基質結合体が生成し、このＧｌｃＮＡｃトラン
スフェラーゼＩは、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ウサギ肝
臓抽出物を使用する酵素的グリコシル移動によって、Ｇ
ｌｃＮＡｃ−Ｔ ＩＩ基質に変換され得、この反応は、
調製用スケールで行われた（Ｋａｕｒら、１９８１）。
【０１０１】内部標識に必要な重水素標識した誘導体の
合成は、標識ＰＥＧ−ジアミンビルディングブロックを
使用することによって、並行して行われる（Ｇｅｒｂｅ
ｒら、１９９９）。ビオチン化三糖類は、ＵＤＰ−Ｇｌ
ｃＮＡｃおよびトランスフェラーゼＩＩと共にインキュ
ベートし（ＫａｕｒおよびＨｉｎｄｓｇａｕｌ、１９９
１、Ｔａｎら、１９９６）、そして酵素産物の親和性精
製用のＢ−Ｓハンドルを利用することによって、四糖類
（ＧｌｃＮＡｃ−Ｔ ＩＩの産物）に変換される。
【０１０２】（Ｖ型ＣＤＧＳ） グリコシル化タンパク質のＡｓｎ残基に転移される脂質
結合オリゴ糖（ＬＬＯ）は、２個のＧｌｃＮＡｃ、９個
のマンノースおよび３個のグルコースからなる。最近、
Ｖ型ＣＤＧＳ患者由来のミクロソームは、ＬＬＯ生合成
の間、１つ以上のグルコース残基を転移させる酵素が非
常に欠乏しているということが示された（Ｋｏｒｎｅｒ
ら、１９９８）。ＬＬＯの炭水化物単位をＡｓｎ残基に
結合するトランスフェラーゼは、グルコース欠乏ＬＬＯ
を識別するため、Ｖ型ＣＤＧＳ患者は、糖タンパク質
（例えば、トランスフェリン）に結合した少数の炭水化
物単位を有する（Ｋｏｒｎｅｒら、１９９８）。しか
し、存在する少数の炭水化物単位は全長であり、これは
残りのグリコシル転移は、Ｖ型ＣＤＧＳ患者において起
こることを示す（Ｋｏｒｎｅｒら、１９９８）。従っ
て、ＥＳＩ−ＭＳによるＡｓｎグリコシル化の速度の定
量化は、Ｖ型ＣＤＧＳ症候群の実行可能なアッセイを構
成する。
【０１０３】Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列を含
む、３−７アミノ酸残基を有する合成ペプチドは、グリ
コシル化に良好な基質であることが示された（Ｒｏｎｉ
ｎら、１９８１）。オリゴ糖トランスフェラーゼのＥＳ
Ｉ−ＭＳアッセイのための戦略は、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓ
ｅｒ／Ｔｈｆ配列を含む適切なペプチドのＢ−Ｓ結合体
に依存する（スキーム１３）。ヘプタペプチド、ＮＨ2
−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−
Ｍｅｔ−ＮＨ2（配列番号１）は、以前の研究において
高い活性を示した（Ｒｏｎｉｎら、１９８１）。ペプチ
ドは、社内の自動合成装置を使用する標準的なペプチド
合成によって容易に入手可能である。ヘプタペプチドお
よびその糖結合体は、ＥＳＩによってイオン化され、安
定な一価のイオンを与え得る。ＢＳ−テトラフルオロフ
ェニルエステルとＮＨ2−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａ
ｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−ＮＨ2（配列番号２）
との結合により、このトランスフェラーゼの基質が直接
得られる。いくつかの産物は、オリゴ糖アンテナの酵素
的グリコシル化および続く改変から予想される。この産
物は、甲状腺のラフ（ｒｏｕｇｈ）ミクロソームを、Ｂ
Ｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
−Ｍｅｔ−ＮＨ2およびＤｏｌ−Ｐ−Ｇｌｕと共にイン
キュベートし（Ｒｏｎｉｎら、１９８１ａ）、続いてビ
オチン化産物を親和性精製することによって、酵素的に
調製され得る。グリコシル化の程度の違いによる産物の
分布は、ＥＳＩ−ＭＳによってモニタリングされ得、主
成分はＨＰＬＣによって精製され得る。Ｂ−Ｎ（Ｃ
Ｄ3）ＣＤ2ＣＯ−結合体を使用する類似の手順が、重水
素化内部標準を調製するために使用される。
【０１０４】Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩおよびＶ型ＣＤＧＳ症候
群についてアッセイされた酵素のセットのための、イオ
ン化された基質結合体、ならびに産物および内部標準の
分子量は、表５に集められ、これは（Ｍ＋Ｈ）+種の中
で電荷の重なり（ｉｓｏｂａｒｉｃ ｏｖｅｒｌａｐ）
は起こらないことを示す。Ｉａ、ｂ型産物の（Ｍ＋Ｎ
ａ）+イオンと脱マンノシル化Ｂ−（Ｎ−Ｃ2Ｄ5）−
２，２−Ｄ2−Ｇｌｙ−Ｄｏｌ10−Ｐ内部標準の（Ｍ＋
Ｈ）+イオンとの間の接近した間隔は、Ｎａ+イオンの付
加によりＮａ付加体として気相イオンを生成することに
より、ＥＳＩ−ＭＳ条件を調節することによって、容易
に回避され得る。
【０１０５】単一の生物学的サンプル（例えば、細胞溶
解産物）において、３つの標的酵素の全てが同時に分析
され得る。ＰＭＭ２およびＰＭＩｂは同時にアッセイさ
れ得ない。なぜなら、これらは異なる外因性基質の添加
を必要とするからである。それにもかかわらず、同一の
ＥＳＩ−ＭＳ技術を使用する２つのアッセイが、一連の
種々の方法に依存する代わりに、様々なＣＤＧＳ型を診
断するために使用され得る。
【０１０６】（臨床酵素学的アッセイ） 線維芽細胞ペレットを氷上で解凍する。十分な０．９％
ＮａＣｌを添加して、溶解産物中の最終タンパク質濃度
が約５ｍｇ／ｍＬ（典型的には、１００ｍｃＬ）を得、
そしてこの細胞ペレットを、氷水中で５回、適度な電力
で、それぞれ２秒間超音波処理する。全タンパク質を、
ＢＣＡ試薬（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキッ
ト、Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して分光光学的に決定した。
【０１０７】全酵素反応容量は、２０〜３０ｍｃＬであ
る。基質ストック溶液は、３ｍＭ（ＳＦＢ）および２ｍ
Ｍ（ＧＭ１）の濃度に維持する。これらの濃度は、１Ｈ
−ＮＭＲシグナルの積分比対内部標準（ＤＭＦのホルム
アミドプロトン）により測定した。基質の最終濃度は、
それぞれ、０．３ｍＭおよび０．２ｍＭである。２０〜
３０ｍｃＬ−（（基質の追加分（２〜３ｍｃＬ）＋（５
０〜７０ｍｃｇの全タンパク質に等しくなるのに十分な
細胞サンプル容量））に等しい容量の反応緩衝液（例え
ば、２００ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５）
を、０．５ｍＬエッペンドルフチューブに添加し、続い
て基質を添加する。サンプルを氷で冷却し、そして患者
の細胞サンプルを添加する。この反応を、３７℃でイン
キュベートすることによって開始する。
【０１０８】ＳＦＢについて：この反応系を、４．５〜
６時間進行させ、この後、ＧＭ１基質を添加し得るか、
またはこの反応は、１００ｍｃＬの２００ｍＭグリシン
カルボン酸緩衝液（ｐＨ１０．５）でクエンチし得る。
【０１０９】ＧＭ１について：この反応を０．５時間進
行させる。ＳＦＢの場合と同様にクエンチする。
【０１１０】クエンチした後、これらのサンプルを氷上
に置く。内部標準を添加する（それぞれ１ｎｍｏｌ、す
なわち５０ｍｃＬの０．０２ｍＭ溶液）。これらのサン
プルを、約１５，０００ｒｐｍ、２分間、室温で、ペレ
ット細胞片に対して微量遠心する。ストレプトアビジン
−アガロースビーズ（Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ ｉｍｍｏ
ｂｉｌｉｚｅｄ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ｐｉｅｒ
ｃｅ）を、ミクロバイオスピンクロマトグラフィーカラ
ム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に入れる。十分なビーズを添加し
て５ｎｍｏｌの全ビオチン結合能力のビーズ（典型的な
結合能力は、Ｐｉｅｒｃｅにより決定した場合、１００
ｐｍｏｌ／ｍｃＬ）を得る。サンプルの上清をバイオス
ピンチューブに移し、そして室温で１０分間結合させ
る。このサンプルを約３，０００ｒｐｍでスピンして、
過剰の上清を除去し、次いで、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００で１回、精製水で少なくとも５回洗浄し、
中程度にチューブをスピンして溶液を除去する。それぞ
れ洗浄するために、十分な洗浄溶液を添加して、バイオ
スピンチューブを満たす。
【０１１１】次いで、精製ビーズを３０ｍｃＬの精製水
で処理し、続いて、１０ｍｃＬの４ｍＭビオチン溶液で
処理する。これらのチューブの底をキャップして、漏れ
を防ぎ、そして２〜８℃で２〜１２時間インキュベート
させる。これらのサンプルを、約３，０００ｒｐｍでス
ピンして、サンプルをきれいなエッペンドルフチューブ
に溶離する。
【０１１２】次いで、サンプルを、６０ｍｃＬの５０％
メタノール／水で希釈し、そしてイオントラップ質量分
光計に注入する。ＥＳＩ−ＭＳスペクトルを調整して、
まずブランクサンプル（反応をクエンチした後に添加さ
れる細胞溶解物）を分析することによって、サンプルの
非特異的な切断を減らす。注入したサンプルを、産物お
よび内部標準の（Ｍ＋Ｈ＋）+イオンについて、１ａｍ
ｕ幅のウインドーのイオンクロマトグラムの積分によっ
て分析する。
【０１１３】結果を、形成された生成物ｎｍｏｌ／イン
キュベーションの時間／反応混合物中の全タンパク質ミ
リグラムで報告する。
【０１１４】（ＧＭ１およびＳＦＢについての、患者サ
ンプルの臨床的分析） 患者皮膚線維芽細胞を、凍結ペレットとして得、そして
使用まで−２０℃で保存した。ＧＭ１罹患した２つのサ
ンプルおよび６つの正常なコントロールを分析した。
【０１１５】５０ｍｃＬの０．９％ＮａＣｌを、各患者
細胞ペレットへ添加した。これらのペレットを、氷水
中、各中程度の超音波パワーで２秒間×５回超音波処理
によって溶解させ、超音波処理の間において氷水中でマ
イクロチップを冷凍した。
【０１１６】サンプルを、以下のようにＢＣＡ（Ｐｉｅ
ｒｃｅ）アッセイによって定量した：試薬ＡおよびＢ
を、上述のように５０：１の比で混合した。タンパク質
標準曲線を、ウシ血清アルブミンを、標準として、２、
１、０．５、０．２、および０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度
で使用して調製した。患者超音波処理物の一部を、水中
１：１５で希釈し、そして各希釈した親サンプルの５ｍ
ｃＬおよび標準曲線ポイントを、２連で、２００ｍｃＬ
の水を含む個々のガラス培養チューブへ添加した。次い
で、これらのサンプルを、１ｍＬの混合ＢＣＡ試薬で希
釈し、ボルテックスして混合し、そして３７℃で６０分
間インキュベートした。これらのサンプルを、室温まで
冷却し、そして２００ｍｃＬの水のみを含有するブラン
クに対して分析した。これらのサンプルを、ポリスチレ
ンキュベット中、５６２ｎｍでの吸光度をモニターする
ことによって分析した。平均患者吸光度値を、ブランク
補正し（ｂｌａｎｋ ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）、そして線
形回帰によって標準と比較した。
【０１１７】患者タンパク質濃度は、以下であると測定
された：１．（罹患）１２．２ｍｇ／ｍＬ、２．（正
常）１０．８ｍｇ／ｍＬ、３．（正常）１１．９ｍｇ／
ｍＬ、４．（正常）１２．１ｍｇ／ｍＬ、５．（正常）
１０．３ｍｇ／ｍＬ、６．（正常）７．７９ｍｇ／ｍ
Ｌ、７．（正常）１５．７ｍｇ／ｍＬ、８．（罹患）１
１．４ｍｇ／ｍＬ。
【０１１８】インキュベーションを、総計３０ｍｃＬの
総容量で実施した。ブランクＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管へ添
加した反応緩衝液（２００ｍＭ クエン酸ナトリウム、
ｐＨ４．２５）の量は、基質容量（３ｍｃＬの各基質ス
トック溶液、ＧＭ１について２ｍＭおよびＳＦＢについ
て３ｍＭ、６ｍｃＬの総量）＋７５ｍｃｇの総タンパク
質に等しくなるために要求される細胞溶解物の容量の、
３０ｍｃＬからの、差であった。例えば、患者１．のイ
ンキュベーション混合物は、最初に３ｍｃＬのＳＦＢ基
質溶液、６．１４ｍｃＬの患者細胞溶解物、および１
７．８６ｍｃＬの反応緩衝液を含んだ。ＧＭ１基質を、
後で、このインキュベーションに添加した（以下を参照
のこと）。
【０１１９】各患者サンプルを、３連で分析した。反応
混合物を、調製の間、氷上に維持し、そしてこの反応を
３７℃の水浴へ移すことによって開始した。５．５時間
インキューベーションし、３ｍｃＬのＧＭ１基質を、各
反応物に添加し、そしてさらに０．５時間後、これらの
反応物を、氷上に配置し、そして２００ｍｃＬの２００
ｍＭグリシン−カーボネート緩衝液（ｐＨ１０．２５）
でクエンチした。
【０１２０】精製手順および分析手順は、Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ａｓｓａｙ（Ｔｙｐｉｃ
ａｌ）に記載の通りである。
【０１２１】得られた酵素活性は、平均標準偏差ｎｍｏ
ｌ生成物／時間インキュベーション／ｍｇ全タンパク質
である：
【０１２２】
【化４】
【０１２３】以下の合成方法は、スキーム１４〜２３を
言及する。ＧＭ１−ガングリオシドーシス（β−Ｄ−ガ
ングリオシド欠乏）についての合成。
【０１２４】（１．２，３，５，６−テトラフルオロフ
ェニルトリフルオロアセテート（１）） ２５ｇ（０．１５ｍｏｌ）の２，３，５，６−テトラフ
ルオロフェノール、３５ｍＬ（０．２ｍｏｌ）の無水ト
リフルオロ酢酸および０．５ｍＬの三フッ化ホウ素エー
テラートを、アルゴン下で、１８時間還流した。無水ト
リフルオロ酢酸およびトリフルオロ酢酸を、室温での蒸
留によって除去した。この無水トリフルオロ酢酸の画分
を、この混合物に戻し、そしてこの反応系を２４時間還
流した。これを、２回繰り返した。室温での最後の蒸留
の後、所望の生成物１を、減圧下（６２℃／４５ｍｍ
ｇ）で蒸留し、無色液体（３０ｇ、８２％）が生成し
た。１Ｈ−ＮＭＲ．（Ｇａｍｐｅｒ，Ｈ．Ｂ．、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第２１巻 第１４５〜第１
５０頁を参照）。
【０１２５】（２．ビオチン−２，３，５，６−テトラ
フルオロフェニルエステル（２）） ２０ｍＬの無水ＤＭＦ中の２．５ｇ（１０．３ｍｍｏ
ｌ）量のｄ−ビオチンを、アルゴン雰囲気下で、攪拌し
ながら６０℃まで加温して、溶解した。１．７ｍＬ（１
２．５ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン、続いて３．４ｇ
（１２．５ｍｍｏｌ）の１を添加した。この混合物を、
２時間攪拌し、この後、溶媒をロータリーエバポレーシ
ョンによって除去した。得られた半固体を、１５ｍＬの
エーテルで２回粉末化し、白色固体を生成した（２．６
ｇ、６５％）。１Ｈ−ＮＭＲ．（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｄ．
Ｓ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ，Ｃｈｅｍ．，第８巻、第５７２
〜第５８４頁を参照）。
【０１２６】（３．Ｎ−メチルグリシルビオチンアミド
−メチルエステル（３）） ３０ｍＬの無水ＤＭＦ中の２．５ｇ（６．４ｍｍｏｌ）
量のビオチンテトラフルオロフェニルエステルを、アル
ゴン雰囲気下で、１０ｍＬの無水ＤＭＦおよび１．２５
ｍＬ（９．０ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン中に溶解し
た１．１ｇ（７．７ｍｍｏｌ）のＮ−メチルグリシンメ
チルエステルヒドロクロリドの混合物へ添加した。この
反応混合物を、室温で２時間攪拌し、次いで、溶媒をロ
ターリーエバポレーションによって除去した。残渣をク
ロロホルム（２×１００ｍＬ）で抽出し、水（２×２０
ｍＬ）で洗浄し、そして無水硫酸ナトリウムで乾燥し
た。溶媒を、真空下で除去し、Ｎ−メチルグリシンビオ
チンアミドのメチルエステルをオイルとして得た（２．
１ｇ、９８％）。１Ｈ−ＮＭＲ．（Ｗｉｂｕｒ，Ｄ．
Ｓ．、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，第８巻、第５７２
〜第５８４頁を参照）。
【０１２７】（４．Ｎ−メチルグリシルビオチンアミド
酸（４）） Ｎ−メチルグリシルビオチンアミドメチルエステルを、
１時間攪拌しながら室温で、３１ｍＬのＭｅＯＨおよび
１０ｍＬの１Ｎ ＮａＯＨの混合液中で加水分解した。
この混合物を、５０ｍＬ ５０％ ＭｅＯＨ／水で希釈
し、そして陽イオン交換樹脂水素型（ｈｙｄｒｏｇｅｎ
ｆｏｒｍ）（ＡＧ ＭＰ−５０，ＢｉｏＲａｄ）で中
和した。この溶液を濾過し、この樹脂を５０％ ＭｅＯ
Ｈ／水で洗浄し（３×５０ｍＬ）、そして溶媒をロター
リーエバポレーションによって除去して、Ｎ−メチルグ
リシルビオチンアミド酸をオフホワイト固体として得た
（１．６ｇ、９０％）。１Ｈ−ＮＭＲ．（Ｗｉｌｂｕ
ｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，第８巻、
第５７２〜第５８４頁を参照）。
【０１２８】（５．ｐ−アクリルアミドフェニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド（５）） ４０ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）のｐ−アミノフェニルβ
−Ｄ−ガラクトピラノシドを、攪拌しながら、２５ｍＬ
のメタノールおよび２００ｍｃＬのトリエチルアミンに
添加した。この溶液を、氷浴中で冷凍した。５３．３ｍ
ｇ（０．６ｍｍｏｌ）のアクリロイルクロリドを、５ｍ
Ｌの乾燥塩化メチレンへ溶解し、そしてこの攪拌溶液へ
５分間にわたって滴下した。この反応系を、室温に戻
し、続いて２時間攪拌した。次いで、この溶液を、中性
ｐＨが湿性ｐＨ紙（ｍｏｉｓｔ ｐＨ ｐａｐｅｒ）で
得られるまで、連続の陰イオン交換樹脂および陽イオン
交換樹脂（それぞれ、ＡＧ ＭＰ−１およびＡＧ ＭＰ
−５０、ＢｉｏＲａｄ）で処理した。溶媒をロターリー
エバポレーションによって除去し、固体を得た（４３ｍ
ｇ、９０％）。１Ｈ−ＮＭＲ．（Ｒｏｍａｎｏｗｓｋ
ａ，Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第２４
２巻、第９０〜第１０１頁を参照）。
【０１２９】（６．４，７，１０−トリオキサ−１，１
３−トリデカンジアミンおよび５のマイケル付加生成物
（６）） ２０ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）の５を、５ｍＬの０．２
Ｍ炭酸ナトリウム中の８０ｍｇ（０．３５ｍｍｏｌ）の
４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジア
ミンの攪拌溶液（ｐＨ１０．５、３７℃で）へ添加し
た。この反応を、３日間進行させ、この後、この溶液を
希トリフルオロ酢酸で中和し、そして逆相ＨＰＬＣ（Ｖ
ｙｄａｃ Ｃ−１８ 分取スケール（ｐｒｅｐ−ｓｃａ
ｌｅ）カラム、６ｍＬ／分、移動相：Ｈ2Ｏ（０．０８
％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））によって精
製し、７．３ｍｇの生成物を得た。（Ｒｏｍａｎｏｗｓ
ｋａ，Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第２
４２巻、第９０〜第１０１頁を参照）。
【０１３０】（７．４および６のＧＭ１基質結合体
（７）） ２．５ｍｇ（７．４ｍｃｍｏｌ）量の４を、１．５ｍＬ
の無水ＤＭＦに、アルゴン雰囲気下で、攪拌しながら溶
解した。５ｍｃＬのトリエチルアミン、続いて２．３ｍ
ｇ（８．８ｍｃｍｏｌ）の１を添加した。活性エステル
の形成を、シリカＴＬＣ（５：１ ＣＨＣｌ3／ＣＨ3Ｏ
Ｈ，Ｒｆ０．５，ＵＶ）によって、スポットしたＴＬＣ
プレートを空気流で簡単に乾燥することによってモニタ
ーした。２５分後、この混合物を、１ｍＬの無水ＤＭＦ
中の３．２ｍｇ（５．９ｍｃｍｏｌ）の６へ添加した。
２時間後、溶媒を真空遠心分離によって除去し、そして
最終生成物を逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８ 分
取スケールカラム、６ｍＬ／分、移動相：Ｈ2Ｏ（０．
０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））によっ
て精製した。収量４．６ｍｇ。（Ａｎａｌｏｇｏｕｓ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｉｌｂｕｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｉｏ
ｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，第８巻、第５７２〜第５８４頁
を参照）。
【０１３１】（８．１，２，１０，１１−オクタジュー
テロ（ｏｃｔａｄｅｕｔｅｒｏ）−３，６，９−トリオ
キサ−１，１１−ウンデカンジニトリル（８）） １ｇ（９．４ｍｍｏｌ）のジエチレングリコールを、窒
素雰囲気下、１０ｍＬの丸底フラスコ中で、２ｍＬのＤ
2Ｏに溶解した。Ｄ2Ｏをロターリーエバポレーションに
よって除去し、そしてこのプロセスを４回繰り返した。
ｄ−２ジエチレングリコールを、２５ｍＬの乾燥ベンゼ
ンと共に添加し、続いて１．６ｇ（２８．２ｍｍｏｌ）
のｄ−３アクリロニトリルを、攪拌しながら、アルゴン
雰囲気下で添加した。１２時間後、この溶媒を減圧下で
除去し、そして得られた半個体を、クロロホルム（２×
２５ｍＬ）で抽出した。溶媒をロターリーエバポレーシ
ョンによって除去し、生成物を得た（１．８５ｇ、８９
％）。（Ａｓｈｉｋａｇａ，Ｋ．、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．、第６１巻、第２４４３〜第２４
５０頁を参照）。
【０１３２】（９．２，３，１１，１２−オクタジュー
テロ−４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカ
ンジアミン（９）） ラネーニッケル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、無水メタノール
で、反転およびデカンテーションによって、５回洗浄し
た。５０ｍｇのこの洗浄した触媒を、２０ｍＬの無水メ
タノール中に静置し、続いてテフロン（登録商標）ライ
ンゴム隔壁（Ｔｅｆｌｏｎ−ｌｉｎｅｄ ｒｕｂｂｅｒ
ｓｅｐｔｕｍ）を取り付けた５０ｍＬのスクリューキ
ャップバイアル中で１ｇ（４．６ｍｍｏｌ）の８中に静
置した。このバイアルのヘッドスペースを、数分間、こ
の隔壁を貫通する１８ゲージ針を介して、Ｈ2でフラッ
シュした。このキャップを密接にネジで締め、そしてこ
の全体のアセンブリを、４０ｐｓｉ Ｈ2まで充填し、
４時間、熱水浴（８０℃）中に配置し、その後、この固
体触媒を、濾過によって除去し、そしてメタノールをエ
バポレートした。この最終生成物を逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙ
ｄａｃ Ｃ−１８ 分取スケールカラム、６ｍＬ／分、
移動相：Ｈ2Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０
８％ＴＦＡ）））によって精製した。収量１８０ｍｇ。
（Ａｓｈｉｋａｇａ，Ｋ．、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．Ｊｐｎ．、第６１巻、第２４４３〜第２４５０頁を
参照）。
【０１３３】（１０．６の重水素化アナログ（１０）） ２５ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）の５を、５ｍＬの０．２
Ｍ炭酸ナトリウム中の９０ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ）の
９の攪拌溶液（ｐＨ１０．５ ３７℃で）へ添加した。
この反応を、３日間進行させ、この後、この溶液を希ト
リフルオロ酢酸で中和し、そして逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄ
ａｃ Ｃ−１８ 分取スケールカラム、６ｍＬ／分、移
動相：Ｈ2Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８
％ＴＦＡ））によって精製した。収量６ｍｇ。
【０１３４】（１１．７の重水素化アナログ（１１）） ３ｍｇ（８．４ｍｃｍｏｌ）量の４を、アルゴン雰囲気
下で、攪拌しながら、０．７ｍＬの無水ＤＭＦに溶解し
た。５ｍｃＬのトリエチルアミン、続いて２．４ｍｇ
（８．９ｍｍｃｍｏｌの１を添加した。活性エステルの
形成を、シリカＴＬＣ（５：１ ＣＨＣｌ3／ＣＨ3Ｏ
Ｈ，Ｒｆ０．５，ＵＶ）によって、スポットしたＴＬＣ
プレートを空気流で簡単に乾燥することによってモニタ
ーした。２５分後、この混合物を、１ｍＬの無水ＤＭＦ
中の６ｍｇ（１１ｍｃｍｏｌ）の１０に添加した。２時
間後、この溶媒を、真空遠心分離によって除去し、そし
て最終生成物を、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８
分取スケールカラム、６ｍＬ／分、移動相：Ｈ2Ｏ
（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））
によって精製した。収量１．８ｍｇ。
【０１３５】（１２．ＧＭ１内部標準結合体（１２）） １．８ｍｇの１１を、攪拌しながら、２ｍＬの１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ２．３緩衝
液へ添加した。１５ユニット組換えβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、そして１２時間後、こ
の混合物を、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８ 分
取スケールカラム、６ｍＬ／分、移動相：Ｈ2Ｏ（０．
０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））によっ
て精製した。収量１．５ｍｇ。
【０１３６】（ポリエーテルジアミンリンカー合成（第
２生成）） 合成は、以前に記載された化学（Ｋａｔａｋｙ，Ｒ．
ら、Ｊ ＣＨＥＭ ＳＯＣ ＰＥＲＫ Ｔ ２（２）
３２１−３２７ ＦＥＢ １９９０）に基づき、少しの
改変および追加の２工程を伴う。例として、確立された
手順からの逸脱、ならびに追加の工程についての正確な
細部を、出発物質のジエチレングリコールについて以下
に概要を述べる。
【０１３７】（１，１１−ジシアノ−３，６，９−トリ
オキサウンデカン（１３）） ２％（ｗ／ｖ）水酸化ナトリウム（５ｍＬ）およびジエ
チレングリコール（５．３ｇ、５０ｍｍｏｌ）の攪拌溶
液へ、アクリロニトリル（７．９５ｇ、１５０ｍｍｏ
ｌ）を添加した。この混合物を室温で一晩攪拌し、そし
て５０ｍＬのジクロロメタンを添加した。この有機層
を、ブラインで２回洗浄し、そして乾燥した（ＭｇＳＯ
4）。この溶媒を、ロターリーエバポレーションによっ
て除去した。油状残渣を、２００プルーフのエタノール
で処理し、そして溶媒をロータリーエバポレーションに
よって除去した。これを２回繰り返して、過剰な未反応
のアクリロニトリルを除去した。生成物をさらなる精製
なしに使用した。
【０１３８】（ジエチル４，７，１０−トリオキサトリ
デカン−１，１３−ジオエート（１４）） ２ｇ（９．４ｍｍｏｌ）の１３を、５ｍＬのエタノール
に溶解した。１ｇの濃硫酸を、５分間にわたって徐々に
添加した。この反応系を一晩加熱還流した。この反応物
を、４０ｍＬの塩化メチレンで抽出し、１０ｍＬの水で
１回、そして１０ｍＬの希ブライン溶液で洗浄した。こ
の有機層を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、そして溶媒を除去し
て、オイルを得た。この最終生成物を、シリカクロマト
グラフィー（塩化メチレン／酢酸エチル）によって精製
した。
【０１３９】（１，１３−ジヒドロキシ−４，７，１０
−トリオキサトリデカン（１５）） テトラヒドロフランを溶媒として使用して、記載のよう
に正確に調製した（１．７ｇ、５．５ｍｍｏｌの１４、
５０ｍＬの希［ＣａＨ2］ＴＨＦ、０．６６ｇ，１６．
５ｍｍｏｌの水素化アルミニウムリチウム）。一旦添加
が完了すると、過剰のＬＡＨをエタノールでクエンチ
し、そしてこれらの塩を、白色沈殿が形成されるまで飽
和硫酸ナトリウム溶液を滴下することによって、沈殿さ
せた。溶媒を除去し、この沈殿物を、３０ｍＬのＴＨＦ
で６回洗浄し、そして合わせた有機抽出物を、エバポレ
ートして、オイルを得た。最終生成物を、シリカクロマ
トグラフィー（最初に、塩化メチレンで、次いで酢酸エ
チルで、最後にアセトンで）よって精製した。
【０１４０】（１，１３−ジクロロ−４，７、１０−ト
リオキサトリデカン（Ｐ２を使用するアナログ）（１
６）） １．１．ｇ（４．９ｍｍｏｌ）の１５を、３０ｍＬの乾
燥ベンゼン中の１．１５ｇ（１４．６ｍｍｏｌ）の希ピ
リジンへ、攪拌しながら添加し、続いて１．８ｇ（１
４．６ｍｍｏｌ）の塩化チオニルを添加した。この混合
物を、６時間加熱還流した。氷浴中で冷却した後、５ｍ
Ｌの３Ｍ ＨＣＬを、激しく攪拌しながら添加した。有
機層を分離し、希ブライン溶液で３回洗浄し、そして乾
燥し（ＮａＳＯ4）、黄色がかったオイルを得た。洗浄
および溶媒の除去後、このジクロリドをさらなる精製な
しで使用した。
【０１４１】（追加の工程） （１，１３−ジシアノ−４，７，１０−トリオキサドデ
カン（１７）） ４ｍＬのジメチルスルホキシド中の０．７８ｇ（１５．
５ｍｍｏｌ）のシアン化ナトリウムの攪拌溶液へ、８０
℃で、１ｇ（３．９ｍｍｏｌ）の１６を添加した。２時
間後、この反応物に、１０ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶
液、５ｍＬの水、および５０ｍＬの酢酸エチルを添加し
た。前述のように、この有機層をブライン溶液で３回洗
浄し、その後、この有機層を乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、そ
して溶媒を除去した。最終生成物を、シリカクロマトグ
ラフィー（塩化メチレン／酢酸エチル）によって精製し
た。ＥＳＩ−ＭＳ：予測値、２４０．１；実測値、２４
１．１（Ｍ＋Ｈ+）+。
【０１４２】（１，１５−ジアミノ−５，８，１１−ト
リオキサペンタデカン（１８）） ０．４２ｇ（１０．４ｍｍｏｌ）の新鮮なＬＡＨを含有
する５０ｍＬの乾燥ＴＨＦの攪拌溶液を、アルゴン下
で、１５分間、穏やかに加熱還流した。１５ｍＬの乾燥
ＴＨＦ中の０．５ｇ（２ｍｍｏｌ）の１７を、２０分間
にわたって滴下し、穏やかな還流を維持した。未反応の
ＬＡＨを、エタノールでクエンチし、そしてこの混合物
を、効率的に攪拌しながら、白色沈殿物が形成するま
で、飽和硫酸ナトリウムの滴下で処理した。この混合物
を濾過し、そしてこの沈殿物を３０ｍＬのＴＨＦで６回
洗浄した。有機抽出物を合わせ、そして溶媒をロターリ
ーエバポレーションによって除去し、オイルを得た。Ｅ
ＳＩ−ＭＳ：予測値、２４８．１；実測値、２４９．１
（Ｍ＋Ｈ+）+。
【０１４３】（重水素化） 重水素を、重水素化アルミニウムリチウム（９８％Ｄ）
を使用する１４および１７の還元によって、このジアミ
ンリンカーに組み込み、ｄ−８重水素化ジアミンを達成
した。この合成の他の局面は、この手順について変更さ
れなかった。これらのジオールを、後述のようにＳＦＤ
結合体の構築において使用した。
【０１４４】（サンフィリポ症候群Ｂ型（Ｎ−β−Ｄ−
グルコサミニダーゼ欠乏）についての重要な基質合成） （１３．ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−Ｎ−アセチルグ
ルコサミン（１９）） ２０ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）のｐ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｓｉｇｍａ）を、
５ｍＬの隔壁ラインバイアル（ｓｅｐｔａ−ｌｉｎｅｄ
ｖｉａｌ）中、３ｍＬのメタノール中の５ｍｇの洗浄
した活性炭担持パラジウム触媒へ、攪拌しながら添加し
た。この隔壁を、１６ゲージ針によって貫通し、そして
このバイアルのヘッドスペースを、Ｈ2ガスでフラッシ
ュした。Ｈ2ガスを、溶液を通してゆっくりと２時間バ
ブルさせ、この後、触媒を、ケイ藻土（セライト）で濾
過することによって除去した。溶媒をロターリーエバポ
レーションによって除去し、半固体を得た（１８ｍｇ、
９０％）。
【０１４５】（１４．ｐ−アクリルアミドフェニル−β
−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（２０）） １０ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）の１９を、１５ｍＬのエ
タノールおよび１００ｍｃＬのトリエチルアミンへ、攪
拌しながら添加した。この溶液を、氷浴中で冷蔵した。
１５ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）のアクリロイルクロリド
を、２ｍＬの乾燥塩化メチレンに溶解し、そして５分間
にわたってこの攪拌溶液に滴下した。この反応系を、室
温まで戻し、続いて２時間攪拌した。次いで、溶液を、
中性ｐＨが湿性ｐＨ紙で得られるまで、連続の陰イオン
交換樹脂および陽イオン交換樹脂（それぞれ、ＡＧ Ｍ
Ｐ−１およびＡＧ ＭＰ−５０、ＢｉｏＲａｄ）で処理
した。溶媒をロターリーエバポレーションで除去し、固
体（１１ｍｇ、９５％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ．収量１
１ｍｇ。
【０１４６】（１５．３，６−ジオキサ−１，９−ノナ
ンジニトリル（２１）） ２ｇ（０．０３２ｍｍｏｌ）のエチレングリコールを、
３０ｍＬの乾燥ベンゼン中の０．５ｇの乾燥水酸化カリ
ウムへ、続いて５ｇ（０．０９６ｍｍｏｌ）のアクリロ
ニトリルを添加し、室温で一晩攪拌した。この反応物を
濾過し、そして溶媒をロターリーエバポレーションによ
って除去して、オイルを得た。最終産物を、シリカクロ
マトグラフィー（クロロホルム／メタノール）によって
精製し、無色オイルを得た（３．２ｇ、６０％）。
【０１４７】（１６．４，７−ジオキサ−１，１０−デ
カンジアミン（２２）） ラネーニッケル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、反転およびデカ
ンテーションによって、無水メタノールで５回洗浄し
た。５０ｍｇのこの洗浄した触媒を、２０ｍＬの無水メ
タノールに静置し、続いてテフロンラインゴム隔壁を取
り付けた５０ｍＬのスクリューキャップバイアル中で１
ｇ（６ｍｍｏｌ）の２１に静置した。このバイアルのヘ
ッドスペースを、この隔壁を貫通する１６ゲージ針を介
して、Ｈ2でフラッシュした。このキャップを密接にネ
ジで締め、そしてこの全体のアセンブリを、４０ｐｓｉ
Ｈ2まで充填し、熱水浴（８０℃）中に４時間配置
し、その後、この固体触媒を、濾過によって除去し、そ
してメタノールをエバポレートした。この最終生成物を
逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８ 分取スケールカ
ラム、６ｍＬ／分、移動相：Ｈ2Ｏ（０．０８％ＴＦ
Ａ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））によって精製し
た。
【０１４８】（１７．２０および２２のマイケル付加生
成物（２３）） ５ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）の２０を、５ｍＬの０．
２Ｍ炭酸ナトリウム中の１３ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）
の２２の攪拌溶液（ｐＨ１０．５、３７℃で）へ添加し
た。この反応を、３日間進行させ、この後、この溶液を
希トリフルオロ酢酸で中和し、そして逆相ＨＰＬＣ（Ｖ
ｙｄａｃ Ｃ−１８ 分取スケールカラム、６ｍＬ／
分、移動相：Ｈ2Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ
（０．０８％ＴＦＡ））によって精製した。収量６ｍ
ｇ。
【０１４９】（１８．４および２３のＳＦＢ基質結合体
（２４）） ４ｍｇ（０．０１３ｍｍｏｌ）量の４を、攪拌しなが
ら、アルゴン雰囲気下で１．５ｍＬの無水ＤＭＦに溶解
した。１０ｍｃＬの乾燥トリエチルアミン、続いて４ｍ
ｇ（０．０１５ｍｍｏｌ）の１を添加した。活性エステ
ルの形成を、シリカＴＬＣ（５：１ ＣＨＣｌ3／ＣＨ3
ＯＨ，Ｒｆ０．５，ＵＶ）によって、スポットしたＴＬ
Ｃプレートを空気流で簡単に乾燥することによってモニ
ターした。２５分後、この混合物を、１ｍＬの無水ＤＭ
Ｆ中の６ｍｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）の２３へ添加し
た。２時間後、溶媒を真空遠心分離によって除去し、そ
して最終生成物を逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８
分取スケールカラム、６ｍＬ／分、移動相：Ｈ2Ｏ
（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））
によって精製した。収量４．２ｍｇ。
【０１５０】（１９．１，９−テトラジューテロ−３，
６−ジオキサ−１，９−ノナンジニトリル（２５）） ０．５ｇ（８ｍｍｏｌ）のエチレングリコールを、０．
１ｇの乾燥水酸化カリウム（２０ｍＬのアセトニトリル
中）に添加し、次いで１．４ｇ（２４ｍｍｏｌ）ｄ−３
アクリロニトリルを室温で一晩攪拌しながら添加した。
この反応物を濾過し、そして溶媒をロタリーエバポレー
トにより除去し、オイル状物を得た。最終生成物をシリ
カクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール）に
より精製し、無色のオイル状物０．９ｇ（６５％）を得
た。
【０１５１】（２０．１，９−テトラジューテロ−３，
６−ジオキサ−１，９−ノナンジアミン（２６）） Ｒｅｎｅｙニッケル（Ａｌｄｒｉｃｈ）を、インバージ
ョンおよびデカンテーションにより無水メタノールで５
回洗浄した。２０ｍｇの洗浄した触媒を無水メタノール
（３０ｍＬ）中に配置し、続いて、０．５ｇ（３ｍｍｏ
ｌ）の２５（Ｔｅｆｌｏｎラインラバーセプタムを備え
た５０ｍＬスクリューキャップバイアル中）を配置し
た。このバイアルの頭隙を、セプタムを貫通する１８−
ゲイジ針を介してＨ2ガスで排除した。このキャップを
しっかりとねじで取り付け、そして全アセンブリを、４
０ｐｉｓ Ｈ2でチャージし、そして温水浴（８０℃）
に４時間配置し、その後、この固体触媒を濾過によって
取り除き、そしてメタノールをエバポレートした。この
最終生成物を、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８分
取−スケールカラム、６ｍＬ／分 移動相：Ｈ2Ｏ
（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））
により精製した。
【０１５２】（２１．２３の重水素化したアナログ（２
７）） ２０ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）のｐ−アクリルアミドフ
ェニルβ−Ｄ−ガラクトシドを、攪拌した２６（９０ｍ
ｇ、０．４ｍｍｏｌ）（０．５ｍＬの０．２Ｍ炭酸ナト
リウム中）の溶液に、ｐＨ１０．５、３７℃で添加し
た。この反応を３日進行させ、この後、溶液を希釈トリ
フルオロ酢酸で中和し、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ
−１８分取スケールカラム、６ｍＬ／分、移動相：Ｈ2
Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦ
Ａ））により精製した。収量２ｍｇ。
【０１５３】（２２．２４の重水素化したアナログ（２
８）） ２ｍｇ（６．３ｍｃｍｏｌ）量の４を、攪拌しながら無
水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中に、アルゴン雰囲気下で溶解
した。５ｍｃＬのトリエチルアミンを添加し、続いて
２．１ｍｇ（７．６ｍｃｍｏｌ）の１を添加した。活性
エステルの形成は、シリカＴＬＣ（５：１ＣＨＣｌ3／
ＣＨ3ＯＨ、Ｒｆ０．５、ＵＶ）（空気流でスポットし
たＴＬＣプレートを簡単に乾燥する）によりモニターし
た。３５分後、この混合物を４ｍｇ（７ｍｃｍｏｌ）の
２７（１ｍＬの無水ＤＭＦ中）に添加した。２時間後、
溶媒を真空遠心分離により除去し、そして最終生成物
を、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８分取−スケー
ルカラム、６ｍＬ／分 移動相：Ｈ2Ｏ（０．０８％Ｔ
ＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））により精製し
た。収量１．２ｍｇ。
【０１５４】（２３．ＳＦＢ内部標準結合体（２９）） １．２ｍｇの２８を２ｍＬの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／１
０ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ７．３緩衝液に攪拌しながら
添加した。１５単位の組換え型β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、そして１２時間後に、混合
物を逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８分取−スケー
ルカラム、６ｍＬ／分 移動相：Ｈ2Ｏ（０．０８％Ｔ
ＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））により精製し
た。収量０．７ｍｇ。
【０１５５】（Ｄ型サンフィリポ症候群（スルファター
ゼ欠乏症）のための臨床的基質の合成） （２４．ｐ−アクリルアミドフェニル−β−Ｄ−Ｎ−ア
セチルグルコサミン−６−スルフェート（３０）） １
００ｍｇ（０．２８ｍｍｏｌ）の２０を、１０ｍＬの乾
燥ＤＭＦに、アルゴン雰囲気下で室温で攪拌させながら
添加した。８９ｍｇ（０．５６ｍｍｏｌ）の硫黄トリオ
キシドピリジン錯体を、２ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解
し、そして０．７×、１．１×、１．３×および１．９
×当量（＋７００ｍｃＬ、＋４００ｍｃＬ、＋２００ｍ
ｃＬ、および＋６００ｍｃＬ）で反応物に添加した。反
応の進行を、硫酸化剤の各量の添加１時間後に１５ｍｃ
Ｌの溶液を除去することにより、５．２９ｐｐｍから
５．２４ｐｐｍへのアノマー（Ｃ１）プロトン化学シフ
トの1Ｈ−ＮＭＲシフトによってモニターした。除去し
た混合物を真空遠心分離により乾燥し、ｄ−６ＤＭＳＯ
に再溶解し、そして分析した。Ｃ１アノマープロトンの
２形態（出発物質およびＣ−６スルフェート）以上が出
現すると、この反応物を−２０℃で取り出し、そして保
存した。この生成物を真空遠心分離により溶媒を除去
し、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８分取−スケー
ルカラム、６ｍＬ／分 移動相：Ｈ2Ｏ（０．０８％Ｔ
ＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））により精製し
た。収率７２％。
【０１５６】（２５．１８および３０のマイケル付加生
成物（３１）） ２５ｍｇ（０．０５８ｍｍｏｌ）の３０を、攪拌した８
３ｍｇ（０．３５ｍｍｏｌ）の１８（５ｍＬの０．２Ｍ
炭酸ナトリウム中）の溶液に、ｐＨ１０．５、３７℃で
添加した。この反応を３日間進行させ、この後、この溶
液を希釈トリフルオロ酢酸で中和し、逆相ＨＰＬＣ（Ｖ
ｙｄａｃ Ｃ−１８分取−スケールカラム、６ｍＬ／分
移動相：Ｈ2Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．
０８％ＴＦＡ））により精製した。収量１０ｍｇ。
【０１５７】（２６．４および３１のＳＦＤ基質結合体
（３２）） ５．７ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）量の４を、１．０ｍ
Ｌの無水ＤＭＦ中にアルゴン雰囲気下で攪拌しながら溶
解した。２０ｍｃＬの乾燥トリエチルアミンを添加し、
続いて５．５ｍｇ（０．０２０ｍｍｏｌ）の１を添加し
た。活性エステルの形成は、シリカＴＬＣ（５：１ＣＨ
Ｃｌ3／ＣＨ3ＯＨ、Ｒｆ０．５、ＵＶ）（空気流でスポ
ットしたＴＬＣプレートを簡単に乾燥する）によりモニ
ターした。２５分後、この混合物を１０ｍｇ（０．０１
５ｍｍｏｌ）の３１（１ｍＬの無水ＤＭＦ中）に添加し
た。２時間後、溶媒を真空遠心分離により除去し、そし
て最終生成物を、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８
分取−スケールカラム、６ｍＬ／分 移動相：Ｈ2Ｏ
（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））
により精製した。収量５．４ｍｇ。
【０１５８】（２７．１，２，１４，１５−オクタジュ
ーテロ−１，１５−ジアミノ−５，８，１１−トリオキ
サペンタデカン（３３）） ポリエーテルジアミンリンカーの合成、第２生成におい
て参照される。
【０１５９】（２８．３１の重水素化アナログ（３
４）） ２５ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）の２０を、攪拌した１０
０ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）の１１（５ｍＬの０．２Ｍ炭
酸ナトリウム中）の溶液に、ｐＨ１０．５、３７℃で添
加した。反応を３日間進行させ、この後、この溶液を希
釈トリフルオロ酢酸で中和し、逆相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａ
ｃ Ｃ−１８分取−スケールカラム、６ｍＬ／分 移動
相：Ｈ2Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）／ＡＣＮ（０．０８％
ＴＦＡ））により精製した。収量７ｍｇ。
【０１６０】（２９．ＳＦＤ内部標準結合体（３５）） ４ｍｇ（１２．６ｍｃｍｏｌ）量の４を、攪拌しながら
無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中に、アルゴン雰囲気下で溶解し
た。２０ｍｃＬのトリエチルアミンを添加し、続いて４
ｍｇ（１４ｍｃｍｏｌ）の１を添加した。活性エステル
の形成は、シリカＴＬＣ（５：１ＣＨＣｌ3／ＣＨ3Ｏ
Ｈ、Ｒｆ０．５、ＵＶ）（空気流でスポットしたＴＬＣ
プレートを簡単に乾燥する）によりモニターした。２０
分後、この混合物を７ｍｇ（１１ｍｃｍｏｌ）の３４
（１ｍＬの無水ＤＭＦ中）に添加した。４時間後、溶媒
を真空遠心分離により除去し、そして最終生成物を、逆
相ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８分取−スケールカラ
ム、６ｍＬ／分 移動相：Ｈ2Ｏ（０．０８％ＴＦＡ）
／ＡＣＮ（０．０８％ＴＦＡ））により精製した。収量
２．７ｍｇ。
【０１６１】（Ｎ−（ｄ−ビオチニル−サルコシニル）
−１２−アミノドデカン酸（３６）） 化合物４（３２．２ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）を、減
圧下（Ｐ2Ｏ5で）で一晩乾燥した。乾燥ＤＭＦ（２ｍ
Ｌ）を添加し、そして混合物を窒素下で溶解に影響を与
えるために加温しながら攪拌した。トリエチルアミン
（３４ｍｃＬ）を添加し、続いて１（２０．４ｍｃＬ、
０．１１５ｍｍｏｌ）を２つの１０．２ｍｃＬ部分にわ
けて、５分の間隔で添加した。この混合物を、１時間室
温で、窒素下で攪拌した。１２−アミノドデカン酸（２
４．１ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ）を、１
度に添加し、そしてこの混合物を、２時間室温で、窒素
下で攪拌した。ＣＨＣｌ3（８０ｍＬ）を添加し、そし
て有機溶液を、１ＭのＨＣｌの２つの１０ｍＬ部分で洗
浄した。ＣＨＣｌ3を、ロタリーエバポレーターにより
取り除いた。この化合物をメタノールに溶解し、そして
残渣のＤＭＦを真空遠心分離によって除去し、そしてＨ
ＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ ２１８ＴＰ、分取カラム）によっ
て精製した。溶媒プログラムは：０〜１０分（０．０６
％のＴＦＡを有する水）；１０〜５５分（０．０６％の
ＴＦＡを有する０〜１００％メタノール）であり、流速
が、６ｍＬ／分である。収量３１．７ｍｇ。1Ｈ−ＮＭ
Ｒ、ＥＳＩ−ＭＳ、計算値５１３．４、実測値５３１．
４（Ｍ＋Ｈ）±。
【０１６２】（３６のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル
エステル（３７）） 化合物３６（９．８ｍｇ、１９ｍｃｍｏｌ）を窒素下で
１００ｍｃＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解した。Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド（２．２ｍｇ、１９ｍｃｍｏｌ）を添
加し、続いてジシクロヘキシルカルボジイミド（３．９
ｍｇ、１９ｍｃｍｏｌ）を添加した。この混合物を、暗
闇で６０時間室温で攪拌した。溶媒を、真空遠心分離に
より除去し、そして残渣をＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ（１５
／１）〜ＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ（１２／１）の勾配を用
いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーに供し
た。収量９．８ｍｇ。1Ｈ−ＮＭＲ。ＥＳＩ−ＭＳ、計
算値６１０．８、実測置６０９．７（Ｍ＋Ｈ）±。
【０１６３】（Ｎ−（Ｎ−（ｄ−ビオチニル−サルコシ
ニル）−１２−アミノドデカノイル）−プシコシン（ｐ
ｙｓｃｈｏｓｉｎｅ）（３８）） 化合物３７（６．２ｍｇ、１０ｍｃｍｏｌ）およびプシ
コシン（（ｐｙｓｃｈｏｓｉｎｅ）（４．７ｍｇ、１０
ｍｃｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ）を窒素下で２００ｍｃＬの乾
燥ＤＭＦ中に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン
（５ｍｃＬ）を添加し、そして、この混合物を、暗闇で
２日間窒素下で攪拌した。化合物を直接ＨＰＬＣカラム
（Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰセミ−分取）に注入し、そして
このカラムを２ｍＬ／分で０〜２０分（０．０６％ＴＦ
Ａを有する水）、次いで２０〜８０分（０．０６％ＴＦ
Ａを有する０〜１００％のメタノール）で展開した。収
量３．８ｍｇ。1Ｈ−ＮＭＲ。ＥＳＩ−ＭＳ、計算値９
５７．３、実測置９５６．８（Ｍ＋Ｈ）±。
【０１６４】（Ｎ−（Ｎ−（ｄ−ビオチニル−サルコシ
ニル）−１２−アミノドデカノイル）−スフィンゴシル
ホスホリルコリン（３９）） スフィンゴシルホスホリルコリン（４．０ｍｇ、Ｓｉｇ
ｍａ）を１ｍＬの乾燥ＤＭＦと共に混合し、そして溶媒
を真空遠心分離によって除去した。これらをさらに２回
繰り返した。最終の乾燥した残渣の重量は、２．５ｍｇ
（５．４ｍｃｍｏｌ）であった。この残渣に、３．３ｍ
ｇの３７（５．４ｍｃＬ）、１５０ｍｃＬの乾燥ＤＭ
Ｆ、および２．５ｍｃＬのジイソプロピルエチルアミン
を添加した。この混合物を、暗闇で３日間窒素下で攪拌
した。化合物を直接ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ２１８
ＴＰセミ−分取）に注入し、そしてこのカラムを２ｍＬ
／分で０〜２０分（０．０６％ＴＦＡを有する水）、次
いで２０〜８０分（０．０６％を有する０〜１００％の
メタノール）で展開した。収量３．８ｍｇ。1Ｈ−ＮＭ
Ｒ。ＥＳＩ−ＭＳ、計算値９６０．３、実測置９５８．
７（Ｍ＋Ｈ）±。
【０１６５】（１，１３−ジアミノ−４，７，１０−ト
リオキサトリデカンとのｄ−ビオチンの結合体（４
０）） 化合物２を、基本的に３の合成のために記載したよう
に、１，１３−ジアミノ−４，７，１０−トリオキサト
リデカン（Ｆｌｕｋａ）と反応させた。この生成物を、
１．５ｍＬ／分で３０分かけて０．０６％のＴＦＡを有
する０〜１００％のメタノールを使用するＨＰＬＣ（Ｖ
ｙｄａｃ２１８ＴＰ、セミ−分取）により精製した。
【０１６６】（ヨードアセチル化した４０（４１）） 化合物４０を、室温で４時間窒素下で攪拌しながら、５
当量のヨード無水酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）（乾燥ＤＭＦ
中で処理した。この生成物を、４０についてのようにＨ
ＰＬＣで精製した。この構造は、ＥＳＩ−ＭＳによって
同定した。
【０１６７】（オクタジューテロ化した４１（４２）） この表題化合物を、４０についてのように、１３−ジア
ミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカンの代わりに
９を使用して調製した。
【０１６８】（オクタジューテロ化した４２（４３）） 表題化合物を、４１についてのように、４２から調製し
た。この構造をＥＳＩ−ＭＳによって同定した。
【０１６９】（例示的ＭＳN技術および計測） アミノ酸配列によるタンパク質の同定のための自動化Ｌ
Ｃ−ＭＳ／ＭＳシステムが、開発されている。略図を図
７に示す。オートサンプラー、ＥＳＩ三重極−四重極Ｍ
Ｓ／ＭＳ装置にオンライン接続されたキャピラリーＨＰ
ＬＣシステムおよびデータシステムからなる、このシス
テムを以下の方法で操作する：タンパク質（典型的に１
Ｄまたは２Ｄゲル電気泳動により分離される）を、特定
のプロテアーゼ（通常、トリプシン）を用いて切断し、
得られた切断フラグメントをオートサンプラーに配置す
る。３７分おきに、オートサンプラーは、１サンプルを
ＨＰＬＣシステムに注入し、そしてペプチドはキャピラ
リー逆相クロマトグラフィーによって分離される。クロ
マトグラフィーカラムから分離されたペプチドが溶出す
ると、これらのペプチドはＥＳＩプロセスによりイオン
化され、ＭＳに入り、電荷比（ｍ／ｚ）に対する質量が
測定される。ペプチドの強度が予め測定した強度閾値
（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を超える
任意のペプチドイオンが、自動的にこの装置によって選
択され、不活性ガスを含む衝突セル内で衝突される。こ
れらの衝突により、主にペプチド骨格の結合でのペプチ
ドフラグメント化（衝突誘発される解離（ＣＩＤ））が
生じる。このＣＩＤフラグメントの質量が測定され、そ
してデータシステムに記録される。ペプチドのＣＩＤス
ペクトルは、連続ＭＳ／ＭＳスペクトルを有する配列デ
ータベースを調査することによって、タンパク質を同定
する十分な情報を含む。このことは、Ｓｅｑｕｅｎｔプ
ログラムで達成される。このプログラムにより、ＣＩＤ
に対してＭＳで選択されたペプチドと同じ質量を有する
配列データベースで各ペプチドを同定し、同重核の（ｉ
ｓｏｂａｒｉｃ）ペプチドの各々に対するＭＳ／ＭＳス
ペクトルを予想する。実験的に測定されたＣＩＤスペク
トルを、コンピュータにより得られる理論的ＣＩＤスペ
クトルと対応させることで、観測したペプチドが由来す
るタンパク質を同定する。このシステムにより、十分に
自動化した様式で、１サンプル当たり４０分未満のペー
スで、タンパク質サンプルを分析することが可能であ
る。各ペプチドは、独立したタンパク質の同定を意味
し、そして通常多種のペプチドが１種のタンパク質から
導かれるので、この方法によるタンパク質の同定は、余
分であり、ゲル中で共遊走する（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉ
ｎｇ）タンパク質に対して寛容である。このシステム
は、ペプチド鎖の修飾された残基の検出および特徴づけ
のために十分に適している。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術およ
び得られたＣＩＤスペクトルの自動化分析は、本発明の
方法のために使用され得る。
【０１７０】（固相抽出キャピラリー電気泳動タンデム
質量スペクトル（ＳＰＥ−ＣＥ−ＭＳ／ＭＳ）によるサ
ブ−フェムトモル感度でのタンパク質の同定） この方法によるタンパク質の同定は、ペプチドの分離お
よびイオン化が著しく高感度で実施されることを除い
て、上記と同じ原理に基づく。図８は、キーとなるデザ
イン要素の略図を示す。このシステムのデザインおよび
操作の方法は公表される。タンパク質消化物から誘導さ
れるペプチドは、ＳＰＥにより濃縮され、ＣＥにより分
離され、そしてＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳにより分析される。
得られる連続ＣＩＤスペクトルを使用して、Ｓｅｑｕｅ
ｓｔソフトウエアシステムで配列データベースを調査し
た。ＳＰＥ抽出デバイスは、融合したシリカ分離キャピ
ラリーに直接パックされた寸法０．１８×１ｍｍの小さ
な逆相クロマトグラフィーカラムである。サンプル溶液
中に含まれるペプチドは、ＳＰＥデバイスにおいて吸着
され、濃縮され、見積もられた１００〜３００ｎｌの有
機溶媒で溶出され、そして５〜３０ｎｌの見積り体積ま
で電気泳動スタッキングおよび／または等速電気泳動に
よりさらに濃縮される。次いで、これらのペプチドは、
ＣＥにより２０μｍまたは５０μｍのｉ．ｄ．キャピラ
リーにより分離され、ペプチドがキャピラリーを離れる
とき直接ＥＳＩによりイオン化される（このミクロスプ
レイイオン化源のデザインについては参照文献１３を参
照のこと）。このシステムを用いて、ペプチドの質量
を、６６０アットモル（ａｔｔｏｍｏｌｅ）（２０個の
残基ペプチドに対して約５００ｆｇ）の感度で、３３ａ
ｍｏｌ／μｌの濃度限度で測定され得、そしてこのタン
パク質は、３００ａｍｏｌ／μｌ未満の濃度限度で１０
ｆｍｏｌ（５０ｋＤａのタンパク質につき０．５ｎｇ）
未満の自動的に選択したペプチドのＣＩＤスペクトルに
より同定され得る。この技術は、実験により得られるペ
プチドの非常に高感度の分析のために使用される。自動
化ＣＩＤ実験に利用可能な分析時間が、ＣＥ電圧のデー
タ依存性調節により十分に延ばされ得ることも実証され
ている。いくつかのペプチドイオンが同時にＭＳで検出
される場合、このＣＥ電圧は、自動的にドロップされ
る。このことで、キャピラリーの電気浸透流が減少し、
これによりペプチドイオンをＣＩＤ用に選択するための
利用可能な時間の延長する結果となる。このピークパー
キング（ｐｅａｋ ｐｅｒｋｉｎｇ）技術の正味の効果
は、技術の動的範囲の延長である。なぜなら、この利用
可能な増加した時間が、低イオン電流を有するイオンの
ＣＩＤに使用されるからである。いったん、全てのペプ
チドイオンが分析されると、ＣＥ電圧が元々の値まで増
加することによって、電気泳動が自動的に再加速され
る。
【０１７１】表１． α−ラクトアルブミン存在率の相
対的な、余剰の定量（システインが重い同位体のビオチ
ン化剤により修飾された既知量の同じタンパク質との混
合後）
【０１７２】
【表１】
【０１７３】ａ ４-ペプチドでは、重イオンと軽イオ
ンとの２ａｍｕのみの差に起因して、同位体パターンが
高度にオーバーラップしたため、同位体比を分析しなか
った。
【０１７４】表２． 単一の分析におけるタンパク質混
合物の成分の、配列同定および定量
【０１７５】
【表２】
【０１７６】＊ 遺伝子名は、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ命
名法に従う（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ）。 † 各ペプチドについて、図３に示すように、比を計算
した。 ＝ 予測した比を、各混合物に存在する既知量のタンパ
ク質から計算した。 ＃ ＩＣＡＴ標識化システイニル残基。
【０１７７】表３． 炭素源としてガラクトースまたは
エタノール上で増殖するイーストからの、タンパク質プ
ロフィール。
【０１７８】
【表３】
【０１７９】＊ 遺伝子名は、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｅ
ｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＹＰＤ）に従う（１９）。 ＃ システイニル残基はＩＣＡＴ標識化される。 † タンパク質発現比を、図３に記載のように計算し
た。 ＝ イースト増殖のための炭素源は、２％エタノール
（Ｅｔｈ）または２％ガラクトース（ＧＡＬ）であっ
た。 § 遺伝子は、ガラクトースまたはグルコースにより抑
圧されることが公知である（１９）。 ¶ 他の８つのリボソームタンパク質を、類似の遺伝子
発現レベルで検出した。
【０１８０】
【表４】
【０１８１】
【０１８２】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【０１８９】
【０１９０】
【０１９１】表５． プロトン化およびナトリウム化
（ｓｏｄｉａｔｅｄ）基質結合体、生成物、およびＣＤ
ＧＳ酵素に対する内部標準の、分子量
【０１９２】
【表５】
【０１９３】a ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−マンノ
ース−（マンノース−ＧｌｕＮＡｃ）2残基を含むＣｌ
ｃＮＡｃ−Ｔ ＩＩ生成物および内部標準について算出
した。
【０１９４】
【化５】
【０１９５】
【化６】
【０１９５】
【化７】
【０１９７】
【化８】
【０１９８】
【化９】
【０１９９】
【化１０】
【０２００】
【化１１】
【０２０１】
【化１２】
【０２０２】
【化１３】
【０２０３】
【化１４】
【０２０４】
【化１５】
【０２０５】
【化１６】
【０２０６】
【化１７】
【０２０７】
【化１８】
【０２０８】
【化１９】
【０２０９】
【化２０】
【０２１０】
【化２１】
【０２１１】
【化２２】
【０２１２】
【化２３】
【０２１３】
【化２４】
【０２１４】
【化２５】
【０２１５】
【化２６】
【０２１６】
【表６】
【０２１７】
【０２１８】
【０２１９】
【０２２０】 ［図面の簡単な説明］
【図１Ａ】図１Ａは、同位体的に軽い（１４５７．９
ｕ）および重い（１４６１．８）ビオチン化試薬で改変
したペプチドの［Ｍ＋２Ｈ］2+イオンの４ａｍｕ同位体
分布を示すイオン捕捉質量分析計からのズームスキャン
を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、同位体的に重い試薬で標識した既
知の量のペプチドの存在下で測定した５つの異なる濃度
のｄ０標識ペプチドのズームスキャンからの同位体比の
分析から得た曲線を示す。
【図２】図２は、α−ラクトアルブミンからのシステイ
ン修飾ペプチドのタンデム型質量スペクトルを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、単一のペプチド対について、ＭＳ
モードで操作した質量分析計の単回スキャンを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、単一のペプチド対について、それ
ぞれ９９３．８および９７７．７のｍ／ｚ比を有する、
イオン対の周囲の質量スペクトルの拡大図を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、９９３．８および９７７．７のｍ
／ｚ比を有する、イオン対について再構成されたイオン
クロマトグラムを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ｍ／ｚ＝９９８を有するペプチド
イオンから記録されたＣＩＤスペクトルを示す
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４ＡのＣＩＤスペクトルととも
に行ったデータベース検索の結果を示す。これによっ
て、タンパク質をグリセロアルデヒド−３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼ（これは、タンパク質の混合物の１メンバ
ーであった）と同定した。
【図５Ａ】図５Ａは、酵母におけるイソチームのアルコ
ールデヒドロゲナーゼファミリーが、六炭糖（ＡＤＨ
１）およびエタノール（ＡＤＨ２）のいずれも増殖を促
進し、遺伝子ＡＤＨ２が、ともにグルコース抑制され、
そしてガラクトース抑制され、ＴＣＡサイクルに入るア
セトアルデヒドへとそれを転換することによって酵母細
胞がエタノールで完全に増殖することを可能とする酵素
をコードし、糖存在下、ＡＤＨ１が、アセトアルデヒド
をエタノールへと変換する、その逆反応を実施すること
を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＡＤＨ１ペプチドの質量分析結果
を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＡＤＨ２ペプチドの質量分析結果
を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ブランクのＥＳＩ−ＭＳスペクト
ルであり、これは試薬１および２（ｍ／ｚ８４３および
８４０）からの（Ｍ＋Ｈ）+イオンのピーク、内部標準
５および６（ｍ／ｚ６８９および６４１）のピーク、お
よび微量の産物３および４（ｍ／ｚ６８１および６３
７）のピークを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、健康な個体由来の細胞ホモジネー
トと共にインキュベートしたサンプルのＥＳＩ−ＭＳス
ペクトルを示し、ｍ／ｚ６８１において、β−ガラクト
シダーゼ産物、そしてｍ／ｚ６３７においてＮ−アセチ
ル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ産物をはっきりと示
す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、β−ガラクトシダーゼ欠乏症の２
人の患者由来の細胞を使用した場合のＥＳＩ−ＭＳスペ
クトルを示し、ブランクレベル（０．９±０．９および
０．８±０．６ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇ）より上の酵素産物
は、ほんのわずかしか観察されず、一方、Ｎ−アセチル
−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性は、はっきりと検出
されることがわかる。
【図７】図７は、自動化ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムの概
略図である。
【図８】図８は、ＳＰＥ−ＣＥ−ＭＳ／ＭＳシステムの
概略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/566 33/566 33/68 33/68 (72)発明者 ゲルブ， マイケル エイチ. アメリカ合衆国 ワシントン 98115, シアトル， 34ティーエイチ アベニ ュー エヌイー 6203 (72)発明者 ジジ， スティーブン ピー. アメリカ合衆国 ワシントン 98115, シアトル， エヌイー 75ティーエイ チ ストリート エイ211 5844 (72)発明者 スコット， シー． ロナルド アメリカ合衆国 ワシントン 98105, シアトル， プルマン アベニュー エヌイー 4815 (72)発明者 トゥレセック， フランティセック アメリカ合衆国 ワシントン 98115, シアトル， 29ティーエイチ アベニ ュー エヌイー 7001 (72)発明者 ガーバー， スコット エイ. アメリカ合衆国 ワシントン 98115, シアトル， 27ティーエイチ アベニ ュー エヌイー 7264 (72)発明者 リスト， ビート アメリカ合衆国 ワシントン 98112, シアトル， 16ティーエイチ アベニ ュー イースト 1146 (56)参考文献 米国特許5650270（ＵＳ，Ａ) 米国特許5614368（ＵＳ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，Ｖ ｏｌ．17，Ｎｏ．10，Ｐ．994−999（Ｏ ｃｔ．1999) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/34 ZNA C12Q 1/48 G01N 27/62 G01N 30/72 G01N 30/88 G01N 33/53 G01N 33/566 G01N 33/68 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (76)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 タンパク質の混合物を含む２つまたはそ
    れ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上のタンパク質
    またはタンパク質機能を同定しそしてそれらの相対量を
    決定するための方法であって、該方法は以下： （ａ）親和性タグ化した、実質的に化学的に同一である
    が同位体的に区別可能であるタンパク質反応試薬を、各
    サンプルに対して提供する工程であって、ここで、該試
    薬は以下の式を有し： Ａ−Ｌ−ＰＲＧ ここで、Ａは、捕捉試薬に選択的に結合する親和性標識
    であり、Ｌは、１つまたはそれ以上の原子が１つまたは
    それ以上の安定同位体で差次的に標識され得る、リンカ
    ー基であり、そしてＰＲＧは、タンパク質反応基であ
    る、工程； （ｂ）各サンプルを１つの該タンパク質反応試薬と反応
    させ、該サンプル中に親和性タグ化タンパク質また親和
    性タグ化酵素生成物を提供する工程であって、それによ
    って、異なるサンプル中の親和性タグ化タンパク質およ
    び酵素生成物が、安定同位体で差次的に標識される、工
    程； （ｃ）該差次的に標識されたサンプルを合わせる工程； （ｄ）選択的にＡと結合する該捕捉試薬を使用して、該
    サンプルの親和性タグ化成分を捕捉する工程； （ｅ）該親和性タグ化成分と該捕捉試薬との間の相互作
    用を中断することによって、該捕捉試薬から捕捉された
    親和性タグ化成分を放出する工程； （ｆ）該放出された親和性タグ化成分を質量分析計によ
    って検出および同定する工程；および （ｇ）該親和性タグ化した差次的に標識されたタンパク
    質の相対量か、該親和性タグ化した差次的に標識された
    酵素生成物の相対量か、またはその両方を測定する工
    程； を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 タンパク質の混合物を含む１つまたはそ
    れ以上のサンプル中の１つまたはそれ以上のタンパク質
    またはタンパク質機能を同定するための方法であって、
    該方法は以下： （ａ）親和性タグ化したタンパク質反応試薬を提供する
    工程であって、ここで、該試薬は以下の式を有し： Ａ−Ｌ−ＰＲＧ ここで、Ａは、捕捉試薬に選択的に結合する親和性標識
    であり、Ｌは、１つまたはそれ以上の原子が１つまたは
    それ以上の安定同位体で差次的に標識され得る、リンカ
    ー基であり、そしてＰＲＧは、酵素に対する基質である
    タンパク質反応基である、工程； （ｂ）各サンプルをタンパク質反応試薬と反応させ、各
    サンプル中に親和性タグ化酵素生成物を提供する工程； （ｃ）選択的にＡと結合する該捕捉試薬を使用して、該
    サンプルの親和性タグ化成分を捕捉する工程； （ｄ）該親和性タグ化成分と該捕捉試薬との間の相互作
    用を中断することによって、該捕捉試薬から捕捉された
    親和性タグ化成分を放出する工程；および （ｅ）該放出された親和性タグ化成分を質量分析計によ
    って検出および同定する工程、 を包含する、方法。
  3. 【請求項３】 タンパク質を含む２つまたはそれ以上の
    サンプル中のタンパク質の相対量を決定するための方法
    であって、該方法は以下： （ａ）親和性タグ化した、実質的に化学的に同一である
    が同位体的に区別可能である標識したタンパク質反応試
    薬を、各サンプルに対して提供する工程であって、ここ
    で、該試薬は以下の式を有し： Ａ−Ｌ−ＰＲＧ ここで、Ａは、捕捉試薬に選択的に結合する親和性標識
    であり、Ｌは、安定同位体で差次的に標識され得るリン
    カー基であり、そしてＰＲＧは、タンパク質官能基と選
    択的に反応するタンパク質反応基である、工程； （ｂ）各サンプルを１つの該タンパク質反応試薬と反応
    させ、該サンプル中に親和性タグ化タンパク質を提供す
    る工程であって、それによって、異なるサンプル中の親
    和性タグ化タンパク質が安定同位体で差次的に標識され
    ている、工程； （ｃ）該差次的に標識されたサンプルを合わせ、そして
    該合わせたサンプル中のタンパク質を切断してペプチド
    を生成するために該合わせたサンプルを処理する工程； （ｄ）選択的にＡと結合する該捕捉試薬を使用して、該
    合わせたサンプルの親和性タグ化した差次的に標識した
    ペプチドを捕捉する工程； （ｅ）親和性タグ化した差次的に標識したペプチドと該
    捕捉試薬との間の相互作用を中断することによって、該
    捕捉試薬から捕捉された該親和性タグ化ペプチドを放出
    する工程； （ｆ）該放出された親和性タグ化した差次的に標識した
    ペプチドを、質量分析計によって検出および同定する工
    程；および （ｇ）親和性タグ化した差次的に標識したペプチドから
    発生する同位体的に異なるイオンの相対存在度を測定
    し、該親和性タグ化した差次的に標識したペプチドが由
    来する該タンパク質の相対量を決定する工程、 を包含する、方法。
  4. 【請求項４】 親和性タグ化した実質的に化学的に同一
    であるが同位体的に区別可能であるタンパク質反応試薬
    が、該タンパク質反応試薬のリンカー基を１つまたはそ
    れ以上の安定同位体で差次的に標識することによって、
    各サンプルに提供される、請求項１〜３のいずれか１項
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ＰＲＧが、タンパク質官能基と選択的に
    反応するタンパク質反応基であり、そして該タンパク質
    官能基を含む複数のタンパク質が、１つのサンプル中で
    検出されそして同定される、請求項１、３または４のい
    ずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 １つまたはそれ以上の前記親和性タグ化
    成分のタンパク質部分が、タンデム型質量分析計によっ
    て配列決定され、該タンパク質を同定する、請求項１〜
    ５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記合わせたサンプル中の前記親和性タ
    グ化タンパク質が、該親和性タグ化タンパク質を親和性
    タグ化ペプチドに転化するために、該親和性タグ化タン
    パク質の捕捉前または後に消化またはフラグメント化さ
    れる、請求項１または３〜６のいずれか１項に記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 １つまたはそれ以上の前記親和性タグ化
    ペプチドが、タンデム型質量分析計によって配列決定さ
    れ、該ペプチドが由来する該親和性タグ化タンパク質を
    同定する、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記放出された親和性タグ化成分が、質
    量分析計によって該成分を検出しそして同定する前に、
    クロマトグラフィーによって分離される、請求項１〜８
    のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 サンプル中の１つまたはそれ以上のタ
    ンパク質が、前記タンパク質反応試薬のタンパク質反応
    基と反応し得るタンパク質官能基を露出させるために、
    酵素学的にまたは化学的に処理される工程をさらに包含
    する、請求項１または３〜９のいずれか１項に記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】 前記サンプル中の１つまたはそれ以上
    のタンパク質の量もまた、質量分析計によって決定さ
    れ、定量される該タンパク質の各々に対する既知の量の
    １つまたはそれ以上の内部標準を、１つまたはそれ以上
    の該サンプルに導入する工程をさらに包含する、請求項
    １または３〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記内部標準が、１つまたはそれ以上
    の前記サンプルにおいて同定されるタンパク質に特徴的
    な、親和性タグ化した差次的に同位体的に標識したペプ
    チドである、請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 タンパク質との反応について異なる特
    異性を有する、親和性タグ化した、実質的に化学的に同
    一であるが同位体的に区別可能である、２つまたはそれ
    以上のタンパク質反応試薬を提供し、そして分析する各
    サンプルと反応させる、請求項１〜１２のいずれか１項
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ＰＲＧが、酵素に対する基質である、
    請求項１または２に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 親和性タグ化した、実質的に化学的に
    同一であるが同位体的に区別可能である基質を、前記タ
    ンパク質反応試薬のリンカー基を１つまたはそれ以上の
    安定同位体で差次的に標識することによって、サンプル
    中の検出および同定されるべき各酵素に提供する、請求
    項１、２、９または１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ２つまたはそれ以上の異なるサンプル
    中の１つまたはそれ以上のタンパク質またはタンパク質
    機能の相対量もまた決定され、前記差次的に標識したサ
    ンプルを合わせる工程、該合わせたサンプルから親和性
    タグ化成分を捕捉する工程、および該異なるサンプル中
    の該親和性タグ化した差次的に標識した成分の相対量を
    測定する工程さらに包含する、請求項１、２、９、１４
    または１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ＰＲＧが、酵素基質であり、そしてサ
    ンプル中の１つまたはそれ以上の酵素の酵素学的速度
    が、親和性タグ化酵素生成物の定量によって決定され、
    定量される該親和性タグ化酵素生成物の各々に対する既
    知の量の１つまたはそれ以上の内部標準を、１つまたは
    それ以上の前記サンプルに導入する工程をさらに包含す
    る、請求項１、２、９または１４〜１６のいずれか１項
    に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 サンプル中の１つまたはそれ以上の酵
    素の酵素学的速度が、時間の関数としての親和性タグ化
    酵素生成物の定量によって決定される、請求項１７に記
    載の方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜１８のいずれか１項に記載
    の方法であって、前記試薬が、以下の式： 【化１】 を有し、 Ａは、前記親和性標識であり； ＰＲＧは、前記タンパク質反応基であり；そして 【化２】 は、前記リンカー基であり、ここで： Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、そし
    てＸ２は他のＸ２と独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ、Ｎ
    ＲＲ’＋、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯＳ、Ｓ−Ｓ、ＳＯ、ＳＯ
    ２、ＣＯ−ＮＲ’、ＣＳ−ＮＲ’、Ｓｉ−Ｏ、アリール
    またはジアリール基から選択され得るか、あるいはＸ１
    〜Ｘ４は、存在しなくてもよく； Ｂ１およびＢ２は、互いに独立して、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｃ
    Ｏ−ＮＲ’、ＣＳ−ＮＲ’、（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮ
    Ｒ’、（ＣＨ２）ｑ−ＣＳ−ＮＲ’、または（ＣＨ２）
    ｑから選択される任意の基であり； ｎ、ｍ、ｐ、ｑおよびｘは、０〜約１００の値を取り得
    る整数であり、ここで、ｎ＋ｘｍ＋ｐ＋ｑの合計が約１
    ００未満であり； Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキ
    シ、または必要に応じて１つまたはそれ以上のアルキ
    ル、アルケニル、アルキニルもしくはアルコキシ基で置
    換されるアリール基であり；そして、 Ｒ’は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ア
    ルコキシ、または必要に応じて１つまたはそれ以上のア
    ルキル、アルケニル、アルキニルもしくはアルコキシ基
    で置換されるアリール基であり、 ここで、該リンカー中の１つまたはそれ以上のＣＨ２基
    は、アルキル、アルケニル、アルコキシ基、必要に応じ
    て１つまたはそれ以上のアルキル、アルケニル、アルキ
    ニルもしくはアルコキシ基で置換されるアリール基、酸
    性基、塩基性基、または永久的な正の電荷もしくは負の
    電荷を有する基で必要に応じて置換され得；ここで、該
    リンカー中の非隣接ＣＨ２基を連結する１つまたはそれ
    以上の単結合は、二重または三重結合で置き換えられ
    得、ここで、該リンカー中の１つ以上の原子は、安定同
    位体で置換され得る、 方法。
  20. 【請求項２０】 Ｂ１またはＢ２の少なくとも１つが、
    ＣＯ−ＮＲ’またはＣＳ−ＮＲである、請求項１９に記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】 Ｘ１およびＸ４が、ＮＨ、ＮＲ、およ
    びＮＲＲ’＋からなる群より選択され、Ｘ３がＯであ
    り、そして全てのＸ２基がＯである、請求項１９または
    ２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記試薬における親和性標識が、ハプ
    テンである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方
    法。
  23. 【請求項２３】 前記試薬における親和性標識が、ビオ
    チンまたは改変ビオチンである、請求項１〜２２のいず
    れか１項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記タンパク質反応試薬における親和
    性標識が、１，２−ジオール、グルタチオン、マルトー
    ス、ニトリロ三酢酸基、オリゴヒスチジンおよびハプテ
    ンからなる群より選択される、請求項１〜２３のいずれ
    か１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記タンパク質反応試薬における前記
    リンカー基が、ジスルフィド基を含む、請求項１〜２４
    のいずれか１項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記タンパク質反応試薬における前記
    リンカー基が、切断可能である、請求項１〜２５のいず
    れか１項に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記タンパク質反応基における前記リ
    ンカー基が、重同位体で置換され得る、請求項１〜２６
    のいずれか１項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記試薬のＰＲＧが、タンパク質官能
    基と選択的に反応する、請求項１、３、５〜１３または
    １９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記試薬のＰＲＧが、スルフヒドリル
    反応基である、請求項１、３、５〜１３または１９〜２
    ８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記タンパク質反応試薬のＰＲＧが、
    ヨードアセチルアミド基、エポキシド、α−ハロアシル
    基、ニトリル、スルホン化アルキル、アリールチオール
    またはマレイミドである、請求項１、３、５〜１３また
    は１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記試薬のＰＲＧが、アミン反応基、
    ホモセリンラクトンと反応する基またはカルボン酸基と
    反応する基である、請求項１、３、５〜１３または１９
    〜３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記試薬のＰＲＧが、アミン反応性ペ
    ンタフルオロフェニルエステル基、アミン反応性Ｎ−ヒ
    ドロキシスクシンイミドエステル基、スルホニルハライ
    ド、イソシアネート、イソチオシアネート、活性エステ
    ル、テトラフルオロフェニルエステル、酸ハライド、酸
    無水物、ホモセリンラクトン反応性１級アミン基、カル
    ボン酸反応性アミン、アルコールおよび２，３，５，６
    −テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテートから
    なる群から選択される、請求項１、３、５〜１３または
    １９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記ＰＲＧが、１つまたはそれ以上の
    酵素に対する酵素基質である、請求項１、２または１４
    〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記ＰＲＧが、１つまたはそれ以上の
    酵素に対する酵素基質であり、該酵素の欠乏が、疾患状
    態に関連する、請求項１、２、１４〜２７または３３の
    いずれか１項に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 親和性タグ化した、実質的に化学的に
    同一かつ差次的に同位体的に標識した酵素基質が、サン
    プル中で検出および同定されるべき各酵素に提供され
    る、請求項１、２、１４〜２７または３３〜３４のいず
    れか１項に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記試薬のＰＲＧが、β−ガラクトシ
    ダーゼ、アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、ヘパ
    ランスルファミダーゼ、アセチル−ＣｏＡ−Ｄ−グルコ
    サミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼまたはＮ−ア
    セチルグルコサミン−６−スルファターゼに対する基質
    である、請求項１、２、１４〜２７または３３〜３５の
    いずれか１項に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 １つまたはそれ以上の前記酵素が、出
    生時欠損と関連する、請求項１、２、１４〜２７または
    ３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 １つまたはそれ以上の前記酵素の欠乏
    が、疾患状態に関連する、請求項１、２、１４〜２７ま
    たは３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 同定される前記タンパク質またはタン
    パク質機能の１つまたはそれ以上が、リソソーム蓄積病
    と関連する、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方
    法。
  40. 【請求項４０】 同定される前記タンパク質またはタン
    パク質機能の１つまたはそれ以上が、出生時欠損と関連
    する、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 ２つまたはそれ以上の異なるサンプル
    中の膜タンパク質の相対量を測定する、請求項１または
    ３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 異なるサンプルが、異なるオルガネラ
    または異なる細胞成分画分に由来するタンパク質を含
    む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 異なるサンプルが、異なる環境状態も
    しくは栄養状態、異なる化学的刺激もしくは物理的刺
    激、または異なる時間に応答して発現されるタンパク質
    を表す、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記サンプルが、細胞表面タンパク質
    を含むサンプルである、請求項１〜４３のいずれか１項
    に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 細胞表面タンパク質を含む２つまたは
    それ以上の前記サンプルにおける、特定の細胞状態に特
    徴的な１つまたはそれ以上のマーカータンパク質を同定
    する、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 細胞表面タンパク質を含む２つまたは
    それ以上の前記サンプルにおける、特定の細胞状態に特
    徴的な１つまたはそれ以上のマーカータンパク質の相対
    的な発現レベルを決定する、請求項１〜４５のいずれか
    １項に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 １つのサンプル中の複数のタンパク質
    またはタンパク質機能を検出および同定する、請求項１
    〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 １つのサンプル中の全てのタンパク質
    またはタンパク質機能を検出および同定する、請求項１
    〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 以下の一般式： Ａ−Ｌ−ＰＲＧ を有するタンパク質の質量分析計分析のための試薬であ
    り、ここで、Ａは、捕捉試薬に選択的に結合する親和性
    標識であり、Ｌは、安定同位体で差次的に標識されるリ
    ンカー基であり、そしてＰＲＧは、タンパク質反応基で
    ある、試薬。
  50. 【請求項５０】 以下の一般式： Ａ−Ｌ−ＰＲＧ を有するタンパク質の質量分析計分析のための試薬であ
    り、ここで、Ａは、捕捉試薬に選択的に結合する親和性
    標識であり、Ｌは、安定同位体で差次的に標識され得る
    リンカー基であり、そしてＰＲＧは、酵素に対する基質
    であるタンパク質反応基である、試薬。
  51. 【請求項５１】 以下の一般式： 【化３】 を有する、請求項４９または５０に記載の試薬であっ
    て： Ａは、親和性標識であり； ＰＲＧは、タンパク質反応基であり；そして 【化４】 は、リンカー基であり、ここで： Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４は、互いに独立して、そし
    てＸ２は他のＸ２と独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ、Ｎ
    ＲＲ’＋、ＣＯ、ＣＯＯ、ＣＯＳ、Ｓ−Ｓ、ＳＯ、ＳＯ
    ２、ＣＯ−ＮＲ’、ＣＳ−ＮＲ’、Ｓｉ−Ｏ、アリール
    またはジアリール基から選択され得るか、あるいはＸ１
    〜Ｘ４は、存在しなくてもよく； Ｂ１およびＢ２は、互いに独立して、ＣＯＯ、ＣＯ、Ｃ
    Ｏ−ＮＲ’、ＣＳ−ＮＲ’、（ＣＨ２）ｑ−ＣＯＮ
    Ｒ’、（ＣＨ２）ｑ−ＣＳ−ＮＲ’、または（ＣＨ２）
    ｑから選択される任意の基であり； ｎ、ｍ、ｐ、ｑおよびｘは、０〜約１００の値を取り得
    る整数であり、ここで、ｎ＋ｘｍ＋ｐ＋ｑの合計が約１
    ００未満であり； Ｒは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキ
    シ、または必要に応じて１つまたはそれ以上のアルキ
    ル、アルケニル、アルキニルもしくはアルコキシ基で置
    換されるアリール基であり；そして、 Ｒ’は、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ア
    ルコキシ、または必要に応じて１つまたはそれ以上のア
    ルキル、アルケニル、アルキニルもしくはアルコキシ基
    で置換されるアリール基であり、 ここで、該リンカー中の１つまたはそれ以上のＣＨ２基
    は、アルキル、アルケニル、アルコキシ基、必要に応じ
    て１つまたはそれ以上のアルキル、アルケニル、アルキ
    ニルもしくはアルコキシ基で置換されるアリール基、酸
    性基、塩基性基、または永久的な正の電荷もしくは負の
    電荷を有する基で必要に応じて置換され得；ここで、該
    リンカー中の非隣接ＣＨ２基を連結する１つまたはそれ
    以上の単結合は、二重または三重結合で置き換えられ
    得、ここで、該リンカー中の１つ以上の原子は、安定同
    位体で置換され得る、試薬。
  52. 【請求項５２】 Ｂ１またはＢ２の少なくとも１つが、
    ＣＯ−ＮＲ’またはＣＳ−ＮＲである、請求項４９〜５
    １のいずれか１項に記載の試薬。
  53. 【請求項５３】 Ｘ１およびＸ４が、ＮＨ、ＮＲおよび
    ＮＲＲ’＋から選択され、Ｘ３がＯであり、そして全て
    のＸ２基がＯである、請求項４９〜５２のいずれか１項
    に記載の試薬。
  54. 【請求項５４】 前記親和性標識が、ハプテンである、
    請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の試薬。
  55. 【請求項５５】 前記親和性標識が、ビオチンまたは改
    変ビオチンである、請求項４９〜５４のいずれか１項に
    記載の試薬。
  56. 【請求項５６】 前記親和性標識が、１，２−ジオー
    ル、グルタチオン、マルトース、ニトリロ三酢酸基、ま
    たはオリゴヒスチジンからなる群から選択される、請求
    項４９〜５５のいずれか１項に記載の試薬。
  57. 【請求項５７】 前記リンカー基が、ジスルフィド基を
    含む、請求項４９〜５６のいずれか１項に記載の試薬。
  58. 【請求項５８】 前記リンカー基の任意の原子が、重同
    位体で置換され得る、請求項４９〜５７のいずれか１項
    に記載の試薬。
  59. 【請求項５９】 前記リンカー基が、切断可能なリンカ
    ーである、請求項４９〜５８のいずれか１項に記載の試
    薬。
  60. 【請求項６０】 前記Ａ−Ｌ−ＰＲＧが、分析されるサ
    ンプル液体に可溶である、請求項４９〜５９のいずれか
    １項に記載の試薬。
  61. 【請求項６１】 ＰＲＧが、タンパク質官能基と選択的
    に反応する基である、請求項４９または５１〜６０のい
    ずれか１項に記載の試薬。
  62. 【請求項６２】 ＰＲＧが、スルフヒドリル反応基であ
    る、請求項４９または５１〜６１のいずれか１項に記載
    の試薬。
  63. 【請求項６３】 ＰＲＧが、ヨードアセチルアミド基、
    エポキシド、α−ハロアシル基、ニトリル、スルホン化
    アルキル、アリールチオールまたはマレイミドである、
    請求項４９または５１〜６１のいずれか１項に記載の試
    薬。
  64. 【請求項６４】 ＰＲＧが、アミン反応基、ホモセリン
    ラクトンと反応する基またはカルボン酸基と反応する基
    である、請求項４９または５１〜６１のいずれか１項に
    記載の試薬。
  65. 【請求項６５】 ＰＲＧが、アミン反応性ペンタフルオ
    ロフェニルエステル基、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシス
    クシンイミドエステル基、スルホニルハライド、イソシ
    アネート、イソチオシアネート、活性エステル、テトラ
    フルオロフェニルエステル、酸ハライド、酸無水物、ホ
    モセリンラクトン反応性１級アミン基、カルボン酸反応
    性アミン、アルコールまたは２，３，５，６−テトラフ
    ルオロフェニルトリフルオロアセテートからなる群から
    選択される、請求項４９、５１〜６１または６４のいず
    れか１項に記載の試薬。
  66. 【請求項６６】 ＰＲＧが、酵素に対する基質である、
    請求項４９〜６０のいずれか１項に記載の試薬。
  67. 【請求項６７】 ＰＲＧが、その欠乏が出生時欠損と関
    連する酵素に対する基質である、請求項４９〜６０また
    は６６のいずれか１項に記載の試薬。
  68. 【請求項６８】 ＰＲＧが、その欠乏がリソソーム蓄積
    病と関連する酵素に対する基質である、請求項４９〜６
    ０または６６のいずれか１項に記載の試薬。
  69. 【請求項６９】 ＰＲＧが、β−ガラクトシダーゼ、ア
    セチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ、ヘパランスルフ
    ァミダーゼ、アセチル−ＣｏＡ−α−Ｄ−グルコサミニ
    ドＮ−アセチルトランスフェラーゼまたはＮ−アセチル
    グルコサミン−６−スルファターゼに対する基質であ
    る、請求項４９〜６０または６６〜６８のいずれか１項
    に記載の試薬。
  70. 【請求項７０】 請求項４９または５０に記載の試薬を
    含む、質量分析計分析によるタンパク質の分析のための
    試薬キット。
  71. 【請求項７１】 請求項４９または５０に記載の１つま
    たはそれ以上の試薬を含む、請求項７０に記載の試薬キ
    ット。
  72. 【請求項７２】 親和性タグ化タンパク質の消化におけ
    る使用のための１つまたはそれ以上のタンパク質分解酵
    素をさらに含む、請求項７０〜７１のいずれか１項に記
    載の試薬キット。
  73. 【請求項７３】 １セットの、実質的に化学的に同一か
    つ差次的に標識した親和性タグ化試薬を含む、請求項７
    ０〜７２のいずれか１項に記載の試薬キット。
  74. 【請求項７４】 前記試薬が、親和性タグ化酵素基質試
    薬である、請求項７０〜７３のいずれか１項に記載の試
    薬キット。
  75. 【請求項７５】 １セットの、実質的に化学的に同一か
    つ差次的に標識した親和性タグ化酵素基質を含む、請求
    項７０〜７４のいずれか１項に記載の試薬キット。
  76. 【請求項７６】 １セットの、実質的に化学的に同一か
    つ差次的に標識した親和性タグ化酵素生成物をさらに含
    む、請求項７０〜７５のいずれか１項に記載の試薬キッ
    ト。
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