JP3231791B2 - 糖ヌクレオチドの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、オリゴ糖合成の重要な基質である糖ヌクレ
オチドの製造法に関するものである。

背景技術 近年、糖鎖についての研究が急速に進み、その機能が
明らかになるにつれ、生理活性を有するオリゴ糖の医薬
品または機能性素材としての用途開発が注目を集めてい
る。しかし、現在市販されているオリゴ糖はごく限られ
た種類のものしかなく、しかも極めて高価である。ま
た、そのようなオリゴ糖は試薬レベルでしか製造でき
ず、必ずしもその大量製造法が確立されているとは限ら
ない。

従来、オリゴ糖の製造は天然物からの抽出法、化学合
成法あるいは酵素合成法、さらにはそれらの併用により
行われていたが、その中でも酵素合成法が大量製造に適
した方法であると考えられている。すなわち、（１）酵
素合成法が化学合成法にみられる保護、脱保護といった
煩雑な手順を必要とせず、速やかに目的のオリゴ糖を合
成できる点、（２）酵素の基質特異性により、きわめて
構造特異性の高いオリゴ糖を合成できる点などが他の方
法より有利と考えられるためである。さらに、近年の組
換えDNA技術の発達により種々の合成酵素が安価にしか
も大量に生産できるようになりつつあることが、酵素合
成法の優位性をさらに押し上げる結果となっている。

酵素合成法によりオリゴ糖を製造する方法としては、
オリゴ糖の加水分解酵素の逆反応を利用する方法および
糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が考えられて
いる。前者の方法は、基質として単価の安い単糖を用い
ることができるという利点はあるものの、反応自体は分
解反応の逆反応を利用するものであり、合成収率や複雑
な構造を持つオリゴ糖製造への応用といった点では必ず
しも最良の方法とは考えられていない。

一方、後者は糖転移酵素を用いる合成法であり、合成
収率や複雑な構造を持つオリゴ糖製造への応用といった
点で前者の方法よりも有利であると考えられており、ま
た、近年の組換えDNA技術の進歩により各種糖転移酵素
の量産化も該技術の実現化への後押しとなってる。

しかしながら、糖転移酵素を用いる合成法で用いる糖
供与体である糖ヌクレオチドは、一部のものを除き依然
として高価で、量的にも試薬レベルのわずかな供給量で
しか提供し得ないのが現状である。例えば、多くの生理
活性糖鎖のコア部分に含まれるグルコースの供与体であ
るウリジン二リン酸グルコース（UDPG）についてもウリ
ジル酸（UMP）とグルコース１−リン酸（Ｇ−１−Ｐ）
から化学的に合成する方法あるいはUMPとグルコースを
基質として用いた酵母菌体法（T.Tochikura et al.,J.F
erment.Technol.,46,957（1968）,S.Shirota,et al.,Ag
ric.Biol.Chem.,35,325（1971）,S.Watanabe and I Tak
eda,Agric.Biol.Chem.,36,2265（1972））などが報告さ
れているものの、工業的生産の現実化までにはまだまだ
検討の余地が残されている。

本発明者らは、UMPとグルコースを基質として用いた
従来の酵母菌体法によるUDPGの生産法を検討したが、UD
PGの生成量はわずかであり、添加したUMPの60％以上は
ウリジン三リン酸（UTP）もしくはウリジン二リン酸（U
DP）に変換されており、UDPGの生産方法としては到底実
用化には耐えうる方法ではなかった。

したがって、本発明は、従来の酵母菌体法を改良し、
UDPGなどの糖ヌクレオチドを効率よく製造する方法を提
供することを目的とするものである。

発明の開示 本発明者らは上記目的を達成すべく研究を重ねた結
果、酵母によるUDPGの合成は、UMPからUTPを合成する反
応系とグルコースからＧ−１−Ｐを合成する反応系とUT
PとＧ−１−ＰからUDPGを合成する反応系の３つの反応
系が効果的に共役することが重要であるところ、UMPか
らUTPを合成する反応は比較的スムーズに進行するのに
対し、Ｇ−１−Ｐ合成活性とUTPとＧ−１−ＰからのUDP
G合成活性が徴弱であり、しかもそれらが効果的に共役
していないがために結果として目的とするUDPGの生産量
が低くなることを突き止めた。

この問題を解決すべく、更に研究を進めた結果、酵母
においてはUDPGではなく、UTPの合成を主眼とし、反応
系にUDPグルコースピロホスホリラーゼとＧ−１−Ｐを
共存させることでそれぞれの酵素反応を効果的に共役さ
せることができ、もって目的とするUDPGを高収率で製造
することができることを見出した。しかも、この方法は
UDPGに限らず、他の糖ヌクレオチドの合成にも適用可能
であることを確認し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、酵母菌体を用いてヌクレオチド
から糖ヌクレオチドを製造する方法において、反応系に
ヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼと糖１−
リン酸とを共存させることを特徴とする糖ヌクレオチド
の製造法に関するものである。

図面の簡単な説明 図１は、UDPGの経時的な生産量を示したものである。

図２は、GDPマンノースの経時的な生成量を示したも
のである。

発明を実施するための最良の形態 本発明における糖ヌクレオチドとしては、公知の糖ヌ
クレオチドであれば特に限定されない。具体的にはUDP
G、UDPガラクトース、UDPグルクロン酸などのUDP糖、GD
Pマンノース、GDPフコース、GDPグルコースなどのGDP
糖、ADPグルコースなどのADP糖、dTDPグルコース、dTDP
ガラクトースなどのdTDP糖、CDPグルコースなどのCDP糖
などを例示することができる。

反応に使用する酵母としては、従来、ヌクレオチド、
糖ヌクレオチドなどの製造に使用されていた酵母であれ
ば特に制限なく使用することができる。具体的には、チ
ゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）属、サッカロ
ミセス（Saccharomyces）属、カンディダ（Candida）
属、トルロプシス（Torulopsis）属、ハンセヌラ（Hans
enula）属、デバリオミセス（Debaryomyces）属などの
属に属する酵母を使用することができる。このような酵
母は、生酵母、乾燥酵母いずれであってもよいが、反応
収率の点から乾燥酵母を用いるのが好ましい。

反応系に共存させるヌクレオシド二リン酸−糖ピロホ
スホリラーゼとしては、特定の由来のものに限定され
ず、動物由来、植物由来、微生物由来など、すべての由
来のものを使用することができるが、酵素調製の簡便性
などの点から微生物由来のヌクレオシド二リン酸−糖ピ
ロホスホリラーゼを使用するのが好ましい。また、使用
するヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ遺伝
子がクローン化されている場合には、そのクローン化さ
れたヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ遺伝
子を用いて常法により大腸菌などを宿主として大量生産
させ、当該組換え菌より当該酵素を調製することも可能
である。

このようなヌクレオシド二リン酸−糖ピロホスホリラ
ーゼは、当該活性を有する限りどのような形態であって
もよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物ま
たは該処理物から得られる酵素調製物などが挙げられ
る。

微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地
を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法
で行うことができる。具体的に、バシラス属または大腸
菌類に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としては
ブイヨン培地、LB培地（１％トリプトン、0.5％イース
トエキストラクト、１％食塩）または２×YT培地（1.6
％トリプトン、１％イーストエキストラクト、0.5％食
塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種
後、約30〜50℃で約10〜50時間程度必要により撹拌しな
がら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体
を集菌することによりヌクレオシド二リン酸−糖ピロホ
スホリラーゼ活性を有する微生物菌体を調製することが
できる。

微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械
的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモ
ジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消火、
乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチ
ームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカ
リ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理
して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは
細胞膜の変性物が挙げられる。

酵素調製物としては、上記菌体処理物からヌクレオシ
ド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼ活性を有する画分を
通常の酵素の精製手段、例えば塩析処理、等電点沈澱処
理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフ
ィー処理などを施して得られる粗酵素または精製酵素を
使用することができる。

反応液に添加する糖１−リン酸及びヌクレオチド（ヌ
クレオシドモノリン酸）は、目的とする糖ヌクレオチド
に応じ、既知のものから適宜選択して市販されているも
の、あるいは公知の方法で調製したもの等を使用すれば
よい。使用濃度としては、各々約１〜200mMが好まし
く、約10〜100mMが特に好ましい。

糖ヌクレオチドの合成に使用するヌクレオシド二リン
酸−糖ピロホスホリラーゼ、ヌクレオチドおよび糖１−
リン酸の組み合わせの具体例を、下記表１に示す。

また、糖１−リン酸の代わりに糖１−リン酸の生成系
を反応液に共存させてもよい。例えば、ショ糖とショ糖
ホスホリラーゼの組み合わせによるＧ−１−Ｐ生成系
（E.J.Vandamme et al.,Adv.Appl.Microbiol.,32,163−
201（1987））、グリコーゲンとグリコーゲンホスホリ
ラーゼの組み合わせによるＧ−１−Ｐ生成系（P.H.Stra
usbauch et al.,Methods in Enzymology,11,671−67
5）、デキストリンとマルトデキストリンホスホリラー
ゼの組み合わせによるＧ−１−Ｐ生成系などを利用する
ことができる。

上記酵素及び基質以外に、反応系には無機リン酸とエ
ネルギー源を添加するのが好ましい。

使用する無機リン酸としては、リン酸カリウムなどの
リン酸塩をそのまま使用することもできるが、リン酸緩
衝液として使用するのが好ましいい。使用濃度は、約10
〜500mMが好ましく、約100〜300mMが特に好ましい。ま
た、リン酸緩衝液のpHも約6.0〜9.0の範囲から適宜設定
することができる。

エネルギー源としては、グルコース、フラクトース、
シュクロースなどの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸
を使用することができる。

糖ヌクレオチドの合成反応は、リン酸緩衝液中に酵母
菌体、ヌクレオチド、糖１−リン酸、エネルギー源とし
ての糖類もしくは有機酸を添加し、さらにヌクレオシド
二リン酸−糖ピロホスホリラーゼを好ましくは約0.001
ユニット/ml以上、さらに好ましくは約0.01〜ユニット/
ml添加し、好ましくは約30℃以下、より好ましくは約５
〜50℃で約１〜50時間程度、必要により撹拌しながら反
応させることにより実施できる。

なお、糖１−リン酸とヌクレオシド二リン酸−糖ピロ
ホスホリラーゼは、反応開始時に添加してもかまわない
が、反応開始後、添加したヌクレオチドに対応するヌク
レオシド三リン酸の生産が最大となったところで、反応
液を約60℃以上、５分間以上の熱処理などの酵母由来の
酵素を失活させる処理を行ったのち、糖１−リン酸ヌク
レオシド二リン酸−糖ピロホスホリラーゼを添加して酵
素反応を続けて行わせるのが望ましい。

このようにして得られた糖ヌクレオチドは、糖ヌクレ
オチドの通常の単離精製手段（イオン交換クロマトグラ
フィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単
離精製することができる。

実施例 以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、
本発明はこれに限定されるものではない。

なお、以下の実施例におけるDNAの調製、制限酵素に
よる切断、T4DNAリガーゼによるDNA連結、並びに大腸菌
の形質転換法は全て「Molecularcloning」（Maniatisら
編、Cold spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harb
or,New York（1982））に従って行った。また、制限酵
素、AmpliTaqDNAポリメラーゼ、T4DNAリガーゼは宝酒造
（株）より入手した。さらに、反応液中の糖ヌクレオチ
ドの定量はHPLC法により行った。具体的には、分離には
YMC社製のODS−AQ312カラムを用い、溶出液として0.5M
リン酸−カリウム溶液を用いる系、分離にはYMC社製のO
DS−AM303カラムを用い、溶出液として0.2Mトリエチル
アミン−酢酸（pH8.0）を用いる系などを採用した。

実施例1:UDPGの合成１ （１）大腸菌UDPグルコースピロホスホリラーゼ遺伝子
のクローニング 大腸菌K12株JM109菌（宝酒造（株）より入手）の染色
体DNAを斉藤と三浦の方法（Biochim.Biophys.Acta.,72,
619（1963））で調製した。このDNAをテンペレートとし
て、以下に示す２種類のプライマーDNAを常法に従って
合成し、PCR法により大腸菌UDPグルコースピロホスホリ
ラーゼ（galU）遺伝子（Weissborn et al.,J.Bacterio
l.,176,2611（1994））を増幅した。

幅した。

PCRによるgalU遺伝子の増幅は、50mM塩化カリウム、1
0mMトリス塩酸（pH 8.3）、1.5mM塩化マグネシウム、
0.001％ゼラチン、テンペレートDAN0.1μｇ、プライマ
ーDNA（Ａ）（Ｂ）各々0.2μM AmpliTaqDNAポリメラー
ゼ2.5ユニットの組成の反応液100μをDNA Thermal Cy
cler（Perkin−Elmer Cetus Instrument社製）を用い
て、熱変性（94℃、１分）、アニーリング（55℃、1.5
分）、ポリメライゼーション（72℃、1.5分）のステッ
プを25回繰り返すことにより行った。

遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム
（1:1）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノ
ールを添加しDNAを沈殿させた。沈殿回収したDNAを文献
（Molecular cloning、前述）の方法に従ってアガロー
スゲル電気泳動により分離し、1.0kb相当のDNA断片を精
製した。該DNAを制限酵素EcoR I及びSal Iで切断し、同
じく制限酵素EcoR I及びSal Iで消火したプラスミドpTr
c99A（Pharmacia Biotech.社より入手）とT4DNAリガー
ゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌JM109
菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体
よりプラスミドpTrc−galUを単離した。pTrc−galUは、
pTrc99Aのtrcプロモーター下流のEcoR I−Sal I切断部
位に大腸菌galU遺伝子を含有するEcoR I−Sal I DNA断
片が挿入されたものである。

（２）大腸菌UDPグルコースピロホスホリラーゼの調製 プラスミドpTrc−galUを保持する大腸菌JM109菌を、1
00mg/Lのアンピシリンを含有する２×YT倍地300mlに植
菌し、37℃で振とう培養した。４×10⁸菌/mlに達した時
点で、培養液に終濃度1mMになるようにIPTGを添加し、
さらに37℃で2.5時間振とう培養を続けた。

50mMトリス塩酸（pH7.5）、5mM EDTA、0.1％トライ
トンＸ−100、0.2mg/mlリゾチームの組成の緩衝液60ml
に菌体を懸濁した。37℃で１時間保温した後、超音波処
理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（20,000×
ｇ、10分）により菌体残渣を除去した。このように得ら
れた上清画分を酵素標品とした。酵素標品におけるUDP
グルコースピロホスホリラーゼ活性を対照菌（pTrc99A
を保持する大腸菌JM109菌）と共に下記表２に示す。

なお、UDPグルコースピロホスホリラーゼ活性の単位
（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出した。す
なわち、5mM塩化マグネシウム、6mM UTP、6mM Ｇ−１
−Ｐを含有する50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に酵素
標品を添加して37℃で保温することで反応を行い、100
℃、５分間の熱処理により酵素を失活させた後、HPLC法
により反応液中のUDPGを定量し、37℃で１分間に１μmo
leのUDPGを生成活性を１単位（ユニット）とした。

（３）乾燥パン酵母を用いたUDPG−UTP液の調製 40mM UMP、100mM グルコース、200mM リン酸ナト
リウム（pH8.0）、10mM 塩化マグネシウムの組成の反
応液20mlを100ml容ビーカーに調製し、これに2gの乾燥
パン酵母（オリエンタル酵母工業株式会社）を懸濁し、
20℃で９時間撹拌反応させた。反応終了後、反応液を10
0℃、５分間処理し、遠心分離（2,000×ｇ、10分間）に
より酵母菌体を除去した。回収した上清画分をHPLCで分
析したところ、7.9mM UDPG、21.9mM UTPの生成が確認
された。

（４）UDPG−UTP液へのUDPグルコースピロホスホリラー
ゼ及びＧ−１−Ｐ添加によるUDPGの合成 上述のUDPG−UTP液100mlに終濃度30mMとなるようにＧ
−１−Ｐを添加し、さらに0.5ユニット/ml UDPグルコ
ースピロホスホリラーゼとなるように実施例２記載の酵
素標品を添加し、30℃で30時間反応させた。反応液中の
UDPG濃度をHPLCで分析したところ、30.9mMのUDPGの生成
が確認された。

実施例2:UDPGの合成２ 実施例１の（３）および（４）と同じ方法にてUDPGを
合成した。ただし、添加するUDPグルコースピロホスホ
リラーゼは０ユニット、0.5ユニットまたは５ユニット
の酵素単位の酵素を用いて行った。

UDPGの経時的な生成量を図１に示す。

実施例3:UDPGの合成３ （１）大腸菌マルトデキストリンホスホリラーゼ遺伝子
のクローニング 大腸菌K12株JM109菌（宝酒造（株）より入手）の染色
体DNAを斉藤と三浦の方法（Biochim.Biophys.Acta.,72,
619（1963））で調製した。このDNAをテンペレートとし
て、以下に示す２種類のプライマーDNAを常法に従って
合成し、PCR法により大腸菌マルトデキストリンホスホ
リラーゼ（malP）遺伝子（Nature,313（6002）,500〜50
2（1985））を増幅した。

PCRによるmalP遺伝子の増幅は、50mM塩化カリウム、1
0mMトリス塩酸（pH 8.3）、1.5mM塩化マグネシウム、
0.001％ゼラチン、テンペレートDNA0.1μｇ、ライマーD
NA（Ｃ）（Ｄ）各々0.2μＭ、AmpliTaqDANポリメラーゼ
2.5ユニットの組成の反応液100μをDNA Thermal Cycl
er（Perkin−ELmer Cetus Instrument社製）を用いて、
熱変性（94℃、１分）、アニーリング（60℃、1.5
分）、ポリメライゼーション（72℃、３分）のステップ
を25回繰り返すことにより行った。

遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム
（1:1）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノ
ールを添加しDNAを沈殿させた。沈殿回収したDNAを文献
（Molecular cloning、前述）の方法に従ってアガロー
スゲル電気泳動により分離し、2.0kb相当のDNA断片を精
製した。該DNAを制限酵素EcoR I及びBamH Iで切断し、
同じく制限酵素EcoR I及びBamH Iで消火したプラスミド
pTrc99A（Pharmacia Biotech.社より入手）とT4DNAリガ
ーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌JM10
9菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換
体よりプラスミドpTrc−malPを単離した。pTrc−malP
は、pTrc99Aのtrcプロモーター下流のEcoR I−BamH I切
断部位に大腸菌malP遺伝子のプロモーター及び構造遺伝
子を含有するEcoR I−BamH I DNA断片が挿入されたもの
である。

（２）大腸菌マルトデキストリンホスホリラーゼの調製 プラスミドpTrc−malPを保持する大腸菌JM109菌を、1
00mg/Lのアンピシリンを含有する２×YT倍地300mlに植
菌し、37℃で８時間振とう培養した。４×10⁸菌/mlに達
した時点で、培養液に終濃度1mMになるようにIPTGを添
加し、さらに37℃で５時間振とう培養を続けた。

培養終了後、遠心分離（9,000×g,10分）により菌体
を回収し、50mMトリス塩酸（pH7.5）、5mM EDTA、0.1
％トライトンＸ−100、0.2mg/mlリゾチームの組成の緩
衝液60mlに懸濁した。37℃で１時間保温した後、超音波
処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（9,000×
ｇ、10分）により菌体残さを除去した。このように得ら
れた上清画分を酵素標品とした。酵素標品におけるマル
トデキストリンホスホリラーゼ活性を対照菌（pTrc99A
を保持する大腸菌JM109菌）と共に下記表３に示す。

なお、本発明におけるマルトデキストリンホスホリラ
ーゼ活性の単位（ユニット）は、以下の方法で測定、算
出したものである。すなわち、5mM塩化マグネシウム、6
mM UTP、0.5％デキストリン（W/V）、1U/ml基質のUDPG
ピロホスホリラーゼを含有する50mMりん酸カリウム緩衝
液（pH7.0）にマルトデキストリンホスホリラーゼ酵素
標品を添加して30℃で保温することで反応を行い、反応
量と等量の70％エタノールを添加することにより酵素を
失活させ、HPLCにより反応液中のUDPGを定量し、30℃で
１分間に１μmoleのUDPGを生成する活性を１単位（ユニ
ット）とした。

（３）UDPG−UTP酵母反応液へのUDPグルコースピロホス
ホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼおよび
デキストリン添加によるUDPGの合成 実施例１の（３）で調製したUDPG−UTP液100mlに終濃
度２％（W/V）となるようにデキストリン（Difco社製）
を添加し、さらに0.5ユニット/mlとなるようにUDPグル
コースピロホスホリラーゼ及びマルトデキストリンホス
ホリラーゼ標品を添加し、30℃で30時間反応させた。反
応液中のUDPG濃度をHPLCで分析したところ、31.0mMのUD
PGの生成が確認された。

実施例4:GDPマンノースの合成 （１）大腸菌のGDPマンノースピロホスホリラーゼ遺伝
子のクローニング 大腸菌ATCC4157の染色体DNAを斉藤と三浦の方法（Bio
chim.Biophys.Acta.,72,619（1963））で調製した。こ
のDNAをテンペレートとして、以下に示す２種類のプラ
イマーDNAを常法に従って合成し、PCR法により大腸菌GD
Pマンノースピロホスホリラーゼ（manC）遺伝子（Gordo
n Stevenson et al.,J.Bacteriol.,178,4885（1996））
を増幅した。

PCRによるmanC遺伝子の増幅は、50mM塩化カリウム、1
0mMトリス塩酸（pH 8.3）、1.5mM塩化マグネシウム、
0.001％ゼラチン、テンペレートDNA0.1μｇ、プライマ
ーDNA（Ｅ）（Ｆ）各々0.2μＭ、AmpliTaqDNAポリメラ
ーゼ2.5ユニットの組成の反応液100μ）をDNA Therma
l Cycler（Perkin−Elmer Cetus Instrument社製）を用
いて、熱変性（94℃、１分）、アニーリング（55℃、２
分）、ポリメライゼーション（72℃、３分）のステップ
を25回繰り返すことにより行った。

遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロロホルム
（1:1）混合液で処理し、水溶性画分に２倍容のエタノ
ールを添加しDNAを沈殿させた。沈殿回収したDNAを文献
（Molecular cloning、前述）の方法に従ってアガロー
スゲル電気泳動により分離し、1.8kb相当のDNA断片を精
製した。該DNAを制限酵素EcoR Iで切断し、同じく制限
酵素EcoR Iで消火したプラスミドpUC18（玉酒造（株）
より入手）とT4DNAリガーゼを用いて連結した。連結反
応液を用いて大腸菌JM109菌を形質転換し、得られたア
ンピシリン耐性質転換体よりプラスミドpUC18−manCを
単離した。pUC18−manCは、pUC18のlacプロモーター下
流のEcoR I切断部位に大腸菌manC遺伝子を含有するEcoR
I DNA断片が挿入されたものである。

（２）大腸菌GDPマンノースピロホスホリラーゼの調製 プラスミドpUC18−manCを保持する大腸菌JM109菌を、
100mg/Lのアンピシリンを含有する２×YT培地300mlに植
菌し、37℃で振とう培養した。４×10⁸菌/mlに達した時
点で、培養液に終濃度1mMになるようにIPTGを添加し、
さらに37℃で５時間振とう培養を続けた。

培養終了後、遠心分離（9,000×g,10分）により菌体
を回収し、50mMトリス塩酸（pH7.5）、5mM EDTA、0.1
％トラインＸ−100、0.2mg/mlリゾチームの組成の緩衝
液60mlに懸濁した。37℃で１時間保温した後、超音波処
理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（20,000×
ｇ、10分）により菌体残渣を除去した。このように得ら
れた上清画分を酵素標品とした。酵素標品におけるGDP
マンノースピロホスホリラーゼ活性を対照菌（pUC18を
保持する大腸菌JM109菌）と共に下記表４に示す。

なお、GDPマンノースピロホスホリラーゼ活性の単位
（ユニット）は、以下に示す方法で測定、算出した。す
なわち、1mM塩化マグネシウム、5mM GTP、5mM マンノ
ース−１−Ｐを含有する50mMリン酸カリウム緩衝液（pH
7.6）に酵素標品を添加して37℃で保温して反応を行
い、100℃、５分間の熱処理により酵素を失活させた
後、HPLC法により反応液中のGDPマンノースを定量し、3
7℃で１分間に１μmoleのGDPマンノースを生成活性を１
単位（ユニット）とした。

（３）乾燥パン酵母を用いたGDPマンノース−GTP液の調
製 40mM GMP、200mM グルコース、200mM リン酸カリ
ウム（pH8.0）、10mM 塩化マグネシウムの組成の反応
液20mlを100ml容ビーカーに調製し、これに2gの乾燥パ
ン酵母（オリエンタル酵母工業株式会社）を懸濁し、20
℃で７時間撹拌反応させた。反応終了後、反応液を100
℃、５分間処理し、遠心分離（2,000×ｇ、10分間）に
より酵母菌体を除去した。回収した上清画分をHPLCで分
析したところ、11.2mM GDPマンノース、10.1mM GTPの
生成が確認された。

（４）GDPマンノース−GTP液へのGDPマンノースピロホ
スホリラーゼ及びマンノース−１−Ｐ添加によるGDPマ
ンノースの合成 上述のGDPマンノース−GTP液200μに終濃度20mMと
なるようにマンノース−１−Ｐを添加し、さらに0.1ユ
ニット/ml GDPマンノースピロホスホリラーゼとなるよ
うに上記酵素標品を添加し、水で全量を400μとした
上で37℃で８時間反応させた。反応液中のGDPマンノー
ス濃度をHPLCで分析したところ、10.5mMのGDPマンノー
スの生成が確認された。

実施例５ 実施例４の（３）および（４）と同じ方法にてGDPマ
ンノースを合成した。ただし、添加するGDPマンノース
ピロホスホリラーゼは０、0.025、0.05、0.1ユニットの
酵素単位の酵素を用いて行った。GDPマンノースの経時
的な生成量を図２に示す。

産業上の利用可能性 本発明によれば、従来の酵母菌体法では生産性の低か
った各種糖ヌクレオチドを効率的よく製造することがで
きる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 19/00 - 19/64

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵母菌体を用いてUMPからUDPグルコースを
   製造する方法において、酵母としてパン酵母を用い、反
   応系にUDPグルコースピロホスホリラーゼとグルコース
   −１−リン酸（Ｇ−１−Ｐ）とを共存させる方法であっ
   て、反応系に添加したUMPからUTPの生産が最大になった
   ところでパン酵母由来の酵素を失活させ、次いで当該反
   応系にUDPグルコースピロホスホリラーゼとグルコース
   −１−リン酸を添加して酵素反応を行わせることを特徴
   とするUDPグルコースの製造法。
2. 【請求項２】グルコース−１−リン酸の代わりにグルコ
   ース−１−リン酸生成系を共存させる、請求項１記載の
   製造法。
3. 【請求項３】グルコース−１−リン酸生成系がホスホリ
   ラーゼを用いたものである、請求項２記載の製造法。
4. 【請求項４】グルコース−１−リン酸生成系がショ糖と
   ショ糖ホスホリラーゼの組み合わせによるＧ−１−Ｐ生
   成系、グリコーゲンとグリコーゲンホスホリラーゼの組
   み合わせによるＧ−１−Ｐ生成系またはデキストリンと
   マルトデキストリンホスホリラーゼの組み合わせによる
   Ｇ−１−Ｐ生成系である、請求項２又は３記載の製造
   法。