JP3280969B2 - 可視光および紫外光の共焦点結像装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、全体的には共焦点顕微鏡法に関し、一層詳
しくは可視光および紫外光に使用できる共焦点走査式顕
微鏡に関する。

生物学調査や医学的診断では蛍光顕微鏡法が広く用い
られている。この蛍光顕微鏡法では、細胞あるいは組織
の特定の構成部を可視化したり、これら構成部の空間的
組織を決めるには選択が必要である。共焦点顕微鏡法
は、照明および検出をサンプル内のただ１つの点に制限
して用いる。これは、代表的には、対象物およびコンデ
ンサの光路内に空間フィルタ（通常はピンホール）を用
いることによって達成され、視野内のすべての点を順次
に走査することによって完全な像が構成される。

或る特別な共焦点顕微鏡が米国特許第5,032,720号に
示されている（この米国特許の開示内容を参考資料とし
てここに援用する）。この顕微鏡は、サンプル上に小さ
い（好ましくは回析制限した）スポットを生じさせ、こ
のスポットをラスタ・パターンでサンプル上を走査し、
スポットの領域から発する光を集めてこの光の強度に比
例した電気信号を発生する。この電気信号は、モニタ上
に可視表示を行えるコンピュータに送られる。

ソース（または検出器）とサンプルの間の光学縦例
は、スポットを形成する合焦光学素子と、２つの直交方
向へビームを走査してサンプル上にラスタ・パターンを
形成する走査要素とからなる。サンプルから発する光は
戻り経路に沿って検出器へ通り、ここで電気信号が発生
する。アイリス絞りの形をしたアパーチャが検出器の前
方に配置してあり、ビームスポットから空間的に変位し
た点から発した光を阻止するようになっている。

普通の顕微鏡で用いるための共焦点顕微鏡アクセッサ
リが、カルフォルニア州ハーキュリーズ市のBio−Rad L
aboratories,Inc.が商品番号MRC−500、MRC−600として
市販されている。こうしてできた共焦点顕微鏡は可視励
起光線を発生し、可視範囲内の蛍光を検知する。

発明の概要 本発明は紫外励起を行うことのできる走査式共焦点顕
微鏡を提供する。光学縦列が、紫外波長および可視波長
を含む波長範囲にわたる走査エラー、合焦エラーを実質
的に訂正する。

簡単に言えば、本発明による共焦点走査顕微鏡は、市
街励起源と、紫外線透過式走査・結像光学素子とを包含
する。紫外光は、順方向経路に沿って送られ、サンプル
面における小スポットとして合焦する。スポットの領域
から発する光は戻り経路に沿って送られ、検出される。
スポットから空間的に変位した点から発する光は検出器
アパーチャによって阻止される。ビームスポットはサン
プル上をラスタ・パターンで走査される。戻り光が可視
の場合（たとえば、可視蛍光を検出したい場合）には、
光学縦列は可視光、紫外光の両方にとって共焦点となっ
ていなければならない。このことは、また、同時に紫外
励起、可視励起を行うのを可能とする。

特別の実施例では、光学縦列の共通経路部分にあるレ
ンズが色誘因の走査エラーを補正すると共に、余分なレ
ンズを順方向紫外線経路内に設け、縦方向色収差（可視
光／紫外光）による合焦エラーを補正する。走査エラー
と合焦エラーの補正を分けることにより、縦方向収差の
程度の変わる異なった対物レンズに順応するのが容易と
なる。

本発明の特徴および利点のさらなる理解は本明細書の
以下の部分および図面を参照することによって実現でき
る。

図面の簡単な説明 第1A図および第1B図は、従来の共焦点顕微鏡の光学的
構成を簡単に示す図である。

第1C図は、適切な共焦点動作を説明する光学的スケッ
チである。

第２図は、本発明の倒立顕微鏡の実施例を示す簡略光
学構成図である。

第３図および第４図は、倒立顕微鏡実施例のファース
トジェネレエション接眼レンズ、アダプタレンズの光学
的構成を示す図である。

第５図は、本発明の直立顕微鏡実施例のファーストジ
ェネレエション接眼レンズの光学的構成図である。

第６図は、倒立顕微鏡実施例のためのセカンドジェネ
レーション6.25x接眼レンズの光学的構成図である。

第7A図および第7B図は、倒立顕微鏡実施例のためのセ
カンドジェネレーション8x接眼レンズ、アダプタレンズ
の光学的構成図である。

第８図は、直立顕微鏡実施例のためのセカンドジェネ
レーション8x接眼レンズの光学的構成図である。

第9A−9E図は、合焦エラーの効果および補正を説明す
る光学的スケッチである。

第10A−10C図は、走査エラーの効果および補正を説明
する光学的スケッチである。

第11図は、像面湾曲の効果および補正を説明するプロ
ットを示す図である。

第12A−12C図は、像面湾曲エラーと倍率エラーの効果
および補正を説明するプロットを示す図である。

第13A図および第13B図は、側面を横切る強度のプロッ
トを示す図である。

特殊な実施例の説明 従来の可視共焦点顕微鏡 第1A図は、従来の走査式共焦点顕微鏡10の簡略光学構
成図である。ここに説明する特別の従来の共焦点顕微鏡
と本発明に従って改造したような共焦点顕微鏡は、普通
の顕微鏡と組み合わせて用いられるBio−Rad MRC−600
アクセッサリである。ここで用いる「顕微鏡」なる用語
は、代表的には、この組み合わせから得た走査式共焦点
顕微鏡を意味する。

顕微鏡は、サンプル面15の点に可視光線を合焦し、サ
ンプル面のこの点から発する光（反射光および蛍光）を
検出するように作動する。この目的のために、顕微鏡
は、光学縦列を通して順方向経路に沿って光線が送られ
るアルゴンイオン・レーザのような可視光源20を包含す
る。光学縦列は、ビームスプリッタ22、走査用光学素子
25、接眼レンズ27、アダプタレンズ30、無限補正レンズ
22（テロンレンズと呼ばれる）および対物レンズ35から
なる。ビームスプリッタ22は、可視励起光線は反射する
が、サンプルからの蛍光の波長特性範囲内の光は透過さ
せるダイクロイック材料で作る。対物レンズおよび接眼
レンズは、サンプル面に小スポットを形成するように光
線を合焦する。

スポット領域から発した光は、戻り経路に沿ってビー
ムスプリッタ22まで移動し、ここから検出器37a、たと
えば、増倍型光電管（PMT）に行き、検出される。アパ
ーチャ40a、好ましくは、アイリス絞り（可変直径、0.7
−7.0mm）が検出器の前方に配置してある。ダイクロイ
ック・ビームスプリッタ42は、１つの波長範囲内の光を
検出器37aへ送ると共にそれと異なった波長範囲内の光
を第２検出器37bおよび対応したアパーチャ40bに送るよ
うに戻り専用経路内に配置してもよい。

走査光学素子組立体から検出器までの光路は、多数の
平面ステアリング・ミラーによって折り返されて比較的
長い経路長さを得ている。走査光学素子は、一対のガル
バノメータ駆動平面鏡と、それらの間のリレー光学素
子、好ましくは、一対の対面する凹面鏡とからなる。第
１の走査鏡は、図の平面に対して直角の平面で光線を走
査し、第２走査鏡は、図の平面で光線を走査する。図に
は、第２走査鏡のみが示してある。

最後の走査鏡は、接眼レンズの焦点面付近に設置して
あり、その結果、光線は、走査角と無関係に光軸に対し
てほぼ平行に接眼レンズからアダプタレンズまで移動す
る。平行レーザ光線は接眼レンズの後方焦点面に合焦
し、顕微鏡は、アダプタレンズの前方焦点面が接眼レン
ズの後方焦点面と一致するように共焦点アクセッサリに
対して設置してある。

図示した実施例は倒立顕微鏡用のものであり、ここで
は、接眼レンズと対物レンズの間の光路は、接眼レンズ
および対物レンズが通常に設計されたものの光路よりも
長くなっている。特別な詳細図が第1B図に示してある。
たいていの対物レンズは、あたかも160mm離れた点状光
源からくるかのように入射光を受け取るべく補正され
る。テロンレズ32が対物レンズと協働し、これら２つの
組み合わせが入射平行光線を補正する（すなわち、無限
補正する）。対応する要領で、アダプタレンズ（基本的
には160mm色消しレンズ）が接眼レンズと協働して平行
光線を与える。こうして、アダプタレンズ30およびテロ
ンレンズ32は或る種のリレー光学要素として作動する。
直立顕微鏡実施例（図示せず）では、アダプタレンズお
よびテロンレンズは存在しない。

上手側の素子（接眼レンズおよびあるとすればアダプ
タレンズ）を１つの単位として考え、下手側の素子（あ
るとしてテロンレンズおよび対物レンズ）を１つの単位
として考えると時には便利である。接眼レンズ、長い戻
り経路および平行戻り光線を使用することにより、ピン
ホール式空間フィルタなしに共焦点動作を達成すること
ができる。

説明の目的のために、光路を多数のセグメントに分割
すると便利である。ここで用いる用語「順方向専用」
は、光源からビームスプリッタ22までの経路セグメント
であって、励起光のみが移動する経路セグメントを言
う。「共通経路セグメント」なる用語は、ビームスプリ
ッタとサンプル面の間で、光が両方向に移動する光を言
う。「戻り専用」なる用語は、ビームスプリッタと検出
器の間で、サンプルから戻る光のみが移動する経路セグ
メントを言う。或るレンズの前面と言った場合、これ
は、順方向経路上の光が最初に遭遇する表面を意味し、
後面と言った場合には、戻り経路上の光が最初に遭遇す
る表面を意味する。

共焦点動作 第1C図は、サンプル平面15のビームスポット領域から
発する光がいかにして戻り経路に沿って光学系を通り抜
け、検出器に移動するかを示している。図は、また、サ
ンプル面からそれぞれ上手側、下手側に変位した一対の
平面15u、15dにおける点から発する光がいかにしてアパ
ーチャによって阻止されるかを示している。サンプル面
15は実線で描いてあり、平面15の点から発する光が実線
で示してある。平面15u、15dは２種類の破線で描いてあ
り、これらお平面から出る光がそれ相当に描いてある。
ここでわかるように、下手側の平面15dから発する光は
レンズによって再合焦し、発散し、上手側の平面15uか
ら発する光はレンズを出るきに発散する。いずれにして
も、光線はアパーチャ平面に達するまでに大きく発散
し、アパーチャによってかなり阻止される。

上記説明はやや修飾を受けている。サンプル面からの
光が光学素子によって平行にされる程度まで、ほんの少
し下手側（平面15dほど下手側に離れていない）の平面
から発する光はアパーチャ内へ実際に合焦される。これ
が意味することは、検出器に達した光が励起光と共焦点
でない小成分を含んでいるということである。この影響
は、戻り専用経路内に長レンズ（たとえば、100mm）を
設置し、平行（共焦点）光線をアパーチャ内へ合焦し、
やや下手側からの光をアパーチャに達したときに発散さ
せるようにすることによって回避することができる。こ
れを以下により詳しく説明する。

紫外線共焦点顕微鏡実施例 第２図は、本発明に従って改造して可視光、紫外光の
両方を励起に用いることができるようにした共焦点顕微
鏡の簡略光学的構成図である。第1A図のものと同じであ
る素子は同じ参照符号が付けてあり、改造した対応する
素子はダッシュ記号付きの参照符号で示してあり、第1A
図に対応する部分がない素子は異なった参照符号で示し
てある。上述したように、倒立顕微鏡実施例が示してあ
る。

従来の可視顕微鏡に関連して説明したような共焦点動
作は、当然、可視励起を行おうとしているときほど、紫
外線励起の領域に敷衍して説明していない。第１の明ら
かな問題は、接眼レンズ27が紫外光を透過させず、アダ
プタレンズ30が若干透過させるということにある。倒
立、直立両方の顕微鏡実施例の設計上の詳細を以下に説
明し、適宜図示する。

紫外線レーザ55は紫外線ビームを発し、これはビーム
コンバイナ57（可視光／紫外光ダイクロイック反射器）
によって可視光レーザ20からの可視光線と組み合わされ
る。紫外線レーザ55とビームコンバイナ57の間には、合
焦用紫外線（5x）ビームエキスパンダ60、ステアリング
・ミラー62および紫外線補正レンズ65が挿設してある。
ビームスプリッタ22は、それが紫外光を反射しない程度
まで改造し、可視レーザ光線および紫外線レーザ光線を
共に反射するが、可視蛍光を透過させるようにしなけれ
ばならない。顕微鏡は、さらに、後述するように特別に
設計した接眼レンズ27′およびアダプタレンズ30′を設
けることによってさらに改造される。ビームスプリッタ
42の特性は分離しようとしている可視波長に応じて選ぶ
とよい。

合焦用紫外線ビームエキスパンダ60は、最大の解像度
を得るに充分に対物レンズの後方アパーチャを満たすこ
とのできる倍率を与える。共焦点顕微鏡を使用すること
によって、スポット間の最短検出可能距離を普通の顕微
鏡によって検出できる最短距離の0.707倍まで縮めるこ
とができる。紫外線励起を用いることによって、より短
い波長による可視励起で得ることのできる解像度に比し
て解像度を改良できる。

可視光線エキスパンダ67が可視光線レーザ20とビーム
コンバイナ57の間に配置してあると好ましい。この可視
光線エキスパンダ67は、1.5x−2xの倍率を提供し、可視
励起光線で対物レンズの後方アパーチャを満たすことを
可能とする。これは、紫外線接眼レンズ27′が可視光線
接眼レンズ27よりも倍率が低い（約6.4x対8x）ので必要
である。倍率の低下に鑑みて、最小アパーチャ直径を0.
7mmから0.5mmまで減らすことを考慮している。

紫外線補正レンズ65は、好ましくは、500mmレンズで
あり、紫外線励起光を接眼レンズの前方の点に合焦し、
ここからこの光が発散する。上述したように、可視励起
光は接眼レンズに達するまでほぼ平行化される。紫外光
は、下手側のレンズ素子における縦方向色収差効果を補
正するように発散させられる。以下により詳しく説明す
るように、色走査効果は接眼レンズおよびアダプタレン
ズにおいて補正しなければならず、この補正は縦方向色
収差も補正するのを難しくする傾向がある。

光軸に沿った紫外線補正レンズの位置は、単独である
いはビームエキスパンダの再合焦と一緒に調節して、対
物レンズの後方アパーチャの適切な充満状態を維持しな
がら種々の対物レンズにおける種々の縦方向色収差量を
調節することができる。これは、対物レンズ色収差が紫
外線において有為に変化し、後方アパーチャ寸法が対物
レンズ毎に有意に変わるので、比較的必要なオプション
である。

ファーストジェネレエション・レンズ設計 第３、４図は、倒立顕微鏡実施例のための接眼レンズ
27′および紫外線アダプタレンズ30′のファーストジェ
ネレエション設計の光学的構成図である。これらのレン
ズのための幾何学的および光学的パラメータは表１、２
に示してある。レーザ光線の方向応に沿って表面に番号
が振ってあり、特に指摘しないかぎり寸法はミリメート
ル単位である。色補正は以下の設計波長によるものであ
る:330nm、464nm、560nmおよび656nmである。レンズ設
計は、カリフォルニア州サンホセ市のSCIOPT Enterpris
esから入手できるOPTEC光学系設計分析ソフトウェア（P
Cバージョン）を用いて行った。

第５図は、直立顕微鏡実施例用の接眼レンズ（27″で
示す）のためのファーストジェネレエション設計の光学
的構成図である。

接眼レンズについての設計基準（直立実施例について
のみあるいは倒立実施例のアダプタレンズとの組み合せ
について）は次のように要約できる。接眼レンズ（また
は組み合わせ）は、両方向へ移動する光についての各設
計波長の標準単色収差（球面球差、コマ、非点収差、ひ
ずみ）を良く補正する。上述したように、紫外線焦点は
合焦レンズ65および合焦用ビームエキスパンダ60によっ
て補正されるが、接眼レンズ（または組み合わせ）は可
視波長についての縦方向色収差について補正される。し
かしながら、接眼レンズ（または組み合わせ）は、以下
に説明するように、走査エラーを最小限に抑えるべく色
補正される。像面湾曲は最小限に抑えられ、無限遠にあ
る可視対象物および接眼レンズの前面から195mmのとこ
ろに位置する有限紫外線対象物に対して種々の色に合わ
される。前方焦点距離は充分に長くて、調整中に接眼レ
ンズが走査ミラーに触れるのを防ぐことができる。

この特別なレンズ設計は多数のより世俗的な制限も受
けた。たとえば、ガラスは高品質レンズに製作すること
ができ、しかも比較的容易に製作できなければならなか
った。さらに、レンズは、通常の実験室温度・湿度条件
に耐え、かつ、紫外線レーザおよび可視光線レーザへの
露光に耐えなければならなかった。紫外光を通し、通常
の実験室条件の下でかなりの耐久性があり、長時間の紫
外光露出（200mwのパワーの下で）で曇らず、正当に達
成できるレンズ表面湾曲について色補正を行うに充分に
異なったばらつき特性を持つという理由で、石英ガラ
ス、弗化カルシウムがレンズ材料として選ばれた。

ファーストジェネレエション設計では、弗化カルシウ
ムのレンズ素子はすべて同じ形状であり、所望の品質
（湾曲および厚みについて１％公差）で、ブァーモント
州タウンゼンド市のJanos Technology,Inc.から素材と
して入手可能である。しかしながら、弗化カルシウムの
レンズ素子についての対称性制限を緩和し、注文仕様で
研削することによって単色収差の改善を（或る程度のコ
ストをかけて）達成することができると考えられてい
た。これは一連のセカンドジェネレーション設計で行わ
れた。

セカンドジェネレーション・レンズ設計 多数のセカンドジェネレーション設計を行ったが、こ
れらはファーストジェネレエション設計との次のような
差異を特徴とする。まず、これらのセカンドジェネレー
ション設計は、弗化カルシウム素子が任意特定の形状で
あるという制限を受けない。次に、接眼レンズの最後の
２つの素子の順序が逆にされ、弗化カルシウム素子（幾
分湿度に敏感である）のいずれもが大気に露出すること
がなくなる。この方向に沿って、アダプタレンズは余分
なシリカ素子を備え、色収差を減らし、弗化カルシウム
素子を密封する。これらのセカンドジェネレーション設
計は、倒立顕微鏡の場合には6.25x、8x接眼レンズおよ
びアダプタ（共に同じアダプタ）を包含し、直立顕微鏡
の場合には8x接眼レンズを包含する。

第６図は倒立顕微鏡実施例のための6.25x接眼レンズ
の光学的構成図である。このレンズの幾何学的、光学的
パラメータは表４に記載してある。表面１は走査鏡の位
置および接眼レンズの前方焦点面にある。表面14は、接
眼レンズが光線を合焦する平面、すなわち、アダプタレ
ンズの前方焦点面（表４には含まれていないが、8x接眼
レンズのためのアダプタレンズと同じパラメータを持
つ）に対応する平面にある。１、14のような表面は空気
中の平面であり、便宜上10000mmの半径を持つものとす
る。

第7A、7B図は、倒立顕微鏡実施例のための8x接眼レン
ズ、アダプタレンズの光学的構成図である。これらのレ
ンズの幾何学的および顕微鏡のパラメータは表５に記載
してある。表面１は、走査鏡の位置および接眼レンズの
前方焦点面にある。表面14は、接眼レンズが光線を合焦
する平面、すなわち、アダプタレンズの前方焦点面に対
応する平面にある。表面21は対物レンズの後方アパーチ
ャ付近に位置する。

第８図は、直立顕微鏡実施例のための8x接眼レンズの
光学的構成図である。このレンズの幾何学的および顕微
鏡のパラメータは表６に記載してある。表面１は走査鏡
の位置および接眼レンズの前方焦点面にある。表面14は
接眼レンズが光線を合焦する平面にある。表面15は対物
レンズの後方アパーチャ付近に位置する。

合焦エラー 第9A−9E図は、縦方向色収差によって生じる合焦エラ
ーおよびこの問題を処理する方法を示す光学的スケッチ
である。

第9A図は、レンズにおける縦方向色収差がどのように
して合焦エラーを生じさせるかを示している。これは倒
立顕微鏡実施例に関連して図示してあるが、問題および
解決策は直立顕微鏡実施例にとっても同じである。一層
詳しくは、入射平行紫外線励起光線は、入射可視光線が
合焦するであろう平面15から上手側に変位した平面15u
における焦点に入射するように破線で示してある。平面
15における点から発散する可視光はこれらのレンズによ
って平行にされてから検出器に到達する。しかしなが
ら、平面15u（紫外線が合焦する平面）から発する可視
光はその戻りにおいてレンズによって平行にされず、検
出器に到達する前に発散する。上述したように、合焦用
ビームエキスパンダ60および紫外線補正レンズ65を使用
して縦方向色収差を補正すると便利である。

第9B図は、紫外線補正衛レンズ65がどのようにして紫
外線励起光線（破線で示す）を同じ平面15（ここから発
した実線で示す可視光がレンズによって平行にされ、検
出される）に合焦させるかを示している。これは、接眼
レンズ27′の前の焦点（紫外線がレンズと遭遇するとき
に発散する）まで紫外線を移動させることによって達成
される。これらのレンズは紫外線についての縦方向色収
差を補正せず、紫外光は平面15に合焦する。ここで、図
示の可視光が可視励起光線に等しく一致する可能性があ
るということに注目されたい。

第9C−9E図は、合焦ビームエキスパンダ60および紫外
線補正レンズ65をどのように調節して紫外線焦点の位置
を変え、ビーム倍率を大きくして対物レンズの後方アパ
ーチャの充満度を高めるかを示している。第9C図は、ビ
ームエキスパンダ60が広がって平行になった光線を与え
る。第9D図は、発散する光線を与えるようにビームエキ
スパンダをどのように調節すれば、紫外線焦点の位置を
変えることができるのかを示している。第9E図は、より
強いレンズを用いて紫外線焦点を有効位置に変位させ得
る方法を示している。

走査エラー 第10A−10C図は、色効果によって生じる走査エラーお
よびこの問題を処理する方法を示す光学的スケッチであ
る。

第10A図は、レンズにおける色効果が共焦点走査にど
のように影響するかを示している。この問題は、縦方向
（合焦）エラーとは別のものであり、上述したように考
慮したものと仮定する。これは倒立顕微鏡実施例に関連
して図示してあるが、問題は直立顕微鏡実施例にとって
も同じである。共焦点動作の場合、紫外線励起（破線で
示してある）から生じる戻り可視光（実線で示してあ
る）は、走査光学素子に遭遇したときに、走査光学素子
を出たときに移動した励起光と同じ経路に沿って移動し
なければならない。図に示したときに、この条件はレン
ズにおける色効果により大きな走査角で受け入れられ、
可視光は、最大紫外線励起の点から側方に変位した点か
ら集められる。この種の走査エラーは、像面を横切って
著しい強度低下を生じさせる。

第10B図は、倒立顕微鏡の場合の走査エラーを補正す
る方法を示す光学的すけっちである。これは、対象物点
80からの紫外光および可視光を接眼レンズ27′およびア
ダプタレンズ30′によって色収差無しの結像点82に合焦
させることによって達成される。この場合、対象物点は
最後の走査鏡の位置に対応し、結像点はテロン−対物レ
ンズの組み合わせの中心付近に点に対応する。ファース
トジェネレエション設計では、対象物点は接眼レンズの
前面から約18mmであり、色収差無し結像点はアダプタレ
ンズの後面から167.3mmである。セカンドジェネレーシ
ョン6.25x設計では、対応する距離は約13.5mm、148.2mm
である。セカンドジェネレーション8x設計では、対応す
る距離は約21.2mm、151.5mmである。

ここで、この色補正が縦方向色収差の補正と完全に適
合するものではなく、縦方向色収差が上述したように紫
外線補正レンズおよび合焦用ビームエキスパンダによっ
て処理されるということに注意されたい。この最適化を
実施する方法は次の通りである。接眼レンズは、（ａ）
逆方向における可視色および平行紫外光が同じ点に合焦
し、（ｂ）順方向における可視平行光のすべての色が大
小の走査角について同じ平面に合焦するように補正され
る。アダプタレンスは、（ａ）順方向における平行な紫
外光、可視光が結像点82に色収差無しに合焦し、（ｂ）
アダプタレンズに向かって逆方向に移動する平行可視光
が大小の走査角について共通の前方焦点面（アダプタレ
ンズと接眼レンズの間に位置する）に合焦するように最
適化される。さらに、この光学系は可視光のすべての色
についてほぼ色収差無しである。

第10C図は、直立顕微鏡について走査エラーを補正す
る方法を示す光学的スケッチである。これは、対象物点
85からの紫外光、可視光を27″で示す接眼レンズによっ
て結像点87に合焦させることによって達成される。この
場合、対象物点は最後の走査鏡の位置に対応し、結像点
は対物レンズの中心付近の点に対応する。ファーストジ
ェネレエション設計では、対象物点は接眼レンズの前面
から32mmであり、色収差無し結像点は接眼レンズの後面
から178.25mmである。セカンドジェネレーション8x設計
では、対応する距離は約27.3mm、160mmである。

任意所与の設計において、点80（または85）から発す
る種々の波長は同じ点82（または87）に正確に合焦する
ことはない。この制限は最適化過程において処理しなけ
ればならない多くの制限のうちの１つだからである。こ
うして、基準波長に対して、各所定の波長は、所定波長
の焦点と基準波長の焦点の間の縦方向の距離を表わす色
走査焦点エラー（Δｆ）によって特徴付けられる。

表７は、４つの接眼レンズの494nmの位置（０と定
義）に対して330nm、656nmの場合の色走査焦点エラー
（Δｆ）を示している。比較の目的で用いられた第１レ
ンズ（接眼レンズ＃１）は、単色収差について最適化さ
れてはいるが、走査色収差については最適化されていな
い４素子石英ガラス接眼レンズである。他の３つは6.5x
ファーストジェネレエション接眼レンズと6.25x、8xセ
カンドジェネレーション接眼レンズであり、これらはす
べて倒立顕微鏡用である。

各接眼レンズ設計をOPTECプログラムで160mmレンズ設
計と組み合わせ、種々の波長の光線を光学素子を通して
走査線に沿ってトレースした。色走査焦点エラー（Δ
ｆ）は494nmの基準波長を用いて決定した。Δｆは未補
正の石英ガラス接眼レンズの場合に紫外線波長で１イン
チより大きく、本発明に従って補正した接眼レンズの場
合に数ミリメートルまで低下した。表８が6.25x接眼レ
ンズの場合の付加的な波長のΔｆを示している。

最大解像度について、8x接眼レンズが6x接眼レンズの
要求する色補正よりも25％低い色補正を必要とすること
を薄肉レンズ等式が示している。しかしながら、色エラ
ーはより長い焦点距離の6.5x接眼レンズを設計すること
によって半分にした場合より大きい（表８の接眼レンズ
＃２、＃３を比較）。8x設計は6xと同じ色補正を達成す
るにはより強い表面湾曲を必要とし、単色収差を許容で
きないほど大きい値まで増大させる。したがって、8x接
眼レンズの場合には色補正は必ず減らされた。接眼レン
ズ＃３（6.5x）の色収差は最小量であったが、かなりの
ひずみによってフレアが生じ、接眼レンズ＃４（6.25
x）を作るために再設計した。接眼レンズ＃４の場合、
色補正は単色補正を最適化するように妥協した。

色走査焦点エラーの補正は、倒立顕微鏡実施例でも、
主として接眼レンズにおいて達成されるように思える。
実際、いくつかの試験で、紫外線も透過させる市販の可
視色消しレンズがファーストジェネレエションのアダプ
タレンズよりも幾分良好に作動し、ほぼセカンドジェネ
レーションのアダプタレンズと同様に作動することを示
した。

像面湾曲および倍率エラー 像面湾曲は補正するのが最も難しい収差の１つであ
り、或る程度の残量は許容することが多い。たとえば、
すべての波長が同じ程度の像面湾曲を受けたと仮定する
と、サンプル面が平面とならず、やや湾曲した面とな
る。基本的には、このことは問題とはならない。やや湾
曲した部分は一般的に完全に平らな面と同じ有用な情報
を与えるからである。

しかしながら、すべての波長が同じ像面湾曲度を受け
ないときに現実的な問題が生じる。この場合、像面の中
心から外れた点について、紫外線励起は可視蛍光と共焦
点となることがない。むしろ、検出器に達する可視光が
合焦ビームスポットから離れた点から発する可視光とな
り、かなり強度の低いものとなる。これは縦方向合焦エ
ラーが補正されない場合に生じる問題と同じであるが、
ただしその結果は像面を横切って均一とはならず、像面
の中心から離れるにつれて増大する。

したがって、この問題は、或る程度の像面湾曲を許容
し、紫外波長、可視波長について同じ形状となる像面を
優先的に達成することによって処理される。

第11図は、接眼レンズ＃１の像面湾曲の計算プロット
（上部３曲線）と接眼レンズ＃３の像面湾曲の計算プロ
ット（下部３曲線）を示しており、これら接眼レンズは
それぞれ理論160mmアダプタレンズと理論対物レンズと
組み合わされている。ここには、対物レンズ単独のプロ
ットも示してある（３本のほとんど一致した曲線）。サ
ンプル面での像面湾曲は、理論肉厚レンズのもでる（OP
TECプログラムを用いる）を通して増分走査角毎に光線
をトレースすることによって計算した。走査角が増分す
るにつれて、対物レンズ焦点の二乗平均位置を軸線方
向、半径方向において記録し、プロットした。全光学縦
列を設計するために、理論的に無限補正した10x対物レ
ンズ（可視光の場合には色消しであり、紫外光の場合に
は或る程度の残留色収差がある）を弗化カルシウムと石
英ガラスから作った。同様の色特性を持つ160mmレンズ
も作った。３種の波長、すなわち、赤（656nm）、青（4
88nm）および紫外（330nm）で光学系を通る光線をとれ
えすした。弗化カルシウム／石英ガラス接眼レンズの色
収差は、無補正の石英ガラス接眼レンズで生じるエラー
に比べて、側方倍率エラー（Δｙ）および像面湾曲エラ
ー（Δｚ）を劇的に低下させた。

第12A−12C図は、100x対物レンズ、40x対物レンズお
よび10x対物レンズの顕微鏡についての視野の縁付近で
の側面湾曲エラー、倍率エラーを計算して得たプロット
を示している。垂直軸線は光線方向に沿ったスポットの
位置を表わしている。水平軸線はスポットの横方向位置
を表わしている。３列のプラス記号は４素子石英ガラス
対物レンズの場合の赤（上部）、青および紫外（下部）
について行った測定の結果を表わしている。或る特定の
走査角で３つの波長のそれぞれについての測定値をグル
ープ分けしてある。点間の垂直方向距離は、その角での
波長間の像面湾曲エラーを表わしており、水平方向の距
離は倍率エラーを表わしている。

４列のひし形は、紫外（上部）、赤、青および緑（下
方にグループ分けしてある）について補正６素子6.5x接
眼レンズで行った測定の結果を表わしている。ここでわ
かるように、補正接眼レンズの場合、像面湾曲エラーお
よび倍率エラーはかなり小さい。倍率エラーは、100x対
物レンズの場合、像面湾曲エラーを左右するが、10x対
物レンズの場合にはその逆となる。これらのエラーは40
x対物レンズのものに匹敵する。

全体的な強度分布 40Xオリンパス対物レンズを用いて、青色光または紫
外光で励起したフルオレセイン染料の厚いスラブの中心
を通して共焦点セクションを集めた。曲線は像面の中心
を通して描かれた蛍光像のプロファイルにぴったり合っ
た。次に、曲線をやや変位させてそれらのピークを一致
させた。（ピーク変位は小ミラー・アラインメント差に
よって生じた。）全視野は768画素であった。第13A図
は、色補正接眼レンズ＃３の場合の紫外光または可視光
励起での蛍光像面輝度（曲線a.vおよびa.uv）ならびに
色補正接眼レンズ＃１の場合の紫外光または可視光励起
での蛍光像面輝度（曲線b.vおよびb.uv）を示してい
る。ここでわかるように、像面を横切る像強度は色補正
接眼レンズによって劇的に改善される。第13B図は、接
眼レンズ＃１および100x、40x、10xオリンパス対物レン
ズを用いて集めたデータを示している。ここでわかるよ
うに、像面強度は対物レンズの度を高めることによって
改善した。

検出器経路における合焦レンズ 上述したように、データ収集能率は検出器経路にレン
ズを設置することによって改善される。平行にされた励
起レーザ光は、接眼レンズおよび対物レンズを通り、励
起点に合焦する。回析制限三次元点広がり関数（psf）
の強度分布に従って励起点まわりの領域において発蛍光
団が励起される。光はこの同じ強度分布に沿って対物レ
ンズによって集められ、励起点まわりにほぼ対称的な幾
分幅の狭い共焦点psfを生じる。単純なピンホール式共
焦点顕微鏡においては、psf像の中心はピンホールに合
焦し、対物レンズ焦点の上下の平面からの光はほぼ対称
的に阻止される。上述した特別な顕微鏡においては、ps
f像の中心からの光は無限遠に合焦し、その結果、対物
レンズ焦点の上下の平面からの光が非対称的に阻止され
る。

共焦点アパーチャのところでの光束の半径を、薄肉レ
ンズ等式を用いて、励起点付近の光軸に沿った種々の点
から発せられた光について計算した。各点から集められ
た強度の比率は、Ｉ＝（rp/rΔ）^２に従って平行光束の
幅に設定されたアパーチャについて計算される。この式
において、rpはピンホールの半径であり、励起点からの
平行光束の半径に設定し、ｒΔは焦点外の点からピンホ
ールに発散あるいは収束している光の半径である。１よ
り大きい値は１に短縮した（これはすべての光がPMTに
集まったことを示す）。こうしてできたピンホール集束
関数（pcf）の中心が光軸に沿ってpsfの中心を通って変
位することがわかった。ピンホールが開いたり閉じたり
するときに、pcfはその中心まわりに広がったり縮んだ
りする。pcfの中心からの光線はピンホールに合焦し
た。40x対物レンズの場合、6x接眼レンズを用いている
ときには、光学セクションは、最大励起点からpsfの中
心にすべての光が集まる10x接眼レンズからのセクショ
ンの２倍よりも大きな幅となることがわかった。

ピンホールは、また、空間サンプリング装置とも考え
られる。理論的な解像度を得るためには、pcfはナイキ
スト・サンプリング判定基準を満たす理論的解像度の幅
の少なくとも半分でなければならない。pcfは、一般
に、psfと異なった形を持ち、その結果、軸線方向より
も半径方向に最大の解像度を得るにはより小さいピンホ
ールを用いなければならない。理論的な軸線方向解像度
を得るためにピンホールの寸法を縮めた場合には、pcf
はその中心まわりに縮まり、psfからの励起された光の
大部分が阻止されることになる。

ピンホールのところで半径方向におけるpsfの倍率を
計算するのに薄肉レンズ等式を用いた。理論的な側方解
像度は、この構成では、10x接眼レンズで得ることがで
き、6x接眼レンズでは得られないことがわかった。同様
の計算を6x、8x、10xの接眼レンズと共に100x、40x、20
x、10xの対物レンズについて行った。モデルの10x接眼
レンズは、10x対物レンズ以外のすべてについて理論的
な軸線方向、半径方向解像度を得ることができたが、最
適度数については得られなかった。8x接眼レンズの解像
度は、40x対物レンズについては限界であり、10x対物レ
ンズについては不充分であった。6x接眼レンズのみが10
0x対物レンズでの理論的解像度を得た。

この解像度問題を解決するために、ダイクリック・ミ
ラーとピンホールの間に1000mmレンズを設置して励起ス
ポットの中心からの平行光線をピンホールに合焦させ
た。この方法は軸線方向pcfの中心を軸線方向psfの中心
へ変位させ、ピンホールを任意の寸法に縮め、しかもな
お、試料における最大励起点から光を集めることができ
る。

小さいアパーチャでは、長いレンズを用いて集められ
た光の強度を40％まで強める。焦点外の光を集めること
は、焦点内の光の若干量を阻止するほどの大きな問題と
ならない。アパーチャが戻る途中の平行光束の幅よりも
小さいからである。最終的な効果は、解像度を維持ある
いは増強しながら小さいアパーチャのところで光の強度
を高めるということにある。この基本的な設計（接眼レ
ンズおよび長い戻り経路を含む）により、ピンホールの
代わりにアイリス絞りを用いることの利点が長いレンズ
を戻り専用経路に挿入された場合でも達成される。

しかしながら、単レンズは、いくつかの対物レンズ／
接眼レンズ組み合わせの場合に、ピンホールでのpsf F
WHMMの倍率を0.5mm（可変アパーチャの実際の限界）よ
り低い値に低下させた。したがって、単レンズの代わり
に、psf像をアパーチャに合焦させ、この像の側方FWHM
をすべての対物レンズについて0.5mmよりも大きい寸法
に倍増するように設計した２レンズ光学素子を用いた。
この設計は理論的な共焦点解像度を得るために色補正6x
接眼レンズ設計を使用できることを予測させる。

結論 結論として、本発明が共焦点走査顕微鏡の利点を紫外
線まで敷衍させる経済的かつ効果的な技術を提供すると
いうことを理解されたい。

上記の説明は好ましい実施例についての説明である
が、種々の改造、代替構造および代替物を使用できる。
たとえば、戻り専用経路を単一のビームスプリッタと２
つの検出器を備えたものとして説明したが、第２のビー
ムスプリッタおよび第３の検出器を追加して顕微鏡の紫
外線能力をより充分に発揮させることもできる。さら
に、倒立顕微鏡実施例における対物レンズをテロンレン
ズとの組み合わせで示したが、テロンレンズなしに無限
補正対物レンズを用いてもよい。

したがって、上記の説明および図示は本発明の範囲を
限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求の範
囲によってのみ定義されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クラハム デビッド エルドン アメリカ合衆国 ミネソタ 55902 ロ チェスター バレイ ビュー ロード エスダブリュ 3565 (72)発明者 レシュレイター ジェームス ドナルド アメリカ合衆国 バージニア 22942 ゴードンスビル ボックス 147 ルー ト ３ (56)参考文献 特開 昭63−306413（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−298211（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−49313（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−228223（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−70412（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 21/62 - 21/74 G02B 21/00 G02B 26/10 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (18)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】紫外線ビームを発する紫外線源手段と、 可視光検出器と、 前記光検出器の有効寸法を制限する手段と、 前記紫外線源からサンプル領域までの順方向経路が順方
   向専用セグメントと共通経路セグメントからなり、前記
   順方向経路に沿って前記紫外線ビームを送る手段と、 前記サンプル領域から前記可視光検出器までの戻り経路
   が前記共通経路セグメントと戻り専用セグメントからな
   り、前記戻り経路に沿って可視光を送る手段と、 前記共通経路セグメントにあり、前記紫外線ビームを前
   記サンプル領域におけるスポットに合焦する合焦手段
   と、 前記共通経路セグメントにあり、前記紫外線ビームが前
   記合焦手段に遭遇する角度を変えて前記サンプル領域に
   おける前記スポットの位置を変える走査手段と、を包含
   し、 前記合焦手段が、紫外光が所与の角度で前記走査手段を
   出て、前記サンプル領域の所与の位置に合焦する場合
   に、この所与の位置から発する可視光が同じ所与の角度
   で前記走査手段に遭遇するように色収差による走査エラ
   ーについて補正してあることを特徴とする走査共焦点顕
   微鏡
2. 【請求項２】前記合焦手段が可視光と紫外光の間で縦方
   向に色収差ありであり、前記スポットから発する可視光
   が前記合焦手段を出るときに平行にされ、 前記順方向専用セグメントが、前記紫外線ビームが前記
   合焦手段に遭遇するときにこれを発散させるように配置
   した手段を包含することを特徴とする請求の範囲第１項
   に記載の走査共焦点顕微鏡。
3. 【請求項３】前記合焦手段が接眼レンズと対物レンズと
   からなることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の走
   査共焦点顕微鏡。
4. 【請求項４】前記合焦手段が接眼レンズ、アダプタレン
   ズ、テロンレンズおよび対物レンズからなることを特徴
   とする請求の範囲第１項に記載の走査共焦点顕微鏡。
5. 【請求項５】前記光検出器の有効寸法を制限する前記手
   段がアイリス絞りを包含することを特徴とする請求の範
   囲第１項記載の走査共焦点顕微鏡。
6. 【請求項６】前記合焦手段の一部であるアダプタレンズ
   を含む接眼レンズまたは接眼レンズが対象物点と結像点
   の間で可視光および紫外光について色収差の補正がして
   あることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の走査共
   焦点顕微鏡。
7. 【請求項７】前記対象物点が前記紫外線ビームが前記走
   査手段を出る点またはその近傍にあることを特徴とする
   請求の範囲第６項に記載の走査共焦点顕微鏡。
8. 【請求項８】前記紫外線源手段と共焦点である可視光源
   を包含することを特徴とする請求の範囲第１項に記載の
   走査共焦点顕微鏡。
9. 【請求項９】前記合焦手段が可視光と紫外光の間で縦方
   向に色収差があり、前記順方向専用セグメントが可視光
   と紫外光の間の縦方向色収差を補正するように配置した
   手段を包含することを特徴とする請求の範囲第１項に記
   載の走査共焦点顕微鏡。
10. 【請求項１０】紫外線ビームを順方向経路に沿ってサン
    プル領域に送る紫外線照射サブシステムと、戻り経路に
    沿って前記サンプル領域から送られてきた可視光を検出
    する可視光サブシステムとを包含し、 前記紫外線照射サブシステムおよび可視光システムがビ
    ームスキャナと合焦光学素子を含む共有要素を有し、 前記合焦光学素子が前記紫外線ビームを前記サンプル領
    域のスポットに合焦させると共にこのスポットから発す
    る可視光を集めるように作動し、 前記ビームスキャナが前記サンプル領域の前記スポット
    の位置を変えるように作動し、 前記合焦光学素子が、紫外光が所与の角度で前記ビーム
    スキャナを出て、前記サンプル領域の所与の位置に合焦
    する場合に、この所与の位置から発する可視光が同じ所
    与の角度で前記ビームスキャナに遭遇するように色収差
    による走査エラーについて補正してあること を特徴とする走査共焦点顕微鏡。
11. 【請求項１１】前記合焦光学素子が接眼レンズと対物レ
    ンズからなることを特徴とする請求の範囲第10項に記載
    の走査共焦点顕微鏡。
12. 【請求項１２】前記接眼レンズが対象物点と結像点の間
    で可視光および紫外光について色収差が補正されている
    ことを特徴とする請求の範囲第11項に記載の走査共焦点
    顕微鏡。
13. 【請求項１３】前記対象物点が前記紫外線ビームが前記
    ビームスキャナを出る点またはその近傍にあることを特
    徴とする請求の範囲第12項に記載の走査共焦点顕微鏡。
14. 【請求項１４】前記合焦光学素子が接眼レンズ、アダプ
    タレンズ、テロンレンズおよび対物レンズを包含するこ
    とを特徴とする請求の範囲第10項に記載の走査共焦点顕
    微鏡。
15. 【請求項１５】前記接眼レンズおよびアダプタレンズが
    対象物点と結像点の間で可視光および紫外光について色
    収差が補正されていることを特徴とする請求の範囲第14
    項に記載の走査共焦点顕微鏡。
16. 【請求項１６】前記対象物点が、前記紫外線ビームが前
    記ビームスキャナを出る点またはその近傍にあることを
    特徴とする請求の範囲第15項に記載の走査共焦点顕微
    鏡。
17. 【請求項１７】前記可視光サブシステムが可視光検出器
    とアイリス絞りとを包含することを特徴とする請求の範
    囲第９項に記載の走査共焦点顕微鏡。
18. 【請求項１８】前記合焦光学素子が可視光と紫外光の間
    で縦方向色収差があり、 前記紫外線サブシステムが可視光と紫外光の間の縦方向
    色収差を補正するように、前記可視光サブシステムと共
    有しない少なくとも１つのレンズを包含することを特徴
    とする請求の範囲第９項に記載の走査共焦点顕微鏡。