JP3036711B2

JP3036711B2 - 乳酸またはピルビン酸の高感度定量法および定量用組成物

Info

Publication number: JP3036711B2
Application number: JP3145379A
Authority: JP
Inventors: 成植田; 守高橋; 英生美崎; 茂行今村
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1991-05-21
Filing date: 1991-05-21
Publication date: 2000-04-24
Anticipated expiration: 2015-04-24
Also published as: JPH04346796A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床生化学検査、食品
検査等における乳酸またはピルビン酸、あるいはこれら
を反応生成物とする物質の新規な高感度定量法および定
量用組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】血中乳酸の測定は、嫌気的解糖系の指標
として代謝異常のみならず循環障害でも変動し、これら
疾患の病態把握に重要である。酵素法を用いた測定法と
しては、（１）乳酸デヒドロゲナーゼを用いるもの、
（２）乳酸オキシダーゼを用いるものとがある。このう
ち（１）の方法は、Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ⁺→ピルビン酸＋
ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺の反応を行わせ、還元型ＮＡＤの増加を
定量して乳酸量を求めるのであるが、この反応は生理的
ｐＨでは平衡が左に傾いているので、（イ）ｐＨ９、１
０のアルカリ性反応液を用いる、（ロ）ＮＡＤを過剰に
添加する、（ハ）セミカルバジンを添加しピルビン酸を
除去する、などの方法で、反応を右方へ進める必要があ
る。また、（２）の方法は、乳酸オキシダーゼによって
生成した過酸化水素を検出するもので、ペルオキシダー
ゼを用いて色原体の存在下に比色定量するものである
が、還元物質の影響をうけやすいという欠点がある。ま
た、酵素電極による測定についても報告されている（日
本臨床化学会年会記録、第２５集、ｐ７０、１９８５
年）。

【０００３】一方、ピルビン酸は多種にわたる代謝経路
の交差点に位置し、種々の病態を反映することが知られ
ており、一般には乳酸デヒドロゲナーゼ（日本臨床、第
４７巻、ｐ４９６、１９８９年）やピルビン酸オキシダ
ーゼ（米国特許第４，２４６，３４２号明細書、特公昭
６１−１４７９４号公報）を用いて測定されている。し
かしながら、ピルビン酸はもともと血中で３４〜１０２
μｍｏｌ／l と少量であるため、より高感度な測定法が
望まれている。そのため、酵素サイクリング法を用いた
定量法が報告されている（臨床化学、１５巻、ｐ２７０
−２７６、１９８６年）。この方法は、Ｄ−アミノ酸オ
キシダーゼ（ＥＣ１．４．３．３）、Ｄ−アラニンア
ミノトランスフエラーゼ（ＥＣ２．６．１．２１）を
用いる方法であり、従来法に比べて高感度になってい
る。

【０００４】また、乳酸は、ある種の微生物において
は、乳酸醗酵によりＤ体が生じることが既に知られてお
り、Ｄ−乳酸に特異的に働くＤ−乳酸デヒドロゲナーゼ
を用いた測定キットも市販されている。

【０００５】一般に、酵素を用いて分析を行う場合、測
定しようとする対象物質を、分光学的に検出可能な過酸
化水素や還元型ＮＡＤ（Ｐ）等に変換することが行わ
れ、この場合、検出可能な物質の量は化学量論的に測定
対象物と等しくなる。現在、この検出可能な物質を測定
する方法としては、分光分析機器を用いる方法が最も普
及しているが、これも感度上に限界があり、測定対象物
の含量が少ない場合適さないという欠点があった。そこ
で、測定対象物の含量が少ない場合や、測定対象物を含
む被検体が少量の場合等は、分光分析よりも感度の優れ
た蛍光分析、発光分析等が行われている。しかしなが
ら、これらの方法も臨床検査等の汎用検査においては、
機器の普及という点からはあまり適したものではなかっ
た。

【０００６】また、微量の物質を測定するその他の方法
としては、該物質が等量の補酵素等に変換できる場合、
２種類の酵素を用いて補酵素等を増幅する、いわゆる酵
素サイクリング法が知られている。例えば、ＮＡＤサイ
クリング、ＣｏＡサイクリング、ＡＴＰサイクリングな
どがあるが、これらの方法は臨床検査等のルーチン分析
においては、操作が煩雑なため、殆ど用いられていない
のが現状であった。前述のピルビン酸の酵素サイクリン
グ反応も、反応により蓄積される過酸化水素またはアン
モニアを更に検出のための反応系と連結させなければな
らないという欠点を有する。

【０００７】高感度測定法がもたらす利点としては、測
定対象物の含量が少ない場合はもとより、測定に必要な
検体量を減らすことができるため、例えば血清のように
種々の成分を含むものを被検体に用いる場合は、その測
定系に及ぼす共存物質の影響を小さくすることができ
る。また、ある限られた被検体量で検査できる項目数を
増やすことも可能である。更に、検体が人血液である場
合などは、採血量を減らすことができるため、被採血者
への心理的な負担を軽減することもできるし、廃棄物の
減少により環境汚染を軽減することに貢献することにも
なる。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】前述のごとく乳酸、ま
たはピルビン酸の測定法は種々報告され、ピルビン酸に
ついては酵素サイクリング法による高感度な測定法も報
告されているが、更に簡便で高感度な方法が望まれてい
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の問
題点につき鋭意検討した結果、乳酸またはピルビン酸の
定量において、チオＮＡＤ類と、ＮＡＤ類との補酵素に
作用する乳酸デヒドロゲナーゼを用い、かつチオニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、チオＮＡＤ
類という）とニコチンアミドアデニンジヌレオチド類
（以下、ＮＡＤ類という）との二種の補酵素を用いるこ
とにより、乳酸とピルビン酸とのサイクリング反応を形
成することを見出し、更にこの反応における吸光度の測
定に際し、ＮＡＤのアナログであるチオＮＡＤとＮＡＤ
の還元型吸収波長がそれぞれ４００ｎｍ付近、３４０ｎ
ｍ付近と異なつていることを利用し、他物質の吸収波長
の混雑が回避できる酵素サイクリング反応が実施でき、
高感度な測定が可能であることを確認し、本発明を完成
するに至った。即ち、乳酸デヒドロゲナーゼを用いた酵
素サイクリング反応を実施するに当り、二種類の補酵素
の一つにチオＮＡＤ類、他方にＮＡＤ類を使用して、ど
ちらか一方の補酵素の変化量のみを分別定量するもの
で、その結果、乳酸またはピルビン酸を高感度に測定で
きるものである。

【００１０】本発明は、上記のような知見に基づいて完
成されたものであって、乳酸またはピルビン酸を含有す
る被検液に、（１）チオＮＡＤ類と、ＮＡＤ類を補酵素
とし、少なくとも乳酸を基質としてピルビン酸を生成す
る可逆反応をなす乳酸デヒドロゲナーゼ、（２）Ａ１、
（３）Ｂ１、

【００１１】（式中、Ａ１はチオＮＡＤ類またはＮＡＤ
類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ
１がチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤ類を、Ａ１がＮ
ＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示す）で表されるサイクリング反応を
形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の
量を測定することを特徴とする乳酸またはピルビン酸の
高感度定量法を提供するものである。

【００１２】更にまた本発明は、次の成分（１）〜
（３）（１）チオＮＡＤ類と、ＮＡＤ類とを補酵素とし、少な
くとも乳酸を基質としてピルビン酸を生成する可逆反応
をなす乳酸デヒドロゲナーゼ、（２）Ａ１、（３）Ｂ
１、

【００１３】（式中、Ａ１はチオＮＡＤ類またはＮＡＤ
類を示し、Ａ２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ
１がチオＮＡＤ類のときは還元型ＮＡＤ類を、Ａ１がＮ
ＡＤ類のときは還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１
の酸化型生成物を示す）を含有することを特徴とする乳
酸またはピルビン酸の定量用組成物を提供するものであ
る。

【００１４】本発明において用いられる、乳酸デヒドロ
ゲナーゼとは少なくとも、Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ⁺＝ピルビ
ン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺またはＤ−乳酸＋ＮＡＤ⁺＝ピル
ビン酸＋ＮＡＤＨ＋Ｈ⁺なる反応を触媒するものであっ
て、チオＮＡＤ類およびＮＡＤ類を補酵素とするものな
ら特に限定されない。

【００１５】本酵素の具体例としては、ＥＣ１．１．
１．２７のＬ−乳酸を基質とする酵素、ＥＣ１．１．
１．２８のＤ−乳酸を基質とする酵素が挙げられる。Ｅ
Ｃ１．１．１．２７の酵素は、補酵素（チオ）ＮＡＤ類
に特異的であり、動物の心、肝、腎、筋肉、血球などに
広く分布している。酵素分子は、心筋型、骨格筋型の２
種類の異なつたサブユニツトからなる４量体で５種類の
アイソザイムがある。このうち、肝、骨格筋などは骨格
筋型サブユニツトを多く含み、心筋には心筋型サブユニ
ツトを多く含んでいる。ブタ筋肉、ブタ心、ウサギ筋肉
由来の酵素が市販されている。ＥＣ１．１．１．２８
の酵素は大腸菌、カビ、乳酸菌等に見出されており、Ｅ
Ｃ１．１．１．２７の酵素と同様、（チオ）ＮＡＤ類
に特異的である。

【００１６】ラクトバチルスライヒマンニ（Ｌａｃｔ
ｏｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）、ロイ
コノストツクメセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔ
ｏｃｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、スタフイロコツカ
スエピデルミデイス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）等由来の酵素が市販されて
いる。これらの酵素のうち、例えばＥＣ１．１．１．
２７の酵素で、ベーリンガーマンハイム社より市販され
ているブタ筋肉由来の酵素の補酵素に対する相対活性は
１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９）では、ＮＡ
Ｄを用いた時を１００％とすると、チオＮＡＤで３３
％、デアミノＮＡＤでは５４％、アセチルＮＡＤでは１
４％であつた。

【００１７】また、ラクトバチルスプランタラム（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来
の、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼは同様にＮＡＤを用いた
時を１００％とすると、チオＮＡＤでは１８５％、同じ
菌由来のＤ−乳酸デヒドロゲナーゼについてはチオＮＡ
Ｄに対しては５２％である。（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５，４２６，１９６２）。その他
の起源の酵素についても適宜の系に使用可能であり、補
酵素（チオ）ＮＡＤ類に対する特異性は、基質である乳
酸に対して反応性を有するものであればよく、これらの
補酵素と基質を用いて確認できる。

【００１８】又、Ａ１およびＢ２で示される補酵素は、
チオＮＡＤ類、ＮＡＤ類を示すが、チオＮＡＤ類として
は、例えばチオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（チオＮＡＤ）、チオニコチンアミドヒポキサンチンジ
ヌクレオチドが挙げられる。又、ＮＡＤ類としては、ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセ
チルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡ
Ｄ）、アセチルピリジンヒポキサンチンジヌクレオチ
ド、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（デ
アミノＮＡＤ）が挙げられる。

【００１９】本発明のＡ１およびＢ１において例えばＡ
１がチオＮＡＤ類である場合、Ｂ１は還元型ＮＡＤ類で
あることが必要であり、Ａ１およびＢ１の関係において
一つのチオ型補酵素を使用するものである。

【００２０】本発明の高感度定量法を用いれば、被検液
中にもともと含有されている乳酸またはピルビン酸を測
定することができるが、更に、これらの物質を遊離また
は生成する酵素系における基質や、その酵素活性を測定
することもできる。更に、本発明の高感度定量法を用い
れば、上記のような乳酸またはピルビン酸を遊離、また
は生成する酵素系と連結し得る、単一の、もしくは複数
の工程からなる酵素系における基質や、その酵素活性を
も測定することができる。これらの酵素系は、特に限定
されるものではないが、例えば以下に示す種々の酵素の
反応系が挙げられる。

【００２１】（１）ＡＤＰ、ホスホエノールピルビン酸
とピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）の酵
素反応系によって遊離、生成するピルビン酸を定量する
ためのもので、ＡＤＰ、ホスホエノールピルビン酸の定
量、またはピルビン酸キナーゼの活性測定のための反応
系。 ●ホスホエノールピルビン酸＋ＡＤＰ→ピルビン酸＋Ａ
ＴＰ

【００２２】（２）Ｌ−アラニン、２−オキソグルタル
酸とアラニンアミノトランスフエラーゼ（ＥＣ２．
６．１．２）の酵素反応系によって遊離、生成するピル
ビン酸を定量するためのもの。 ●Ｌ−アラニン＋２−オキソグルタル酸→Ｌ−グルタミ
ン酸＋ピルビン酸

【００２３】（３）上記（１）の酵素反応系におけるＡ
ＤＰが、グリセロール、ＡＴＰとグリセロールキナーゼ
（ＥＣ２．７．１．３０）の酵素反応系由来である場
合。 ●グリセロール＋ＡＴＰ→グリセロール−３−リン酸＋
ＡＤＰ

【００２４】（４）上記（１）の酵素反応系におけるＡ
ＤＰが、クレアチン、ＡＴＰとクレアチンキナーゼ（Ｅ
Ｃ２．７．３．２）の酵素反応系である場合。 ●クレアチン＋ＡＴＰ→クレアチンリン酸＋ＡＤＰ

【００２５】（５）上記（１）の酵素反応系におけるＡ
ＤＰが、ＮＨ₃、Ｌ−グルタミン酸、ＡＴＰとグルタミ
ンシンセターゼ（ＥＣ６．３．１．２）の酵素反応系
由来である場合。 ●ＮＨ₃＋Ｌ−グルタミン酸＋ＡＴＰ→Ｌ−グルタミン
＋ＡＤＰ＋Ｐｉ

【００２６】（６）上記（３）の酵素反応系におけるグ
リセロールが、モノ、ジ、またはトリグリセライドとリ
パーゼ（ＥＣ３．１．１．３）の酵素反応系由来であ
る場合。 ●グリセライド＋ｎＨ₂Ｏ→ｎ脂肪酸＋グリセロール

【００２７】（７）上記（４）の酵素反応系におけるク
レアチンが、クレアチニンとクレアチニナーゼ（ＥＣ
３．５．２．１０）の酵素反応系由来である場合。 ●クレアチニン＋Ｈ₂Ｏ→クレアチン

【００２８】（８）Ｎ−アセチルノイラミン酸とＮ−ア
セチルノイラミン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．
３）の酵素反応系によつて遊離、生成するピルビン酸を
定量するためのもの。 ●Ｎ−アセチルノイラミン酸→Ｎ−アセチルマンノサミ
ン＋ピルビン酸

【００２９】（９）（８）のＮ−アセチルノイラミン酸
が、結合型シアル酸とノイラミニダーゼ（ＥＣ３．
２．１．１８）の酵素反応系由来である場合。 ●結合型シアル酸＋Ｈ₂Ｏ→遊離シアル酸（Ｎ−アセチ
ルノイラミン酸）＋Ｒ −
ＯＨ

【００３０】本発明の乳酸またはピルビン酸定量用組成
物においては、Ａ１およびＢ１の濃度は０．０２〜１０
０ｍＭ、特に０．０５〜２０ｍＭが好ましく、乳酸デヒ
ドロゲナーゼの量は１〜１０００ｕ／ml、特に２〜４０
０ｕ／mlが好ましいが、その量は被検体の種類等により
適宜決定することができ、これ以上の量を用いることも
できる。

【００３１】Ａ１およびＢ１の量は、被検体中の乳酸ま
たはピルビン酸の合計量に比較して過剰量であること、
かつ乳酸デヒドロゲナーゼのＡ１及びＢ１それぞれに対
するＫｍ値に比較して過剰量であることが必要であり、
特に乳酸またはピルビン酸の合計量の２０〜１００００
倍モルが好ましい。

【００３２】反応液組成については、使用する乳酸デヒ
ドロゲナーゼの各種補酵素間の相対活性等を考慮して二
種の補酵素を適宜選択し、その後正反応／逆反応の至適
ｐＨ条件を酵素サイクリング反応が効率よく進行するよ
うに設定すればよい。これら使用する酵素は単独でも、
あるいは適宜２種以上を組み合わせて用いてもよい。

【００３３】斯くして、調製された本発明の乳酸または
ピルビン酸定量用組成物によって被検体中の乳酸または
ピルビン酸を測定するには、上記成分（１）〜（３）を
含有する組成物に、被検体０．００１〜０．５mlを加
え、約３７℃の温度にて反応させ、反応開始一定時間後
の２点間の数分ないし数十分間、例えば３分後と４分後
の１分間、または３分後と８分後の５分間における生成
されたＡ２の量または消費されたＢ１の量を、それぞれ
の吸収波長に基づく吸光度の変化によつて測定すればよ
い。

【００３４】例えば、Ａ２がチオＮＡＤＨ、Ｂ１がＮＡ
ＤＨの場合、Ａ２の生成を４００ｎｍ付近の吸光度の増
加により測定するか、あるいはＢ１の消費を３４０ｎｍ
付近の吸光度の減少により測定し、既知濃度の乳酸また
はピルビン酸を用いて測定したときの値と比較すれば、
被検液中の乳酸またはピルビン酸量をリアルタイムで求
めることができる。

【００３５】また、被検体中に乳酸とピルビン酸が共存
している場合は、本発明定量法によれば、これら合計量
として定量される。即ち、Ｌ−乳酸とピルビン酸が共存
している場合には、Ｌ−乳酸に特異的なＥＣ１．１．
１．２７を用いて、これらの合計量が、またＤ−乳酸と
ピルビン酸が共存している場合には、Ｄ−乳酸に特異的
なＥＣ１．１．１．２８を用い、これらの合計量が測
定される。個々の成分の値を測定したい場合には、被検
体をあらかじめどちらかの成分のみに作用する酵素によ
つて消去する等の前処理をしたのち、酵素サイクリング
反応に導けばよい。

【００３６】例えば、ピルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ
１．２．３．３）により前処理を行えばピルビン酸はア
セチルリン酸に転換されるので、引続き本発明による酵
素サイクリング反応を実施することにより乳酸のみを定
量することができる。また、乳酸とピルビン酸の合計量
から前記乳酸の量を差し引くことにより、ピルビン酸の
みの定量値を算出することもできる。更に、Ｄ−乳酸、
Ｌ−乳酸、ピルビン酸が共存している場合にも、ピルビ
ン酸オキシダーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ−乳
酸デヒドロゲナーゼを適宜選択し、組み合わせて用いれ
ばそれぞれ個々の量を算出することができる。

【００３７】又、本発明定量法は、被検液中の乳酸また
はピルビン酸そのものを酵素サイクリング反応に導くも
のであり、被検液中の共存物質の影響を受けにくいた
め、被検液のブランク測定を省略することができ、レイ
トアツセイによる簡便な測定を成し得る。なお、本発明
においてはＡ２またはＢ１の測定に当り、吸光度測定の
代わりに他の公知の測定法を使用して定量を行うことも
できる。

【００３８】

【発明の効果】上述のごとく、本発明は還元型の吸収波
長の異なる補酵素を用いるため測定誤差が生じず、ま
た、酵素のサイクリング反応を組合せることによつて感
度を増大させることができるため、少量の検体で迅速か
つ正確に被検体中の乳酸またはピルビン酸を定量するこ
とができる。

【００３９】

【実施例】以下に本発明の実施例を挙げて具体的に述べ
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１Ｌ−乳酸の定量＜反応液＞４０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２ｍＭチオＮＡＤ（シグマ社製）０．２ｍＭ還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）２５０ｕ／ml Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（オリエンタル酵母工業社製：ブタ心臓由来）

【００４０】＜操作＞上記試薬１mlをキユベツトにとり、０、２０、４０、６
０、８０、１００μＭのＬ−乳酸溶液をそれぞれ２０μ
l 添加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開始後、
３分目と５分目の４００ｎｍにおける吸光度を読み取
り、その差を求めた。その結果を図１に示した。図１か
ら明らかなように、Ｌ−乳酸量に対する吸光度変化量は
良好な直線性を示した。

【００４１】実施例２ピルビン酸の定量＜反応液＞５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９）３ｍＭチオＮＡＤ（シグマ社製）０．２ｍＭ還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）３４０ｕ／ml Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製：ブタ筋肉由来）

【００４２】＜操作＞上記の試薬１mlをキユベツトにとり、０、１０、２０、
３０、４０、５０μＭのピルビン酸カリウム溶液をそれ
ぞれ２０μl 添加し、３７℃にて反応を開始させた。反
応開始後、２分目と５分目の４００ｎｍにおける吸光度
を読み取り、その差を求めた。その結果を図２に示し
た。図２から明らかなように、ピルビン酸カリウム量に
対する吸光度変化量は良好な直線性を示した。

【００４３】実施例３血清中Ｌ−乳酸、ピルビン酸合計量の定量＜反応液＞５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９）３ｍＭチオＮＡＤ（シグマ社製）０．２ｍＭ還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）０．１％トリトンＸ−１００２６０ｕ／ml Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製：ブタ筋肉由来）

【００４４】＜操作＞上記試薬１mlをキユベツトにとり、３種類の正常新鮮人
血清をそれぞれ５μl添加し、３７℃にて反応を開始さ
せた。反応開始後３分目と５分目の４００ｎｍにおける
吸光度を読み取り、その差を求めた。別に標準液として
２００μｍｏｌ／l のピルビン酸カリウム溶液を、また
試薬ブランクとして血清の代わりに蒸留水をそれぞれ５
μl 用い、同様の操作を行った。次の計算式によりそれ
ぞれの血清中のＬ−乳酸とピルビン酸の合計量を算出
し、その結果を表１に示した。

【００４５】

【式１】

【００４６】

【表１】

【００４７】実施例４血清中Ｌ−乳酸、ピルビン酸の分画定量＜反応液（１）＞２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）０．２ｍＭチアミンピロリン酸０．５ｍＭ塩化マンガン０．１％トリトンＸ−１００２０ｕ／ml ピルビン酸オキシダーゼ（東洋醸造社製：ペデイオコツカスエスピー（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）由来）

【００４８】＜反応液（２）＞１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９）６ｍＭチオＮＡＤ（シグマ社製）０．４ｍＭ還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）０．１％トリトンＸ−１００２０ｍＭＥＤＴＡ２０ｍＭクエン酸ナトリウム５２０ｕ／ml Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製：ブタ筋肉由来）

【００４９】＜操作＞反応液（１）０．５mlをキユベツトにとり、実施例３に
用いた３種類の正常新鮮人血清をそれぞれ５μl 添加
し、３７℃にて５分間反応を実施し、内在性のピルビン
酸を消去した。その後、反応系（２）を０．５ml添加
し、３７℃にて酵素サイクリング反応を開始させた。反
応液（２）添加後の３分目と５分目の４００ｎｍにおけ
る吸光度を読み取り、その差を求めた。

【００５０】別に、標準液として２００μｍｏｌ／l の
ピルビン酸カリウム溶液を、また試薬ブランクとして血
清の代わりに蒸留水をそれぞれ５μl 用い、同様の操作
を行った。実施例３と同様の計算式によりそれぞれの血
清中のＬ−乳酸量を算出し、実施例３の結果から、この
値を差し引くことにより、ピルビン酸量を求めた。その
結果を表２に示した。

【００５１】

【表２】

【００５２】実施例５血清中ピルビン酸の定量＜反応液＞５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．９）２ｍＭチオＮＡＤ（シグマ社製）０．２ｍＭ還元型ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製）０．１％トリトンＸ−１００２８０ｕ／ml Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製：ラクトバチルスライヒマンニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ）由来）

【００５３】＜操作＞上記試薬１mlをキユベツトにとり、実施例３に用いたも
のと同じ３種類の正常新鮮人血清をそれぞれ１０μl 添
加し、３７℃にて反応を開始させた。反応開始後２分目
７分目の４００ｎｍにおける吸光度を読み取り、その差
を求めた。別に、標準液として５０μｍｏｌ／l のピル
ビン酸カリウム溶液を、また試薬ブランクとして血清の
代わりに蒸留水をそれぞれ１０μl 用い、同様の操作を
行った。実施例３と同様の計算式によりそれぞれの血清
中のピルビン酸量を算出し、その結果を表３に示した。

【００５４】

【式２】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｌ−乳酸の定量曲線である。

【図２】ピルビン酸の定量曲線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/25 - 1/66 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】被検体に、（１）チオニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド類（以下、チオＮＡＤ類という）
と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、
ＮＡＤ類という）とを補酵素とし、少なくとも乳酸を基
質としてピルビン酸を生成する可逆反応をなす乳酸デヒ
ドロゲナーゼ、（２）Ａ１、（３）Ｂ１、を含有する試
薬を作用せしめて、次の反応式【化１】（式中、Ａ１はチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ
２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡ
Ｄ類のときは還元型ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤ類のとき
は還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成
物を示す）で表されるサイクリング反応を形成せしめ、
該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定する
ことを特徴とする乳酸またはピルビン酸の高感度定量
法。
【請求項２】チオＮＡＤ類が、チオニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド（チオＮＡＤ）、チオニコチンア
ミドヒポキサンチンジヌクレオチドからなる群より選ば
れるものであることを特徴とする請求項１記載の乳酸ま
たはピルビン酸の高感度定量法。
【請求項３】ＮＡＤ類が、ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤ）、アセチルピリジンアデニンジ
ヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）、アセチルピリジンヒ
ポキサンチンジヌクレオチドおよびニコチンアミドヒポ
キサンチンジヌクレオチド（デアミノＮＡＤ）からなる
群より選ばれるものであることを特徴とする請求項１記
載の乳酸またはピルビン酸の高感度定量法。
【請求項４】次の成分（１）〜（３）（１）チオニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド類（以下、チオＮＡ
Ｄ類という）と、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ド類（以下、ＮＡＤ類という）とを補酵素とし、少なく
とも乳酸を基質としてピルビン酸を生成する可逆反応を
なす乳酸デヒドロゲナーゼ、（２）Ａ１、（３）Ｂ１、
（式中、Ａ１はチオＮＡＤ類またはＮＡＤ類を示し、Ａ
２はＡ１の還元型生成物を示し、Ｂ１はＡ１がチオＮＡ
Ｄ類のときは還元型ＮＡＤ類を、Ａ１がＮＡＤ類のとき
は還元型チオＮＡＤ類を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成
物を示す）を含有することを特徴とする乳酸またはピル
ビン酸定量用組成物。