JP3026843B2 - 核酸増幅の促進法 - Google Patents
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Description
技術分野 本発明は、本質的に一定の温度でDNAポリメラーゼお
よびRNAポリメラーゼを用いる核酸鎖の増幅に関する。 背景技術 特定の核酸配列を検出する能力は、遺伝学的研究、臨
床診断試験、法医学、考古学などのような領域で多くの
実際的な利便を提供してきた。多くの場合、問題とする
配列は、非常に高度に特異的な活性標識を有するプロー
ブを用いても直接的には検出できないほど低濃度でしか
存在しないであろう。最近、非常に強力な指数関数的増
幅法を含む、標的配列の新たなコピーを効率的に発生さ
せるための戦略が考案され、それにより非常に低い標的
レベルの存在をより正確に検出することができるように
なった。 そのような方法の一つは、ポリメラーゼ連鎖反応（Mu
llis et al.,米国特許第4,683,202号）であり、この方
法では、プライマー、基質、DNAポリメラーゼおよび分
析核酸の反応混合物を、二本鎖核酸の変性に十分な温度
への加熱およびプライマーアニーリングおよび伸長が起
こり得る温度への冷却からなるｎ回のサイクルにかけ
る。この反応は、各々のサイクルの間に標的配列の各々
の鎖が（最大で）一つの新しい相補鎖へコピーされうる
ため、2n倍の最大増幅を有すると理解されている。 続いての回に使用されるプライマーにより規定される
標的領域が前の回に使用されたプライマーにより発生し
た標的アンプリコン内に含まれている二つまたはそれ以
上の連続する増幅反応を実施することにより、標的特異
的増幅の実行は増大した。非標的アンプリコンは通常、
組み込まれた（nested）プライマーの組によるさらなる
増幅に対して、存在するその他の非標的配列よりも効率
的な鋳型ではないため、非標的配列の同時増幅のために
最初の回で所望の標的の増幅が不十分であっても、発生
した標的アンプリコンは次のプライマーの組によるさら
なる増幅のための選択的利点を有するに違いない。この
戦略は、非常に低い標的レベルを検出するために、PCR
のような増幅法の能力を改良するために使用されてきた
（Conway et al.,J.Acquired Immune Def.Syndromes 3:
1059（1990）;Matsumoto et al.,J.Virol.64:5290（199
0）;Garson et al.,Lancet 336:1022（1990）；およびN
ASBA（Kievits et al.,J.Virol.Methods 35:273（199
1））。 Kacian et al.PCT/US90/03907の増殖法は、多酵素活
性（すなわち、RNAポリメラーゼ、DNA指向性（directe
d）DNAポリメラーゼ、RNA指向性DNAポリメラーゼおよび
RNAse Ｈを含む）に依存している。他の反応体とこれ
らの活性の各々の一つを有する別々の酵素とを接触させ
ることによりこれらの活性を提供することが可能である
が、好適な形態では単一の酵素、すなわち逆転写酵素を
上に挙げた最後の三つの活性の主な源として使用する。
例えば、この方法の一つの実施態様では、コリファージ
T7からのRNAポリメラーゼおよびモロネイマウス白血病
ウイルス（MuLV）からの逆転写酵素を反応に用いて、10
12倍またはそれ以上までの増幅度を支持している。 増幅生成物の蓄積の速度は、そのような非同期的、連
続的増幅法ではより複雑であるが、反応成分の簡単な物
理的性質に基づいて計算可能である。 増幅生成物の指数的蓄積はこれらのいずれの方法にお
いても無限には進行しない。存在する利用可能なコピー
されるべき鋳型の数により存在する酵素が飽和するた
め、新たなコピー生成の時間当たりの速度は極大に達す
る。従って、この系での蓄積の速度は時間とともに指数
的というより直線的なものに変化する。最後には、製造
される生成物の量は、増幅生成物に物理的に取り込まれ
るプライマーおよびヌクレオシド等の基質の分子数によ
り制限される。 発明の要約 本発明はKacian et al.により記載された方法の著し
い改良に関する。特に、本発明はその方法の感度、すな
わち、非常に少ない数しか存在しない所望の標的配列を
増幅する能力を改良するための方法に関する。 最高感度を達成するのに最も重要で支配的な障害は、
非標的配列の増幅による反応成分の競合であると考えら
れる。プライマーアニーリングおよび伸長は、プライマ
ーと高度に相補的である標的配列上で最も有効であるべ
きであるが、プライマーの３′末端に相補的である数塩
基のみを有する配列にプライマーが複合体形成し、そこ
から伸長される可能性が熱力学的に予測されており、本
分野で経験的に知られている。非標的開始の部位当たり
の頻度がたとえ低くても、反応中の非標的塩基の数は、
標的配列を選択するのに使用されるプライマーに相補的
な標的塩基の数よりも通常非常に多い。プライマーは開
始生成物内に物理的に取り込まれるため、本来の親配列
が所望の標的とほとんど似ていない場合においても続く
相補的コピーはさらなる増幅のための非常に活性な鋳型
でありうる。 異なるプライマー配列による開始の相対的特異性は非
常に広範囲に変わり得る。また、特異性は配列のみに基
づいて信頼性を持って予測することはできないが、日常
の実験により好適な配列を同定することが可能である。
しかしながら、上記の考察は次のことを暗示する。すな
わち、反応のある早い時点において非標的アンプリコン
の集団が標的特異的アンプリコンの集団よりも大きくな
るであろう可能性がより高くなるため、最良のプライマ
ーについてさえも、非標的開始による妨害の可能性は標
的分子の数が減少するにつれて重大になる。これらの集
団の大きさ間の相違は反応が進行するにつれて指数的に
増幅されることができ、このような場合には、標的特異
的生成物が検出可能なレベルに達する前に、非標的増幅
による反応成分の消耗が反応の遅延または停止を起こす
可能性がある。 二つの核酸配列間の塩基対複合体の安定性は温度が上
昇するにつれて減少することが本分野ではよく知られて
いる。ハブリッド熱安定性は塩基対形成の程度および連
続性に依存するため、上記のことにより検出可能なハイ
ブリッド形成特異性が見掛け上増加する。熱安定性DNA
ポリメラーゼを利用しうることにより、PCRについてよ
り高い反応温度を使用することができる場合、標的特異
的アンプリコンの収率の改良および非標的生成物の蓄積
の減少が観察された（Saiki et al.,Science 239:487
（1988））。反応温度選択の柔軟性は通常の実験による
PCRシステムの有効な最適化を簡便化してきた（Rychlik
et al.,Nucleic Acids Res.18:6409（1990））。しか
しながら、非常に低い標的レベルの（例えば、＜50）信
頼できる検出のためのシステムの開発は挑戦すべきこと
として残っている。 温度を上昇させることは一度形成された塩基対複合体
の寿命を減少させるが、より高い温度はまた分子間の衝
突の速度を増加させて、伸長できる可能性がある複合体
を形成する。本出願人は、非標的プライミングの量が測
定された最適条件の上および下の両方の温度で増加する
ことを見いだした。従って、温度制御のみに基づいて所
望の標的のための絶対的な特異性を期待することはほと
んどできない。 プライマー伸長の特異性を増強するために記載されて
いる他の戦略には、化学変性剤および一本鎖結合タンパ
ク質の使用が含まれる。これらの戦略はいくつかの場合
では有用であったが、統一的に良好な条件は記載されて
いない。 今の時点で、前記の三つすべての活性を保持する逆転
写酵素の熱安定変異体は知られていない。熱安定RNAポ
リメラーゼは記載されているが、T7RNAポリメラーゼの
ようによく特徴付けされたプロモーター特異性を有して
いるものはない。本分野では、所望する特性（熱安定性
を含む）を有する酵素変異体をスクリーニングし、選択
し、および／または遺伝子操作するための方法は知られ
ているが、ここに開示される方法は開始特異性の増強、
およびその結果としての標的増幅の感度の増強の挑戦に
対する別の解決法を提供する。これらの方法は、莫大に
過剰な非標的核酸存在下に少数の標的配列を有する組成
物において特に有効であり、さらに、高温処理とともに
用いることができる。 ここに開示される方法は、アンプリコンネスティング
（nesting）の概念を用いるが、第一のプライマーの組
を用いて行われた反応液の一部を第二のプライマーの組
を含む新しい反応液に移すという、従来記載されている
戦略とは著しく異なるものである。ここに記載される方
法においては、組合わさった（nested）アンプリコンの
範囲を定めるすべてのプライマーは、新しい反応液へ生
成物を連続的に移さなくてもよいように単一の反応液中
で混合することができ、さらに、最適な様式は明らかに
それらの活性間の動的な調整により奨励される。 混合物中に存在するプライマーの数および型を増加す
ると、競合的な非標的増幅を導くような反応を含む種々
の副反応の可能性を有意に増加させる。加えられた余分
なプライマーはまた主体のプライマーの組の望まれる正
常な機能を妨害する可能性がある。従って、増強の程度
が明確であるのみならず劇的な程度である条件を同定す
ることはできないことが予期された。本方法は、連続的
過程を通して機能し、二本鎖プライマー伸長生成物を熱
的に変性するための熱処理を必要としないまたは用いな
いことに注意されたい。 したがって、第一の態様において、本発明は、試験試
料中の核酸鎖の標的配列を増幅する方法を特徴とする。
この方法は、試験試料からの核酸鎖を少なくとも三つの
オリゴヌクレオチドプライマーと同時に接触させること
を含む。少なくとも一つのプライマーはプロモーター−
プライマー（すなわち、核酸鎖またはその相補体と相補
的なプライマー領域、およびRNAポリメラーゼによりそ
の二本鎖形が認識されるプライマー領域の５′の別の領
域）であり、および少なくとも一つの他のプライマーは
核酸鎖と相補的であり、および一つの他のプライマーは
核酸鎖に相補的な鎖に相補的である。本方法はさらに、
核酸鎖およびプライマーを、RNA指向性および／またはD
NA指向性DNAポリメラーゼ活性、RNAポリメラーゼ活性お
よびRNAse Ｈ活性を有する一つまたはそれ以上の蛋白
質と、本質的に一定の温度で核酸鎖中の標的領域の増幅
を可能にするプライマー伸長条件下で接触させることを
含む。 “試験試料”には臨床、農業または環境試料が含ま
れ、それらは核酸鎖をプライマーとのハイブリッド形成
に使用可能にするために前処理されていてもされていな
くてもよい。そのような鎖はここに記載された第一の接
触工程の前に他の方法により増幅されない。すなわち、
本発明の方法は、そのような試料中の核酸を増幅するた
めに直接使用することができる。前もってPCRまたはKac
ian et al.の方法により増幅する必要はない。本方法
は、本質的にKacian et al.の方法を特徴とするが、追
加のプライマーにより非標的増幅を犠牲にして、著しく
および予想されなかったように標的増幅の増強が提供さ
れる。 “オリゴヌクレオチド”とは、ホスホジエステル結合
または本分野では既知のホスホジエステル結合の類似結
合を介して連結された少なくとも二つのヌクレオシド残
基を有する核酸分子を含む。オリゴヌクレオチドのヌク
レオチド塩基部分は、アデニン、グアニン、シトシン、
チミン、ウラシルまたは他の天然に存在するまたは合成
塩基誘導体、特に別の核酸配列中の相補的塩基と複合体
を形成して二本鎖核酸構造に関与することができる塩基
でありうる。糖部分はリボース、デオキシリボース、ま
たはこれらの構造の誘導体または修飾形であろう。ホス
ホジエステル部分の多くの誘導体が本分野では知られて
おり、本発明において使用することができる。オリゴヌ
クレオチドはまた、ヌクレオシドではなく、例えば、標
識または固形支持体への連結基としてまたは他の機能性
を提供するために使用されるであろうドメインまたは残
基を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、本分野
ではよく知られた多くの方法を用いて、化学的に、もし
くは核酸ポリメラーゼを使用することにより、または天
然に存在する核酸を処理することにより合成することが
できる。 “プライマー”とは、適したヌクレオシド−５′−ホ
スホリル（または等価物）残基の共有結合による付加の
ためのレセプターとして核酸ポリメラーゼにより使用さ
れる分子を意味する。プライマーの配列を制御し、それ
によりポリメラーゼに影響を及ぼしてプライマーと相補
的な配列に隣接する所望の標的配列をコピーすることが
簡単であるため、３′末端が伸長可能なオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして使用するのが都合がよい；しか
しながら、いくつかの蛋白質等のプライミング活性を有
する他の分子も知られている。 “プロモーター−プライマー”とは、RNAポリメラー
ゼと相互作用してRNAポリメラーゼに所望の鋳型の転写
を起こさせることができる配列または構造的特質をも有
するプライマーを意味する。本実施例で使用されるプロ
モーター−プライマーは、例えばHIVゲノム中の所望の
標的に相補的である配列に連結されたT7RNAポリメラー
ゼのための有効なプロモーターの一部であることが知ら
れている配列からなるオリゴヌクレオチドである。他の
プロモーター配列も知られており、用いることができ
る。例えば、T3RNAポリメラーゼおよびSP6RNAポリメラ
ーゼのためのプロモーターが含まれる。相対的に特異的
な転写を促進するために他の戦略を用いることもでき、
これらもこのプロモーター−プライマーの定義に含まれ
ることを意図するものである。例えば、DNA鋳型、特に
発生期のRNA転写産物に似ているヘテロトリプレックス
構造（時にはＲ−ループと呼ばれる）中の鋳型にハイブ
リダイズするRNAオリゴヌクレオチドは、RNAポリメラー
ゼにより伸長され、所望の標的鋳型のRNA相補体が得ら
れる。 “標的領域”または“増幅標的”とは、連続的な核酸
ポリマー化による配列またはその相補体の複製により増
幅されることが望まれる連続するヌクレオチド残基の配
列を意味する。全標的領域のヌクレオチド配列を知る必
要はないが、少なくとも一つの相補的プライマーおよ
び、標識された相補的プローブとのハイブリッド形成に
よること等による増幅生成物の特異的検出に使用しうる
配列を設計するのに十分な配列を知ることは役に立つ。 句“非標的核酸”には、そのような所望の標的領域中
に含まれないすべての配列が含まれる。これらには、例
えば、標的領域と同一のゲノム上に存在する他の配列、
反応系に存在する他のゲノムからの核酸またはそれらの
遺伝子生成物（例えば宿主細胞からのまたは環境夾雑物
からのもの）および反応系に計画的に添加された核酸
（例えばプライマー）が含まれるであろう。 好適な実施態様においては、核酸鎖は一本鎖DNA鎖で
あるかまたは二本鎖DNAの変性により一本鎖に変換され
るものである；核酸鎖およびプライマーは、最初に60℃
またはそれ以上で活性なDNAポリメラーゼ活性を有する
酵素と60℃またはそれ以上で接触させ；第二の接触工程
は、逆転写酵素およびRNAポリメラーゼの存在下42℃ま
たはそれ以上であり；四つのプライマーが第一の接触工
程で使用され；少なくとも一つのプライマーが他のプラ
イマーと異なる濃度で提供され；すべての酵素活性は逆
転写酵素およびRNAポリメラーゼにより提供され；しか
しその酵素活性はDNAポリメラーゼ活性を有しないRNseH
により補充されてもよく;DNAポリメラーゼは５′−３′
エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、およびバシラ
ス（Basillus）種：例えば、種バシラス ステアロテル
モフィラス（Bacillus stearothermophilus）またはバ
シラス カルドテナックス（Bacillus cardotenax）のD
NAポリメラーゼＩから誘導され；二つの外側プライマー
は前記核酸鎖またはその相補体に最大2000、500または3
50塩基離れてハイブリダイズし；および一つのプライマ
ーは１から10μＭの間の濃度で提供され、および別の前
記プライマーは10から50μＭの間の濃度で提供される。 別の好適な実施態様においては、二つのプライマーは
プラス−センスプライマーであり、内側のプラス−セン
スプライマーはプロモーター−プライマーである；また
は二つのプライマーはマイナス−センスプライマーであ
り、外側のマイナスセンスプライマーはプロモーター−
プライマーである。位置および極性の参照は図１の構造
に関して下記の意味を有するように意図されており、標
的領域が見いだされる遺伝子系に慣用的な極性呼称には
依存しない。従って、図１のT74116および4196は、ここ
では内側プライマーと考えられ;T74312および／または4
009は外側プライマーであると考えられる。プライマー
のこのアレイにより生じ得るアンプリコンに関して、内
側プライマーにより範囲を定められる標的領域内の配列
は高度に増幅されることが期待される。なぜなら、一つ
または両方の外側プライマーにより範囲を定められる増
幅生成物は、相補的内側プライマーによるアニーリング
の標的であるが、逆は必ずしも正しくないからである。
従って、図１の内側プライマーにより範囲を定められる
標的領域は主標的領域と考えられ、T74116は主プロモー
ター−プライマーの例である。 主プロモーター−プライマーに相補的である内因性標
的領域のセンスは負またはマイナスセンスと定義されて
おり、同様に、同一の配列センスを有する存在するその
他の核酸もマイナス標的鎖である。したがって、主プロ
モーター−プライマーは陽またはプラスセンスとして定
義され、マイナスセンス核酸に相補的である存在するそ
の他の核酸も同様である。標的領域を含む内因性鋳型の
負の形が一本鎖核酸分子（例えば、RNA）であっても、
これらの帰属が有効であることは当業者には明らかであ
ろう。なぜなら、この鎖は相補鎖を独特のものとして特
定するための十分な情報を含み、そのような相補体は反
応成分により合成できるからである。 本発明のその他の特色および利点は、下記の好適な実
施例および請求の範囲の記述から明らかになるであろ
う。 好適な実施例の説明 最初に簡単に図について説明する。 図 図１はpol1標的領域の構造に対して相対的なプライマ
ーの位置の図的表現であり； 図２は増幅イニシエーション法IM1、IM2およびIM3プ
ロトコールの図的表現であり； 図３は外側T7プライマーの伸長によるイニシエーショ
ンのための可能なスキームを示す図的表現であり；そし
て 図４は標的特異的イニシエーションをより効率的にす
ることを助けるであろう、4009プライマーの続いての伸
長によるT74116プライマー伸長生成物の鎖置換活性の可
能性を示す図的表現である。 実施例 以下の実施例は本発明を制限するものではない。当業
者はこれらの実施例の変形は付随する請求の範囲に記載
される本発明の範囲内であることを認識するであろう。
特に、試薬の特定の量およびそれらの比率、および使用
された特定の酵素および核酸を変化させて、任意の選択
された標的を増幅することができる。これらの実施例に
おいては、ある種の用語は以下のように用いられる。 “イニシエーション”とは、内因性鋳型配列がコピー
されるかまたは標的領域またはその相補体（これが所望
の標的配列であるにしろないにしろ）のRNAコピーへ効
率的に転写できるような形へ変換される過程を意味して
いる。Kacian et al.の増幅法では、特定の標的におけ
るイニシエーションは、そのようなRNA生成物が反応工
程のサイクルに鋳型として関与できるようになったとき
に完了し、それは転写されて本質的に同じRNA分子を生
成しうる鋳型のデノボ形成を導くことができる。（この
RNA分子はその前駆体と配列が同一ではないであろう
が、少なくともさらに増幅されるのに十分な配列類似性
を保持している。） “アンプリコン”とは、増幅サイクル中の一つの反応
の生成物であり、さらなる増幅のために鋳型として働く
能力を保持している核酸を意味する。 “プレイニシエーションされた鋳型”とは、アンプリ
コンの性質を有している核酸を表すために使用される。
すなわち、これは最初にイニシエーション反応の一つに
関与することなく増幅サイクル中の一つの反応の鋳型と
して働くことができる。プレイニシエーションされた鋳
型はまさに前の増幅反応のアンプリコン生成物である
か、またはPCR、化学合成またはクローニング等の方法
によりアンプリコン活性の実験モデルとして合成的に構
築されるであろう。 上で示唆したように、増幅反応は二つの段階を有する
ものとして認識できる。一つの段階はコピーされるかま
たは機能性アンプリコンに変換されるべき内因性鋳型を
生じる反応工程を含み、第二の段階は本質的に周期的な
増幅過程の一部である工程を含む。増幅工程の中間体お
よび生成物は、本来の内因性鋳型にかかわらず本質的に
類似するが、使用されるイニシエーション工程は内因性
鋳型の性質に依存している。Kacian et al.（上記文
献）の標的増幅法に対する種々のイニシエーション戦略
が以前に記載されている；ここで便宜のためにそのいく
つかを簡単に説明し、図２に図式的に示す。 図２を参照すると、イニシエーション法１（IM1）は
内因性鋳型がDNAであるイニシエーション法を表してい
る。プロモーター−プライマーが相補的標的にアニーリ
ングしうる条件下、DNAポリメラーゼ活性を加えてプロ
モーター−プライマーの伸長による標的鋳型に対する相
補体を合成する。反応液を加熱して（例えば、95℃）二
本鎖DNA生成物を変性させ、第二のプライマーが新たに
合成された伸長生成物上の相補的配列にアニーリングし
うる温度まで冷却する。適した酵素（例えば、RNAポリ
メラーゼ、逆転写酵素および任意にRNAseH）を添加した
時、第二のプライマーはDNAポリメラーゼ活性により伸
長されることができ、プロモーターに連結された標的領
域の二本鎖コピー、すなわちRNAポリメラーゼのための
活性な鋳型が生成される。 イニシエーション法２（IM2）は内因性鋳型がDNAであ
るイニシエーション法を表している。最初のプライマー
伸長生成物を変性させるために反応液を加熱しなくて
も、単に酵素（RNAポリメラーゼ、逆転写酵素および任
意にRNアーゼＨを含む）の添加だけで効率的なイニシエ
ーションが十分に得られる。等温反応液中の固有の過程
を通じて適格なアンプリコンが反応液中に生成する。 イニシエーション法３（IM3）は内因性鋳型がRNAであ
るイニシエーション法を表している。反応系を組み立
て、単一の酵素（例えばRNAポリメラーゼ、逆転写酵素
および任意にRNAseHを含む）を添加する。プロモーター
プライマーの最初の伸長の二本鎖生成物はRNA/DNAハイ
ブリッドである。RNA鎖は存在するRNAseHの基質であ
り、分解されて標的領域に連結されたプロモーターの一
本鎖コピーが得られ、次にこれは上記のように第二のプ
ライマーの伸長のための鋳型となる。 術語“反応失敗”または“増幅失敗”は、ここで使用
される限り、増幅が起こらなかったことを示すことを意
味するのではなく、単に所望の標的配列のコピーが生成
物の中で検出できなかっただけである。このことは分析
される核酸の中に所望の標的がなかったことを示してい
るであろう。これはまた、十分に有効でなかった標的特
異的イニシエーションまたは増幅から生じたものであろ
う。例えば、たとえ多くの特異的イニシエーションが起
こったとしても、もし非標的配列上のイニシエーション
により過剰の競合的アンプリコンが生成すれば、標的特
異的イニシエーションは有効でないかもしれない。下記
の実施例に示されるように、本発明は現存する方法の十
分な改良を提供し、反応中間体を変性させるための追加
の加熱工程を必要とせずに試料中の標的核酸の１−５程
度の少ないコピーの検出を可能とする。 一般法 この節に記載される操作またはそのわずかな変更を下
記の実施例のほとんどにおいて使用した。例外および修
正は各々の実施例に詳しく説明されている。 以下はIM2増幅反応の例である。 １）以下の成分を含む溶液を調製し、25μｌの容量に分
配した： 200mM トリス・HCl（約20−25℃でpH8.0） 70mM MgCl2 8mM スペルミジン 0.4mM デフェロキサミン メシレート 25mM GTP＆ATP各々 10mM UTP＆CTP各々 0.8mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP各々 0.6μＭ T74116プロモーター−プライマー 1.2μＭ 4195プライマー 20％（v/v） グリセロール 実施例に使用されたプライマーは図に示されている。
それらは以下の配列を有している：配列ID番号１（400
9）:5′−ATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAA−３′；配列ID番
号２（T74116）:5′−［AATTTAATACGACTCACTATAGGGAG
A］CAAATGGCAGTATTCATCCACA−３′；配列ID番号３（419
5）:5′−GTTTGTATGTCTGTTGCTATTAT−３′；および配列
ID番号４（T74312）:5′−［AATTTAATACGACTCACTATAGGG
AGA］CCCTTCACCTTTCCAGAG−３′。（プロモーター配列
は括弧内に示されており、本発明において他のプロモー
ターを使用することができる。）T74116、4195およびT7
4312のHIV配列は以前に開示されている（McDonough et
al、米国特許出願第08/040,745、ここに引例として含ま
れている）。 ２）この混合物に分析されるべき核酸を含む50μｌの試
料を加えた。モデル参照系試料は、80mMの酢酸カリウム
に溶解した１から10μｇの精製ヒト白血球（WBC）DNAを
含む。WBC DNAは種々の既知の方法により調製すること
ができる（Maniatis et al.,Molecular Cloning,a labo
ratory manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,NY,1982参照）。もしくは、実施例４に記載し
たように調製された50μｌの加水分解WBC溶解物を使用
した。反応液には陰性対照の場合には５μｌの水を加
え、増幅効率試験のためには既知の量の精製クローン化
HIV核酸を含む５μｌの溶液を加えた。 ３）混合物を95℃に加熱し、この温度に５分間維持し
た。次に42℃に移し、この温度まで放置して冷却させ
た。 ４）800UのモロネイMuLV逆転写酵素（RT）および400Uの
T7RNAポリメラーゼを含む20μｌの溶液を、50mMトリス
・HCl（pH8.0）、10mM酢酸カリウム、100mM Ｎ−アセ
チル−Ｌ−システインおよび20％（v/v）グリセロール
を含む溶液に加えた。 ５）これを軽く混合し、42℃で２時間インキュベートし
た。 ６）意図する標的配列を含む増幅生成物の生成は、特異
的ハイブリダイゼーション法を用いて決定した。ここに
記載したすべての実験について、ハイブリダイゼーショ
ン保護アッセイ（Arnold et al.,Clin.Chem.35:1588（1
989）およびPCT/US88/03195）を使用した。 下記の実施例においては、特に指示しない限り、IM2
実験においてpol1プライマーは上に掲げた濃度で使用し
た（すなわち、100μｌ反応液当たり15ピコモルのT7411
6および30ピコモルの4195）。gag11プライマーを使用し
た場合は、100μｌ反応液当たり各々30ピコモルのT7811
および872を加えた。 基本的IM2法の以下の改良法を用いて、増強されたイ
ニシエーション効率のための戦略を試験した。 1a）反応成分の混合物をIM2法の工程１に記載されたよ
うに調製した。任意に、追加のオリゴヌクレオチドを外
側プライマーとして添加した、例えば、pol1増幅につい
て各々反応液当たり３ピコモルの4009およびT74312。 2a）この混合物に、分析されるべき核酸を含む50μｌの
試料を加えた。モデル参照系試料は、80mMのKOAcに溶解
した１から10μｇの精製ヒトWBC DNAを含む。もしく
は、実施例４に記載したように調製された50μｌの加水
分解WBC溶解物を使用した。反応液には、陰性対照につ
いては５μｌの水、または既知の量の精製クローン化HI
V核酸を含む５μｌの溶液を加えた。 3a）混合物を95℃に加熱し、この温度に５分間維持し
た。次に60℃に移し、この温度まで放置して冷却した。 4a）任意に、50mMトリス・HCl（pH8.0）、10mM酢酸カリ
ウム、100mM Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよび20
％（v/v）グリセロールを含む溶液に熱安定性DNAポリメ
ラーゼを溶解した溶液10μｌを加えた。試験された酵素
およびその望ましい性質は、以下の実施例において記載
される。 5a）反応液を軽く混合し、60℃で10分間インキュベート
した。 6a）反応液を42℃に移し、この温度まで放置して冷却し
た。 7a）800UのモロネイMuLV逆転写酵素および400UのT7RNA
ポリメラーゼを含む溶液10μｌを、50mMトリス・HCl（p
H8.0）、10mM酢酸カリウム、100mM Ｎ−アセチル−Ｌ
−システインおよび20％（v/v）グリセロールを含む溶
液に加えた。 8a）反応液を軽く混合し、42℃で２時間インキュベート
した。 9a）意図する標的配列を含む増幅生成物の生成は、ハイ
ブリダイゼーション保護アッセイ（Arnold et al.、上
記文献）等の特異的ハイブリダイゼーション法を用いて
決定した。 用いた外側プライマー（用いた場合には）、およびそ
れらの濃度は各々の実施例に記載される。 イニシエーション効率の最も有用な指標は、個々の反
応における増幅の程度よりむしろ特定の鋳型レベルに対
する反応失敗の頻度であることが見いだされた。従っ
て、試験した各々の条件について、改良されたイニシエ
ーション効率が失敗頻度の統計的に有為な減少により同
定できるように、多複製反応を用いて実験を組み立て
た。さらに、複製反応のシグナルの幾何平均（G.M.）は
イニシエーション効率と良く相関し、ほとんどの実施例
で示されている。 実施例に記載される実験で使用したHIV鋳型は、HIV配
列のプラスミドクローンを含む大腸菌から標準的な方法
で精製した（例えば、Maniatis et al.上記文献を参照
されたい）。BH10 DNAを特定する実験においては、鋳
型は、本質的にGenbankにHIVBH102（受入番号M15654
号）として記載されている8932のヌクレオチド配列に相
補的鎖を加えた精製二本鎖線状DNAであった。他の実験
では、標準pUCクローニングベクター中にBH10のgagおよ
びpol遺伝子を含む線状化プラスミドDNA（pUCHIV）を使
用した。両方の鋳型とも並列比較において分子当たり実
質上同一の鋳型活性を有していた。 精製後、各々の調製物試料により吸収される260nm紫
外光の量（A260）を測定することにより、これらの調製
物中のDNA濃度を決定した。これらのDNA化学種の各々の
ヌクレオチド配列（従ってその長さ）は既知である。そ
のような調製物のモル濃度は標準変換因子を適用するこ
とにより決定した：二本鎖DNAの質量濃度＝50μgml-1A
260 -1;二本鎖DNAの分子量＝長さ（bp）x650g mol-1bp
-1。５μｌ当たり≧108鋳型濃度での鋳型DNA保存溶液
（33pM）を別々のアリコートに分けて凍結した。各々の
増幅実験について鋳型のアリコートを融解し、反応液に
添加するため所望の作業濃度に連続的に希釈した（例え
ば、５μｌ当たり５の鋳型）。融解したアリコートおよ
び希釈物は各々の実験後に廃棄した。 実施例1:イニシエーション効率 イニシエーション効率に対する種々の反応パラメータ
ーの影響を定量的に評価するため、与えられた変化に応
答する増幅効率とイニシエーション効率の変化とを区別
する方法を開発することが望まれた。このことは、例え
ば、最適の増幅実施に好まれる条件は、最適なイニシエ
ーション効率が得られる条件には必要とされないことが
見いだされたため、必要であった。これを達成する一つ
の方法は、種々の反応組成物または処理概要の固有の増
幅実施の指標として、反応液にプレイニシエーションさ
れた鋳型を加えるか、または、これらの結果を天然の標
的配列の添加により生じる増幅の結果と比較することで
あった。 この方法を用い、非標的配列の増幅と競合せず、標的
由来のアンプリコンのイニシエーションがいかに迅速か
つ広範囲にちがいないかを決定することが可能であっ
た。増幅の経時変化を実施した。ここでは、反応系を種
々の所望の試験条件に従って組み立てたが、標的鋳型は
除かれている。RTおよびRNAポリメラーゼ酵素の添加に
より反応が開始した後の種々の時間に鋳型を加え、生じ
る最終的な増幅程度を下記のように決定した： １）下記の成分を含む混合物を調製し、この溶液の85μ
ｌを各々の反応管に分配した。掲げた濃度は全反応液10
0μｌ中の各々の濃度を示している。 50mM トリス・HCl（室温でpH8.0） 17.5mM MgCl2 5mM ジチオスレイトール 2mM スペルミジン 6.25mM GTP＆ATP各々 2.5mM UTP＆CTP各々 0.2mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP各々 0.3μＭ T74116プロモーター−プライマーおよび
4195プライマー各々 ３μｇ ヒトWBC DNA ２）反応液を95℃に７分間加熱し、37℃に移し、５分間
放置してこの温度まで冷却させた。 ３）モロネイMuLV逆転写酵素（600U）およびT7 RNAポ
リメラーゼ（400U）を、緩衝液（10mMトリス・HCl、pH
8.0）、10mM酢酸カリウム、および5mMのジチオスレイト
ール）10μｌ中の各々の反応液に加えた。 ４）酵素添加後の種々の時間に、100コピーの一本鎖BH1
0 DNA（精製クローン化HIV DNA、前もって煮沸により
変性させた）または10コピーのプレイニシエーションさ
れた鋳型を５μｌの容量で各々の反応液に加えた。それ
ぞれの時間点および条件の３つのレプリカを処理した。 ５）２時間後、標的特異的増幅生成物の収量をハイブリ
ダイゼーション保護アッセイ（Arnoldら、上記文献）に
より決定した。 各々の条件についての３つのレプリカのシグナルの幾
何平均の分析は、もし非標的核酸の存在下、標的核酸の
非存在下に、10分という短い時間に増幅生化学が進行す
れば、10個のプレイニシエーションされたアンプリコン
でさえも検出可能なレベルには増幅できなかったであろ
うことを示している。さらに、プレイニシエーションさ
れた鋳型について観察されたような増幅の経時変化と本
質的に同様な変化を達成するには、約10倍以上の内因性
鋳型が必要とされた。この相違は、プレイニシエーショ
ンされた鋳型が増幅サイクルに速やかに入るのに対し、
すでに存在している非標的アンプリコンは、コピーされ
るべき天然の鋳型がイニシエーション反応を経て増幅可
能形になるために必要な時間の間、指数的に蓄積を続け
ることにより説明される。これらの条件の各々につい
て、増幅過程を始めるために逆転写酵素およびRNAポリ
メラーゼを添加して３−５分後以内に標的特異的増幅能
力の90％以上が失われた。非標的プライミングおよびイ
ニシエーションの有意なレベルを期待していたにもかか
わらず、効果的なイニシエーションのためのこの機会の
枠の非常な短さは非常に驚きであった。ここで、並びに
多くの同じような実験において観察された傾向は、阻害
が、高レベルの非標的イニシエーションに由来する増幅
による必須の反応成分の過剰な消耗によるためであるこ
とを示唆している。 Kacianら（上記文献）により記載されている方法の通
常の最適化により開発された増幅システムを用いて、多
くの場合比較的低い標的レベルを検出することが可能で
あった。例えば、IM2法およびpol1プライマーの組を用
いて、≧50HIVゲノムを含むほとんどすべての試料、お
よび20HIVゲノムを含む約2/3の試料を検出することがで
きた。この性能は非常に強力な増幅を反映しており、ほ
とんどの目的に適用できるであろう。しかしながら、さ
らに高い感度が望まれる場合があ。HIVはその核酸が全
血等の感染組織中に非常に低濃度でしか存在しない病原
体の一つの例である。HIV核酸の信頼できる検出には、
少なくとも一つの標的が存在することを確実にするた
め、時にはかなりの試料量（例えば、≧0.1−1mlまたは
それ以上の血からのWBC）を必要とする。そのような試
料からの核酸抽出物は、非標的DNAが＞20μｇ存在する
中に一個のHIVゲノムを含むであろう。実施例１で明ら
かにしたように競合的非標的増幅の非常に攻撃的な特性
は、そのような試料における標的の検出が非常に挑戦す
るのに値する目標であり、通常の実験では期待できなか
ったことを明らかにしている。 実施例2:熱安定性DNAポリメラーゼ この実施例は、ここに記載した原理の応用により有意
の感度の増加を達成しうることを示している。表１に示
した試料ＡおよびＢヲ、上記の一般法に記載したような
標準IM2法を用いて処理した；すなわち、試料を95℃か
ら直接42℃に冷却し、逆転写酵素/T7 RNAポリメラーゼ
混合物を添加して反応を開始した。試料（Ｃ−Ｆ）は、
前に記載したように95℃から60℃に冷却し、2UのB.ステ
アロテルモフィラス（stearothermophilus）（Bst）DNA
ポリメラーゼを各々に加えて10分間インキュベートし
た。次に試料を42℃に冷却した後、逆転写酵素/T7 RNA
ポリメラーゼ混合物を添加した。各々の反応液に、反応
液当たり平均５つの鋳型になるように希釈した精製クロ
ーン化HIV DNA（pUCHIV）を加えた。 生成した標的配列の量は、表１−７において相対的光
単位（RLU）、すなわち検出プローブ上の化学発光標識
から得られる信号の量で表現されている。 陰性対照（pUCHIVなし）のRLU値は、これらの各々の
条件について（Ａ−Ｆ）各々2591、3097、2471、3569、
3459および6030であった。 これらの結果は、Bstポリメラーゼによる高温イニシ
エーション工程（Ｃ）を用いるかまたは42℃でも外側プ
ライマーが含まれていると（Ｂ）、各々単独でイニシエ
ーション効率を増強しうることを示している。最も劇的
な増強は、外側プライマーのいずれかの存在下、60℃補
充イニシエーション工程を実施した時（Ｄ、Ｅ）に観察
され、最良の条件は両方の外側プライマー、並びにBstD
NAポリメラーゼを用いる60℃補充イニシエーションを含
むものであった（Ｆ）。 実施例3:プライマー滴定 この実施例は、増強されたイニシエーション系のいく
つかの驚くべき性質を示しており、それはこれらの増強
が従来の技術からでは自明でも予測可能でもないとを明
らかにしている。 外側プライマーの最も有効な濃度を滴定により決定し
た。この実施例においては、表２に示されているよう
に、T74312プロモーター−プライマーおよび4009プライ
マーの両方が等モルレベルで含まれていた。この実験は
また、イニシエーション増強が主としてプライマーネス
ティングによるものか、高温度工程のみによるものか、
DNAポリメラーゼ存在下での高温インキュベーションに
よるものか、またはこれらの因子のいくつかの組み合わ
せによるものかを決定することも意図していた。Bstポ
リメラーゼおよび外側プライマーを含まない反応条件
（Ａ）を、上記一般法で概説したような標準IM2法イニ
シエーション（すなわち、60℃工程なし）を用いて実行
した。他のすべての試料には60℃インキュベーション工
程を施し、Bstポリメラーゼが反応液に含まれる場合と
含まれない場合があった。 表に示した各々の試料には、平均で５分子のpUCHIV
DNAを加えた。陰性対照もまた各々の反応条件で行っ
た；陰性対照に対するRLU値はＡ−Ｇについて各々148
1、3073、1888、1579、2150、1685、および2038であっ
た。 前記のごとく、反応に含まれる余分なプライマーは、
標的配列上の余分なイニシエーションを促進することに
より標的特異的増幅を阻害することが可能である。この
ような反応中の余分なプライマーによる所望の増幅の妨
害の可能性がここで観察されている、すなわち、より高
い温度のプレイニシエーション工程なしに各々0.5また
は１ピコモルの外側プライマーを用いる反応において
（Ｂ、Ｃ）。対照的に、各々３ピコモルの外側プライマ
ー（Ｄ）からは、標準IM2イニシエーション条件（Ａ）
よりも著しく良好なイニシエーション効率が得られた。
60℃プライマー伸長工程が含まれると（Ｅ−Ｇ）、組み
合わされた（nested）プライマー戦略が有効な範囲が広
がったのみでなく、前の実施例のように最良の外側プラ
イマー条件（Ｇ）との相乗効果により印象的なイニシエ
ーション効率が得られた。 実施例4:粗溶解物 この実施例は、適当な処理後の患者の試料の典型であ
る粗溶解物に応用された場合、イニシエーション増強が
機能的であるだけではなく、より価値を有することを示
している。そのような溶解物の複雑で変化しやすい化学
組成のため、少なくともいくつかの増幅法では精製され
た成分を含む系よりも溶解物では効率が悪いことが典型
的である。従って、モデル参照系反応のような精製され
た成分を含む反応系と同じような標的レベルでも、信号
はおそらくしばしばより低くおよび／または観察されな
いであろう。 １）抗凝血物質としてのEDTAで処理された全血を、0.25
Mスクロース中に1.110g/mlの密度でパーコールを含む等
量の密度遠心分離培地（DCM）と混合した。混合物は160
0×ｇで20分間遠心分離した。 ２）平衡化混合物のメニスカスに形成されたバンドをピ
ペッティングすることにより、単核WBC（MNC）を採取し
た。DCM/MNC懸濁液を等量の0.14M KOHと混合し、良く
混ぜて95℃で30分間加熱した。 ３）室温まで冷却後、得られた加水分解物に： 0.65N 酢酸 0.066M トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン［トリス塩基］ 0.084M トリス・HCl を含む溶液を10分の１容量加えてpH8.0±0.5に調整し
た。 ４）増幅反応液にこの溶解液を50μｌ、または１μｇの
精製ヒトWBC DNAの80mM酢酸カリウム溶液を50μｌ（比
較系）加えた。 試験反応には表３に示した数のpUCHIV鋳型を加えた。
各々の条件（Ａ−Ｄ）に対して１回の陰性対照反応を行
い、これらの値は各々2988、2179、5740および5602RLU
であった。 参照系（標準IM2）（Ａ）の結果は良好なイニシエー
ション効率を示したが、増強系（Ｂ）は有意により良好
であるのは明らかである；これらの条件下、10の信号す
べてが事実上飽和している。さらに、溶解物試料の結果
（Ｃ、Ｄ）は、イニシエーション増強を用いることによ
りいかに多くの利点が達成できるかを非常に明瞭にして
いる。 実施例5:外側プライマー この実施例は、溶解物の存在下、低い標的レベル（3p
UCHIV）の挑戦的条件のもとでの各々の外側プライマー
を用いて得られた増強効果の再試験である。すべての反
応に1UのBst DNAポリメラーゼを加え、60℃で10分間イ
ンキュベーションした。使用した外側プライマー（反応
当たり各々３ピコモル）および試験された組み合わせは
表４の最初の列に示されている。プライマー4312bはT74
312と同様にHIVに相補的な配列と同一の配列を有する
が、プロモーター配列を有していない。 各々の条件について、10個のレプリカ反応から得られ
たRLU値を表４に示す。表４の最下列はその条件の個々
のレプリカの結果の幾何平均を示す。各々の条件（Ａ−
Ｅ）について、陰性対照の結果は各々776、2850、405
3、3875および4126RLUであった。 実施例２で以前に見られたように、これらの結果は、
4009不在下でも外側プロモーター−プライマーT74312が
増強されたイニシエーションを促進することができるこ
とを示している。さらに、相同的非プロモーター−プラ
イマー4312bが外側プライマーなしの対照条件ではイニ
シエーションを有意に促進しなかったため、これらの結
果はT74312の増強能力はプロモーター部分からの恩恵で
あることを強く示唆している。これらの結果を説明する
一つの可能な機構は図３に示されている。T74312が通常
の方法でその相補体上に伸長されることによりIM2過程
をイニシエーションしうることはありそうである。主プ
ロモーター−プライマーT74116によりプライミングされ
る正常のイニシエーション工程は異なった鎖で起こるた
め、これは上述の工程により妨害されるはずがないこと
に注目されない。 T74312はより低い濃度で存在しているため、この反応
におけるT74312によるイニシエーションは、T74116によ
るものより効率的ではないことが予測されるであろう；
しかしながら、首尾よく完了したT74312イニシエーショ
ンは多数の一本鎖RNAを生じ、それらはT74116による高
度に効率的なIM3型イニシエーションの鋳型であり、反
応の初期の段階の間に反応性を有するpol1アンプリコン
の蓄積を著しくかつ好ましく加速することができる。両
方の鎖上の高度に効率のよい転写は有効な増幅を阻害す
ることが観察されているため、外側プロモーター−プラ
イマー（例えば、T74312）が内側プロモーター−プライ
マー（例えば、T74116）よりも反応においてより低い活
性を有することがおそらく望ましい。 異なる配列は、同一の濃度においてさえもその各々の
相補体へのハイブリッド形成の異なる速度を有すること
ができることに注目されたい。従って、二つの異なるオ
リゴヌクレオチド配列に対するプライミング活性の比は
それらの濃度の比と同一ではないであろう。しかしなが
ら、二つの異なるプロモーター−プライマーの相対的な
活性の最初の見積としてはモル濃度が有用であり、最適
の比は通常の実験により決定することができる。さら
に、ハイブリッド形成速度を定量するための方法は本分
野ではよく知られており、有効濃度の明かな例外の解決
に使用できる。 T74312の伸長によりイニシエーションされた転写的に
活性な化学種の形成の完了に働くであろうという役割
（図３に図解されている）に加えて、4009がイニシエー
ション効率を改良していることは明らかである。非プロ
モーター−プライマー4312bと対を形成する時でさえ
も、4009の存在はこの実験において明かな促進を起こす
だけでなく、それはいずれかの4312化学種の不在下でも
実施例２における増強されたイニシエーションも促進さ
せた。 これらの観察と一致する可能な促進機構が図４に示さ
れている。ここで、プライマー4009はDNA合成をプライ
ミングすることができ、これは内側プロモーター−プラ
イマーT74116から伸長された以前に合成されたDNAを置
換しうる。外側プライマーが最初に伸長され、主標的領
域を二本鎖にして内側プロモーター−プライマー（例え
ば、T74116）によるイニシエーションができないように
することがないように、この外側プロモーター−プライ
マーは内側プロモーター−プライマーよりも低い活性を
有することが望ましい。 実施例6:DNAポリメラーゼ特性 この実施例で示されている実験は、補充したDNAポリ
メラーゼの熱安定性以外の性質がイニシエーション増強
機構に重要であるかどうかを決定するために行った。表
５に示された結果は各々それ自体の目的を有する三つの
異なった実験からのものであるが、各々の酵素の相対的
長所を判断するために参照系として比較しうる同様の対
照を各々含む。“ナシ”と付けた下段の群のRLU値は、
外側プライマーおよび熱安定性DNAポリメラーゼなしで
インキュベートされた標準IM2反応からのものである。
“Bst−1"と付けられた中段の群は、一般法に記載さ
れ、およびBio−RadからのBst DNAポリメラーゼを使用
した増強イニシエーション法を用いて処理した。上段の
群は、カラムの頭に示した別の熱安定性DNAポリメラー
ゼの一つに置換した同じ増強イニシエーション法の結果
を示している。“Bst−2"は第二の販売元（Molecular B
iology Resources）からのBstポリメラーゼの試料を示
している；“Bca"はバシラス カルドテナックス（Baci
llus caldotenax）からのDNAポリメラーゼ（Takara）に
対応する；“REPLIT−HERMTM"はEpicentreから入手可能
なDNAポリメラーゼである；“KLENTAQTM"DNAポリメラー
ゼ（Abペプチド）は以下に記載するようにテルムス ア
クアチカス（Thermus aquaticus）DNAポリメラーゼの誘
導体である。試料はすべて一般法に記載した増強イニシ
エーション法を用いて取り扱った。示された各々のDNA
ポリメラーゼを、10分間の60℃インキュベーション工程
で使用した。反応液はWBC溶解物を含むか、または参照
系であり、表５に示された平均鋳型接種物を加えた。 表５は、Bst以外のいくつかの熱安定性DNAポリメラー
ゼもまた外側プライマーと提携して増強されたイニシエ
ーション効率を支持することができることを示してい
る。別の実験において、いくつかの他の熱安定性DNAポ
リメラーゼは組み込まれたプライマーと共働して作用せ
ず、促進されたイニシエーションが得られないように思
われた。これらにはテルムス アクアチカス（Thermus
aquaticus）（Taq）、テルムス フラバス（Thermus fl
avus）（Tfl）、テルムス テルモフィラス（Thermus t
hermophilus）（Tth）、テルモコッカス リトラリス
（Thermococcus litoralis）（VentTM、New England Bi
olabs）またはRetrothrmTM（Epicentre）からの天然のD
NAポリメラーゼが含まれる。これらのいくつかは、外側
プライマーなしで反応の最初の10分の60℃プライマー伸
長工程に用いた場合、標準IM2と比較して改良されたイ
ニシエーション効率を与えた；しかし、この改良は上述
の完全に増強された系と同等の程度になることはなかっ
た。 完全な促進イニシエーションを支持した４つのポリメ
ラーゼ酵素は、少なくとも一つの共通の性質を有してい
る。すなわち、それらの効率に寄与するであろう５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性が欠失している。Bst、Bca
およびKLENTAQは各々大腸菌DNAポリメラーゼＩの相同体
である。これらの群の酵素に通常観察される５′→３′
エキソヌクレアーゼは、両方の販売元によりBstの精製
の間に蛋白質分解により除去される。BcaおよびKlenTaq
は両方ともこの活性に欠陥ある突然変異体遺伝子の各々
のクローンからの発現により製造される。REPLITHERMは
その販売元からエキソヌクレアーゼ活性が欠失している
と報告されている。この相関から、増強機構が５′→
３′エキソヌクレアーゼ欠失から恩恵を受けることが示
唆され、Taqポリメラーゼの天然の親形に比較して優れ
たKLENTAQの効力によりさらに確証される。 これらおよび他の実験において、バシラス（Bacillu
s）種からの三つのポリメラーゼはREPLITHERMまたはKLE
NTAQよりもより一貫した、安定な増強を支持するようで
あった；従って、これらの三つの関連する酵素はそれら
を他の二つから区別する性質を共有しているのであろ
う。一つの可能性は、DNAポリメラーゼ間で異なること
が知られている効率的鎖置換活性が図４に示したような
機構に寄与しているかもしれないことであるが、他の可
能性も排除できない。 これらの洞察は、完全増強系により与えられた恩恵
は、単に熱安定性DNAポリメラーゼにより可能となった
高められたプライマーアニーリングストリンジェンシー
という簡単な窓口に依存するのみではなく、ここに形成
されたような系が従来の技術からでは自明ではなく予測
できない機構的利点を有することを示している。 実施例7:他の標的領域 pol1以外の標的領域についてもイニシエーション増強
を試験し、これが働くことが示された。ここに示した内
側標的領域はgag11と称され、プロモーター−プライマ
ーT7811および非プロモーター−プライマー872を使用し
た。組み込まれているgag11標的領域のためのプライマ
ー配置は図１に対応し、4009、T74116、4195およびT743
12を各々780、T7811、872およびT71062に置換した。こ
れらのプライマーの配列は：配列ID番号:5（780）： 配列ID番号:6（T7811） 配列ID番号:7（872）： 配列ID番号:8（T71062）： ここで括弧内の配列は以前に記載されているような（Ka
cianら、上記文献）T7プロモーター配列に対応してい
る。上記のように、プロモーター部分は他の機能的プロ
モーター配列に置換することができる。T7811および872
のHIV配列はMcDonoughら（上記文献）により開示されて
いる。 この実施例においては、872は30ピコモル／反応で使
用した。主プロモーター−プライマー、T7811、および
外側プライマーT71062および780は示された濃度で存在
した。もしくは、反応を、反応当たり1UのBst DNAポリ
メラーゼを用いて、一般法に記載したように取り扱っ
た。 すべての反応は実施例４に記載したような50μｌのKO
H−加水分解溶解物を含み、陽性反応には平均で５のpUC
HIV鋳型を加えた。これらの条件（Ａ−Ｈ）の各々に対
する陰性対照の結果は、各々5682、6501、5775、4954、
5689、5140、5079および4805RLUであった。 この実施例は各々のプライマーを独立して滴定するこ
との恩恵を示している。この結果および他の類似の実験
の結果は、前に議論したような、外側プライマーの最適
濃度は内側プライマーの濃度より低くなければならない
という予想と一致した。さらなる最適化により、次の実
施例のデータに示されるように、gag11イニシエーショ
ン増強はさらに改良された。 実施例8:マルチプレックス増幅 ある場合には同じ反応で二つまたはそれ以上の異なる
標的領域を増幅することが望まれる。各々が別の標的領
域の範囲を定めている二つまたはそれ以上のプライマー
の組の対を含むような、“マルチプレックス”増幅反応
は本分野では既知である。そのような反応においては、
各々の標的領域は、各々の標的領域が別々の反応で増幅
される場合よりも低く増幅することが最も一般的であ
る。増幅反応成分に対し両方（または全部）の真の標的
アンプリコンが互いに競合するだけでなく、非標的イニ
シエーションおよび競合的増幅の可能性が（約）pp×pt
（ここでppは反応液中のすべてのプロモーター−プライ
マーの総濃度であり、ptは存在するすべてのプライマー
の総濃度である）、またはすべてのプライマーがイニシ
エーションに対して機能的に等価である通常のPCRのよ
うな場合は〜pt 2だけ増加するに違いない。 これらの複雑性は、非常に低い鋳型レベルについて信
頼できる検出感度でのマルチプレックス増幅系の開発に
対する著しい障害である。それにもかかわらず、ここに
記載した標的特異的イニシエーション増強を用いると、
pol1およびgag11標的の両方に対して高感度でマルチプ
レックス反応組成物を同定することに成功した。 表７は、一つのそのような実験の結果を要約してい
る。条件Ａは10個のレプリカ反応の各々にpol1内側プラ
イマー（T74116および4195）およびgag11プライマー（T
7811および872）が加えてあるが外側プライマーが存在
しない標準IM2法であった。増幅後、各々の反応液の50
μｌを採り、pol1プローブを用いるハイブリッド形成に
より分析した。各々の反応液の残りの50μｌをgag11プ
ローブを用いて分析した。欄Ａのpol部分の結果はgag11
の結果と同一の試料順で並べられている（すなわち、50
μｌの試料＃１はpol1プローブで分析した場合7,448のR
LUが得られ；残りの50μｌはgag11プローブで分析した
場合19,596のRLUを与えた）。 同様に、欄ＣのRLU値は、示されるように、pol1また
はgag11プローブを用いた各々の反応液の半分の分析を
反映している。条件Ｃは上記一般法に記載された増強イ
ニシエーション法であるが、ただし八つのオリゴヌクレ
オチドプライマーが存在している（780、T7811、872、T
71062、4009、T74116、4195およびT74312、各々５、3
0、30、10、３、15、30および３ピコモル／反応）。 条件Ｂは四つのpol1プライマーのみを用いた増強イニ
シエーション法であり、条件Ｄの試料には４つのgag11
プライマーのみを加えた。ＢおよびＤの各々のレプリカ
反応は、全反応容量を用いてハイブリッド形成により分
析した。 表７に示した反応には、各々平均で５つの鋳型および
実施例４に記載したように調製された溶解物50μｌを加
えた。これらの条件（Ａ、Ｂ、C,A′、ＤおよびＣ′）
に対応する陰性対照は各々2094、2907、2925、1799、20
14および2315であった。 増強系を用いたgag11の結果から、この標的領域は、g
ag11プライマーのみを含む反応（Ｄ）において、pol1お
よびgag11プライマーを含む反応（Ｃ′）よりもはるか
に増幅されたことが明らかであった。さらに、両方の標
的領域（特にpol1）について、検出効率はマルチプレッ
クスIM2系（Ａ）よりも増強マルチプレックス系（Ｃ）
で著しく大きいことが明らかであった。標的IM2におけ
るpol1（Ａ）に比較したgag11（Ａ′）の優れたイニシ
エーション効率は、多くの既述の結果と一致しているこ
とに注目されたい。 各々のプローブによるハイブリッド形成により分析し
た場合、ベースライン信号レベル（pol1 RLU＝3120、g
ag11 RLU＝2129）が同一の促進マルチプレックス試料
（Ｃ、Ｃ′）で観察され、これらの試料中には増幅され
るべきHIV DNAが存在しないことを示している。ポアソ
ン分布に基づくと、５つの鋳型を加えたレベルでは10個
のレプリカでの１回の失敗が予期されないわけではない
（ｐ≧0.065）。従って、これらの結果はこのマルチプ
レックス系は同じ反応で二つの異なる標的領域の単一の
コピーを検出できることを示している。 その他の実施態様も以下の請求の範囲内に含まれてい
る。
よびRNAポリメラーゼを用いる核酸鎖の増幅に関する。 背景技術 特定の核酸配列を検出する能力は、遺伝学的研究、臨
床診断試験、法医学、考古学などのような領域で多くの
実際的な利便を提供してきた。多くの場合、問題とする
配列は、非常に高度に特異的な活性標識を有するプロー
ブを用いても直接的には検出できないほど低濃度でしか
存在しないであろう。最近、非常に強力な指数関数的増
幅法を含む、標的配列の新たなコピーを効率的に発生さ
せるための戦略が考案され、それにより非常に低い標的
レベルの存在をより正確に検出することができるように
なった。 そのような方法の一つは、ポリメラーゼ連鎖反応（Mu
llis et al.,米国特許第4,683,202号）であり、この方
法では、プライマー、基質、DNAポリメラーゼおよび分
析核酸の反応混合物を、二本鎖核酸の変性に十分な温度
への加熱およびプライマーアニーリングおよび伸長が起
こり得る温度への冷却からなるｎ回のサイクルにかけ
る。この反応は、各々のサイクルの間に標的配列の各々
の鎖が（最大で）一つの新しい相補鎖へコピーされうる
ため、2n倍の最大増幅を有すると理解されている。 続いての回に使用されるプライマーにより規定される
標的領域が前の回に使用されたプライマーにより発生し
た標的アンプリコン内に含まれている二つまたはそれ以
上の連続する増幅反応を実施することにより、標的特異
的増幅の実行は増大した。非標的アンプリコンは通常、
組み込まれた（nested）プライマーの組によるさらなる
増幅に対して、存在するその他の非標的配列よりも効率
的な鋳型ではないため、非標的配列の同時増幅のために
最初の回で所望の標的の増幅が不十分であっても、発生
した標的アンプリコンは次のプライマーの組によるさら
なる増幅のための選択的利点を有するに違いない。この
戦略は、非常に低い標的レベルを検出するために、PCR
のような増幅法の能力を改良するために使用されてきた
（Conway et al.,J.Acquired Immune Def.Syndromes 3:
1059（1990）;Matsumoto et al.,J.Virol.64:5290（199
0）;Garson et al.,Lancet 336:1022（1990）；およびN
ASBA（Kievits et al.,J.Virol.Methods 35:273（199
1））。 Kacian et al.PCT/US90/03907の増殖法は、多酵素活
性（すなわち、RNAポリメラーゼ、DNA指向性（directe
d）DNAポリメラーゼ、RNA指向性DNAポリメラーゼおよび
RNAse Ｈを含む）に依存している。他の反応体とこれ
らの活性の各々の一つを有する別々の酵素とを接触させ
ることによりこれらの活性を提供することが可能である
が、好適な形態では単一の酵素、すなわち逆転写酵素を
上に挙げた最後の三つの活性の主な源として使用する。
例えば、この方法の一つの実施態様では、コリファージ
T7からのRNAポリメラーゼおよびモロネイマウス白血病
ウイルス（MuLV）からの逆転写酵素を反応に用いて、10
12倍またはそれ以上までの増幅度を支持している。 増幅生成物の蓄積の速度は、そのような非同期的、連
続的増幅法ではより複雑であるが、反応成分の簡単な物
理的性質に基づいて計算可能である。 増幅生成物の指数的蓄積はこれらのいずれの方法にお
いても無限には進行しない。存在する利用可能なコピー
されるべき鋳型の数により存在する酵素が飽和するた
め、新たなコピー生成の時間当たりの速度は極大に達す
る。従って、この系での蓄積の速度は時間とともに指数
的というより直線的なものに変化する。最後には、製造
される生成物の量は、増幅生成物に物理的に取り込まれ
るプライマーおよびヌクレオシド等の基質の分子数によ
り制限される。 発明の要約 本発明はKacian et al.により記載された方法の著し
い改良に関する。特に、本発明はその方法の感度、すな
わち、非常に少ない数しか存在しない所望の標的配列を
増幅する能力を改良するための方法に関する。 最高感度を達成するのに最も重要で支配的な障害は、
非標的配列の増幅による反応成分の競合であると考えら
れる。プライマーアニーリングおよび伸長は、プライマ
ーと高度に相補的である標的配列上で最も有効であるべ
きであるが、プライマーの３′末端に相補的である数塩
基のみを有する配列にプライマーが複合体形成し、そこ
から伸長される可能性が熱力学的に予測されており、本
分野で経験的に知られている。非標的開始の部位当たり
の頻度がたとえ低くても、反応中の非標的塩基の数は、
標的配列を選択するのに使用されるプライマーに相補的
な標的塩基の数よりも通常非常に多い。プライマーは開
始生成物内に物理的に取り込まれるため、本来の親配列
が所望の標的とほとんど似ていない場合においても続く
相補的コピーはさらなる増幅のための非常に活性な鋳型
でありうる。 異なるプライマー配列による開始の相対的特異性は非
常に広範囲に変わり得る。また、特異性は配列のみに基
づいて信頼性を持って予測することはできないが、日常
の実験により好適な配列を同定することが可能である。
しかしながら、上記の考察は次のことを暗示する。すな
わち、反応のある早い時点において非標的アンプリコン
の集団が標的特異的アンプリコンの集団よりも大きくな
るであろう可能性がより高くなるため、最良のプライマ
ーについてさえも、非標的開始による妨害の可能性は標
的分子の数が減少するにつれて重大になる。これらの集
団の大きさ間の相違は反応が進行するにつれて指数的に
増幅されることができ、このような場合には、標的特異
的生成物が検出可能なレベルに達する前に、非標的増幅
による反応成分の消耗が反応の遅延または停止を起こす
可能性がある。 二つの核酸配列間の塩基対複合体の安定性は温度が上
昇するにつれて減少することが本分野ではよく知られて
いる。ハブリッド熱安定性は塩基対形成の程度および連
続性に依存するため、上記のことにより検出可能なハイ
ブリッド形成特異性が見掛け上増加する。熱安定性DNA
ポリメラーゼを利用しうることにより、PCRについてよ
り高い反応温度を使用することができる場合、標的特異
的アンプリコンの収率の改良および非標的生成物の蓄積
の減少が観察された（Saiki et al.,Science 239:487
（1988））。反応温度選択の柔軟性は通常の実験による
PCRシステムの有効な最適化を簡便化してきた（Rychlik
et al.,Nucleic Acids Res.18:6409（1990））。しか
しながら、非常に低い標的レベルの（例えば、＜50）信
頼できる検出のためのシステムの開発は挑戦すべきこと
として残っている。 温度を上昇させることは一度形成された塩基対複合体
の寿命を減少させるが、より高い温度はまた分子間の衝
突の速度を増加させて、伸長できる可能性がある複合体
を形成する。本出願人は、非標的プライミングの量が測
定された最適条件の上および下の両方の温度で増加する
ことを見いだした。従って、温度制御のみに基づいて所
望の標的のための絶対的な特異性を期待することはほと
んどできない。 プライマー伸長の特異性を増強するために記載されて
いる他の戦略には、化学変性剤および一本鎖結合タンパ
ク質の使用が含まれる。これらの戦略はいくつかの場合
では有用であったが、統一的に良好な条件は記載されて
いない。 今の時点で、前記の三つすべての活性を保持する逆転
写酵素の熱安定変異体は知られていない。熱安定RNAポ
リメラーゼは記載されているが、T7RNAポリメラーゼの
ようによく特徴付けされたプロモーター特異性を有して
いるものはない。本分野では、所望する特性（熱安定性
を含む）を有する酵素変異体をスクリーニングし、選択
し、および／または遺伝子操作するための方法は知られ
ているが、ここに開示される方法は開始特異性の増強、
およびその結果としての標的増幅の感度の増強の挑戦に
対する別の解決法を提供する。これらの方法は、莫大に
過剰な非標的核酸存在下に少数の標的配列を有する組成
物において特に有効であり、さらに、高温処理とともに
用いることができる。 ここに開示される方法は、アンプリコンネスティング
（nesting）の概念を用いるが、第一のプライマーの組
を用いて行われた反応液の一部を第二のプライマーの組
を含む新しい反応液に移すという、従来記載されている
戦略とは著しく異なるものである。ここに記載される方
法においては、組合わさった（nested）アンプリコンの
範囲を定めるすべてのプライマーは、新しい反応液へ生
成物を連続的に移さなくてもよいように単一の反応液中
で混合することができ、さらに、最適な様式は明らかに
それらの活性間の動的な調整により奨励される。 混合物中に存在するプライマーの数および型を増加す
ると、競合的な非標的増幅を導くような反応を含む種々
の副反応の可能性を有意に増加させる。加えられた余分
なプライマーはまた主体のプライマーの組の望まれる正
常な機能を妨害する可能性がある。従って、増強の程度
が明確であるのみならず劇的な程度である条件を同定す
ることはできないことが予期された。本方法は、連続的
過程を通して機能し、二本鎖プライマー伸長生成物を熱
的に変性するための熱処理を必要としないまたは用いな
いことに注意されたい。 したがって、第一の態様において、本発明は、試験試
料中の核酸鎖の標的配列を増幅する方法を特徴とする。
この方法は、試験試料からの核酸鎖を少なくとも三つの
オリゴヌクレオチドプライマーと同時に接触させること
を含む。少なくとも一つのプライマーはプロモーター−
プライマー（すなわち、核酸鎖またはその相補体と相補
的なプライマー領域、およびRNAポリメラーゼによりそ
の二本鎖形が認識されるプライマー領域の５′の別の領
域）であり、および少なくとも一つの他のプライマーは
核酸鎖と相補的であり、および一つの他のプライマーは
核酸鎖に相補的な鎖に相補的である。本方法はさらに、
核酸鎖およびプライマーを、RNA指向性および／またはD
NA指向性DNAポリメラーゼ活性、RNAポリメラーゼ活性お
よびRNAse Ｈ活性を有する一つまたはそれ以上の蛋白
質と、本質的に一定の温度で核酸鎖中の標的領域の増幅
を可能にするプライマー伸長条件下で接触させることを
含む。 “試験試料”には臨床、農業または環境試料が含ま
れ、それらは核酸鎖をプライマーとのハイブリッド形成
に使用可能にするために前処理されていてもされていな
くてもよい。そのような鎖はここに記載された第一の接
触工程の前に他の方法により増幅されない。すなわち、
本発明の方法は、そのような試料中の核酸を増幅するた
めに直接使用することができる。前もってPCRまたはKac
ian et al.の方法により増幅する必要はない。本方法
は、本質的にKacian et al.の方法を特徴とするが、追
加のプライマーにより非標的増幅を犠牲にして、著しく
および予想されなかったように標的増幅の増強が提供さ
れる。 “オリゴヌクレオチド”とは、ホスホジエステル結合
または本分野では既知のホスホジエステル結合の類似結
合を介して連結された少なくとも二つのヌクレオシド残
基を有する核酸分子を含む。オリゴヌクレオチドのヌク
レオチド塩基部分は、アデニン、グアニン、シトシン、
チミン、ウラシルまたは他の天然に存在するまたは合成
塩基誘導体、特に別の核酸配列中の相補的塩基と複合体
を形成して二本鎖核酸構造に関与することができる塩基
でありうる。糖部分はリボース、デオキシリボース、ま
たはこれらの構造の誘導体または修飾形であろう。ホス
ホジエステル部分の多くの誘導体が本分野では知られて
おり、本発明において使用することができる。オリゴヌ
クレオチドはまた、ヌクレオシドではなく、例えば、標
識または固形支持体への連結基としてまたは他の機能性
を提供するために使用されるであろうドメインまたは残
基を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドは、本分野
ではよく知られた多くの方法を用いて、化学的に、もし
くは核酸ポリメラーゼを使用することにより、または天
然に存在する核酸を処理することにより合成することが
できる。 “プライマー”とは、適したヌクレオシド−５′−ホ
スホリル（または等価物）残基の共有結合による付加の
ためのレセプターとして核酸ポリメラーゼにより使用さ
れる分子を意味する。プライマーの配列を制御し、それ
によりポリメラーゼに影響を及ぼしてプライマーと相補
的な配列に隣接する所望の標的配列をコピーすることが
簡単であるため、３′末端が伸長可能なオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして使用するのが都合がよい；しか
しながら、いくつかの蛋白質等のプライミング活性を有
する他の分子も知られている。 “プロモーター−プライマー”とは、RNAポリメラー
ゼと相互作用してRNAポリメラーゼに所望の鋳型の転写
を起こさせることができる配列または構造的特質をも有
するプライマーを意味する。本実施例で使用されるプロ
モーター−プライマーは、例えばHIVゲノム中の所望の
標的に相補的である配列に連結されたT7RNAポリメラー
ゼのための有効なプロモーターの一部であることが知ら
れている配列からなるオリゴヌクレオチドである。他の
プロモーター配列も知られており、用いることができ
る。例えば、T3RNAポリメラーゼおよびSP6RNAポリメラ
ーゼのためのプロモーターが含まれる。相対的に特異的
な転写を促進するために他の戦略を用いることもでき、
これらもこのプロモーター−プライマーの定義に含まれ
ることを意図するものである。例えば、DNA鋳型、特に
発生期のRNA転写産物に似ているヘテロトリプレックス
構造（時にはＲ−ループと呼ばれる）中の鋳型にハイブ
リダイズするRNAオリゴヌクレオチドは、RNAポリメラー
ゼにより伸長され、所望の標的鋳型のRNA相補体が得ら
れる。 “標的領域”または“増幅標的”とは、連続的な核酸
ポリマー化による配列またはその相補体の複製により増
幅されることが望まれる連続するヌクレオチド残基の配
列を意味する。全標的領域のヌクレオチド配列を知る必
要はないが、少なくとも一つの相補的プライマーおよ
び、標識された相補的プローブとのハイブリッド形成に
よること等による増幅生成物の特異的検出に使用しうる
配列を設計するのに十分な配列を知ることは役に立つ。 句“非標的核酸”には、そのような所望の標的領域中
に含まれないすべての配列が含まれる。これらには、例
えば、標的領域と同一のゲノム上に存在する他の配列、
反応系に存在する他のゲノムからの核酸またはそれらの
遺伝子生成物（例えば宿主細胞からのまたは環境夾雑物
からのもの）および反応系に計画的に添加された核酸
（例えばプライマー）が含まれるであろう。 好適な実施態様においては、核酸鎖は一本鎖DNA鎖で
あるかまたは二本鎖DNAの変性により一本鎖に変換され
るものである；核酸鎖およびプライマーは、最初に60℃
またはそれ以上で活性なDNAポリメラーゼ活性を有する
酵素と60℃またはそれ以上で接触させ；第二の接触工程
は、逆転写酵素およびRNAポリメラーゼの存在下42℃ま
たはそれ以上であり；四つのプライマーが第一の接触工
程で使用され；少なくとも一つのプライマーが他のプラ
イマーと異なる濃度で提供され；すべての酵素活性は逆
転写酵素およびRNAポリメラーゼにより提供され；しか
しその酵素活性はDNAポリメラーゼ活性を有しないRNseH
により補充されてもよく;DNAポリメラーゼは５′−３′
エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、およびバシラ
ス（Basillus）種：例えば、種バシラス ステアロテル
モフィラス（Bacillus stearothermophilus）またはバ
シラス カルドテナックス（Bacillus cardotenax）のD
NAポリメラーゼＩから誘導され；二つの外側プライマー
は前記核酸鎖またはその相補体に最大2000、500または3
50塩基離れてハイブリダイズし；および一つのプライマ
ーは１から10μＭの間の濃度で提供され、および別の前
記プライマーは10から50μＭの間の濃度で提供される。 別の好適な実施態様においては、二つのプライマーは
プラス−センスプライマーであり、内側のプラス−セン
スプライマーはプロモーター−プライマーである；また
は二つのプライマーはマイナス−センスプライマーであ
り、外側のマイナスセンスプライマーはプロモーター−
プライマーである。位置および極性の参照は図１の構造
に関して下記の意味を有するように意図されており、標
的領域が見いだされる遺伝子系に慣用的な極性呼称には
依存しない。従って、図１のT74116および4196は、ここ
では内側プライマーと考えられ;T74312および／または4
009は外側プライマーであると考えられる。プライマー
のこのアレイにより生じ得るアンプリコンに関して、内
側プライマーにより範囲を定められる標的領域内の配列
は高度に増幅されることが期待される。なぜなら、一つ
または両方の外側プライマーにより範囲を定められる増
幅生成物は、相補的内側プライマーによるアニーリング
の標的であるが、逆は必ずしも正しくないからである。
従って、図１の内側プライマーにより範囲を定められる
標的領域は主標的領域と考えられ、T74116は主プロモー
ター−プライマーの例である。 主プロモーター−プライマーに相補的である内因性標
的領域のセンスは負またはマイナスセンスと定義されて
おり、同様に、同一の配列センスを有する存在するその
他の核酸もマイナス標的鎖である。したがって、主プロ
モーター−プライマーは陽またはプラスセンスとして定
義され、マイナスセンス核酸に相補的である存在するそ
の他の核酸も同様である。標的領域を含む内因性鋳型の
負の形が一本鎖核酸分子（例えば、RNA）であっても、
これらの帰属が有効であることは当業者には明らかであ
ろう。なぜなら、この鎖は相補鎖を独特のものとして特
定するための十分な情報を含み、そのような相補体は反
応成分により合成できるからである。 本発明のその他の特色および利点は、下記の好適な実
施例および請求の範囲の記述から明らかになるであろ
う。 好適な実施例の説明 最初に簡単に図について説明する。 図 図１はpol1標的領域の構造に対して相対的なプライマ
ーの位置の図的表現であり； 図２は増幅イニシエーション法IM1、IM2およびIM3プ
ロトコールの図的表現であり； 図３は外側T7プライマーの伸長によるイニシエーショ
ンのための可能なスキームを示す図的表現であり；そし
て 図４は標的特異的イニシエーションをより効率的にす
ることを助けるであろう、4009プライマーの続いての伸
長によるT74116プライマー伸長生成物の鎖置換活性の可
能性を示す図的表現である。 実施例 以下の実施例は本発明を制限するものではない。当業
者はこれらの実施例の変形は付随する請求の範囲に記載
される本発明の範囲内であることを認識するであろう。
特に、試薬の特定の量およびそれらの比率、および使用
された特定の酵素および核酸を変化させて、任意の選択
された標的を増幅することができる。これらの実施例に
おいては、ある種の用語は以下のように用いられる。 “イニシエーション”とは、内因性鋳型配列がコピー
されるかまたは標的領域またはその相補体（これが所望
の標的配列であるにしろないにしろ）のRNAコピーへ効
率的に転写できるような形へ変換される過程を意味して
いる。Kacian et al.の増幅法では、特定の標的におけ
るイニシエーションは、そのようなRNA生成物が反応工
程のサイクルに鋳型として関与できるようになったとき
に完了し、それは転写されて本質的に同じRNA分子を生
成しうる鋳型のデノボ形成を導くことができる。（この
RNA分子はその前駆体と配列が同一ではないであろう
が、少なくともさらに増幅されるのに十分な配列類似性
を保持している。） “アンプリコン”とは、増幅サイクル中の一つの反応
の生成物であり、さらなる増幅のために鋳型として働く
能力を保持している核酸を意味する。 “プレイニシエーションされた鋳型”とは、アンプリ
コンの性質を有している核酸を表すために使用される。
すなわち、これは最初にイニシエーション反応の一つに
関与することなく増幅サイクル中の一つの反応の鋳型と
して働くことができる。プレイニシエーションされた鋳
型はまさに前の増幅反応のアンプリコン生成物である
か、またはPCR、化学合成またはクローニング等の方法
によりアンプリコン活性の実験モデルとして合成的に構
築されるであろう。 上で示唆したように、増幅反応は二つの段階を有する
ものとして認識できる。一つの段階はコピーされるかま
たは機能性アンプリコンに変換されるべき内因性鋳型を
生じる反応工程を含み、第二の段階は本質的に周期的な
増幅過程の一部である工程を含む。増幅工程の中間体お
よび生成物は、本来の内因性鋳型にかかわらず本質的に
類似するが、使用されるイニシエーション工程は内因性
鋳型の性質に依存している。Kacian et al.（上記文
献）の標的増幅法に対する種々のイニシエーション戦略
が以前に記載されている；ここで便宜のためにそのいく
つかを簡単に説明し、図２に図式的に示す。 図２を参照すると、イニシエーション法１（IM1）は
内因性鋳型がDNAであるイニシエーション法を表してい
る。プロモーター−プライマーが相補的標的にアニーリ
ングしうる条件下、DNAポリメラーゼ活性を加えてプロ
モーター−プライマーの伸長による標的鋳型に対する相
補体を合成する。反応液を加熱して（例えば、95℃）二
本鎖DNA生成物を変性させ、第二のプライマーが新たに
合成された伸長生成物上の相補的配列にアニーリングし
うる温度まで冷却する。適した酵素（例えば、RNAポリ
メラーゼ、逆転写酵素および任意にRNAseH）を添加した
時、第二のプライマーはDNAポリメラーゼ活性により伸
長されることができ、プロモーターに連結された標的領
域の二本鎖コピー、すなわちRNAポリメラーゼのための
活性な鋳型が生成される。 イニシエーション法２（IM2）は内因性鋳型がDNAであ
るイニシエーション法を表している。最初のプライマー
伸長生成物を変性させるために反応液を加熱しなくて
も、単に酵素（RNAポリメラーゼ、逆転写酵素および任
意にRNアーゼＨを含む）の添加だけで効率的なイニシエ
ーションが十分に得られる。等温反応液中の固有の過程
を通じて適格なアンプリコンが反応液中に生成する。 イニシエーション法３（IM3）は内因性鋳型がRNAであ
るイニシエーション法を表している。反応系を組み立
て、単一の酵素（例えばRNAポリメラーゼ、逆転写酵素
および任意にRNAseHを含む）を添加する。プロモーター
プライマーの最初の伸長の二本鎖生成物はRNA/DNAハイ
ブリッドである。RNA鎖は存在するRNAseHの基質であ
り、分解されて標的領域に連結されたプロモーターの一
本鎖コピーが得られ、次にこれは上記のように第二のプ
ライマーの伸長のための鋳型となる。 術語“反応失敗”または“増幅失敗”は、ここで使用
される限り、増幅が起こらなかったことを示すことを意
味するのではなく、単に所望の標的配列のコピーが生成
物の中で検出できなかっただけである。このことは分析
される核酸の中に所望の標的がなかったことを示してい
るであろう。これはまた、十分に有効でなかった標的特
異的イニシエーションまたは増幅から生じたものであろ
う。例えば、たとえ多くの特異的イニシエーションが起
こったとしても、もし非標的配列上のイニシエーション
により過剰の競合的アンプリコンが生成すれば、標的特
異的イニシエーションは有効でないかもしれない。下記
の実施例に示されるように、本発明は現存する方法の十
分な改良を提供し、反応中間体を変性させるための追加
の加熱工程を必要とせずに試料中の標的核酸の１−５程
度の少ないコピーの検出を可能とする。 一般法 この節に記載される操作またはそのわずかな変更を下
記の実施例のほとんどにおいて使用した。例外および修
正は各々の実施例に詳しく説明されている。 以下はIM2増幅反応の例である。 １）以下の成分を含む溶液を調製し、25μｌの容量に分
配した： 200mM トリス・HCl（約20−25℃でpH8.0） 70mM MgCl2 8mM スペルミジン 0.4mM デフェロキサミン メシレート 25mM GTP＆ATP各々 10mM UTP＆CTP各々 0.8mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP各々 0.6μＭ T74116プロモーター−プライマー 1.2μＭ 4195プライマー 20％（v/v） グリセロール 実施例に使用されたプライマーは図に示されている。
それらは以下の配列を有している：配列ID番号１（400
9）:5′−ATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAA−３′；配列ID番
号２（T74116）:5′−［AATTTAATACGACTCACTATAGGGAG
A］CAAATGGCAGTATTCATCCACA−３′；配列ID番号３（419
5）:5′−GTTTGTATGTCTGTTGCTATTAT−３′；および配列
ID番号４（T74312）:5′−［AATTTAATACGACTCACTATAGGG
AGA］CCCTTCACCTTTCCAGAG−３′。（プロモーター配列
は括弧内に示されており、本発明において他のプロモー
ターを使用することができる。）T74116、4195およびT7
4312のHIV配列は以前に開示されている（McDonough et
al、米国特許出願第08/040,745、ここに引例として含ま
れている）。 ２）この混合物に分析されるべき核酸を含む50μｌの試
料を加えた。モデル参照系試料は、80mMの酢酸カリウム
に溶解した１から10μｇの精製ヒト白血球（WBC）DNAを
含む。WBC DNAは種々の既知の方法により調製すること
ができる（Maniatis et al.,Molecular Cloning,a labo
ratory manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,NY,1982参照）。もしくは、実施例４に記載し
たように調製された50μｌの加水分解WBC溶解物を使用
した。反応液には陰性対照の場合には５μｌの水を加
え、増幅効率試験のためには既知の量の精製クローン化
HIV核酸を含む５μｌの溶液を加えた。 ３）混合物を95℃に加熱し、この温度に５分間維持し
た。次に42℃に移し、この温度まで放置して冷却させ
た。 ４）800UのモロネイMuLV逆転写酵素（RT）および400Uの
T7RNAポリメラーゼを含む20μｌの溶液を、50mMトリス
・HCl（pH8.0）、10mM酢酸カリウム、100mM Ｎ−アセ
チル−Ｌ−システインおよび20％（v/v）グリセロール
を含む溶液に加えた。 ５）これを軽く混合し、42℃で２時間インキュベートし
た。 ６）意図する標的配列を含む増幅生成物の生成は、特異
的ハイブリダイゼーション法を用いて決定した。ここに
記載したすべての実験について、ハイブリダイゼーショ
ン保護アッセイ（Arnold et al.,Clin.Chem.35:1588（1
989）およびPCT/US88/03195）を使用した。 下記の実施例においては、特に指示しない限り、IM2
実験においてpol1プライマーは上に掲げた濃度で使用し
た（すなわち、100μｌ反応液当たり15ピコモルのT7411
6および30ピコモルの4195）。gag11プライマーを使用し
た場合は、100μｌ反応液当たり各々30ピコモルのT7811
および872を加えた。 基本的IM2法の以下の改良法を用いて、増強されたイ
ニシエーション効率のための戦略を試験した。 1a）反応成分の混合物をIM2法の工程１に記載されたよ
うに調製した。任意に、追加のオリゴヌクレオチドを外
側プライマーとして添加した、例えば、pol1増幅につい
て各々反応液当たり３ピコモルの4009およびT74312。 2a）この混合物に、分析されるべき核酸を含む50μｌの
試料を加えた。モデル参照系試料は、80mMのKOAcに溶解
した１から10μｇの精製ヒトWBC DNAを含む。もしく
は、実施例４に記載したように調製された50μｌの加水
分解WBC溶解物を使用した。反応液には、陰性対照につ
いては５μｌの水、または既知の量の精製クローン化HI
V核酸を含む５μｌの溶液を加えた。 3a）混合物を95℃に加熱し、この温度に５分間維持し
た。次に60℃に移し、この温度まで放置して冷却した。 4a）任意に、50mMトリス・HCl（pH8.0）、10mM酢酸カリ
ウム、100mM Ｎ−アセチル−Ｌ−システインおよび20
％（v/v）グリセロールを含む溶液に熱安定性DNAポリメ
ラーゼを溶解した溶液10μｌを加えた。試験された酵素
およびその望ましい性質は、以下の実施例において記載
される。 5a）反応液を軽く混合し、60℃で10分間インキュベート
した。 6a）反応液を42℃に移し、この温度まで放置して冷却し
た。 7a）800UのモロネイMuLV逆転写酵素および400UのT7RNA
ポリメラーゼを含む溶液10μｌを、50mMトリス・HCl（p
H8.0）、10mM酢酸カリウム、100mM Ｎ−アセチル−Ｌ
−システインおよび20％（v/v）グリセロールを含む溶
液に加えた。 8a）反応液を軽く混合し、42℃で２時間インキュベート
した。 9a）意図する標的配列を含む増幅生成物の生成は、ハイ
ブリダイゼーション保護アッセイ（Arnold et al.、上
記文献）等の特異的ハイブリダイゼーション法を用いて
決定した。 用いた外側プライマー（用いた場合には）、およびそ
れらの濃度は各々の実施例に記載される。 イニシエーション効率の最も有用な指標は、個々の反
応における増幅の程度よりむしろ特定の鋳型レベルに対
する反応失敗の頻度であることが見いだされた。従っ
て、試験した各々の条件について、改良されたイニシエ
ーション効率が失敗頻度の統計的に有為な減少により同
定できるように、多複製反応を用いて実験を組み立て
た。さらに、複製反応のシグナルの幾何平均（G.M.）は
イニシエーション効率と良く相関し、ほとんどの実施例
で示されている。 実施例に記載される実験で使用したHIV鋳型は、HIV配
列のプラスミドクローンを含む大腸菌から標準的な方法
で精製した（例えば、Maniatis et al.上記文献を参照
されたい）。BH10 DNAを特定する実験においては、鋳
型は、本質的にGenbankにHIVBH102（受入番号M15654
号）として記載されている8932のヌクレオチド配列に相
補的鎖を加えた精製二本鎖線状DNAであった。他の実験
では、標準pUCクローニングベクター中にBH10のgagおよ
びpol遺伝子を含む線状化プラスミドDNA（pUCHIV）を使
用した。両方の鋳型とも並列比較において分子当たり実
質上同一の鋳型活性を有していた。 精製後、各々の調製物試料により吸収される260nm紫
外光の量（A260）を測定することにより、これらの調製
物中のDNA濃度を決定した。これらのDNA化学種の各々の
ヌクレオチド配列（従ってその長さ）は既知である。そ
のような調製物のモル濃度は標準変換因子を適用するこ
とにより決定した：二本鎖DNAの質量濃度＝50μgml-1A
260 -1;二本鎖DNAの分子量＝長さ（bp）x650g mol-1bp
-1。５μｌ当たり≧108鋳型濃度での鋳型DNA保存溶液
（33pM）を別々のアリコートに分けて凍結した。各々の
増幅実験について鋳型のアリコートを融解し、反応液に
添加するため所望の作業濃度に連続的に希釈した（例え
ば、５μｌ当たり５の鋳型）。融解したアリコートおよ
び希釈物は各々の実験後に廃棄した。 実施例1:イニシエーション効率 イニシエーション効率に対する種々の反応パラメータ
ーの影響を定量的に評価するため、与えられた変化に応
答する増幅効率とイニシエーション効率の変化とを区別
する方法を開発することが望まれた。このことは、例え
ば、最適の増幅実施に好まれる条件は、最適なイニシエ
ーション効率が得られる条件には必要とされないことが
見いだされたため、必要であった。これを達成する一つ
の方法は、種々の反応組成物または処理概要の固有の増
幅実施の指標として、反応液にプレイニシエーションさ
れた鋳型を加えるか、または、これらの結果を天然の標
的配列の添加により生じる増幅の結果と比較することで
あった。 この方法を用い、非標的配列の増幅と競合せず、標的
由来のアンプリコンのイニシエーションがいかに迅速か
つ広範囲にちがいないかを決定することが可能であっ
た。増幅の経時変化を実施した。ここでは、反応系を種
々の所望の試験条件に従って組み立てたが、標的鋳型は
除かれている。RTおよびRNAポリメラーゼ酵素の添加に
より反応が開始した後の種々の時間に鋳型を加え、生じ
る最終的な増幅程度を下記のように決定した： １）下記の成分を含む混合物を調製し、この溶液の85μ
ｌを各々の反応管に分配した。掲げた濃度は全反応液10
0μｌ中の各々の濃度を示している。 50mM トリス・HCl（室温でpH8.0） 17.5mM MgCl2 5mM ジチオスレイトール 2mM スペルミジン 6.25mM GTP＆ATP各々 2.5mM UTP＆CTP各々 0.2mM dATP、dGTP、dCTP、dTTP各々 0.3μＭ T74116プロモーター−プライマーおよび
4195プライマー各々 ３μｇ ヒトWBC DNA ２）反応液を95℃に７分間加熱し、37℃に移し、５分間
放置してこの温度まで冷却させた。 ３）モロネイMuLV逆転写酵素（600U）およびT7 RNAポ
リメラーゼ（400U）を、緩衝液（10mMトリス・HCl、pH
8.0）、10mM酢酸カリウム、および5mMのジチオスレイト
ール）10μｌ中の各々の反応液に加えた。 ４）酵素添加後の種々の時間に、100コピーの一本鎖BH1
0 DNA（精製クローン化HIV DNA、前もって煮沸により
変性させた）または10コピーのプレイニシエーションさ
れた鋳型を５μｌの容量で各々の反応液に加えた。それ
ぞれの時間点および条件の３つのレプリカを処理した。 ５）２時間後、標的特異的増幅生成物の収量をハイブリ
ダイゼーション保護アッセイ（Arnoldら、上記文献）に
より決定した。 各々の条件についての３つのレプリカのシグナルの幾
何平均の分析は、もし非標的核酸の存在下、標的核酸の
非存在下に、10分という短い時間に増幅生化学が進行す
れば、10個のプレイニシエーションされたアンプリコン
でさえも検出可能なレベルには増幅できなかったであろ
うことを示している。さらに、プレイニシエーションさ
れた鋳型について観察されたような増幅の経時変化と本
質的に同様な変化を達成するには、約10倍以上の内因性
鋳型が必要とされた。この相違は、プレイニシエーショ
ンされた鋳型が増幅サイクルに速やかに入るのに対し、
すでに存在している非標的アンプリコンは、コピーされ
るべき天然の鋳型がイニシエーション反応を経て増幅可
能形になるために必要な時間の間、指数的に蓄積を続け
ることにより説明される。これらの条件の各々につい
て、増幅過程を始めるために逆転写酵素およびRNAポリ
メラーゼを添加して３−５分後以内に標的特異的増幅能
力の90％以上が失われた。非標的プライミングおよびイ
ニシエーションの有意なレベルを期待していたにもかか
わらず、効果的なイニシエーションのためのこの機会の
枠の非常な短さは非常に驚きであった。ここで、並びに
多くの同じような実験において観察された傾向は、阻害
が、高レベルの非標的イニシエーションに由来する増幅
による必須の反応成分の過剰な消耗によるためであるこ
とを示唆している。 Kacianら（上記文献）により記載されている方法の通
常の最適化により開発された増幅システムを用いて、多
くの場合比較的低い標的レベルを検出することが可能で
あった。例えば、IM2法およびpol1プライマーの組を用
いて、≧50HIVゲノムを含むほとんどすべての試料、お
よび20HIVゲノムを含む約2/3の試料を検出することがで
きた。この性能は非常に強力な増幅を反映しており、ほ
とんどの目的に適用できるであろう。しかしながら、さ
らに高い感度が望まれる場合があ。HIVはその核酸が全
血等の感染組織中に非常に低濃度でしか存在しない病原
体の一つの例である。HIV核酸の信頼できる検出には、
少なくとも一つの標的が存在することを確実にするた
め、時にはかなりの試料量（例えば、≧0.1−1mlまたは
それ以上の血からのWBC）を必要とする。そのような試
料からの核酸抽出物は、非標的DNAが＞20μｇ存在する
中に一個のHIVゲノムを含むであろう。実施例１で明ら
かにしたように競合的非標的増幅の非常に攻撃的な特性
は、そのような試料における標的の検出が非常に挑戦す
るのに値する目標であり、通常の実験では期待できなか
ったことを明らかにしている。 実施例2:熱安定性DNAポリメラーゼ この実施例は、ここに記載した原理の応用により有意
の感度の増加を達成しうることを示している。表１に示
した試料ＡおよびＢヲ、上記の一般法に記載したような
標準IM2法を用いて処理した；すなわち、試料を95℃か
ら直接42℃に冷却し、逆転写酵素/T7 RNAポリメラーゼ
混合物を添加して反応を開始した。試料（Ｃ−Ｆ）は、
前に記載したように95℃から60℃に冷却し、2UのB.ステ
アロテルモフィラス（stearothermophilus）（Bst）DNA
ポリメラーゼを各々に加えて10分間インキュベートし
た。次に試料を42℃に冷却した後、逆転写酵素/T7 RNA
ポリメラーゼ混合物を添加した。各々の反応液に、反応
液当たり平均５つの鋳型になるように希釈した精製クロ
ーン化HIV DNA（pUCHIV）を加えた。 生成した標的配列の量は、表１−７において相対的光
単位（RLU）、すなわち検出プローブ上の化学発光標識
から得られる信号の量で表現されている。 陰性対照（pUCHIVなし）のRLU値は、これらの各々の
条件について（Ａ−Ｆ）各々2591、3097、2471、3569、
3459および6030であった。 これらの結果は、Bstポリメラーゼによる高温イニシ
エーション工程（Ｃ）を用いるかまたは42℃でも外側プ
ライマーが含まれていると（Ｂ）、各々単独でイニシエ
ーション効率を増強しうることを示している。最も劇的
な増強は、外側プライマーのいずれかの存在下、60℃補
充イニシエーション工程を実施した時（Ｄ、Ｅ）に観察
され、最良の条件は両方の外側プライマー、並びにBstD
NAポリメラーゼを用いる60℃補充イニシエーションを含
むものであった（Ｆ）。 実施例3:プライマー滴定 この実施例は、増強されたイニシエーション系のいく
つかの驚くべき性質を示しており、それはこれらの増強
が従来の技術からでは自明でも予測可能でもないとを明
らかにしている。 外側プライマーの最も有効な濃度を滴定により決定し
た。この実施例においては、表２に示されているよう
に、T74312プロモーター−プライマーおよび4009プライ
マーの両方が等モルレベルで含まれていた。この実験は
また、イニシエーション増強が主としてプライマーネス
ティングによるものか、高温度工程のみによるものか、
DNAポリメラーゼ存在下での高温インキュベーションに
よるものか、またはこれらの因子のいくつかの組み合わ
せによるものかを決定することも意図していた。Bstポ
リメラーゼおよび外側プライマーを含まない反応条件
（Ａ）を、上記一般法で概説したような標準IM2法イニ
シエーション（すなわち、60℃工程なし）を用いて実行
した。他のすべての試料には60℃インキュベーション工
程を施し、Bstポリメラーゼが反応液に含まれる場合と
含まれない場合があった。 表に示した各々の試料には、平均で５分子のpUCHIV
DNAを加えた。陰性対照もまた各々の反応条件で行っ
た；陰性対照に対するRLU値はＡ−Ｇについて各々148
1、3073、1888、1579、2150、1685、および2038であっ
た。 前記のごとく、反応に含まれる余分なプライマーは、
標的配列上の余分なイニシエーションを促進することに
より標的特異的増幅を阻害することが可能である。この
ような反応中の余分なプライマーによる所望の増幅の妨
害の可能性がここで観察されている、すなわち、より高
い温度のプレイニシエーション工程なしに各々0.5また
は１ピコモルの外側プライマーを用いる反応において
（Ｂ、Ｃ）。対照的に、各々３ピコモルの外側プライマ
ー（Ｄ）からは、標準IM2イニシエーション条件（Ａ）
よりも著しく良好なイニシエーション効率が得られた。
60℃プライマー伸長工程が含まれると（Ｅ−Ｇ）、組み
合わされた（nested）プライマー戦略が有効な範囲が広
がったのみでなく、前の実施例のように最良の外側プラ
イマー条件（Ｇ）との相乗効果により印象的なイニシエ
ーション効率が得られた。 実施例4:粗溶解物 この実施例は、適当な処理後の患者の試料の典型であ
る粗溶解物に応用された場合、イニシエーション増強が
機能的であるだけではなく、より価値を有することを示
している。そのような溶解物の複雑で変化しやすい化学
組成のため、少なくともいくつかの増幅法では精製され
た成分を含む系よりも溶解物では効率が悪いことが典型
的である。従って、モデル参照系反応のような精製され
た成分を含む反応系と同じような標的レベルでも、信号
はおそらくしばしばより低くおよび／または観察されな
いであろう。 １）抗凝血物質としてのEDTAで処理された全血を、0.25
Mスクロース中に1.110g/mlの密度でパーコールを含む等
量の密度遠心分離培地（DCM）と混合した。混合物は160
0×ｇで20分間遠心分離した。 ２）平衡化混合物のメニスカスに形成されたバンドをピ
ペッティングすることにより、単核WBC（MNC）を採取し
た。DCM/MNC懸濁液を等量の0.14M KOHと混合し、良く
混ぜて95℃で30分間加熱した。 ３）室温まで冷却後、得られた加水分解物に： 0.65N 酢酸 0.066M トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン［トリス塩基］ 0.084M トリス・HCl を含む溶液を10分の１容量加えてpH8.0±0.5に調整し
た。 ４）増幅反応液にこの溶解液を50μｌ、または１μｇの
精製ヒトWBC DNAの80mM酢酸カリウム溶液を50μｌ（比
較系）加えた。 試験反応には表３に示した数のpUCHIV鋳型を加えた。
各々の条件（Ａ−Ｄ）に対して１回の陰性対照反応を行
い、これらの値は各々2988、2179、5740および5602RLU
であった。 参照系（標準IM2）（Ａ）の結果は良好なイニシエー
ション効率を示したが、増強系（Ｂ）は有意により良好
であるのは明らかである；これらの条件下、10の信号す
べてが事実上飽和している。さらに、溶解物試料の結果
（Ｃ、Ｄ）は、イニシエーション増強を用いることによ
りいかに多くの利点が達成できるかを非常に明瞭にして
いる。 実施例5:外側プライマー この実施例は、溶解物の存在下、低い標的レベル（3p
UCHIV）の挑戦的条件のもとでの各々の外側プライマー
を用いて得られた増強効果の再試験である。すべての反
応に1UのBst DNAポリメラーゼを加え、60℃で10分間イ
ンキュベーションした。使用した外側プライマー（反応
当たり各々３ピコモル）および試験された組み合わせは
表４の最初の列に示されている。プライマー4312bはT74
312と同様にHIVに相補的な配列と同一の配列を有する
が、プロモーター配列を有していない。 各々の条件について、10個のレプリカ反応から得られ
たRLU値を表４に示す。表４の最下列はその条件の個々
のレプリカの結果の幾何平均を示す。各々の条件（Ａ−
Ｅ）について、陰性対照の結果は各々776、2850、405
3、3875および4126RLUであった。 実施例２で以前に見られたように、これらの結果は、
4009不在下でも外側プロモーター−プライマーT74312が
増強されたイニシエーションを促進することができるこ
とを示している。さらに、相同的非プロモーター−プラ
イマー4312bが外側プライマーなしの対照条件ではイニ
シエーションを有意に促進しなかったため、これらの結
果はT74312の増強能力はプロモーター部分からの恩恵で
あることを強く示唆している。これらの結果を説明する
一つの可能な機構は図３に示されている。T74312が通常
の方法でその相補体上に伸長されることによりIM2過程
をイニシエーションしうることはありそうである。主プ
ロモーター−プライマーT74116によりプライミングされ
る正常のイニシエーション工程は異なった鎖で起こるた
め、これは上述の工程により妨害されるはずがないこと
に注目されない。 T74312はより低い濃度で存在しているため、この反応
におけるT74312によるイニシエーションは、T74116によ
るものより効率的ではないことが予測されるであろう；
しかしながら、首尾よく完了したT74312イニシエーショ
ンは多数の一本鎖RNAを生じ、それらはT74116による高
度に効率的なIM3型イニシエーションの鋳型であり、反
応の初期の段階の間に反応性を有するpol1アンプリコン
の蓄積を著しくかつ好ましく加速することができる。両
方の鎖上の高度に効率のよい転写は有効な増幅を阻害す
ることが観察されているため、外側プロモーター−プラ
イマー（例えば、T74312）が内側プロモーター−プライ
マー（例えば、T74116）よりも反応においてより低い活
性を有することがおそらく望ましい。 異なる配列は、同一の濃度においてさえもその各々の
相補体へのハイブリッド形成の異なる速度を有すること
ができることに注目されたい。従って、二つの異なるオ
リゴヌクレオチド配列に対するプライミング活性の比は
それらの濃度の比と同一ではないであろう。しかしなが
ら、二つの異なるプロモーター−プライマーの相対的な
活性の最初の見積としてはモル濃度が有用であり、最適
の比は通常の実験により決定することができる。さら
に、ハイブリッド形成速度を定量するための方法は本分
野ではよく知られており、有効濃度の明かな例外の解決
に使用できる。 T74312の伸長によりイニシエーションされた転写的に
活性な化学種の形成の完了に働くであろうという役割
（図３に図解されている）に加えて、4009がイニシエー
ション効率を改良していることは明らかである。非プロ
モーター−プライマー4312bと対を形成する時でさえ
も、4009の存在はこの実験において明かな促進を起こす
だけでなく、それはいずれかの4312化学種の不在下でも
実施例２における増強されたイニシエーションも促進さ
せた。 これらの観察と一致する可能な促進機構が図４に示さ
れている。ここで、プライマー4009はDNA合成をプライ
ミングすることができ、これは内側プロモーター−プラ
イマーT74116から伸長された以前に合成されたDNAを置
換しうる。外側プライマーが最初に伸長され、主標的領
域を二本鎖にして内側プロモーター−プライマー（例え
ば、T74116）によるイニシエーションができないように
することがないように、この外側プロモーター−プライ
マーは内側プロモーター−プライマーよりも低い活性を
有することが望ましい。 実施例6:DNAポリメラーゼ特性 この実施例で示されている実験は、補充したDNAポリ
メラーゼの熱安定性以外の性質がイニシエーション増強
機構に重要であるかどうかを決定するために行った。表
５に示された結果は各々それ自体の目的を有する三つの
異なった実験からのものであるが、各々の酵素の相対的
長所を判断するために参照系として比較しうる同様の対
照を各々含む。“ナシ”と付けた下段の群のRLU値は、
外側プライマーおよび熱安定性DNAポリメラーゼなしで
インキュベートされた標準IM2反応からのものである。
“Bst−1"と付けられた中段の群は、一般法に記載さ
れ、およびBio−RadからのBst DNAポリメラーゼを使用
した増強イニシエーション法を用いて処理した。上段の
群は、カラムの頭に示した別の熱安定性DNAポリメラー
ゼの一つに置換した同じ増強イニシエーション法の結果
を示している。“Bst−2"は第二の販売元（Molecular B
iology Resources）からのBstポリメラーゼの試料を示
している；“Bca"はバシラス カルドテナックス（Baci
llus caldotenax）からのDNAポリメラーゼ（Takara）に
対応する；“REPLIT−HERMTM"はEpicentreから入手可能
なDNAポリメラーゼである；“KLENTAQTM"DNAポリメラー
ゼ（Abペプチド）は以下に記載するようにテルムス ア
クアチカス（Thermus aquaticus）DNAポリメラーゼの誘
導体である。試料はすべて一般法に記載した増強イニシ
エーション法を用いて取り扱った。示された各々のDNA
ポリメラーゼを、10分間の60℃インキュベーション工程
で使用した。反応液はWBC溶解物を含むか、または参照
系であり、表５に示された平均鋳型接種物を加えた。 表５は、Bst以外のいくつかの熱安定性DNAポリメラー
ゼもまた外側プライマーと提携して増強されたイニシエ
ーション効率を支持することができることを示してい
る。別の実験において、いくつかの他の熱安定性DNAポ
リメラーゼは組み込まれたプライマーと共働して作用せ
ず、促進されたイニシエーションが得られないように思
われた。これらにはテルムス アクアチカス（Thermus
aquaticus）（Taq）、テルムス フラバス（Thermus fl
avus）（Tfl）、テルムス テルモフィラス（Thermus t
hermophilus）（Tth）、テルモコッカス リトラリス
（Thermococcus litoralis）（VentTM、New England Bi
olabs）またはRetrothrmTM（Epicentre）からの天然のD
NAポリメラーゼが含まれる。これらのいくつかは、外側
プライマーなしで反応の最初の10分の60℃プライマー伸
長工程に用いた場合、標準IM2と比較して改良されたイ
ニシエーション効率を与えた；しかし、この改良は上述
の完全に増強された系と同等の程度になることはなかっ
た。 完全な促進イニシエーションを支持した４つのポリメ
ラーゼ酵素は、少なくとも一つの共通の性質を有してい
る。すなわち、それらの効率に寄与するであろう５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性が欠失している。Bst、Bca
およびKLENTAQは各々大腸菌DNAポリメラーゼＩの相同体
である。これらの群の酵素に通常観察される５′→３′
エキソヌクレアーゼは、両方の販売元によりBstの精製
の間に蛋白質分解により除去される。BcaおよびKlenTaq
は両方ともこの活性に欠陥ある突然変異体遺伝子の各々
のクローンからの発現により製造される。REPLITHERMは
その販売元からエキソヌクレアーゼ活性が欠失している
と報告されている。この相関から、増強機構が５′→
３′エキソヌクレアーゼ欠失から恩恵を受けることが示
唆され、Taqポリメラーゼの天然の親形に比較して優れ
たKLENTAQの効力によりさらに確証される。 これらおよび他の実験において、バシラス（Bacillu
s）種からの三つのポリメラーゼはREPLITHERMまたはKLE
NTAQよりもより一貫した、安定な増強を支持するようで
あった；従って、これらの三つの関連する酵素はそれら
を他の二つから区別する性質を共有しているのであろ
う。一つの可能性は、DNAポリメラーゼ間で異なること
が知られている効率的鎖置換活性が図４に示したような
機構に寄与しているかもしれないことであるが、他の可
能性も排除できない。 これらの洞察は、完全増強系により与えられた恩恵
は、単に熱安定性DNAポリメラーゼにより可能となった
高められたプライマーアニーリングストリンジェンシー
という簡単な窓口に依存するのみではなく、ここに形成
されたような系が従来の技術からでは自明ではなく予測
できない機構的利点を有することを示している。 実施例7:他の標的領域 pol1以外の標的領域についてもイニシエーション増強
を試験し、これが働くことが示された。ここに示した内
側標的領域はgag11と称され、プロモーター−プライマ
ーT7811および非プロモーター−プライマー872を使用し
た。組み込まれているgag11標的領域のためのプライマ
ー配置は図１に対応し、4009、T74116、4195およびT743
12を各々780、T7811、872およびT71062に置換した。こ
れらのプライマーの配列は：配列ID番号:5（780）： 配列ID番号:6（T7811） 配列ID番号:7（872）： 配列ID番号:8（T71062）： ここで括弧内の配列は以前に記載されているような（Ka
cianら、上記文献）T7プロモーター配列に対応してい
る。上記のように、プロモーター部分は他の機能的プロ
モーター配列に置換することができる。T7811および872
のHIV配列はMcDonoughら（上記文献）により開示されて
いる。 この実施例においては、872は30ピコモル／反応で使
用した。主プロモーター−プライマー、T7811、および
外側プライマーT71062および780は示された濃度で存在
した。もしくは、反応を、反応当たり1UのBst DNAポリ
メラーゼを用いて、一般法に記載したように取り扱っ
た。 すべての反応は実施例４に記載したような50μｌのKO
H−加水分解溶解物を含み、陽性反応には平均で５のpUC
HIV鋳型を加えた。これらの条件（Ａ−Ｈ）の各々に対
する陰性対照の結果は、各々5682、6501、5775、4954、
5689、5140、5079および4805RLUであった。 この実施例は各々のプライマーを独立して滴定するこ
との恩恵を示している。この結果および他の類似の実験
の結果は、前に議論したような、外側プライマーの最適
濃度は内側プライマーの濃度より低くなければならない
という予想と一致した。さらなる最適化により、次の実
施例のデータに示されるように、gag11イニシエーショ
ン増強はさらに改良された。 実施例8:マルチプレックス増幅 ある場合には同じ反応で二つまたはそれ以上の異なる
標的領域を増幅することが望まれる。各々が別の標的領
域の範囲を定めている二つまたはそれ以上のプライマー
の組の対を含むような、“マルチプレックス”増幅反応
は本分野では既知である。そのような反応においては、
各々の標的領域は、各々の標的領域が別々の反応で増幅
される場合よりも低く増幅することが最も一般的であ
る。増幅反応成分に対し両方（または全部）の真の標的
アンプリコンが互いに競合するだけでなく、非標的イニ
シエーションおよび競合的増幅の可能性が（約）pp×pt
（ここでppは反応液中のすべてのプロモーター−プライ
マーの総濃度であり、ptは存在するすべてのプライマー
の総濃度である）、またはすべてのプライマーがイニシ
エーションに対して機能的に等価である通常のPCRのよ
うな場合は〜pt 2だけ増加するに違いない。 これらの複雑性は、非常に低い鋳型レベルについて信
頼できる検出感度でのマルチプレックス増幅系の開発に
対する著しい障害である。それにもかかわらず、ここに
記載した標的特異的イニシエーション増強を用いると、
pol1およびgag11標的の両方に対して高感度でマルチプ
レックス反応組成物を同定することに成功した。 表７は、一つのそのような実験の結果を要約してい
る。条件Ａは10個のレプリカ反応の各々にpol1内側プラ
イマー（T74116および4195）およびgag11プライマー（T
7811および872）が加えてあるが外側プライマーが存在
しない標準IM2法であった。増幅後、各々の反応液の50
μｌを採り、pol1プローブを用いるハイブリッド形成に
より分析した。各々の反応液の残りの50μｌをgag11プ
ローブを用いて分析した。欄Ａのpol部分の結果はgag11
の結果と同一の試料順で並べられている（すなわち、50
μｌの試料＃１はpol1プローブで分析した場合7,448のR
LUが得られ；残りの50μｌはgag11プローブで分析した
場合19,596のRLUを与えた）。 同様に、欄ＣのRLU値は、示されるように、pol1また
はgag11プローブを用いた各々の反応液の半分の分析を
反映している。条件Ｃは上記一般法に記載された増強イ
ニシエーション法であるが、ただし八つのオリゴヌクレ
オチドプライマーが存在している（780、T7811、872、T
71062、4009、T74116、4195およびT74312、各々５、3
0、30、10、３、15、30および３ピコモル／反応）。 条件Ｂは四つのpol1プライマーのみを用いた増強イニ
シエーション法であり、条件Ｄの試料には４つのgag11
プライマーのみを加えた。ＢおよびＤの各々のレプリカ
反応は、全反応容量を用いてハイブリッド形成により分
析した。 表７に示した反応には、各々平均で５つの鋳型および
実施例４に記載したように調製された溶解物50μｌを加
えた。これらの条件（Ａ、Ｂ、C,A′、ＤおよびＣ′）
に対応する陰性対照は各々2094、2907、2925、1799、20
14および2315であった。 増強系を用いたgag11の結果から、この標的領域は、g
ag11プライマーのみを含む反応（Ｄ）において、pol1お
よびgag11プライマーを含む反応（Ｃ′）よりもはるか
に増幅されたことが明らかであった。さらに、両方の標
的領域（特にpol1）について、検出効率はマルチプレッ
クスIM2系（Ａ）よりも増強マルチプレックス系（Ｃ）
で著しく大きいことが明らかであった。標的IM2におけ
るpol1（Ａ）に比較したgag11（Ａ′）の優れたイニシ
エーション効率は、多くの既述の結果と一致しているこ
とに注目されたい。 各々のプローブによるハイブリッド形成により分析し
た場合、ベースライン信号レベル（pol1 RLU＝3120、g
ag11 RLU＝2129）が同一の促進マルチプレックス試料
（Ｃ、Ｃ′）で観察され、これらの試料中には増幅され
るべきHIV DNAが存在しないことを示している。ポアソ
ン分布に基づくと、５つの鋳型を加えたレベルでは10個
のレプリカでの１回の失敗が予期されないわけではない
（ｐ≧0.065）。従って、これらの結果はこのマルチプ
レックス系は同じ反応で二つの異なる標的領域の単一の
コピーを検出できることを示している。 その他の実施態様も以下の請求の範囲内に含まれてい
る。
配列番号:1 （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ： 24 （Ｂ） 型： 核酸 （Ｃ） 鎖の数： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー： 直線状 （iii） 配列： 配列番号:2 （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ： 39 （Ｂ） 型： 核酸 （Ｃ） 鎖の数： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー： 直線状 （iii） 配列： 配列番号:3 （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ： 23 （Ｂ） 型： 核酸 （Ｃ） 鎖の数： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー： 直線状 （iii） 配列： 配列番号:4 （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ： 45 （Ｂ） 型： 核酸 （Ｃ） 鎖の数： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー： 直線状 （iii） 配列： 配列番号:5 （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ： 25 （Ｂ） 型： 核酸 （Ｃ） 鎖の数： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー： 直線状 （iii） 配列： 配列番号:6 （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ： 46 （Ｂ） 型： 核酸 （Ｃ） 鎖の数： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー： 直線状 （iii） 配列： 配列番号:7 （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ： 33 （Ｂ） 型： 核酸 （Ｃ） 鎖の数： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー： 直線状 （iii） 配列： 配列番号:8 （ｉ） 配列の特性： （Ａ） 配列の長さ： 49 （Ｂ） 型： 核酸 （Ｃ） 鎖の数： 一本鎖 （Ｄ） トポロジー： 直線状 （iii） 配列：
フロントページの続き (72)発明者 ビルヤード，エリザベス・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州92126, サン・ディエゴ，イジーアン・コート 7512 (72)発明者 ダッタグプタ，ナニブフシャン アメリカ合衆国カリフォルニア州92130, サン・ディエゴ，カーウッド・コート 4221 (56)参考文献 特開 平５−244951（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−500012（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−507197（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−500759（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/00 Ｍｅｄｌｉｎｅ
Claims (19)
- 【請求項１】試験試料中の標的核酸鎖中に存在する標的
領域を増幅する方法であって、以下の工程： 第１に、前記標的核酸鎖を少なくとも三種のオリゴヌク
レオチドプライマーの組み合わせと同時に接触させ、こ
こにおいて前記組み合わせは以下のものを含む： 前記標的領域の第１領域３′において標的核酸鎖とハイ
ブリダイズするプライマー領域を含む、第１オリゴヌク
レオチドプライマー、 前記標的領域の第２領域３′において標的核酸鎖とハイ
ブリダイズするプライマー領域を含む、第２オリゴヌク
レオチドプライマー、ここにおいて、前記第２領域は前
記第１領域の５′である、そして 相補的標的領域の第１相補領域３′において前記標的核
酸鎖に相補的な核酸にハイブリダイズするプライマー領
域を含む、第３オリゴヌクレオチドプライマー、 ここにおいて、前記第１または第２オリゴヌクレオチド
はさらにプロモーター領域を有する； 第２に、前記標的核酸鎖および前記少なくとも三種のオ
リゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを、RNA指向
性および／またはDNA指向性DNAポリメラーゼ活性、RNA
ポリメラーゼ活性、およびRNAse Ｈ活性を有する１種
またはそれ以上のタンパク質と接触させ；そして 前記標的領域をプライマー伸長条件下で増殖させる、こ
こにおいて、温度は二本鎖プライマー伸長産物が変性す
るようなサイクル化をさせない を含む、前記方法。 - 【請求項２】前記標的核酸鎖がDNA鎖であり、前記第２
の接触工程の前に前記標的核酸鎖および前記少なくとも
三種のオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを、
約60℃またはそれ以上で活性なDNAポリメラーゼ活性を
有する酵素と約60℃またはそれ以上で接触させる、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記第２の接触工程が、逆転写酵素の存在
下、約42℃またはそれ以上で行われる、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項４】前記標的核酸鎖および前記少なくとも三種
のオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせが、前記
第２の接触工程の前に、約95℃またはそれ以上に加熱さ
れる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】さらに、第４オリゴヌクレオチドプライマ
ーの使用を含む、ここにおいて前記第４オリゴヌクレオ
チドプライマーは、相補的標的領域の３′である第２相
補領域において前記標的核酸鎖に相補的な核酸にハイブ
リダイズするプライマー領域、および前記第１相補領域
の３′、ならびに前記第２オリゴヌクレオチドプライマ
ー領域がプロモーター領域を含む場合、プロモーター領
域、を含む、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項６】１種の前記プライマーが１種の他の前記プ
ライマーと異なる濃度で提供される、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項７】１種の前記プライマーが１種の他の前記プ
ライマーと異なる濃度で提供される、請求項５に記載の
方法。 - 【請求項８】２種の前記プライマーが他の前記プライマ
ーと異なる濃度で提供される、請求項５に記載の方法。 - 【請求項９】前記第２プライマーが前記プロモーター領
域を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】すべての前記酵素活性が逆転写酵素およ
びRNAポリメラーゼにより提供される、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１１】前記酵素活性がDNAポリメラーゼ活性を
有しないRNAse Ｈにより補給される、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項１２】前記DNAポリメラーゼが５′−３′エキ
ソヌクレアーゼ活性を欠失している、請求項２に記載の
方法。 - 【請求項１３】前記DNAポリメラーゼが、５′−３′エ
キソヌクレアーゼ活性をその天然型では有しているDNA
ポリメラーゼに由来する、請求項12に記載の方法。 - 【請求項１４】前記DNAポリメラーゼがバシラス（Bacil
lus）属の種のDNAポリメラーゼＩである、請求項12また
は13に記載の方法。 - 【請求項１５】前記種が、バシラス ステアロテルモフ
ィラス（Bacillus stearothermophilus）またはバシラ
ス カルドテナックス（Bacillus caldotenax）であ
る、請求項14に記載の方法。 - 【請求項１６】２種の外側プライマーが、前記標的核酸
鎖または前記標的核酸鎖に相補的な核酸に最大2000塩基
離れてハイブリダイズする、請求項１−15のいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項１７】２種の外側プライマーが、前記標的核酸
鎖または前記標的核酸鎖に相補的な核酸に最大500塩基
離れてハイブリダイズする、請求項16に記載の方法。 - 【請求項１８】２種の外側プライマーが、前記標的核酸
鎖または前記標的核酸鎖に相補的な核酸に最大350塩基
離れてハイブリダイズする、請求項17に記載の方法。 - 【請求項１９】１種の前記プライマーが１から10μＭの
間の濃度で提供され、別の前記プライマーが10から50μ
Ｍの濃度で提供される、請求項６に記載の方法。
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