JP3002115B2 - ヒト急性および慢性を含む持続性ストレス負荷における細胞内ＨＳＰ７０ｍＲＮＡの転写異常とその応用（新規ヒト細胞内ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡの転写発現とＨＳＰ７０ｍＲＮＡ転写異常との応用） - Google Patents
ヒト急性および慢性を含む持続性ストレス負荷における細胞内ＨＳＰ７０ｍＲＮＡの転写異常とその応用（新規ヒト細胞内ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡの転写発現とＨＳＰ７０ｍＲＮＡ転写異常との応用）Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト急性および慢性を
含む持続性ストレス負荷における細胞内ＨＳＰ７０ｍＲ
ＮＡの転写異常とその応用（新規ヒト細胞内ＳＨＳＰ７
０ｍＲＮＡの転写発現とＨＳＰ７０ｍＲＮＡ転写異常と
の応用）に関する。
含む持続性ストレス負荷における細胞内ＨＳＰ７０ｍＲ
ＮＡの転写異常とその応用（新規ヒト細胞内ＳＨＳＰ７
０ｍＲＮＡの転写発現とＨＳＰ７０ｍＲＮＡ転写異常と
の応用）に関する。
【０００２】
【発明の背景】ストレスと呼ばれる現象は、刺激と応答
を周辺の状況まで包合し、誘起的作用因子に反応する生
体内の状態を意味することである。しかし、ストレスと
いう言葉の普遍的な定義は困難であるが、仮定として生
体反応を引き起こす外的刺激要因をストレスと呼び、そ
れに対応する生体の機能的、構造的変化をストレス応答
と云える。
を周辺の状況まで包合し、誘起的作用因子に反応する生
体内の状態を意味することである。しかし、ストレスと
いう言葉の普遍的な定義は困難であるが、仮定として生
体反応を引き起こす外的刺激要因をストレスと呼び、そ
れに対応する生体の機能的、構造的変化をストレス応答
と云える。
【０００３】ところでストレスには、ストレスの種類が
色々変化しても、生起する症状は似通っている非特異的
応答がある、それがストレス応答の本質であろうか。つ
まり、ひとつのストレス作用因子は、非特異的応答と特
異的応答とを引き起こす両方の効果をもち、両者は修飾
することによって生体の反応性に変化を与える。いずれ
にせよストレスは、ストレスの種類が変化しても、引き
起こされる応答には共通性がある。これはストレス応答
の特徴である。また、ヒトの場合には、高度な精神活動
と文化活動を営んでいるために、心理的ストレス、生理
的ストレスがある。そこでストレスに対する反応を知る
場合、中枢神経系を中心とする生体調節系の機能をどれ
だけ理解出来るかが重要であろう。
色々変化しても、生起する症状は似通っている非特異的
応答がある、それがストレス応答の本質であろうか。つ
まり、ひとつのストレス作用因子は、非特異的応答と特
異的応答とを引き起こす両方の効果をもち、両者は修飾
することによって生体の反応性に変化を与える。いずれ
にせよストレスは、ストレスの種類が変化しても、引き
起こされる応答には共通性がある。これはストレス応答
の特徴である。また、ヒトの場合には、高度な精神活動
と文化活動を営んでいるために、心理的ストレス、生理
的ストレスがある。そこでストレスに対する反応を知る
場合、中枢神経系を中心とする生体調節系の機能をどれ
だけ理解出来るかが重要であろう。
【０００４】しかし、基礎的データの裏付けが十分でな
く、物質の変化で現象間の因果関係を見い出すには程遠
いのが現状である。しかしながら、生理的ストレス現象
は、物理的、科学的、複合的な因子分類によって、要因
分別が可能である。
く、物質の変化で現象間の因果関係を見い出すには程遠
いのが現状である。しかしながら、生理的ストレス現象
は、物理的、科学的、複合的な因子分類によって、要因
分別が可能である。
【０００５】そこで、基本的なストレスマーカーである
熱ショックタンパク（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ；ＨＳＰ）について、分子生物学的検索を行な
う。ＨＳＰは、熱によって誘導されることから命名され
た総称タンパク質であるが、熱以外のストレスでも似た
ようなタンパク質として合成される。これら一群のタン
パク質は、ストレス関連タンパク質と総称でき、加えら
れたストレス因子から生体を守るために機能していると
考えられ、ストレスに応答するものが、個体から組織、
細胞へと変化し、細胞も同レベルでストレスを受けてい
よう。そこで、細胞レベルでストレスの影響を把握する
ことが、ストレス応答を知る手がかりになるが、細胞レ
ベルでストレス応答のすべては解明されないことは判っ
ている。しかし、細胞レベルで、ストレスに対してＨＳ
Ｐが変動することは知られているが、その機構について
はよく判っていない。またストレス応答には、ＨＳＰの
中でもＨＳＰ７０キロダルトンタンパクが、その応答に
敏感であると同時に、多機能を有す。特に、ＨＳＰ７０
はシャペロン機能をもち、ストレス応答に反応してその
シャペロン機能の異変が発現し、細胞にストレス現象の
応答と異常化がでると考えるのである。これが、細胞レ
ベルでのストレス応答であろう。よって、後述のごと
く、ＨＳＰ７０について解明する。
熱ショックタンパク（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ；ＨＳＰ）について、分子生物学的検索を行な
う。ＨＳＰは、熱によって誘導されることから命名され
た総称タンパク質であるが、熱以外のストレスでも似た
ようなタンパク質として合成される。これら一群のタン
パク質は、ストレス関連タンパク質と総称でき、加えら
れたストレス因子から生体を守るために機能していると
考えられ、ストレスに応答するものが、個体から組織、
細胞へと変化し、細胞も同レベルでストレスを受けてい
よう。そこで、細胞レベルでストレスの影響を把握する
ことが、ストレス応答を知る手がかりになるが、細胞レ
ベルでストレス応答のすべては解明されないことは判っ
ている。しかし、細胞レベルで、ストレスに対してＨＳ
Ｐが変動することは知られているが、その機構について
はよく判っていない。またストレス応答には、ＨＳＰの
中でもＨＳＰ７０キロダルトンタンパクが、その応答に
敏感であると同時に、多機能を有す。特に、ＨＳＰ７０
はシャペロン機能をもち、ストレス応答に反応してその
シャペロン機能の異変が発現し、細胞にストレス現象の
応答と異常化がでると考えるのである。これが、細胞レ
ベルでのストレス応答であろう。よって、後述のごと
く、ＨＳＰ７０について解明する。
【０００６】
【発明の目的】本発明は、ヒト急性および慢性を含む持
続性ストレス負荷における細胞内ＨＳＰ７０ｍＲＮＡの
転写異常とその応用（新規ヒト細胞内ＳＨＳＰ７０ｍＲ
ＮＡの転写発現とＨＳＰ７０ｍＲＮＡ転写異常との応
用）を提供することを目的とする。
続性ストレス負荷における細胞内ＨＳＰ７０ｍＲＮＡの
転写異常とその応用（新規ヒト細胞内ＳＨＳＰ７０ｍＲ
ＮＡの転写発現とＨＳＰ７０ｍＲＮＡ転写異常との応
用）を提供することを目的とする。
【０００７】
【目的を達成するための手段】本発明の上記目的は、 １．図１に示す核酸配列に関してメッセンジャーＲＮＡ
からアミノ酸に翻訳されるアミノ酸配列のうち、翻訳開
始コドンのメチオニン（Ｍ）をＮｏ．１として、Ｎｏ．
８６のアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）までの配列８６ア
ミノ酸を特異的に認識する抗体の作製方法、
からアミノ酸に翻訳されるアミノ酸配列のうち、翻訳開
始コドンのメチオニン（Ｍ）をＮｏ．１として、Ｎｏ．
８６のアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）までの配列８６ア
ミノ酸を特異的に認識する抗体の作製方法、
【０００８】２．図１に示す核酸配列に関してメッセン
ジャーＲＮＡからアミノ酸に翻訳されるアミノ酸配列の
うち、翻訳開始コドンのメチオニン（Ｍ）をＮｏ．１と
して、Ｎｏ．８６のアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）まで
の配列８６アミノ酸配列の合成方法、
ジャーＲＮＡからアミノ酸に翻訳されるアミノ酸配列の
うち、翻訳開始コドンのメチオニン（Ｍ）をＮｏ．１と
して、Ｎｏ．８６のアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）まで
の配列８６アミノ酸配列の合成方法、
【０００９】３．図１に示す核酸配列番号１４４〜３０
５の有無を検出するにあたって、下記（３Ｃ）及び（４
Ｃ）オリゴマーを用いて、微量ＤＮＡやＲＮＡより作製
したｃＤＮＡを適度に増幅して検出する方法、 （３Ｃ）５′−ＴＴＴＣＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＴＴ−３′（１〜２０） （４Ｃ）５′−ＡＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣ−３′（４４７〜４ ２８）
５の有無を検出するにあたって、下記（３Ｃ）及び（４
Ｃ）オリゴマーを用いて、微量ＤＮＡやＲＮＡより作製
したｃＤＮＡを適度に増幅して検出する方法、 （３Ｃ）５′−ＴＴＴＣＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＴＴ−３′（１〜２０） （４Ｃ）５′−ＡＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣ−３′（４４７〜４ ２８）
【００１０】４．図１に示す核酸配列のうち核酸配列番
号１４４〜３０５を欠失したクローンを作製し、このク
ローンを用いて患者検体中のＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡの有
無を検出する方法、
号１４４〜３０５を欠失したクローンを作製し、このク
ローンを用いて患者検体中のＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡの有
無を検出する方法、
【００１１】５．分離細胞内ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合
成し、下記（３Ｃ）及び（４Ｃ）プライマーを用いてポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、この増幅
産物を電気泳動により確認して産物の位置より核酸配列
番号１４４〜３０５の転写欠失の有無を同定する方法、 （３Ｃ）５′−ＴＴＴＣＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＴＴ−３′（１〜２０） （４Ｃ）５′−ＡＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣ−３′（４４７〜４ ２８）
成し、下記（３Ｃ）及び（４Ｃ）プライマーを用いてポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、この増幅
産物を電気泳動により確認して産物の位置より核酸配列
番号１４４〜３０５の転写欠失の有無を同定する方法、 （３Ｃ）５′−ＴＴＴＣＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＴＴ−３′（１〜２０） （４Ｃ）５′−ＡＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣ−３′（４４７〜４ ２８）
【００１２】６．ＨＳＰ７０遺伝子産物を対象に、１〜
８６のアミノ酸配列特異抗体及びＬＨＳＰ７０抗体を用
いてＥＬＩＳＡ解析を行うことによって、１〜８６のア
ミノ酸配列の翻訳欠失の検出判定を行う方法、の各々に
よって達成される。
８６のアミノ酸配列特異抗体及びＬＨＳＰ７０抗体を用
いてＥＬＩＳＡ解析を行うことによって、１〜８６のア
ミノ酸配列の翻訳欠失の検出判定を行う方法、の各々に
よって達成される。
【００１３】
【００１４】
【発明の具体的な説明】図１〜図６は、分離決定したｃ
ＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列（ＬＨＳＰ７０ｍＲＮ
Ａ−ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡ）であ
り、図１はＨＳＰ７０ｍＲＮＡ（ＬＨＳＰ７０ｍＲＮ
Ａ）の全塩基配列、図２はＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡ（うつ
病患者）の全塩基配列、図３はＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡ
（ネフローゼ患者）の全塩基配列、図４はＨＳＰ７０
（ＬＨＳＰ７０）の遺伝子全アミノ酸配列、図５はＳＨ
ＳＰ７０（うつ病患者）の遺伝子全アミノ酸配列、図６
はＳＨＳＰ７０（ネフローゼ患者）の遺伝子全アミノ酸
配列を示す。また、表１は合成オリゴヌクレオチドプラ
イマー（２０ｍｅｒ）、表２はアミノ酸記号と塩基記号
を示す。
ＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列（ＬＨＳＰ７０ｍＲＮ
Ａ−ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡ）であ
り、図１はＨＳＰ７０ｍＲＮＡ（ＬＨＳＰ７０ｍＲＮ
Ａ）の全塩基配列、図２はＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡ（うつ
病患者）の全塩基配列、図３はＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡ
（ネフローゼ患者）の全塩基配列、図４はＨＳＰ７０
（ＬＨＳＰ７０）の遺伝子全アミノ酸配列、図５はＳＨ
ＳＰ７０（うつ病患者）の遺伝子全アミノ酸配列、図６
はＳＨＳＰ７０（ネフローゼ患者）の遺伝子全アミノ酸
配列を示す。また、表１は合成オリゴヌクレオチドプラ
イマー（２０ｍｅｒ）、表２はアミノ酸記号と塩基記号
を示す。
【００１５】以下の如くＨＳＰ７０について解明する。
先ず、健康人およびストレス負荷ヒトの末梢血より、リ
ンパ球画分を分離し、細胞内高分子ＤＮＡとＲＮＡを分
離精製する。細胞内の全ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮ
Ａを分離後、リバーストランスクリプターゼ酵素にて相
補的ＤＮＡ形に、つまり、ｃＤＮＡを合成する。そのｃ
ＤＮＡよりヒトｃＤＮＡライブラリーを作成する。ｃＤ
ＮＡライブラリーは、ｐＷＥＸ１５コスミドベクター
（ストラトジーン社）でＡＧ１宿主大腸菌を用いた。ク
ローニングは、ＰＣＲクローニングにて実施した。
先ず、健康人およびストレス負荷ヒトの末梢血より、リ
ンパ球画分を分離し、細胞内高分子ＤＮＡとＲＮＡを分
離精製する。細胞内の全ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮ
Ａを分離後、リバーストランスクリプターゼ酵素にて相
補的ＤＮＡ形に、つまり、ｃＤＮＡを合成する。そのｃ
ＤＮＡよりヒトｃＤＮＡライブラリーを作成する。ｃＤ
ＮＡライブラリーは、ｐＷＥＸ１５コスミドベクター
（ストラトジーン社）でＡＧ１宿主大腸菌を用いた。ク
ローニングは、ＰＣＲクローニングにて実施した。
【００１６】ＰＣＲクロニングに用いた合成オリゴヌク
レオチドプライマー（２０ｍｅｒ）は、表１に示す。
レオチドプライマー（２０ｍｅｒ）は、表１に示す。
【００１７】
【表１】
【００１８】ｃＤＮＡライブラリーよりクローニングし
たＨＳＰ７０関連クローンは、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
酵素を用いた７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ ｋｉｔ（ＵＳ
Ｂ社，ｖｅｒ．２）にてシーケンスし、その塩基配列を
決定した。健常人より得たＨＳＰ７０ｍＲＮＡクローン
の塩基配列は、図１に示す。また、ストレスを受けた人
より得たＨＳＰ７０ｍＲＮＡクローンの塩基配列は、図
２、図３に示す（図２は鬱病患者から、図３はネフロー
ゼ症候群患者から得たクローンの塩基配列）。さらに、
得られた各クローンのメッセンジャーＲＮＡより翻訳さ
れるアミノ酸配列は、図４（健常人）、図５（鬱病患
者）、図６（ネフローゼ症候群患者）に示す。
たＨＳＰ７０関連クローンは、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
酵素を用いた７−ｄｅａｚａ−ｄＧＴＰ ｋｉｔ（ＵＳ
Ｂ社，ｖｅｒ．２）にてシーケンスし、その塩基配列を
決定した。健常人より得たＨＳＰ７０ｍＲＮＡクローン
の塩基配列は、図１に示す。また、ストレスを受けた人
より得たＨＳＰ７０ｍＲＮＡクローンの塩基配列は、図
２、図３に示す（図２は鬱病患者から、図３はネフロー
ゼ症候群患者から得たクローンの塩基配列）。さらに、
得られた各クローンのメッセンジャーＲＮＡより翻訳さ
れるアミノ酸配列は、図４（健常人）、図５（鬱病患
者）、図６（ネフローゼ症候群患者）に示す。
【００１９】また、分離したリンパ球の、３７℃、４
３．５℃の培養系でも同様の結果が得られる。表２は、
使用したアミノ酸記号と塩基記号を示す。
３．５℃の培養系でも同様の結果が得られる。表２は、
使用したアミノ酸記号と塩基記号を示す。
【００２０】
【表２】
【００２１】よって、ヒトリンパ球細胞内のＨＳＰ７０
遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの転写には、２つ以上の
経路があり１つは、図１に示すごとく、正常なＨＳＰ７
０ｍＲＮＡの転写が起き、アミノ酸コーディングリージ
ョン１７３〜２０９４（図１の塩基番号）の１９２２塩
基からなるｍＲＮＡになる。
遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの転写には、２つ以上の
経路があり１つは、図１に示すごとく、正常なＨＳＰ７
０ｍＲＮＡの転写が起き、アミノ酸コーディングリージ
ョン１７３〜２０９４（図１の塩基番号）の１９２２塩
基からなるｍＲＮＡになる。
【００２２】一方、ストレス負荷を持続的にすると、細
胞内ＨＳＰ７０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写にお
いて、インターナルスプライシングが起き、転写異常が
発生する。
胞内ＨＳＰ７０遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写にお
いて、インターナルスプライシングが起き、転写異常が
発生する。
【００２３】その転写異常とは、図１に示す塩基配列番
号１４３と３０５でスプライシングが起き、塩基番号１
４４〜３０５（図１）がメッセンジャーＲＮＡに転写さ
れない。また、アミノ酸コーディングリージョンが塩基
番号４３１〜２０９４（図１）の１６６４塩基からなる
１６２塩基短い異常ｍＲＮＡになる（この異常ｍＲＮＡ
をＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡと称す、対して正常ｍＲＮＡを
ＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡと称す）。また、ＬＨＳＰ７０ｍ
ＲＮＡ、ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡより翻訳されるアミノ酸
の推定構造は、図４、図５、図６に示され、アミノ酸数
にしてＬＨＳＰ７０では６４０、ＳＨＳＰ７０では５５
４であり、ＳＨＳＰ７０では８６コのアミノ酸が少なく
なる。
号１４３と３０５でスプライシングが起き、塩基番号１
４４〜３０５（図１）がメッセンジャーＲＮＡに転写さ
れない。また、アミノ酸コーディングリージョンが塩基
番号４３１〜２０９４（図１）の１６６４塩基からなる
１６２塩基短い異常ｍＲＮＡになる（この異常ｍＲＮＡ
をＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡと称す、対して正常ｍＲＮＡを
ＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡと称す）。また、ＬＨＳＰ７０ｍ
ＲＮＡ、ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡより翻訳されるアミノ酸
の推定構造は、図４、図５、図６に示され、アミノ酸数
にしてＬＨＳＰ７０では６４０、ＳＨＳＰ７０では５５
４であり、ＳＨＳＰ７０では８６コのアミノ酸が少なく
なる。
【００２４】本発明においては、ヒトにおけるストレス
の持続的負荷において、末梢血分離リンパ球細胞内の熱
ショックタンパクの一つであるＨＳＰ７０のｍＲＮＡの
転写異常がインターナルスプライシングと云う現象で発
現する。また ２つ以上の転写経路（正常では、転写発
現しない）がある。いずれにせよ、ＳＨＳＰ７０ｍＲＮ
Ａの転写活性が起こる。ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡより翻訳
されるタンパクのアミノ酸数は、正常なＬＨＳＰ７０ｍ
ＲＮＡより翻訳れるアミノ酸数より８６少ない。また、
ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡによって出来るタンパクの推定分
子量は、６０６９９．４１（尚、ＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡ
では、６９８６４．２６）である。
の持続的負荷において、末梢血分離リンパ球細胞内の熱
ショックタンパクの一つであるＨＳＰ７０のｍＲＮＡの
転写異常がインターナルスプライシングと云う現象で発
現する。また ２つ以上の転写経路（正常では、転写発
現しない）がある。いずれにせよ、ＳＨＳＰ７０ｍＲＮ
Ａの転写活性が起こる。ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡより翻訳
されるタンパクのアミノ酸数は、正常なＬＨＳＰ７０ｍ
ＲＮＡより翻訳れるアミノ酸数より８６少ない。また、
ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡによって出来るタンパクの推定分
子量は、６０６９９．４１（尚、ＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡ
では、６９８６４．２６）である。
【００２５】このように、ストレス負荷ヒト細胞におい
て、ＨＳＰ７０遺伝子の異常転写が発生し、ＳＨＳＰ７
０ｍＲＮＡへの異常転写活性が発現、それによって、本
来のＨＳＰ７０遺伝子タンパクの機能を失うと同時に、
シャペロンとしての機能も失う。特に、シャペロン機能
を失うことは、他の多くの遺伝子産生タンパクの高次構
造形成にも影響する。よって、細胞の複製や修復−再修
復、また遺伝子タンパクの産生−複製−再構成形成にも
異常をきたすと考えられる。
て、ＨＳＰ７０遺伝子の異常転写が発生し、ＳＨＳＰ７
０ｍＲＮＡへの異常転写活性が発現、それによって、本
来のＨＳＰ７０遺伝子タンパクの機能を失うと同時に、
シャペロンとしての機能も失う。特に、シャペロン機能
を失うことは、他の多くの遺伝子産生タンパクの高次構
造形成にも影響する。よって、細胞の複製や修復−再修
復、また遺伝子タンパクの産生−複製−再構成形成にも
異常をきたすと考えられる。
【００２６】このような事から、ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡ
転写異常発現の検出やその特異的タンパクの検出をする
事は、細胞のストレス負荷程度を知ることができると同
時に、ストレス負荷による異常化を予知することが可能
となる。また個々の細胞の異常を知ることは、生体全体
の異常あるいは異常化をも知り得る指標になる。従っ
て、図１に示す核酸配列番号１４４〜３０５を、ゲノム
ＤＮＡやｍＲＮＡの相補的転化ｃＤＮＡより特異的検出
すること、図５と６に示すアミノ酸配列に対する抗体で
そのタンパク質の有無を検出することが有効である。
転写異常発現の検出やその特異的タンパクの検出をする
事は、細胞のストレス負荷程度を知ることができると同
時に、ストレス負荷による異常化を予知することが可能
となる。また個々の細胞の異常を知ることは、生体全体
の異常あるいは異常化をも知り得る指標になる。従っ
て、図１に示す核酸配列番号１４４〜３０５を、ゲノム
ＤＮＡやｍＲＮＡの相補的転化ｃＤＮＡより特異的検出
すること、図５と６に示すアミノ酸配列に対する抗体で
そのタンパク質の有無を検出することが有効である。
【００２７】
【実施例】ストレス持続的負荷ヒトのヘパリン加末梢血
５ｍｌより、比重分離法にてリンパ球画分を分離精製す
る。分離した細胞画分は、ＨＭＷ溶液５ｍｌに浮遊し、
１５ｍｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒＡを加え、３０分
後に遠心分離して上清を捨て、次にｌｙｓｉｓ ｂｕｆ
ｆｅｒＢを５ｍｌ加え、６０分間細胞核分を溶解し細胞
内の高分子ＤＮＡを溶出させ、フェノール／クロライド
法にて高分子ＤＮＡを分離抽出する。得た高分子ＤＮＡ
は、ＴＥ溶液０．５ｍｌに再溶解する。ＤＮＡ濃度は、
分光光度計にてＯＤ２６０ｎｍにて吸光度を測定し、Ｄ
ＮＡ濃度を計算し求める。最終濃度５００ｎｇ／μｌに
調整する。使用時まで４℃保管する。
５ｍｌより、比重分離法にてリンパ球画分を分離精製す
る。分離した細胞画分は、ＨＭＷ溶液５ｍｌに浮遊し、
１５ｍｌのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒＡを加え、３０分
後に遠心分離して上清を捨て、次にｌｙｓｉｓ ｂｕｆ
ｆｅｒＢを５ｍｌ加え、６０分間細胞核分を溶解し細胞
内の高分子ＤＮＡを溶出させ、フェノール／クロライド
法にて高分子ＤＮＡを分離抽出する。得た高分子ＤＮＡ
は、ＴＥ溶液０．５ｍｌに再溶解する。ＤＮＡ濃度は、
分光光度計にてＯＤ２６０ｎｍにて吸光度を測定し、Ｄ
ＮＡ濃度を計算し求める。最終濃度５００ｎｇ／μｌに
調整する。使用時まで４℃保管する。
【００２８】ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒＡ（１５５ｍＭ
ＮＨ4Ｃｌ−１０ｍＭ ＫＨＣＯ3−０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，ｐＨ７．４）、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒＢ（１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−１０ｍＭ ＥＤＴＡ−８ｍＭ Ｕ
ｒｅａ−１％ＳＤＳ，ｐＨ７．０）、ＨＭＷ溶液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−０．１５Ｍ ＮａＣｌ−１０ｍＭＥＤ
ＴＡ，ｐＨ８．０）、ＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）。
ＮＨ4Ｃｌ−１０ｍＭ ＫＨＣＯ3−０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，ｐＨ７．４）、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒＢ（１
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−１０ｍＭ ＥＤＴＡ−８ｍＭ Ｕ
ｒｅａ−１％ＳＤＳ，ｐＨ７．０）、ＨＭＷ溶液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−０．１５Ｍ ＮａＣｌ−１０ｍＭＥＤ
ＴＡ，ｐＨ８．０）、ＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）。
【００２９】次に表１の合成オリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて、ＰＣＲ遺伝子増幅を行なう。ＰＣＲ遺伝
子増幅に使用するプラオマーの組合せは、３ｃ／４ｃ、
１０５ｃ／１０６ｃ、１０７ｃ／１０８ｃ、１０９ｃ／
１１０ｃ、１１１ｃ／１１２ｃである。ＰＣＲ遺伝子増
幅法は、９６℃Ｘ３分、５５℃Ｘ１分ー７２℃Ｘ３０秒
ー９４℃Ｘ３０秒の４０回、５５℃Ｘ２分ー７２℃Ｘ１
分にておこなう。増幅ＤＮＡの検定は、３％ＭＥアガロ
ースを用い、サブマリン水平電気泳動法にて行なう。泳
動されたＤＮＡの検出は、エチジュウムブロマイド染色
にて行ない、最後に蛍光写真を撮る。サイズの検定は、
ＨａｅＩＩＩ消化ΦＸ１７４プラスミドＤＮＡの消化産
物ＤＮＡの大きさにて決める。ＰＣＲ遺伝子増幅に用い
た酵素は、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベ
ーリンガー社）２単位である。
マーを用いて、ＰＣＲ遺伝子増幅を行なう。ＰＣＲ遺伝
子増幅に使用するプラオマーの組合せは、３ｃ／４ｃ、
１０５ｃ／１０６ｃ、１０７ｃ／１０８ｃ、１０９ｃ／
１１０ｃ、１１１ｃ／１１２ｃである。ＰＣＲ遺伝子増
幅法は、９６℃Ｘ３分、５５℃Ｘ１分ー７２℃Ｘ３０秒
ー９４℃Ｘ３０秒の４０回、５５℃Ｘ２分ー７２℃Ｘ１
分にておこなう。増幅ＤＮＡの検定は、３％ＭＥアガロ
ースを用い、サブマリン水平電気泳動法にて行なう。泳
動されたＤＮＡの検出は、エチジュウムブロマイド染色
にて行ない、最後に蛍光写真を撮る。サイズの検定は、
ＨａｅＩＩＩ消化ΦＸ１７４プラスミドＤＮＡの消化産
物ＤＮＡの大きさにて決める。ＰＣＲ遺伝子増幅に用い
た酵素は、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ベ
ーリンガー社）２単位である。
【００３０】ＨＳＰ７０遺伝子ゲノムのＰＣＲ遺伝子増
幅データは表３に示す。
幅データは表３に示す。
【００３１】
【表３】 これは、ヒトＨＳＰ遺伝子マップとＰＣＲ遺伝子増幅産
物の大きさを示す。
物の大きさを示す。
【００３２】
【表４】 ゲノムでは、健常人やストレス持続的負荷ヒトで遺伝子
異常はない。
異常はない。
【００３３】次は、分離リンパ球画分より細胞内ＲＮＡ
をグアニジンチオシアネート法にて全ＲＮＡを分離し、
オリゴ−ｄＴセルロースを用いてポリＡ ＲＮＡ，つま
りｍＲＮＡを分離精製する。分離精製したｍＲＮＡおよ
び全ＲＮＡより相補的ＤＮＡ，所謂ｃＤＮＡを合成す
る。ｃＤＮＡの合成は、ベーリンガー社のｃＤＮＡ合成
キットを用いる。ｃＤＮＡ合成に用いた酵素は、ＡＭＶ
リバーストランスクリプターゼである。ｃＤＮＡの生成
程度は、内部コントロールとして、βーアクチンの遺伝
子構造配列の特異的部分配列を用いた。
をグアニジンチオシアネート法にて全ＲＮＡを分離し、
オリゴ−ｄＴセルロースを用いてポリＡ ＲＮＡ，つま
りｍＲＮＡを分離精製する。分離精製したｍＲＮＡおよ
び全ＲＮＡより相補的ＤＮＡ，所謂ｃＤＮＡを合成す
る。ｃＤＮＡの合成は、ベーリンガー社のｃＤＮＡ合成
キットを用いる。ｃＤＮＡ合成に用いた酵素は、ＡＭＶ
リバーストランスクリプターゼである。ｃＤＮＡの生成
程度は、内部コントロールとして、βーアクチンの遺伝
子構造配列の特異的部分配列を用いた。
【００３４】
【表５】 となり、分離細胞内ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成し、Ｈ
ＳＰ７０ｍＲＮＡの転写発現を、ＰＣＲ遺伝子増幅法に
て解析すると、合成オリゴヌクレチドプライマー３ｃ／
４ｃ組合せで、異常転写産物の存在が、うつ病（５、
７）およびネフローゼ症候群（６、８）で検出された。
また中間体（７、８）もある。
ＳＰ７０ｍＲＮＡの転写発現を、ＰＣＲ遺伝子増幅法に
て解析すると、合成オリゴヌクレチドプライマー３ｃ／
４ｃ組合せで、異常転写産物の存在が、うつ病（５、
７）およびネフローゼ症候群（６、８）で検出された。
また中間体（７、８）もある。
【００３５】他の部分では、異常は認められない。つま
り、プライマー３ｃ／４ｃ組合せのＰＣＲ遺伝子増幅の
データより健常人を基準にして４４７ｂｐ−２８５ｂｐ
＝１６２ｂｐとなり、ＨＳＰ７０遺伝子のｍＲＮＡへの
転写異常が発現する。その転写異常は、インターナルス
プライシングによると考えられると同時に、もう一つの
転写経路があることも考慮する必要もある。いずれにせ
よ、ＨＳＰ７０遺伝子のｍＲＮＡへの転写で、１６２塩
基短い異常転写ｍＲＮＡを検出することは意義がある。
この異常転写ｍＲＮＡをＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡと命名、
対して、正常転写ｍＲＮＡをＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡとし
た。
り、プライマー３ｃ／４ｃ組合せのＰＣＲ遺伝子増幅の
データより健常人を基準にして４４７ｂｐ−２８５ｂｐ
＝１６２ｂｐとなり、ＨＳＰ７０遺伝子のｍＲＮＡへの
転写異常が発現する。その転写異常は、インターナルス
プライシングによると考えられると同時に、もう一つの
転写経路があることも考慮する必要もある。いずれにせ
よ、ＨＳＰ７０遺伝子のｍＲＮＡへの転写で、１６２塩
基短い異常転写ｍＲＮＡを検出することは意義がある。
この異常転写ｍＲＮＡをＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡと命名、
対して、正常転写ｍＲＮＡをＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡとし
た。
【００３６】このデータを観察すると、異常転写ＳＨＳ
Ｐ７０ｍＲＮＡの発現は、個体がストレスを受け、その
ストレスが細胞まで影響し、細胞のライフサイクルに障
害をきたしていることが考えられる。ＨＳＰ７０遺伝子
タンパクは、細胞の自己防御に働くと同時に、重要なシ
ャペロン機能も有し、他の遺伝子タンパクの高次構造形
成にも機能しているのであるから、転写異常によってそ
の機能が喪失される。また、ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡより
翻訳されるタンパクは、ＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡによって
翻訳されるタンパクより、８６アミノ酸少ないと同時
に、ＡＴＰ活性ドメンもなくなることから、機能低下や
機能異常が発生する。このことから、異常転写ＳＨＳＰ
７０ｍＲＮＡ、つまりＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡに対して
短い１６２塩基部分の検出は、細胞ストレスを知る重要
なマーカーと考える。
Ｐ７０ｍＲＮＡの発現は、個体がストレスを受け、その
ストレスが細胞まで影響し、細胞のライフサイクルに障
害をきたしていることが考えられる。ＨＳＰ７０遺伝子
タンパクは、細胞の自己防御に働くと同時に、重要なシ
ャペロン機能も有し、他の遺伝子タンパクの高次構造形
成にも機能しているのであるから、転写異常によってそ
の機能が喪失される。また、ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡより
翻訳されるタンパクは、ＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡによって
翻訳されるタンパクより、８６アミノ酸少ないと同時
に、ＡＴＰ活性ドメンもなくなることから、機能低下や
機能異常が発生する。このことから、異常転写ＳＨＳＰ
７０ｍＲＮＡ、つまりＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡに対して
短い１６２塩基部分の検出は、細胞ストレスを知る重要
なマーカーと考える。
【００３７】また、ＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡの塩基配列Ｎ
ｏ．１４４〜３０５の１６２塩基およびＮｏ．１〜４４
７の４４７塩基を組込んだプラスミドクローンを作成す
る。そのクローン名は、ｐＬＨＳＰ１６２，ｐＬＨＳＰ
４４７とした。クローン化ベクターには、ｐＵＣ１９プ
ラスミドベクターを用い、宿主大腸菌ＤＨ５αを用い
た。
ｏ．１４４〜３０５の１６２塩基およびＮｏ．１〜４４
７の４４７塩基を組込んだプラスミドクローンを作成す
る。そのクローン名は、ｐＬＨＳＰ１６２，ｐＬＨＳＰ
４４７とした。クローン化ベクターには、ｐＵＣ１９プ
ラスミドベクターを用い、宿主大腸菌ＤＨ５αを用い
た。
【００３８】このクローンとユニバーサルプライマーを
用いアンチセンス側を、ｋｌｅｎｏｗ酵素で伸長を｛α
３２ーＰ｝ｄＣＴＰを行い、３２ＰーＤＮＡを分離精製
する。これとサンプルＲＮＡをハイブリダイズし、その
後Ｓ１ヌクレアーゼ酵素で処理し熱変性して、変性アク
リルアミドゲルで電気泳動する。泳動終了後、３ＭＭペ
ーパーに転移し乾燥して、Ｘ−ｒａｙフイルムにオート
ラジオグラフィーをし解析する。
用いアンチセンス側を、ｋｌｅｎｏｗ酵素で伸長を｛α
３２ーＰ｝ｄＣＴＰを行い、３２ＰーＤＮＡを分離精製
する。これとサンプルＲＮＡをハイブリダイズし、その
後Ｓ１ヌクレアーゼ酵素で処理し熱変性して、変性アク
リルアミドゲルで電気泳動する。泳動終了後、３ＭＭペ
ーパーに転移し乾燥して、Ｘ−ｒａｙフイルムにオート
ラジオグラフィーをし解析する。
【００３９】
【表６】 となり、ＨＳＰ７０遺伝子のｍＲＮＡへの転写で、正常
転写ｍＲＮＡ（ＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡ）と異常転写ｍＲ
ＮＡ（ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡ）が検出される。
転写ｍＲＮＡ（ＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡ）と異常転写ｍＲ
ＮＡ（ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡ）が検出される。
【００４０】また、ＨＳＰ７０（ＬＨＳＰ７０）遺伝子
タンパク抗体と、そのアミノ酸配列Ｎｏ．１〜８６に対
する抗体でＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡ、ＳＨＳＰ７０ｍＲＮ
Ａから翻訳産生されたタンパクの検出
タンパク抗体と、そのアミノ酸配列Ｎｏ．１〜８６に対
する抗体でＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡ、ＳＨＳＰ７０ｍＲＮ
Ａから翻訳産生されたタンパクの検出
【００４１】
【表７】 のように、ＨＳＰ７０遺伝子の異常転写遺伝子産物を検
出できる。
出できる。
【００４２】
【発明の効果】本発明によれば、ヒト急性および慢性を
含む持続性ストレス負荷における細胞内ＨＳＰ７０ｍＲ
ＮＡの転写異常とその応用（新規ヒト細胞内ＳＨＳＰ７
０ｍＲＮＡの転写発現とＨＳＰ７０ｍＲＮＡ転写異常と
の応用）を提供できる。
含む持続性ストレス負荷における細胞内ＨＳＰ７０ｍＲ
ＮＡの転写異常とその応用（新規ヒト細胞内ＳＨＳＰ７
０ｍＲＮＡの転写発現とＨＳＰ７０ｍＲＮＡ転写異常と
の応用）を提供できる。
【図１】ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ（ＬＨＳＰ７０ｍＲＮＡ）
の全塩基配列
の全塩基配列
【図２】ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡ（うつ病患者）の全塩基
配列
配列
【図３】ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡ（ネフローゼ患者）の全
塩基配列
塩基配列
【図４】ＨＳＰ７０（ＬＨＳＰ７０）の遺伝子全アミノ
酸配列
酸配列
【図５】ＳＨＳＰ７０（うつ病患者）の遺伝子全アミノ
酸配列
酸配列
【図６】ＳＨＳＰ７０（ネフローゼ患者）の遺伝子全ア
ミノ酸配列
ミノ酸配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ラーリ タブリュ．ハンキンズ 神奈川県横浜市保土ケ谷区神戸町106番 地 株式会社保健科学研究所内 (72)発明者 久川 芳三 神奈川県横浜市保土ケ谷区神戸町106番 地 株式会社保健科学研究所内 (56)参考文献 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏ ｌ．32，Ｎｏ．４（1990）ｐ．242−251 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ
Claims (6)
- 【請求項１】図１に示す核酸配列に関してメッセンジャ
ーＲＮＡからアミノ酸に翻訳されるアミノ酸配列のう
ち、翻訳開始コドンのメチオニン（Ｍ）をＮｏ．１とし
て、Ｎｏ．８６のアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）までの
配列８６アミノ酸を特異的に認識する抗体の作製方法。 - 【請求項２】図１に示す核酸配列に関してメッセンジャ
ーＲＮＡからアミノ酸に翻訳されるアミノ酸配列のう
ち、翻訳開始コドンのメチオニン（Ｍ）をＮｏ．１とし
て、Ｎｏ．８６のアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）までの
配列８６アミノ酸配列の合成方法。 - 【請求項３】図１に示す核酸配列番号１４４〜３０５の
有無を検出するにあたって、下記（３Ｃ）及び（４Ｃ）
オリゴマーを用いて、微量ＤＮＡやＲＮＡより作製した
ｃＤＮＡを適度に増幅して検出する方法。 （３Ｃ）５′−ＴＴＴＣＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＴＴ−３′（１〜２０） （４Ｃ）５′−ＡＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣ−３′（４４７〜４ ２８） - 【請求項４】図１に示す核酸配列のうち核酸配列番号１
４４〜３０５を欠失したクローンを作製し、このクロー
ンを用いて患者検体中のＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡの有無を
検出する方法。 - 【請求項５】分離細胞内ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを合成
し、下記（３Ｃ）及び（４Ｃ）プライマーを用いてポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、この増幅産
物を電気泳動により確認して産物の位置より核酸配列番
号１４４〜３０５の転写欠失の有無を同定する方法。 （３Ｃ）５′−ＴＴＴＣＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＣＣＣＧＴＴ−３′（１〜２０） （４Ｃ）５′−ＡＡＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＣ−３′（４４７〜４ ２８） - 【請求項６】ＨＳＰ７０遺伝子産物を対象に、１〜８６
のアミノ酸配列特異抗体及びＬＨＳＰ７０抗体を用いて
ＥＬＩＳＡ解析を行うことによって、１〜８６のアミノ
酸配列の翻訳欠失の検出判定を行う方法。
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| JP7158581A JP3002115B2 (ja) | 1995-06-01 | 1995-06-01 | ヒト急性および慢性を含む持続性ストレス負荷における細胞内ＨＳＰ７０ｍＲＮＡの転写異常とその応用（新規ヒト細胞内ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡの転写発現とＨＳＰ７０ｍＲＮＡ転写異常との応用） |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7158581A JP3002115B2 (ja) | 1995-06-01 | 1995-06-01 | ヒト急性および慢性を含む持続性ストレス負荷における細胞内ＨＳＰ７０ｍＲＮＡの転写異常とその応用（新規ヒト細胞内ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡの転写発現とＨＳＰ７０ｍＲＮＡ転写異常との応用） |
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| JP11257146A Division JP2000069999A (ja) | 1999-09-10 | 1999-09-10 | ヒト急性および慢性を含む持続性ストレス負荷における細胞内ＨＳＰ７０ｍＲＮＡの転写異常とその応用（新規ヒト細胞内ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡの転写発現とＨＳＰ７０ｍＲＮＡ転写異常との応用） |
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| JPH08322577A JPH08322577A (ja) | 1996-12-10 |
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| JP7158581A Expired - Fee Related JP3002115B2 (ja) | 1995-06-01 | 1995-06-01 | ヒト急性および慢性を含む持続性ストレス負荷における細胞内ＨＳＰ７０ｍＲＮＡの転写異常とその応用（新規ヒト細胞内ＳＨＳＰ７０ｍＲＮＡの転写発現とＨＳＰ７０ｍＲＮＡ転写異常との応用） |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8268356B2 (en) | 2007-11-16 | 2012-09-18 | Asahi Kasei Chemicals Corporation | Aqueous film coating solution, film coated granule and tablet using the same |
-
1995
- 1995-06-01 JP JP7158581A patent/JP3002115B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．４（１９９０）ｐ．２４２−２５１ |
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|---|---|---|---|---|
| US8268356B2 (en) | 2007-11-16 | 2012-09-18 | Asahi Kasei Chemicals Corporation | Aqueous film coating solution, film coated granule and tablet using the same |
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| Publication number | Publication date |
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| JPH08322577A (ja) | 1996-12-10 |
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