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JP3080771B2 - ジヌクレオシドポリリン酸又はその誘導体の製造方法 - Google Patents

ジヌクレオシドポリリン酸又はその誘導体の製造方法

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JP3080771B2
JP3080771B2 JP04125668A JP12566892A JP3080771B2 JP 3080771 B2 JP3080771 B2 JP 3080771B2 JP 04125668 A JP04125668 A JP 04125668A JP 12566892 A JP12566892 A JP 12566892A JP 3080771 B2 JP3080771 B2 JP 3080771B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は，医薬品又はその原料と
して有用なジヌクレオシドポリリン酸又はその誘導体の
製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ジアデノシンポリリン酸又はその誘導体
は，Ｇ1 阻害を起こしたＢＨＫ細胞に対するＤＮＡ合成
の促進作用〔エフ・グルムト（F.Grummt）, プロシーデ
ィング・オブ・ナシヨナル・アカデミック・サイエンス
（Pro.N.A.S.）７５巻，３７１頁（1978）〕，リン酸化
の阻害作用〔ピー・エフ・マネス（P.F.Maness）ら，ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bi
ol.Chem.）２５８巻，４０５５頁（1983）〕，血小板凝
集阻害作用〔エム・ジェイ・ハリソン（M.J.Harrison）
ら，フェブス・レターズ（FEBS Letters）５４巻，５７
頁（1975）〕等の生理作用を有している。このように，
ジアデノシンポリリン酸をはじめとするジヌクレオシド
ポリリン酸（以下ＮｐｎＮ’という。）又はその誘導体
は医薬品及び医薬品原料としての利用が期待されている
物質である。このジアデノシンポリリン酸又はその誘導
体を得る方法としては，ヨーロピアン・ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）１２６巻，
１３５頁（1982）には，エシエリキア・コリ由来のリジ
ル−ｔＲＮＡ合成酵素，ヒスチジル−ｔＲＮＡ合成酵
素，フェニルアラニル−ｔＲＮＡ合成酵素，酵母由来の
リジル−ｔＲＮＡ合成酵素，フェニルアラニル−ｔＲＮ
Ａ合成酵素，フザリウム由来のフェニルアラニル−ｔＲ
ＮＡ合成酵素，羊肝細胞由来のフェニルアラニル−ｔＲ
ＮＡ合成酵素等の種々のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵
素によりアデノシン−５’−三リン酸（以下ＡＴＰとい
う。）からジアデノシン四リン酸（以下Ａｐ4Ａとい
う。）が，また，ＡＴＰの誘導体である２’−デオキシ
アデノシン−５’−三リン酸からＡｐ4Ａの誘導体であ
るジデオキシアデノシン四リン酸が合成されることが報
告されている。また，バイオケミストリー（Biochemist
ry）２７巻，２８５９頁（1988）には，ジアデノシン四
リン酸ホスホリラーゼ（以下Ａｐ4Ａホスホリラーゼと
いう。）の触媒作用により，ＡＴＰ又はその誘導体とア
デノシン−５’−ホスホスルフェート（以下ＡＰＳとい
う。）とを反応させてＮｐｎＮ’を合成する方法が提案
されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし，上記した各ア
ミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素の触媒作用によりＡＴＰ
又はその誘導体とアミノ酸とを反応させてＮｐｎＮ’を
合成する方法では，触媒として用いるアミノアシル−ｔ
ＲＮＡを得るために，培養後の菌体あるいは肝細胞を破
砕後，酵素を精製する操作を経ているが，天然に存在す
る菌体あるいは細胞中のアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵
素の含有量は極わずかであるために，目的とするＮｐｎ
Ｎ’を製造する際，大量の菌体を培養しあるいは大量の
細胞を用意し，処理しなければならないという欠点があ
った。また，ＡＰＳを用いる方法では，原料となるＡＰ
Ｓが不安定で高価であること及びＡＴＰ又はその誘導体
（文献ではＡＴＰ）からのＮｐｎＮ’（文献ではＡｐｎ
Ｎ’）への変換収率が低いためＡＴＰ又はその誘導体か
らＮｐｎＮ’を合成するのにコスト的な問題があった。
本発明は上記のような問題を解決するものであって，高
純度のＮｐｎＮ’又はその誘導体を高収率で容易に得る
ことができる製造方法を提供することを目的とする。
【０００４】本発明者らは，このような課題を解決する
ために鋭意研究の結果，ＡＴＰスルフリラーゼとＡｐ4
Ａホスホリラーゼの存在下にＡＴＰ又はその誘導体とス
ルフェートを基質にして反応することにより，驚くべき
ことに高変換率でＮｐｎＮ’又はその誘導体が製造でき
ることを，さらにこの反応系にアデノシン５’−二リン
酸（以下ＡＤＰという。）をＡＴＰに変換する酵素を共
存させることにより，高純度でかつ高収率のＮｐｎＮ’
又はその誘導体が製造できることを見出し，本発明を完
成するに至った。すなわち，本発明は，ＡＴＰ又はその
誘導体およびスルフェートを反応基質として用い，ＡＴ
ＰスルフリラーゼおよびＡｐ4Ａホスホリラーゼの二種
の酵素を触媒とする二段階反応によりＮｐｎＮ’又はそ
の誘導体を生成させることを特徴とするＮｐｎＮ’又は
その誘導体の製造方法及び，ＡＤＰをＡＴＰに変換する
酵素の存在下にＡＴＰ又はその誘導体およびスルフェー
トを反応基質として用い，ＡＴＰスルフリラーゼおよび
Ａｐ4Ａホスホリラーゼの二種の酵素を触媒とする二段
階反応によりＮｐｎＮ’又はその誘導体を生成させるこ
とを特徴とするＮｐｎＮ’又はその誘導体の製造方法を
要旨とするものである。
【０００５】以下，本発明を詳細に説明する。本発明の
ＮｐｎＮ’又はその誘導体の生成に関与する酵素反応
は，ＡＴＰからＡｐ4Ａを製造する方法を例に示すと下
記式１，式２のごとくである。すなわち，ＡＴＰとスル
フェートからＡＴＰスルフリラーゼの触媒作用によりＡ
ＴＰを硫酸化し（式１），生じたＡＰＳとＡＴＰからＡ
ｐ4Ａホスホリラーゼの触媒作用によりＡｐ4Ａを製造す
る（式２）という二段階反応によるものである。
【０００６】また通常，反応の平衡をいっそうＡｐ4Ａ
生成の方向に傾けるために，式３に示すように，ピロリ
ン酸をリン酸に加水分解する酵素，すなわち，ピロホス
ファターゼ（以下ＰＰａｓｅという。）を共存させるこ
とが好ましい。
【０００７】
【式１】
【０００８】本発明でいうＮｐｎＮ’の誘導体とは，ジ
アデノシンポリリン酸の構造を基本骨格として有する化
合物であって，その構成部分であるＡＴＰ又はその誘導
体から変換される化合物をいう。このようなＮｐｎＮ’
の誘導体としては，アデニン環のＮ６位アルキル化，カ
ルボキシアルキル化，ベンゾイル化，カルボキシベンゾ
イル化誘導体，アデニン環のハロゲン化誘導体，ヒドロ
キシ誘導体，デアミノ誘導体，デオキシアミノ誘導体，
Ｎ6，Ｎ6 −ジカルボキシメチルアデノシン四リン酸及び
五リン酸，Ｎ6，Ｎ6 −ジカルボキシエチルアデノシン四
リン酸及び五リン酸，Ｎ6，Ｎ6 −（Ｐ−ジカルボキシベ
ンゾイル）アデノシン四リン酸及び五リン酸，ジ８−ブ
ロムアデノシン四リン酸及びこれらの化合物の誘導体等
が具体例として挙げられる。ヌクレオシド（Ｎ，Ｎ’）
としては，アデノシン，グアノシン等が挙げられる。
【０００９】本発明に用いられるＡＴＰスルフリラーゼ
とＡｐ4Ａホスホリラーゼは，これらを組み合わせてＡ
ｐ4 Ａを合成する能力を有するものであればいかなるも
のでもよい。ＡＴＰスルフリラーゼとＡｐ4Ａホスホリ
ラーゼは，例えば，サッカロマイセス・セルビシエ（Ｉ
ＦＯ１００８）等の酵母由来の酵素，バチルス・ステア
ロサーモフィルス（ＮＣＡ１５０３株）やバチルス・コ
アギュランス（ＡＴＣＣ７０５０株）等のバチルス属や
サーマス属などの好熱性細菌由来の酵素などが挙げられ
る。さらにＡｐ4Ａホスホリラーゼにおいてはエシエリ
キア・コリ（ＪＭ１０１Ｔｒ，Ｙ１０８９，ＩＢＰＣ１
１１），サッカロマイセス・セルビシエＣＭＹ２１４）
由来の酵素等を，ＡＴＰスルフリラーゼにおいてはペニ
シリウム・クリソゲニム（ＩＦＯ４６２６），アスペル
ギルス・ニガー，ネウロスボラ・クラツサ由来の酵素等
を挙げることができる。また，これら微生物の遺伝子を
導入した細菌も含まれる。
【００１０】また本発明に用いられるＡＤＰをＡＴＰに
変換する酵素としては，酢酸キナーゼ，カルバミン酸キ
ナーゼ，クレアチンキナーゼ，３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ，ピルビン酸キナーゼ，ポリリン酸キナーゼな
ど多くのものが使用できるが，酵素の入手の容易さなど
を勘案すると，酢酸キナーゼを使用するのが最も有利で
ある。
【００１１】またＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素として
は，エシエリキア・コリ由来の酵素，酵母由来の酵素，
バチルス属やサーマス属などの耐熱性細菌由来の酵素な
どを具体例としてあげることができる。
【００１２】エシエリキア・コリ，酵母，バチルス属や
サーマス属等の培養は周知の方法で行うことができる。
本発明における細菌を培養するに際して用いられる栄養
培地に関しては，炭素源として，例えば，グルコース，
シュークロース，フルクトース，殿粉加水分解物，糖
密，亜硫酸パルプ廃液の糖類，酢酸，乳酸等の有機酸
類，さらには使用する細菌が資化しうるアルコール類，
油脂，脂肪酸およびグリセリン等が使用でき，窒素源と
して，例えば，硫酸アンモニウム，塩化アンモニウム，
リン酸アンモニウム，アンモニア，アミノ酸，ペプト
ン，肉エキス，酵母エキス等の無機又は有機物が使用で
きる。さらに無機塩類として，例えば，カリウム，ナト
リウム，リン酸，亜鉛，鉄，マグネシウム，マンガン，
銅，カルシウム，コバルト等の各塩類，必要に応じて微
量金属塩，コーンステイープリカー，ビタミン類，核酸
等を使用してもよく，細菌の一般的栄養培地が使用でき
る。これらの培地を用いて，細菌を１０〜８０℃で，２
〜６時間，好気的に培養すればよい。
【００１３】これらの菌体から上記の三種の酵素を得る
ためには，例えば，先ず培養物から菌体を集菌したの
ち，ホモジナイザー，ブレンダー，マントンゴーリン，
ダイノミル，フレンチプレス，超音波処理，凍結融解，
リゾチーム処理等により細胞を破砕して得ることが出来
る。次に上記細胞破砕液（細胞抽出液）にカチオン系高
分子凝集剤を添加して，細胞破砕片及び核酸を沈澱させ
る。
【００１４】ここでカチオン系高分子凝集剤としては，
例えば，ポリアミノアルキルメタアクリレート類，ポリ
アミノアルキルメタアクリレートとアクリルアミドの共
重合物類，ポリアクリルアミドのマンニッヒ変性物類，
ポリジメチルジアリルアンモニウム塩類，ポリビニルイ
ミダゾリン類，ポリアクリルアミド類，アミン系重縮合
物類などがあげられる。その際の高分子凝集剤の添加量
としては，凝集剤の種類によって異なるが，破砕した微
生物の乾燥重量１００重量部に対し１〜４０重量部が好
ましい。このカチオン系高分子凝集剤を予め水に溶解し
た後，細胞破砕液に添加して１０分間から２４時間撹拌
する。
【００１５】また，ｐＨの調整が必要な場合には，適宜
１０〜２００ｍＭになるように緩衝液を加えることもで
きるし，タンパク質の安定化のために，グルコースを細
胞破砕液１００重量部に対し，１〜５０重量部添加して
もよい。次いで沈澱させた細胞破砕片及び核酸を分離す
る。そのためには，例えば，静置するか，遠心分離する
か，あるいは濾過するかして行えばよい。これらの操作
により，粗酵素標品を得ることができる。さらに高度に
精製された酵素標品を得るには，ゲル濾過クロマトグラ
フィー，疎水性クロマトグラフィー，アフィニティーク
ロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィ等の各
種クロマトグラフィーを用いることができる。
【００１６】第一発明において，ＮｐｎＮ’又はその誘
導体の製造に際して，たとえば同一の反応器の中に緩衝
液，ＡＴＰ又はその誘導体，硫酸イオン（ＳＯ4 2-），
マグネシウムイオン（Ｍｇ2+），ＡＴＰスルフリラーゼ
及びＡｐ4Ａホスホリラーゼを共存させて反応させれば
よく，また，反応をスムーズに進めるために，必要に応
じて，ＰＰａｓｅを共存させることができる。
【００１７】第二発明において，ＮｐｎＮ’又はその誘
導体の製造に際して，たとえば同一の反応器の中に緩衝
液，ＡＴＰ又はその誘導体，硫酸イオン，マグネシウム
イオン，ＡＴＰスルフリラーゼ，Ａｐ4Ａホスホリラー
ゼ，ＡＤＰをＡＴＰに変換する酵素及びリン酸供与体を
共存させて反応させればよく，また，反応をスムーズに
進めるために，必要に応じてＰＰａｓｅを共存させるこ
とができる。
【００１８】このときに用いられる反応器としては，反
応をスムーズに進行させうるものであればいかなるもの
でもよく，各々の酵素量，基質液の濃度，ｐＨ及び供給
速度，反応温度などによって反応器の大きさ及び形状を
選定すればよい。その反応器の形状としては，例えば，
膜型の反応器，カラム型反応器を使用することができ
る。この中でも膜型反応器は，反応生成物が低分子であ
るので，特に有効に使用できる。この際，酵素は高分子
物質であるので，各酵素はそのまま反応器の中にとどま
った状態で使用することができる。
【００１９】また，カラム型反応器の場合には，使用す
る酵素を適当な担体，例えばセルロース，デキストラ
ン，アガロースなどのような多糖類の誘導体，ポリスチ
レン，エチレン−マレイン酸共重合体，架橋ポリアクリ
ルアミドなどのようなビニルポリマーの誘導体，Ｌ−ア
ラニン，Ｌ−グルタミン酸共重合体，ポリアスパラギン
酸などのようなポリアミノ酸又はアミドの誘導体，ガラ
ス，アルミナ，ヒドロキシアパタイトなどのような無機
物の誘導体などに結合，包括あるいは吸着させて，いわ
ゆる固定化酵素としてカラムに充填して使用すればよ
い。
【００２０】上述の反応器は，連続的に操作することを
前提として説明したものであるが，このような思想に基
づいて他の反応器を用いることもできるし，場合によっ
ては，バッチ式の反応器を使用してバッチ式に操作して
反応させることもできる。
【００２１】次にバッチ式の反応器でＮｐｎＮ’を製造
する場合を例にとり，反応条件について説明すると，Ａ
ＴＰスルフリラーゼは０．００５ｕｎｉｔ／ｍｌ〜５０
００ｕｎｉｔ／ｍｌが適当である。Ａｐ4Ａホスホリラ
ーゼはＡＴＰスルフリラーゼのｕｎｉｔ数に対して２倍
程度が好ましい。ＡＴＰ又はその誘導体は１０μＭ以
上，特に１ｍＭ以上，さらに１０ｍＭ以上，スルフェー
トは１μＭ以上，特に１００μＭ以上，さらに１ｍＭ以
上，アセチルリン酸はＡＴＰ又はその誘導体の濃度に対
して１０ないし１／１０2当量，特に２ないし１／１０
当量，さらに１ないし１／２当量の濃度で添加するのが
望ましく，その添加方法は特に限定されるものではな
く，反応スタート時に一括して添加してもよいし，分割
して添加してもよい。スルフェートとしては，例えば，
硫酸アンモニウム，硫酸マグネシウム，硫酸ナトリウ
ム，硫酸カリウム等が挙げられる。また，反応をスムー
ズに進めるために，ＰＰａｓｅを添加したり，マグネシ
ウムイオン，マンガンイオン，カルシウムイオン，コバ
ルトイオン，カドミウムイオン等の金属イオンを添加す
ることもできる。ＰＰａｓｅは０．０１ｕｎｉｔ／ｍｌ
〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌが好ましい。さらに，ＡＤＰを
ＡＴＰに変換する酵素は１ｕｎｉｔ／ｍｌ〜１００ｕｎ
ｉｔ／ｍｌが好ましい。
【００２２】反応のｐＨとしては，おおむね中性付近，
すなわち，ｐＨ５〜１１，好ましくはｐＨ６〜９の範囲
が使用され，緩衝液で調整することができる。この緩衝
液としては，これらのｐＨに適した通常のものを使用す
ることができる。また，反応の温度としては，酵素の失
活が起こらず，反応がスムーズに進行する範囲であれば
特に限定されるものではないが，２０℃から５０℃の範
囲が好ましい。
【００２３】このようにした反応生成物をイオン交換ク
ロマトグラフィー等一般に広く用いられている方法で精
製して，ＮｐｎＮ’を単離すればよい。リン酸供与体と
してはアセチルリン酸が使用される。アセチルリン酸
は，アンモニウム塩，カリウム・リチウム塩，ナトリウ
ム塩などの塩として使用することができるが，入手のし
やすさから二ナトリウム塩を用いることが好ましい。ア
セチルリン酸はＡＴＰの濃度に対して１／１０ないし１
００倍当量，特に１ないし５０倍当量の濃度で用いるの
が好ましい。その添加方法は特に限定されるものではな
く，反応スタート時に一括して添加してもよいし，分割
して添加してもよい。
【００２４】
【実施例】次に，本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお，ＡＴＰスルフリラーゼ，Ａｐ4Ａホスホリラ
ーゼの活性測定は以下の方法により測定した。
【００２５】ＡＴＰスルフリラーゼの活性測定法 下に示す組成の反応溶液を３０℃に保ち，適量の酵素試
料液を加えて反応を開始した。１０分後に３Ｎの硫酸を
０．０５ｍｌ加え反応を停止した。反応終了後のリン酸
濃度を，和光純薬工業株式会社製無機リン酸測定試薬ホ
スファＣ−テストワコーにより定量した。 １分間に２
μｍｏｌのリン酸，すなわち１μｍｏｌのピロリン酸が
生成するＡＴＰスルフリラーゼの量を１ｕｎｉｔとし
た。反応溶液組成（総量０．５ｍｌとする） トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８） １００ｍＭ 塩化マグネシウム １０ｍＭ モリブデン酸ナトリウム １０ｍＭ ＡＴＰ １０ｍＭ ピロフォスファターゼ ０．４ｕ／ｍｌ 試料（ＡＴＰスルフリラーゼ溶液） 適量
【００２６】Ａｐ4Ａホスホリラーゼの活性測定法 下に示す組成の反応溶液を３０℃に保ち，適量の酵素試
料を加えて反応を開始した。１０分後に沸騰水浴中１分
間加熱し，反応を停止した。反応終了後のＡｐ4Ａ濃度
を下に示すＨＰＬＣにより定量した。１分間に１μｍｏ
ｌのＡｐ4Ａが分解するＡｐ4Ａホスホリラーゼの量を１
ｕｎｉｔとした。反応溶液組成（総量０．５ｍｌとす
る） トリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８） １００ｍＭ 塩化マグネシウム ５ｍＭ Ａｐ4Ａ １ｍＭ 試料（Ａｐ4Ａホスホリラーゼ溶液） 適量 リン酸１カリウム １００ｍＭ ＨＰＬＣ移動相 過塩素酸テトラブチルアンモニウム ３ｍＭ リン酸１カリウム ３０ｍＭ メタノール ２５ｖｏｌ％ 水 ７５ｖｏｌ％ ＨＰＬＣの流速は０．６ｍｌ／分，検出はＵＶの吸収
（λ＝２５４ｎｍ）を測定することにより行った。ま
た，カラムはノバパックＣ１８（ウオーターズ社製）カ
ラムを使用した。
【００２７】参考例１グルコース濃度１％，酵母エキス
濃度１％，リン酸濃度０．１％および若干のミネラル類
を含んだ培地を殺菌した後，ｐＨを６．５に調整し，バ
チルス・ステアロサーモフィルス（ＮＣＡ１５０３株）
を接種し，培養を行った。６０℃で３時間培養後，培地
中のグルコースが消費されたことを確認し，遠心分離に
て菌体をえた。
【００２８】参考例２ 参考例１により得られた湿菌体を凍結融解法で破砕した
のち，ポリアクリルアミド系の凝集剤を用いて除核酸を
おこなった。生じた沈澱を遠心分離により除去して，粗
酵素液を得た。あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカ
ラムに粗酵素液をアプライしたところ，ＡＴＰスルフリ
ラーゼが吸着されたので，同緩衝液で十分洗浄したの
ち，同緩衝液を用いて０から５００ｍＭの塩化ナトリウ
ムの直線濃度勾配にて溶出を行った。その活性画分を回
収し，１Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを加えた。この
活性画分を，１Ｍ硫酸アンモニウムを５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したフェニルセファロ
ースカラムにアプライした。同緩衝液で十分洗浄したの
ち，５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化
したフェニルセファロースカラムにアプライした。同緩
衝液で十分洗浄した後，５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）で溶出した。得られた活性画分を回収し，濃
縮，透析後，５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で平衡化したマトレックスゲルブルーＡカラムにアプラ
イした。同緩衝液で十分洗浄した後，１Ｍ塩化カリウム
を含む同緩衝液で溶出した。活性画分を回収し，濃縮後
ポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ，単一なバ
ンドが得られた。酵素標品の比活性は，１１．１Ｕ／ｍ
ｇであった。
【００２９】参考例３ グルコース濃度１％，酵母エキス濃度１％，リン酸濃度
０．１％および若干のミネラル類を含んだ培地を殺菌し
た後，ｐＨを７．２に調整し，サッカロマイセス・セル
ビシエ（ＩＦＯ１００８）を接種し，培養を行った。２
８℃で８時間培養後，遠心分離にて菌体をえた。
【００３０】参考例４ 参考例３により得られた湿菌体をソニケーターにより破
砕したのち，ポリアクリルアミド系の凝集剤を用いて除
核酸を行った。生じた沈澱を遠心分離により除去して，
粗酵素液を得た。あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカ
ラムに粗酵素液をアプライし，十分洗浄したのち，同緩
衝液を用いて０から５００ｍＭの塩化ナトリウムの直線
濃度勾配にて溶出を行った。その活性画分を回収し，Ａ
ｐ4Ａホスホリラーゼを得た。
【００３１】実施例１ 参考例２で得たＡＴＰスルフリラーゼ０．２５ｕｎｉｔ
／ｍｌ，参考例４で得たＡｐ4Ａホスホリラーゼ０．５
ｕｎｉｔ／ｍｌを用いて，バッチ法でＡｐ4Ａの合成を
行った。このとき，ＡＴＰ１５ｍＭ，硫酸マグネシウム
１０ｍＭ，ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＭか
らなる反応液を３０℃で６時間反応させた。得られた反
応生成物を，Ａｐ4Ａホスホリラーゼの活性測定法と同
じ条件でＨＰＬＣにより分析したところ，５．０ｍＭの
Ａｐ4Ａが生成していた。反応生成物がＡｐ4Ａであるこ
とをリン核磁気共鳴スペクトルにより同定した。
【００３２】実施例２ 参考例２で得たＡＴＰスルフリラーゼ０．２５ｕｎｉｔ
／ｍｌ，参考例４で得たＡｐ4Ａホスホリラーゼ０．５
ｕｎｉｔ／ｍｌを用いて，バッチ法でＡｐ4Ａの合成を
行った。このとき，ＡＴＰ１５ｍＭ，硫酸マグネシウム
３０ｍＭ，ＰＰａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製）
０．７１ｕｎｉｔ／ｍｌ，酢酸キナーゼ（ユニチカ社
製）０．００４ｕｎｉｔ／ｍｌ，ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７．８）５０ｍＭからなる反応液にアセチルリン酸を
反応開始時に１ｌ当たり３．１ｍｌ添加し，１時間毎に
１ｌ当たり３．１ｍｌ追加しながら，３０℃で６時間反
応させた。得られた反応生成物を，Ａｐ4Ａホスホリラ
ーゼの活性測定法と同じ条件でＨＰＬＣにより分析した
ところ，６．０ｍＭのＡｐ4Ａが生成していた。反応生
成物がＡｐ4Ａであることをリン核磁気共鳴スペクトル
により同定した。
【００３３】
【発明の効果】本発明によれば，高純度でかつ高収率の
ＮｐｎＮ’又はその誘導体が製造でき，また容易にこれ
を単離精製できるので，工業的に有利にＮｐｎＮ’又は
その誘導体の製造ができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:07） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 19/00 - 19/64 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】アデノシン−５’−三リン酸又はその誘導
    体およびスルフェートを反応基質として用い，アデノシ
    ン−５’−三リン酸スルフリラーゼおよびジアデノシン
    四リン酸ホスホリラーゼの二種の酵素を触媒とする二段
    階反応によりジヌクレオシドポリリン酸又はその誘導体
    を生成させることを特徴とするジヌクレオシドポリリン
    酸又はその誘導体の製造方法。
  2. 【請求項２】 アデノシン−５’−二リン酸をアデノシ
    ン−５’−三リン酸に変換する酵素の存在下に，アデノ
    シン−５’−三リン酸又はその誘導体およびスルフェー
    トを反応基質として用い，アデノシン−５’−三リン酸
    スルフリラーゼおよびジアデノシン四リン酸ホスホリラ
    ーゼの二種の酵素を触媒とする二段階反応によりジヌク
    レオシドポリリン酸又はその誘導体を生成させることを
    特徴とするジヌクレオシドポリリン酸又はその誘導体の
    製造方法。
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