JP3078599B2 - Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルセリン誘導体の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】ラセミ−３−（３，４−ジヒドロ
キシフェニル）セリン誘導体を、Ｄ−３−（３，４−ジ
ヒドロキシフェニル）セリン誘導体を特異的にグリシン
と対応するプロトカテキュアルデヒド誘導体に分解する
能力を有する酵素、同酵素を産生する微生物あるいはそ
の菌体処理物でもって処理することにより、パーキンソ
ン病治療薬及び家族性アミロイドポリニューロパシーの
治療薬として有用なことが知られているＬ−スレオ−３
−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリンをはじめと
するＬ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セリン
誘導体（以下、Ｌ−ＤＯＰＳ誘導体と略す）を製造する
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体の合
成は、以下の方法により行なわれていた。即ち、カテコ
ール部分を保護したプロトカテキュアルデヒド誘導体
と、グリシンとを強アルカリ下で縮合させ、次にラセミ
−スレオ／エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体を得、次にこうし
て得られた生成物をスレオ／エリスロ体の相互分離処理
を行ない、次にラセミ−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体を光学
分割するために、カテコール部分の保護基を除去後、ア
ミノ基部分に置換基を導入した後、キニン、ブルシン等
の光学分割剤を用いて光学分割を行った後、最後にアミ
ノ基部分の置換基を除去するというものである（特開昭
５８−２１６１４６号）。

【０００３】

【発明が解決しようとする問題点】Ｌ−スレオ−ＤＯＰ
Ｓ誘導体の合成にあたっては、各種の特定の保護基を導
入したり、除去することが必要であるのに加えて、その
合成において複数の立体異性体が産生され、それら立体
異性体相互の分離が、大きな課題となっている。このよ
うに、その合成工程において２種以上の立体異性体が生
じることから、それら異性体の分離には少なくとも複数
の工程が必須であり、さらに各種保護基の導入除去工程
もそれに伴って必要であることから、工業的製造の上で
大きな問題となっていた。

【０００４】このうち特に、光学分割法は、工程が複雑
で収率が悪いばかりでなく、それに使用する光学分割剤
も高価であり、工業的製造法としては問題があった。さ
らに従来の光学分割法では、ラセミ体分離前に必ず、ス
レオ／エリスロ体間の分離処理も必要としており、さら
にこれらの方法の結果得られる不要の生成物、すなわ
ち、ＤＬ−エリスロ誘導体及びＤ−スレオ誘導体は、再
度それを利用するために別途ラセミ化したり、分解した
りする必要があり、ますます製造設備などが複雑となる
ことになっていた。

【０００５】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、Ｌ−ス
レオ−ＤＯＰＳ及びＬ−エリスロ−ＤＯＰＳ合成にあた
り重要な中間体であるＬ−ＤＯＰＳ誘導体を得ることの
できる手法を鋭意検討した結果、ラセミ−ＤＯＰＳ誘導
体に、特定の基質特異性を有する酵素を作用させること
により、特異的にＬ−ＤＯＰＳ誘導体のみが得られるこ
とを見出し、本発明を完成したものである。本発明は、
一般式

【０００６】

【化２】 （式中、Ｒ₁ 、Ｒ₂ は同一又は相異なり、水素、低級ア
ルキル又はアラルキル基を示し、Ｒ₁ 、Ｒ₂ 共にアルキ
レン基で置換されて環を形成していてもよい）で表わさ
れるラセミ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）セ
リン誘導体に、Ｄ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニ
ル）セリン誘導体を特異的にグリシンと対応するプロト
カテキュアルデヒド誘導体に分解する能力を有する酵
素、同酵素を産生する微生物菌体あるいは菌体処理物を
作用させることを特徴とするＬ−３−（３，４−ジヒド
ロキシフェニル）セリン誘導体の製造法に関する。

【０００７】本発明で用いられる原料ラセミ−ＤＯＰＳ
誘導体としては、上記式（Ｉ）を有する化合物があげら
れるが、それら化合物は、その保護基のＲ₁及びＲ₂ が
同一又は相異なるところの化合物の混合物であってもよ
い。上記式（Ｉ）で示される化合物の代表的なものとし
ては、ラセミ−スレオ／エリスロ−３−（３，４−メチ
レンジオキシフェニル）セリン、ラセミ−スレオ／エリ
スロ−３−（３，４−ジベンジロキシフェニル）セリ
ン、ラセミ−スレオ／エリスロ−３−（３，４−ジヒド
ロキシフェニル）セリン、ラセミ−スレオ／エリスロ−
３−（３，４−ジメチルオキシフェニル）セリンあるい
はそれらの混合物があげられる。

【０００８】また原料ラセミ−ＤＯＰＳ誘導体は、その
エリスロ／スレオ異性体の混合物であってもあるいは、
スレオ体あるいはエリスロ体単独のものであってもよ
い。エリスロ体とスレオ体とは、繁雑ではあるが、晶析
などの方法で互いを分離することができたり、あるいは
副生物としてその一方だけからなるものも得られるの
で、それら各異性体を単独で含むものを原料として用い
ることも好ましい。また、従来ラセミ−エリスロ体を簡
単且つ効率よく光学分割することは困難であったが、本
発明の方法によれば簡単にＬ−エリスロ体のみが得られ
るのみでなく、得られたグリシン及びプロトカテキュア
ルデヒド誘導体を再度合成に使用することができる。

【０００９】本発明においては、Ｌ−ＤＯＰＳ誘導体以
外の異性体、すなわち、Ｄ−スレオ−ＤＯＰＳ誘導体並
びにＤ−エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体を特異的に分解する
のみでなく、それらの異性体をグリシンと対応するプロ
トカテキュアルデヒド誘導体とに分解することから、こ
うして得られたグリシンと対応するプロトカテキュアル
デヒド誘導体はそれを再度合成に使用できる。

【００１０】本発明で使用されるＤ−スレオ及びエリス
ロ−ＤＯＰＳ誘導体を特異的にグリシンと対応するプロ
トカテキュアルデヒド誘導体に分解する能力を有する酵
素としては、Ｄ−スレオニンアルドラーゼがあげられる
他、その酵素と実質的に同一な活性を有するもの、例え
ば、それら酵素を産生する微生物そのもの、あるいは菌
体の処理物などがあげられる。

【００１１】本発明においては、上記酵素又はその同等
物は、エリスロ体とスレオ体を分離する前に反応せしめ
られてもよいし、あるいは分離した後反応せしめられて
もよい。本発明においては、前記したように、Ｄ−ＤＯ
ＰＳ誘導体を分解する酵素を用いることがあげられる
が、このような酵素としては、Ｄ−スレオ及び／又はエ
リスロ−ＤＯＰＳ誘導体を特異的に分解するものであれ
ば、いずれも使用できる。このような酵素として特に好
ましいものとしては、Ｄ−スレオ／エリスロ−ＤＯＰＳ
誘導体を特異的にグリシンと対応するプロトカテキュア
ルデヒド誘導体に分解する能力を有するものがあげられ
る。また特に好ましいものとしては、Ｄ体とＬ体の立体
構造の違いを特異的に認識するが、スレオ体とエリスロ
体の構造上の差異には影響を受けないものがあげられ
る。さらにまた（ジヒドロキシフェニル）セリンに導入
された各種保護基などの存在にかかわらず、特異的な活
性を有するものがあげられる。

【００１２】このような酵素として特に好ましいもの
は、Ｄ−スレオニンアルドラーゼがあげられる。このよ
うな、Ｄ−スレオニンアルドラーゼとしては、特公昭６
４−１２７９号に記載されたものの他、その遺伝子を操
作して得られたもの（例えば、特願平１−２７６１２６
号）などをあげることができる。

【００１３】これらＤ−スレオニンアルドラーゼは、予
想外にもＤ−型の立体配位には非常に高い特異性を有す
るにも拘らず、エリスロ／スレオといった立体配位に対
しては、許容されうる寛容性を有するのみでなく、（ジ
ヒドロキシフェニル）セリンのみでなくその誘導体にも
作用することができ、さらにグリシンと対応するプロト
カテキュアルデヒドとを生成せしめるという優れた特性
を有している。

【００１４】本発明で用いられるＤ−スレオニンアルド
ラーゼは、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ産生菌あるい
は、その変異株又は変種株などから得ることができる。
Ｄ−スレオニンアルドラーゼ産生菌としては、例えば、
アルカリゲネス フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＩＦＯ １２６６９）、シュー
ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＤＫ−２ (微工研
菌寄６２００号）、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ）ＤＫ−１９ (微工研菌寄６２０１号）、キサ
ントモナス オリゼー（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙ
ｚａｅ）（ＩＡＭ１６５７）などが知られている（特公
昭６４−１１２７９号及び特開平１−２７３５８６号）
が、これらのものに限定されることなく使用することも
できる。

【００１５】また、Ｄ−スレオニンアルドラーゼの合成
に関与する遺伝子を担うＤＮＡを遺伝子組換えなどの手
法を用いて導入して作成された組換え体も、好適に使用
することができる。このような遺伝子を導入して利用し
うる微生物としては、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ）属細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
属細菌、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属
細菌、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属細
菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細
菌、グルコノバクター（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）
属細菌、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属
細菌、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌、アル
カリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属細菌、クレブ
シエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属細菌、サルモネラ
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ）属細菌などの原核微生物や酵母などの下等真
核生物などを用いることができる。

【００１６】このような組換え体のうち、特にＤ−スレ
オニンアルドラーゼを高度に産生する能力を有している
組換え体の例としては、キサントモナス属細菌に属する
ものがあげられる。微工研菌寄１０９７９号として寄託
のされているキサントモナスシトリ（Ｘａｎｔｈｏｍｏ
ｎａｓ ｃｉｔｒｉ）ＩＦＯ３３１１ (ｐＤＴ６４８）
は、Ｄ−スレオニンアルドラーゼを高度に産生する能力
を有しており（特願平１−２７６１２６号）、特に好適
なものである。

【００１７】特に、このキサントモナス シトリ ＩＦ
Ｏ３３１１ (ｐＤＴ６４８）は、Ｄ−スレオニンアルド
ラーゼのみを特異的に大量に産生することから、簡単な
処理で、高い活性を有するＤ−スレオニンアルドラーゼ
を得ることができ、それを用いた場合、単位反応時間が
短縮できるとか、収量を増加させるとか、装置を簡素化
できるとかという、予想外の優れた効果を得ることがで
きる。

【００１８】本発明に用いる微生物は常法に従って培養
することが出来る。培養に用いられる培地は微生物の生
育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培
地である。ここで用いられる炭素源としては、グルコー
ス、リボース、ガラクトース、可溶性デンプンなどがあ
げられ、窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム、ペプトン、肉エキス、イー
ストエキス、コーンスティプリカー、大豆粉、綿実カス
などがあげられる。また、塩化ナトリウム、カリウム
塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、燐酸塩などの他、
亜鉛、マグネシウム、鉄、マンガンなどの無機物も使用
できる。更に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素
を添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。培養
は、好気的条件下でｐＨ４から１０、温度２０から６０
℃の任意の範囲に制御して１〜１０日間培養を行えばよ
い。組換え体を用いる場合、使用する菌株に応じて、ア
ンピシリン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養
液に添加してもよい。

【００１９】酵素反応にあたっては、菌体の培養液、培
養液から分離した菌体、凍結乾燥などによる乾燥菌体、
菌体破砕液、粗酵素抽出液、精製酵素、さらには、上記
の処理物および固定化物、その他何れも使用できるが、
ラセミースレオ／エリスロ体からＬ−スレオ／エリスロ
体を製造する場合又はラセミ−エリスロ体からＬ−エリ
スロ体を製造する場合は、使用する酵素液あるいは菌体
に含まれているＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を
あらかじめ除去してから反応に用いる必要がある。Ｌ−
アロスレオニンアルドラーゼは、Ｌ−アロスレオニンを
特異的にグリシンとアセトアルデヒドに分解する酵素で
あり、Ｌ−エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体にも特異的に作用
し、プロトカテキュアルデヒド誘導体とグリシンに分解
する。Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性とＬ−アロスレ
オニンアルドラーゼ活性を持つ酵素液からＬ−アロスレ
オニンアルドラーゼ活性のみを除去する方法としては６
０℃、３０分程度の熱処理による方法や、酵素液のアセ
トン分画による方法が好ましいが、それに限定されるこ
となく、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を選択的
に除去出来る方法であればいずれも用いることが出来
る。酵素反応を実施する方法は、水性媒体中にて基質で
あるラセミ−スレオ及び／又はエリスローＤＯＰＳ誘導
体を、上に記した微生物の培養液、菌体、菌体処理物、
酵素、あるいはこれらを通常の方法で固定化したものと
接触させれば良い。かかる反応時の水性媒体としては、
例えば、水、緩衝液、含水有機溶媒等が使用できる。

【００２０】反応における酵素、微生物菌体あるいは菌
体処理物等の濃度は、Ｄ−スレオ／エリスローＤＯＰＳ
誘導体を完全に分解できるならば特に制限はないが、Ｄ
−スレオニンアルドラーゼ活性（１ＵはＤ−スレオニン
から１分間に１μｍｏｌｅのグリシンを生成するのに必
要な酵素量を表わす）が、０．０１Ｕ／ｍｌ以上である
ことが望ましい。特に、０．１Ｕ／ｍｌ以上であれば反
応を速やかに終了させることが出来る。基質であるラセ
ミ−スレオ及び／又はエリスロ−ＤＯＰＳ誘導体の濃度
は、反応を著しく阻害しない程度であれば良く１ｍｍｏ
ｌｅ／リットルから１００ｍｍｏｌｅ／リットルが好ま
しく、基質の供給は、一括、連続、分割のいずれの手段
でも実施出来る。

【００２１】反応温度は、１０から５５℃が良く、２０
から４０℃がより好適である。反応時のｐＨは５から１
０、好ましくは６から８である。Ｄ−スレオニンアルド
ラーゼは、ピリドキサール−５′−リン酸を補酵素とし
て要求するため、反応系に１０ｎｍｏｌｅ／リットル〜
１０ｍｍｏｌｅ／リットル、好ましくは１μｍｏｌｅ／
リットル〜１００μｍｏｌｅ／リットルの濃度で添加す
ることにより反応が促進される。

【００２２】また、Ｄ−スレオニンアルドラーゼは２価
金属イオンを補欠因子として要求するため、Ｍｇ²⁺、Ｍ
ｎ²⁺、Ｃｏ²⁺、Ｆｅ²⁺等を塩の形で１００μｍｏｌｅ／
リットル〜１００ｍｍｏｌｅ／リットル、好ましくは１
ｍｍｏｌｅ／リットル〜１０ｍｍｏｌｅ／リットルの濃
度で添加することにより反応が促進される。

【００２３】反応形式はバッチ方式、連続方式のいずれ
でも良いが、かくして、反応は０．５から５０時間程度
で終了する。反応終了後、反応液は遠心分離や限外ろ過
等により除菌・除タンパクし、まず有機溶媒抽出により
生成プロトカテキュアルデヒド誘導体を分離する。抽出
には、プロトカテキュアルデヒド誘導体の溶解性が高
く、Ｌ−ＤＯＰＳ誘導体及びグリシンがほとんど不溶で
ある溶媒であればいずれも使用することが出来るが、エ
ーテルを使用すると良好な結果が得られる。

【００２４】溶媒相からは減圧濃縮することによりプロ
トカテキュアルデヒド誘導体を回収する。水相からのＬ
−ＤＯＰＳ誘導体とグリシンの単離回収は、通常のイオ
ン交換樹脂を用いたクロマト分離によって行うことが出
来る。すなわち、水相を陽イオン交換樹脂を充填したカ
ラムに通液、水洗後、希アンモニア水等により溶出を行
う。

【００２５】純度が低い場合には、さらに晶析・水再結
晶を行うことにより精製度を高めることが出来る。上記
反応生成物の単離精製法は、一つの代表的な方法を例示
したものであり、好ましい方法であるが、本発明におい
てはそれに限定されることなく各種の分離精製法が適用
できる。このような方法の例としては、メタノール、エ
タノール等のアルコール系溶媒、ベンゼン、トルエン等
の芳香族炭化水素系溶媒、酢酸エチル等のエステル系溶
媒、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン溶媒、ジ
メチルスルホキシド等のスルホキシド類溶媒、Ｎ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド等のアミド溶媒、アセトニトリル
などのニトリル系溶媒、エチルエーテル、ジオキサン、
テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、メチレンクロ
ライド等のハロゲン化炭化水素溶媒及びそれらの混合溶
媒あるいはそれらの水性溶媒などを用いた溶媒抽出など
の分離法、カラムクロマトグラフィー、逆相クロマトグ
ラフィー、高速液体クロマトグラフィー、再結晶化法な
どの方法をあげることができる。

【００２６】本発明の方法によると、 （１）光学分割のための置換基の導入及び除去が不要で
あり、さらに高価な光学分割剤を用いる必要もなく、収
率も高い。 （２）非常に工程を単純化できるので、装置のための設
備費を大巾に節約することができる。 （３）Ｄ−スレオ及び／又はエリスロ−ＤＯＰＳ誘導体
は共に合成原料であるグリシンとプロトカテキュアルデ
ヒド誘導体に分解されるため、それらは再度反応液から
回収してラセミ−スレオ／エリスロ−ＤＯＰＳ誘導体合
成にリサイクル使用することができ、生産コストを大き
く低減させることができる。特に、カテコール部分を保
護した誘導体を基質として用いて本発明の処理を行なっ
た場合においても、本発明の処理は良好に行なうことが
でき、更に回収されたプロトカテキュアルデヒド誘導体
には、保護基がそのまま残っているので再度保護基の導
入操作を行なうことなく、それをそのまま合成原料に用
いることができる。 （４）原料からの目的物の収率を大巾に高めることがで
きると共に、高純度の目的物を簡単に取得できる。

【００２７】

【実施例】次に、実施例により本発明の方法を更に詳し
く説明するが、本発明は実施例により限定されるもので
はない。例中％は重量％を示す。

【００２８】酸素製造例１ ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、塩化ナト
リウム０．５％からなるｐＨ７．５の培地を調製し、５
リットルの培養槽にその３リットルを添加し、１２０℃
で１５分間加熱殺菌した。その培地にＡｒｔｈｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ＤＫ−１９（微工研菌寄６２０１号）を接種
し、ｐＨ７．５に保ちながら３０℃で２０時間通気及び
攪拌をしつつ培養した。培養終了後、培養液から菌体を
遠心分離で集菌、水洗後、０．０１ｍＭピリドキサール
−５′−リン酸、及び１．０ｍＭ塩化マグネシウムを含
むｐＨ７．５の０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−Ｈｙｄ
ｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ′−２−
ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液１０
０ｍｌに懸濁し、この菌体懸濁液を２０ｋＨｚ、３分間
の超音波破砕処理を４回行い、破砕液の懸濁物質を遠心
分離で除去して粗酵素液を調製した。次に、この粗酵素
液に冷アセトンを攪拌しながら徐々に添加し、アセトン
濃度４５から６５％画分の析出物を分取し、上記緩衝液
１０ｍｌに溶解しアセトン分画酵素液を調製した。得ら
れた菌体懸濁液及びアセトン分画酵素液のＤ−スレオニ
ンアルドラーゼ活性（１ＵはＤ−スレオニンから１分間
に１μmoleのグリシンを生成するのに必要な酵素量を表
わす）を測定した。 菌体懸濁液 ：０．４２Ｕ／ｍｌ アセトン分画酵素液：３．５ Ｕ／ｍｌ

【００２９】酸素製造例２ 酵素製造例１と同様の方法で、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ＤＫ−２（微工研菌寄６２００号）、Ａｌｃａｌｉｇ
ｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（ＩＦＯ１２６６９）、Ｘ
ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ（ＩＡＭ１６５
７）、及びＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃｉｔｒｉ ＩＦ
Ｏ３３１１（ｐＤＴ６４８）の菌体懸濁液、及びアセト
ン分画酵素液を調製した。得られた菌体懸濁液及びアセ
トン分画酵素液のＤ−スレオニンアルドラーゼ活性を測
定した。

【００３０】

【表１】

【００３１】合成例１ ラセミ−スレオ−３−（３，４−メチレンジオキシフェ
ニル）セリンの合成水酸化カリウム４８．８ｇ、グリシ
ン２６．４ｇをメタノール８４４ｍｌに溶解し、３０℃
以下でピペロナール１１６ｇを加え６５℃で３０分間攪
拌後、減圧濃縮を行った。残渣をメタノール１０８ｍｌ
に溶解し、３０℃以下で酢酸６４．８ｇを加え、４５℃
で１時間攪拌した。トルエン１０００ｍｌと水１０８ｍ
ｌを加え、４５℃で３０分間攪拌、さらに５℃で２時間
攪拌後、析出した結晶を濾取し、乾燥したところ、８
６．９ｇの結晶が得られた。この結晶に１０００ｍｌの
水を加え、還流下８０℃で攪拌溶解後濾過し、母液を５
℃で２時間攪拌することにより水からの再結晶を行っ
た。濾取した結晶を乾燥させ、４２．３ｇのラセミ−ス
レオ−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）セリ
ンを得た。 また、ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ−シ
ステインによる誘導体化後、ＯＤＳカラムを用い、ＨＰ
ＬＣによる異性体分析によって、各異性体の比率を調べ
た。

【００３２】合成例２ ラセミ−スレオ−ＤＯＰＳの合成 合成例１で得られたラセミ−スレオ−３−（３，４−メ
チレンジオキシフェニル）セリン２ｇとジクロロメタン
２０ｍｌ、エチルメルカプタン２ｍｌを混合し、無水臭
化アルミニウム１０ｇを氷冷下で攪拌しながら加え、氷
冷下で３時間、さらに室温で１５時間攪拌した。この反
応液に１Ｎ塩酸２００ｍｌを加え混合後分液し、水層の
ｐＨを水酸化ナトリウムで約５とし、析出した結晶を濾
取した。この結晶を０．０５％のＬ−アスコルビン酸を
含む水４０ｍｌから再結晶を行い、得られた結晶を乾燥
させ、１．５ｇのラセミ−スレオ−ＤＯＰＳを得た。

【００３３】実施例１ 酵素製造例１で得たアセトン分画酵素液１００ｍｌに合
成例２で得たＤ，Ｌ−スレオ−ＤＯＰＳ１００ｍｇを加
え、３０℃で１０時間反応させた。反応終了後、１Ｎ塩
酸を１０ｍｌ加えた後、遠心分離で不溶物を除去した。
ＨＰＬＣ（島津アミノ酸分析システム）で残存基質と生
成グリシンを定量したところ、基質は添加時の５０．８
％残存、グリシンは基質の減少と等しいモル濃度で生成
していた。また、プロトカテキュアルデヒドは、２，４
−ジニトロフェニルヒドラジンと反応させ、ＯＤＳカラ
ムを用いてＨＰＬＣ分析を行ったところ、基質の減少と
等しいモル濃度で生成していた。上記遠心上清に２００
ｍｌのエチルエーテルを加え、攪拌・静置し、エーテル
相を分離、減圧乾固を行い、３１ｍｇのプロトカテキュ
アルデヒドを得た。水相を、強酸性陽イオン交換樹脂Ｄ
ＯＷＥＸ ５０Ｗ×８を充填したカラム（１０ｍｍφ×
１００ｍｍ）に通液、脱イオン水による十分な洗浄後、
０．５Ｎのアンモニア水で吸着物質を溶出させ、ＤＯＰ
Ｓ画分とグリシン画分に分けて採取した。両画分それぞ
れ減圧乾固を行ったところ、それぞれ４９ｍｇ、１６ｍ
ｇの結晶を得た。ＤＯＰＳ画分より得られた結晶は、以
下の分析によりＬ−スレオ−ＤＯＰＳであることが確認
できた。ｍｐ：２０８℃ 元素分析：Ｃ₉ Ｈ₁₁Ｏ₅ Ｎに対し 計算値：Ｃ５０．７１，Ｈ５．２０，Ｎ６．５７％ 実測値：Ｃ５０．９７，Ｈ５．１５，Ｎ６．４６％ 異性体分析（ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ
−システインによる誘導体化後、ＯＤＳカラムでＨＰＬ
Ｃ分析）：ピークはＬ−スレオ体の位置にのみ見られ
た。 比旋光度：〔α〕²⁰ _D ＝−３９．９°（Ｃ＝０．５，０．１Ｎ・ＨＣｌ）

【００３４】実施例２ 酵素製造例２で得たアセトン分画酵素液を用い、実施例
１と同様に反応を行い、反応液中の残存基質を定量した
結果を示す。

【００３５】

【表２】

【００３６】反応終了後、反応液を実施例１と同様に処
理し、比旋光度を測定したところ、得られたＤＯＰＳは
いずれもＬ−スレオ体であることが確認された。

【００３７】実施例３ 酵素製造例１及び２で得た菌体懸濁液を用いたのと反応
時間３０時間とした以外は、実施例１と同様に反応を行
い、反応液中の残存基質量を定量した結果を示す。

【００３８】

【表３】

【００３９】反応終了後、反応液を実施例１と同様に処
理し、比旋光度を測定したところ、得られたＤＯＰＳは
いずれもＬ−スレオ体であることが確認された。

【００４０】実施例４ 一般式（Ｉ）におけるＲ₁ 、Ｒ₂ がともにメチル基、ベ
ンジル基である誘導体及びＲ₁ 、Ｒ₂ がメチレン基で置
換されて五員環を形成している誘導体を基質に用い、下
表に示す菌株のアセトン分画酵素液を実施例１と同様の
方法で反応させ、反応液中の残存基質を定量した結果を
示す。

【００４１】

【表４】

【００４２】反応終了後、反応液を実施例１と同様に処
理し、比旋光度を測定したところ、得られたＤＯＰＳ誘
導体は、いずれもＬ−スレオ体であることが確認され
た。

【００４３】合成例３ ラセミ−エリスロ−３−（３，４−メチレンジオキシフ
ェニル）セリンの合成水酸化カリウム４８．８ｇ、グリ
シン２６．４ｇをメタノール８４４ｍｌに溶解し、３０
℃以下でピペロナール１１６ｇを加え６５℃で３０分間
攪拌後、減圧濃縮を行った。残渣をメタノール１０８ｍ
ｌに溶解し、３０℃以下で酢酸６４．８ｇを加え、４５
℃で１時間攪拌した。トルエン１０００ｍｌと水１０８
ｍｌを加え、４５℃で３０分間攪拌、さらに５℃で２時
間攪拌後、析出した結晶をのぞいた母液を、さらに室温
で２０時間攪拌し、析出した結晶を濾取し、乾燥したと
ころ、４．２８ｇの結晶が得られた。この結晶に５０ｍ
ｌの水を加え、還流下８０℃で攪拌溶解後濾過し、母液
を５℃で２時間攪拌することにより水からの再結晶を行
った。濾取した結晶を乾燥させ、２．９ｇのラセミ−エ
リスロ−３−（３，４−メチレンジオキシフェニル）セ
リンを得た。 また、ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ−シ
ステインによる誘導体化後、ＯＤＳカラムを用い、ＨＰ
ＬＣによる異性体分析によって、各異性体の比率を調べ
た。

【００４４】合成例４ ラセミ−エリスロ−ＤＯＰＳの合成 合成例３で得られたラセミ−エリスロ−３−（３，４−
メチレンジオキシフェニル）セリン２ｇとジクロロメタ
ン２０ｍｌ、エチルメルカプタン２ｍｌを混合し、無水
臭化アルミニウム１０ｇを氷冷下で攪拌しながら加え、
氷冷下で３時間、さらに室温で１５時間攪拌した。この
反応液に１Ｎ塩酸２００ｍｌを加え混合後分液し、水層
のｐＨを水酸化ナトリウムで約５とし、析出した結晶を
濾取した。この結晶を０．０５％のＬ−アスコルビン酸
を含む水４０ｍｌから再結晶を行い、得られた結晶を乾
燥させ、１．３ｇのラセミ−エリスロ−ＤＯＰＳを得
た。

【００４５】実施例５ 酵素製造例１で得たアセトン分画酵素液１００ｍｌに合
成例４で得たＤ，Ｌ−エリスロ−ＤＯＰＳ１００ｍｇを
加え、３０℃で１０時間反応させた。反応終了後、１Ｎ
塩酸を１０ｍｌ加えた後、遠心分離で不溶物を除去し
た。ＨＰＬＣ（島津アミノ酸分析システム）で残存基質
と生成グリシンを定量したところ、基質は添加時の４
８．２％残存、グリシンは基質の減少と等しいモル濃度
で生成していた。また、プロトカテキュアルデヒドは、
２，４−ジニトロフェニルヒドラジンと反応させ、ＯＤ
Ｓカラムを用いてＨＰＬＣ分析を行ったところ、基質の
減少と等しいモル濃度で生成していた。上記遠心上清に
２００ｍｌのエチルエーテルを加え、攪拌・静置し、エ
ーテル相を分離、減圧乾固を行い、３０ｍｇのプロトカ
テキュアルデヒドを得た。水相を、強酸性陽イオン交換
樹脂ＤＯＷＥＸ ５０Ｗ×８を充填したカラム（１０ｍ
ｍφ×１００ｍｍ）に通液、脱イオン水による十分な洗
浄後、０．５Ｎのアンモニア水で吸着物質を溶出させ、
ＤＯＰＳ画分とグリシン画分に分けて採取した。両画分
それぞれ減圧乾固を行ったところ、それぞれ４７ｍｇ、
１７ｍｇの結晶を得た。ＤＯＰＳ画分より得られた結晶
は、以下の分析によりＬ−エリスロ−ＤＯＰＳであるこ
とが確認できた。 異性体分析（ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチル−
Ｌ−システインによる誘導体化後、ＯＤＳカラムでＨＰ
ＬＣ分析）：ピークはＬ−エリスロ体の位置にのみ見ら
れた。 比旋光度：〔α〕²⁰ _D ＝＋５１．３°（Ｃ＝０．５，０．１Ｎ・ＨＣｌ）

【００４６】実施例６ 酵素製造例２で得たアセトン分画酵素液を用い、実施例
５と同様に反応を行い、反応液中の残存基質を定量した
結果を示す。

【００４７】

【表５】

【００４８】反応終了後、反応液を実施例５と同様に処
理し、比旋光度を測定したところ、得られたＤＯＰＳは
いずれもＬ−エリスロ体であることが確認された。

【００４９】実施例７ 一般式（Ｉ）におけるＲ₁ 、Ｒ₂ がともにメチル基、ベ
ンジル基である誘導体及びＲ₁ 、Ｒ₂ がメチレン基で置
換されて五員環を形成している誘導体を基質に用い、下
表に示す菌株のアセトン分画酵素液を、実施例５と同様
の方法で反応させ、反応液中の残存基質を定量した結果
を示す。

【００５０】

【表６】

【００５１】反応終了後、反応液を実施例５と同様に処
理し、比旋光度を測定したところ、得られたＤＯＰＳ誘
導体は、いずれもＬ−エリスロ体であることが確認され
た。

【００５２】酵素製造例３ 酵素製造例１及び２で得た粗酵素液をそれぞれ６０℃で
３０分間処理した後、遠心分離して得られた上清を熱処
理酵素液とした。

【００５３】粗酵素液及び熱処理酵素液のＤ−スレオニ
ンアルドラーゼ活性及びＬ−アロスレオニンアルドラー
ゼ活性（１ＵはＬ−アロスレオニンから１分間に１μmo
leのグリシンを生成するのに必要な酵素量を表わす）を
測定した。

【００５４】

【表７】

【００５５】

【表８】

【００５６】実施例８ 酵素製造例３で得た Arthrobacter ＤＫ−１９の熱処理
酵素液１００ｍｌにＤ，Ｌ−スレオ／エリスロ−ＤＯＰ
Ｓ（各異性体の等量混合物）１００ｍｇを加え、３０℃
で３０時間反応させた。反応終了後、１Ｎ塩酸を１０ｍ
ｌ加えた後、遠心分離で不溶物を除去した。ＨＰＬＣ
（島津アミノ酸分析システム）で残存基質と生成グリシ
ンを定量したところ、基質は添加時の４８．３％残存、
グリシンは基質の減少と等しいモル濃度で生成してい
た。また、プロトカテキュアルデヒドは、２，４−ジニ
トロフェニルヒドラジンと反応させ、ＯＤＳカラムを用
いてＨＰＬＣ分析を行ったところ、基質の減少と等しい
モル濃度で生成していた。上記遠心上清に２００ｍｌの
エチルエーテルを加え、攪拌・静置し、エーテル相を分
離、減圧乾固を行い、２８ｍｇのプロトカテキュアルデ
ヒドを得た。水相を、強酸性陽イオン交換樹脂ＤＯＷＥ
Ｘ ５０Ｗ×８を充填したカラム（１０ｍｍφ×１００
ｍｍ）に通液、脱イオン水による十分な洗浄後、０．５
Ｎのアンモニア水で吸着物質を溶出させ、ＤＯＰＳ画分
とグリシン画分に分けて採取した。両画分それぞれ減圧
乾固を行ったところ、それぞれ４８ｍｇ、１８ｍｇの結
晶を得た。ＤＯＰＳ画分より得られた結晶は、以下の分
析によりＬ−スレオ−ＤＯＰＳとＬ−エリスロ−ＤＯＰ
Ｓの混合物であることが確認できた。 元素分析：Ｃ₉ Ｈ₁₁Ｏ₅ Ｎに対し 計算値：Ｃ５０．７１，Ｈ５．２０，Ｎ６．５７％ 実測値：Ｃ５０．８３，Ｈ５．１８，Ｎ６．４９％ 異性体分析（ｏ−フタルアルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ
−システインによる誘導体化後、ＯＤＳカラムでＨＰＬ
Ｃ分析）による各異性体の比率：Ｌ−スレオ体：Ｄ−ス
レオ体：Ｌ−エリスロ体：Ｄ−エリスロ体＝４９：０：
５１：０

【００５７】実施例９ 酵素製造例３で得た熱処理酵素液（Ａ）又は酵素製造例
１ないし２で得たアセトン分画酵素液（Ｂ）を用い、実
施例８と同様に反応を行い、反応液中の残存基質を定量
した結果を示す。

【００５８】

【表９】

【００５９】反応終了後、反応液を実施例８と同様に処
理し、異性体分析を行なったところ、得られたＤＯＰＳ
はいずれもＬ−スレオ体とＬ−エリスロ体の等量混合物
であることが確認された。

【００６０】実施例１０ 一般式（Ｉ）におけるＲ₁ 、Ｒ₂ がともにメチル基、ベ
ンジル基である誘導体のＤ，Ｌ−スレオ／エリスロ体等
量混合物及びＲ₁ 、Ｒ₂ がメチレン基で置換されて五員
環を形成している誘導体のＤ，Ｌ−スレオ／エリスロ体
等量混合物を基質に用い、酵素製造例１ないし２で得た
アセトン分画酵素液を、実施例８と同様の方法で反応さ
せ、反応液中の残存基質を定量した結果を示す。

【００６１】

【表１０】

【００６２】反応終了後、反応液を実施例８と同様に処
理し、異性体分析を行なったところ、得られたＤＯＰＳ
誘導体はいずれもＬ−スレオ体とＬ−エリスロ体の等量
混合物であることが確認された。

【００６３】

【発明の効果】Ｌ−ＤＯＰＳを得るための従来の光学分
割法は、置換基の導入や除去が必要であるため工程が複
雑で収率も悪く、分割剤も高価であり、また残りの光学
異性体をラセミ化させる必要がある等、工業的製造法と
しては問題があった。本発明によれば、光学分割のため
の置換基の導入や除去が不要であり、高価な光学分割剤
を用いる必要もなく、生成するグリシンとプロトカテキ
ュアルデヒド誘導体を原料合成にリサイクル使用するこ
とが可能で、繁雑なラセミ化を行う必要がないため、従
来の方法に比べて極めて有利な方法である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平４−330297（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 41/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中、R₁、R₂は、同一又は相異なり、水素、低級アル
   キル又はアラルキル基を示すが、R₁、R₂共にアルキレン
   基で置換されて環を形成していてもよい）で表わされる
   ラセミ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体
   に、D-3-(3,4- ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体を
   特異的にグリシンと対応するプロトカテキュアルデヒド
   誘導体に分解する能力を有するD-スレオニンアルドラー
   ゼを作用させることを特徴とする L-3-(3,4-ジヒドロキ
   シフェニル）セリン誘導体の製造法。
2. 【請求項２】 D-スレオニンアルドラーゼが、Alcalige
   nes 属、Pseudomonas 属、Arthrobacter属、Xanthomona
   s 属に属する微生物よりなる群より選ばれた少なくとも
   １種の微生物より得られたものである請求項１記載の方
   法。
3. 【請求項３】 該ラセミ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニ
   ル）セリン誘導体が、ラセミ−スレオ-3-(3,4-ジヒドロ
   キシフェニル）セリン誘導体であり、該 L-3-(3,4-ジヒ
   ドロキシフェニル）セリン誘導体が、L-スレオ-3-(3,4-
   ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体である請求項１記
   載の方法。
4. 【請求項４】 該ラセミ-3-(3,4-ジヒドロキシフェニ
   ル）セリン誘導体が、ラセミ−エリスロ-3-(3,4-ジヒド
   ロキシフェニル）セリン誘導体であり、該 L-3-(3,4-ジ
   ヒドロキシフェニル）セリン誘導体が、L-エリスロ-3-
   (3,4-ジヒドロキシフェニル）セリン誘導体である請求
   項１記載の方法。