JP2922565B2 - Ｔリンパ球亜分画の分離材、分離器および分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、リンパ球中の特定の亜分画を分離・精製す
るためのリンパ球亜分画の分離材、分離器および分離方
法に関するものである。詳しく述べると、本発明はヒト
末梢血やリンパ系組織より得られたリンパ球浮遊液から
Ｔリンパ球中の亜分画であるＴヘルパ／インデューサー
（Ｔ_H/I）およびＴサプレッサー／サイトトキシック
（Ｔ_S/C）を選択的に捕捉することのできる簡便、迅速
かつ高精度なリンパ球亜分画の分離材、分離器および分
離方法を示すものである。

リンパ球は、血球系の幹細胞から分化した免疫機能を
担う細胞であり、機能あるいは細胞膜形質等の点からい
くつかの亜群に分けられる。それらは、抗体を産生し体
液性免疫を担うＢリンパ球、免疫調節性リンホカインや
炎症性リンホカイン等を産生し細胞性免疫を担うＴリン
パ球、およびヌル細胞等のリンパ球サブクラスであり、
さらに、T,Bリンパ球には、機能的に異なるサブセット
が存在する。近年、このような免疫学的特性の異なるT,
Bリンパ球等のサブクラスを、機能的損傷を最小限にと
どめ純粋に分離、精製、濃縮する技術が、広範囲にわた
る社会的分野で強く望まれている。例えば細胞学、免疫
学などの基礎研究においては生体内免疫系の生体外（in
vitro）での解析において、少なくともT,Bリンパ球群
までの分離が必要であり、臨床医学における診断、治療
等では、機能低下あるいは昂進した特定分画の移入ある
いは除去が必要であり、またリンパ系の生理活性物質の
取得においては、産生細胞分画の分離、濃縮が重要であ
る。

（従来の技術） Ｔリンパ球とＢリンパ球の分離方法としては、まずソ
ディウムメトリゾエイトフィコール混液などの高密度等
張液を用いた比重遠心法により末梢血あるいは生体組織
等からリンパ球分画を得、続いてこれを分離処理してＴ
リンパ球とＢリンパ球に分離するのが従来一般的であ
る。この後続する分離処理方法としては、大きく（１）
細胞膜表面の特異抗原、レセプター、免疫グロブリンを
指標とするもの、（２）物理的細胞分離および（３）吸
着クロマトグラフィーの３つに分けられる。

（１）の方法としては、ロゼット形成法、（抗体や免疫
複合体を結合させた）アフィニティークロマトグラフィ
ー、抗体、補体による細胞融解法、マイトジェン活性化
リンパ球の除去、フルオレセインアクチベイテッドセル
ソーター（F.A.C.S.）などが知られているが、これらの
方法では、生物学的に特異性の高い強固な結合や刺激を
受けるため、インタクトな状態でＴリンパ球もしくはＢ
リンパ球を回収するのが難しく、かつ大量処理に向かな
い手法を多い。また、（２）の方法としては、密度勾配
遠心法、細胞電気泳動法などが知られているが、Ｔリン
パ球とＢリンパ球との間に比重、表面電荷等の物理的諸
物性に際だった差がないため、分離回収された細胞の収
率あるいは純度に高い精度が要求できない。さらに
（３）の方法としては、ナイロン、テトロン、綿繊維等
の異物に対するＴリンパ球とＢリンパ球の非特異的接着
能力の差を利用するものが知られているが、高精度に分
離細胞を得るためには、吸着担体の牛胎児血清（FCS）
等による処理が必要であることや流速などの実施条件の
設定が難しく、マクロファージ等の不純物の混入も多
い。加えて、これらの従来の方法は、全般に、繁雑な操
作、あるいは準備がともない、分離操作を行う場合の経
験的技術的習熱が必須であるという大きな課題も存在し
ているものであった。

（発明が解決しようとする課題） 従って、本発明は、新規なリンパ球亜分画の分離材、
分離器および分離方法を提供することを目的とする。本
発明はまた、細胞の諸活性に影響を与えることなく、簡
便かつ迅速に高収率、高純度でナチュラルキラー（NK）
あるいはLGL［large granular lymphocyte］系のリンパ
球分画を分離・精製するリンパ球亜分画の分離材、分離
器および分離方法を示すものである。本発明はさらに、
大量処理に適した白血球分離材、分離器および分離方法
を提供することを目的とする。

（問題点を解決するための手段） 上記諸目的は、リンパ球分画中のＴ_H/IおよびＴ_S/C分
画を他のリンパ球分画よりも優先的に吸着させる脂質
を、水不溶性固体物質表面に固定化したことを特徴とす
るリンパ球亜分画の分離材によって達成される。

本発明はまた、固定化される脂質が、炭素数８〜26の
アシル鎖を有するリン脂質であることを特徴とするリン
パ球亜分画の分離材を示すものである。本発明はさら
に、不溶性固体物質として粒径0.05〜5mmの粒子状体を
用いるものであるリンパ球亜分画の分離材を示すもので
ある。本発明は、さらに水不溶性固体物質表面に導入さ
れた疎水部として、メチレンの繰返しからなる直鎖アル
キルによる疎水結合を介して脂質を固定化することを特
徴とするリンパ球亜分画の分離材を示すものである。

上記諸目的はさらに、前記したようなリンパ球亜分画
の分離材を充填したカラムを有することを特徴とするリ
ンパ球亜分画の分離器によっても達成される。

上記諸目的はさらに、前記したようなリンパ球亜分画
の分離材に、リンパ球浮遊液を接着させ、Ｔペルパー／
インデューサーおよびＴサプレッサー／サイトトキシッ
ク分画を効率よく捕捉させることでNKあるいはLGL系の
リンパ球に富む非捕捉分画を回収することを特徴とする
リンパ球亜分画の分離方法によっても達成される。

（作用） 本発明は、リンパ球分画中のＴ_H/IおよびＴ_S/C分画を
他のリンパ球分画よりも優先的に吸着させる脂質を、水
不溶性固体物質表面に固定化したことを特徴とするリン
パ球亜分画の分離材を用いるために、例えば該分離材を
充填したカラムにリンパ球浮遊液を注入するのみで、効
率よくNKあるいはLGL系のリンパ球分画を分離・濃縮す
ることができるものである。なお、このように所定の脂
質を水不溶性固体物質表面に固定化した分離材に、Ｔ
_H/IおよびＴ_S/C分画が優先的に吸着されることの詳細な
機序は現在のところ明らかとなっていない。

さらに、本発明の分離材を用いての分離操作に際し
て、リンパ球浮遊液中には、ウシ胎児血清などを特に添
加する必要もなく（なお、場合によって添加することは
可能である。）、滅菌処理された分離材にリンパ球浮遊
液を接触させるだけで無菌的にNKあるいはLGL系のリン
パ球分画を分離回収することができ、血清を用いなくと
も回収細胞の生存率は常に98％以上を維持することから
リンパ球に対する刺激も極めて低いことが示唆されるも
のである。

以下、本発明を実施態様に基づきより詳細に説明す
る。

本発明のリンパ球亜分画の分離材は、リンパ球分画中
のＴ_H/IおよびＴ_S/C分画を他のリンパ球分画よりも優先
的に吸着させる脂質を、水不溶性固体物質表面に固定化
したことを特徴とするものである。

本発明において用いられるリンパ球分画中のＴ_H/Iお
よびＴ_S/C分画を他のリンパ球分画よりも優先的に吸着
させる脂質としては、リン脂質、特に炭素数８〜26、よ
り好ましくは炭素数12〜20のアシル鎖を有するものが用
いられ得る。なお、リン脂質の親水部のリン酸エステル
等を含むリン酸部分は、どのような構造を有するもので
あっても構わない。リン脂質としては天然あるいは非天
然のいずれのものであってもよく、具体的には例えば、
ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、
ホスファチジルエタノールアミンや、糖分子を含むホス
ファチジルイノシトール、ガングリオシドなどが好適に
用いられ得る。また、場合によってはアシル鎖中に不飽
和結合が存在しても構わない。

このような脂質は、水不溶性固体物質表面に直接的に
固定化され得るが、好ましくは、水不溶性固体物質表面
に導入された疎水部としての、メチレンの繰返しからな
る直鎖アルキルによる疎水結合を介して固定化されるこ
とが望ましい。

本発明においてメチレンの繰返しからなる直鎖アルキ
ルとしては、炭素数が４〜26程度の各種アルキルアミ
ン、脂肪酸、アルコールやこれらを含む単純脂質や複合
脂質がに用いられ得、場合によっては分岐状のものであ
ってもよいが、好ましくは、メチレンの繰返しが26以下
の直鎖状のもの、特にメチレンの繰返しが８〜20程度の
ものがより高い特性を付与することができるために望ま
しい。

このような直鎖アルキルは、例えば、多感応性エポキ
シド、アルデヒド、カルボジイミドなどの公知のカップ
リング剤を用いて水不溶性担体表面に導入され得る。特
に水不溶性担体として、後述するようにガラスビーズを
用いた場合には、例えばオクタデシルジメチル［３−
（トリメトキシシリル）プロピル］アンモニウムクロラ
イドなどのシランカップリング剤を用いれば、容易に直
鎖アルキルを導入できる。

そしてこのように直鎖アルキルを表面に導入された水
不溶性担体は、疎水結合によって容易に上記したような
脂質を固定化できる。

本発明において用いられる担体としての水不溶性固体
物質としては、アガロース系、デキストラン系、セルロ
ース系、ポリアクリルアミド系、ポリビニルアルコール
系、ポリビニルピロリドン系、ポリアクリロニトリル
系、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリスチレ
ン系、アクリル酸エステル系、メタクリル酸エステル
系、ポリエチレン系、ポリプロピレン系、ポリ４−フッ
化エチレン系、エチレン−酢酸ビニル共重合体系、ポリ
アミド系、ポリカーボネート系、ポリフッ化ビニリデン
系、ポリビニルホルマール系、ポリアリレート系、ポリ
エーテルスルフォン系などの有機高分子、ガラス系、ア
ルミナ系、チタン系、活性炭系、セラミックス系などの
無機物などが挙げられるが、特に細胞接着性の高すぎな
いもの、すなわち、細胞−担体間の相互作用が比較的穏
やかなものが好まれる。また、生体由来の天然有機高分
子であるコラーゲン、キトサン等も用いられ得る。この
ような水不溶性固体物質の形態としては、特に限定され
ず、平板上のものも用いることができるが、好ましく
は、粒子状、特に平均粒径が0.05〜5mmの粒子状のもの
が望ましい。なお平均粒径はJIS−Ｚ−8801に規定され
るフルイを用いて分級した後、各級の上限粒径と下限粒
径の中間値を各級の粒径とし、その重量平均として算出
したものである。さらに粒子形状は細胞に物理的な損傷
を与えにくいことや均一な粒子を得やすい等の点から球
形のものが好ましい。

本発明のリンパ球亜分画の分離器は、上記のごときリ
ンパ球分画中のＴ_H/IおよびＴ_S/C分画を他のリンパ球分
画よりも優先的に吸着させる脂質を、水不溶性固体物質
表面に固定化したことを特徴とするリンパ球亜分画の分
離材を充填したカラムを有することを特徴とするもので
ある。

本発明のリンパ球亜分画の分離材をリンパ球浮遊液に
接触させるには、例えば、平板状のリンパ球亜分画の分
離材にリンパ球浮遊液を接触させて行なうことも可能で
あるが、上記のごとき分離材の表面上に存在して細胞吸
着に作用する疎水性サイトの絶対量や十分な細胞吸着ス
ペースを獲得するという点から、粒子状の分離材を充填
してなるカラムを有する分離器を用いて接触させること
が望ましい。

この粒子状の分離材を充填してなるカラムを有するリ
ンパ球亜分画の分離器において、カラム容器を構成する
材質としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカ
ーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート
等の合成樹脂、ガラスおよびステンレス等の金属などが
使用できるが、オートクレープ滅菌が可能で取り扱いや
すいポリプロピレンやポリカーボネート等が特に好まし
い。またこのリンパ球亜分画の分離器のカラムの出入口
とリンパ球亜分画の分離材を充填した分離材層との間に
は、リンパ球浮遊液中の細胞成分は通過するが分離材は
通過できない網目を有するフィルターを備えていること
が好ましく、このフィルターを構成する材質としては、
生理学的に不活性で強度の高いものであればよいが、特
にポリエステル、ポリアミドであることが好まれる。

第１図は本発明のリンパ球亜分画の分離器の一実施態
様の使用状態における模式図である。第１図に示す実施
態様において、カラム１は、両端部が開口され、かつ下
端開口部のやや上方の部位より流出口５となる下端開口
部までは漸次縮径され先細とされた管形状のものであ
り、さらにこの先細部７には三方活栓４が備えられ、流
出口５に至る流路を開閉可能なものとしている。このカ
ラム１の前記先細部７より上方の実径部６内には上記の
ごとき本発明のリンパ球亜分画の分離材２が充填されて
おり、この分離材２は、カラム１の実径部６の上方に設
けられたフィルター３および下端に設けられたフィルタ
ー３′によってカラム１内に保持され分離材層を形成し
ている。

また本発明のリンパ球亜分画の分離方法は、上記のご
ときリンパ球分画中のＴ_H/IおよびＴ_S/C分画を他のリン
パ球分画よりも優先的に吸着させる脂質を、水不溶性固
体物質表面に固定化したことを特徴とするリンパ球亜分
画の分離材に、リンパ球浮遊液を接触させ、Ｔヘルパー
／インデューサーおよびＴサプレッサー／サイトトキシ
ック分画を効率よく捕捉させることでNKあるいはLGL系
のリンパ球に富む非捕捉分画を回収することを特徴とす
るものである。

本発明のリンパ球亜分画の分離方法を、前記第１図に
示す分離器を用いた場合を例にとり、より具体的に説明
すると、まず末梢血平衡塩溶液に浮遊させたリンパ球液
あるいは動物血漿に再浮遊させたリンパ球液などのリン
パ球浮遊液を、リンパ球亜分画分離材２を充填してなる
カラム１内に注入して静置する。

ここで、リンパ球浮遊液の通液方法は、特に限定され
るものではなく、必要に応じて連続あるいは非連続にし
てもよい。

このようにしてカラム１内において、リンパ球浮遊液
を分離材２と所定時間接触させた後、各種ポンプあるい
はピペット等を用いてカラム１内にリンス液を注入し、
三方活栓４を開いて、流出口５から静かに洗浄液を落下
させ、試験管８などで回収する。

これにより分離材２に吸着されなかったNKあるいはLG
L系のリンパ球分画を多く含む非捕捉分画を回収するこ
とができる。

なお、この洗浄操作の際用いられるリンス液として
は、分離材２に吸着された細胞成分を溶離することな
く、吸着されなかった細胞成分を洗い落とすことを目的
とするものであるために、活性の低いものが望まれ、平
衡塩溶液、細胞培養液等が用いられ、好ましくは２価カ
チオンフリーの平衡塩溶液、例えばハンクス平衡塩溶液
（Hank's balanced salt solution: HBBS）などが用い
られる。

（実施例） 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明す
る。

比較例１ 水不溶性担体として、オキシラン基を有するアクリル
ビーズ［オイパーキッドＣ（EC）、φ150μｍ、オキシ
ラン基含量200μmol/g（wet）レーム ファルマ［Ｒh
m Pharma］社製］を用いて、テトラデシルアミンンを固
定化した疎水性ビーズを調製した。

まず、ECを蒸溜水で洗浄し、ジメチルホルムアミド
（DMF）を用いて調整された0.2Mのテトラデシルアミン
溶液に添加し、80℃の水浴中で３時間加温した後に、60
℃のオーブン中に約20時間静置した。

調製された反応物を、DMF、ジメチルスルフォキシド
（DMSO）、および水の順で洗浄し、DMSOとリン酸緩衝液
（0.1M pH7.4）を順次用いて121℃、30分でオートクレ
ーブ処理した。

このようにして得られた分離材をハンクス平衡塩溶液
（HBSS、pH7.4）に分散させ、ポリプロピレン製カラム
に湿潤状態で0.1mlとなるように充填した。

次に、正常人より採取した新鮮血2mlをカラムに注入
し、連続的に流出させた。そしてこのカラム内を1ml以
上のハンクス平衡塩溶液などをを用いて直ちに洗浄しリ
ンパ球を回収した。

回収された分画中の細胞数、単球とリンパ球の割合、
およびＴ、Ｂリンパ球の割合は、自動血球計数器（オル
ソ インスツルメンツ［ORTHO INSTRUMENTS］社製、ELT
−８）と自動細胞分析装置（日本分光（株）製、Cyto A
CE−100）と螢光標識された抗leu抗体（ベクトン ディ
ッキンソン社製）を用いて評価した。これらの測定結果
に基づき分離材への細胞付着率を算出した。結果を第１
表に示す。

実施例１ 比較例１で調製された疎水性ビーズを用いてリン脂質
固定化ビーズを作成した。

まずテトラデシルアミン結合ビーズをクロロホルム溶
液を用いたホスファチジルグリセロール（日本精化
（株）製）（アシル鎖の炭素数が16で、不飽和結合を１
個含有する。）溶液（25mg/ml）に添加し、一時間撹拌
の後、減圧乾燥した。この後、15gのビーズあたり１
の水を用いて洗浄し、１日間水中に保存し、実験に供し
た。

リンパ球分離実験および分離能の評価は、比較例１の
手順に従って、行なわれた。その結果を第１表に示す。

実施例２ 固定化するリン脂質をホスファチジルコリン（シグマ
社製）（アシル鎖の炭素数16）に代える以外は実施例１
の方法に従って、リン脂質固定化ビーズを作成し、同様
の実験に供した。結果を第１表に示す。

実施例３ 固定化するリン脂質をガングリオシド（シグマ社製）
（ウシ脳由来）に代える以外は実施例１の方法に従っ
て、リン脂質固定化ビーズを作成し、同様の実験に供し
た。結果を第１表に示す。

実施例４ 固定化するリン脂質をホスファチジルイノシトール
（シグマ社製）（ダイズ由来）に代える以外は実施例１
の方法に従って、リン脂質固定化ビーズを作成し、同様
の実験に供した。結果を第１表に示す。

（発明の効果） 以上述べたように本発明は、リンパ球分画中のＴ_H/I
およびＴ_S/C分画を他のリンパ球分画よりも優先的に吸
着させる脂質を、水不溶性固体物質表面に固定化したこ
とを特徴とするリンパ球亜分画の分離材であるから、リ
ンパ球浮遊液から選択的にＴ_H/I（CD4陽性）およびＴ
_S/C（CD8陽性）分画吸着するため、リンパ球浮遊液から
の簡便かつ迅速なNKあるいはLGL系のリンパ球分画の分
離、濃縮を可能にすることができることが明らかになっ
た。従って、本発明のリンパ球亜分画の分離材は免疫機
能に関連した白血球亜分画の細胞間相互作用の解析、リ
ンパ球由来の生理活性物質を効率的に得るための基礎技
術、さらには各種免疫疾患の治療に応用できることを示
すとともに、本発明の分離材によって、特殊な生理活性
物質を用いることなく、精度の高いＴリンパ球亜分画分
離が達成できることも示された。

さらに本発明はまた、固定化される脂質が、炭素数８
〜26のアシル鎖を有するリン脂質であり、また、不溶性
固体物質として粒径0.05〜5mmの粒子状体を用い、さら
に水不溶性固体物質表面に導入された疎水部として、メ
チレンの繰返しからなる直鎖アルキルによる疎水結合を
介して脂質を固定化するものであると、より効率のよい
リンパ球亜分画分離操作が可能となるものである。

本発明はまた、前記したようなリンパ球分画中のＴ
_H/IおよびＴ_S/C分画を他のリンパ球分画よりも優先的に
吸着させる脂質を、水不溶性固体物質表面に固定化した
ことを特徴とするリンパ球亜分画の分離材を充填したカ
ラムを有することを特徴とするリンパ球亜分画の分離器
であるから、上記のごとく優れた特性を有するリンパ球
亜分画の分離材と血球浮遊液との接触をより効率よく行
なうことができ、リンパ球亜分画の分離操作を短時間で
かつ守備よく実施することが可能となるものである。

本発明はさらに、リンパ球分画中のＴ_H/IおよびＴ_S/C
分画を他のリンパ球分画よりも優先的に吸着させる脂質
を、水不溶性固体物質表面に固定化したことを特徴とす
るリンパ球亜分画の分離材、リンパ球浮遊液を接触さ
せ、Ｔヘルパー／インデューサーおよびＴサプレッサー
／サイトトキシック分画を効率よく捕捉させることでNK
あるいはLGL系のリンパ球に富む非捕捉分画を回収する
ことを特徴とするリンパ球亜分画の分離方法であるか
ら、従来の分離法に比べ、操作の習熟を必要としないで
NK系あるいはLGL系のリンパ球を分離・濃縮することが
でき、さらに安価で、際だった細胞損傷も一切与えない
ことから、極めて有用な技術であると言うことができる
ものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のリンパ球亜分画の分離器の一実施態様
の使用状態における模式図である。 １……カラム、２……リンパ球亜分画の分離材、3,3′
……フィルター、４……三方活栓、５……流出口、６…
…実径部、７……縮径部、８……試験管。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高橋 晃 神奈川県足柄上郡中井町井ノ口1500番地 テルモ株式会社内 (72)発明者 赤池 敏宏 東京都保谷市下保谷４丁目15番23号 (56)参考文献 特開 昭60−231613（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−23680（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61M 1/36 G01N 33/49 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】リンパ球分画中のＴヘルパー／インデュー
   サーおよびＴサプレッサー／サイトトキシック分画を他
   のリンパ球分画よりも優先的に吸着させる脂質を、水不
   溶性固体物質表面に固定化したことを特徴とするリンパ
   球亜分画の分離材。
2. 【請求項２】固定化される脂質が、炭素数８〜26のアシ
   ル鎖を有するリン脂質であることを特徴とする請求項１
   に記載のリンパ球亜分画の分離材。
3. 【請求項３】不溶性固体物質として粒径0.05〜5mmの粒
   子状体を用いるものである請求項１または２のいずれか
   に記載のリンパ球亜分画の分離材。
4. 【請求項４】水不溶性固体物質表面に導入された疎水部
   として、メチレンの繰返しからなる直鎖アルキルによる
   疎水結合を介して脂質を固定化することを特徴とする請
   求項１〜３のいずれかに記載のリンパ球亜分画の分離
   材。
5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載のリンパ球
   亜分画の分離材を充填したカラムを有することを特徴と
   するリンパ球亜分画の分離器。
6. 【請求項６】請求項１〜４のいずれかに記載のリンパ球
   亜分画の分離材に、リンパ球浮遊液を接触させ、Ｔヘル
   パー／インデューサーおよびＴサプレッサー／サイトト
   キシック分画を効率よく捕捉させることでNKあるいはLG
   L系のリンパ球に富む非捕捉分画を回収することを特徴
   とするリンパ球亜分画の分離方法。