JP2978518B2 - ファージｄｎａの精製方法 - Google Patents
ファージｄｎａの精製方法Info
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ファージDNAの精製方法に関する。本発明
の方法は、遺伝子工学分野において用いることができ
る。
の方法は、遺伝子工学分野において用いることができ
る。
［従来の技術］ 近年、遺伝子工学技術の進歩と共に、種々の細胞、ウ
イルス、ファージから核酸を精製することが盛んに行な
われている。特に遺伝情報を担っているDNAの塩基配列
を決定する方法として、M13ファージを大腸菌と共に培
養することにより単鎖DNAを増幅させる技術は重要であ
り、この中でファージDNAの精製が一般的に行なわれて
いる。従来、上記培養液からファージDNAを精製する方
法としては、先ず遠心分離により大腸菌を除去した後、
ポリエチレングリコールでファージを沈殿させ、フェノ
ール抽出で脱タンパクし、さらにエタノール沈殿により
DNAを濃縮する方法が広く一般的に行なわれている。
イルス、ファージから核酸を精製することが盛んに行な
われている。特に遺伝情報を担っているDNAの塩基配列
を決定する方法として、M13ファージを大腸菌と共に培
養することにより単鎖DNAを増幅させる技術は重要であ
り、この中でファージDNAの精製が一般的に行なわれて
いる。従来、上記培養液からファージDNAを精製する方
法としては、先ず遠心分離により大腸菌を除去した後、
ポリエチレングリコールでファージを沈殿させ、フェノ
ール抽出で脱タンパクし、さらにエタノール沈殿により
DNAを濃縮する方法が広く一般的に行なわれている。
しかし、上述の方法では、フェノール、クロロホルム
等人体に有害な試薬を使用しなければならない。また、
各段階で遠心分離を必要とするため、機械で自動化を行
なうことが困難であり、今後、自動化をはかるためには
遠心分離を行なわない方法が必要となる。
等人体に有害な試薬を使用しなければならない。また、
各段階で遠心分離を必要とするため、機械で自動化を行
なうことが困難であり、今後、自動化をはかるためには
遠心分離を行なわない方法が必要となる。
［発明が解決しようとする問題点］ 従って、本発明の目的は、遠心分離操作及び人体に有
害な試薬を必要とせずにファージDNAを高純度に精製す
ることができる、ファージDNAの精製方法を提供するこ
とである。
害な試薬を必要とせずにファージDNAを高純度に精製す
ることができる、ファージDNAの精製方法を提供するこ
とである。
［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは鋭意研究の結果、メンブレンフィルタ
ーで大腸菌をろ過除去し、ファージタンパク質を分解、
変性した後に、限外ろ過により除タンパク質及び濃縮す
ることによりファージDNAを高純度に精製することがで
きることを見出し本発明を完成した。
ーで大腸菌をろ過除去し、ファージタンパク質を分解、
変性した後に、限外ろ過により除タンパク質及び濃縮す
ることによりファージDNAを高純度に精製することがで
きることを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、微生物菌体とファージとを含有
する混合液をメンブレンフィルターによりろ過し、微生
物菌体を除去する工程と、次いでファージタンパク質を
分解、変性させる工程と、次いで限外ろ過により不純物
を除去する工程を含むファージDNAの精製方法を提供す
る。
する混合液をメンブレンフィルターによりろ過し、微生
物菌体を除去する工程と、次いでファージタンパク質を
分解、変性させる工程と、次いで限外ろ過により不純物
を除去する工程を含むファージDNAの精製方法を提供す
る。
［発明の効果］ 本発明の方法によれば、培養液から遠心分離操作を必
要とすることなくファージDNAを高純度、高収率に精製
することができる。本発明の方法によると、遠心分離操
作が不要なので機械による自動化が可能である。また、
本発明の方法では人体に有害な試薬を用いる必要がな
く、また、精製に費やされる時間も短縮される。
要とすることなくファージDNAを高純度、高収率に精製
することができる。本発明の方法によると、遠心分離操
作が不要なので機械による自動化が可能である。また、
本発明の方法では人体に有害な試薬を用いる必要がな
く、また、精製に費やされる時間も短縮される。
［発明の具体的説明］ 本発明の方法では、微生物菌体とファージとを含有す
る混合液が処理される。このような混合液の代表例とし
ては、ファージが感染した微生物の培養液を挙げること
ができる。培養液としては、通常の方法で培養された培
養液をそのまま使用することができ、例えばM13ファー
ジを大腸菌と共に2xTY培地で培養した培養液等を用いる
ことができる。
る混合液が処理される。このような混合液の代表例とし
ては、ファージが感染した微生物の培養液を挙げること
ができる。培養液としては、通常の方法で培養された培
養液をそのまま使用することができ、例えばM13ファー
ジを大腸菌と共に2xTY培地で培養した培養液等を用いる
ことができる。
本発明の方法の第１工程では、上記混合液をメンブレ
ンフィルターによりろ過し、微生物菌体を除去する。こ
こで、使用されるメンブレンフィルターの孔径は、菌体
の透過阻止率とろ過速度の関係より0.45μｍないし0.22
μｍ程度が好ましい。また、メンブレンフィルターの材
質は何ら限定されるものではない。
ンフィルターによりろ過し、微生物菌体を除去する。こ
こで、使用されるメンブレンフィルターの孔径は、菌体
の透過阻止率とろ過速度の関係より0.45μｍないし0.22
μｍ程度が好ましい。また、メンブレンフィルターの材
質は何ら限定されるものではない。
続く第２工程では、第１工程で得られたろ液につい
て、タンパク質の分解、変性を行なう。タンパク質の分
解、変性の方法として、例えばプロテイナーゼＫのよう
なタンパク質分解酵素を作用させる方法を挙げることが
できる。この場合、タンパク質分解酵素の濃度は適宜選
択することができるが、M13ファージと大腸菌とを含む
培養液を処理する場合には通常0.001mg/mlないし0.5mg/
ml程度である。タンパク質分解酵素を用いる方法以外に
も、常法に基づき、有機溶媒処理、界面活性剤処理、ア
ルカリ処理又は加熱処理等によりファージタンパク質の
分解、変性工程を行なうことができる。これらの処理を
より詳細に説明すると、まず、最初に限外ろ過膜上にM1
3ファージと大腸菌培養液が存在しているわけである
が、培養液をろ過し、M13ファージのみを残す。ただし
条件によっては培養液が存在したままでも構わない。次
に上記タンパク質分解酵素を加える。タンパク質分解酵
素のうち好ましいものの例としてプロテイナーゼＫが挙
げられる。また、タンパク質を分解、変性させる工程
は、30〜100％メタノールやエタノールのような有機溶
媒で処理することによっても行なうことができる。さら
に、M13ファージのような、比較的単純なファージの分
解においては、酵素や有機溶媒等強い分解力を持つもの
でなくとも、DNAとタンパク質は分離できる。すなわ
ち、例えば、界面活性剤処理によってもタンパク質の分
解、変性を行なうことでき、好ましい界面活性剤は、ラ
ウリル硫酸ナトリウム（SDS）のような陰イオン系界面
活性剤であり、その濃度はSDSの場合0.01〜１重量％で
ある。また、タンパク質は熱に弱く、DNA等の核酸は比
較的強いことから、熱変性を利用することもでき、この
場合、加熱条件は80℃ないし100℃で５分ないし20分が
好ましい。また、アルカリ処理によってもタンパク質の
分解、変性を行なうことができ、好ましいアルカリとし
ては0.1Nないし1Nの濃度のアルカリ金属水酸化物水溶液
を挙げることができる。
て、タンパク質の分解、変性を行なう。タンパク質の分
解、変性の方法として、例えばプロテイナーゼＫのよう
なタンパク質分解酵素を作用させる方法を挙げることが
できる。この場合、タンパク質分解酵素の濃度は適宜選
択することができるが、M13ファージと大腸菌とを含む
培養液を処理する場合には通常0.001mg/mlないし0.5mg/
ml程度である。タンパク質分解酵素を用いる方法以外に
も、常法に基づき、有機溶媒処理、界面活性剤処理、ア
ルカリ処理又は加熱処理等によりファージタンパク質の
分解、変性工程を行なうことができる。これらの処理を
より詳細に説明すると、まず、最初に限外ろ過膜上にM1
3ファージと大腸菌培養液が存在しているわけである
が、培養液をろ過し、M13ファージのみを残す。ただし
条件によっては培養液が存在したままでも構わない。次
に上記タンパク質分解酵素を加える。タンパク質分解酵
素のうち好ましいものの例としてプロテイナーゼＫが挙
げられる。また、タンパク質を分解、変性させる工程
は、30〜100％メタノールやエタノールのような有機溶
媒で処理することによっても行なうことができる。さら
に、M13ファージのような、比較的単純なファージの分
解においては、酵素や有機溶媒等強い分解力を持つもの
でなくとも、DNAとタンパク質は分離できる。すなわ
ち、例えば、界面活性剤処理によってもタンパク質の分
解、変性を行なうことでき、好ましい界面活性剤は、ラ
ウリル硫酸ナトリウム（SDS）のような陰イオン系界面
活性剤であり、その濃度はSDSの場合0.01〜１重量％で
ある。また、タンパク質は熱に弱く、DNA等の核酸は比
較的強いことから、熱変性を利用することもでき、この
場合、加熱条件は80℃ないし100℃で５分ないし20分が
好ましい。また、アルカリ処理によってもタンパク質の
分解、変性を行なうことができ、好ましいアルカリとし
ては0.1Nないし1Nの濃度のアルカリ金属水酸化物水溶液
を挙げることができる。
上記処理は単独で、又は組合わせて採用することがで
き、この工程によりファージDNAからタンパク質を除去
することができる。
き、この工程によりファージDNAからタンパク質を除去
することができる。
次いで、得られた溶液について限外ろ過を行なう。こ
こで用いられる限外ろ過膜の分画分子量としては２万な
いし100万程度のものが好ましい。分画分子量がこの範
囲よりも小さいとタンパク質除去の効率が低下し、これ
より大きいとDNAが流出するおそれがある。また、限外
ろ過膜の材質としては一般に市販されているもの、例え
ばポリスルフォン製のもの等の用いることができる。限
外ろ過後、望ましくはファージDNAの収率を上げるため
に適当な溶液等で限外ろ過膜を洗浄ろ過すると、ファー
ジDNAは溶液の形態で回収できる。この時用いられる溶
液としては特に限定されないが、一般的に用いられてい
る緩衝液、例えばTE緩衝液（Tris−HCl緩衝液EDTA）等
を用いることができる。この限外ろ過により、第２工程
で得られた溶液からタンパク質、その他の不純物が除か
れ、ファージDNAが精製される。
こで用いられる限外ろ過膜の分画分子量としては２万な
いし100万程度のものが好ましい。分画分子量がこの範
囲よりも小さいとタンパク質除去の効率が低下し、これ
より大きいとDNAが流出するおそれがある。また、限外
ろ過膜の材質としては一般に市販されているもの、例え
ばポリスルフォン製のもの等の用いることができる。限
外ろ過後、望ましくはファージDNAの収率を上げるため
に適当な溶液等で限外ろ過膜を洗浄ろ過すると、ファー
ジDNAは溶液の形態で回収できる。この時用いられる溶
液としては特に限定されないが、一般的に用いられてい
る緩衝液、例えばTE緩衝液（Tris−HCl緩衝液EDTA）等
を用いることができる。この限外ろ過により、第２工程
で得られた溶液からタンパク質、その他の不純物が除か
れ、ファージDNAが精製される。
上記したように、第１工程に続いて第２工程を行なう
ことができるが、第１工程終了後、ろ液を限外ろ過にか
けて低分子量成分を除去し、ファージを精製することも
できる。この場合の限外ろ過は、上記第３工程と同様に
行なうことができる。なお、この場合は、第２工程のタ
ンパク質分解、変性処理を限外ろ過膜上で行ない、第３
工程の限外ろ過を同一の限外ろ過膜を用いて行なうこと
もできる。
ことができるが、第１工程終了後、ろ液を限外ろ過にか
けて低分子量成分を除去し、ファージを精製することも
できる。この場合の限外ろ過は、上記第３工程と同様に
行なうことができる。なお、この場合は、第２工程のタ
ンパク質分解、変性処理を限外ろ過膜上で行ない、第３
工程の限外ろ過を同一の限外ろ過膜を用いて行なうこと
もできる。
［実施例］ 以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明す
る。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるもので
はない。
る。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるもので
はない。
大腸菌JM109株を2xTY培地に植菌し、次いでM13ファー
ジを接種した後、37℃で４時間培養した。
ジを接種した後、37℃で４時間培養した。
この培養液を孔径が0.45μｍのメンブレンフィルター
にのせて、窒素ガスで加圧することによりろ過した。
にのせて、窒素ガスで加圧することによりろ過した。
ろ液を集め、さらに分画分子量30万の限外ろ過膜でろ
過して低分子量の培地成分を除去した。残ったファージ
のタンパク質を分解するために、膜上に５μg/μｌのプ
ロテイナーゼＫ溶液をのせ、10分間反応させた。
過して低分子量の培地成分を除去した。残ったファージ
のタンパク質を分解するために、膜上に５μg/μｌのプ
ロテイナーゼＫ溶液をのせ、10分間反応させた。
これを加圧して酵素溶液を除き、TE緩衝液をさらにの
せて加圧し、これを除いた。この限外ろ過膜にTE緩衝液
200μｌをのせて振盪した後に、これをピペットで回収
した。
せて加圧し、これを除いた。この限外ろ過膜にTE緩衝液
200μｌをのせて振盪した後に、これをピペットで回収
した。
回収量は、培養液2mlからファージDNA2.5μｇであっ
た。
た。
得られたファージDNAについて、常法に基づきアガロ
ースゲル電気泳動を行なった。対照として、市販のM13
ファージ単鎖DNA及び従来法であるポリエチレングリコ
ール沈殿−フェノール抽出法により精製したM13ファー
ジDANについても同様にアガロースゲル電気泳動を行な
った。
ースゲル電気泳動を行なった。対照として、市販のM13
ファージ単鎖DNA及び従来法であるポリエチレングリコ
ール沈殿−フェノール抽出法により精製したM13ファー
ジDANについても同様にアガロースゲル電気泳動を行な
った。
結果を図に示す。図中、レーン１はλファージのHind
III消化物から成る分子量マーカー、レーン２は市販の
M13ファージ単鎖DNAの泳動パターン、レーン３はポリエ
チレングリコール沈殿−フェノール抽出法により精製し
たM13ファージDNAの泳動パターン、レーン４は本発明の
方法により精製したM13ファージDNAの泳動パターンを示
す。
III消化物から成る分子量マーカー、レーン２は市販の
M13ファージ単鎖DNAの泳動パターン、レーン３はポリエ
チレングリコール沈殿−フェノール抽出法により精製し
たM13ファージDNAの泳動パターン、レーン４は本発明の
方法により精製したM13ファージDNAの泳動パターンを示
す。
図から明らかなように、本発明の方法によりファージ
DNAが高純度に精製されることが確認された。
DNAが高純度に精製されることが確認された。
図面は本発明の方法により精製されたファージDNAのア
ガロース電気泳動パターンを従来法により精製されたフ
ァージDNAの泳動パターン及び市販のファージDNAの泳動
パターンと共に示す図である。
ガロース電気泳動パターンを従来法により精製されたフ
ァージDNAの泳動パターン及び市販のファージDNAの泳動
パターンと共に示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−236486（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−504224（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/99 ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】微生物菌体とファージとを含有する混合液
をメンブレンフィルターによりろ過し、微生物菌体を除
去する工程と、次いでファージタンパク質を分解、変性
させる工程と、次いで限外ろ過により不純物を除去する
工程を含むファージDNAの精製方法。 - 【請求項２】メンブレンフィルターの孔径は0.45μｍな
いし0.22μｍであり、限外ろ過の分画分子量は２万ない
し100万である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】ファージタンパク質の変性、分解工程は、
タンパク質分解酵素を作用させることにより行なわれる
請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】メンブレンフィルターによるろ過とファー
ジタンパク質分解、変性工程との間に限外ろ過工程をさ
らに含む請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方
法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1317114A JP2978518B2 (ja) | 1989-12-06 | 1989-12-06 | ファージｄｎａの精製方法 |
| EP19900313173 EP0431905B1 (en) | 1989-12-06 | 1990-12-05 | Method for purifying phage DNA |
| DE1990608825 DE69008825T2 (de) | 1989-12-06 | 1990-12-05 | Verfahren zur Reinigung von Phagen-DNA. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1317114A JP2978518B2 (ja) | 1989-12-06 | 1989-12-06 | ファージｄｎａの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03180182A JPH03180182A (ja) | 1991-08-06 |
| JP2978518B2 true JP2978518B2 (ja) | 1999-11-15 |
Family
ID=18084596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1317114A Expired - Fee Related JP2978518B2 (ja) | 1989-12-06 | 1989-12-06 | ファージｄｎａの精製方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0431905B1 (ja) |
| JP (1) | JP2978518B2 (ja) |
| DE (1) | DE69008825T2 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04360686A (ja) * | 1991-06-04 | 1992-12-14 | Tosoh Corp | Ｄｎａの精製方法 |
| FR2678950B1 (fr) * | 1991-07-09 | 1993-11-05 | Bertin Et Cie | Cartouche, dispositif et procede d'extraction d'acides nucleiques tels que l'adn a partir d'un echantillon de sang ou de cellules de tissus. |
| DE4139664A1 (de) | 1991-12-02 | 1993-06-03 | Diagen Inst Molekularbio | Vorrichtung und verfahren zur isolierung und reinigung von nukleinsaeuren |
| FR2712511B1 (fr) * | 1993-11-16 | 1996-02-09 | Bertin & Cie | Cartouche pour la préparation d'acides nucléiques purifiés. |
| US7026468B2 (en) | 1996-07-19 | 2006-04-11 | Valentis, Inc. | Process and equipment for plasmid purification |
| US6011148A (en) * | 1996-08-01 | 2000-01-04 | Megabios Corporation | Methods for purifying nucleic acids |
| US7807822B2 (en) | 1996-08-01 | 2010-10-05 | Robert Bridenbaugh | Methods for purifying nucleic acids |
| DE19746874A1 (de) * | 1997-10-23 | 1999-04-29 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren an hydrophoben Oberflächen - insbesondere unter Verwendung hydrophober Membranen |
| WO2000066723A1 (en) * | 1999-05-04 | 2000-11-09 | Millipore Corporation | Method of ultrafiltration |
| US6498240B1 (en) | 1999-09-17 | 2002-12-24 | Millipore Corporation | Method for sequencing reaction cleanup by constant pressure diffential ultrafiltration |
| JP2005538717A (ja) | 2002-09-13 | 2005-12-22 | ヴァレンティス，インコーポレイテッド | 核酸のプレパラティブスケールの精製のための装置および方法 |
| DE102008055606A1 (de) | 2008-11-03 | 2010-05-06 | Bayer Technology Services Gmbh | Verfahren zur hochdurchsatzfähigen Präparation sequenzierungsfähiger DNA aus einzelnen Plaques von Peptiden präsentierenden Phagen |
| CN115354041A (zh) * | 2022-10-19 | 2022-11-18 | 北京君全智药生物科技有限公司 | 一种m13噬菌体单链dna的制备方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0240191A3 (en) * | 1986-03-13 | 1989-10-25 | Seiko Instruments Inc. | Method of isolating dna contained in a virus or cell |
| DE3724442A1 (de) * | 1987-07-23 | 1989-02-02 | Europ Lab Molekularbiolog | Verfahren und vorrichtung zur reinigung von m-13-phagen-dna |
| IT1226210B (it) * | 1988-12-22 | 1990-12-21 | Claudio Schneider | Procedimento per l'estrazione e la purificazione di dna |
-
1989
- 1989-12-06 JP JP1317114A patent/JP2978518B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-12-05 DE DE1990608825 patent/DE69008825T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-05 EP EP19900313173 patent/EP0431905B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0431905A1 (en) | 1991-06-12 |
| EP0431905B1 (en) | 1994-05-11 |
| JPH03180182A (ja) | 1991-08-06 |
| DE69008825D1 (de) | 1994-06-16 |
| DE69008825T2 (de) | 1994-08-25 |
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