JP2941041B2 - フローサイトメトリーによる白血球の分類方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、臨床検査分野における白血球の分類測定
法およびそれに使用する試薬に関するものであり、さら
に詳しくは、フローサイトメーターを用いて、蛍光発色
処理された血球を光学的に測定し、白血球を分類する方
法において採血後の経過時間の差にかかわらず常に正し
い白血球分類精度を維持できる方法に関するものであ
る。

（従来の技術） 健常人の末梢血中の白血球には、リンパ球、単球、好
中球、好酸球、好塩基球の種類がある。これらは各々そ
の機能が異っており、血液中の白血球を種類別に計数す
ることによって、病気の診断に貢献することができる。
たとえば、好中球の増加は、炎症、心筋梗塞、白血病な
どにみられ、好中球の減少は、ウイルス性疾患、再生不
良性貧血、無顆粒球少などに見られる。好酸球の増加
は、寄生虫症、ホジキン病、アレルギー疾患などにみら
れる。単球の増加は、感染症の快復期、単球性白血病な
どにみられる。

白血球を分類・計数するために従来から最も良く実施
されている方法は、血液像鑑定（視算法、用手法）と呼
ばれるものである。

この方法は、血液をスライドグラス上に塗抹し、血球
を固定し、さらに染色したのち、顕微鏡で観察し、一つ
ずつの白血球の形態的特徴（白血球の大きさ、核の形
態、細胞質の形態、顆粒の有無等）や染色度合から測定
者がいずれの血球であるかを判定し、分類−計数するも
のである。このとき、一般の検査室では100〜200個の白
血球を計数し、白血球全体の数の中に占める各々の血球
の百分率（％）を測定値としている。

この方法は、顕微鏡による観察の前に、血液の塗抹、
固定、染色等の繁雑な標本作成操作が必要であること
と、顕微鏡を用いた分類−計数は、血球のわずかな差を
見分けなければならないこととのために、測定者に大き
な負担をかけるものとなっている。さらに、計数する白
血球数が少い上に、塗抹試料上の血球が不均一な分布と
なっている場合もあり、熟練した測定者でも再現性のあ
る測定値を出すことは難しい。

このために、白血球の分類・計数が自動的に行なえる
方法が強く求められており、現在のところ、大きく分け
て二種類の方法が実現されている。

そのうちの一つの方法は、血球像をビデオカメラ等で
とらえ、コンピュータによる画像処理によって白血球を
分類するものである。この方法は従来の視算法に原理的
には近い方法であるが、コンピューターによる処理では
分類できない血球も多く、完全には視算法に取ってかわ
るものとはなっていない。また、装置が複雑で大型にな
り、価格が高くなるという問題もある。

白血球を自動的に分類−計数するもう一つの方法は、
フローシステムを利用した方法である。この方法は、血
球を希釈液中に浮遊させた試料を用い、血球が一個ずつ
細い検出器中を通過するようにこの試料を流し、このと
き検出器で発生する信号を分析することにより白血球を
分類するものである。このフローシステムを利用した方
法は、さらに、二つの方法に細分される。

第１の方法は、赤血球を溶解剤で破壊し、白血球のみ
が浮遊した電解液を細孔中に流し、血球が細孔を通過し
たときの細孔部のインピーダンス変化を検出し、検出信
号の大きさによって白血球を分類するものである。

第２の方法は、光源と、試料中の細胞が１個ずつ細い
流路を流れるようにしたフローセルと、細胞から発せら
れた光を検出すの側光部と、検出信号を解析する解析装
置とを備えたフローサイトメーターを使用するものであ
る。この方法では、血球を染色し、染色された血球を光
で照射し、そのとき血球から発する蛍光および場合によ
っては散乱光を一緒に検出し、検出信号の強度によって
白血球を分類しようとするものである。

この第２の方法に属するものとしては、例えば特公昭
59−853号公報およびエル・エイ・カメンツキー（L.A.K
amentsky）「ブラッド・セルズ（Blood Cells）、第６
巻、121〜140頁、1980年に記載された方法がある。この
方法は、血液に10倍量のアクリジンオレンジ染色液を加
え、１分間インキュベートしたのち、アルゴンイオンレ
ーザー等の光源で照射したとき血球から発する緑色蛍光
と赤色蛍光を測定し、その二次元分布から、白血球単球
を分類・計数するものである。

第２の方法に属する他の例としては、特開昭50−2082
0号公報およびエイチ・エム・シャピロ（H.M.Shariro）
他「ザ・ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アン
ド・サイトケミストリー（The Jouynal of Histochemis
try and Cytochemistry）第24巻第１号、396〜411頁、1
976年；同じく第25巻第８号、976〜989頁、1977年に記
載された方法がある。この方法は、血液に４倍量の染色
液１を加え、３分間インキュベートした後、血液と等容
の20％ホルムアルデヒドを加え、５分間固定を行ない、
希釈用の染色液IIで15〜20倍に希釈し、フローサイトメ
ーターで測定するものである。この測定に用いられるフ
ローサイトメーターは、光源として光を３分割した水銀
アークランプ又は三本のレーザーを備え、染色液に含ま
れる３種の蛍光染料を各々励起し、その３種の蛍光と前
方散乱光、側方散乱光、吸光の６つのパラメーターを測
定し、４段階の二次元分布解析により白血球を分類・計
数する装置である。

さらに、特開昭63−70166号公報においては、緩衝
液、無機塩類及び蛍光染料からなる染色液に血液を加え
て染色するという一段階染色工程が開示されているが、
未溶解の赤血球が測定データに影響を及ぼし、側定が不
明確となるおそれがあった。

一方特開昭63−134958号公報において、低張酸性の蛍
光塗料溶液と、その浸透圧と液性を変化させる溶液とを
用いる二段染色法が開示されている。そして、その染色
された血液試料をフローサイトメーターに供し蛍光信
号、散乱信号を得、第２図に示す蛍光強度対側方散乱光
強度の二次元分布図を描き、白血球の５分類を行ってい
る。第２図中の１〜６はそれぞれリンパ球、単球、好中
球、好酸球、好塩基球、ノイズ成分の集団を示してい
る。

（発明が解決しようとする問題点） フローシステムを利用して白血球を分類・計数する方
法のうち第１の方法においては、赤血球を破壊しなけれ
ばならないが、血液によっては赤血球の溶解が完全に行
なわれ得ない場合もあり、このときには測定値の正確さ
が損なわれるという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうちの特公昭
59−853号公報等に記載された方法は、細胞による染料
の吸収が平衡に達する前に、すなわち、染色の途中で各
白血病の蛍光強度の差が最大となる時間に測定すること
を特徴としている。しかしながら、白血球数が極端に多
いか、または少い検体については、染色強度が適正レベ
ルとなる染色時間は正常な検体とは異ることになり、検
体ごとに適切な染色時間を選定しなければならない。ま
た、この方法は蛍光強度の差のみによって白血球を分類
しようとしているため、リンパ球と単球との分類等各皿
球の分離が必ずしも良くないという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうちの特公昭
50−853号公報等に記載された方法は、細胞による染料
の吸収が平衡に達する前に、すなわち、染色の途中で各
白血球の蛍光強度の差が最大となる時間に測定すること
を特徴としている。

しかしながら、白血球数が極端に多いか、または少い
検体については、染色強度が適正レベルとなる染色時間
は正常な検体とは異なることになり、検体ごとに適切な
染色時間を選定しなければならない。また、この方法は
蛍光強度の差のみによって白血球を分類しようとしてい
るため、リンパ球と単球との分離等各血球の分離が必ず
しも良くないという問題がある。

フローシステムを利用した第２の方法のうちの他の例
すなわち特開昭50−20820号公報等に記載された方法
は、操作手順が多く、染色時間が長くかかる上に、複雑
な試薬を使用しなければならない。また、光源が３種必
要であることに加え、６つのパラメーターを測定しなけ
ればならないため装置が非常に複雑で高価なものとな
る。さらに、このように多くのパラメーターを測定して
いるため解析が複雑となり、大容量の解析装置を必要と
するという問題もある。

さらに、前出の特開昭63−70166号の発明を含めフロ
ーサイトメトリーにより白血球を分類する方法において
は、血液を長時間放置しておいたため好中球が死細胞に
なると、フローサイトメーターでは検出できなくなる場
合があると言う問題があった。また、特開昭63−134958
号公報には、死細胞を検出し正しい好中球数を算出する
方法が記載されているが、検体によっては必ずしも死細
胞の弁別が完全に行えないという問題があった。また損
傷を受けた細胞の場合にも分布域が異動し、他の細胞分
布域に混入し弁別が不完全になるという問題があった。
このため測定血液は必ず新鮮血液を使用しなければなら
なかった。

この発明は、上記発明にさらに改良を加え、検体差
や、細胞膜の損傷等により通常とは異なる位置に分布す
る細胞がある場合にもかかわらず、より正しい白血球分
類が行える方法を提供することを目的とし、上記従来の
問題点を解決するために、簡単な手順と構成で、白血球
を正確に分類・計数するための方法を提供するものであ
る。

（課題を解決するための手段） 本発明の白血球分類方法は、 低張酸性状態の蛍光染料溶液である第１液と、その浸
透圧、液性を変化させる溶液である第２液とを用いたフ
ローサイトメトリーによる方法であり、 上記第１液に、損傷を受けている白血球細胞の核を特
異的に蛍光染色する染料を追加した液を用いて測定し、 得られた２種類の二次元分布を関連付けて解析するこ
とにより、細胞膜の損傷等により通常とは異なる位置に
分布する白血球細胞の数を求め、白血球分類結果を算出
することを特徴としている。

具体的には、第１液にPI（Propidium iodide）、EB
（Etidium bromide）などの第３の染料を追加して含有
させ、赤色蛍光強度対側方散乱光強度、緑色蛍光強度対
側方散乱光強度の両二次元分布を関連付けて解析するこ
とにより、採血後の時間経過などにより変質し通常とは
異なる位置に分布するようになった白血球細胞（例えば
細胞膜を損傷した好中球）の数を求めることができるよ
うにした。

本発明の方法において第１液の染料として使用できる
染料の例は次のとおりである。

第１の染料：アストラゾンイエロー3G 第２の染料： アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン6G ローダミンＢ ローダミン19ベルクロレート ローダミン123 エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンFFS 1,1′−ジメチルチオカルボシアニン 1,1′−ジエチルチオカルボシアニン 1,1′−ジエチル−９−メチルチオカルボシアニンブ
ロミド ２−〔γ−（１′−エチル−４′,5′−ベンゾチアゾ
リリデン）プロペニル〕−１−エチル−4,5−ベンゾオ
キサゾリウムヨージド アストラゾンレッド6B ベイシックバイオレット16 ２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−
4,5−ベンゾチアゾリウムヨージド 2,4−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
チル−ピリジニウムヨージド 2,6−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
チル−ピリジニウムヨージド TA−２ アストラゾンオレンジＲ 第３の染料： プロピディウムイオダイド、エチディウムブロマイド
およびＭ−264（Ｎ−メチル−４−（１−ピレンビニ
ル）ピリジニウムイオダイド） さて、白血球より発せられる前記蛍光信号および側方
散乱光信号のうち、蛍光信号は、細胞化学的特定を反映
するものであり、染料と各白血球との相互作用により、
各白血球から異なる強度の信号が得られる。

一方、側方散乱光信号は細胞内情報を反映するもので
ある。すなわち、細胞内の細胞核が大きいほど、また、
顆粒が多いほど細胞内での光の反射が強まり、側方散乱
光強度は増大する。したがって、リンパ球は、その内部
に顆粒が存在しないかあるいは少いので、散乱光強度は
一番小さく、好中球は、その内部に顆粒が多く存在し、
また、大きな核を持つので、散乱光強度は大きくなる。
好酸球の散乱光強度は好中球のそれにほぼ匹敵する。単
球、好塩基球による散乱光強度はリンパ球と好中球の中
間にある。

したがって、蛍光信号と側方散乱光信号とを組み合わ
せることにより、後に詳細に述べるように白血球の５分
解が可能となる。

本発明に使用されるフローサイトメーターの光学系の
一具体例を第１図に示された図面に基いて説明する。第
１図は側方散乱光と赤蛍光と緑蛍光とを側定する場合を
示している。このフローサイトメーターの光学系10に使
用された光源は、波長;488nm、出力;10mWのアルゴンイ
オンレーザー12である。レーザー12から発せられた光
は、シリンドリカルレンズ16によって絞られ、フローセ
ル14中を流れる測定用試料を照射する。

測定用試料中の染色された白血球がレーザー光によっ
て照射されると、白血球からは散乱光と蛍光が発せされ
る。

このうち、側方へ発せられた散乱光と蛍光はコンデン
サレンズ18によって集められ、アパーチヤ20を通過した
のち、ダイクロイックミラー22に達する。

ダイクロイックミラー22は側方散乱光24を反射し、蛍
光26を透過させる。ダイクロイックミラー22によって反
射された側方散乱光24は光電子増倍管28によって測定さ
れる。ダイクロイックミラー22を透過した蛍光26のうち
赤蛍光32はダイクロイックミラー30によって反射させら
れ、緑蛍光38のみが透過させられる。反射された赤蛍光
32はカラーフィルム34を通過したのち、光電子増倍管36
によって測定される。透過した緑蛍光38はカラーフィル
ター40を通過したのち光電子増倍管42によって測定され
る。

ところで、測定用試料中の赤血球は非常に弱い蛍光し
か発しないので、蛍光強度を測定する限りにおいては、
赤血球が白血球と同時に検出部を通過（同時通過）して
も、白血球の側定には妨害を与えない。しかし、散乱光
を測定する場合には、赤血球は白血球と同レベルの強度
の散乱光を発するため、白血球の計数に対して妨害を与
える。このとき、蛍光と散乱光を同時に測定し、一定レ
ベル以上の強度の蛍光を発したもののみを白血球とする
ことはできるが、白血球と赤血球が同時通過したときに
は、白血球による散乱光に赤血球により散乱光が重畳さ
れるので、正しい白血球の散乱光強度を測定することが
できない。第１図に示したフローサイトメーターの光学
系10では、希釈倍率をたとえば20倍とし、赤血球と白血
球との同時通過が起こる確率を減少させ、赤血球による
妨害の程度を実用上無視できる程度におさえた測定用試
料をフローセル14に流すようにしている。

（実施例） 本発明具体的には特開昭63−134958号公報に記載した
発明（実施例２、2:2ステップ法）の改良であり、以下
の実施例によって説明される。しかし、それを以って本
発明を限定するものではない。下に試薬組成を示す試薬
を調製した。第１の染料は好酸球、好塩基球の両方を選
択的に蛍光染色し、第２の染料は白血球の核を蛍光染色
し、第３の染料は細胞膜に損傷を受けた白血球の核を蛍
光発色する。

なお、EB（エチディウムブロマイド）はDNAのＧ−Ｃ
ペアにインターカレイション結合する。PI（プロピディ
ウムイオダイド）も同様である。

上記第１液及び第２液を使用して以下のように白血球
分類のための蛍光および散乱光の測定を行なった。

まず、健康な人の血液を抗凝固処理し、該抗凝固処理
された血液100μと上記第１液1800μとを均一に混
合し、撹拌後25℃で約20秒インキュベーションする。そ
の後さらに上記第２液を200μ加え、撹拌後25℃で約4
0秒間インキュベーションする。この測定用サンプル液
は最終的にpH8.6〜8.7、浸透圧約280mOsm/kg（等張）と
なる。

このようにして赤血球を溶血させ各白血球を染めたサ
ンプル液を調製し、そのサンプル液をフローサイトメー
ターに供し、白血球からの蛍光、散乱光を測定した。

測定結果は添付の図面にもとづいて次のように説明さ
れる。

まず、第２図は従来の試薬、すなわち第３の染料を含
有しない第１液を用いて測定した場合に得られる緑色蛍
光強度、側方散乱光強度を２軸とする二次元分布図であ
る。１〜６はそれぞれリンパ球、単球、好中球、好酸
球、好塩基球、赤血球ゴーストの分布領域である。（な
お、赤色蛍光強度、側方散乱光強度を２軸とする二次元
分布図も同様の分布パターンを示す。）各分布領域を分
画しその分画内の粒子数を算出することにより各白血球
が求められ、各白血球の比率が得られる。

第２図は採血後６時間以内の新鮮血を測定した場合の
二次元分布図である。しかし、採血後長時間（例えば20
時間）室温放置した血液を測定すると、白血球の細胞膜
が損傷したため、本来その細胞から分布すべき領域から
ずれて分布するものが現れる。そしてそれが他の細胞の
分布領域に入り込んで分類精度を低下させることにな
る。特に、第３図に示すように好中球の一部が矢印で示
すように単球の領域に入り込むことの影響が最も大き
い。従来の試薬を用いた場合には２種の二次元分布図は
ほぼ同じであった。そこで、従来は二次元分布図上に新
鮮血においてはほとんど分布がなく、長時間放置の血液
において分布が現れるある領域を設定し、その領域の細
胞を好中球の死細胞とみなしていた。

しかし、このやり方は検体ばらつきや細胞の傷つき程
度の差などにより必ずしも精度の良いものではなかっ
た。

そこで本発明ではこれを改良し白血球分類精度を高く
維持するため、第３の染料を加えた第１液を用いたので
ある。本実施例で示したエチディウムブロマイドは死細
胞を染色する物質として公知である。しかし、第1,第２
の染料を含有せずエチディウムブロマイドだけを染料と
して含むようにし他は上記と同様に調製した第１液を用
いた場合、損傷を受けた白血球細胞が多く存在する血液
においてさえも損傷細胞を検出することはできなかっ
た。第12図、第13図はそのことを証明するための二次元
分布図である。第12図は緑色蛍光強度、側方散乱光強度
を２軸とし、第13図は赤色蛍光強度、側方散乱光強度を
２軸とする二次元分布図である。いずれにおいても損傷
を受けた白血球細胞は検出できていない。

一方、第３の染料だけでなく第1,第２の染料も含有さ
せた本実施例の第１液を用いて上記検体を測定した場合
には損傷を受けた白血球細胞は明確に検出できた。第10
図、第11図はそれぞれ、緑色蛍光強度、側方散乱光強度
を２軸とする二次元分布図であり、赤色蛍光強度、側方
散乱光強度を２軸とする二次元分布図である。第11図に
おいて線で囲んだ部分がその損傷を受けた白血球細胞で
ある。

つまり、他の２つの染料とともに第３の染料を存在さ
せることに格別の意義があるのであり、本発明はその知
見から成したものである。

さて、上記の測定方法で得られる白血球の分布域の説
明をする。

第５図は赤色蛍光強度、側方散乱光強度を２軸とする
第２の二次元分布図であり、図中１〜８はそれぞれリン
パ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球ゴース
ト、細胞膜に損傷を受けた好中球、細胞膜に損傷を受け
たリンパ球の領域である。第４図は緑色蛍光強度、側方
散乱光強度を２軸とする第１の二次元分布図であり、こ
の分布は従来の第１液を用いたときとほぼ同様のパター
ンを示しており、細胞膜に損傷を受けたリンパ球８はリ
ンパ球１の領域に、細胞膜に損傷を受けた好中球７は単
球２の領域に入り込む。また、第１の二次元分布図（第
４図）と第２の二次元分布図（第５図）の分布パターン
が異なっていることも注目すべき点である。両者を関連
づけて解析することにより精度よく白血球分類が行え
る。

具体的なデータ解析法は次のとおりである。すなわち
第１の二次元分布図において分布が明確なところはその
まま分画し、分布が不明確な領域に関してはその領域に
ついて第２の二次元分布図を作製し、第２の二次元分布
図において分画するのである。

まず、第１の二次元分布図に対して第６図に示すよう
に分画する。

領域Ｉはリンパ球1,8 領域IIは単球２、損傷なしの好中球３、損傷ありの好中
球７ 領域IIIは好酸球４ 領域IVは好塩基球５ 次に、不明確な領域II内の細胞（３種類）に対して第
２の二次元分布図を描かせる。（第７図参照）。３種の
細胞群は第１の二次元分布図においては分布が不明確で
あっても、第２の二次元分布図においては分布が明確で
ある。そこで第７図のように分画する。

領域Ｖは単球２ 領域IVは損傷なしの好中球３ 領域VIIは損傷ありの好中球７ そして、領域VIと領域VIIの細胞を加えると全好中球
数となる。

以上のようにして各白血球数が精度よく求められる。

白血球分類の安定性の結果を説明する。

第８図は本実施例の第１液、第２液を用い、上記の解
析を行ったときの白血球比率の経時変化を示した図であ
る。横軸は採血後の室温放置時間である（単位は時
間）。

図に示すように採血後、20時間以上にわたって全項目
とも安定していることがわかる。

第９図は従来の第１液を用い、緑色蛍光強度と側方散
乱光強度の二次元分布図で解析し、得た分類結果であ
る。従来法では採血後８時間位から好中球比率が減少し
単球が増加しているのがわかる。

なお、第３の染料としてエチディウムブロマイドだけ
ではなく、プロピディウムイオダイドやＭ−264も同様
に用いることができる。

（発明の効果） 第１、第２の染料に加えて本発明においては第３の染
料を不させたので、二次元分布上に細胞膜に損傷を受け
た白血球を明確に分布させることができるので、検体の
差、損傷の差にかかわらず、常に安定してそれを検出す
ることができる。そして、このデータを用いて結果をだ
しているので、採血後室温に長時間放置され損傷細胞が
含まれた血液であっても白血球分類結果の精度が保証さ
れる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明に使用されるフローサイトメーター
の光学系の一具体例を示す概略図。第１図中の符号は次
のとおりに説明される： 10……フローサイトメーターの光学系 12……レーザー 14……フローセル 16……シリンドリカルレンズ 18……コンデンサーレンズ 20……アパーチャー 22……ダイクロイックミラー 24……側方散乱光 26……蛍光 28……光電子増倍管 30……ダイクロイックミラー 32……赤蛍光 34……カラーフィルター 36……光電子増倍管 38……緑蛍光 40……カラーフィルター 42……光電子増倍管 第２図は採血後６時間以内の新鮮血を従来の試薬、すな
わち第３の染料を含有しない第１液を用いて測定した場
合に得られる緑色蛍光強度、側方散乱光強度を２軸とす
る二次元分布図である。１〜６はそれぞれリンパ球、単
球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球ゴーストの分布
領域である。 第３図には、採血後長時間（例えば20時間）室温放置し
た血液を第２図の場合と同じ方法で測定して得られた二
次元分布図である。図中の矢印は好中球の一部が単球の
領域に入り込んだことを示す。 第４図は緑色蛍光強度、側方散乱光強度を２軸とする二
次元分布図であり、第５図は赤色蛍光強度、側方散乱光
強度を２軸とする第２の二次元分布図である。第４およ
び５図中１〜８はそれぞれリンパ球、単球、好中球、好
酸球、好塩基球、赤血球ゴースト、細胞膜に損傷を受け
た好中球、細胞膜に損傷を受けたリンパ球の領域であ
る。 第６図は第１の二次元分布図の分画を示す二次元分布図
である。第６図中、 領域Ｉはリンパ球1,8; 領域IIは単球２、損傷なしの好中球３、損傷ありの好中
球7; 領域IIIは好酸球4;そして 領域IVは好塩基球５を示す。 第７図は第６図の領域II内の細胞（３種類）に対して描
いた第２の二次元分布図であり、第７図中、 領域Ｖは単球2; 領域VIは損傷なしの好中球3;そして 領域VIIは損傷ありの好中球７である。 第８図は本実施例の第１液、第２液を用い、上記の解析
を行ったときの白血球比率の経時変化を示したグラフで
ある。 第９図は従来の第１液を用い、緑色蛍光強度と側方散乱
光強度の二次元分布図で解析し、得た分類結果を示すグ
ラフである。第８および第９図において、縦軸の各種白
血球の比率を示し、横軸は採血後経過時間を示し、各記
号は以下の意味を有する。 第10図は緑色蛍光強度、側方散乱光強度を２軸とする二
次元分布図であり、第11図は赤色蛍光強度、側方散乱光
強度を２軸とする二次元分布図である。第11図において
矢印で示し線で囲んだ部分は損傷を受けた白血球細胞で
ある。 第12図、第13図は、上記実施例で使用したエチディウム
ブロマイドは死細胞を染色する物質として公知である
が、第１、第２の染料を使用せずエチディウムブロマイ
ドだけを含むようにして上記と同様の調製した第１液を
用いた場合、損傷を受けた白血球細胞が多く存在する血
液においてさえも損傷細胞を検出することはできないこ
とを証明するための二次元分布図である。すなわち、第
12図は緑色蛍光強度、側方散乱光強度を２軸とする二次
元分布図であり、第13図は赤色蛍光強度、側方散乱光強
度を２軸とする二次元分布図である。

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のａ〜ｅの工程からなることを特徴とす
   るフローサイトメトリーによる白血球の分類方法： ａ）好酸球と好塩基球の両方を選択的に蛍光染色する第
   １の染料と、 白血球の核を蛍光染色する第２の染料と、 細胞膜に損傷を受けた白血球の核を蛍光染色する第３の
   染料と、 pHを酸性域に保つための緩衝剤と、 からなる低張な第１液と、血液とを混合する工程； ｂ）第１液の酸を中和し、溶液pHを染色pHに保つための
   緩衝剤と、 白血球の形態を保持する浸透圧に溶液を調整するための
   浸透圧調整剤と、 からなる第２液と、前記ａ工程で得られた試料液とを混
   合する工程； ｃ）前記ａ、ｂ工程にて得られた試料液をサンプルとし
   てフローサイトメータに供し、個々の白血球について蛍
   光および散乱光などの複数の信号を測定する工程； ｄ）白血球から発せられた蛍光、散乱光信号などのう
   ち、緑色蛍光強度と側方散乱光強度を２軸とする第１の
   二次元分布を得る工程； ｅ）上記第１の二次元分布において各白血球を分画する
   際に、採血後の時間経過などの原因により本来の分布領
   域からずれて分布している細胞群の分布領域を設定し、
   その領域の細胞群に対し、赤色蛍光強度と側方散乱光強
   度を２軸とする第２の二次元分布を得、その第２の二次
   元分布において上記ずれて分布している細胞群を分画
   し、これを計数する工程。
2. 【請求項２】第１液の第３の染料がプロピディウムイオ
   ダイド、エチディウムブロマイドおよびＮ−メチル−４
   −（１−ピレンビニル）ピリジニウムイオダイドから選
   ばれたものである、請求項１の方法。
3. 【請求項３】第１液の第１の染料が、アストラゾンイエ
   ロー3Gである、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】第１液の第２の染料が、次の群から選ばれ
   たものである、請求項１記載の方法： アクリジンレッド ローダミンＳ ローダミン6G ローダミンＢ ローダミン19ベルクロレート ローダミン123 エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンFFS 1,1′−ジメチルチオカルボシアニン 1,1′−ジエチルチオカルボシアニン 1,1′−ジエチル−９−メチルチオカルボシアニンブロ
   ミド ２−［γ−（１′−エチル−４′,5′−ベンゾチアゾリ
   リデン）プロペニル］−１−エチル−4,5−ベンゾオキ
   サゾリウムヨージド アストラゾンレッド6B ベイシックバイオレット16 ２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチル−4,
   5−ベンゾチアゾリウムヨージド 2,4−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチ
   ル−ピリジニウムヨージド 2,6−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エチ
   ル−ピリジニウムヨージド TA−２ アストラゾンオレンジＲ
5. 【請求項５】第１の二次元分布における設定領域が、単
   球、好中球の分布領域であり、第２の二次元分布におい
   て単球、正常な好中球、細胞膜に損傷を受けた好中球を
   分画する、請求項１記載の方法。