JP2815461B2 - 神経栄養活性抑性物質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、神経栄養活性抑制作用を有する新規物質に
関する。本発明の物質は、アルツハイマー病の治療に有
効である。

［従来の技術］ アルツハイマー病は、通常50歳以上の人に起こる器質
性痴呆で、アルツハイマー硬化症、神経原繊維変性、老
人斑等を伴うことがある疾病である。アルツハイマー病
には、ニューロンの代謝の亢進や異常な再生が関与して
いると考えられているが、有効な治療法は見出されてい
ない。

［発明が解決しようとする課題］ 従って、本発明の目的は、アルツハイマー病の治療に
有効な新規な神経栄養活性抑制物質を提供することであ
る。

［課題を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、正常老人の脳中に
は存在するにも関わらず、アルツハイマー病患者の脳中
には存在しなくなる全く新規なタンパク質で、神経栄養
活性を抑制する作用を有するものを見出し本発明を完成
した。

すなわち、本発明は、ヒト脳組織より抽出され、神経
栄養活性抑制作用を有するタンパク質である神経栄養活
性抑制物質を提供する。

［発明の効果］ 本発明により、新規な神経栄養活性抑制物質が提供さ
れた。本発明の新規物質はニューロンの代謝の亢進や異
常な再生を阻止する重要な役割をしていると考えられ、
例えばアルツハイマー病患者に対して大きな臨床効果が
期待される。

［発明の具体的説明］ 上記のように、本発明の物質は、ヒト脳から抽出さ
れ、神経栄養活性を抑制する作用を有するタンパク質で
ある。神経栄養活性とは海馬や大脳皮質で作られている
物質でニューロンの生存維持に大きく関与しているもの
であり、具体的には下記実施例に示す方法により測定す
ることができるものである。上述したように、本発明の
物質は、正常老人の脳中には存在するにも関わらず、ア
ルツハイマー病患者の脳中には存在しなくなる全く新規
なタンパク質である。

下記実施例において得られた本発明の物質は以下の特
性を有する。

（１）分子量：約5000（下記実施例において詳述するSD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定） （２）性状：白色無定形粉末 （３）安定pHの範囲:pH3.0〜7.7で安定 （４）熱安定性:37℃で20時間保温又は100℃で５分間加
熱しても神経栄養活性を抑制する作用を保持する。

なる部分アミノ酸配列を有する。

本発明の物質は、ヒト脳組織より抽出された抽出液を
そのまま、又は濃縮した後、塩析、限外ろ過、イオン交
換クロマトグラフィー、ゲルろ過、又は高速液体クロマ
トグラフィーの操作を２種類以上組合わせて精製するこ
とができ、その具体的な方法は下記実施例に示されてい
る。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明す
る。

実施例１ 本物質の分離、精製 正常ヒト大脳皮質の灰白質20gに水60mlを加え、ホモ
ジナイズし、20,000gで１時間遠心した後、遠心上清を5
5ml得た。

得られた上清55mlにアミコンYM−10膜（商品名）を用
いて限外ろ過し、分子量10キロダルトン以上の画分をDE
AE−セファセルカラム（1.6cmφ×16cm、ファルマシア
社製）にのせ、洗浄バッファー（50mM NaCl、20mM Tris
−Cl（pH7.6））200mlで洗浄後、50mMから300mM NaClの
直線濃度勾配をつけた20mM Tris−Cl（pH7.6）バッファ
ー320mlで抽出した。上記DEAE−セファセルカラムによ
るクロマトグラムを第１図に示す。フラクションNo.31
から38までの抑制活性を有する分画を集め（40ml）、透
析後フィコール400を用いて濃縮後TSK G2000SW（トーソ
ー社製）でゲルろ過（カラムサイズ7.5mmφ×6cm）し、
フラクションNo.30から32の活性画分を集め（2.5ml）、
5mMリン酸バッファー（pH7.4）中で透析した。上記TSK
G2000SWを用いたゲルろ過クロマトグラフィーの結果を
第２図に示す。液量を550μｌまで濃縮後、C18逆相HPLC
カラム（4.6mmφ×25cm、センシュー化学社製）にかけ
た。溶出には、０％から80％アセトニトリルの直線勾配
をつけた5mMギ酸アンモニウム溶液を用いた。このC18逆
相HPLCクロマトグラフィーの結果を第３図に示す。第３
図に示されるように、C18逆相HPLCクロマトグラフィー
によりシャープなピークが実質的に１つだけ得られ、本
発明の物質が単離されたことがわかる。

実施例２ 特性測定 実施例１で得られた物質について下記の種々の特性を
測定した。

（１）紫外線吸収スペクトル 実施例１で得られた物質３μｇの蒸留水溶液を用いて
分光光度計（ベックマン社製DU65型）で紫外線吸収スペ
クトルを測定した。結果を第４図に示す。

（２）安定性 実施例１で得られた物質を20μg/mlの水溶液に調製
し、その10μｌにトリフルオロ酢酸を終濃度0.1％とな
るように加え（pH3.0）、37℃20時間加温した後凍結乾
燥した。ダルベコ社製リン酸バッファー（PBS（−））
に溶解し、２μg/ml濃度の本物質水溶液の100μｌをと
り、37℃で20時間又は100℃で５分加熱した後、この溶
液の10μｌを用いて、下記実施例３に示す方法で抑制活
性を測定したが活性の抑制活性の減少は全く認められな
かった。さらに、実施例１で得た物質の20μg/mlの水溶
液をアンモニア水でpH7.7に調製し、その10μｌを前述
と同様にして安定性試験を行なったところ全く抑制活性
の減少が認められなかった。

（３）分子量 実施例１で得られた物質５μｇを水10μｌに溶解し、
分子量マーカー（キモトリプシノーゲンＡ（分子量250
0）、チトクロムＣ（分子量12500）、アプロチニン（分
子量6500）、バイオラッド社製）を用いて7.5％から20
％の濃度勾配のあるSDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で測定した結果、分子量約5000ダルトンであること
が確認された。この電気泳動の結果を第５図に示す。

実施例３ 神経栄養活性抑制活性の測定 新生児ラットの大脳皮質より調製した細胞をゲラチン
−ポリオルイチンを塗布した6mmのミクロプレートに1.7
×10⁴個の細胞を撒き、実施例１と同様の方法で得られ
たアルツハイマー病脳抽出液を125μg/ml濃度に調製し
た水溶液100μｌを含む無血清培地MEMN2（イーグル基本
培地）にインシュリン、トランスフェリン、プトレシ
ン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウムを添加）に
実施例１で得られた物質20ngを加え、５日間５％炭酸ガ
ス培養槽中、37℃で培養した。パラホルムアルデヒドと
90％メタノール/5％酢酸溶液で固定した後、マイクロチ
ューブル結合タンパク２（MAP2）抗体（アマーシャム社
製）を使ったELISAでMAP2量を定量した。一方、本物質
を加えないでアルツハイマー病脳抽出液を加えて培養し
た時のMAP2量を定量し、MAP2量が何％減少するかによっ
て抑制活性を表わした。

上記方法を用いて、本物質の量と抑制率との関係を測
定した。結果を第６図に示す。第６図に示すように、抑
制活性は、本物質0.2μg/ml濃度で平衡となり、その抑
制活性は約90％であった。

実施例４ アミノ酸配列の分析 実施例１で得られた物質50μｇを、常法によりピリジ
ルエチル化し、0.1M Tris−Cl（pH8.0）溶液100μｌに
トリプシン（シグマ社製）0.5μｇを加え、37℃、５時
間反応させた後、C18逆相HPLC（０〜80％アセトニトリ
ル/0.1％トリフルオロ酢酸溶液）で分離し、タンパクシ
ークエンサー（アプライドバイオシステム社477A型）に
かけて分析し、得られたピークの保持時間との標準物質
のそれを比較解読して本物質の部分的アミノ酸配列を決
定した。その結果、本物質は下記の部分アミノ酸配列を
有することがわかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は正常ヒト大脳皮質をホモジナイズして限外ろ過
し、分子量10キロダルトン以上の画分のDEAE−セファセ
ルカラムにかけたクルマトグラム、 第２図は、本発明の物質の精製過程において、抑制活性
を有するフラクションをゲルろ過したクロマトグラム、 第３図は本発明の物質をC18逆相HPLCにかけたクロマト
グラム、 第４図は、本発明の物質の紫外線吸収スペクトル図、 第５図は、本発明の物質のSDS−PAGEの泳動パターンを
示す図、 第６図は、本発明の物質の量と抑制率との関係を示す図
である。

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】脳組織より抽出される、神経栄養活性抑制
   作用を有するタンパク質であって、次の部分アミノ酸配
   列（１）及び物理化学的性状（２）を有する物質。 （２）分子量：約5000 性 状：白色無定形粉末 pH安定性:pH3.0〜7.7で安定 熱安定性:37℃で20時間保温又は100℃で５分間加熱して
   も安定
2. 【請求項２】請求項１記載の神経栄養活性抑制作用を有
   する物質を含有するアルツハイマー病の治療薬。