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JP2779621B2 - モノクローナル抗体，ハイブリドーマ，それらの製造法およびそれらの用途 - Google Patents

モノクローナル抗体，ハイブリドーマ，それらの製造法およびそれらの用途

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JP2779621B2
JP2779621B2 JP63050249A JP5024988A JP2779621B2 JP 2779621 B2 JP2779621 B2 JP 2779621B2 JP 63050249 A JP63050249 A JP 63050249A JP 5024988 A JP5024988 A JP 5024988A JP 2779621 B2 JP2779621 B2 JP 2779621B2
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JP
Japan
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hybridoma
ifo
bfgf
monoclonal antibody
growth factor
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JP63050249A
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理 岩根
勉 黒川
貢一 五十嵐
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は塩基性線維芽細胞増殖因子に特異的に結合す
るモノクローナル抗体，ハイブリドーマ，それらの製造
法およびそれらの用途に関する。
従来の技術 塩基性線維芽細胞増殖因子（本明細書において、bFGF
と略称することがある。）は主として下垂体より分泌さ
れる分子量約17000の塩基性ポリペプチドホルモンであ
り、当初BALB/c3T3細胞などの線維芽細胞に強い増殖促
進作用を示す因子として分離された［D.Gospodarowicz;
ネイチャー（Nature）249:123（1974）］。しかし、そ
の後中胚葉由来の殆んど全ての細胞に対して増殖促進作
用を示すことが判明した［D.Gospodarowiczら；ナショ
ナル・キャンサー・インスティテュート・モノグラフ
（National Cancer Institute Monograph）48;109（197
8）］。中でもbFGFの血管新生作用は細胞増殖作用と相
まって損傷，火傷の治療薬および血栓症，動脈硬化症な
どの予防治療薬としての可能性を示すものである。
発明が解決しようとする課題 天然に存在するヒトbFGFは極めて微量であり、またこ
れをヒトの組織から得る試みは種々の制約によって極め
て困難であった。さらにこれ迄bFGFの定量法として容易
に使える方法は確立されておらず、これらの理由からbF
GFを医薬品として開発する上で欠かすことの出来ないbF
GFに関する性状などの基礎知見について不明の点が非常
に多い。
従って、bFGFに関する多くの基礎知見、例えばbFGFの
生体内における分布やその産生様式などを知ることがで
きれば、該bFGFの医薬品としての開発が容易となる。
また、bFGFの量を正確に知ることは、この蛋白質を遺
伝子組換え体から精製する際にも重要である。さらに、
bFGFを投与した動物の血中FGF濃度を追跡することは非
常に重要であるが、サンプル中に血清が混入するため従
来の3T3細胞を用いた方法では測定出来ない。通常、bFG
Fの測定は血清濃度を下げて培養し、DNA合成を低下させ
た3T3細胞にbFGFを加え、DNA合成能がどの程度回復する
かにより逆算される。しかしながら、この方法は細胞を
用いるため操作が微妙で測定誤差が大きく、しかも結果
を得るのに長時間を要するという欠点を有する。従っ
て、上記目的のために簡便かつ正確なbFGFの測定手段の
開発が望まれている。
課題を解決するための手段 上記実状にかんがみ、本発明者らはbFGFの実用的な測
定手段を見い出すべく種々検討した結果、その測定を可
能ならしめるbFGFに特異的に結合するモノクローナル抗
体を作製し、これに基づいてさらに研究した結果、本発
明を完成した。
本発明は、（１）、次の性質を有し、bFGFに特異的に
結合するモノクローナル抗体， （ａ）分子量：約140〜160キロダルトン （ｂ）酸性線維芽細胞増殖因子と交差反応しない。
（ｃ）免疫グロブリンクラスがIgGに属する。
（ｄ）それぞれハイブリドーマHbF12（IFO 50142）、ハ
イブリドーマHbF52（IFO 50143）、ハイブリドーマHbF7
8（IFO 50144）およびハイブリドーマHbF98（IFO 5014
5）によって産生されるMoAb12、MoAb52、MoAb78およびM
oAb98からなる群から選ばれるモノクローナル抗体， （２）、ハイブリドーマHbF12（IFO 50142）、ハイブリ
ドーマHbF52（IFO 50143）、ハイブリドーマHbF78（IFO
50144）およびハイブリドーマHbF98（IFO 50145）から
なる群から選ばれるハイブリドーマ， （３）、bFGFで免疫したマウスの脾臓細胞と、マウスの
ミエローマとを細胞融合し、クローニングすることを特
徴とするハイブリドーマHbF12（IFO 50142）、ハイブリ
ドーマHbF52（IFO 50143）、ハイブリドーマHbF78（IFO
50144）およびハイブリドーマHbF98（IFO 50145）から
なる群から選ばれるハイブリドーマの製造法， （４）、bFGFで免疫したマウスの脾臓細胞と、マウスの
ミエローマとからなるクローン化されたハイブリドーマ
HbF12（IFO 50142）、ハイブリドーマHbF52（IFO 5014
3）、ハイブリドーマHbF78（IFO 50144）およびハイブ
リドーマHbF98（IFO 50145）からなる群から選ばれるハ
イブリドーマを液体培地中またはマウスの腹腔内で増殖
し、モノクローナル抗体を生成、蓄積せしめ、これを採
取することを特徴とする該因子に特異的に結合するモノ
クローナル抗体の製造法， （５）、上記（１）項のモノクローナル抗体を用いるこ
とを特徴とするbFGFの精製法，および （６）、上記（１）項のモノクローナル抗体を用いるこ
とを特徴とするbFGFの検出，定量法である。
bFGFとしては、温血哺乳動物のbFGFであればいずれで
もよい。また、そのムテイン（mutein）でもよい。した
がって、本明細書においては、「塩基性線維芽細胞増殖
因子（bFGF）」は、とくにことわりのない限り、そのム
テインをも含むこともある。
該哺乳動物のbFGFの代表例としては、たとえば、ウシ
のbFGF「プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）USA,第82巻 第6507頁（1985年）］，ヒトのbFGF
［日本特願昭61−241053号明細書（ヨーロッパ特許出願
公開第237,966号公報），ヨーロピアン・モレキュラー
・バイオロジー・オーガナイゼイション・ジャーナル
（European Molecular Biology Organization（EMBO）J
ournal）第５巻，第2523頁（1986年）］などがあげられ
る。
さらに具体的には、 で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好まし
い。
さらに、一般式 ［式中、ＸはThrまたはSerを示し、ＸがThrのときＹはS
erを、ＸがSerのときＹはProをそれぞれ示す。］で表わ
されるポリペプチドが好ましい。
ヒトのbFGF（以下、hbFGFと略称することもある。）
を得るには、たとえば上述のhbFGF蛋白質のポリペプチ
ドをコードする塩基配列を有するDNAを含有する発現型
ベクターは、例えば、 （イ）hbFGFをコードするRNAを分離し、 （ロ）該RNAから単鎖の相補DNA（cDNA）を、次いで二重
鎖DNAを合成し、 （ハ）該相補DNAをプラスミドに組み込み、 （ニ）得られた組み換えプラスミドで宿主を形質転換
し、 （ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法、例えばDNAプローブを用いたコロニーハイブ
リダイゼーション法、により目的とするDNAを含有する
プラスミドを単離し、 （ヘ）そのプラスミドから目的とするクローン化DNAを
切り出し、 （ト）該クローン化DNAをビークル中のプロモーターの
下流に連結する、 ことにより製造することができる。
hbFGFをコードするRNAは、種々のhbFGF産生細胞、例
えばヒト下垂体由来細胞あるいはヒト線維芽細胞から得
ることができる。該ヒト線維芽細胞としては、WI38（AT
CC番号CCL−75）あるいはIMR90（ATCC番号CCL−186）な
どがあげられる。上記細胞WI38およびIMR90は、ジ・ア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（The Am
erican Type Culture Collection）発行のカタログ・オ
ブ・セル・ラインズ・アンド・ハイブリドーマズ（Cata
logue of Cell Lines ＆ Hybridomas）5th edition,198
5に掲載されている。
このようにして得られた発現ベクターを、適当な宿主
（例、大腸菌，枯草菌，酵母，動物細胞）に組み込み、
得られた形質転換体を培地に培養することにより、ヒト
のbFGFを製造することができる。
本発明におけるムテインとしては、本来、元のペプチ
ドあるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異したものであ
り、したがって該変異としては、アミノ酸の付加，構成
アミノ酸の欠損，他のアミノ酸への置換が挙げられる。
該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ
酸が付加しているものが挙げられる。
該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のbF
GF構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。
該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個の
bFGF構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。
bFGFに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているムテ
インにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ペプ
チドを発現する際に用いられる開始コドンに基因するメ
チオニンや、シグナルペプチドは含まれないものであ
る。
付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１
個であるが、bFGFの特徴を失わない限り何個でもよい。
さらに好ましくは、bFGFと相同性（ホモロジー）が認め
られており、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配列
の一部あるいはすべてが挙げられる。
bFGFの少なくとも１個のbFGF構成アミノ酸が欠損して
いるムテインにおける欠損している構成アミノ酸の数と
しては、bFGFの有する特徴を失わない限り何個でもよ
い。
該欠損している構成アミノ酸の例としては、ヒトbFGF
のアミノ末端側10残基： ヒトbFGFのアミノ末端側14残基： などが挙げられる。
bFGFの少なくとも１個のbFGF構成アミノ酸が別のアミ
ノ酸で置換されているムテインにおける置換される前の
少なくとも１個のbFGF構成アミノ酸の数としては、bFGF
の特徴を失わない限り何個でもよい。
置換される前の構成アミノ酸の例としては、システイ
ン，システイン以外のものが挙げられる。システインが
特に好ましい。置換される前の構成アミノ酸としてシス
テイン以外のものとしては、アスパラギン酸，アルギニ
ン，グリシン，バリンなどが挙げられる。
置換される前の構成アミノ酸がシステインである場合
には、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミ
ノ酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、た
とえば、グリシン，バリン，アラニン，ロイシン，イソ
ロイシン，チロシン，フェニルアラニン，ヒスチジン，
トリプトファン，セリン，スレオニン，メチオニンなど
が挙げられる。特に、セリン，スレオニンが好ましい。
置換される前の構成アミノ酸がシステイン以外のもの
である場合には、置換された別のアミノ酸としては、た
とえば、アミノ酸の親水性，疎水性あるいは電荷の点
で、置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつもの
を選ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラ
ギン酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてア
スパラギン，スレオニン，バリン，フェニルアラニン，
アルギニンなどが挙げられるが、特にアスパラギン，ア
ルギニンが好ましい。
置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換
されたあとのアミノ酸としてグルタミン，スレオニン，
ロイシン，フェニルアラニン，アスパラギン酸が挙げら
れるが、特にグルタミンが好ましい。
置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン，
ロイシン，フェニルアラニン，セリン，グルタミン酸，
アルギニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好まし
い。
置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン，
アラニン，ロイシン，システイン，グルタミン，アルギ
ニン，アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニン
が好ましい。
置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としては、セリン，ロイ
シン，プロリン，グリシン，リジン，アスパラギン酸な
どが挙げられ、特にセリンが好ましい。
置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラ
ギン酸，アルギニン，グリシン，セリン，バリンが好ま
しい。
置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン，
グルタミン，アルギニン，スルオニン，メチオニン，セ
リン，ロイシンが好ましい。
置換されたムテインの最も好ましいものとしては、構
成アミノ酸であるシステインがセリンに置換されたもの
が最も好ましい。
上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なっ
てもよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換さ
れるのが好ましい。
本発明のムテインは、上記した付加，欠損，置換の２
つまたは３つが組み合わさったものでもよい。
該ムテインを製造するためには、特定部位指向性変異
誘発技術（Sitedirected mutagenesis）が採用される。
該技術は周知であり、アール・エフ・レイサー（Lathe
r,R.F.）及びジェイ・ピー・レコック（Lecoq,J.P.），
ジェネティック・エンジニアリング（Genetic Engineer
ing）、アカデミックプレス社（1983年）第31−50頁、
に示されている。オリゴヌクレオチドに指示された変異
誘発はエム・スミス（Smith,M.）及びエス・ギラム（Gi
llam,S.）、ジェネティック・エンジニアリング：原理
と方法、プレナムプレス社（1981年）３巻 １−32頁に
示されている。
該ムテインをコードする構造遺伝子を製造するために
は、たとえば、 （ａ）bFGFの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖DNAを
突然変異株オリゴヌクレオチドプライマーと雑種形成さ
せる（この１本鎖で代替えすべきシステイン用コドン、
又は場合によりこのコドンと対合をつくるアンチセンス
・トリプレットを包含する領域に対して上記プライマー
は相補的なものである。但し、当該コドンの他のアミノ
酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセンス・トリ
プレットとの不一致はこの限りでない。）、 （ｂ）DNAポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、
突然変異性ヘテロ二量体（heteroduplex）を形成させ
る、及び （ｃ）この突然変異性ヘテロ二量体を複製する。
次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージDN
Aを単離し、プラスミドへ組み込む。
このようにして得られたプラスミドで適当な宿主（前
出と同様）を形質転換し、得られた形質転換体を培地に
培養することにより、ムテインを製造することができ
る。
該bFGFを免疫するに際しては、bFGFをキャリヤー蛋白
との複合体としてから、これを免疫に用いてもよい。
該キャリヤー蛋白としては、たとえばフロインドの完
全アジュバント（ディフコ社製）などが挙げられる。
キャリヤー蛋白複合体を用いる場合に、キャリヤー蛋
白とbFGFとのカップリング比率は、約５〜30倍（キャリ
ヤー/bFGF:重量比）で用いられる。望ましくは約15〜20
倍が用いられる。
また、ハプテンとキャリヤーとのカプリングには、種
々の縮合剤を用いることが出来るが、グルタルアルデヒ
ドやカルボジイミド等が好都合に用いられる。
bFGFまたは蛋白複合体を用いて免疫するに際し、免疫
する哺乳動物は、羊、山羊、兎、モルモット、ラット、
マウス等の実験動物が使われるが、モノクローナル抗体
を得るためには、ラット、マウスが好ましく、特にマウ
スが好ましい。免疫方法は、例えばマウスを免疫する場
合、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等のいずれの
ルートからでも可能であるが、主として皮下、腹腔内、
静脈内に（とりわけ皮下）注入するのが好ましい。ま
た、免疫間隔，免疫量等も可変度は高く、種々の方法が
可能であるが、例えば２週間隔で約２〜６回免疫し、最
終免疫後、約１〜５回、好ましくは約２〜４日後に摘出
した脾臓細胞を用いる方法がよく用いられる。免疫量は
１回にペプチド量として、マウス当り約0.1μｇ以上、
好ましくは約10μｇ〜300μｇ用いることが望ましい。
又、脾臓を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体
価の上昇を確認した上で、脾臓細胞を用いる融合実験を
行うことが望ましい。
上記脾臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融合は例えば
摘出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチン−グアニ
ン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損 や、チミジンキナーゼ欠損 の様なマーカーを持った適切な同種または異種（好まし
くは同種）のリンパ球様細胞株との間で融合させる。リ
ンパ球様細胞株としては、ミエローマが好ましく、その
例としてはミエローマP3−X63−Ag・8U1（市森 他ジャ
ーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド 80 55（198
5））が挙げられる。例えばケラーおよびミルスタイン
らの方法［ネイチャー（Nature）256:495（1975）］に
準じて融合させることにより製造される。たとえばミエ
ローマ細胞と脾細胞とを約1:5の割合で、たとえばイス
コフ培地とハムＦ−12培地を1:1に混合した培地（以下I
H培地と称する。）に懸濁させ、センダイウイルス，ポ
リエチレングリコール（PEG）等の融合剤が用いられ
る。もちろんジメチルスルホキシド（DMSO）その他の融
合促進剤を加えることも可能である。PEGの重合度は、
ふつう約1000〜6000,時間は約0.5〜30分，濃度は約10％
〜80％等が用いられるが、好ましく条件の一例として、
PEG6000を約35〜55％で約４〜10分処理することによ
り、効率よく融合させることが出来る。融合細胞は、ヒ
ポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地［HAT培
地；ネイチャー，256,495（1975）］等を用いて、選択
的に増殖させることが出来る。
増殖して来た細胞の培養上清は、目的とする抗体産生
があるか否かについてスクリーニングを行うことができ
るが、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出
来る。即ち、この場合には、まず第１段階として免疫し
たペプチドに対する抗体産生の有無を、ラジオイムノア
ッセイ（RIA）法またはエンザイムイムノアッセイ（EI
A）法等の方法で調べることが出来るが、これらの方法
についても種々の変法が可能である。好ましい測定法の
一例として、EIAを用いる一つの方法について述べる。
セルロースビーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウスイ
ムノグロブリン抗体を常法に従ってカプリングさせてお
き、これに測定したい培養上清や、マウスの血清を加
え、一定時間、定温（約４〜40℃を示す。以下において
も同様。）で反応させる。この後、反応物をよく洗った
後、酵素で標識したペプチド（酵素とペプチドを常法に
従いカプリングさせた後精製）を加え、一定時間，定温
で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基質を加
え、一定時間，定温で反応させ、その後、生成発色物を
吸光度または蛍光度等で測定することが出来る。
選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いたペプチドに
対する抗体活性のみられたウエルの細胞は、限界稀釈法
等によりクローニングを行うことが望ましい。クローン
化された細胞の上清について同様にスクリーニングを行
い抗体価の高いウエルの細胞を増やすことにより、免疫
したペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマクローンが得られる。
このようにしてクローン化されたハイブリドーマを、
液体培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地
たとえばRPMI−1640［Moore,G.E.,et.al.ジャーナル・
オブ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（J.
Am.Med.Assoc.）199,549（1967）］に約0.1〜40％の牛
血清を加えた培地等で約２〜10日間、好ましくは約３〜
５日間培養することにより、培養液から該モノクローナ
ル抗体を得ることができる。また、哺乳動物の腹腔内に
接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取することにより抗
体を取得することが出来る。このためには、例えばマウ
スの場合、ミネラルオイル等を前もって接種したBALB/c
等のマウスに約１×104〜１×107個、好ましくは約５×
105〜２×106個のハイブリドーマを腹腔内に接種し、約
７〜20日後、好ましくは約10〜14日後に腹水液を採取す
る。腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画,DEAE
−セルロースカラムクロマトグラフィー等により、容易
にモノクローナル抗体を純粋な免疫クロブリンとして単
離することが出来る。
このようにして、bFGFに特異的に結合するモノクロー
ナル抗体が得られる。
本発明のモノクローナル抗体にあっては、免疫原のペ
プチドのbFGFと特異的に結合する。
なお、本発明のモノクローナル抗体は、製造時に用い
た免疫原のペプチドとは異なるbFGFと結合する場合もあ
る。
本発明のモノクローナル抗体は、免疫原ペプチドであ
るbFGFあるいはそのムテインに対するモノクローナル抗
体である。
本発明のモノクローナル抗体は、bFGF（およびそのム
テイン）のみに抗体が結合するという性質を有するbFGF
に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
後述の実施例３に示されたように、ヒトbFGFを抗原と
して用いた場合に、免疫グロブリンクラスがIgMに属す
るモノクローナル抗体が得られる場合がある。
本発明のモノクローナル抗体は、bFGFに対し特異的に
結合することから、bFGF測定用試薬として極めて有用で
ある。さらに生体臓器、組織中のbFGFの測定を容易にす
ることは、bFGFに関する基礎知見（例えば生体内分布）
を得る上からを極めて有用である。生体臓器，組織中の
bFGFの検出には通常酵素免疫測定法（EIA法）などによ
る定量、あるいは蛍光抗体法やラジオイムノアッセイ法
（RIA法）が用いられる。またこれらの臓器，組織中に
存在するbFGFの大きさを知るにはタンパクのウエスタン
ブロッティング法が有効である。この方法は臓器，組織
由来の粗抽出液あるいはその部分精製試料をアクリルア
ミド電気泳動した後、メンブランフィルターにトランス
ファーし、HRP結合抗bFGF抗体で検出する。
また癌細胞の中には細胞自身がbFGFを産生し、そのbF
GFにより増殖を続ける場合のあることが考えられる。こ
のような癌に抗bFGF抗体を作用させると増殖を促進する
bFGFが中和され、癌細胞の増殖阻止、すなわち制癌物質
としての作用が期待される。またbFGFを産生する癌で
は、抗体を用いてそのbFGFを定量することができ癌の診
断検査薬にも応用できる。さらに該抗体とbFGFとの結合
能を利用し、抗体アフィニティーカラムを作製してbFGF
の精製の試薬として利用することもできる。
bFGFを検出，定量するために用いられるEIA法またはR
IA法としては、例えば、精製した抗体を0.1〜10μg/ウ
エル,96穴プラスチックプレート（例えばヌンク社，デ
ンマークのイムノプレート），ガラスビーズ，プラスチ
ックビーズなどの担体に固定する。固定は、プラスチッ
クの場合約４℃，一夜または室温で約0.5〜４時間反応
させることにより行われる。ガラスの場合、例えばPro
c.Natl.Acad.Sci.USA,第80巻，第3513−3516頁（1983
年）に記載したような方法で固定する。その他、抗体固
定のための各種プレート（前述，ヌンク社等）の市販さ
れているものを使うこともできる。
以上のようにして抗体を固定したプレート又はビーズ
に抗原bFGF（またはそのムテイン）を含む溶液を加え吸
着反応を行う。吸着反応は室温で約0.2〜２時間で行わ
れることもあるが、約４℃，一夜が望ましい。
抗原−抗体の結合反応の後、酵素標識（EIAの場合）
または放射標識（RIAの場合）した抗体を加え吸着反応
を行う。酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（HRP），アルカリ性フォスファターゼなどがよく用い
られ、放射標識としては125Iがよく用いられる。酵素標
識のものについては、反応基質、例えばHRPの場合2,2′
−アジノージ−〔３−エチルベンゾチアゾリンスルフォ
ネート（６）〕（2,2′−Adino−di［３−ethylbenzoth
iazoline sulfonate（６）］）などを加え発色させ吸光
度を測定する。放射標識のものは、非結合の放射活性を
シンチレーションカウンターで測定する。サンプルの吸
光度または放射活性を既知の量のbFGFに対する値と比較
することによって定量することができる。
上記の２種の抗体で抗原をはさみ込むサンドイッチEI
A法の他にも自体公知の競合的EIA法，間接的EIA法がよ
り行なわれる。競合的EIA法としては、抗体を担体に固
定し、酵素または放射標識した抗原bFGFとサンプルとを
加えて、反応させ定量する。反応条件，標識量の測定
は、上述と同様に行なわれる。間接的EIA法としては、
サンプルと固定していない抗体とを反応させ、未吸着の
抗体を抗原固定のプレートと抗マウス標識抗体によって
定量する。反応条件，標識量の測定は、上述と同様に行
なわれる。
bFGFの精製のためには、精製した当該抗体を例えば活
性化したアガロースゲルビーズの様な適切な担体に常法
に従ってカプリングさせた後、カラムに充め、培養上清
或いは破さいした菌体等の粗bFGFを含む資料を抗体アフ
イニティカラムにかけ、吸着させた後、洗浄し、その後
例えばKSCN（チオシアン酸カリウム）の様なカオトロピ
ック試薬、或いはbFGFの失活のない程度の弱酸性条件で
溶出させる方法等により、効率よく精製できる。
抗体カラムの作製は、例えばハイブリドーマを接種し
た腹水等から純粋に精製した本発明のモノクローナル抗
体を適切な担体とカプリングさせることにより、以下の
様な方法でできる。
用いる担体は、カプリングの後にbFGFが特異的に効率
よく吸着され、その後適切な溶出が可能なものであれば
どの様なものでもよく、該担体としては、たとえばアガ
ロース，セルロースまたはアクリルアミドのポリマーが
挙げられ、その一例として蛋白の一級アミンが結合し易
い様に活性化されたポリアクリルアミドゲルビーズ、例
えばアフィゲル−10（バイオラド社製）などが以下に述
べる様な方法で好都合に用いられる。アフィゲル−10と
抗体との反応は、約0.001〜1M、好ましくは約0.1Mのバ
イカーボネート等の緩衝液中で反応を行なう。反応条件
は約０゜〜20℃，約10分〜24時間、種々のpHが可能であ
るが、好ましくは、約４℃，約４時間,pH約３〜10の条
件が用いられる。混合するアフィゲル−10と抗体の量比
は、アフィゲル1mlに対し抗体量が約50mg位迄は多けれ
ば多い程多くの抗体がつくので、この範囲内でいくらで
もよいが、結合効率およびアフィニティーカラムクロマ
トグラフィーにおける精製効率を考慮して約10〜30mgの
抗体が好都合に用いられる。この様にしてできた抗体−
担体結合物は、反応に用いた緩衝液でよく洗った後、数
日放置するか、もしくは最終濃度約0.05〜0.10Mのエタ
ノールアミン・塩酸，グリシン等の一級アミンを有する
化合物を加え約４℃で約１〜４時間反応させる，あるい
は１〜５％牛血清アルブミン（BSA）等のタンパク質を
４℃一夜反応させる等の方法により、残存する未反応の
活性基をブロックした後、適切なカラムにつめることに
より、抗体カラムとして使用できる。
上記した抗体カラムで精製するに際しては、たとえば
bFGF蛋白質含有資料を中性付近の緩衝液、たとえばリン
酸緩衝液やトリス・塩酸緩衝液に溶解して抗体カラムに
吸着させる。次にカラムを同じ緩衝液で洗浄したのち、
bFGFを溶出する。溶出液としては、弱酸性溶液たとえば
酢酸溶液，ポリエチレングリコールを含む溶液，試料に
くらべ抗体により結合し易いペプチドを含む溶液，高濃
度塩溶液などおよびこれらを組み合せた溶液などが用い
られ、bFGFの分解をあまり促進しないものが好ましい。
カラム溶出液は、常法により緩衝液で中和する。必要
により再度上記の抗体カラムによる精製操作を行なうこ
とができる。
このようにして、実質的にパイロジエンもエンドトキ
シンも含まない、実質的に純粋なbFGFが得られる。本発
明の実質的に純粋なbFGFとしては、蛋白質含量としてbF
GFを90％（w/w）以上であるもの、さらに好ましくはhbF
GFを95％（w/w）以上であるものが挙げられる。
ここで得られるbFGF蛋白質溶液は透析に付し、必要に
よりこれを凍結乾燥により粉末とすることができる。凍
結乾燥に際しては、ソルビトール，マンニトール，デキ
ストロース，マルトース，グリセロールなどの安定剤を
加えることができる。
このようにして得られるhbFGFは線維芽細胞の増殖を
促進させる作用，内皮細胞の増殖を促進させる作用，血
管を新生させる作用を有し、毒性は低いので、火傷，創
傷，術後組織などの治療促進剤，あるいは血管新生作用
による血栓症や動脈硬化症などの治療薬として用いるこ
とができる。また、細胞培養を促進させるための試薬と
して用いることができる。
該hbFGFを医薬として用いるには、そのまま粉末とし
て、または他の薬理学的に許容されうる担体，賦形剤，
希釈剤とともに医薬組成物（例、注射剤、錠剤，カプセ
ル剤，液剤，軟膏）として、温血哺乳動物（例、ヒト，
マウス，ラット，ハムスター，ウサギ，犬，ネコ）に対
して非経口的または経口的に安全に投与することができ
る。
注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖
やその他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行
なわれる。錠剤，カプセル剤等の医薬組成物も常法に従
って調製しうる。
該hbFGFを上記した医薬として用いる場合には、たと
えば上記した温血哺乳動物に、投与ルート，症状などを
考慮して、１日量約1ngないし100μg/kgの中から適当量
を選んで投与される。
また、該hbFGFを細胞培養を促進させるための試薬と
して用いる場合、培地１あたり約0.01〜10μｇ、さら
に好ましくは約0.1〜10μｇとなるように培地に加える
ことが好ましい。
また、hbFGFのムテインも、上述のhbFGFと同様に用い
ることができる。
本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commision on Bi
ochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を下記す
る。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合
は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。
DNA ：デオキシリボ核酸 cDNA ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン RNA ：リボ核酸 dATP ：デオキシアデノシン三リン酸 dTTP ：デオキシチミジン三リン酸 dGTP ：デオキシグアノシン三リン酸 dCTP ：デオキシシチジン三リン酸 ATP ：アデノシン三リン酸 Tdr ：チミジン EDTA ：エチレンジアミン四酢酸 SDS ：ドデシル硫酸ナトリウム Gly ：グリシン Ala ：アラニン Val ：バリン Leu ：ロイシン Ile ：イソロイシン Ser ：セリン Thr ：スレオニン Cys ：システイン Met ：メチオニン Glu ：グルタミン酸 Asp ：アスパラギン酸 Lys ：リジン Arg ：アルギニン His ：ヒスチジン Phe ：フェニールアラニン Tyr ：チロシン Trp ：トリプトファン Pro ：プロリン Asn ：アスパラギン Gln ：グルタミン 後述の参考例において、ヒトbFGFの構成アミノ酸の番
号は、前述のアミノ酸配列（II）においてＸがThrであ
りＹがSerであるペプチドのＮ末端にMetが付加したアミ
ノ酸配列において、該Metを第１番目として数えるもの
とする。
後述の実施例２（３）で得られたマウスHbF99細胞，
マウスHbF161細胞およびマウスHbF165細胞は、それぞ
れ、昭和62年１月28日から財団法人発酵研究所（IFO）
に次の受託番号として寄託されている。
マウスHbF99 細胞:IFO 50122 マウスHbF161細胞:IFO 50123 マウスHbF165細胞:IFO 50124 また、後述の実施例４で得られたマウスハイブリドー
マHbF12,HbF52,HbF78およびHbF98は、それぞれ、昭和62
年８月17日からIFOに次の受託番号として寄託されてい
る。
マウスHbF12細胞:IFO 50142 マウスHbF52細胞:IFO 50143 マウスHbF78細胞:IFO 50144 マウスHbF98細胞:IFO 50145 以下に示す参考例および実施例において製造された形
質転換体のうち、受託番号の付されているものは、財団
法人発酵研究所（IFO）および通商産業省工業技術院微
生物工業技術研究所（FRI）に寄託されている。それら
の受託番号および受託日を次の第１表に示す。なお、第
１表において、FERM P番号とFERM BP番号とが併記され
ているものは、当初国内寄託がなされFERM P番号で示さ
れる受託番号が付され、該寄託はブダペスト条約に基づ
く寄託に切換えられて、FERM BP番号で示される受託番
号が付され、同研究所（FRI）に保管されている。
実施例 以下の実施例により本発明をより具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１ （hbFGFをコードする遺伝子を含むプラスミ
ドの構築） （１）cDNA含有プラスミドの単離： ヒト包皮由来初代培養細胞mRNAより合成したcDNAをpC
Dベクター［Okayamaら，モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジー（Molecular and Cellular Biolog
y），３,280（1983）参照］に組み込んで作成した大腸
菌x1776を宿主としたcDNAライブラリーをNational Inst
itute of Child Health and Human Development,Bethes
da,U.S.A.の岡山博士より分与を受けた。このcDNAライ
ブラリーよりアルカリ法（Birnboim.H.C.＆ Doly.J.ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Rese
arch），１,1513（1979）］でプラスミドDNAを抽出し、
このDNAを大腸菌DH1に感染させ、約２×106個のcloneよ
りなる大腸菌DH1を宿主としたcDNAライブラリーを作成
した。
上記大腸菌DH1を用いたcDNAライブラリーをニトロセ
ルロースフィルター（ミリポア社,HATFフィルター）上
に約５×104clone/フィルターとなるように10枚まき、
このフィルターをマスターフィルターとしている各２枚
ずつを１組としたレプリカフィルター計20枚を作成し
た。このレプリカフィルター上の大腸菌を0.5N NaOH溶
液で溶かし、露出変性したプラスミドDNAをフィルター
上に固定した［Grunstein,M.＆ Hogness,D.S.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 72,3961（1975）］。
一方、F.Eschらにより報告されている［Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 82,6507（1985）］ウシ塩基性線維芽細胞成
長因子のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸No.13−20
（Pro−Pro−Gly−His−Phe−Lys−Asp−Pro）およびア
ミノ酸No.89−96（Thr−Asp−Glu−Cys−Phe−Phe−Phe
−Glu）をもとに、これらのアミノ酸配列に対応する塩
基配列（一部のコドンは３番目の文字を任意に固定し
た。それぞれ５′GG A/G TC T/C TT A/G AA A/G TGＧCC
ＡGGＡGG,および５′TC A/G AA A/G AA A/G AA A/G CA
T/C TCＧTCＧGT,下線を引いた塩基は固定したものを示
した。）を化学合成した。このオリゴヌクレオチドに対
してT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）を用いて
50μの反応液［オリゴヌクレオチド0.1μg,50mM Tris
−HCl pH8.0,10mM MgCl2,10mM メルカプトエタノール,
50μCiγ−32P ATP（＞5000Ci/mmole）,3ユニット T4
ポリヌクレオチドキナーゼ］中で37℃１時間反応させ、
オリゴヌクレオチドの５′末端を32Pで標識した。
上記方法で標識したオリゴヌクレオチド二種をプロー
ブとして、別々に、DNAを固定したレプリカフィルター
に会合させた。会合反応は、10μCiのプローブを含む５
×SSPE［180mM NaCl,10mM NaH2PO4,1mM EDTA（pH7.
4）］,5×Denhardt′s,0.1％SDS,100μg/ml変性サケ精
子DNA溶液10ml中で、35℃16時間行い、反応後フィルタ
ーを５×SSC［0.15M NaCl,0.015M Sodium citrate］0.1
％SDS溶液で室温で30分ずつ３回さらに45℃30分ずつ２
回洗浄した［T.Maniatisら，“Molecular Cloning"Cold
Spling Harbor Laboratory,P.309（1982）］。
洗浄したフィルターよりラジオオートグラムをとり、
二種類のプローブの両方に対して反応する菌株を一組２
枚のレプリカフィルターのラジオオートグラムを重ね合
わせることにより探した。この方法により５×105 clon
iesより二種類のプローブに対して反応する１株［Esche
richia coli K12 DH1/pTB627（IFO 14494,FERM BP−128
0）］を得た。
（２）、上記（１）で得た菌株（Escherichia coli K12
DH1/pTB627（IFO 14494,FERM BP−1280）］よりプラス
ミドDNA（pTB627）をアルカリ法〔ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research），１,1513
（1979）〕によって抽出精製した。
（３）、hbFGFをコードするcDNAの塩基配列を、ジデオ
キシヌクレオチド合成鎖停止法［J.Messingら，ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチNucleic Acids Res.），
９,309（1981）］により決定し、その配列から推定され
るアミノ酸配列を第１図に示す。
参考例２ （hbFGFをコードする遺伝子の大腸菌におけ
る発現） hbFGF発現用プラスミドpTB669の構築： 前記参考例１（２）で得られたhbFGF cDNAを含むプラ
スミドpTB627を制限酵素Ava IおよびBal Iで切断し、hb
FGFをコードする領域を含む0.44Kb DNA断片を得た。こ
のDNA断片のBal I切断部位（平滑末端）に、T4DNAリガ
ーゼでBgl IIリンカーpCAGATCTGを結合させて、0.44Kb
のAva I−Bgl II DNA断片を分離した。この0.44Kb Ava
I−Bgl II DNA断片にT4DNAリガーゼを反応させてBgl II
切断部位どうしを結合させたのち、dXTP存在下にDNAポ
リメラーゼ（Klenowフラグメント）反応を行いAva I切
断部位を平滑化した。このDNA断片に、リン酸化反応後
の合成オリゴヌクレオチド５′AATTCTATGCCAGCATTGC
３′および５′GCAATGCTGGCATAG３′をT4DNAリガーゼに
より結合させEcoR I−Bgl IIで切断して、約0.46KbDNA
断片を調製した。一方、trpプロモーターを有するプラ
スミドptrp781〔Kurokawa,T.らニユークレイック・アシ
ッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）11,3077−3085
（1983）〕DNAをPst Iで切断し、T4DNAポリメラーゼ反
応によって平滑化した。Bgl IIリンカーpCAGATCTGをT4D
NAリガーゼ反応によって平滑末端に結合させたのちEcoR
I−Bgl IIで切断して、trpプロモーター，テトラサイ
クリン耐性遺伝子およびプラスミド複製開始部位を含む
約3.2Kb DNA断片を分離した。hbFGFをコードする遺伝子
領域を含む前記0.46Kb EcoR I−Bgl II DNA断片と、こ
の3.2Kb DNA断片をT4DNAリガーゼ反応により結合させhb
FGF発現用プラスミドpTB669を構築した。
このプラスミドpTB669を用いて大腸菌DH1を形質転換
させることによりプラスミドpTB669を含む菌株Escheric
hia coli DH1/pTB669を得た。
さらに、同様にして、pTB669を用いて大腸菌K12 MM29
4,あるいはC600を形質転換して、Escherichia coli K12
MM294/pTB669（IFO 14532,FERM BP−1281）,E.coli C6
00/pTB669をそれぞれ得た。
参考例３ （ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（hbFGF）
の精製） 参考例２で得られたEscherichia coli K12 MM294/pTB
669（IFO 14532,FERM BP−1281）を１％グルコース,0.4
％カザミノ酸、８μg/mlテトラサイクリンを含むM9培地
［ティ・マニアティス（T.Maniatis）ら，モレキュラー
・クローニング・ラボラトリー・マニュアル，（Maniat
is,T.et al Melecular Cloning（1982）,A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring H
arbor NY.USA）］で培養し、Klett値が約200の時点で、
３βインドリールアクリル酸を25μg/mlになるように添
加し、さらに４時間培養した。培養後、菌体を集め、1/
20量の20mM Tris・HCl,pH7.6,10％シユークロース溶液
に懸濁した。この懸濁液にフェニルメチルスルホニルフ
ルオライド（PMSF）を1mM,EDTAを10mM,NaClを0.1M,スペ
ルミジン塩酸塩を10mM,リゾチームを100μg/ml（いずれ
も最終濃度）となるように添加し、０℃,45分放置後、3
0秒間超音波処理を加えた。この溶液を18000rpm（サー
バル遠心機,SS34ローター）30分間遠心して上清を得、
菌体抽出液とした。
この抽出液25ml（培養液500mlより調製）を20mM Tris
−HCl pH7.6,0.2M NaCl溶液で平行化したDEAEセルロー
ス（DE52,ワットマン社）カラム，（径２×10cm）に通
し、抽出液中の核酸成分を除去した。カラムからの素通
り液および20mM Tris−HCl,pH7.6,0.2M NaCl溶液でのカ
ラム洗液を合わせて集めた（DEAE素通り画分44ml）。
この画分14mlをヘパリンカラムShodex AF−pak HR−8
94（8mm ID×5cm,昭和電工製）を装備した高速液体クロ
マト装置（ギルソン社）にかけた。カラムを、20mM Tri
s−HCl pH7.6溶液，次いで20mM Tris−HCl pH7.6,0.5M
NaCl溶液で洗った後、20mM Tris−HCl pH7.6,バッファ
ー中、0.5Mから2MのNaClの直線勾配溶出（linear gradi
ent elution,60ml,流速1.0ml/min）を行った。
この操作により溶出されたhbFGFは、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを示し、十分に精
製されており、抗原として使用するのに好適であること
が判明した。なおhbFGFの検定は以下の条件で行った。
マウスBALB/c3T3細胞を５％仔牛血清を含むDMEM培地
でヌンク96穴マイクロタイタープレート（平底）に１穴
あたり２×103個を0.2mlの培地にて播種して、培養し、
翌日,0.5％仔牛血清を含むDMEM培地に交換した。３日間
培地したのち0.5％BSAを含むDME培地で５倍ずつ段階的
に希釈した菌体抽出液を１穴あたり10μ添加して、培養
し、20時間後に3H−Tdr（5Ci/mmol,0.5mCi/ml RCC Amer
sham）を各穴に２μずつ加えた。６時間後に細胞を0.2
％トリプシン−0.02％EDTAを含むリン酸緩衝液（PBS）
処理ではがし、タイターテックセルハーベスターを用い
て、グラスフィルター上に細胞を捕集し細胞に取り込ま
れた3H−チミジン量をシンチレーションカウンターにて
測定した。
参考例４ （ムテインをコードする塩基配列を有する組
換えDNAの製造） （１）、ヒトbFGF遺伝子のM13ベクターのクローニン
グ： 参考例２で得られたプラスミドpTB669を制限酵素EcoR
I及びBamH Iで消化させた。ファージベクターM13mp8
〔ジェイ・メッシング（J.Messing），メソッズ・イン
・エンジーモロジー，101,20〜78（1983）〕複製型（R
F）DNAを制限酵素EcoR I及びBamH Iで消化させ、予めEc
oR I及びBamH Iで消化させてあったpTB669由来のヒトbF
GF DNA断片と混合した。次に混合物をT4DNAリガーゼで
連結させ、連結DNAを大腸菌−JM105菌株の被感染能力の
ある菌体中へ形質転換させ、Xgalを指示種とするプレー
ト上に播き〔ジェイ・メッシング等、ニユークレイック
・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）（1981）
９巻 309−321頁〕、組換えファージを含有するプラー
ク（白いプラーク）を拾い上げ、組み換え部分の塩基配
列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法（J.Messing
ら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acid
s Res.）９,309（1981））によって決定して、ヒトbFGF
DNAが正確に挿入されていることを確認した。
このM13POクローンから１本鎖ファージDNAを精製し合
成オリゴヌクレオチドを使用する特定部位指向性変異誘
発の鋳型として用いた。
（２） サイト特異的突然変異誘発 0.1mMアデノシン三燐酸（ATP）、50mMヒドロキシメチ
ルアミノメタン塩酸塩（トリス−HCl）pH8.0、10mM MgC
l2、5mMジチオスレイトール（DTT）及びT4キナーゼ９単
位の存在下に、50μ中で合成オリゴヌクレオチド 〔Cys26をSerに変更するためのプライマー（制限酵素Rs
a Iの認識配列が消失する。）〕40ピコモルをT4キナー
ゼにより37℃で１時間処理した。50mM NaCl、1.0mMトリ
ス−HCl、pH8.0、10mM MgCl2及び10mM β−メルカプト
エタノールを含有する混合物50μ中で、このキナーゼ
処理されたプライマー（12ピコモル）を67℃で５分、及
び42℃で25分加熱することによって１本鎖（ss）M13−P
O DNA5μｇに雑種形成させた。アニーリングした混合物
を次に氷上で冷却し、0.5mMジデオキシヌクレオチド三
燐酸（dNTP）、80mMトリス−HCl、pH7.4、8mM MgCl2、1
00mM NaCl、DNAポリメラーゼI Klenow断片９単位、0.5m
M ATP及びT4DNAリカーゼ２単位を含有する反応混合物50
μに添加し、37℃で３時間及び25℃で２時間反応し、
0.2mM EDTA2μを加え反応を停止した。被感染能力の
あるJM 105細胞の形質転換に使用し、菌を一夜成育さ
せ、培養基上澄液からssDNAを単離した。このssDNAをプ
ライマー伸長の第二サイクルに鋳型として使用し、ゲル
精製されたRF型DNAを被感染能力のあるJM105細胞中へ形
質転換させ、寒天プレート上に播き、一夜培養するとフ
ァージプラークが得られた。
（３） 特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オ
リゴヌクレオチドプライマーは、システイン70を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるもので とする。（制限酵素Hae IIの認識配列が生成される） （４） 特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オ
リゴヌクレオチドプライマーは、システイン88を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるもので とする。（制限酵素Alu Iの認識配列が生成される） （５） 特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オ
リゴヌクレオチドプライマーは、システイン93を暗号づ
けるものからセリンを暗号づけるもので とする。（制限酵素Hinf Iの認識配列が生成される） （６） 突然変異誘発原化されたプラークのふるい分け
と同定： 突然変異させたM13−POプラークの入ったプレート類
（上記（１）項）並びに突然変異しないM13−POファー
ジプラークの入った２枚のプレートを４℃に冷却し、各
プレートからのプラークを２枚のニトロセルロース円形
フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾燥フィル
ターを寒天プレート上へ５分重ね、第二フィルターの場
合は15分重ねて移した。次に0.2N NaOH,1.5M NaCl及び
0.2％トリトンＸ−100に５分浸した厚手のろ紙上へフィ
ルター類を置き、次に0.5Mトリス−HCl,pH7.5、及び1.5
M NaClに浸したろ紙上へ更に５分重ねて中和した。フィ
ルター類を同様なやり方で２×SSC（標準クエン酸塩）
に浸したフィルター上で２回洗い、乾燥し、真空乾燥炉
内で80℃で２時間乾燥させた。重複フィルター類をフィ
ルター当たり10mlのDNA雑種形成緩衝液（５×SSC）,pH
7.0,4×デンハード液（ポリビニルピロリドン，フイコ
ール及び牛血清アルブミン,1×＝各0.02％）,0.1％ドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）,50mM燐酸ナトリウム緩衝
液,pH7.0及び100μg/mlの、変性サケ精子DNAにより、55
℃で４時間、事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチド
プライマーを105cpm/mlに42℃で24時間雑種形成させ
た。0.1％SDSと減少量のSSCを含有する洗浄用緩衝液中
でそれぞれ30分、50℃でフィルター類を洗った。フィル
ター類を、初めに２×SSCを含んだ緩衝液で洗い、突然
変異化されないM13−POプラークを含有する対照フィル
ターはガイガー計数管を用いて放射能の存在について検
査した。SSC濃度を段階的に低下させ、未突然変異M13−
POプラークをもつ対照フィルター上に検出可能な放射能
が残らなくなるまでフィルター類を洗った。SSCの使用
最低濃度は0.1×SSCであった。フィルターを空気乾燥
し、−70℃で２〜３日露光してオートラジオグラフをと
った。突然変異したM13−POのプラーク10000個と突然変
異されない対照プラーク100個をキナーゼ処理したオリ
ゴヌクレオチドプローブによってふるい分けた。対照プ
ラークではプローブと雑種形成したものが全く存在せ
ず、一方突然変異されたM13−POプラーク３〜10個がプ
ローブと雑種を形成した。
突然変異M13−POプラークの１個を取り上げ、JM105培
養基へ接種した。上澄液からssDNAをつくり、菌体ペレ
ットから２本鎖（ds）DNAをつくった。適当なオリゴヌ
クレオチドプライマーとssDNAを使用して塩基配列を解
析した。
その結果、TGC（Cys26）コドンがTCT（Ser）コドンへ
変換されたこと,TGT（Cys70）コドンがAGC（Ser）コド
ンへ変換されたこと,TGT（Cys88）コドンが、TCT（Se
r）コドンへ変換されたこと、TGT（Cys93）コドンがTCT
（Ser）コドンへ変換されたことがそれぞれ確認され
た。
変異したM13−POファージのうち、コドンCys−26がSe
rになったものをM13−P1,コドンCys−70がSerになった
ものをM13−P2,コドンCys−88がSerになったものをM13
−P3,コドンCys−93がSerになったものをM13−P4とし
た。
参考例５ ヒトbFGFのムテインをコードする遺伝子の大
腸菌における発現： （１） ヒトbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB739の
構築 前記参考例４で得られたM13−P1のレプリカティブフ
ォーム（RF）を制限酵素EcoR IおよびRst Iで切断し、
ヒトbFGFのムテインをコードする領域を含む約0.5Kb DN
A断片を得た。
一方、trpプロモーターを有するプラスミドptrp781
〔Kurokawa,T.らニユークレイック・アシッズ・リサー
チ（Nucleic Acids Res.）11,3077−3085（1983）〕DNA
をEcoR I−Pst Iで切断して、trpプロモーター，テトラ
サイクリン耐性遺伝子およびプラスミド複製開始部位を
含む約3.2Kb DNA断片を分離した。ヒトbFGFのムテイン
をコードする遺伝子領域を含む前記0.5Kb EcoR I−Pst
I DNA断片と、この3.2Kb DNA断片をT4DNAリガーゼ反応
により結合させヒトbFGFのムテイン発現用プラスミドpT
B739を構築した。
このプラスミドpTB739を用いて大腸菌DH1を形質転換
させることによりムテインをコードする遺伝子を含有す
るプラスミドpTB739を含む菌株Escherichia coli DH1/
pTB739（IFO 14575,FERM BP−1641）を得た。
（２） 菌体抽出液の調製 前記（１）で得られた形質転換体を、１％グルコー
ス,0.4％カザミノ酸、８μg/mlテトラサイクリンを含む
M9培地で培養し、Klett値が約200の時点で、３βインド
リールアクリル酸を25μg/mlになるように添加し、さら
に４時間培養した。培養後、菌体を集め、1/20量の20mM
Tris・HCl,pH7.6,10％シユークロース溶液に懸濁し
た。この懸濁液にフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド（PMSF）を1mM,EDTAを10mM,NaClを0.1M,スペルミジン
塩酸塩を10mM,リゾチームを100μg/ml（いずれも最終濃
度）となるように添加し、０℃,45分放置後、30秒間超
音波処理を加えた。この溶液を18000rpm（サーバル遠心
機,SS34ローター）30分間遠心して上清を得、菌体抽出
液とした。
（３） 菌体抽出液のヒトbFGF活性 マウスBALB/c3T3細胞を５％仔牛血清を含むDMEM培地
でヌンク96穴マイクロタイタープレート（平底）に１穴
あたり２×103個を0.2mlの培地にて播種して、培養し、
翌日,0.5％仔牛血清を含むDMEM培地に交換した。３日間
培養したのち0.5％BSAを含むDME培地で５倍ずつ段階的
に希釈した菌体抽出液を１穴あたり10μ添加して、培
養し、20時間後に3H−チミジン（5Ci/mmol,0.5mCi/ml R
CCAmersham）を各穴に２μずつ加えた。６時間後に細
胞を0.2％トリプシン−0.02％EDTAを含むリン酸緩衝液
（PBS）処理ではがし、タイターテックセルハーベスタ
ーを用いて、グラスフィルター上に細胞を捕集し細胞に
取り込まれた3H−チミジン量をシンチレーションカウン
ターにて測定した。
その結果、E.coli DH1/pTB739の菌体抽出液は、FGF活
性を示した。
このようにして、ヒトbFGFの26位のCysがSerに置換さ
れたムテインCS1が得られた。
参考例６ （ヒトbFGFのムテインをコードする遺伝子の
大腸菌における発現） （１） ヒトbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB742の
構築 前記参考例４で得られたM13−P2のレプリカティブフ
ォーム（RF）を制限酵素EcoR IおよびPst Iで切断し、
ヒトbFGFのムテインをコードする領域を含む約0.5Kb DN
A断片を得た。
一方、trpプロモーターを有するプラスミドptrp781DN
AをEcoR I−Pst Iで切断して、trpプロモーター，テト
ラサイクリン耐性遺伝子およびプラスミド複製開始部位
を含む約3.2Kb DNA断片を分離した。ヒトbFGFのムテイ
ンをコードする遺伝子領域を含む前記0.5Kb EcoR I−Ps
t I DNA断片と、この3.2Kb DNA断片をT4DNAリガーゼ反
応により結合させヒトbFGFのムテイン発現用プラスミド
pTB742を構築した。
このプラスミドpTB742を用いて大腸菌DH1を形質転換
させることによりムテインをコードする遺伝子を含有す
るプラスミドpTB742を含む菌株Escherichia coli DH1/
pTB742（IFO 14584,FERM BP−1642）を得た。
（２） 菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培
養し、上清を得、菌体抽出液とした。
（３） 菌体抽出液のヒトbFGF活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５
（３）と同様の方法でヒトbFGF活性を測定した。
その結果、E.coli DH1/pTB742の菌体抽出液は、FGF活
性を示した。
このようにして、ヒトbFGFの70位のCysがSerに置換さ
れたムテインCS2が得られた。
参考例７ （ヒトbFGFのムテインをコードする遺伝子の
大腸菌における発現） （１） ヒトbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB743の
構築 前記参考例４で得られたM13−P3のレプリカティブフ
ォーム（RF）を制限酵素EcoR IおよびPst Iで切断し、
ヒトbFGFのムテインをコードする領域を含む約0.5Kb DN
A断片を得た。
一方、trpプロモーターを有するプラスミドptrp781DN
AをEcoR I−Pst Iで切断して、trpプロモーター，テト
ラサイクリン耐性遺伝子およびプラスミド複製開始部位
を含む約3.2Kb DNA断片を分離した。ヒトbFGFのムテイ
ンをコードする遺伝子領域を含む前記0.5Kb EcoR I−Ps
t I DNA断片と、この3.2Kb DNA断片をT4DNAリガーゼ反
応により結合させヒトbFGFのムテイン発現用プラスミド
pTB743を構築した。
このプラスミドpTB743を用いて大腸菌DH1を形質転換
させることによりムテインをコードする遺伝子を含有す
るプラスミドpTB743を含む菌株Escherichia coli DH1/
pTB743（IFO 14585,FERM BP−1643）を得た。
（２） 菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培
養し、上清を得、菌体抽出液とした。
（３） 菌体抽出液のヒトbFGF活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５
（３）と同様の方法でヒトbFGF活性を測定した。
その結果、E.coli DH1/pTB743の菌体抽出液は、FGF活
性を示した。
このようにして、ヒトbFGFの88位のCysがSerに置換さ
れたムテインCS3が得られた。
参考例８ （ヒトbFGFのムテインをコードする遺伝子の
大腸菌における発現） （１） ヒトbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB744の
構築 前記参考例４で得られたM13−P4のレプリカティブフ
ォーム（RF）を制限酵素EcoR IおよびPst Iで切断し、
ヒトbFGFのムテインをコードする領域を含む約0.5Kb DN
A断片を得た。
一方、trpプロモーターを有するプラスミドptrp781DN
AをEcoR I−Pst Iで切断して、trpプロモーター，テト
ラサイクリン耐性遺伝子およびプラスミド複製開始部位
を含む約3.2Kb DNA断片を分離した。ヒトbFGFのムテイ
ンをコードする遺伝子領域を含む前記0.5Kb EcoR I−Ps
t I DNA断片と、この3.2Kb DNA断片をT4DNAリガーゼ反
応により結合させヒトbFGFのムテイン発現用プラスミド
pTB744を構築した。
このプラスミドpTB744を用いて大腸菌DH1を形質転換
させることによりムテインをコードする遺伝子を含有す
るプラスミドpTB744を含む菌株Escherichia coli DH1/
pTB744（IFO 14586,FERM BP−1644）を得た。
（２） 菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培
養し、上清を得、菌体抽出液とした。
（３） 菌体抽出液のヒトbFGF活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５
（３）と同様の方法でヒトbFGF活性を測定した。
その結果、E.coli DH1/pTB744の菌体抽出液は、FGF活
性を示した。
このようにして、ヒトbFGFの93位のCysがSerに置換さ
れたムテインCS4が得られた。
参考例９ （突然変異誘発原化されたプラークのふるい
分けと同定） 参考例４で得られた突然変異させたM13−P2ファージ
プラークの入ったプレート類並びに参考例４で得られた
突然変異しないM13−P2ファージプラークの入った２枚
のプレートを４℃に冷却し、各プレートからのプラーク
を２枚のニトロセルロース円形フィルター上へ、第一フ
ィルターの場合には乾燥フィルターを寒天プレート上へ
５分重ね、第二フィルターの場合は15分重ねて移した。
次に0.2N NaOH,1.5M NaCl及び0.2％トリトンＸ−100に
５分浸した厚手のろ紙上へフィルター類を置き、次に0.
5Mトリス−HCl,pH7.5、及び1.5M NaClに浸したろ紙上へ
更に５分重ねて中和した。フィルター類を同様なやり方
で２×SSC（標準クエン酸塩）に浸したフィルター上で
２回洗い、乾燥し、真空乾燥炉内で80℃で２時間乾燥さ
せた。重複フィルター類をフィルター当たり10mlのDNA
雑種形成緩衝液（５×SSC）,pH7.0,4×デンハード液
（ポリビニルピロリドン，フイコール及び牛血清アルブ
ミン,1×＝各0.02％）,0.1％ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）,50mM燐酸ナトリウム緩衝液,pH7.0及び100μg/m
lの、変性サケ精子DNAにより、55℃で４時間、事前雑種
形成させた。次にオリゴヌクレオチドプライマーを105c
pm用い42℃で24時間雑種形成させた。0.1％SDSと減少量
のSSCを含有する洗浄用緩衝液中でそれぞれ30分、50℃
でフィルター類を洗った。フィルター類を、初めに２×
SSCを含んだ緩衝液で洗い、突然変異化されないM13−P2
プラークを含有する対照フィルターはガイガー計数管を
用いて放射能の存在について検査した。SSC濃度を段階
的に低下させ、未突然変異M13−P2プラークをもつ対照
フィルター上に検出可能な放射能が残らなくなるまでフ
ィルター類を洗った。SSCの使用最低濃度は0.1×SSCで
あった。フィルターを空気乾燥し、−70℃で２〜３日露
光してオートラジオグラフをとった。突然変異したM13
−P2のプラーク10000個と突然変異されない対照プラー
ク100個をキナーゼ処理したオリゴヌクレオチドプロー
ブによってふるい分けた。対照プラークではプローブと
雑種形成したものが全く存在せず、一方突然変異された
M13−P2プラーク３〜10個がプローブと雑種を形成し
た。
突然変異M13−P2プラークの１個を取り上げ、JM105培
養基へ接種した。上澄液からssDNAをつくり、菌体ペレ
ットから２本鎖（ds）DNAをつくった。適当なオリゴヌ
クレオチドプライマーとssDNAを使用して塩基配列を解
析した。
その結果、TGC（Cys26）コドンがTCT（Ser）コドンへ
変換されたこと,TGT（Cys88）コドンがTCT（Ser）コド
ンへ変換されたこと、TGT（Cys93）コドンがTCT（Ser）
コドンへ変換されたことがそれぞれ確認された。
変異したM13−P2ファージのうち、コドンCys−26およ
び−70がSerになったものをM13−P12,コドンCys−70お
よび−88がSerになったものをM13−P23,コドンCys−70
および−93がSerになったものをM13−P24とそれぞれ称
することとした。
参考例10 （ヒトbFGFのムテインをコードする遺伝子の
大腸菌における発現） （１） ヒトbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB762の
構築 前記参考例９で得られたM13−P23のレプリカティブフ
ォーム（RF）を、参考例５（１）と同様に処理し、ヒト
bFGFのムテイン発現用プラスミドpTB762を構築した。
このプラスミドpTB762を用いて大腸菌MM294を形質転
換させることによりムテインをコードする遺伝子を含有
するプラスミドpTB762を含む菌株Escherichia coli MM
294/pTB762（IFO 14613,FERM BP−1645）を得た。
（２） 菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培
養し、上清を得、菌体抽出液とした。
（３） 菌体抽出液のヒトbFGF活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５
（３）と同様の方法でヒトbFGF活性を測定した。
その結果、E.coli MM294/pTB762の菌体抽出液は、FGF
活性を示した。
このようにして、ヒトbFGFの70位および88位のCysがS
erに置換されたムテインCS23が得られた。
参考例11 （ムテインをコードする塩基配列を有する組
換えDNAの製造） （１） ヒトbFGF遺伝子のM13ベクターのクローニン
グ： 参考例２で得られたプラスミドpTB669を制限酵素EcoR
I及びBamH Iで消化させた。ファージベクターM13mp8
〔ジェイ・メッシング（J.Messing），メソッズ・イン
・エンジーモロジー，101,20〜78（1983）〕複製型（R
F）DNAを制限酵素EcoR I及びBamH Iで消化させ、予めEc
oR I及びBamH Iで消化させてあったpTB669由来のヒトbF
GF DNA断片と混合した。次に混合物をT4DNAリガーゼで
連結させ、連結DNAを大腸菌−JM105菌株の被感染能力の
ある菌体中へ形質転換させ、Xgalを指示種とするプレー
ト上に播き〔ジェイ・メッシング等、ニユークレイック
・アシッズ・リサーチ（Nicleic Acids Res.）（1981）
９巻309−321頁〕、組換えファージを含有するプラーク
（白いプラーク）を拾い上げ、組み換え部分の塩基配列
をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法（J.Messing
ら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acid
s Res.）９,309（1981））によって決定して、ヒトbFGF
DNAが正確に挿入されていることを確認した。
このM13−POクローンから１本鎖ファージDNAを精製し
合成オリゴヌクレオチドを使用する特定部位指向性変異
誘発の鋳型として用いた。
（２） サイト特異的突然変異誘発 0.1mMアデノシン酸燐酸（ATP）、50mMヒドロキシメチ
ルアミノメタン塩酸塩（トリス−HCl）pH8.0、10mM MgC
l2、5mMジチオスレイトール（DTT）及びT4キナーゼ９単
位の存在下に、50μ中で合成オリゴヌクレオチド 〔塩基配列中に制限酵素EcoR Iの認識部位を生成し、さ
らにProl4をMetに変更するためのプライマー〕40ピコモ
ルをT4キナーゼにより37℃で１時間処理した。50mM NaC
l、1.0mMトリス−HCl、pH8.0、10mM MgCl2及び10mM β
−メルカプトエタノールを含有する混合物50μ中で、
このキナーゼ処理されたプライマー（12ピコモル）を67
℃で５分、及び42℃で25分加熱することによって１本鎖
（ss）M13−PO DNA5μｇに雑種形成させた。アニーリン
グした混合物を次に氷上で冷却し、0.5mM各デオキシヌ
クレオチド三燐酸（dNTP）、80mMトリス−HCl、pH7.4、
8mM MgCl2、100mM NaCl、DNAポリメラーゼI Klenow断片
９単位、0.5mM ATP及びT4DNAリカーゼ２単位を含有する
反応混合物50μに添加し、37℃で３時間及び25℃で２
時間反応し、0.2mM EDTA2μを加え反応を停止した。
被感染能力のあるJM 105細胞の形質転換に使用し、菌を
一夜成育させ、培養基上澄液からssDNAを単離した。こ
のssDNAをプライマー伸長の第二サイクルに鋳型として
使用し、ゲル精製されたRF型DNAを被感染能力のあるJM1
05細胞中へ形質転換させ、寒天プレート上に播き、一夜
培養するとファージプラークが得られた。
（３） 特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オ
リゴヌクレオチドプライマーは、塩基配列中に制限酵素
Nco Iの認識部位を生成し、同時にGly9をThrに、Ser10
をMetに変更するもので、 とする。
（４） 特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オ
リゴヌクレオチドプライマーは、塩基配列中に制限酵素
Afl IIの認識部位を生成し、同時にLys87をコードする
コドンを停止コドンに変更するもので とする。
（５） 特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オ
リゴヌクレオチドプライマーは、塩基配列中に制限酵素
Hpa Iの認識部位を生成し、同時にAsp42をAsnに変更す
るもので とする。
（６） 特定部位指向性変異誘発： 上の（２）項の操作をくり返すが、但し使用の合成オ
リゴヌクレオチドプライマーは、塩基配列中に制限酵素
Hpa IIの認識部位を消失させ、同時にArg45をGlnに変更
するもので とする。
（７） 突然変異誘発原化されたプラークのふるい分け
と同定： 突然変異させたM13−POプラークの入ったプレート類
（上記（１）項）並びに突然変異しないM13−POファー
ジプラークの入った２枚のプレートを４℃に冷却し、各
プレートからのプラークを２枚のニトロセルロース円形
フィルター上へ、第一フィルターの場合には乾燥フィル
ターを寒天プレート上へ５分重ね、第二フィルターの場
合は15分重ねて移した。次に0.2N NaOH,1.5M NaCl及び
0.2％トリトンＸ−100に５分浸した厚手のろ紙上へフィ
ルター類を置き、次に0.5Mトリス−HCl,pH7.5、及び1.5
M NaClに浸したろ紙上へ更に５分重ねて中和した。フィ
ルター類を同様なやり方で２×SSC（標準クエン酸塩）
に浸したフィルター上で２回洗い、乾燥し、真空乾燥炉
内で80℃で２時間乾燥させた。重複フィルター類をフィ
ルター当たり10mlのDNA雑種形成緩衝液（５×SSC）,pH
7.0,4×デンハード液（ポリビニルピロリドン，フイコ
ール及び牛血清アルブミン,1×＝各0.02％）,0.1％ドデ
シル硫酸ナトリウム（SDS）,50mM燐酸ナトリウム緩衝
液,pH7.0及び100μg/mlの、変性サケ精子DNAにより、55
℃で４時間、事前雑種形成させた。オリゴヌクレオチド
プライマー105cpmを42℃で24時間雑種形成させた。0.1
％SDSと減少量のSSCを含有する洗浄用緩衝液中でそれぞ
れ30分、50℃でフィルター類を洗った。フィルター類
を、初めに２×SSCを含んだ緩衝液で洗い、突然変異化
されないM13−POプラークを含有する対照フィルターは
ガイガー計数管を用いて放射能の存在について検査し
た。SSC濃度を段階的に低下させ、未突然変異M13−POプ
ラークをもつ対照フィルター上に検出可能な放射能が残
らなくなるまでフィルター類を洗った。SSCの使用最低
濃度は0.1×SSCであった。フィルターを空気乾燥し、−
70℃で２〜３日露光してオートラジオグラフをとった。
突然変異したM13−POのプラーク10000個と突然変異され
ない対照プラーク100個を32P−γ−ATPでキナーゼ処理
したオリゴヌクレオチドプローブによってふるい分け
た。対照プラークではプローブと雑種形成したものが全
く存在せず、一方突然変異されたM13−POプラーク３〜1
0個がプローブと雑種を形成した。
突然変異M13−POプラークの１個を取り上げ、JM105培
養基へ接種した。上澄液からssDNAをつくり、菌体ペレ
ットから２本鎖（ds）DNAをつくった。適当なオリゴヌ
クレオチドプライマーとssDNAを使用して塩基配列を解
析した。
その結果、AGC（Ser10）コドンがATG（Met）コドンへ
変換されたこと、CCG（Prol4）コドンがATG（Met）コド
ンへ変換されたこと,AAA（Lys87）コドンがTAA（停止）
コドンへ変換されたこと、GAC（Asp42）コドンがAAC（A
sn42）コドンへ変換されたこと、CGG（Arg45）コドンが
CAG（Gln45）コドンへ変換されたことがそれぞれ確認さ
れた。
変異したM13−POファージのうち、コドンSer10がMet
になったものをM13−PN10と、 コドンPro14がMetになったものをM13−PN14と、 コドンLys87が停止コドンになったものをM13−PC86
と、 コドンAsp42がAsnになったものをM13−PDN42と、 コドンArg45がGlnになったものをM13−PRQ45とそれぞ
れ称することとした。
参考例12 （ヒトbFGFのムテインをコードする遺伝子の
大腸菌における発現） （１） ヒトbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB795の
構築 前記参考例11で得られたM13−PN14のレプリカティブ
フォーム（RF）を、参考例５（１）と同様に処理し、ヒ
トbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB795を構築した。
このプラスミドpTB795を用いて大腸菌MM294を形質転換
させることにより、ムテインをコードする遺伝子を含有
するプラスミドpTB795を含む菌株Escherichia coli MM
294/pTB795（IFO 14700,FERM BP−1660）を得た。
（２） 菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培
養し、上清を得、菌体抽出液とした。
（３） 菌体抽出液のヒトbFGF活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５
（３）と同様の方法でヒトbFGF活性を測定した。その結
果、E.coli MM294/pTB795の菌体抽出液は、FGF活性を示
した。このようにして、ヒトbFGFのPro2からPro14まで
が欠損したムテインN14が得られた。
参考例13 （ヒトbFGFのムテインをコードする遺伝子の
大腸菌における発現） （１） ヒトbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB796の
構築 前記参考例11で得られたM13−PC86のレプリカティブ
フォーム（RF）を、参考例５（１）と同様に処理し、ヒ
トbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB796を構築した。
このプラスミドpTB796を用いて大腸菌MM294を形質転換
させることにより、ムテインをコードする遺伝子を含有
するプラスミドpTB796を含む菌株Escherichia coli MM
294/pTB796（IFO 14701,FERM BP−1661）を得た。
（２） 菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培
養し、上清を得、ヒトbFGFのLys87以降のアミノ酸を欠
損したムテインC86を含有する菌体抽出液を得た。
参考例14 （ヒトbFGFのムテインをコードする遺伝子の
大腸菌における発現） （１） ヒトbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB797の
構築 前記参考例11で得られたM13−PDN42のレプリカティブ
フォーム（RF）を、参考例５（１）と同様に処理し、ヒ
トbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB797を構築した。
このプラスミドpTB797を用いて大腸菌MM294を形質転換
させることにより、ムテインをコードする遺伝子を含有
するプラスミドpTB797を含む菌株Escherichia coli MM
294/pTB797（IFO 14702,FERM BP−1662）を得た。
（２） 菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培
養し、上清を得、菌体抽出液とした。
（３） 菌体抽出液のヒトbFGF活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５
（３）と同様の方法でヒトbFGF活性を測定した。その結
果、E.coli MM294/pTB797の菌体抽出液は、FGF活性を示
した。このようにして、ヒトbFGFのAsp42がAsnに置換さ
れたムテインDN42が得られた。
参考例15 （ヒトbFGFのムテインをコードする遺伝子の
大腸菌における発現） （１） ヒトbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB855の
構築 前記参考例２で得られたプラスミドpTB669のDNAを制
限酵素Hinc IIで切断し、EcoR Iリンカー ｐ（５′−C
ATGAATTCATG−３′）をT4DNAリガーゼ反応によって結合
させた。さらに制限酵素EcoR IとPst Iで切断して、約
0.35kbのDNA断片を分離した。このDNA断片とプラスミド
ptrp 781をEcoR I−Pst Iで切断して得られる約3.2kbの
DNA断片（参考例５（１））をT4DNAリガーゼ反応により
結合させヒトbFGFムテイン発現用プラスミドpTB855を構
築した。
このプラスミドpTB855を用いて大腸菌MM294を形質転
換させることにより、ムテインをコードする遺伝子を含
有するプラスミドpTB855を含む菌株E.coli MM294/pTB85
5を得た。
（２） 菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培
養し、上清を得、菌体抽出液とした。
（３） 菌体抽出液のヒトbFGF活性 上記（２）で得られた菌体抽出液につき、参考例５
（３）と同様の方法でヒトbFGF活性を測定した。その結
果、E.coli MM294/pTB855の菌体抽出液は、FGF活性を示
した。このようにして、ヒトbFGFのPro2からVal41まで
が欠損したムテインN41が得られた。
参考例16 （ヒトbFGFのムテインをコードする遺伝子の
大腸菌における発現） （１） ヒトbFGFのムテイン発現用プラスミドpTB856の
構築 前記参考例２で得られたプラスミドpTB669のDNAを制
限酵素BamH Iで部分的に切断し、bFGF遺伝子内にあるBa
mH I認識部位のみを切断した。切断部位をdATP,dCTP,dG
TP,dTTP存在下で大腸菌DNAポリメラーゼＩを用いて平滑
末端とし、Nhe Iリンカー ｐ（５′−CTAGCTAGCTAG−
３′）をT4DNAリガーゼ反応により結合させた。制限酵
素Nhe Iで処理して、さらにT4DNAリガーゼ反応により切
断部位を結合させ、ヒトbFGFのムテイン発現用プラスミ
ドpTB856を構築した。
このプラスミドpTB856を用いて大腸菌MM294を形質転
換させることにより、ムテインをコードする遺伝子を含
有するプラスミドpTB856を含む菌株E.coli MM294/pTB85
6を得た。
（２） 菌体抽出液の調製 前記形質転換体を、参考例５（２）と同様の方法で培
養し、上清を得、ヒトbFGFのLys130以降のアミノ酸を欠
損したムテインC129を含有する菌体抽出液を得た。
参考例17 Ｈ−Leu−Pro−Met−Ser−Ala−Lys−Ser−OH（bFGF［1
40−146］）の製造 Boc−Ser（Bzl）−樹脂696mg（0.72mmol/g樹脂）よ
り、アプライド・バイオシステムズ社（米国）430A型全
自動ペプチド合成機にのせ、以下のアミノ酸を順次縮合
及び脱Boc反応に付した。
Boc−Lys（Ｚ）−OH,Boc−Ala−OH,Boc−Ser（Bzl）−O
H,Boc−Met−OH,Boc−Pro−OH,Boc−Leu−OH Bzl:ベンジル Boc:t−ブトキシカルボニル Z :ベンジルオキシカルボニル 斯くしてBoc−Leu−Pro−Met−Sre（Bzl）−Ala−Lys
（Ｚ）−Ser（Bzl）−樹脂1.08gを得た。このうち400mg
をアニソール0.5ml及びジメチルスルフィド0.5mlを含む
弗化水素5.0ml中で０℃で60分間インキュベーションし
樹脂から取り出した。過剰の弗化水素を減圧留去し残渣
をEt2Oで洗浄後、水30mlにて抽出し、凍結乾燥して得ら
れた粗製品を水5mlに溶かしアンバーライトIRA−400
（酢酸型）樹脂（カラム２×5cm,溶出液 水）でイオン
交換を行い、溶出液を減圧濃縮し、セファデックスLH−
20（ファルマシア社，カラム2.5×125cm,溶出液1N酢
酸）によるゲルろ過にて精製して、目的物を得た。収量
118mg（78.8％） Rf 0.22（酢酸エチル：酢酸：ブタノール：水＝1:1:1:
1） ▲［α］25 D▼−81゜（ｃ＝0.11,1N酢酸中） アミノ酸分析値:Ser2.08,Pro1.06,Ala1.00,Met0.98,L
eu1.03,Lys0.99 実施例１ （免疫） BALB/cマウス（♀４週令）に対しフロインド完全アジ
ュバント（Difco社製）0.4mlに溶解させた10μｇの抗原
ヒトbFGF（参考例３で得られたもの。）を腹腔に注射し
た。３週間後に、フロインド不完全アジュバント0.4ml
にとかした10μｇの抗原hbFGFを腹腔に再投与した。さ
らに３週間後に同様の追加免疫を行い、その２週間後に
生理食塩水に溶かした10μｇのヒトbFGFを腹腔内に接種
した。
実施例２ （１）細胞融合 実施例１で示した免疫マウスより、抗原最終投与の４
日後脾臓を摘出し、細胞融合に用いる細胞を得た。この
細胞は、イスコフ培地とハムＦ−12培地を1:1の比率で
混合した培地（以下IH培地と略す）に懸濁した。
マウスミエローマ細胞P3−X63−Ag・8U1は、10％ウシ
胎児血清を含むRPMI1640培地で５％炭酸ガス,95％空気
の条件で継代培養した。
細胞融合は、ケーラーおよびミルスタインらが確立し
た方法［ケーラー,G.およびミルスタイン,C.;ネイチャ
ー（Nature）256,495（1975）］に準じて行った。上記
ミエローマ細胞2.9×107個と上述した方法で得られた免
疫されたリンパ球1.5×108個を混合、遠沈し、0.3mlのI
H培地に溶解した45％ポリエチレングリコール6000（以
下PEG6000）を滴下した。PEG6000溶液は、予め37℃に温
め、ゆっくりと滴下した。５分後37℃に予温したIH培地
１分間に0.5mlずつ加え10mlとした後、室温で600回転15
分遠心し上清を除去した。この細胞沈殿物を20％子牛血
清を含むIH培地200mlに懸濁し、24穴マイクロプレート
（リンブロ社）に2mlずつ植えつけた。１日後、HAT（ヒ
ポキサンチン１×10-4M,アミノプテリン４×10-7M,チミ
ジン1.6×10-5M）を含んだIH培地（20％仔牛血清含有）
（以下HAT培地と称する。）を各ウエルに1mlずつ添加
し、さらに３日おきに、培地の1/2量をHAT培地と交換し
た。このようにして生育した細胞は雑種細胞である。
（２）抗体産生細胞の検索 予め、ヒトbFGFを固定したポリスチレン製96穴マイク
ロタイタープレートに、雑種細胞培養上清を100μず
つ加え室温で２時間インキュベートした。培養上清を除
去、洗浄後２次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ
（HRP）標識抗マウスIgGヤギ抗体（マイルス社）を加え
室温で２時間インキュベートした。２次抗体を除去し、
よくウエル洗浄した後、反応基質を加えた呈色反応を行
った（EIA法）。この方法により３つのウエルに強い結
合価が観察された。
（３）雑種細胞のクローニング これらのウエル中の細胞を、１ウエルあたり0.5個と
なるように、予め104個／ウエルのマウス胸腺細胞を栄
養細胞としてまいておいた96穴マイクロタイタープレー
トにまき、クローニングを行った。その結果、３つのク
ローン，マウスHbF99細胞（IFO 50122），マウスHbF161
細胞（IFO 50123），マウスHbF165細胞（IFO 50124）を
得た。
これらの細胞上清中の抗体価測定結果を第２表に示
す。
クローニングされた細胞は、20％仔牛血清を含むIH培
地に10％となるようジメチルスルホキシド（DMSO）を加
え液体窒素内に貯蔵した。
実施例３ （モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラ
ス） 実施例２で得られたマウス抗体サブクラス検出キット
（バイオラッド社）により各種標品免疫グロブリンと反
応させた。その結果を第３表に示す。
第３表より、MoAb99、MoAb161およびMoAb165はいずれ
も免疫グロブリンクラスがIgMに属することが分かる。
実施例４ 実施例１に記載の方法によって免疫したマウスBALB/c
から脾臓を採取し、実施例２（１），（２）および
（３）に記載の方法によってハイブリドーマHbF12（IFO
50142）,HbF45,HbF47,HbF52（IFO 50143）,HbF78（IFO
50144）およびHbF98（IFO 50145）を得た。
ハイブリドーマHbF12,HbF45,HbF47,HbF52,HbF78,HbF9
8について、それぞれ２×106個の細胞を予めミネラルオ
イルを0.5ml腹腔内に投与しておいたマウスに接種し
た。10日後、１匹あたり２〜4mlの腹水を採取し、それ
ぞれのハイブリドーマよりモノクローナル抗体MoAb12,M
oAb45,MoAb47,MoAb52,MoAb78,MoAb98を得た。
実施例３に記載の方法に従って、これらモノクローナ
ル抗体の免疫クロブリンクラスを測定したところ、次の
第４表のように決定された。
実施例５ （１）放射標識hbFGFの調製 参考例２に記載した大腸菌MM294/pTB669（IFO 14532,
FERM BP−1281）を用いて、35Sにより放射標識されたhb
FGFを以下の方法により得た。
上記大腸菌MM294/pTB669を参考例３に記載した培地で
Klett値が200になるまで培養した。この培養液を に1/5量投入した。
は１％グルコース,8μg/mlテトラサイクリンを含むM9培
地に以下の組成でアミノ酸を添加した培地である。
アミノ酸組成 Ｌ−アラニン 25.0mg/ Ｌ−アルギニン塩酸塩 84.0 Ｌ−アスパラギン １水和物 28.4 Ｌ−アスパラギン酸 30.0 Ｌ−システイン ２ナトリウム塩 82.8 Ｌ−グルタミン酸 75.0 Ｌ−グルタミン 584.0 Ｌ−グリシン 30.0 Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 １水和物 42.0 Ｌ−イソロイシン 105.0 Ｌ−ロイシン 105.0 Ｌ−リジン塩酸塩 146.0 Ｌ−フェニルアラニン 66.0 Ｌ−プロリン 40.0 Ｌ−セリン 42.0 Ｌ−スレオニン 95.0 Ｌ−チロシン 83.9 Ｌ−バリン 94.0 でKlett値が200になるまで培養し、３βインドールアク
リル酸を25μg/mlになるよう添加し、さらに２時間培養
を続けた。この後、1mlを分取し、10μCiの35S−Met
（比活性＞1000Ci/mmol）を投与し30分培養した。培養
後、集菌し参考例３に記載の方法に従って菌体抽出液を
得た。
また、参考例２に記載のベクタープラスミドptrp781
を有する大腸菌MM294についても同じ処理を行い、標識
菌体抽出液を得た。
（２）免疫沈降 プロテインＡ（BRL社製）は、その使用書に従って調
製し10％溶液を使用した。非標識大腸菌抽出液は大腸菌
MM294/ptrp781を参考例３に記載の方法により得た。
実施例４で得た腹水1mlを非標識大腸菌抽出液100μ
と混合し、４℃１時間放置後、標識菌体抽出液（MM294/
ptrp781又はMM294/pTB669）を106cpm加え４℃一夜放置
した。
プロテインA10％溶液100μに非標識大腸菌抽出液10
0μを加え混合し４℃一晩放置後、遠心し、100μの
NETBN液［150mM NaCl,5mM EDTA,50mM Tris Cl（pH7.
5）,0.1％BSA,0.05％NP−40（ノニデット（Non−idet）
Ｐ−40）］に再懸濁した。これに上記の処理をした標識
抽出液と腹水の混合物を加え混合し、４℃一晩放置し
た。これを遠心し、沈殿物を500μのNETBN液に懸濁し
た。この操作を５回繰り返し、吸着しない標識物質を除
いた後、最後に50μの電気泳動サンプルバッファーに
懸濁し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。泳
動はLaemmli,U.K.の方法［Nature,227,680（1970）］に
従った。泳動後、ゲルを50％トリクロロ酢酸（TCA）に
１時間浸し、蒸留水で30分ずつ４回洗いTCAを除いた
後、ジメチルスルホキシド（DMSO）に１時間浸した。こ
の後、10％2.5ジフェニルオキサゾール（DPO）を含むDM
SOに１時間浸した。蒸留水で30分ずつ３回ゲルを洗った
後、ゲルを乾燥させた。これよりラジオオートグラムを
とり免疫沈降パターンを観察した。これを第２図に示
す。第２図より、モノクローナル抗体MoAb12,MoAb52,Mo
Ab78,MoAb98は、菌体抽出液中のhbFGFと結合することが
わかった。
実施例６ 実施例４で得られたモノクローナル抗体のうち実施例
５において免疫沈降を示した４抗体すなわちモノクロー
ナル抗体MoAb12,MoAb52,MoAb78およびMoAb98について抗
体結合価を限界希釈法により測定した。
すなわち、実施例４で得られたモノクローナル抗体Mo
Ab12,MoAb52,MoAb78またはMoAb98を含む腹水液をそれぞ
れ10％ウシ胎児血清を含む1H培地で希釈し、実施例２
（２）に示したEIA法によって希釈液中の抗体量を測定
した。この結果を第３図に示す。第３図において、 それぞれ示す。
第３図から、これら抗体を含有する腹水は限界希釈値
が１×106以上であり、したがって、これら抗体は、抗
体結合価が非常に高いことが分かる。
実施例７ （抗原認識部位の決定） 実施例６において抗体結合価を測定した４抗体の抗原
認識部位を競合的結合阻害実験により検討した。
競合物として、参考例３で得られたhbFGF,合成ペプチ
ドPepl:Pro−Ala−Leu−Pro−Glu−Asp−Gly−Gly−Ser
−Tyr（Ｎ末アミノ酸２−10にTyrを付加したもの）〔レ
ギュラトリー・ペプタイズ（Regulatory Peptides），1
0,309−317（1985）〕,Pep2:Leu−Pro−Met−Ser−Ala
−Lys−Ser（アミノ酸142−147に相当）（参考例17で得
られたもの），および欠失型bFGFムテインすなわちムテ
インN14（参考例12で得られたもの），およびムテインN
41（参考例15で得られたもの）を用いた。
合成ペプチドは、100μg/mlの濃度に調製し、10％FCS
を含むIH培地〔イスコフおよびハムＦ−12混合培地（1:
1）〕で希釈を行った。ムテインN14およびN41は、参考
例12（２）または15（２）にそれぞれ示した方法により
得られた抽出液を10％FCSを含むIH培地で希釈して用い
た。抗体量がA415において0.7〜1.0となるように実施例
４で得た腹水液について、MoAb12,MoAb52,MoAb98につい
ては、５×105倍に、MoAb78は５×104倍に希釈した。希
釈液としては、10％FCSを含むIH培地を用いた。希釈抗
体液に希釈した競合物を加え撹拌後、37℃,30分保温し
た。この液中に含まれる未結合の抗体量を実施例２
（２）に示すEIA法によって測定した。
合成ペプチドを用いた場合の結果を、第４図，第５
図，第６図および第７図に示す。第４図はモノクローナ
ル抗体MoAb12についての結果を、第５図はモノクローナ
ル抗体MoAb52についての結果を、第６図はモノクローナ
ル抗体MoAb78についての結果を、第７図はモノクローナ
ル抗体MoAb98についての結果を示す。なお、これらの図
において、 はPep2をそれぞれ競合物として用いた結果を示す。また
図において、縦軸は発色剤の吸光（波長415nmによる）
を示す。
第４図および第６図から、モノクローナル抗体MoAb12
およびMoAb78は、Pep1により競合的結合阻害を受けた。
このことから、モノクローナル抗体MoAb12およびMoAb78
は、hbFGFのＮ末端アミノ酸２〜10を認識することが分
かった。
第５図，第７図からMoAb52,MoAb98は、これらの合成
ペプチドによって結合阻害を受けないことがわかった。
これらの抗体の認識部位を決定するために、参考例12
で得られたムテインN14および参考例15で得られたN41を
用いた競合的阻害実験を前記と同様にして行ない、第８
図にMoAb52の結果を、第９図にMoAb98の結果を示す。な
お、これらの図において、 はムテインN41をそれぞれ競合物として用いた結果を示
す。図において、縦軸は発色剤の吸光（波長415nmによ
る）を示す。横軸は参考例３の方法によって得た大腸菌
粗抽出液の総タンパク量を示す。
第８図および第９図から、モノクローナル抗体MoAb5
2,MoAb98はムテインN14によって競合的結合阻害を受け
るが、ムテインN41によって競合的結合阻害を受けなか
った。
このことから、モノクローナル抗体MoAb52およびMoAb
98は、hbFGFのアミノ酸第15〜41を認識することが分か
った。
次に、競合物としてウシ酸性FGF（baFGF）〔R ＆ D S
ystems Inc.社,U.S.A.より購入〕および参考例３で得ら
れたhbFGFを用い競合的阻害実験を前記と同様にして行
ない、次の第５表に示す結果が得られた。数値は、未結
合の抗体量を実施例２（２）に記載の方法によるEIAの
発色による吸光度を示す。
このことから、モノクローナル抗体MoAb12,MoAb52,Mo
Ab78およびMoAb98は、ウシ酸性FGFと交差反応しないこ
とが分かった。
上記したことから、４種のモノクローナル抗体の認識
部位については次の第６表のようにまとめられる。
実施例８ 腹水からの抗体の精製 実施例４の方法によりモノクローナル抗体MoAb12,MoA
b52,MoAb78,MoAb98を各々マウス10匹ずつに接種し、腹
水液20〜30mlを得た。腹水液は2000rpm（日立冷却遠心
機）で遠心し、細胞などを除去した後、スピンコSW28ロ
ーター（ベックマン社，米国）で４℃,2時間遠心し、不
溶性のタンパクや脂肪等を除いた。上清に対し、40％飽
和になるように硫酸アンモニウムを加え、氷中、１時
間、緩やかに撹拌した。沈澱をサーバルSS34ローター
（デュポン，米国）を用い４℃,15000rpmで遠心し、回
収後、バッファー１〔20mM Tris・HCl（pH7.9）,40mM N
aCl〕にタンパク濃度が10〜15mg/mlとなるように溶か
し、バッファー１に対して４℃，一夜透析した。この液
を、バッファー１によって平衡化したDEAE−セルロース
DE52（ワットマン，米国）に通し、吸着させた。溶出は
バッファー１と0.4M NaClを含むバッファー１との濃度
勾配により行った。イムノグロブリン画分を回収し、40
％飽和の硫酸アンモニウム添加により沈澱させ、沈澱を
バッファー２（0.1M NaHCO3）にタンパク濃度が10〜20m
g/mlになるようにとかし、バッファー２に対し、４℃で
二夜透析した。透析後は一夜ごとに交換した。
さらに、ハイドロキシアパタイトカラム（HCA−カラ
ム）によってさらに精製した。この時、開始バッファー
として10mMリン酸ナトリウム（pH6.8）を用い、溶出バ
ッファーとしては500mMリン酸ナトリウムバッファー（p
H6.8）を用いた。溶出は、開始バッファーから溶出バッ
ファーへの直線的濃度勾配により行った。抗体を含む分
画は、４℃に保存した。
実施例９ （抗体カラムを用いるhbFGFムテインの精
製） アフィゲル10（バイオラッド社製，米国）5mlを焼結
フィルター上にとり、吸引下,10倍容量の氷冷イソプロ
パノールで洗浄後、10倍容量の氷冷蒸留水で洗い、反応
器に移した。15mgのモノクローナル抗体MoAb78（実施例
８のバッファー2,またはリン酸バッファーに溶解したも
の）を５〜15ml加え、４℃一夜反応させた。反応液に0.
01Mになるようにモノエタノールアミン（pH8.0）を加
え、室温１時間反応させ、未反応反応基を不活性化し
た。このあとゲルを実施例８のバッファー２をゲルの10
倍容量用いて洗った。その後、2mlのゲルをカラムに詰
め初期バッファー〔20mM Tris・HCl（pH7.6）,1mM EDT
A,0.15M NaCl,0.05％NP40〕で平衡化した。
一方、参考例８（２）で得られたムテインCS4を含む
形失転換体Escherichia coli DH1/pTB744の培養液の抽
出液を、初期バッファーで３倍に希釈し、希釈液を上記
カラムに流速20ml/hで流し、吸着させた。吸着後、初期
バッファー20mlを用いてカラムを洗浄し、以後、高塩バ
ッファー〔20mM Tris・HCl（pH7.6）,1mM EDTA,1M NaC
l,0.05％NP40〕20ml,溶出バッファーＡ〔0.2M酢酸バッ
ファー（pH4.5）,0.2M NaCl〕20ml,溶出バッファーＢ
〔0.2M酢酸（pH2.5）,0.2M NaCl〕を順次通した。流速
は20ml/hで全過程は４℃で行った。
得られた画分につき、17.25％アクリルアミドの電気
泳動にかけた〔Laemmli,ネイチャー（Nature）277,680
（1970）〕。染色は銀染色法によった。結果を第10図に
示す。なお、第10図において、MKは分子量マーカーの、
Ａは粗抽出液の、Ｂは素通り画分の、Ｃは高塩濃度バッ
ファーによる溶出画分の、Ｄは溶出バッファーＡによる
溶出画分の、Ｅは溶出バッファーＢによる溶出画分の結
果をそれぞれ示す。D,E画分については、カラムから溶
出後、すぐに1M Tris・HCl（pH9.5）を加えて、pH7.5に
した。各画分を参考例５（３）記載の方法によりFGFの
活性を測定した。結果を第７表に示す。なお、第７表
中、Ａ〜Ｅは上述の第10図のそれらと同様である。
上記したことから、モノクローナル抗体MoAb78を用い
た抗体カラムは、bFGFムテインCS4を効率よく吸着する
ことが分かり、上記操作によりbFGFムテインCS4が精製
できたのである。
実施例10 （EIA法による、モノクローナル抗体を用い
るhbFGFムテインの定量） （１） 実施例４で得られたモノクローナル抗体78を腹
水から実施例８の方法により精製した。このようにして
得られた抗体を2mg/ml以上になるように濃縮し、次いで
0.2Mリン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）に対して透
析した。2.8mg/mlのモノクローナル抗体MoAb78 1.4mlに
対し、11.5mg/mlとなるようNN′−ジメチルホルムアミ
ド（DMF）に溶解したＳ−アセチルメルカプトサクシニ
ックアンヒドリド（Aldrich社，米国）を50μ加え
た。反応器の空気を窒素ガスに置換し、密栓後、室温で
一時間撹拌し、SH基を導入した。未反応のＳ−アセチル
メルカプトサクシニックアンヒドリドを130μの0.2M
Tris・HCl（pH7.0）,13μの0.2MEDTA,130μの2Mヒ
ドロキシアミン（pH7.0）を加え室温10分処理し、不活
化した。モノクローナル抗体MoAb78は、セファデックス
Ｇ−25（径1cm×80cm,ファルマシア社，スエーデン）を
充填したゲルろ過カラムにより分取した（流速20ml/
h）。
（２） 西洋ワサビパーオキシダーゼ（以下HRP,ベーリ
ンガーマンハイム社，西ドイツ,Grade I）10mgを1.4ml
の0.1Mリン酸バッファー（pH6.8）に溶解した。Ｎ−
（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）マレイミドの
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル 14mgを335μ
のDMFに溶解し、このうち100μをHRP溶液に加え
た。反応器の空気を窒素置換し、密栓後、室温で１時間
撹拌した。この後、セファデックスＧ−25を充填したゲ
ルろ過カラム（前出）により、マレイミド基を導入した
HRP画分を分取した。
（３） 上記（１）においてSH基を導入した抗体MoAb78
画分6mlと上記（２）においてマレイミド基を導入したH
RP画分2mlを混合し、コロジオンバッグ（ザルトリウス
社製，西ドイツ）を用いて減圧下、1mlに濃縮し、４℃,
20時間反応させた。反応後、HRPが導入された抗体をウ
ルトロゲルAcA44（LKB社製，スエーデン，径1cm×80c
m）にかけ分離した（流速10ml/h）。溶出ピーク画分の
うち抗体１分子あたりのHRP数が最も多い画分は、2.4HR
P/抗体であった。これを次の（４）のEIAに使用した。
（４） MoAb52を上記（１）と同様の方法により精製し
た。このMoAb52を10μg/ml又は20μg/mlとなるようPBS
で希釈し、イムノプレート（ヌンク社，デンマーク）に
100μ／ウエル注入し、４℃，一夜静置することによ
り吸着させた。吸着しなかった抗体を除去した後、BPS
で３回洗浄し、0.01％メルチオレート,1％牛血清アルブ
ミン（BSA）を含むPBSを200μ／ウエル加え４℃一夜
放置した。
（５） 参考例３で得られたヒトbFGFを0.1％BSAを含む
PBSで希釈した。上記（４）で作製したプレートよりBSA
溶液を取り除き、PBSで４回洗浄後、希釈したヒトbFGF
を100μ／ウエル加え、４℃一夜吸着を行った。未反
応のヒトbFGFを除去後、PBSで４回洗浄し、上記（３）
で作製したHRP結合抗体（HRP−MoAb78）を0.1％BSAを含
むPBSで1/300希釈し、100μ／ウエル加え、室温４時
間反応させた。抗体を除去後、PBSで６回洗浄し、パー
オキシダーゼ基質（Bio Rad社，米国）を100μ／ウエ
ル加え発色，比色定量した。
（６） 第11図は、プレートに固定したモノクローナル
抗体MoAb52の量が である場合のbFGFの検出曲線を示している。横軸は、加
えたbFGF濃度、縦軸はHRP−MoAb78によって発色した吸
光度を表わす。この図より、２μg/ウエルでMoAb52をプ
レートに吸着させた場合、0.5ng/mlの濃度のbFGFを検出
できることがわかった。
（７） 上記（４）の方法でMoAb98をプレートに２μg/
ウエル吸着させ、上記（５）の方法でbFGFを比色定量し
た。第12図は、その結果を示す。横軸，縦軸は上記
（６）の第11図と同じことを表わしている。この図か
ら、MoAb98はMoAb52と同様に少なくとも0.5ng/mlの濃度
のbFGFを検出できることがわかった。
実施例11 （EIA法による、モノクローナル抗体を用い
るhbFGFムテインの定量） 参考例13で得られたヒトbFGFムテインC86を含有する
抽出液を、実施例９と同様に処理し、ムテインの発現量
を検討した。その結果、C86は大腸菌内で微量であるが
発現していることがわかった。
実施例12 （EIA法による、モノクローナル抗体を用い
るhbFGFムテインの定量） 参考例14で得られたヒトbFGFムテインC129を含有する
抽出液を、実施例９と同様に処理し、検討した。その結
果、ムテインC129は大腸菌内で微量生成していることが
分かった。
実施例13 （ウェスタンブロッティングによるhbFGFの
検出） 参考例３記載の方法で得たhbFGFを17.25％アクリルア
ミドゲル電気泳動（Laemmli,U.K.（1970）Nature 277,6
80−685）した後、ザルトブロット（ザルトリウス社，
西独）を用い、ニトロセルロース膜上にトランスファー
した〔Kyshse−Anderson,J.ジャーナル・オブ・バイオ
ケミカル・アンド・バイオフイジカル・メソッズ（Jour
nal of Biochemical and Biophysical Methods），10,2
03−209（1984）〕。この膜をTBS〔20mM Tris・HCl（pH
7.5）,0.5M NaCl〕で５分ずつ２回洗い、４％BSAを含む
TBS中で室温１時間放置し、膜上の未反応部分をブロッ
クした。0.05％トゥイーン20を含むTBS（TTBS）で５分
ずつ２回洗った。実施例４で得たモノクローナル抗体Mo
Ab12,またはMoAb78を、１％ゼラチンを含むTTBSで3000
倍希釈した液に、上記のニトロセルロース膜を入れ、室
温で一夜反応させた。反応液をとり除き、TTBSで５分ず
つ２回膜を洗い、その後１％ゼラチンを含むTTBSで3000
倍に希釈した２次抗体,HRP標識抗マウスIgGヤギ血清
（バイオラッド社，米国）を加え、室温で１時間反応を
行った。膜をTTBSで５分ずつ３回洗浄し、さらにTBSで
５分ずつ２回洗い、その後、発色剤として0.05％ 4−ク
ロロ−１−ナフトール,0.015％過酸化水素を加え15分間
反応を行った。
第13図にモノクローナル抗体MoAb78を１次抗体として
用いた時のウェスタンブロッティングの結果を示す。レ
ーン１には１μｇのhbFGFを,2には300ngのhbFGFを,3に
は100ngのhbFGFをそれぞれ泳動し、トランスファーして
いる。Ｍはマーカーを表わし、左側の数字はその分子量
である。
なお、上記MoAb78のかわりにMoAb12を用いた場合も同
じ感度でbFGFを検出することができた。
発明の効果 本発明のモノクローナル抗体は、bFGFに対し特異的に
結合するので、bFGF測定用試薬,bFGFの精製に有利に使
用できる。
さらに、本発明のモノクローナル抗体において、抗体
結合価の高いものは、bFGF測定用試薬として用いる際
に、同時に用いる他の試薬例えば抗血清の使用量が少な
くて済む利点がある。また、bFGFの精製をより高度に行
なうことができる利点がある。
【図面の簡単な説明】
第１図は、参考例１で得られたヒトbFGFをコードする塩
基配列と、それから推定されるアミノ酸配列を示す。 第２図は、実施例５で得られたポリアクリルアミドゲル
電気泳動による免疫沈降パターンを示す。 第３図は、実施例６で得られた抗体結合価を示す。 第４図は、実施例７で得られた、各種ペプチドのMoAb12
に対する競合的結合阻害実験の結果を示す。 第５図は、実施例７で得られた、各種ペプチドのMoAb52
に対する競合的結合阻害実験の結果を示す。 第６図は、実施例７で得られた、各種ペプチドのMoAb78
に対する競合的結合阻害実験の結果を示す。 第７図は、実施例７で得られた、各種ペプチドのMoAb98
に対する競合的結合阻害実験の結果を示す。 第８図は、実施例７で得られた、bFGFムテインのMoAb52
に対する競合的阻害実験結果を示す。 第９図は、実施例７で得られた、bFGFムテインのMoAb98
に対する競合的阻害実験結果を示す。 第10図は、実施例９で得られた、電気泳動パターンを示
す。 第11図は、実施例10で得られた、MoAb52,HRP−MoAb78を
用いたEIAによるbFGFの定量結果を示す。 第12図は、実施例10で得られた、MoAb98とHRP−MoAb78
を用いたbFGFの定量結果を示す。 第13図は、実施例12で得られた、モノクローナル抗体Mo
Ab78を用いたウェスタンブロッティングの結果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ. ５［10］（1986）Ｐ．2523−2528 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ 82（1985）Ｐ．6507−6511 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳｉＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の性質を有し、塩基性線維芽細胞増殖因
    子（bFGF）に特異的に結合するモノクローナル抗体： （ａ）分子量：約140〜160キロダルトン、 （ｂ）酸性線維芽細胞増殖因子と交差反応しない、 （ｃ）免疫グロブリンクラスがIgGに属する、 （ｄ）それぞれハイブリドーマHbF12（IFO 50142）、ハ
    イブリドーマHbF52（IFO 50143）、ハイブリドーマHbF7
    8（IFO 50144）およびハイブリドーマHbF98（IFO 5014
    5）によって産生されるMoAb12、MoAb52、MoAb78およびM
    oAb98からなる群から選ばれるモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】bFGFが、アミノ酸配列： を含むポリペプチドである請求項１記載のモノクローナ
    ル抗体。
  3. 【請求項３】ハイブリドーマHbF12（IFO 50142）によっ
    て産生され、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）に特異
    的に結合するモノクローナル抗体MoAb12。
  4. 【請求項４】ハイブリドーマHbF52（IFO 50143）によっ
    て産生され、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）に特異
    的に結合するモノクローナル抗体MoAb52。
  5. 【請求項５】ハイブリドーマHbF78（IFO 50144）によっ
    て産生され、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）に特異
    的に結合するモノクローナル抗体MoAb78。
  6. 【請求項６】ハイブリドーマHbF98（IFO 50145）によっ
    て産生され、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）に特異
    的に結合するモノクローナル抗体MoAb98。
  7. 【請求項７】ハイブリドーマHbF12（IFO 50142）、ハイ
    ブリドーマHbF52（IFO 50143）、ハイブリドーマHbF78
    （IFO 50144）およびハイブリドーマHbF98（IFO 5014
    5）からなる群から選ばれ、塩基性線維芽細胞増殖因子
    （bFGF）に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生
    するハイブリドーマ。
  8. 【請求項８】塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）で免疫
    したマウスの脾臓細胞と、マウスのミエローマとを融合
    し、クローニングすることを特徴とするハイブリドーマ
    HbF12（IFO 50142）、ハイブリドーマHbF52（IFO 5014
    3）、ハイブリドーマHbF78（IFO 50144）およびハイブ
    リドーマHbF98（IFO 50145）からなる群から選ばれ、塩
    基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）に特異的に結合するモ
    ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの製造法。
  9. 【請求項９】bFGFが、アミノ酸配列： を含むポリペプチドである請求項８記載の製造法。
  10. 【請求項１０】塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）で免
    疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエローマからなる
    クローン化されたハイブリドーマHbF12（IFO 50142）、
    ハイブリドーマHbF52（IFO 50143）、ハイブリドーマHb
    F78（IFO 50144）およびハイブリドーマHbF98（IFO 501
    45）からなる群から選ばれるハイブリドーマを液体培地
    中または、マウスの腹腔内で増殖し、モノクローナル抗
    体を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
    る、次の性質を有し、該因子に特異的に結合するモノク
    ローナル抗体の製造法： （ａ）分子量：約140〜160キロダルトン、 （ｂ）酸性線維芽細胞増殖因子と交差反応しない、 （ｃ）免疫グロブリンクラスがIgGに属する、 （ｄ）それぞれハイブリドーマHbF12（IFO 50142）、ハ
    イブリドーマHbF52（IFO 50143）、ハイブリドーマHbF7
    8（IFO 50144）およびハイブリドーマHbF98（IFO 5014
    5）によって産生されるMoAb12、MoAb52、MoAb78およびM
    oAb98からなる群から選ばれるモノクローナル抗体。
  11. 【請求項１１】bFGFが、アミノ酸配列： を含むポリペプチドである請求項10記載の製造法。
  12. 【請求項１２】次の性質を有し、塩基性線維芽細胞増殖
    因子（bFGF）に特異的に結合するモノクローナル抗体： （ａ）分子量：約140〜160キロダルトン、 （ｂ）酸性線維芽細胞増殖因子と交差反応しない、 （ｃ）免疫グロブリンクラスがIgGに属する、 （ｄ）それぞれハイブリドーマHbF12（IFO 50142）、ハ
    イブリドーマHbF52（IFO 50143）、ハイブリドーマHbF7
    8（IFO 50144）およびハイブリドーマHbF98（IFO 5014
    5）によって産生されるMoAb12、MoAb52、MoAb78およびM
    oAb98からなる群から選ばれるモノクローナル抗体、 を用いることを特徴とするbFGFの精製法。
  13. 【請求項１３】bFGFが、アミノ酸配列： を含むポリペプチドである請求項12記載の精製法。
  14. 【請求項１４】アフィニティークロマトグラフィーを行
    う請求項12記載の精製法。
  15. 【請求項１５】次の性質を有し、塩基性線維芽細胞増殖
    因子（bFGF）に特異的に結合するモノクローナル抗体： （ａ）分子量：約140〜160キロダルトン、 （ｂ）酸性線維芽細胞増殖因子と交差反応しない、 （ｃ）免疫グロブリンクラスがIgGに属する、 （ｄ）それぞれハイブリドーマHbF12（IFO 50142）、ハ
    イブリドーマHbF52（IFO 50143）、ハイブリドーマHbF7
    8（IFO 50144）およびハイブリドーマHbF98（IFO 5014
    5）によって産生されるMoAb12、MoAb52、MoAb78およびM
    oAb98からなる群から選ばれるモノクローナル抗体、 を用いることを特徴とするbFGFの検出、定量法。
  16. 【請求項１６】bFGFが、アミノ酸配列： を含むポリペプチドである請求項15記載の検出、定量
    法。
  17. 【請求項１７】酵素免疫測定法を行う請求項15記載の検
    出、定量法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２（１９８５）Ｐ．６５０７−６５１１
Ｔｈｅ ＥＭＢＯ．Ｊｏｕｒｎａｌ．５［１０］（１９８６）Ｐ．２５２３−２５２８

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