JP2760355B2 - 不均整誘導リポソーム - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 この出願は、1986年６月16日付で出願された先の共係
属中の出願番号874,575号の一部継続出願（continuatio
n−in−part）である。 発明の背景 本発明は二分子膜小胞体（vesicle bilayer）中のイ
オン化し得る脂質又はイオン化し得る蛋白質の二分子膜
透過（transbilayer）分配の調節をするための方法に関
する。特に、本発明は、ユニラメラ（unilamellar）小
胞体の内側又は外側のモノレイヤー（一分子膜,monolay
er）又はイオン勾配の膜透過に応じてマルチラメラ（mu
ltilamellar）小胞体（MLV）の最外部二分子膜のそれに
イオン化し得る脂質又はイオン化し得る蛋白質を局部化
するための方法を記載する。 リポソーム類は取り込まれた（entrapped）水性容量
を含有する脂質二分子膜で完全に閉鎖されている。リポ
ソーム類はユニラメラ小胞体（単一の二分子膜を有す
る）又はマルチラメラ小胞体（水性層によってその隣り
のものから各々分離された多層二分子膜によって特徴づ
けられるタマネギ−様構造）であることができる。その
二分子膜は疎水性“尾部”部位と親水性“頭部”部位と
を有する２つの脂質モノレイヤーから構成されている。
その二分子膜の構造は、その脂質モノレイヤーの疎水性
（非−極性）“尾部”が二分子膜の中心に配向し、一方
親水性（極性）“頭部”は水性相に配向しているもので
ある。 バンガム（Bangham）等〔ジャーナル オブ モレキ
ュラー バイオロジー（J.Mol.Biol.,）13,238−252（1
965）〕の最初のリポソームの調製は、リン脂質を有機
溶媒中に懸濁し、次いで蒸発乾燥させて、その反応容器
上にリン脂質膜を残留させることを包含する。ついで、
水性溶液の適当量が加えられ、混合物は“膨潤”され、
そして、その結果得られたマルチラメラ小胞体類（MLV
S）からなるリポソーム類は機械的手段で分散される。
この技術は、パパハジオパウロス（Papahadjopoulos）
等〔バイヒミカ・エト・バイオフィジカ・ウント・アク
タ（Biochim.Biophys.Acta.）135,624−638（1967）〕
によって記載された超音波処理された小さいユニラメラ
小胞体類及び大きいユニラメラ小胞体類の展開のための
基礎を提供する。 大きいユニラメラ小胞体類は、キュリス（Cullis）等
の1986年１月16日出願、PCT87/00238号、発明の名称
“ユニラメラ小胞体類の製造のための押出し技術”中に
記載された方法による押出し装置を用いて製造すること
ができ、この関連部分は参考にこの中に引用されてい
る。この技術によって作られた小胞体類LUVETSは、ポリ
カーボネート膜フィルターを通して、約700psiまでの圧
力下で押出される。これらの小胞体類は、その押出し技
術を行なう前に少なくとも１回の凍結と融解のサイクル
のさらされることができる；この操作は、バリィ（Ball
y）等の1987年１月15日出願、PCT87/00043号、発明の名
称“改良された取り込み効率を有するマルチラメラリポ
ソーム類”中に記載されており、参照されたい。 使用できる他の種類のリポソーム類は、実質的に同一
のラメラ溶質分配を有するものとして特徴づけられる。
この種類のリポソーム類は、レンク（Lenk）等の米国特
許第4,522,803号中で定義されている安定なプルリラメ
ラ（plurilamellar）小胞体（SPLV）、米国特許ファウ
ンティン（Fountain）等の第4,558,579号中に記載され
ている単相（monophasic）小胞体及びその小胞体が少な
くとも１回の凍結と融解のサイクルにさらされている凍
結及び融解マルチラメラ小胞体膜（FATMLV）のように呼
ばれている；この操作は、バリィ（Bally）等の1987年
１月15日付のPCT出願番号87/00043号、発明の名称“改
良された取り込み効率を有するマルチラメラリポソーム
類”中に記載されており、参照されたい。 種々のステロール類及びそれらの水可溶性誘導体類は
リポソーム類を形成するために用いられる。；特にジャ
ノフ（Janoff）等の1985年10月24日出願、PCT85/04578
号、発明の名称“ステロイド性のリポソーム類”を参照
するとよい。1985年３月14日付で公開されたWO85/00968
号のメイヒュー（Mayhew）等は、アルファー−トコフェ
ロール及びその或る種の誘導体を含有するリポソーム中
にそれらをカプセル包囲すること（encapsulating）に
よって、その薬剤の毒性を減少させるための方法を記載
している。又、種々のトコフェロール及びそれらの水可
溶性誘導体類がリポソーム類を形成するために用いられ
る；ジャノフ等の1987年４月23日出願、PCT87/02219
号、発明の名称“アルファー−トコフェロール−ベース
小胞体類”を参照されたい。 そのステロール小胞体類を調製するための方法は、水
性区画（compartment）を取り込む完全に閉鎖された二
分子膜を形成するのに十分な量で閉鎖された二分子膜を
形成できるステロールの有機酸誘導体の塩の形のものを
水性緩衝液に添加することを包含する。マルチラメラ小
胞体類の懸濁は、その混合物を振とうすることにより形
成される。その小胞体類の形成は、もしもその水性緩衝
液が、溶液中にその塩の反対イオンを又含むならば、容
易に行なわれる。 その懸濁物へのエネルギー、例えば超音波、又は、フ
レンチ圧力セル（フレンチプレス）もしくは、適当な大
きさの穴のフィルターを通してのその小胞体類の押出し
技術の適用は、そのマルチラメラステロール小胞体類を
ユニラメラ小胞体類に変換するであろう。 本発明は、膜透過pH勾配に対応して脂質の二分子膜透
過不均整を示す小胞体類、好ましくはユニラメラ小胞体
類の製造方法を提供する。或いは、MLVSではその最も外
部の二分子膜中でこの不均整を表すように作られること
ができる。 高められた薬剤動力学、持続した放出性、安定性及び
標的能力を有するリポソーム類の提供が常に望まれてい
る。 発明の要約 本発明は、イオン化し得る脂質又は蛋白質成分の分配
が、そのリポソーム類の外部二分子膜を構成する複数の
一分子膜（monolayers）間に調節されることができるリ
ポソーム類を作るための方法を記載する。そのような分
配は不均整であるように作られることができる。本発明
のリポソーム類は、そのような外部二分子膜類の一分子
膜類の間に不均整な分配でイオン化し得る脂質又はイオ
ン化し得る蛋白質を含有する外部の二分子膜を有する。
そのイオン化し得る脂質はスフィンゴシン又は、ステア
リルアミンのようなアミンのような塩基性であることも
でき、又は、リン脂質ホスファチジルグリセロール、ホ
スファチジリノシトール又はカルジオリピン、プロスタ
グランジン又はオレイン酸又はステアリン酸のような脂
肪酸のような酸性のものであることもできる。そのイオ
ン化し得る蛋白質は塩基性であることができる。数種の
型のリポソーム類は本発明の実施に用いることができ
る。それはFATMLVS、MPVS又はSPLVSのようなものであ
る。本発明のリポソーム類は又押出し技術にさらされる
こともできる。或いは、そのリポソーム類はユニラメラ
であることができる。 そのリポソーム類は生物活性剤を含有してもよい。そ
して、その生物活性剤自体はイオン化し得るものである
ことができる。そのリポソーム類は人間のような哺乳動
物に投与されることができる。 本発明のリポソーム類は、マルチラメラ又はユニラメ
ラである。マルチラメラリポソーム類は、公知の技術の
いかなる方法によっても作ることができ、そして、SPLV
S、凍結及び融解されたMLVS、REVS及びMPVSを含有する
ことができる。ユニラメラリポソーム類は凍結及び融解
技術続いて行なわれるポリカーボネートフィルター類を
通しての押出しにより形成することができる。 そのリポソーム類はイオン化し得る薬剤のような生物
活性剤を含有してもよい。そのようなイオン化し得る薬
剤類は、その二分子膜にまたがる（across）イオン勾配
の程度により、そのリポソーム類にそれ自身混ぜられ
る。或いは、薬剤類はそのリポソーム−形成操作の水性
液取り込み工程中に単に混ぜることもできる。本発明の
リポソーム類は、再水和及び使用するまで安定な型に長
期貯蔵のために脱水されることができる。そのリポソー
ム類は人間のような哺乳動物に投与されることができ
る。 図面の簡単な説明 第１図は10モル％DOPE含有POPCの小胞体類とTNBSの反
応の時間経過を示すグラフである。標識はクロマトグラ
フ法（閉鎖系統）又は分光光度法（開放系統）のいずれ
かで決定された。 第2A図は、その内側の取り込まれた水性媒体及び外側
の浴媒体の両者がpH8.5であるDOPC小胞体類中のTNBSに
よるステアリルアミンの標識を示すグラフである。 第2B図は、DOPC小胞体類中のTNBSに対するステアリル
アミンの標識に関し、その小胞体二分子膜（内側の取り
込まれた水性媒体pH5.0,外側の浴用媒体pH8.5）にまた
がるプロトン勾配の影響を示すグラフである。 第3A図は、その内側の取り込まれた水性媒体及び外側
の浴用媒体の両者がpH8.5であるDOPC小胞体類中のTNBS
に対するスフィンゴシンの標識を示すグラフである。 第3B図は、DOPC小胞体類中のTNBSに対するスフィンゴ
シンの標識に関し、そのベシクル二分子膜（内側の取り
込まれた水性媒体pH5.0,外側の浴媒体pH8.5）にまたが
るプロトン勾配の影響を示すグラフである。 第4A図は、その内側の取り込まれた水性媒体がpH10.0
であり、そしてその外側の浴媒体がpH7.0である時、LUV
sから〔¹⁴C〕オレイン酸を抽出するためのBSAの能力を
示すグラフである。 第4B図は、その内側の取り込まれた水性媒体及び外側
の浴用媒体の両者が共にpH7.0である時、LUVsから
〔¹⁴C〕オレイン酸を除去するためのBSAの能力を示すグ
ラフである。 本発明の詳細な説明 本明細書では次のような略語を用いている。 DOPE−ジオレオイル ホスファチジルエタノールアミン DOPC−ジオレオイル ホスファチジルコリン PE −ホスファチジルエタノールアミン PS −ホスファチジルセリン PC −ホスファチジルコリン SM −スフィンゴミエリン BSA −牛の血清アルブミン PI −ホスファチジリノシトール PG −ホスファチジルグリセロール CL −カルジオリピン REV −逆相蒸発小胞体 MPV −単相小胞体 MLV −マルチラメラ小胞体 SUV −小ユニラメラ小胞体 LUV −大ユニラメラ小胞体 LIVET−押出し技術により作られた大ユニラメラ小胞体 HEPES−Ｎ−２−ヒドロキシエチル ピペラジン−Ｎ′
−２−エタン スルホン酸 TNBS−トリニトロベンゼン スルホン酸 MTPP⁺−メチルトリフェニルホフホニウムカチオン TNP−PE−トリニトロフェニル化ホスファチジルエタノ
ールアミン 本発明のリポソーム類は、ユニラメラ小胞体、好まし
くは大ユニラメラ小胞体類である。しかしながら、小ユ
ニラメラ小胞体及びマルチラメラ小胞体も又用いること
ができる。 本発明中に用いられる脂質類はイオン化し得る脂質で
ある。イオン化し得る脂質類は酸性及び塩基性のものを
含み、水性環境中、約2.0と約14.0の間のpHにおいて、
脱プロトン化、或いはプロトン化することのできるもの
である。プロトン化又は脱プロトン化により、脂質は荷
電された脂質となる。そのようなイオン化し得る脂質
は、限定されるものではないが、ホスファチジルグリセ
ロール、ホスファチジン酸、及びそれらの誘導体、アミ
ン−含有脂質、ホスファチジルセリン、ホスファチジル
エタノールアミン及びホスファチジリノシトール；ステ
アリルアミン、スフィンゴシン、カルジオリピン、及び
その脂肪酸を含有する。炭素鎖の長さ及び不飽和度のい
ずれの脂肪酸も用いることができる；例えば、それらの
脂肪酸は約６から約22個の炭素原子、最も好ましくは約
12から約18個の炭素原子を有し、そして、約０から約４
個の二重結合、最も好ましくはステアリン酸及びオレイ
ン酸のような約０から約１個の二重結合を有するもので
ある。用いることのできる他のイオン化し得る脂質類
（二分子膜構成要素）は胆汁酸類及びプロスタグランジ
ン類である。そのプロスタグランジン類はそれらの前駆
体物質アラキドン酸、及びそれらと構造類似物質は勿論
その代謝物質、及び合成酵素抑制剤を含有する。そのプ
ロスタグランジンという言葉は又プロスタサイクリン類
（prostacyclines）及びロイコトリエン類（leukotrien
es）は勿論天然に生成するプロスタグランジン類に構造
的に関連のある合成化合物も含有する。 さらに、使用できる他のイオン化し得る二分子膜構成
要素はステロール又はトコフェロールの有機酸誘導体、
好ましくはそれぞれコレステロール又はトコフェロール
のコハク酸半エステルの塩の形態である。電荷のない又
はその用いられるpHにおいてイオン化し得ない天然脂質
は、本発明において用いることができ、ホスファチジル
コリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、スフィン
ゴミエリン、コレステロール及びそれらの誘導体のよう
なリン脂質を含むが、それらに限定されない。イオン化
し得る蛋白質（その“蛋白質”なる言葉はペプチド又は
ポリペプチドを包含する）のような非−脂質物質類が又
使用され得る。そのような蛋白質類（ペプチド及びポリ
ペプチドを包含する）はその蛋白質類の誘導体、類似物
及び断片は勿論その鎖中に天然に生成する物質と比べ
て、置換されたアミノ酸を有するものも又含有する。そ
のような蛋白質類は酸性又は塩基性のものを含有し、そ
して、プロトン化又は脱プロトン化され得る。そのよう
な蛋白質類は、これらに限定されるものではないが、ア
ルファ、ベーター及びガンマーインターフェロン類、イ
ンターロイキン２、インターロイキン１、コロニィー刺
激因子、腫瘍壊死因子、ヒストン蛋白質及びウシの成長
ホルモン、ヒト成長ホルモン及びブタ成長ホルモンのよ
うな成長ホルモンを包含する。これらの蛋白質類はすべ
てイオン化し得る基を有し、それ故、本発明の実施に有
用である。本発明において最も好ましく用いられるもの
は、蛋白質類、オキシトシン、バソプレシン、アルギニ
ン、バソプレシン、カルシトニン及びアルファー−アト
リアル（atrial）ナトリウム利尿性因子（natriuritic
factor）である。 リポソーム類の調製中、有機媒体が脂質を懸濁するた
めに用いることができる。適当な有機溶媒はその脂質を
可溶化する種々の極性及び誘電性を有するものであり、
そして、限定されるものではないが、クロロホルム、メ
タノール、エタノール、ジメチルスルホキシド（DMS
O）、メチレンクロライド、及びベンゼン：メタノール
（70:30）のような溶媒混合物を含有する。その結果と
して、その脂質を含有する溶液（その脂質と他の成分が
均一にすっかり分散されている混合物）が形成される。
溶媒類はそれらの生物適合性（biocompatability）、低
毒性、及び溶解能力を基準にして選択される。 リポソーム類は、脂質二分子膜により取り囲まれてい
る水性媒体を取り込む。その水性媒体は、例えば、水又
は溶解した塩又は緩衝液を含有する水であることができ
る。そのような塩又は緩衝液の例は塩化ナトリウム及び
リン酸塩緩衝整理的食塩水（PBS）であることができ
る。他の緩衝剤はそれに限定されないがホウ酸塩、クエ
ン酸塩及びトリス−HClトリス−（ヒドロキシメチル）
−アミノメタン ハイドロクロライド）及びHEPES（Ｎ
−２−ヒドロキシエチル ピペラジン−Ｎ′−２−エタ
ンスルホン酸）を包含する。緩衝液は約2.0と約14.0の
間のpH範囲であることができる。好ましい具体例におい
ては、その調製物はHEPES緩衝剤（150mMNaCl、20mMHEPE
S）,pH7.0、ホウ酸塩緩衝剤（100mMNa₂HCO₃、50mMH₃B
O₃）,pH8.5、又はクエン酸塩緩衝剤（150mMクエン酸ナ
トリウム））,pH8.5で水和される。 リポソーム−薬剤体内輸送システムにおいて、その薬
剤はそのリポソーム中に取り込まれ、そしてそれから治
療されるべき患者に投与される。例えば、ラアマン（Ra
hman）等の米国特許第3,993,754号明細書；シールスの
米国特許第4,145,410号明細書；パパハジオポウロス（P
apahadjiopoulos）等の米国特許第4,235,871号明細書；
シュネイダーの米国特許第4,224,179号明細書；レンク
（Lenk）等の米国特許第4,522,803号明細書、及びファ
ウンテイン等の米国特許第4,588,578号明細書を参照さ
れたい。 実質的に、いかなる生物活性剤も本発明により用いら
れるリポソーム類中に取り込まれることができる。その
ような薬剤はゲンタマイシン（gentamycin）のような抗
バクテリア性化合物、リファムパシン（rifampacin）の
ような抗ウイルス性化合物、アムホテリシン（amphoter
icin）Ｂのような抗真菌性化合物、アンチモン誘導体の
ような駆虫薬、ビンブラスチン、ビンクリスティン、ミ
トマイシンＣ、ドキソルビシン、ダウノマイシン、メト
トレエクゼイト（methotrexate）、及びシスプラチニウ
ムのような抗新生物発生化合物、とりわけ、アルブミン
のような蛋白質、ジフテリア毒素のような毒素、カタラ
ーゼのような酵素、エストロゲンのようなホルモン、ア
セチルコリンのような神経伝達物質、アルファー、リポ
蛋白質のようなリポ蛋白質、ヒアルロン酸のような糖蛋
白質、IgGのようなイムノグロブリン、インターフェロ
ン又はインターロイキンのような免疫調節剤、アルセナ
ゾIIIのような染料、¹⁴Cのような放射線標識、⁹⁹Teのよ
うな放射線−不伝導性化合物、カルボキシフルオロセイ
ンのようなケイ光指示化合物、グリコーゲンのようなポ
リサッカライド、エストローゲン受容体蛋白質のような
細胞受容体結合分子、インドメタシン、サルチル酸アセ
テート、イブプロフェン、スリンダック（sulindac）、
ピロキシカム及びナプロキセンのような非−ステロイド
性抗炎症剤；デクサメタゾンのような抗炎症剤、チモロ
ール又はピロカルピンのような抗緑内障剤、ジブカイン
のような麻酔剤、チミンのような核酸、RNAポリマーの
ようなポリヌクレオチドを含むが、それらに限定される
ものではない。 本発明のリポソーム類は脱水することができ、それに
より、使用するまでの延長された期間の間貯蔵すること
ができる。標準的凍結−乾燥設備又は同等の装置がその
リポソーム類の脱水に用いられる。リポソーム類は又減
圧下にそれらを置くことにより簡単に脱水され得る。或
いは、そのリポソーム類及びそれらの周囲の媒体は脱水
の前に液体窒素中で凍結することができる。先行する凍
結を伴う脱水は、ジヤノフ等の1986年２月27日付出願、
PCT86/01103号、発明の名称“脱水されたリポソーム
類”の操作により、その調製物中に一つ又はそれ以上の
保護糖の存在下で行なうことができる。使用される保護
糖の例は、トレハロース、マルトース、シュークロー
ス、グルコース、ラクトース及びデキストランを含有す
るが、それらに限定されるものではない。或いは、マル
チラメラベシクル類は、保護糖の存在下或いは不存在下
で先行する凍結を行なって脱水されることができる。そ
の脱水されたリポソーム類が用いられる時、再水和は、
そのリポソームに水性溶液、例えば蒸留水を単に加えて
行なわれ、そして再水和される。 本発明によれば、イオン化し得る脂質又はイオン化し
得る蛋白質（弱酸又は弱塩基）を含有する小胞体類は調
節されたpHの水性環境中で作られ、ついで、比較的より
高い酸性或いは比較的により高い塩基性のpHの溶媒体に
さらされる。このように、濃度勾配は、外部の水性
（浴）媒体のそれとは異なるpHの内部水性（取り込まれ
た）媒体を有する膜を通して形成される。 それを通して或るpH勾配が存在する本質的に不浸透性
の脂質膜を通した弱酸又は弱塩基の移動の現象は、ヘン
ダーソン ハッセルバッハ（Henderson Hasselbach）の
式に記載されているように生ずる。その結果、ユニラメ
ラ小胞体中において、充填された脂質は、優先的に他の
ものをこえて一方のモノレイヤーに移ってヘンダーソン
−ハッセルバッハの平衡定数〔ニコルス、生物エネルギ
ーに関する（In:Bioenergetics）：化学浸透説の導入、
アカデミック プレス、N.Y.1982〕に達するであろう、
その結果不均整二分子膜を有するリポソームが得られ
る。例えばその小胞体類の内部の水性媒体がその外部水
性媒体に関して酸性であるとき、ステアリルアミン及び
スフィンゴシンのようなプロトン化されることのできる
脂質はその内部モノレイヤー中に直ちに隔離される。或
いは、その内部モノレイヤーに対して、ホスファチジル
グリセロール（PG）、ホスファチジルイノシトール（P
I）、カルジオリピン、胆汁酸、プロスタグランジンの
ような酸性脂質及びオレイン酸やステアリン酸のような
脂肪酸の内部のモノレイヤーへの局在化と一致する結果
が、内部の水性媒体が、その外部の水性媒体に関して塩
基性である小胞体に対して観察される。マルチラメラ小
胞体類においては、その最も外側の二分子膜はこの不均
整を表すであろう。 特に、リポソーム類に適用するとき、その二分子膜を
通して脂質及び生物活性剤を包含する弱酸及び弱塩基の
分配は、中性の形において、その膜を浸透するそれらの
能力に基ずくものであり、ヘンダーソン−ハッセルバッ
ハの平衡式に従う膜移動濃度に達する： 式中、AH⁺はプロトン化されたアミンを含むもののよ
うなプロトン化された脂質又は生物活性剤を表し、下に
書いたｉ及びｏはそれぞれ小胞体の内部及び外部を表
す。ステアリルアミン及びスフィンゴシンのようなアミ
ン−含有脂質、又は塩基性生物活性剤の場合には、その
膜へのそれらの局部化は、そのプロトン化されたアミン
の二分子透過の位置がその膜の内部表面におけるその内
部及び外部のプロトン濃度に反映する再分配と同様の結
果となる。 これらのアミン−含有脂質の透過膜分配に著しく影響
するpH勾配の能力は、或る種のリン脂質及び脂肪酸のよ
うな弱酸である脂質の透過膜分配が透過膜pH値に強く依
存することを示す。中性（プロトン化された）の形はそ
の膜を透過することができるので、これは次式によって
透過膜度合に起因するであろう。 式中、RCOO^-はプロトン化されていない脂肪酸を表
す。その内部が塩基性であるpH勾配を示す小胞体類にお
いて、それ故、脂肪酸はその内部のモノレイヤーに移動
する。 イオン化し得る脂質又は蛋白質が又移動され、イオン
化し得る薬剤がNa⁺／K⁺濃度勾配に従ってリポーム中に
充填された。そのような場合に、その膜を通して存在す
るNa⁺／K⁺拡散電位は、拡散するK⁺イオンの代りに膜中
にイオン化した種を入り込ませることができる。 本発明の方法は、調節されたpHで、イオン化し得る脂
質又はイオン化し得る蛋白質を含有するリポソーム類の
形成を必要とするものである。例えば、そのように荷電
された脂質類はステアリルアミン又はスフィンゴシン又
はリン脂質又はオレイン酸又はスアリン酸のような脂肪
酸であることができる。そのイオン化し得る脂質類は、
リポソーム類を形成するために用いられる全脂質の約１
モル％から約50モル％、好ましくは５−10モル％の割合
であることができる。そのイオン化し得る脂質類は約1:
1モル比までの割合であることができる。 その標識剤（labeling agent）TNBSはイオン化し得る
脂質の二分子膜透過移転を追跡するために用いられる。
リポソーム類の形成に続いて、その選択した水和された
脂質に対して、標識剤TNBSの標本が添加され、そのもの
とペプチド類又はリン脂質類かのいずれかのアミノ基と
の反応性がクロマトグラフ的に又は分光光度計的に定量
することができる。荷電された（Charged）脂質を含有
するTNBS−標識されたリポソーム類は形成緩衝剤（比較
的より酸性又はより塩基性）とは異なるpHの浴媒体にさ
らされた。転移されるべきイオン化し得る脂質又は生物
活性剤が負に荷電される場合に、その形成緩衝剤は約8.
0から約pH14.0、好ましくは約pH8.0から約pH11.0、最も
好ましくは約pH10.0のpHであって、塩基性であろう。形
成後、そのリポソーム類は、より酸性のpHの緩衝液に、
約2.0からpH7.5、好ましくは約pH2.0から約6.0、最も好
ましくは約pH5.0においてさらされる。 或いは、転移されるべき脂質が正に荷電されたもので
あるとき、用いられるその形成緩衝剤はpH約2.0から約p
H7.5、最も好ましくはpH5.0であって、酸性であった。
形成後、そのリポソーム類は、約pH7.5から約pH14.0、
最も好ましくは約pH8.0のより塩基性のpHの緩衝液にさ
らされる。そのような交互のpHの緩衝液にリポソームを
さらす処理は、ゲルろ過カラム上か又はその緩衝液中に
直接小胞体類を浸すことにより直接行うかのいずれかに
より実施されることができる。 二分子膜を通して転移されるべき脂質がホスファチジ
ルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、又はカ
ルジオリピンのようなリン脂質であるとき、次のような
操作が続いて行なわれる。リポソーム好ましくはユニラ
メラリポソーム類を形成するための技術の上記のいずれ
の方法かによって、イオン化し得るリン脂質を含有し、
そしてpH8.0の緩衝液、例えば300mMリン酸塩緩衝液を含
有するリポソーム類が形成される。荷電された（イオン
化し得る）脂質を含有するこのような標識リポソーム類
はついで形成媒体のそれとは異なるpHの浴媒体にさらさ
れた。転移されるべきリン脂質は負に荷電されるので、
その形成緩衝液は、約6.0から約10.0のpH、好ましくはp
H8.0であって、塩基性である。リポソーム形成後、その
リポソーム類は、より酸性のpH、即ち、約pH3.0から約
6.0、好ましくは約pH4.0の緩衝液にさらされる。その媒
体の酸性化と同時に、そのリポソーム懸濁液は約30℃か
ら約60℃に約10分間加熱される。その懸濁液が約37℃に
加熱される時、その懸濁液はその温度に約12時間保持さ
れる。その懸濁液はついで約25℃に冷却される。 イオン化し得る脂質を転移するのに用いられたと同じ
操作がイオン化し得る蛋白質に対しても用いることがで
きる。一方又は他方のモノレイヤーへの荷電された脂質
の好ましい転移は、TNBSによりアミノ−含有脂質の標識
化することにより分光光度測定により検出される。或い
は、その不均整性は、DEAEセファセル（sephacel）イオ
ン交換を用いてイオン交換により証明されることができ
る（実施例８参照）。 本発明のリポソーム類は又、その関連部分が参考にこ
の中に導入されたバレイ等の発表、1986年２月26日付出
願、PCT86/01102,発明の名称“リポソームにおけるアン
チネオプラスチック剤のカプセルへの取り込み”によ
り、イオン化剤と共に遠隔操作して充填されることがで
きる。この操作において、透過膜電位は形成中そのリポ
ソーム類の二分子膜を通して創造され、そしてそのイオ
ン化剤はその透過膜電位によりそのリポソーム中に充填
される。この電位は、リポソーム膜にまたがって一つ又
はそれ以上の荷電された種（即ち、Na⁺、K⁺及び／又はH
⁺）のため濃度勾配を創造することによって生じせしめ
られる。或いは本発明においては、そのリポソームの内
部モノレイヤーは、その内部モノレイヤーにイオン化し
得る脂質又はイオン化し得る蛋白質の透過膜移動のため
にすでに荷電されている。イオン化し得る生物活性剤は
この荷電に応じて充填することができ、一方、これらの
薬剤を取り込んでいるリポソーム類の膜不均整はその勾
配により負荷されたこの荷電に応じて変化する。それ
故、両方法、即ち、イオン化剤と共にリポソームを充填
すること及びリポソーム膜中に不均整を導入することを
同時に実施することができる。両方法はそのリポソーム
類に適用されたpH値（勾配）によって調節され得る。そ
の内部及び外部水性媒体の間に適用された相違する各pH
単位のために、そのイオン化剤（脂質、蛋白質及び薬
剤）のカプセル包囲において10倍の相違がある（10:1、
内部：外部）。そのpHの相違は２つの単位の相違に増加
するので、そのイオン化剤の内部：外部の濃度は100:1
に増加し、そして、pH相違が３及びそれ以上の単位へと
進んでいく。イオン化し得る脂質又は蛋白質又は取り込
まれたイオン化剤は、この勾配に応じて問題の二分子膜
（即ち、ユニラメラ リポソームの単一二分子膜又はマ
ルチラメラ リポソームの最も外側の二分子膜）の内部
モノレイヤーに転移される。 医薬は、投与の計画されたルート及び標準的薬学のプ
ラクティスの点で選ばれた薬学的に許容し得る担体と共
に混合されて、リポソーム内部に与えられる。リポソー
ム類中に取り込まれた時のこれらの医薬の１回分の投薬
量は、その薬剤単独の場合の投薬量と同じであろう。投
薬量は患者の年齢、体重及び体調に応じて処方医により
定められるであろう。担体に対する活性成分の比例割合
は本来、その熟考された投薬量と同様に、その活性成分
の化学的性質、溶解性、及び安定性に依存する。投与の
経口型のために、本発明のリポソーム組成は錠剤、カプ
セル、ひし形の錠剤、トローチ、粉末、シロップ、エリ
キシル、水溶液及び水懸濁液及びその類似物の形で用い
ることができる。錠剤の場合、用いることのできる担体
はラクトース、クエン酸ナトリウム、及びリン酸塩を含
む。澱粉のような種々の膨化剤（disintegrants）及び
ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及
びタルクのような潤滑剤は、通常、錠剤中に用いられ
る。カプセルの形の口径投与のために、有用な希釈剤は
ラクトース及び高分子量のポリエチレングリコールであ
る。水性懸濁液が経口使用のため必要とされる時には、
或る種の甘味剤及び／又は風味剤が加えられることがで
きる。非経口的投与又は静脈、腹腔内、筋肉内、皮下又
は乳線内のルートを経由する注射のために、そのリポソ
ーム組成物の無菌溶液が調製される。静脈用のために、
その溶質の全濃度は調整等張溶液を与えるように調節さ
れなければならない。 それらの使用の他の例において、小胞体−取り込み化
合物は、それらに限定されないが、ゲル、油、エマルジ
ョン及びその類似物を含有する問題の投薬の形の広い範
囲で組入れられることができる。例えば、取り込まれた
化合物を含有する懸濁液は、そのリポソーム調整におけ
る成分としてその水性相に加えられることができる。そ
のような調整は、直接の適用のために、問題のクリーム
類、軟こう類、ゲル類、ローション類及びその類似物と
して投与されることができる。 或いは、本発明のリポソーム類は試験管内診断薬とし
て用いられることができる。 次の実施例は単に例示のために与えられるものであ
り、本発明の範囲を限定するためのものではない。 物質及び方法 脂質 ホスファチジルグリセロール，ジオレオイルホスファ
チジルコリン（DOPC）及びジオレオイルホスファチジル
−エタノールアミン（DOPE）はアバンチ ポーラー リ
ピッド（バーミンガム，アラバマ）から購入された。〔
¹⁴C〕−標識DOPEは、ホスホリパーゼＤを用いて、DOPC
及び〔¹⁴C〕−エタノールアミン（両者ともニューイン
グランド ヌクレア（NEN），ボストン，マサチューセ
ッツ，から得られた）とから、そのコリンの頭部の基を
エタノールアミンと交換して調製された。その結果、得
られた〔¹⁴C〕−標識DOPEはCMセルロースで精製され
た。コレステロール、ステアリルアミン、スフィンゴシ
ン、ステアリル酸及びオレイン酸は、シグマ（セント
ルイス）から得られ、さらに精製することなく用いられ
た。〔³H〕−ジパルミトイルホスファチジルコリン（〔
³H〕−DPPC）、〔¹⁴C〕−オレイン酸及び〔¹⁴C〕−ステ
アリン酸は、又NENから購入された。 実施例１ ベシクルの調製 大きなユニラメラ小胞体類はホープ（Hope）等のバイ
オケミカル バイオフィジックス アクタ（Biochim.Bi
ophys.Acta），812,p55−65（1985）にあるような押し
出し技術によって調製された。その押し出し装置は、リ
ペックス バイオメンバランス インク バンクーバー
カナダから得られた。化学的標識化の研究に続くクロ
マトグラフ分析のために、DOPC及び10モル％〔¹⁴C〕−D
OPEがクロロホルム中で混合され、真空下で膜となるま
で乾燥された。緩衝液（150mMNaCl,20mM HEPES,pH7.0）
が、その乾燥された膜に加えられ、10uモルリン脂質/ml
のリポソームの懸濁液を与えた。ついで、そのリポソー
ム類は、その関連部分がこの中に参考に導入されている
バリィ等の1985年11月21日付米国特許出願、出願番号80
0,545号、発明の名称“改良された取り込み効率を有す
るマルチラメラリポソーム類”中に記載されたような、
交互に行なう液体窒素及び温水処理のサイクルを用い
て、５回の凍結−融解を行なった。その小胞体類は、そ
れに続いて、キュリス（Cullis）等の1985年10月16日付
米国特許出願番号788,017号、発明の名称“ユニラメラ
小胞体類を製造するための押し出し技術”に記載されて
いるような、２つの積み重ねられた0.1umの穴の大きさ
のポリカーボネートフィルター〔ヌクレポア（Nuclepor
e）〕を通して10回押し出された。その結果得られたLUV
sは、平均直径100nm（光拡散技術で測定）及び取り込み
容量約1.5ul/uモル リン脂質を示した。 試験操作 PEのTNBS標識のためのクロマトグラフ分析評価 DOPC及びDOPE（〔¹⁴C〕−DOPEの痕跡量を含む1:9モル
比）がクロロホルム中に混合され、LUVsが実施例１に記
載のようにして調整された。その小胞体懸濁液の2uモル
（200ul）が、100mM炭酸水素ナトリウム（NaHCO₃）中の
0.5mMトリニトロベンゼン スルホン酸（TNBS）（シグ
マ）、50mMホウ酸（H₂BO₃）、pH8.5の80μｌに加えられ
た。その混合物は室温で30分間培養し、そして、20mMエ
タノールアミン20μｌが加えられ、その混合物は渦巻き
処理され、約２分間静置された。脂質は、ブリフおよび
ダイヤー抽出操作〔カテス、エム，リピドロジーにおけ
る技術：脂質の単離、分析及び確認（In:Technique in
Lipidology:Isolation,Analysis and Identification o
f Lipids）エルセビニル、N.Y.1972〕を用いて、その水
性混合物から抽出された。得られたクロロホルム抽出物
は窒素下で乾燥され、そして、クロロホルム50μｌ中に
懸濁された。その全抽出物は、予め、コートされたシリ
カゲル60の薄層クロマトグラフ板（20cm×20cm）に適用
され、そして続いて、クロロホルム／メタノール/27％
アンモニア溶液／水（900:300:57:53,v/v）からなる流
出溶媒中に展開された。そのクロマトグラフ法が完了し
た時、そのプレートは乾燥され、飽和ブタノール中の0.
2％ニンヒドリン溶液でスプレイされた。そのガラスプ
レートは、脂質を含むアミノの明瞭なピンクのスポット
が見られるまで加熱して展開された。そのトリニトロフ
ェニルかされたホスファチジルエタノールアミン（TNP
−PE）はその溶媒の最前部近くに黄色のスポットとして
見ることができた。PE及びTNP−PEはよく分離され、そ
して２つの脂質を含有するシリカゲルは4mlのクロロホ
ルム／メタノール／水（60:40:10,v/v）中に直接吸引さ
れた。その渦巻き処理後、そのシリカは、２分間500gで
遠心分離してペレット化し、そしてその溶媒は20mlシン
チレーションガラス容器中に傾瀉法で移した。そのシリ
カペレットはもう一度抽出され、そして一緒にした溶媒
は窒素下50℃で乾燥された。各試料の活性は、パッカー
ド2000CAシンチレーション分析器（ユナイテッド テク
ノロジィズ カルフォルニア）を用いて測定された。こ
の方法は、大きいユニラメラ小胞体系における第一級ア
ミノ基を含有する脂質の透過膜分配を分析評価するため
のTNBS標識方法の確定性を確立した。pH勾配のないDOP
E:DOPC（1:9モル比）LUVs中のPEの50％はこのクロマト
グラフ分析評価方法を用いて標識化された。第１図に示
すように、そのTNBS−PE反応は10分以内で実質的に完了
し、そして、PEの平衡透過膜分配と調和した、52＋／−
４％の平衡値となった。 実施例２ TNBS標識のためのクロマトグラフ分析評価 DOPCが10モル％DOPEと共にクロロホルム中に混合さ
れ、真空下で乾燥された。その脂質はpH8.5で20uモル/m
lの濃度となるまで緩衝液中に再懸濁された（100mM NaH
CO₃、50mM H₂BO₃）。その小胞体類は実施例１と同様に
製造され、そしてpH8.5で100mM NaHCO₃、50mM H₂BO₃de
平衡化されたセファデックスG50（ファルマシアまたは
シグマ）を含有するゲル濾過カラム（15×1.5cm）を通
過させた。二重光線光度計（パイ ユニカム SP8−50
0、フィリップス）が、その小胞体類上の利用できる第
１級アミン基のTNBS標識を追跡するために使用された。
緩衝液（pH8.5）2.5mlを含有する参考クヴェット（cuve
tte）が参考光線中に置かれた。その試料クヴェットは
0.5mM TNBSを含有する緩衝液（pH8.5）2.5mlを含有し
た。420nmにおける吸光度がベースラインを確立するた
めに追跡され、そして続いて小胞体の標本0.1から0.5ml
が各クヴェットに加えられた。420nmにおける吸光度の
増加は、その反応が完了するまで、記録された。トリト
ンＸ−100洗浄剤（0.5％）200ulがその小胞体類を可溶
化するために両クヴェットに加えられ、ついで存在する
すべてのアミノ基がTNBSにさらされた。洗浄剤の存在下
での吸光度は100％標識として採用された。 上記の操作がpH5.0の緩衝液（150mMクエン酸ナトリウ
ム）中に再懸濁された脂質に対して繰り返された。 第１図は、分光光度測定法により測定された。そのDO
PC小胞体類が10モル％DOPを含有する、小胞体−TNBS反
応に対する時間経過を示す。 実施例３ DOPC−ステアリルアミン（５モル％）小胞体を用い、
実施例１の物質及び操作が使用された。 第2A図は、その取り込まれた水性溶液及び浴媒体のpH
が両者共pH8.5であった時、分光光度測定により分析評
価される完了へと進行しているステアリルアミンのTNBS
標識を示す（実施例１参照）。これは、その外側のモノ
レイヤーステアリルアミンがTNBSと反応して消耗される
ので、その外側モノレイヤーへの内側モノレイヤーステ
アリルアミンの急速な再分配を示すものである。 第2B図は、pH勾配（取り込まれた水性溶液pH5.0、溶
媒体pH8.5）の存在下での標識化を示す。ステアリルア
ミンの非標識は10分間以内に見つけることができる。そ
の小胞体類を可溶化するために続いて行なうトリトンＸ
−100洗浄剤（TX−100）の200ulの添加は、20秒以内で
の標識化の完了という結果をもたらす。これらの結果は
そのpH勾配に対応する内部モノレイヤーへのステアリル
アミンに局部化と一致する。 実施例４ DOPC−スフィンゴシン（５モル％）小胞体類を用い、
実施例３の物質及び操作が使用された。 第3A図は、プロトン勾配を示さない（pH8.5:内部及び
外部緩衝液の両者）LUVsの結果を示す。これは外側モノ
レイヤースフィンゴシンがTNBSと反応して消耗されるの
で、その外側モノレイヤーへの内側モノレイヤースフィ
ンゴシンの急速な再分配を示すものである。 第3B図は、プロトン勾配、pH5.0内側及びpH8.5外側を
示すLUVsの結果を示すものである。これらの結果は、そ
のpH勾配に対応するその内部モノレイヤーへのスフィン
ゴシンの局部化と一致する。 実施例５ 脂肪酸分配の分析 DOPCが、クロロホルム中で、10モル％〔¹⁴C〕−オレ
イン酸及び痕跡量の〔³H〕−DPPCと混合された。その混
合物は真空下で乾燥され、そしてその脂質はpH7.0で150
mM NaCl、20mM HEPES中に再懸濁された。そのリポソー
ム類は凍結−融解処理され、実施例１のようにして小胞
体類が製造された。その小胞体類は、pH7.0で150mM NaC
l、20mM HEPESで予め平衡化されたセファデックスG50カ
ラムを通過させられた。脂肪のないウシ血清アルブミン
（BSA）、（シグマ）の200ul溶液が、最終蛋白質濃度5m
g/mlを与えるまで、得られた小胞体調製物の1mlに加え
られた。その小胞体−アルブミン混合物は、pH7.0で緩
衝液中で予め平衡化されたセファロース4Bゲル（ファル
マシア）を含有する15×1.5cmカラムに適用された。分
画（0.5ml）が集められ、シンチレーションガラス管に
移され、パッカード2000CAシンチレーション分析器を使
用して、〔³H〕／〔¹⁴C〕二重標識プログラムを用いて
活性が測定された。 pH10で150mM H₂BO₃中に乾燥された脂質を再懸濁し
て、上記操作がくり返された。 第4A図は、膜透過pH勾配（取り込まれた水性媒体pH1
0.0、外部浴媒体pH7.0）が存在するとき、BSAによりオ
レイン酸の少量のみが除去されたことを示す。 第4B図は、内部取り込み媒体及び外部浴媒体が両者同
じ（PH7.0）であるとき、BSAによりオレイン酸がほとん
ど完全に除去されることを示す。これは、プロトン勾配
（内部塩基性）の存在下、その内側モノレイヤーへのオ
レイン酸の局部化と一致する。 実施例６ クロロホルム中で10モル％〔¹⁴C〕−ステアリン酸及
び痕跡量の〔³H〕−DPPCを混合したDOPCを用い、実施例
５の操作が使用された。オレイン酸を使用する実施例４
のそれと同様の結果が観察された。 実施例７ 20mg/mlEPC及び５モル％PG（約1.0mg/ml）を含有する
リポソーム類が実施例１の操作に従って形成された。そ
の脂質膜はpH8.0で300mMリン酸塩緩衝液2.0ml中で水和
された。ついで、その外部緩衝液は、6M硫酸を滴下する
ことにより、又はpH4.0の150mMクエン酸と外部緩衝液を
ゲル濾過により交換することによって、pH4.0に変化さ
せられた。そのリポソーム懸濁液は60℃で30分間加熱さ
れ、そしてその最初の外部媒体はより酸性の外部媒体に
よっ同時置換された。その30分間の加熱工程に続いて、
そのリポソーム懸濁液は25℃まで冷却された。オレイン
酸を用いる実施例４で得られたものと同様の結果が観察
された。 その内部モノレイヤーへのPGの移動はイオン交換クロ
マトグラフィーにより実証された。その外部媒体のイオ
ン強度は、そのリポソームをDEAEセファセルのカラムを
通過させる前に行なわれるゲル濾過により約10mMまで減
ぜられた。その内部モノレイヤーに局部化されたPGを有
するリポソーム類は、PGのランダムな分配をしているリ
ポソーム類よりも少ない負の表面荷電を示す。その結
果、PGの不均整分配のリポソーム類はDEAEセファセルカ
ラム空間容積を通過した。PG不均整を示さないリポソー
ム類はDEAEに結びつき、そしてそのカラムが高いイオン
度の緩衝液で洗浄されるまで溶出されない（実施例８参
照）。 実施例８ 実施例７のリポソーム類（50uモル/mlリン脂質を有す
る0.5ml）が、10mM HEPES（pH7.0）で平衡にされたセフ
アデックスＧ−50を含有するゲルろ過カラム（15×1.5c
m）を通過させられた。そのリポソーム類はDEAE−セフ
ァセル（ファーマシア）に加えられた。その流出速度は
１−2ml/分に調節され、そして1.0ml分画が集められ
た。そのカラム物質に結合したリポソーム類は、pH7.0
で0.5MNaCl,10mM HEPESを用いて流出された。分画はパ
ッカード2000CAシンチレーション分析器でカウントを数
えられた。 リポソームpH勾配は、各々１μg/uモル脂質の濃度で
ニゲリシン及びバリノマイシンを用い、続いて最終1mM
濃度に100mMKClを添加して、消散させた。 実施例９ 実施例３の操作及び物質が用いられ、そしてイオン交
換クロマトグラフィが、実施例８のように、その内部モ
ノレイヤーへの脂質の移転を測定するために用いられ
た。 実施例３のリポソーム類（50uモル/mlリン脂質を有す
る0.5ml）が、10mM HEPES（pH7.0）で平衡にされたセフ
アデックスＧ−50を含有するゲルろ過カラム（10×1.5c
m）を通過させられた。そのリポソーム類はCM−セファ
ローズ,CL−6B（ファルマシア）に加えられ、そして、
その流出速度が１−2ml/分に調節され、そして1.0ml分
画が集められた。そのカラム物質に結合したリポソーム
類は、pH8.5の0.5M NaCl,10mM HEPESを用いて流出され
た。分画はパッカード2000CAシンチレーション分析器中
でカウントを数えられた。 リポソームpH勾配は、その小胞体を凍結処理及び融解
処理の５サイクルを受けさせ、続いてLUVETプロセスを
用いて再び大きさを評価することにより消散させられ
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリス，ピーター，アール カナダ国 ブリティッシュ コロンビア 州 ブイ６ジェー ３アール２，バンク ーバー，ウォルナット ストリート 1329 (56)参考文献 特開 昭63−211223（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−41279（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−152812（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−500101（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) B01J 13/02 A61K 9/127

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．内部水溶液と、内側モノレイヤーおよび外側モノレ
   イヤーを含有する外部二分子膜とを含有するリポソーム
   において、 外部二分子膜がイオン化し得る脂質またはイオン化し得
   る蛋白質を含有するものであり、 このイオン化し得る脂質またはイオン化し得る蛋白質
   が、該外部二分子膜を貫通して存在するpH勾配によっ
   て、上記内側モノレイヤーと外側モノレイヤーとに均一
   でなく、両モノレイヤーに不均整に分布されている、 ものであることを特徴とするリポソーム。 ２．そのイオン化し得る脂質が塩基性である請求の範囲
   第１項記載のリポソーム。 ３．その塩基性のイオン化し得る脂質が脂質含有−アミ
   ングループである請求の範囲第２項記載のリポソーム。 ４．その脂質含有−アミングループがスフィンゴシン、
   ステアリルアミン、ホスファチジルエタノールアミン又
   はホスファチジルセリンである請求の範囲第３項記載の
   リポソーム。 ５．そのイオン化し得る脂質が酸性である請求の範囲第
   １項記載のリポソーム。 ６．その酸性のイオン化し得る脂質がホスファチジルグ
   リセロール、カルジオリピン又はホスファチジルイノシ
   トールからなる群から選択されるリン脂質である請求の
   範囲第５項記載のリポソーム。 ７．そのイオン化し得る脂質がリン脂質である請求の範
   囲第１項記載のリポソーム。 ８．そのイオン化し得る脂質がプロスタグランジンであ
   る請求の範囲第１項記載のリポソーム。 ９．そのイオン化し得る蛋白質が塩基性である請求の範
   囲第１項記載のリポソーム。 １０．その塩基性のイオン化し得る蛋白質がオキシトシ
   ン、バソプレシン、アルギニン、バソプレシン、カルシ
   トニン、又はアルファー−心房性−ナトリウム排泄増加
   因子である請求の範囲第９項記載のリポソーム。 １１．そのリポソームがマルチラメラリポソームである
   請求の範囲第１項記載のリポソーム。 １２．そのマルチラメラリポソームが実質的に同一のイ
   ンタラメラ溶質分配を有するものである請求の範囲第11
   項記載のリポソーム。 １３．そのリポソームがユニラメラリポソームである請
   求の範囲第１項記載のリポソーム。 １４．内部水溶液と、内側モノレイヤーおよび外側モノ
   レイヤーを含有する外部二分子膜とを含有するリポソー
   ムにおいて、 外部二分子膜がイオン化し得る脂質またはイオン化し得
   る蛋白質を含有するものであり、 このイオン化し得る脂質またはイオン化し得る蛋白質
   が、該外部二分子膜を貫通して存在するpH勾配によっ
   て、上記内側モノレイヤーと外側モノレイヤーとに均一
   でなく、両モノレイヤーに不均整に分布されており、 該リポソームは生物活性剤を含有する、 ものであることを特徴とするリポソーム。 １５．その生物活性剤がイオン化し得る医薬品である請
   求の範囲第14項記載のリポソーム。 １６．次の（ａ）および（ｂ）工程を含有することを特
   徴とする、内部水溶液と、内側モノレイヤーおよび外側
   モノレイヤーを含有する外部二分子膜とを含有するリポ
   ソームであって、 外部二分子膜がイオン化し得る脂質またはイオン化し得
   る蛋白質を含有するものであり、 このイオン化し得る脂質またはイオン化し得る蛋白質
   が、上記内側モノレイヤーと外側モノレイヤーとに均一
   でなく、両モノレイヤーに不均整に分布されている不均
   整リポソームを得るための方法： （ａ）pH2.0とpH7.5の間の内部水性緩衝液を有するリポ
   ソームを調製する工程；及び （ｂ）不均整リポソームを得るために、pH8.0とpH14.0
   間の外部水性緩衝液に工程（ａ）のリポソームをさらす
   工程。 １７．次の（ａ）および（ｂ）工程を含有することを特
   徴とする、内部水溶液と、内側モノレイヤーおよび外側
   モノレイヤーを含有する外部二分子膜とを含有するリポ
   ソームであって、 外部二分子膜がイオン化し得る脂質またはイオン化し得
   る蛋白質を含有するものであり、 このイオン化し得る脂質またはイオン化し得る蛋白質
   が、上記内側モノレイヤーと外側モノレイヤーとに均一
   でなく、両モノレイヤーに不均整に分布されている不均
   整リポソームを得るための方法： （ａ）pH8.0とpH11.0の間の内部水性緩衝液を有するリ
   ポソームを調製する工程；及び （ｂ）不均整リポソームを得るため、pH5.0とpH7.5間の
   外部水性緩衝液に工程（ａ）のリポソームをさらす工
   程。 １８．次の（ａ）（ｂ）および（ｃ）工程を含有するこ
   とを特徴とする、内部水溶液と、内側モノレイヤーおよ
   び外側モノレイヤーを含有する外部二分子膜とを含有す
   るリポソームであって、 外部二分子膜がイオン化し得る脂質またはイオン化し得
   る蛋白質を含有するものであり、 このイオン化し得る脂質またはイオン化し得る蛋白質
   が、上記内側モノレイヤーと外側モノレイヤーとに均一
   でなく、両モノレイヤーに不均整に分布されている不均
   整リポソームを得るための方法： （ａ）6.0と10.0の間のpHを有する内部水性緩衝液を有
   するリポソームを製造する工程， （ｂ）pH3.0と6.0間のpHを有する外部水性緩衝液に工程
   （ａ）のリポソームをさらす工程；及び （ｃ）30℃から60℃の温度で、10分から12時間、工程
   （ｂ）のリポソームを加熱する工程。