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JP2602461B2 - アミノ酸チオヒダントイン法および試薬 - Google Patents

アミノ酸チオヒダントイン法および試薬

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JP2602461B2
JP2602461B2 JP3502895A JP50289591A JP2602461B2 JP 2602461 B2 JP2602461 B2 JP 2602461B2 JP 3502895 A JP3502895 A JP 3502895A JP 50289591 A JP50289591 A JP 50289591A JP 2602461 B2 JP2602461 B2 JP 2602461B2
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Description

【発明の詳細な説明】 1.発明の技術分野 本発明は、アミノ酸チオヒダントインを形成し、ペプ
チドのＣ−末端アミノ酸を決定し、そのＣ−末端ペプチ
ド端部からのペプチドを配列決定するための方法に関す
るものであり、またこの方法に有用な試薬に関するもの
である。
2.参考文献 クロムウェル・エル・ディーら、バイオケミストリィ
8:4735（1969）。
エドマン・ピー、アクタ・ケミカ・スカンディナビ
カ、4:277（1950）。
ホウク・ディー・エイチら、アナリティカル・バイオ
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ケンナー・ジー・ダブリュら、ジャーナル・オブ・ザ
・ケミカル・ソサイアティ、673（1953）。
メウス・ジェイ・エルら、バイオケミストリィ、16:3
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ミラー・エム・ジェイら、ジャーナル・オブ・オーガ
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ランガラジャン・エム、“プロテイン／ペプチド・シ
ーケンス・アナリシス：現在の方法論”（ボウン・エイ
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スターク・ジー・アール、メソッズ・イン・エンザイ
モロジイ（ヒルス・シー・エイチ・ダブリュら著）、25
巻、369頁、アカデミック・プレス（1972）。
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ウッドワード・アール・ビーら、ジャーナル・オブ・
ザ・ケミカル・ソサイアティ、83:1007−1009（196
1）。
ヤマシタ・エス、ビオシミカ・エ・ビオフィジカ・ア
クタ、229:301〜209（1971）。
3.発明の背景 ペプチドのアミノ酸シーケンス、即ち、ペプチドの一
次構造の決定は、ペプチドの構造を理解し、同時に修飾
または部分的に変更した形で所望の性質を得るようにペ
プチドを操作するための主流をなす。さらに、ペプチド
のアミノ酸シーケンスは、ペプチドの遺伝子コードシー
ケンスを同定するため、ペプチドを組換えて生成するた
め、および／またはペプチドの座位特異的変異体を生成
するための種々の組換えDNA法に有用である。
Ｎ−末端配列決定に使用するための方法は良く知られ
ている（例えば、エドマン）。Ｎ−末端配列決定方法は
比較的容易で信頼性があるにも拘らず、利用し難いかま
たはこの方法によって得ることの困難なＣ−末端アミノ
酸シーケンス情報を入手することが望まれることが多
い。特にプロテインのコード領域のＣ−末端部が、恐ら
くcDNAクローンに存在することになる、ポリＡ尾部に最
も近い末端に相当するので、カルボキシル末端シーケン
スについての情報は一定のタイプの組換え体DNA法に有
用であるかも知れない。
３つの一般的なアプローチがＣ−末端ペプチド配列決
定のために提案された：酵素によるもの、物理的方法に
よるもの、化学的方法によるものである。これらの方法
とその固有の限界は上記引用の親の出願において要約し
た。簡単に述べると、酵素による決定も物理的方法によ
る決定も、今までのところ十分には証明されていない。
このことを考慮して、Ｃ−末端アミノ酸残基を決定する
ため、およびＣ−末端配列決定のための化学的方法の開
発にかなりの努力がなされた。Ｃ−末端配列決定に固有
な難点は、Ｎ−末端アミノ基での比較的容易な付加とは
対象的に、カルボキシル基の反応性が比較的乏しいこと
である。Ｃ−末端配列決定のために提案された反応法の
中で、３つの方法が特に注目されている。
第１の方法では、ペプチドのＣ−末端部でカルボキシ
アミド誘導体を生成し、続いてビス（I,I−トリフルオ
ロアセトキシ）ヨードベンゼンと反応させて、再配列し
て短かくなったカルボキシアミドペプチドとＣ−末端ア
ミノ酸のアルデヒド誘導体に加水分解する誘導体を生成
する（パーハム）。この方法は反応が停止する前の３〜
６サイクルに対してのみうまく行われる。第２の関連あ
るアプローチでは、カルボキシ末端はロッセン再配列を
行うようにピバロイルヒドロキサメートと反応させる。
この方法のひとつの限界は化学作用がアスパラギン酸と
グルタミン酸残基を開裂しないことである（ミラー、19
77）。
最も広く研究されたＣ−末端の化学反応は、チオヒダ
ントイン（TH）反応である。TH法を行うための一般的方
法の一つでは、カルボキシル基を無水酢酸のような無水
物を、イソチオシアネート（ITC）塩または酸の存在で
活性化して、Ｃ−末端ITC中間体を介してＣ−末端ペプ
チジル−THを生成する（スターク、1972）。ペプチジル
−THは開裂して短くなったペプチドとＣ−末端アミノ酸
THを生成し、これは例えば、高圧液体クロマトグラフィ
ー（HPLC）によって同定することができる。この方法に
おけるカップリング条件は代表的には60〜70℃にて約90
分を要し（メウス）、ペプチド中のアミノ酸側鎖の若干
が分解されてしまうことが多い。さらに、無水物試薬は
比較的不安定であり、従って貯蔵の問題がある。
穏和な条件で行うことができるＣ−末端TH配列決定法
は本発明者と共同研究者の一人（ホウク）によって発表
されている。試薬としてトリメチルシリルイソチオシア
ネート（TMSITC）を使用するとき、ペプチドを無水酢酸
を用いて15分間50℃で活性化し、次いでさらに30分間50
℃にてTMS−ITCと反応させてTH生成が行なわれた。この
方法は上述のように、反応性の大きい無水物活性化剤に
ペプチドがさらされる欠点がある。さらに、また上記の
関連しているTH生成方法と同様に、TH−アミノ酸反応生
成物はラセミ化され、従ってこの方法はＤ−およびＬ−
形態のアミノ酸を識別するためには使用できない。
前記TH生成を含むＣ−末端配列決定方法は一般にラセ
ミ化生成物に導く。ホスホリルイソチオシアナチデート
試薬を用いるＣ−末端反応の改良が提案されている（ケ
ンナー）。THは生成されるが、この反応が極めて有用と
なるには、ゆっくりすぎた。ミラーらは関連している方
法を提案したが、メルカプトベンゾチアゾール誘導体を
使用している。この化合物を使用するための合理性は、
チアゾール環の開環と同時に環化を起こすことができる
ことである。
4.発明の概要 本発明のひとつの一般的な目的は、比較的穏和な反応
条件で、特に無水物活性化剤の使用を含まない条件下
に、比較的速いＣ−末端ペプチジルTHの形成を含むＣ−
末端ペプチド配列決定法を提供することである。
本発明の他の目的は、Ｃ−末端配列決定に使用するた
めの新規な試薬を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、少なくとも若干の配列決
定反応の反応物を固体支持体に封鎖する条件下に行うこ
とができるＣ−末端配列決定法を提供することである。
本発明のさらに一般的な目的は、アミノ酸THを生成す
るための方法および固定化試薬を提供することである。
本発明は、一面においては、遊離カルボン酸基を有す
る保護されたアミノ酸のチオヒダントイン（TH）を生成
するための方法を含む。保護されたアミノ酸は、イソチ
オシアン酸およびカルボン酸、炭酸またはスルホン酸の
混合酸無水物（以下、混合無水物と呼ぶ）と共に、アミ
ノ酸のカルボン酸基が脱プロトン化する条件下に反応さ
せる。関連した観点では、本発明はペプチドのＣ−末端
アミノ酸残基を決定するための方法を含む。ペプチド
は、イソチオシアン酸およびカルボン酸、炭酸またはス
ルホン酸の混合無水物と共に、Ｃ−末端アミノ酸のカル
ボン酸基が脱プロトン化する条件下に反応させて、相当
するＣ−末端ペプチジルチオヒダントイン（TH）を生成
する。ペプチジル−TH結合のＣ−末端加水分解はアミノ
酸THを脱離し、これは次に、例えば、HPLCによって、ア
ミノ酸TH付加物として同定することができる。
本方法に用いられる混合無水物試薬のひとつの実施態
様は次の形態を有する： （式中Ａはアルキル、アリール、またはアリールオキシ
基である）。
ひとつの一般的な実施態様では、Ｎ−保護アミノ酸ま
たはペプチドを、溶液相混合無水物試薬と反応させる。
本発明の他の一般的な実施態様では、Ｎ−保護アミノ
酸またはペプチドは、イソチオシアン酸およびカルボン
酸、炭酸またはスルホン酸の混合無水物と結合した固体
支持体と、アミノ酸のカルボキシル基を脱プロトン化す
る塩基性条件下に接触させる。溶液中に生成したアミノ
酸THは、例えば生成物を固体支持体から溶離することに
よって、固体支持体から分離される。
好ましくは、アシルITC支持体は次の形態を有する： （式中、Ａは固体支持体に結合したアルキル、アルコキ
シ、アリールまたはアリールオキシ基である）。固体支
持体はウッドワード試薬Ｋまたは無水物試薬を用いて活
性化し、続いて両者の場合においてITCと反応させて、
またはここに開示されたタイプの溶液相アシルITCと反
応させて、誘導することができる。
Ｃ−末端ペプチド配列決定に使用するために、さらに
本発明の方法は、残りのペプチドからＣ−末端アミノ酸
THを開裂し、開裂したアミノ酸THを、例えばHPLCによっ
て同定することを含む。固相試薬を用いる実施態様で
は、ペプチジルTHは好ましくは、残りのペプチドからペ
プチジルTHを開裂するように、開裂試薬効果を有する第
２の固体支持体と接触させる。ペプチドは好ましくは、
イオン交換結合によって、または開裂反応中に形成する
共有結合によって固体支持体に保持される。溶液相中の
アミノ酸THを溶離した後、残りのペプチドを脱離して、
さらにシーケンス決定用に再循環させる。
他の面において、本発明はイソチオシアン酸およびカ
ルボン酸または炭酸の混合無水物と結合し、好ましくは
次の形態を有する活性化支持体を含む： （式中、Ａは固体支持体に結合したアルキル、アルコキ
シ、アリールまたはアリールオキシ基である）。
また、本発明の形成する部分は固相Ｃ−末端配列決定
用システムである。このシステムは前記タイプの活性化
支持体、および好ましくは、（ｉ）アミノ酸THを脱離す
るようにペプチジルTHを開裂し、（ii）残りのペプチド
を支持体に結合することができる第２の固体支持体を含
む。残りのペプチドはアミノ酸THを回収した後に支持体
から選択的に脱離することができる。このシステムは逐
次のＣ−末端ペプチド決定のために、一連のこのような
支持体を含むことができる。
本発明のこれらの目的および他の目的および特徴は、
次に示す本発明の詳細な説明を図面と共に合わせて読む
ときに一層完全に明らかになるだろう。
図面の簡単な説明 図１は本発明を実施する際に使用するイソチオシアン
酸（化合物Ｉ−Ｖ）の混合無水物を示し； 図２は、本発明に従って、ペプチジルITC化合物を形
成するため、ペプチドカルボキシル基とアルキルアシル
ITC試薬との提案された反応機構を示し； 図３は、アミノ酸THと短くなったペプチドを形成する
ため、ペプチジルチオヒダントイン（TH）の生成と末端
アミノ酸THの加水分解の提案された機構を示し； 図4Aと4Bは、従来技術の方法に従って無水酢酸中でTM
S−ITCを用いる方法（4A）、および本発明に従ってベン
ゾイル−ITC混合無水物試薬を用いる方法（4B）で、形
成されたＣ−末端アミノ酸−THの比較収率を示すHPLCク
ロマトグラムであり； 図5Aと5Bは、Ｃ−末端ロイシン（Ｌ）、およびＣ−末
端メチオニン（Ｍ）について、それぞれ生成したアミノ
酸−TH化合物のHPLCクロマトグラムを示し； 図6Aと6Bはペンタペプチドロイシンエンケファリン
（TGGFL）のＣ−末端配列決定における第１および第２
サイクルのそれぞれのHPLCクロマトグラムを示し； 図7Aと7Bは、従来技術の方法に従って無水酢酸中でTM
S−ITCを用いてIleを反応させ（7A）、および本発明方
法に従ってベンゾイル−ITG混合無水物反応で反応させ
て（7B）生成したIle−THのHPLCクロマトグラムを示
し； 図８はＣ−末端ペプチド配列決定のための本発明方法
の使用を示し； 図９はＣ−末端アミノ酸−フェニルTH誘導体を生成す
るため用いることができるメルカプトベンゾチアゾール
の合成を示し； 図10は、メルカプトベンゾチアゾール化合物とＣ−末
端アミノ酸との提案された反応を示し、続いて開裂して
アミノ酸−フェニールTH化合物を生成する反応を示し； 図11は、支持体上のカルボキシル基を活性化するため
ウッドワード試薬Ｋを使用する活性化固体支持体を形成
するための反応工程を示し； 図12は、支持体上のカルボキシル基を活性化するため
酸無水物を用いる固体支持体を形成するための反応工程
を示し； 図13は、支持体上のカルボキシル基を活性化するため
溶液相アシル−ITCを用いる活性化固体支持体を形成す
るための反応工程を示し； 図14は、炭酸とITCの混合無水物と結合した活性化固
体支持体を形成するための反応工程を示し； 図15Aと15Bは、本発明に従って活性化アシルITC支持
体を用いるペプチド反応によってペプチジルTHを形成し
（15A）、ペプチジル−ITCの環化によってペプチジルTH
を形成する（15B）ための反応様式図を示し； 図16は、各化合物に対して示されたカルボニル炭素、
スルホニル硫黄原子およびITC炭素原子について、計算
された原子電荷をもつ種々の混合無水物ITC化合物を示
し； 図17は、カチオン交換樹脂によってペプチジルTHを開
裂し、残りのペプチドを樹脂支持体に結合する工程を示
し； 図18は、ヒドロキシルアミノ基と結合した固体支持体
によってペプチジルTHを開裂し、続いて残りのペプチド
を樹脂支持体から加水分解により脱離する工程を示し； 図19は、本発明によるＣ−末端配列決定操作の工程を
示す図である。
発明の詳細な説明 I.溶液相方法および試薬 本発明のひとつの一般的な実施態様では、アミノ酸TH
の生成はＮ−保護アミノ酸またはペプチドと溶液相混合
無水物試薬を反応させて行われる。即ち、イソチオシア
ン酸およびカルボン酸、炭酸またはスルホン酸の混合無
水物は遊離（固定化していない）形態である。Ｎ−保護
アミノ酸またはペプチドは、下記に示すように、溶液中
にあるかまたは固体支持体に固定化されている。この方
法で使用される混合無水物試薬はここでは溶液相試薬と
呼ばれ、下記のセクションIIで述べる固相混合無水物試
薬からの試薬と区別される。同様に、Ｎ保護アミノ酸ま
たはペプチドが溶液相試薬を反応させる一般的方法は、
溶液相方法と呼ばれる。“溶液相方法”はアミノ酸、ま
たはさらに代表的には、ペプチドが固定化される固相支
持体を含むことができることは評価されるであろう。
IA.混合無水物（混合酸無水物）試薬 本発明方法に用いられる試薬はイソチオシアン酸（IT
C）及びカルボン酸、炭酸またはスルホン酸の混合無水
物である。いくつかの例示的な混合無水物試薬を図１に
示す。これは次のものを含む： （ａ）アセチルITC（Ｉ）およびベンゾイルITC（II）に
よって例示されるような、アルキルまたはアリールアシ
ル−ITC化合物。このアルキル基は、メチル、エチル、
プロピル、ｔ−ブチル、および不飽和化合物を含み炭素
−炭素結合によってアシル炭素に結合した関連する炭化
水素化合物のようなアルキルおよびシクロアルキル化合
物の群から選ばれる。アリール基はベンゼン、置換した
ベンゼン、またはアリール環炭素原子を介してアシル炭
素に結合した関連する化合物であることができる。これ
ら２種類の化合物はまた、ここでは、CO−Ｎ結合の加水
分解がカルボン酸およびHNCSを生成するので、ITCおよ
びカルボン酸の混合無水物と呼ばれる； （ｂ）エトキシアシル−ITC（III）またはベンゾキシカ
ルボニルITC（IV）によって例示されるような、アルコ
キシまたはアリールオキシカルボニル−ITC化合物。こ
の化合物のエーテル結合アルキルまたはアリールグルー
プは（ａ）に記載したようなものである。これら２種類
の化合物はまた、ここでは、CO−Ｎ結合の加水分解が炭
酸およびHNCSを生成するので、ITCと炭酸の混合無水物
と呼ばれる；そして （ｃ）ベンジルスルホニル−ITC（Ｖ）によって例示さ
れるような、アルキルまたはアリールスルホニル−ITC
化合物。この化合物のアルキルまたはアリールグループ
は（ａ）に記載したようなものである。これら２種類の
化合物はまた、ここでは、CO−Ｎ結合の加水分解がスル
ホン酸およびHNCSを生成するので、ITCとスルホン酸の
混合無水物と呼ばれる； 本発明のひとつの好適例では、溶液相試薬は、（ａ）
に記載したように、カルボン酸とITCの混合無水物であ
り、次の一般式を有する： 式中のＡはアルキルまたはアリール基のような任意の炭
素を含有する基であり、TH形成反応に使用される非水溶
煤において試薬を溶解し、記載されることになっている
イソチオシアン化反応において、ペプチドアシル基に対
して反応性がある。
このクラスの若干の化合物は商品として入手すること
ができ、あるいは既知の方法によって調製することがで
きる。アシル置換ITCsを調製する方法のひとつは、塩基
を含む乾燥した不活性溶媒中にイソチオシアネートを溶
解し、徐々に所望のアシルクロライドを添加する工程を
含む。例えば、ベンゾイルITCの合成は、不活性溶媒と
してアセトニトリルまたはジクロロメタンまたはトルエ
ン中でベンゾイルクロライド、および塩基としてジイソ
プロピルエチルアミンを用いる。
ITCおよび炭酸の混合無水物（ROC（Ｏ）NCS）は、ITC
塩との反応において選択されるアルキルまたはアリール
エステルクロライドを用い、類似の方法によって生成す
ることができる。同様に、ITCおよびスルホン酸の混合
無水物は、実施例７に概略を示したように、ITCと所望
のベンゼンスルホニルクロライドを反応させて生成され
る。
IB.溶液相反応方法 本発明方法を実施するとき、Ｃ−末端アミノ酸を同定
することになっているＮ−保護アミノ酸またはペプチド
を、Ｃ−末端アミノ酸のカルボキシル基が脱プロトン化
される塩基性条件下に混合無水物試薬と反応させる。Ｃ
−末端アミノ酸は、環−窒素アミド結合によってペプチ
ド中の終りから２番目のＣ−末端アミノ酸（反応はペプ
チドを用いる）に結合するＣ−末端アミノ酸THに変換さ
れる。
上に使用したように、“ペプチド”の語はペプチドと
タンパク質の両方を含むことを意図しており、これらは
一般に、それぞれ100以下または以上のアミノ酸、およ
びＮ−保護アミノ酸によって区別される。本方法は特に
ペプチドのＣ−末端アミノ酸を決定するときに使用する
ために記述されるだろう。しかし、本方法はまた遊離の
Ｎ−保護アミノ酸からアミノ酸チオヒダントインを生成
するために応用できる。
ペプチドのＣ−末端アミノ酸残基のみを同定するため
に本方法を使用する場合、ペプチドは遊離の形で、すな
わちアミノ末端を保護する固体支持体に結合していない
形で反応させることができる。代表的には、Ｃ−末端ア
ミノ酸同定の連続する範囲が望ましい場合、Ｃ−末端配
列決定のために、ペプチドをそのＮ−末端またはその内
側鎖にて固体支持体に結合する。
ペプチドを固体支持体、例えば活性化ガラスビーズ、
カルボキシル化またはアミノ化樹脂ビーズ等に結合する
ための方法は良く知られている。実施例１に記載した方
法に用いられた好ましい手段のひとつでは、ジペプチド
Leu−Valをベンジルジイソチオシアネートによってアミ
ノ化樹脂に固定化した。
遊離の形または固定化した形のいずれでも、ペプチド
はＣ−末端カルボン酸基を脱プロトン化するために有効
な塩基性の、好ましくは非水の条件下に適当な溶媒中に
溶解または懸濁させる。溶媒はまた好ましくは、下記の
ように、チオヒダントイン（TH）環形成において重要な
触媒の役割を担うことができるピリジンを含む。好まし
い溶媒のひとつは10％の無水ピリジンを含む無水アセト
ニトリルである。代表的な反応容量は１〜3mgのペプチ
ドにつき約100μｌの反応溶媒である。
上記による混合した無水物試薬を、好ましくは反応懸
濁液中の反応に有効なペプチドカルボキシル基を過剰な
モルで、ペプチド懸濁液に添加する。代表的には100μ
ｌの反応溶媒につき約10μｌの試薬を添加する。
TH形成反応は好ましくは50〜70℃にて約10〜60分間、
好ましくは約50℃につき15〜30分間行い、ペプチド中の
非カルボキシル基とITC試薬の反応を最小にする。これ
に続いて、反応混合物を室温まで冷却し、ペプチジルTH
を回収する。ペプチドを固体支持体に結合する場合、支
持体回収は、支持体を例えば数容量のアセトニトリルを
用いて洗浄し、洗浄した支持体を、例えば真空遠心分離
によって乾燥させる。ペプチドを遊離の形で反応させる
場合、ペプチジルTHは、ペプチドからアミノ酸THの末端
開裂を生じない溶媒系でクロマトグラフィー分離等によ
って回収することができる。
図２および３は本発明方法によるペプチジルTH形成の
ための反応の提案された機構を示す。図２の上部に示し
たこの反応機構では、混合した無水物試薬は不安定なIT
C中間体VIを介して作用し、図中のVIIで示されたペプチ
ジル混合無水物を形成する。次いで無水物は無水反応で
生成した遊離のチオシアネートイオンと反応し、四面体
の中間体IXを経て、図中のVIIIで示されたペプチジルIT
C化合物を形成する。この提案された機構では、混合し
た無水物試薬が反応性のペプチジル無水物を形成する活
性化試薬としても、また無水物との反応のためのチオシ
アネートイオン源としても作用する。
代わりの反応機構は図２の第２のラインに示される。
ここでは図中の四面体の中間体Ｘのチオシアネート基が
ペプチドのカルボニルの炭素に移動し、四面体の中間体
IXを形成し、これは速かに分裂してVIIIで示されるペプ
チジルITC化合物を形成する。
引続き図２を参照すると、ペプチジル脱プロトン化
（求核性の）酸素原子の反応の親電子的な２つの可能な
部位がある。第１の部位、および図２の反応図に示され
たものは、カルボニルの炭素である。第２の部位は悪い
反応生成物に導かれるチオカルボニルの炭素である。本
発明の支持体で行われる実験は、生成したアミノ酸−TH
化合物のパーセンテージに基づいて、カルボニルの炭素
での一層親電子的な置換がチオカルボニル炭素での反応
を与えることを示している。従って、例えば、アルキル
およびアリールカルボニル基（イソチオシアン酸とカル
ボン酸の混合した無水物）は最高のパーセンテージの所
望のTH生成物を与え、さらに一層電気陰性のエステル試
薬（イソチオシアン酸と炭酸の混合した無水物）は、さ
らに低いパーセンテージの所望の生成物を与える。現在
の条件下では、スルホン酸混合無水物試薬は最低のパー
センテージの所望のTH生成物を与える。
所望のペプチジルTHを形成するペプチジルITC化合物X
Iの反応は図３に示されるが、恐らくペプチドITC化合物
中のアミドの窒素にチオシアネートの炭素が親電子的に
攻撃して速い環化によって図中のXIIで示されたペプチ
ジルTHを形成するのであろう。環化反応はピリジンによ
って触媒作用を受けることができるが、これは既に提案
された（ミラー、1988）ように、反応性の炭素中心の反
応性を高めるチオシアネート部分とピリジンが反応でき
ることを示唆している。
本発明によるアミノ酸またはペプチジルTHを形成する
ための特殊な反応条件は、ベンゾイル−ITCについては
実施例1A、２、３、および６に、トリメチルアセチル−
ITCについては実施例４に、エトキシカルボニルについ
ては実施例５に、ベンゼンスルホニル−ITCについては
実施例7Bに与えられている。
IC.アミノアシルヒダントインの形成と同定 このセクションでは本発明方法の最終工程を記載して
おり、これは（ａ）THをペプチドに結合するアミド結合
を開裂するために有効な開裂条件下でペプチジルTHを処
理し、（ｂ）開裂反応によって解離されたアミノアシル
THを単離し、そして（ｃ）単離したアミノアシルTHを同
定する工程を含む。
種々の開裂反応条件が知られている。12N HCl、稀ア
ルカリ（ケンナー）、または飽和水性トリエチルアミン
を用いた加水分解が知られている。これらの開裂反応は
70％までの割合の開裂を生じることが報告されている
が、極端なpH条件は内部のペプチド側鎖に対して開環お
よび／または損傷を導く。さらに最近、pH8.0にてピリ
ジン中でアセトヒドロキサメートで処理する分裂が報告
された（メウス）。この方法は60〜80％までのＣ−末端
THの回収率を与える（ミラー、1988）。関連した方法で
はアセトニトリル中で第一または第二アミンを用いて処
理することを含む。
開裂反応は代表的には、使用される開裂剤によって室
温またはこれより高い温度で15〜60分間行われる。反応
工程は、TH脱離を最適にするために、また開環と短くな
ったペプチドへの損傷を最小にするために、反応工程の
間に、下記の分析方法に従って、脱離したアミノアシル
THおよび／または短くなったペプチドの完全さを試験す
ることによって容易に導くことができた。
実施例１〜４に記載された好適な開裂方法では、ペプ
チジルTHは室温にて15分間アセトニトリル中10％プロピ
ルアミンを用いて処理される。実施例５に記載された関
連した方法では、ペプチジル−THは1mg/mlのジチオスレ
イトール（DTT）を含有する水中でテトラ−Ｎ−ブチル
アンモニウムヒドロキサイドを用いて開裂させた。
本発明のひとつの観点によれば、酸性の条件下に行う
とき、TH形成方法はＣ−末端アミノ酸の立体異性の形を
保持することが見出された。これは実施例６に示され、
ｔ−BOC保護Ileは25％H2O中でトリフルオロ酢酸（TFA）
を用いて脱保護され、図7Bに示されるように、単一のＬ
型Ile−TH化合物を生成する。これに対して、トリメチ
ルシリルイソチオシアネート（TMS−ITC）を用いた反応
によって脱保護されたIle−THの反応形成および12N HCl
を用いた脱保護（開裂）は、従来技術のＣ−末端分析方
法（ホウク）に従って、図7Aにおいてダブレットで示さ
れる２つのジアステレオマーの形態を生じた。
開裂反応の結果を図３の下部に示す。図３の反応で
は、開裂によって１個のアミノ酸によって短くなったペ
プチド（化合物X III）、およびR1基が勿論、元のＣ−
末端アミノ酸のアミノ酸側鎖であるアミノ酸TH（X IV）
を生成する。
ペプチドまたは短くなったペプチド、またはその両方
から離脱したアミノアシルTHはＮ−末端アミノ酸を同定
するために分析される。ペプチドが固体支持体に結合す
る場合、離脱したTHは、分裂反応溶液を例えば真空遠心
分離によって除去し、実施例１に述べたように、アセト
ニトリルのような適当な溶媒で遊離したTHを抽出するこ
とによって容易に分離することができる。ペプチドが開
裂反応混合物中で遊離している場合、混合物は例えば、
HPLCによって、化合物を同定するための方法の一部とし
て分離することができる。
脱離したアミノ酸TH化合物を、標準の方法に従って、
高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）のような既知のク
ロマトグラフィー法によって同定することができる。化
合物の同定は都合の良いことには、カラム中の走行時間
を、標準の方法に従って調製された既知の参照用アミノ
酸THの走行時間と比較することによって行うことができ
る。実施例１に述べたHPLC法が適当である。図5Aと5Bは
ロイシンTH（Ｌ−TH）およびメチオニンTH（Ｍ−TH）の
HPLCプロフィルを示し、図6Aと6BはＬ−THとフェニルア
ラニンTH（Ｆ−TH）のHPLCプロフィルを示す。
また、脱離し単離されたアミノ酸THは他の入手できる
器具、例えばマススペクトロメトリーやNMRによって同
定することができる。
ID.C−末端アミノ酸配列決定 上のセクションICに記述された方法は、ペプチドのＣ
−末端アミノ酸残基を決定するために設計されている。
繰り返し適用する方法がペプチドのＣ−末端アミノ酸配
列決定のために使用できることは高く評価されるだろ
う。
図８は配列決定方法を示している。配列決定されるペ
プチドは図に示されるように固体支持体Ｓに結合してい
る。次にペプチドは第１周の工程によって運ばれて、
（ａ）Ｃ−末端ペプチジルTHを生成し、（ｂ）末端THを
開裂し、Ｃ−末端アミノアシルTH（AAn）およびＣ−末
端アミノ残基がAAn-1となって短くなったペプチドを生
成し、（Ｃ）脱離したアミノアシルTHが同定される。
ペプチド支持体を洗浄した後、短くなったペプチドを
上記工程の第２周で処理して、アミノ酸TH（AAn-1）と
して次のアミノ酸を脱離し、２個のＣ−末端残基によっ
て短くなったペプチドを生成する。この方法はペプチド
が配列決定されるまで、または不完全なTH生成と脱離に
よる分割ロスがさらに配列決定することを不可能にする
まで繰り返される。この配列決定法は、ロイシンエンケ
ファリン（YGGFL）の２個のＣ−末端アミノ酸残基の決
定に対して、実施例５に示されている。図6Aに示される
分析の第１周からのHPLCクロマトグラフは、Ｃ−末端Ｌ
−THピークを示す。図6Bに示される第２周からのクロマ
トグラフは、予想されたＦ−THを示す。
上述した手法はペプチドのＮ−末端残基の自動化配列
決定のために知られている技術を用いて容易に自動化さ
れる。Ｃ−末端からペプチドを自動的に配列決定するた
めの装置の一例では、反応容器に含まれる固体支持体を
用い、この容器に溶媒と試薬を添加し、そこから反応混
合物と洗浄溶媒を除去する。脱離したアミノ酸THは後の
HPLCによる同定のために貯蔵物質から単離される。
IE.代わりの混合無水物試薬 本発明はセクションIAに記述したカルボン酸、炭酸お
よびスルホン酸の混合無水物を包含するが、さらに下記
のような混合無水物もＣ−末端アミノ酸−TH化合物を生
成するために適当である。
代わりの試薬の一つは一般式： （式中のＡは任意のアミンであり、好ましくはトリメチ
ルアミンのような４級アミンである）で表されるイソチ
オシアン酸のカルバメート混合無水物である。この試薬
はカーボネート混合無水物と殆ど同じ電気陰性度をもつ
ことが期待され、従って、妥当な収率の所望のペプチジ
ル−TH生成物を与える必要がある。
別の代わりの混合無水物は、図９の右側に示したよう
なベンゾイルメルカプト−ベンゾチアゾール（MBT）XV
である。この化合物は実施例８に記述された合成方法に
従って調製することができる。簡単に述べると、MBT X
VIを乾燥した不活性溶媒に例えばジイソプロピルエチル
アミンのような適当な塩基の存在で溶解する。次いで選
ばれたアシルクロライド、例えばベンゾイルクロライド
（X VII）を、低い温度でゆっくりと添加し、所望の生
成物を形成する。関連したアシルMBT化合物、例えばア
セチルMBTを、所望のアシルクロライド出発物質を用い
て同様の方法によって調製することができる。
図10はMBT試薬を用いるペプチジルフェニルTHの形成
において提案された反応工程を示す。この反応条件はセ
クションＢに記述したものと殆ど同じであり、必要に応
じて、TH形成反応を完全に行なうように反応時間を適当
に調整する。代表的な反応条件は実施例８に与えられて
いる。
図10を参照すると、脱プロトン化したペプチド（X VI
II）をベンゾイル−MBT（BzMBT）と反応させて、提案さ
れた反応経路において、X IXで示された中間体のペプチ
ドベンゾチアゾール化合物を形成する。中間体の形成は
ベンゾチアゾールイオンによって引続き攻撃して活性化
無水物を経て行なわれるか、あるいは図２に関連して記
述したように、一斉に行なわれる再配列反応を含むこと
ができる。
ペプチジルアリールTHを形成するための中間体ベンゾ
チアゾールの環化は、図３に記載されたと同じ経路に沿
って、アミドの窒素と反応する親電子的なチオ環炭素を
用いて行なわれ、次いで環化して所望のペプチドフェニ
ルTH化合物X IVを形成する。
さらに別の可能な混合無水物は、ベンゾイルイソシア
ネートのようなイソシアン酸とカルボン酸の混合無水物
である。実施例９に記載されているような反応は、この
実施例で報告されているように妥当な収率の所望のアミ
ノ酸−TH生成物を生成する。
前記から、どのようにして本発明の種々の目的と特色
が達成されるかを高く評価することができる。本発明の
方法は、ペプチドのカルボキシル基の無水物の活性化を
あてにする従来技術の方法よりは実質的に穏和な条件下
にペプチジルTHを生成することができる。同時に、TH形
成反応は、比較的早く、例えば15〜30分で行なうことが
でき、従って自動化システムにおいて迅速に配列決定を
行なうことができる。
さらに、本方法での開裂反応が酸性の条件下に行なわ
れるとき、本方法はＣ−末端アミノ酸の立体化学を保持
し、従ってＬ−またはＤ−形態のアミノ酸を決定するた
めに使用することができる。
II.固相方法と試薬 本発明の第２の一般的な例では、アミノ酸THの形成は
Ｎ−保護アミノ酸またはペプチドを固相混合無水物試薬
と反応させて行なわれる。特に、イソチオシアン酸とカ
ルボン酸、炭酸またはスルホン酸の混合無水物と、この
混合無水物と結合する固体支持体で行われる。この方法
で使用される混合無水物試薬は、ここでは固相試薬と呼
ばれ、Ｎ−保護アミノ酸またはペプチドを固相試薬と反
応する一般的方法は固相方法と呼ばれる。
II A.固相ITC試薬 本発明の方法は、アシルITC、すなわちカルボン酸ま
たは炭酸、およびイソチオシアン酸の混合無水物と結合
するアシルITC固相（固定化した）試薬を用いる。
この試薬は次式で表される。
（式中のＡはアルキル、アルコキシ、アリール、または
アリールオキシ基であり、ITCはイソチオシアネートで
あり、図面ではＮ＝Ｃ＝ＳまたはNCSで表した）。アル
キル基は、例えばメチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチ
ル、および炭素炭素結合によってアシルの炭素に結合し
た関連する炭素含有化合物のようなアルキルおよびシク
ロアルキル化合物の群から選ぶことができる。アリール
基はベンゼン、置換したベンゼン、またはアリール環の
炭素原子によってアシールの炭素に結合した関連する芳
香族またはヘテロ芳香族化合物であることができる。ア
ルコキシおよびアリールオキシ基は類似のＯ−アルキル
およびＯ−アリール基を含む。Ａで示された化合物の基
はまた、ここではCO−Ｎ結合での加水分解がカルボン酸
とITCを生成するので、ITCとカルボン酸の混合した無水
物と呼ばれる。Ｂで示された化合物の基は同様に、化合
物の加水分解による開裂が炭酸エステルとNCSを生成す
るので、イソチオシアン酸と炭酸の混合した無水物と呼
ばれる。
固体支持体は、アシルITCを含むように機能できる表
面化学基と共に誘導される粒子ビーズ、または膜支持体
等であってもよい。複数のビーズまたは膜支持体材料、
例えばガラスまたは多くのポリマー材料、例えば、種々
の既知の方法によって所望の反応性ITCに変換できるア
ミン、カルボキシル、および水酸基のような反応性化学
基を有するナイロン、ポリスチレン、ポリエチレン、テ
フロン（登録商標）は商業的に入手することができる。
図11はアシルITC基を用いて誘導された活性化固体支
持体の形成の工程を示す。固体支持体（Ｉ）は表面のア
ミン基を有するＳで示された粒子ビーズ等である。これ
らのビーズはまず、適当な溶媒中でFMOC−Glu−OtBuの
ような側鎖保護ジカルボン酸およびカルボジイミドとビ
ーズの反応によってカルボン酸表面基を含むように誘導
され、アミド結合によってアミノ表面基にジカルボン酸
誘導体を結合する。この保護されたカルボキシル化支持
体は図11において（II）で示される。反応条件は実施例
10に詳述する。官能基は、例えばTFAを用いて脱保護化
される。
同様に支持体は他の経路を使用してカルボキシル化支
持体を生成するように調製することも認められるだろ
う。
この支持体（II）はウッドワード試薬Ｋ（ウッドワー
ド）（III）のようなイソキサゾリウムと反応させて活
性化される。トリアルキルアミンのような適当な塩基の
存在で、イソキサゾリウム塩はケテンイミン（IV）を形
成し、これは支持体の遊離のカルボキシル基と反応して
活性化エノールエステル（Ｖ）を形成することができ
る。活性化したエステルは、トリメチルシリルITC（TMS
ITC）のようなITC化合物と反応し、所望の活性化したア
シルITC固体支持体（VI）を形成する。特定の反応条件
を実施例10に与える。好ましいITC化合物はトリアルキ
ルシリル−ITC化合物、例えばTMS−ITC、またはピリジ
ニウムチオシアネートである。構造式ＶおよびVIの括弧
は構造式IIで示される支持体のグルタル酸結合を示す。
図12はベンゾイルITCを用いて活性化された固体支持
体を形成するための第２の一般法を示す。ここで支持体
（II）は無水酢酸のような無水物を用いて無水の条件下
に反応し、仮定された活性化無水物支持体（VII）を生
成する。さらにTMSITCのようなITC化合物との反応は所
望のベンゾイルITCを活性化支持体（VI）を生成する。
活性化した混合無水物ITC固体支持体を形成するため
の第３の方法を図13に示す。この方法では、溶液相アシ
ルITC化合物、例えばベンゾイルITC（VII）は、固体支
持体上のカルボキシル基と直接反応し、所望の活性化ア
シルITC支持体を形成する。反応の詳細は実施例12に述
べる。
溶液相ITC化合物は市販品として得られ、または上に
引用した親出願に記載したように調製することができ
る。アシルITCを調製する方法のひとつは、ITC塩を塩基
を含む乾燥した不活性溶媒中で酸クロライドに添加す
る。
図14は炭酸とITCの混合無水物を用いて誘導された活
性化固体支持体を形成する方法を示している。この方法
で使用される固体支持体（IX）は、既知の方法に従っ
て、アルキルまたはアリール（Ａ）アルコール基を用い
て誘導される。この支持体は、トリホスゲンのようなホ
スゲンと同等のものを用いて活性化され、相当する活性
化された炭酸塩誘導体（X I）を形成する。さらにITC、
例えばTMSITCとの反応は所望の活性化支持体（X II）を
与える。
活性化支持体は安定な形で使用されるまでベンゼンま
たはトルエンのような乾燥したあるいは非プロトン性の
非求核溶媒中で保管することができる。
II B.ペプチジル−TH形成 本発明方法を実施する際に、Ｃ−末端アミノ酸を同定
するためのペプチドは、塩基性条件下にアシルITC試薬
と、好ましくはピリジンの存在で反応させ、アミノ酸の
Ｃ−末端の酸基を脱プロトン化する。Ｃ−末端アミノ酸
はＣ−末端アミノ酸THに変換され、これは環−窒素アミ
ド結合によってペプチド中の次のＣ−末端アミノ酸に結
合する。
ペプチドのアミノ基はまず、標準法（グリーン）に従
って、アシル化またはBOC（ｔ−ブチルオキシカルボニ
ル）またはFMOC（フルオレニルメトキシカルボキシル）
誘導体の生成で保護される。Ｎ−保護ペプチドは適当な
溶媒、例えばアセトニトリル中10％のピリジンで、一般
に0.1〜10μg/mlの最終ペプチド濃度にて溶解される。
次にペプチド溶液は混合した無水物固相試薬に、好まし
くは過剰のモルの活性化した混合無水物基において添加
される。一般には、約100μｌのペプチド溶液を10μｇ
の固相試薬に添加する。
TH形成反応は好ましくは50〜60℃にて約10〜60分間、
さらに好ましくは約50℃にて15〜30分間行われ、ITC試
薬とペプチド中の非カルボキシル基の反応を最小にす
る。代表的な反応条件は実施例14に示される。
図15は本発明の活性化支持体を用いる反応によってペ
プチジルTHを形成するための反応機構を示す。図15Aの
左側に示される機構では、ペプチド（X II）は混合した
無水物試薬（VI）のカルボニル炭素にて反応し、中間体
X IIIを経て、図中のX IVで示されたペプチジルアシルI
TCを形成する。無水物は反応中に生成した遊離のチオシ
アネートイオンと反応し、ペプチジルITC（X VI）を形
成する。この提案された機構では、混合した無水物試薬
は、反応性ペプチジル無水物を形成するように活性化試
薬としても、また無水物との反応に対するチオシアネー
トイオン源としても作用する。
代わりの反応機構は図15Aの右側に示される。ここで
は図中の四面体の中間体X VIIのチオシアネート基は可
能な変換された形でペプチドカルボニル炭素に移動し、
四面体の中間体X Vを形成し、これは迅速にこわれて相
当するペプチドITC化合物（X VI）を形成する。
さらに図15Aを引続いて参照すると、ペプチジル脱プ
ロトン化（求核性）酸素原子の反応の２つの可能な親電
子的部位がある。第１の部位、および図15Aの反応図に
示されたものは、カルボニルの炭素である。第２の部位
はチオカルボニル（チオシアネート）の炭素である。先
に出願した親出願に報告したように、溶液相混合無水物
を含む反応の研究では、アルキルとアリールのカルボニ
ル基（イソチオシアン酸とカルボン酸の混合無水物）は
高率の所望の炭素部位の反応生成物を特定の反応条件
（ピリジンの存在）下に与え、そして、対応して、低率
の反応生成物はチオシアネートの炭素での求核的攻撃か
ら得られる。スルホン酸混合無水物試薬は低率の所望の
生成物を与える。
分子軌道計算は、図16に示された混合無水物で行なわ
れ、これはカルボン酸のアルキル（Ａ）およびアリール
（Ｂ）混合無水物、炭酸のアルキル（Ｃ）およびアリー
ル（Ｄ）無水物、およびスルホン酸（Ｅ）のアリール混
合無水物を含む。この計算は、クオンタム・ケミストリ
ィ・プログラム・イクスチェンジ（ブルーミングトン、
IN）から入手できるMOPACプログラムを用いて、二原子
軌道のモディファイドネグレクト（MNDO）方法（デワ
ー）によって行なわれた。プログラムによってカルボニ
ルとシアネートの炭素原子に対して計算された部分電荷
は、図において５個の分子について示され、同じくカル
ボニル／シアネート炭素原子電荷の比は増加する順番で
並べた。この計算は、ペプチジルTH反応のアリールまた
はアルキル置換体のありそうな効果を試験するために用
いることができる。例えば、ベンゾイルITCの電荷比の
計算は、電子を強く引きよせる置換体、例えばフェニル
環のＦまたはNO2が相対部分電荷比にあまり影響せず、
反応生成物の比にあまり影響しないことを示している。
混合生成物の収率は図16に示された５個の化合物につ
いて観察した。化合物について計算された電荷の割合
は、シアネートの炭素が高い部分電荷によってカルボニ
ルの炭素（またはスルホニルの硫黄）にて活性化され、
従って求核的攻撃に対して一層可能性のある部位になる
ことを示している。これは、アルファ−ベータ不飽和ケ
トンの観察された反応性に類似しており、そこではケト
ンの炭素での一層大きい部分電荷が求核的攻撃に対して
ベータの炭素の反応性を高めることになる。この反応図
は、アルキルカルボン酸の混合無水物（例えば、化合物
Ａ）が最良の生成物の収率を与えることを予想している
が、アルキルカルボニルの炭素の反応性が一層高いと混
合無水物を一層加水分解を受けやすくするが、これはア
リールカルボン酸混合無水物と共に観察された所望のペ
プチジル−ITC生成物の収率が若干大きいことを説明す
ることができる。
所望のペプチジルTHを形成するためのペプチジルITC
化合物の環化は図15Bに示されており、恐らくペプチドI
TC化合物中のアミドの窒素にチオシアネートの炭素によ
る親電子的攻撃、および図中のX IXで示されるペプチジ
ルTHを形成する迅速な環化を含むであろう。この環化反
応はピリジンによって触媒作用され、以前に提案された
ように（ミラー、1989）、ピリジンがチオシアネート部
位と反応し反応性の炭素中心の反応性を高めることがで
きることを示唆している。
ペプチドと活性化固体支持体の反応に続いて、得られ
たペプチジルTHは固体支持体から、反応混合物を固体支
持体から洗浄または溶出することによって、分離され
る。本発明の重要な特徴によれば、保護されたペプチド
をペプチジル−THに変換するための唯一の反応成分は固
体支持体上に運ばれ、反応生成物はペプチジルTHを形成
する際に支持体によって脱離されない。すなわち、固体
支持体から分離したペプチジルTHはTH形成反応の活性化
試薬または試薬副生成物を含まない。
また、図15Aの下部に見られるように、反応は元（活
性化前）の酸の形の固体支持体を再生する。固体支持体
は図11〜13に関連して上述した活性化反応のいずれかに
よって活性化することができる。
別の観点では、本発明はＮ−保護アミノ酸からアミノ
酸THを生成する方法を含む。この方法は上記のものと類
似しており、Ｎ−保護ペプチドの代わりにＮ−保護アミ
ノ酸を使用する。アミノアシル−ITCの形成および相当
するアミノ酸THを生成するための環化に続いて、生成物
を固体支持体から分離し、反応物および副反応生成物を
含まない保護アミノ酸THを生成する。分離されたアミノ
酸THは、例えば既知の方法にしたがって酸または塩基の
条件下に、脱保護することができる。
II C.アミノ酸THの生成と同定 このセクションは、本発明の方法の最終工程を記載し
ており、（ａ）ペプチジルTHを残りのペプチドに結合す
るアミド結合を開裂するために有効な開裂条件下にペプ
チジルTHを処理し、そして（ｂ）単離し、単離したアミ
ノ酸THを同定する。
好ましい方法では、開裂反応は適当な溶媒中でペプチ
ジルTHを固相開裂試薬と接触させて行なわれる。すでに
報告された（ヤマシタ）ひとつの固相開裂試薬はアルド
リッチ（ミルウォーキー、WI）から入手できるカチオン
交換樹脂アンバーライト（登録商標）IR−120（プロト
ン化された形）である。図17に示したように、樹脂はペ
プチジルTHの酸接触加水分解を促進し、所望のアミノ酸
TH（X X I）および残基ペプチド（X X）を生成する。代
表的には、ペプチジルTHサンプルを樹脂（樹脂１グラム
につき入手できる約２ミリグラム当量のH+）に添加し、
混合物を２〜６時間室温にてインキュベートする。ペプ
チド溶液は真空によってペプチジルTH形成に使用される
溶媒を除去し、ペプチジルTHを水性媒体に再溶解するこ
とによって一般に調製される。
残りのペプチドはカチオン交換樹脂に結合することが
でき、樹脂を低いイオン強度の条件下に洗浄することに
よって、遊離のアミノ酸THを残りのペプチドから分離す
る。支持体に結合した残りのペプチドを用いて、遊離の
アミノ酸THは実質的に精製された形で洗浄または溶離に
よって得ることができる。引続いて残りのペプチドは高
いイオン強度またはpHで溶離することによって脱離する
ことができる。
代わりに上記のように形成された残りのペプチドおよ
びアミノ酸THを、必要ならば、アニオン交換樹脂を通る
経路によって、またはクロマトグラフィーによって、例
えばHPLCまたは分子ふるいクロマトグラフィーを用いて
分離することができる。
第２の一般的な実施例では、開裂試薬をペプチジルTH
と反応できる化学基と共に誘導し、遊離アミノ酸THを脱
離し、残りのペプチドを共有結合する。次に遊離アミノ
酸THを洗浄または溶離によって実質的に純粋な形で単離
することができ、残りのペプチドは支持体からペプチド
を加水分解して脱離することができる。
１例となる固相開裂試薬は図18に示したＮ−アルキル
誘導固体支持体（X X II）である。図中のＲ基は好まし
くはメチル基または他の低級アルキル基である。図に示
されるように、固体支持体上のヒドロキシルアミン基に
よるペプチジルTHの加水分解は、遊離アミノ酸THを脱離
すると共に、残りのペプチドの支持体へのＯ−ヒドロキ
サメートエステル結合を形成する。反応は好ましくはア
プロチック溶媒、例えばMeCN中で、トリエチルアミン
（TEA）のような有機塩基の存在で行なわれる。
アミノ酸THを回収した後、残りのペプチドは、図18の
下部に示したように、酸性にした水性媒体と接触させて
支持体から加水分解により開裂することができる。この
ようにして本方法はアミノ酸THおよび残りのペプチド
を、それぞれ反応物や副生成物を含まない実質的に精製
された形で、分離して単離する。加水分解はヒドロキシ
アミン支持体を再生する。
脱離したアミノ酸TH化合物は既知のクロマトグラフィ
ーによる方法、例えば高圧液体クロマトグラフィー（HP
LC）によって、標準の操作に従って、同定することがで
きる。化合物の同定はカラム中の走行時間を、標準法に
従ってあるいは上記アミノ酸THの調製法によって、調製
された既知の参照アミノ酸THの走行時間と比較して簡便
に行なうことができる。代わりに、脱離して単離したア
ミノ酸THを、マススペクトロメトリーまたはNMRのよう
な、他の用い得る方法によって同定することができる。
さらに一般的に、本発明は一般式： （式中のR1、R2はそれぞれアルキルまたはアリール基、
好ましくはアルキル基であり、Ｎ置換体の一つは固体支
持体に結合することができる）を有する２級ヒドロキシ
アミンを用いてペプチジル−TH試薬を加水分解すること
が考えられる。このさらに一般的な実施例では、溶液中
のあるいは固体支持体に固定化されたペプチジル−TH
を、水中でまたはアセトニトリルのような有機溶媒中
で、それ自体が溶液中である（例えばペプチジル−THが
固定化されている場合）、または固定化されている（ペ
プチジル−THが溶液中にある場合）２級ヒドロキシルア
ミンと反応させる。
好ましい２級ヒドロキシルアミンは、ジアルキルヒド
ロキシルアミン、例えばジメチルまたはジエチルヒドロ
キシルアミンであり、これらは市販されている。アリー
ルヒドロキシアミンもまた適当であるが、アミノ酸TH検
出を妨害するかも知れない。また、アリールヒドロキシ
ルアミンは酸性条件下に望ましくないアミノフェノール
に転位するかもしれない。R1、R2はまたアシル基でもよ
いが、これらの化合物は水性の条件下に過度に加水分解
を受けやすい。
II D.C−末端溶液相配列決定 このセクションは上記方法を、自動化または半自動化
操作に適するＣ−末端溶液相配列決定に応用することに
ついて述べる。ここで使用されるように、“溶液相配列
決定”は、ペプチドを溶液中に保存し、順次固相試薬を
介して再循環する配列決定反応である。これはペプチド
を固体支持体に固定化する固相配列決定とは対照的であ
り、溶液相Ｃ−末端残基活性化および開裂試薬に繰り返
し反応させる。
図19は、ペプチドPep−AAn、すなわち、ｎ残基とＣ−
末端残基AAnを有するペプチドに応用する一般の配列決
定図である。まずペプチドはピリジンのアセトニトリル
溶液のような適当な非求核性溶媒に溶解し、12で示した
充填カラムに含まれる活性化固体支持体樹脂に添加す
る。カラム12は好ましくは、固体支持体開裂試薬を含む
カラム16も含む２段階カートリッジ14の一部である。
ペプチドを活性化支持体と反応させた後、ペプチジル
THを含む反応溶液はカラム12からカラム16に溶出する。
オプションとして、２つのカラムを中間室（図には示し
ていない）によって分離することができ、そこではカラ
ム12の溶媒を真空によって除去し、サンプルをカラム16
に導入する前に第２の溶媒によって置換する。好適例で
は、固体支持体試薬は図18に示したタイプのものであ
る。この支持体は（ａ）開裂反応をカラム12の反応に使
用したものと同じ非水溶媒または溶媒混合物中で行うこ
とができ、そして（ｂ）残りのペプチドと支持体の結合
及び支持体からの脱離は共有結合によるものであり、従
ってペプチドの荷電特性に依存しないという利点をも
つ。
開裂反応は上述のような条件下に行なわれ、その後に
Ｃ−末端アミノ酸TH（AAn−TH）がカラムから溶出し、
例えばHPLCによって同定される。続いて、カラムを水性
媒体で洗浄し、結合した残りのペプチド（Pep−AAn-1）
を脱離する。
反応カラムを再使用しようとする場合、良く洗浄し、
第１のカラムを、上記のように、アシルITCの形態まで
再活性化する。代わりに、２つのカラムカートリッジ
は、新しいカートリッジで生じる追加の配列決定反応と
共に、使い捨てにすることができる。
第１の配列決定サイクルから得られた残りのペプチド
を乾燥し、適当な緩衝液中に溶解し、新しいまたは再活
性化したカートリッジに導入する。第２の配列決定サイ
クルは終りから２番目のＣ−末端残基（AAn-1−TH）の
アミノ酸THおよび２個のＣ−末端残基によって短くなっ
た残りのペプチドを生成する。配列決定サイクルは所望
の数のＣ−末端残基が同定されるまで繰り返される。高
い信頼で同定できるＣ−末端残基の全体の数は、第１の
反応カラムにおいてペプチドを所望のペプチジル−THに
変換する度合、および第２の反応カラムにおいてペプチ
ジル−THを開裂する度合に応じて変化するだろう。一般
に、反応条件は３〜５以上の残りの配列決定が望ましい
ところの生成物収率を高めるように選択されるだろう。
別の観点では、本発明はペプチドのＣ−末端アミノ酸
残基を決定するのに使用するための固相システムを含
む。このシステムはイソチオシアン酸とカルボン酸また
は炭酸の混合無水物と結合した固体支持体から成る活性
化支持体、および遊離アミノ酸チオヒダントインおよび
残りのペプチドを形成するようにペプチジルヒダントイ
ンを開裂するために有効な開裂剤を用いて誘導された固
体支持体から成る第２の支持体を含む。好ましい支持体
は、例えばカラムに充填された粒子支持体、またはペプ
チド溶液を通すことができるフィルター膜である。
前述のことから、本発明のこの実施例の種々の目的お
よび特色をいかにして達成するかを理解することができ
る。ペプチジルTH形成の方法は上に引用した親出願にお
いて開示されたアシルITC反応法の利点を提供する。特
に：本反応は（ａ）比較的迅速であり、（ｂ）穏和な反
応条件下に行なうことができ、そして（ｃ）開裂反応を
酸性条件下に行う場合、Ｃ−末端アミノ酸の立体化学を
保持し、従ってＬ−またはＤ−形態のアミノ酸を決定す
るために使用できる。
次の実施例は種々のアシル化合物の合成、およびＣ−
末端アミノ酸基を決定するためのそれらの使用、および
Ｃ−末端配列決定を説明するためのものである。これら
の実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
材料 ピリジン、塩化メチレン、エチレンオキサイド、B
F3、エチルエーテル、トリメチルアミン、ウッドワード
試薬Ｋ、トリメチルシリルITC、トリホスゲン、および
ベンゾイルITCはアルドリッチ（ミルウォーキー、WI）
から得られた。ロイシンエンケファリンはシグマから、
ジペプチドはバシェム・バイオサイエンシーズから得ら
れた。ポリジメチルアクリルアミド樹脂はジェイ・スパ
ロウに従って調製され、約0.7meq/gのアミノ基を有して
いた。これらアミノ基のイソチオシアネートへの変換は
チオカルボニルジイミダゾールおよびジイソプロピルエ
チルアミン（DIPEA）のアセトニトリル溶液を用いて行
われた。核磁気共鳴スペクトルはJeol? HX90スペクト
ロメーターで集められた。マススペクトル分析はジェイ
・レアリイの指導のもとにバークレイ・マススペクトロ
メトリー・ラボラトリーによって行われた。
ペプチドは２つの方法のひとつ：（１）尿素結合によ
って、または（２）チオ尿素結合によって（上記のイソ
チオシアネイト−樹脂を用いて）樹脂に結合させた。
（１）尿素結合：樹脂は過剰のDIPEAを用いて中和し、1
0％ピリジン/NMP中に過剰にDSCを用いて１〜２時間、室
温にて反応させた。数回洗浄後、最後にACNを用いて洗
浄し、ペプチドの10％ピリジン／水溶液を湿った樹脂に
添加し、そのまま終夜放置した。樹脂は良く洗浄し真空
下に乾燥させた。代表的な充填量は＞100ナノモル/mlで
ある。アミノ酸分析および１周のＣ−末端分析によって
確認する。
（２）チオ尿素結合：ペプチドの溶液をITC（上記）ま
たはDITC樹脂に添加し、45℃で終夜インキューベートす
る。洗浄し乾燥した後、ペプチド（アミノ末端アミノ酸
を減らして）のTFA開裂によって、続いてHPLCの特徴と
シーケンス分析によって結合を確認する。
実施例１ Leu−ValジペプチドのＣ−末端分析 A.カップリング： ペプチジル樹脂（約1mg、尿素結合を介して結合したL
eu−Val）を100μｌの10％ピリジン／アセトニトリルに
懸濁させる。ベンゾイルイソチオシアネート（BITC）
（10μｌ）を添加し、かきまぜて混合し、30分間、60℃
にて反応させた。樹脂を数容量のアセトニトリルで洗浄
し、真空下に乾燥させた。
B.加水分解： 上述で得られた樹脂を10μｌの10％プロピルアミンの
アセトニトリル溶液で湿潤させた。室温で15分後に揮発
性物質を除去し、アミノ酸THを分析のためにアセトニト
リルを用いて抽出した。
C.HPLC: 疏水性のアミノ酸チオヒダントインの分離は、PTH−C
18カラム（2.1mm×22cm、ABI）を用いる狭いボアシステ
ム（モデル120 A）、アプライド・バイオシステムズ）
およびTFA−水−アセトニトリルこう配システムで容易
に達成された。まずカラムを注入後、５分間100S Aに保
持したＡ溶媒（水中0.1％TFA、v/v）中で平衡させ、次
いでｘ分析以上ｘ％のＢ溶液（70％アセトニトリル中、
0.85％TFA）に対し勾配を展開させた。Ｂのパーセンテ
ージを次に90％まで５分以上増加させ、そこで20分間保
持した。流速は室温で200μl/分であった。流出液をTH
に対して269nmにて、またペプチドに対して214nmにてモ
ニターした。
チオヒダントインは標品物質の溶出と比較して同定し
た（下記のパートＤを参照）。パートＢでの抽出物のHP
LCは図4Bに示される。主ピークは容易にTH−Ｖとして同
定される。その帰属はコインジェクション（Coinjectio
n）によって確認した。図4Aは樹脂のトリメチルシリル
イソチオシアネート（ホウク）と反応させるコントロー
ル実験で生成したTH−Ｖ生成物を示す。
D.標品の調製： 疏水性残基のアミノ酸チオヒダントインは、古典的方
法（例えばクロムウェル）によって調製することができ
る。簡単に述べると、アミノ酸を酢酸／無水酢酸中のチ
オシアネート塩で90℃まで30分間処理する。真空乾燥し
た後、残渣を12NのHClに溶解し、室温にて１時間までの
間放置した。再び混合物を真空乾燥し、通常のように沸
騰水から残渣を再結晶した。構造式はNMRおよびマスス
ペクトロメトリーによって矛盾しなかった。
実施例２ Ala−MetジペプチドのＣ−末端分析 実施例１に記載した方法に従って、固定化Ala−Met
（尿素結合）はBITCとPAを用いて１サクイルにて分解し
た。得られたクロマトグラムは図4Dに示される。メチオ
ニンTH（Ｍ−TH）の帰属はコインジェクションによって
確認した。
実施例３ ロイシンエンケファリンＣ−末端分析 チオ尿素結合を介して樹脂に結合したLeu−エンケフ
ァリン（YGGFL）を実施例１と同様にBITCおよびPAを用
いて処理した。脱離したＬ−THはHPLCによって検出し
た。
さらに樹脂をアセトニトリルを用いて洗浄し、乾燥
し、次に水中の２％TFAを用いて60℃にて10分間処理
し、ペプチド成分を樹脂から脱離させた。単離に続くHP
LC分析および配列決定およびFABマススペクトロメトリ
ーはデスロイシンペプチドに相当する主ピークを示し、
Ｃ−末端アミノ酸の損失を確認した。
実施例４ Ｎ−保護Phe GlyのＣ−末端分析 Ｎ−保護ｔ−Boc Phe−Glyを市販品により得た。ペプ
チドを100μｌの10％ピリジン／アセトニトリル（PA）
に懸濁させた。トリメチルアセチルITC（10μｌ）を添
加し、撹拌しながら混合し、30分間60℃にて反応させ
た。樹脂を数容量のアセトニトリルで洗浄し、真空下に
乾燥させた。
ｔ−Boc基とGly−THの両者の開裂は60℃にて25％TFA/
水中で加熱して行われた。反応はHPLCによって追跡し、
出発物質の速い損失が示され（反応の15分後に判定し
た）、またＧ−THと少量の成分（多分Boc−脱保護脱ペ
プチジル−TH）の出現が示された。２時間反応したあ
と、Ｇ−THのみが検出された。
実施例５ Leu−エンケファリンのＣ−末端分析 固定化されたロイシンエンケファリン（尿素結合）を
２サイクルの化学作用に対して分解させた。エトキシカ
ルボニルイソチオシアネート（BITCの代わり）を用いて
５分間60℃にてカップリングを行った。1mg/mlのDTTを
含む水中の10μｌの10％テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウ
ムヒドロキサイドを、乾燥樹脂に添加して、45分間60℃
にて加熱して開裂を行った。クロマトグラムは図5Aと5B
に示される。このサイクルはロイシンとフェニルアラニ
ンをそれぞれ帰属させた。この帰属はコインジェクショ
ンによって確認された。
実施例６ イソロイシンの単一異性体の調製 約10μモルのｔ−Boc−イソロイシンを100μｌの10％
ピリジン／アセトニトリルに溶解させた。これを60℃に
て20分間、10μｌのBITCと共に加熱した。生成物のHPLC
分析は単一の新しい主ピーク、ｔ−Boc−Ile−チオヒダ
ントインを示した。少量のこの混合物を25％TFA中で60
℃にて10分間開裂させた。反応混合物をアセトニトリル
を用いて希釈し、HPLCによって分析した。その結果、Il
e−THに相当する単一のピークがあった。イソクラチッ
クに（11％Ｂ）ピークを走行させると、図7Bに示される
ように、異性体の改善された分解能を与え、約２％のエ
ピマー化の上部結合を予想させた。
Ｔ−Boc−イソロイシン（10モル）を100μｌの10％TM
S−ITC無水酢酸溶液に溶解した。60°で20分間加熱して
反応させた。物質を25％TFA中で60℃にて10分間開裂さ
せ、反応混合物をアセトニトリルを用いて希釈し、上述
のように、HPLCによって分析した。その結果、図7Aに示
すようにIle−THのジアステレオマーの形にに相当する
二重のピークがあった。
実施例７ スルホニルITC試薬とＮ−保護アミノ酸の反応 Ａ、ベンゼンスルホニルイソチオシアネート（BzS−IT
C）の調製 ベンゼンスルホニルクロライドをアルドリッチ・ケミ
カル社から入手した。化合物（１ミリモル）を最終容量
10mlの３ミリモルのピリジンエチルアミンを含むCH2Cl2
に溶解した。この混合物に１ミリモルのTMSITCを添加
し、反応混合物を１時間25℃にて撹拌した。ベンジルス
ルホニルイソチオシアネート（BzSITC）を、生成した塩
を濾過することによって回収し、溶媒を除去し、真空で
副生成物を揮発させた。
B.アミノ酸THを生成するための反応 １ミリモルのｔ−Boc−Leuを、ピリジンを含むジクロ
ロメタン、次に上記のＡのように調製した１ミリモルの
BzSITCに溶解した。終夜反応させた後、溶媒をロータリ
ーエバポレーターによって除去し、生成したｔ−Boc−L
eu−THをシリカゲルのクロマトグラフィーによって精製
した。TH化合物の同定はNMRとHPLCによって行った。
実施例８ BzMBTとペプチジル樹脂の反応 A.BzMBTの調製 メルカプトベンゾチアゾール（１ミリモル）とジイソ
プロピルエチルアミン（１ミリモル）を5mlのアセトニ
トリルに溶解した。ベンゾイルクロライド（１ミリモ
ル）を迅速に撹拌しながら注射器によってゆっくりと添
加した。室温にて２時間後、溶媒を一部除去してアミン
塩を沈殿させた。上澄み液をさらに濃縮し、シリカゲル
のクロマトグラフにかけた（9:1、ヘプタン：酢酸エチ
ル）。
B.反応 ペプチジル樹脂（1mgレンク、チオ尿素結合）を100μ
ｌの10％ピリジンを溶かした1mgBz−MBT含有アセトニト
リル溶液に懸濁させた。反応液を60℃にて30分間加熱
し、次いで前述のように洗浄し乾燥した。アリールチオ
ヒダントインを10％のプロピルアミンを用いて室温にて
15分間開裂させた。TFAを用いた処理では、HPLCによっ
て評価されたと同様にＣ−末端残基の喪失によって確認
されたように、残りペプチドフラグメントは樹脂から脱
離された。
実施例９ ベンソイルイソチオシアネートを用いた反応 １モルのｔ−Boc−Leuを僅かに過剰のベンゾイルイソ
チオシアネートと実施例７のものと類似した反応混合物
中で反応させた。ｔ−Boc−Leuにクロマトグラフを行
い、次に、脱保護して適度の収率のヒダントインを与
え、NMRによって確認した。
実施例10 活性化固体支持体の調製：方法１ ｐ−アミノメチルポリスチレン樹脂（１％ジビニルベ
ンゼン架橋）（2g、1.10ミリモル/g）をCH2Cl2中で予備
膨潤させた。FMOC−Glu−OtBu（３ミリモル、0.8モル過
剰）を10mlのCH2Cl2に溶解し、樹脂に添加した。N,N−
ジイソプロピルカルボジイミド（0.46ml、３モル）を直
ちに添加し、反応物を約１時間振盪した。樹脂を溶媒で
良く洗浄し、ニンヒドリンを用いて一部分テストした
（アミンは残っていなかった）。ガンマカルボキシルの
tBu保護基をトリフルオロ酢酸TFA（50％H2Cl2/TFA）を
用いて約0.4時間内に除去した。樹脂を溶媒で洗浄し、
ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）を用いて中和さ
せた。
その間に、ウッドワード試薬Ｋ（WRK、３ミリモル）
を、約２時間にわたって20ml CH2Cl2中で３当量のケテ
ンイミンに変換した。溶液はほぼ均一に黄色くなり、次
いでポリスチレン樹脂に添加した。２時間後、樹脂を洗
浄し、３ミリモルのTMSITCを添加した。終夜撹拌した
後、樹脂をCH2Cl2を用いて洗浄した。機能的になった樹
脂は0.74g重量増であった。理論的な重量増は0.87gであ
る。
実施例11 Ala−THの調製 BOC−Ala（10mg）を2mlのCH2Cl2および12μｌのピリ
ジンに溶解した。これを40℃にて100mgの新しく調製し
た樹脂上でインキュベートした。溶液相を樹脂からピペ
ットで取り出し真空遠心分離によって濃縮した。残りの
オイルをHPLCと1HNMRによってチェックした。約50％のB
OC−Alaを示した積分は対応するTHに変換されていた。B
OC基を水性TFAを用いて除去した。HPLC保持時間は標品
のAlaTHのそれと一致した。
生成したアミノ酸THは、PTH−C18カラム（2.1mm×22c
m、ABI）を用いる狭いボアシステム（モデル120 A・ア
プライドバイオシステムズ）およびTFA−水−アセトニ
トリルグラディエントシステムを用いて、HPLCによって
同定した。カラムは最初、Ａ溶媒（0.1％TFA水、v/v）
中に平衡させ、注入後５分間、100％Ａ、０％溶媒Ｂ内
に保持し、次いでリニアーグラディエントを30分にわた
って40％Ｂ溶媒（70％アセトニトリル中に0.85％TFA）
に対して展開させた。次にＢの割合を90％まで５分間に
わたって増加させ、そこで20分間保持した。流速は室温
で200μl/分であった。溶出液を269nmにてモニターし
た。
本発明は特定の試薬と方法に関して記載されている
が、本発明から離れることなく種々の改変および変更を
行うことができることは認められるだろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭62−156562（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−136101（ＪＰ，Ａ) 特開 昭47−27296（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−124333（ＪＰ，Ａ) 特公 昭49−13451（ＪＰ，Ｂ１) 米国特許3725010（ＵＳ，Ａ) Ｂｉｏ ｏｈｅｎｉｓｔｒｙ，20 （20），Ｐ．5831−６，（1981)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】保護されていないＣ−末端の遊離カルボン
    酸基を有する保護された遊離またはＣ−末端アミノ酸の
    チオヒダントイン（TH）を製造する方法が、 該アミノ酸と、（１）イソチオシアン酸と（２）カルボ
    ン酸、炭酸またはスルホン酸との混合酸無水物とを、該
    カルボン酸基がプロトン化されていない塩基性の条件下
    に接触させ、 前記接触によって該アミノ酸の該THを生成する工程から
    なる製造方法。
  2. 【請求項２】該混合酸無水物が溶液中にあり、 次式： （式中のＡはアルキル、アルコキシ、アリールまたはア
    リールオキシ基である）で表される請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】前記混合酸無水物がベンゾイルイソチオシ
    アネートである請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】ペプチドのＣ−末端アミノ酸を決定するの
    に使用するため、前記接触が、Ｃ−末端アミノ酸チオヒ
    ダントインをペプチド中の終りから２番目のＣ−末端ア
    ミノ酸にアミド結合によって結合するＣ−末端ペプチジ
    ルチオヒダントインを生成するために有効であり、そし
    てさらに前記アミド結合を開裂するために有効な条件下
    にペプチジルチオヒダントインを処理し、これによって
    Ｃ−末端アミノ酸チオヒダントインおよび長さの短くな
    ったペプチドを脱離し、該脱離したアミノ酸チオヒダン
    トインを同定する工程を含む請求項２記載の方法。
  5. 【請求項５】前記ペプチドが非Ｃ−末端残基にて固体支
    持体に結合し、さらに前記接触、生成、処理および同定
    の工程を１回またはそれ以上の回数で繰り返し、該Ｃ−
    末端ペプチド端から、該ペプチド中のアミノ酸の配列を
    同定する請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】該混合酸無水物が固体支持体に対して結合
    し、次式： （式中のＡは固体支持体に結合したアルキル、アルコキ
    シ、アリールまたはアリールオキシ基である）で表さ
    れ、該保護された遊離またはＣ−末端アミノ酸が溶液中
    にある請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】さらに前記接触によって生成された該アミ
    ノ酸THを該固体支持体から分離する工程を含む請求項６
    記載の方法。
  8. 【請求項８】該アミノ酸がペプチド中の該Ｃ−末端アミ
    ノ酸であり、前記接触が該Ｃ−末端ペプチドがアミノ酸
    THである溶液相ペプチジルTHを生成し、前記分離が該ペ
    プチジルTHを前記固体支持体から分離し、該Ｃ−末端ア
    ミノ酸THを該残りのペプチドから開裂し、そして該残り
    のペプチドを含まない該遊離アミノ酸THを単離する工程
    を含む請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】Ｃ−末端ペプチドの配列決定に使用するた
    めに、さらに該ペプチドの該Ｃ−末端アミノ酸を決定す
    るため該アミノ酸THを同定する工程を含む請求項８記載
    の方法。
  10. 【請求項１０】前記開裂が該ペプチジルTHの溶液を、該
    ペプチジルTHを開裂し共に溶液相にある該遊離アミノ酸
    THと該残りのペプチドを形成するために有効である開裂
    剤を用いて誘導された第２の固体支持体と接触させる工
    程を含む請求項８記載の方法。
  11. 【請求項１１】イソチオシアン酸およびカルボン酸また
    は炭酸の混合酸無水物と結合した固体支持体からなる、
    アミノ酸のチオヒダントインを生成するのに使用するた
    めの活性化支持体。
  12. 【請求項１２】次式： （式中のＡは固体支持体に結合したアルキル、アルコキ
    シ、アリールまたはアリールオキシ基である）で表され
    る請求項11記載の支持体。
  13. 【請求項１３】イソチオシアン酸およびカルボン酸また
    は炭酸の混合酸無水物と結合した固体支持体からなる活
    性化支持体、および ペプチジルTHを開裂して遊離アミノ酸THおよび残りのペ
    プチドを生成するために有効な開裂剤を用いて誘導され
    た固体支持体からなる第２の支持体から成る、ペプチド
    のＣ−末端アミノ酸残基を決定するのに使用するための
    固相装置。
  14. 【請求項１４】該第２の支持体が選択されたイオン強度
    とpH条件下に該残りのペプチドを選択的に結合するため
    に有効なイオン交換樹脂である請求項13記載の装置。
  15. 【請求項１５】該第２の支持体が、（ａ）該ペプチジル
    THを開裂して該遊離アミノ酸THを生成し（ｂ）該残りの
    ペプチドに共有結合するために有効なヒドロキシアミン
    基と結合した請求項14記載の装置。
  16. 【請求項１６】該混合酸無水物が、 カルボキシル基と結合した固体支持体を供給し、 該固体支持体をイソキサゾリウム化合物と共に塩基性条
    件下に反応させて、該カルボキシル基の活性化エノール
    エステルを生成し、そして 該支持体を、トリアルキルシリルITCおよびピリジン−I
    TCからなる群から選ばれたイソチオシアネート（ITC）
    と反応させる、 各工程からなる調製方法によって、該支持体上に生成し
    たイソチオシアン酸とカルボン酸の混合酸無水物であ
    る、請求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記ITCがトリメチル−ITCである請求項
    16記載の方法。
  18. 【請求項１８】イソキサゾリウム化合物が２−エチル−
    ５′フェニルイソキサゾリウムスルホネートである請求
    項16記載の方法。
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