JP2678995B2

JP2678995B2 - トリプトフアンシンターゼの製造法

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Publication number: JP2678995B2
Application number: JP63223399A
Authority: JP
Inventors: 泰朗久留主; 恵子小浜; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1988-09-08
Filing date: 1988-09-08
Publication date: 1997-11-19
Anticipated expiration: 2012-11-19
Also published as: JPH0272876A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はトリプトフアンシンターゼの製造法に関し、
更に詳しくは、トリプトフアンシンターゼ遺伝子を含む
DNA領域と、該遺伝子の発現を制御しうるプロモーター
及びオペレーターを含むDNA領域と、コリネ型細菌内で
の自律増殖能及び安定化機能を有するDNA領域から成る
プラスミドで形質転換されたコリネ型細菌を培地で培養
することによりトリプトフアンシンターゼを製造する方
法に関する。

ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ型細菌は、ア
ミノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を生産する工業
的に有用な微生物であるが、組換えDNA技術の導入によ
る菌株の育種改良は、エシエリヒア・コリ等に比べてま
だ遅れており、特に、コリネ型細菌を宿主とする工業的
に有用な安定性に優れたベクターの開発が強く望まれて
いる。

一般に造成プラスミドの宿主内での安定性に関して、
従来より、培養時に宿主からのプラスミドの脱落や挿入
遺伝子の欠落等種々の遺伝的不安定性が報告されてお
り、その対応策が検討されている。

例えば、エシエリヒア属のストレプトマイシンに依存
しないという性質をコードする染色体遺伝子DNA断片が
組み込まれたプラスミドを、エシエリヒア属のストレプ
トマイシン依存性変異株に含有せしめて、プラスミドを
含有する微生物の性質を安定化する方法が提案されてい
る（特開昭55−156591号公報参照）。

しかしながら、かかる方法は経済的に問題があるのみ
ならず、目的のプラスミドに複雑な機能を組み込む必要
があるため、宿主の分裂増殖時にプラスミドが安定に娘
細胞に分配され難いことが予想され、工業的に応用する
にはかなりの問題がある。

また、トリプトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝
子を含むDNA領域のクローニングについても従来からい
ろいろと研究されているが、トリプトフアンシンターゼ
の生合成を司る遺伝子を含むDNA領域が導入されたベク
タープラスミドは、例えばJournal of General Microbi
ology vol118、p253（1980）に記載されているように、
宿主内での安定性に問題があり、トリプトフアンの工業
的製造に応用するには多くの困難があると考えられてい
る。

本発明者らは、先にコリネ型細菌内で複製増殖しうる
ブレビバクテリウム・スタチオニスIFO12144由来のプラ
スミドpBY503上に安定化機能を担うDNA断片が存在する
ことを発見し、該DNA断片を不安定なプラスミドベクタ
ーに結合させることにより安定化させる方法を提案した
（特願昭63−185428号）。

そこで本発明者らは、上記プラスミドの安定化機能を
担うDNA断片を利用し、トリプトフアンシンターゼ遺伝
子を担うプラスミドを安定化させ、トリプトフアンシン
ターゼを安定かつ大量に製造させる方法を検討した結
果、本発明を完成するに至つた。

かくして、本発明によれば、トリプトフアンシンター
ゼ産生能を有するコリネ型細菌、殊に、少なくともトリ
プトフアンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含むDNA
領域と、コリネ型細菌内での自律増殖能及び安定化機能
を有するDNA領域とから成るプラスミドで形質転換され
たコリネ型細菌を培地で培養し、培養物からトリプトフ
アンシンターゼを採取することを特徴とするトリプトフ
アンシンターゼの製造方法が提供される。

本発明に従う上記プラスミドを構成する「トリプトフ
アンシンターゼの生合成を司る遺伝子を含むDNA領域」
（以下「Ｔ領域」と略称することがあるには、インドー
ルとＬ−又はDL−セリンからのＬ−トリプトフアンの生
合成を司る遺伝子を含む領域が包含され、しかして、Ｔ
領域には、例えば、トリプトフアンオペロン中のトリプ
ロフアンシンターゼ遺伝子を含むDNA領域（ａ）、すな
わちtrpA及びtrpBを含むDNA領域に、トリプトフアンオ
ペロン由来の該遺伝子の発現を制御しうるプロモーター
及びオペレーターを含むDNA領域（ｂ）が結合したもの
が挙げられる。これらのＴ領域として実用的にはエシエ
リヒア・コリ（Escherichia coli）由来のものが好適に
使用され、このＴ領域の供給源としては例えば、エシエ
リヒア・コリATCC23282、エシエリヒア・コリATCC2343
7、エシエリヒア・コリATCC23461等が有利に使用され
る。

これら供給源微生物からＴ領域を調製するための基本
操作としては、染色体遺伝子中にフアージφ80を感染さ
せた後誘発し、フアージDNA中にトリプトフアンオペロ
ンを取り込んだフアージを大量に調製する。次にフアー
ジDNAを抽出し、制限酵素BamH I、EcoR I等を用いてト
リプトフアンオペロンDNA断片を切り出し、このDNA断片
をさらに制限酵素Hinc IIで部分分解を行なえば、trpA
及びtrpB遺伝子を含むDNA断片が得られる。次に該DNA断
片にSa1 Iリンカーを付与し、プラスミドpDR720（フア
ルマシア製）のSa1 I部位に挿入した後EcoR Iで切り出
し、さらにプラスミドPUC9（フアルマシア製）のEcoR I
部位に挿入した後BamH Iで切り出すことによりtrpA及び
trpBとトリプトフアンプロモーター及びオペレーターと
が結合したDNA断片、すなわちＴ領域を調製することが
できる。

一方、「コリネ型細菌内での安定化機能を有するDNA
領域」（以下［Ｓ領域」と略称することがある）には、
コリネ型細菌内で複製増殖可能なプラスミドを安定化さ
せ得る機能を担う領域が包含され、例えば、ブレビバク
テリウム・スタチオニス（Brevibacterium stationis）
IFO12144（FERM Ｐ−10136）が保有するプラスミドpBY
503（このプラスミドの詳細については特願昭62−25379
号出願明細書参照）をKpn Iの如き制限酵素で切り出す
ことにより得られる約7.4kbの大きさのDNA断片が挙げら
れ、該DNA断片の各種制限酵素切断による分子量を下記
表１に示す。

以上に述べたトリプトフアンシンターゼの生合成を司
る遺伝子を含むDNA領域（Ｔ領域）と、コリネ型細菌内
での安定化機能を有するDNA領域（Ｓ領域）とを組み込
むためのベクタープラスミドとしては、コリネ型殺菌内
で複製増殖可能なものであれば特に制限はなく、例え
ば、以下のものが挙げられるが、代表例としては、特願
昭63−193659号明細書に開示されているプラスミドpCRY
−２、pCRY−３等を例示することができる。

（１） pAM330 特開昭58−67699号公報参照（２） pAM1519 特開昭58−77895号公報参照（３） pAJ655 特開昭58−192900号公報参照（４） pAJ611 同上（５） pAJ18244 同上（６） pCG1 特開昭57−134500号公報参照（７） pCG2 特開昭58−35197号公報参照（８） pCG4 特開昭47−183799号公報参照（９） pCG11 同上（10） pCRY−２特願昭63−13659号明細書参照（11） pCRY−３同上上記プラスミドベクターpCRY−及びpCRY−３を造成す
る方法としては、ブレビバクテリウム・フラバムMJ233
（FERM Ｐ−3068）及びブレビバクテリウム・スタチオ
ニスIFO12144（FERM Ｐ−10136）からプラスミドpBY50
2及びpBY5039DNAを抽出し、制限酵素Hind III又はKpn I
処理により4.1kb及び6kbのDAN断片を得る。次に該DNA断
片とプラスミドpHSG398（宝酒造製）を同様の制限酵素
で処理したものと結合させることによりpCRY−２及びpC
RY−３が造成できる（特願昭63−13659号明細書参
照）。

「Ｔ領域」及び「Ｓ領域」のかかるベクタープラスミ
ドへの導入は、例えば、まずベクタープラスミドpCRY−
３を制限酵素Kpn Iで部分分解により開裂させ、そこにp
BY503DNAをKpn Iで完全分解することにより得られる7.4
kbの「Ｓ領域」を連結酵素処理により結合させ、次に上
記プラスミドをBamH Iで完全分解により開裂させた後、
そこに前記の「Ｔ領域」を連結酵素処理により結合させ
ることにより行うことができる。

以上に述べたＴ領域及びＳ領域を導入したベクタープ
ラスミドで形質転換しうるコリネ型細菌としては、例え
ばブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium fla
vum）MJ233由来の菌株が挙げられる。なお、本菌株を宿
主として用いる場合、本菌株が保有するpBY502（特開昭
63−36787号公報参照）により形質転換が困難になる場
合があるので、そのような場合には、本菌株よりpBY502
を除去することが望ましい。そのようなプラスミドを除
去する方法としては、例えば、継代培養を繰り返すこと
により自然に欠失させることも可能であるし、人為的に
除去することも可能である［Bact.Rev.36 p361〜405
（1972）参照］。

上記プラスミドを人為的に除去する方法の一例を示せ
ば以下のとおりである。

宿主ブレビバクテリウム・フラバムMJ233の生育を不
完全に阻害する濃度のアクリジンオレンジ（濃度:0.2〜
50μg/ml）もしくはエチジウムブロミド（濃度:0.2〜50
μg/ml）等を含む培地に、1ml当り約10細胞になるよう
に植菌し、生育を不完全に阻害しながら、約24時間35℃
で培養する。培養液を希釈後寒天培地に塗布し、35℃で
約２日培養する。出現したコロニーから各々独立にプラ
スミド抽出操作を行ない、プラスミドが除去されている
株を選択する。この操作によりpBY502が除去されたブレ
ビバクテリウム・フラバムMJ233由来菌株が得られる。

このようにして得られたブレビバクテリウム・フラバ
ムMJ233由来菌株への前記プラスミドの形質転換法とし
ては、エシエリヒア・コリ及びエルビニア・カロトボラ
について知られているように［Calvin,N.M and Hanawa
lt,P.C,Journal of Bacteriology,170、2796（1988）;I
to,K.,Nishida.T and Izaki,K、Agricultural and Biol
ogical Chemistry,52、293（1988）］、DNA受容菌にパ
ルス波を通電することによりプラスミドを導入すること
が可能である。

上記の方法で形質転換して得られたトリプトフアンシ
ンターゼ産生能を有するブレビバクテリウム・フラバム
MJ233由来株の培養はそれ自体既知の方法で行なうこと
ができ、例えば以下に述べる如くして行なうことができ
る。

まず、培地に用いる炭素源としては例えばグルコー
ス、エタノール、メタノール、廃糖蜜等が、窒素源とし
てはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独もしくは
混合して用いることができる。

無機塩としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープ
リカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄
養素を培地に添加して用いることができる。

培養は通気撹拌、振とう等の好気的条件下で行ない、
培養温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃で行なう。培
養途中のpHは５〜10、好ましくは７〜８付近にて行な
い、培養中のpHの調整には酸、アルカリを添加して行な
うことができる。

培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１〜５容量
％、更に好ましくは２〜３容量％である。培養期間は１
〜７日間、最適期間は１〜３日間である。

このようにして得られる培養物から菌体を集め、それ
自体既知の方法で処理することにより、トリプトフアン
シンターゼ画分を得ることができる。

以上に本発明の内容を概括的に説明したが次に実施例
によりさらに具体的に説明する。しかしながら下記の実
施例は本発明について具体的な認識を得る一助としての
み挙げたものであり、これによつて本発明の範囲は何ら
限定するものではない。

実施例１プラスミドPBY503とプラスミドpHSG398とから成る複合
プラスミドpCRY−３の造成と性質（Ａ）プラスミドpBY503の調製プラスミドpBY503は、ブレビバクテリウム・スタチオ
ニスIFO12144FERM Ｐ−10136から新たに分離された分
子量約10メガダルトンのプラスミドであり、特願昭62−
252379号明細書に記載のプラスミドであり、次のように
して調製した。

半合成培地Ａ培地［尿素2g、（NH₄）₂SO₄7g、K₂HPO
₄0.5g、KH₂PO₄0.5g、MgSO₄0.5g、FeSO₄・7H₂O 6mg、Mn
SO₄・４〜6H₂O 6mg、酵母エキス2.5g、カザミノ酸5g、
ビオチン200μｇ、塩酸チアミン200μｇ、グルコース20
g、純水１］１に、ブレビバクテリウム・スタチオ
ニスIFO12144を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集め
た。得られた菌体を10mg/mlの濃度にリゾチームを含む
緩衝液［25mMトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、10mM EDTA、50mMグルコース］20mlに懸濁し、37℃
で１時間反応させた。反応後にアルカリ−SDS液［0.2N
NaOH、１％（w/v）SDS］40mlを添加し、緩やかに混和
して室温にて15分間静置した。次に、この反応液に酢酸
カリウム溶液［5M酢酸カリウム溶液60ml、酢酸11.5ml、
純水28.5mlの混合液］30mlを添加し、充分混和してから
氷水中に15分間静置した。

溶菌物全量を遠心管に移し、４℃で10分間、15,000×
ｇの遠心分離にかけ、上澄液を得た。

これに等量のフエノール−クロロホルム液（フエノー
ル／クロロホルム1/1混和液）を加え懸濁した後、遠心
管に移し、室温下で５分間、15,000×ｇの遠心分離にか
け、水層を回収した。水層に２倍量のエタノールを加
え、−20℃で１時間静置後、４℃で10分間、15,000×ｇ
の遠心分離にかけ、沈殿を回収した。

沈殿を減圧乾燥後、TE緩衝液［トリス10mM、EDTA 1m
M、HClにてpH＝8.0に調整］2mlに溶解した。溶解液に塩
化セシウム溶液［５倍濃度のTE緩衝液100mlに塩化セシ
ウム170gを溶解させた液］15mlと10mg/mlエチジウムブ
ロマイド溶液mlを加えて、密度を1.392g/mlに合わせ
た。この溶液を12℃で42時間、116,000×ｇの遠心分離
を行なつた。

プラスミドpBY−503は紫外線照射により遠心管内で下
方のバンドとして見い出される。このバンドを注射器で
遠心管の側面から抜きとることにより、プラスミドpBY
−503を含む分画液を得た。

次いでこの分画液を等量のイソアミルアルコールで４
回処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後
にTE緩衝液に対して透析を行なつた。このようにして得
られたプラスミドpBY−503を含む透析液に3M酢酸ナトリ
ウム溶液を最終濃度30mMに添加した後、２倍量エタノー
ルを加え、−20℃１時間静置した。この溶液を15,000×
ｇの遠心分離にかけてDNAを沈降させ、プラスミドpBY−
503を50μｇ得た。

（Ｂ）プラスミドpHSG398の準備プラスミドpHSG398は、エシエリヒア・コリ内で複製
し、クロラムフエニコール耐性を発現する分子量約1.4
メガダルトンのプラスミドであり、市販品として宝酒造
より購入が可能である。

（Ｃ）複合プラスミドpCRY−３の造成プラスミドpHSG398（宝酒造製）0.5μｇに制限酵素Kp
n I（5units）を37℃１時間反応させ、プラスミドDNAを
完全に分解した。

前記（Ａ）項で調製したプラスミドpBY503 ２μｇに
制限酵素Kpn I（1unit）を37℃で30分間反応させ、プラ
スミドDNAを部分分解した。

両者のプラスミドDNA分解物を混合し、制限酵素を不
活化するために65℃で10分間加熱処理した後、該失活溶
液中の成分が最終濃度として各々50mMトリス緩衝液pH7.
6、10mM MgCl₂、10mMジチオスレイトール、1mM ATP及
びT₄リガーゼ1unitになるように各成分を強化し、16℃
で15時間保温した。この溶液を用いてエシエリヒア・コ
リJM109コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換し
た。

形質転換株は30μg/ml（最終濃度）のクロラムフエニ
コール4100μg/ml（最終濃度）IPTG（イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド）、100μg/ml（最終濃
度）Ｘ−gal（５−ブロモ−４−クロロ−３インドリル
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含むｌ培地（トリプ
トン10g、酵母エキス5g、NaCl5g、純水１、pH7.2）で
37℃にて24時間培養し、生育株として得られた。これら
生育株のうち、白いコロニーで生育してきたものを選択
し、各々プラスミドをアルカリ−SDS法［T.Maniatis、
E.F.Fritsch、J.Sambrook、“Molecular cloning"（198
2）p90〜91参照］により抽出した。

（Ｄ）複合プラスミドのコリネ型細菌への形質転換形質転換は電気パルス法を用いて行なつた。ブレビバ
クテリウム・フラバムMJ233（FERM Ｐ−3068）プラス
ミド除去株を100mlの前記Ａ培地で対数増殖期初期まで
培養し、ペニシリンＧを１ユニツト/mlになるように添
加しさらに２時間振盪培養し、遠心分離により菌体を集
め、菌体を20mlのパルス用溶液（272mM Sucrose、7mM
KH₂PO₄、1mM MgCl₂:pH7.4）にて洗浄する。さらに菌
体を遠心分離にて集め、5mlのパルス用溶液に懸濁し、
0.75mlの細胞と前記（Ｃ）項で得られたDNA溶液50mlと
を混合し、氷中にて20分間静置する。ジーンパルサー
（バイオラド社製）を用いて、2500ボルト、25μFDに設
定し、パルスを印加後氷中に20分間静置する。全量を3m
lの前記Ａ培地に移し30℃にて１時間培養後、クロラム
フエニコール３μg/ml（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培
地に植菌し30℃で２〜３日間培養する。出現したクロラ
ムフエニコール耐性株より、上記（Ａ）項に記載の方法
を用いてプラスミドを得た。このプラスミドを各種制限
酵素で分子量を測定した。結果を下記の表２に示す。

上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドを“pC
RY−3"と命名した。

なお、複合プラスミドpCRY−３により形質転換された
ブレビバクテリウム・フラバムMJ233GE102は、茨城県筑
波郡谷田部町東１丁目１番地３号の工業技術院微生物工
業技術研究所に、昭和63年１月８日付で受託番号：微工
研菌寄第9802号（FERM Ｐ−9802）として寄託されてい
る。

実施例２プラスミドpCRY−３への安定化機能を担うDNA断片のク
ローニング（ａ）安定化機能を担うDNA断片の調製プラスミドpBY503は、ブレビバクテリウム・スタチオ
ニスIFO12144から実施例１の（Ａ）項に記載の方法によ
り調製した。このプラスミドDNA20μｇに制限酵素Kpn I
（20units）を37℃で２時間反応させ、プラスミドDNAを
完全に分解した。該分解物を0.8％のアガロースゲル電
気泳動にて分離させ、約7kbのDNA断片画分をゲルから切
り出した。該画分からDNAを抽出、精製し約５μｇのDNA
を得た。

（Ｂ）プラスミドpCRY−３への安定化機能を担うDNA
断片のクローニング実施例１で得たプラスミドpCRY−3DNA1μｇに制限酵
素Kpn I（5units）を37℃で15分間反応させプラスミドD
NAを部分分解し、前記（Ａ）項で調製したDNA断片２μ
ｇと混合し、制限酵素を不活化するために65℃で10分間
加熱処理した後、該失活溶液中の節分が最終濃度として
各々50mMトリス緩衝液pH7.6、10mM MgCl₂、10mMジチオ
スレイトール、1mM ATP及びT₄リガーゼ（1unit）にな
るように各成分を強化し、16℃で15分間保温した。該溶
液を用いてエシエリヒア・コリHB101コンピテントセル
（宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は30μg/ml（最終濃度）のクロラムフエニ
コールを含むＬ培地（トリプトン10g、酵母エキス5g、N
aCl5g、純水１、pH7.2）で37℃にて24時間培養し、生
育株として得られた。得られた生育株から各々プラスミ
ドをアルカリ−SDS法［T.Maniatis、E.F.Fritsch、.Jsa
mbrook、“Molecular clonig"（1982）p90〜91参照］に
より抽出した。

（Ｃ）プラスミドのコリネ型殺菌への形質転換形質転換は実施例１の（Ｄ）項記載の電気パルス法を
用いて行なつた。出現したクロラムフェニコール耐性株
より上記方法を用いてプラスミドを得た。このプラスミ
ドを各種制限酵素で分子量を測定した結果を下記の表３
に示す。

上記制限酵素で特徴づけられるプラスミドを“pCRY−
31"と命名した。

実施例３トリプトフアンシンターゼ遺伝子の生合成を司るDNA領
域の調製（Ａ）フアージφ80ptの調製大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）を100mlのＬ培
地（組成は前記と同じ）に接種し、37℃で約４時間振盪
した培養物0.2mlと、フアージφ80（ATCC11456a−B1）
水溶液（10⁵ケ/ml）の0.1mlとを、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培
地＋寒天沫）中に混合したのち、Ｌ培地寒天プレート上
に重層する。該プレートを37℃にて約５時間培養すると
プラーク（溶菌斑）を生じ、さらに２〜３日間37℃にて
培養を継続すると、プラーク中にフアージφ80溶原菌の
生育コロニーを生ずる。該溶原菌をＬ培地にて37℃で４
時間培養後、上記と同じＬ培地寒天プレート上に塗抹し
たのち、紫外線照射（400〜800ergs/mm²、10〜20秒）に
よる溶原フアージの誘発によりフアージφ80pt（トリプ
トフアンオペロンを含むフアージDNA）を調製する。

（Ｂ）トリプトフアンオペロン画分の調製大腸菌（E.coli）Ｋ−12株（IFO3301）を１の培地
（組成は前記と同じ）に接種し、約37℃で約３時間振盪
培養し、対数増殖期に25％（w/v）グルコース溶液10ml
と上記で調製したフアージφ80pt溶液を10¹¹ケ/mlの濃
度で添加し（moi20）、５時間振盪を継続後常法通りク
ロロホルムの添加により、フアージφ80ptを大量に調製
した［T.Maniatis、E.F.Fritsch、Sambroom;“Molecula
r clonig"（1982）p.76〜80 Cold Spring Harbor Labor
atory参照］。

次に取得したフアージφ80pt溶液をトリス緩衝液（pH
7.8）にて透析後、フエノール法により、DNA抽出法［上
記“Molecular cloning"p.85参照］によつてフアージDN
Aを抽出精製し、これに制限酵素BamH Iを与え30℃で30
分間反応させ、トリプトフアンオペロン遺伝子画分を得
た。

（Ｃ） pBR322trpの調製前記（Ｂ）項で得たトリプトフアンオペロン画分に制
限酵素Sa1 I及びXho Iを37℃にて１時間反応させ、次い
で65℃で５分間熱処理して制限酵素を失活させた後、同
様に制限酵素Sa1 Iで処理したプラスミドpBR322を添加
混合した。次いで該失活溶液中の成分が最終濃度として
各々50mMトリス緩衝液pH7.6、10mM MgCl₂、10mMジチオ
スレイトール、1mM ATP及びT₄リガーゼ1unitになるよ
うに各成分を強化し、16℃で15時間保温することによつ
てDNAを結合させた。

再結合後のDNAを用いて大腸菌Ｋ−12株（トリプトフ
アン要求性変異株、ATCC23718）を常法に従い形質転換
させ、形質転換株［Trp要求性の消失、すなわちプラス
ミド上のtrpA、trpB遺伝子により生合成可能となり、最
少培地（K₂HPO₄ 7g、KH₂PO₄ 2g、MgSO₄・7H₂O 0.1
g、（NH₄）₂SO₄ 1g、グルコース2g、純水１）上にて
生育可能となつた菌株］を得た。この菌株を常法に従い
液体培養し、培養液よりプラスミドpBR322trpを分離精
製した。

（Ｄ） trpAB画分のクローニング上記（Ｃ）項で得られたプラスミドpBR322trpを制限
酵素Sac IIとSa1 Iで37℃で１時間切断し、trpAB遺伝子
を含む画分を得た。次いで制限酵素Hinc IIを用いて37
℃で部分的に分解し、trpABを含む最小画分を得た。こ
の断片にSa1 Iリンカーを混合し、T₄DNAリガーゼで結合
させて、両末端にSa1 I部位をもつtrpAB画分を得た。

次いでpDR720（フアルマシア製）を制限酵素Sa1 Iに
て37℃１時間反応させて、65℃で５分間加熱処理して制
限酵素を失活させた後、上記trpAB画分を添加混合し
た。

該失活溶液中の成分が最終濃度として各々50mMトリス
緩衝液pH7.6、10mM MgCl₂、10mMジチオスレイトール、
1mM ATP及びT₄リガーゼ1unitになるように各成分を強
化し、16℃で15時間保温することによつて、DNAを結合
させた。

再結合後のDNAを用いて大腸菌Ｋ−12株（トリプトフ
アン要求性変異株、ATCC23718）を常法に従い形質転換
させ、形質転換株［Trp要求性の消失、すなわちプラス
ミド上のtrpA、trpB遺伝子により生合成可能となり、最
少培地（K₂HPO₄ 7g、KH₂PO₄ 2g、MgSO₄・7H₂O 0.1
g、（NH₄）₂SO₄ 1g、グルコース2g、純水１）上にて
生育可能となつた菌株］を得た。この菌株を常法に従い
液体培養し、培養液よりプラスミドpDR720−trpABを分
離精製した。

（Ｅ） pUC−９へのtrpAB遺伝子のリクローニング前（Ｄ）項で得たpDR720−trpAB画分を制限酵素Eco I
Iで37℃１時間反応させ、65℃５分間熱処理して失活さ
せた。同様にしてpUC−９（フアルマシア性）を制限酵
素EcoR Iで処理し、前記と同様にして結合させた。再結
合後のDNAを前記と同様にして形質変換させた。得られ
た菌株の中からpUC−９にtrpAB画分の挿入されたものを
選択し、常法に従いプラスミドpUC−9trpABを抽出し
た。

実施例４プラスミドpCRY−31−trp1の作成（Ａ）プラスミドpCRY−31trp1の調製実施例３で調製したプラスミドpUC−9trpAB10μｇお
よび実施例１で調製したプラスミドpCRY31 ３μｇを制
限酵素BamH Iを用いて37℃１時間反応させることにより
切断し、65℃で10分間加温することにより制限酵素を失
活させた後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々
50mMトリス緩衝液pH7.6、10mM MgCl₂、10mMジチオスレ
イトール、1mM ATP及びT₄リガーゼ1unitになるように
各成分を強化し、16℃で15時間保温することによつて、
DNAを結合させ、この溶液を用いてエシエリヒリア・コ
リHB101コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換し
た。

形質転換株は30μg/ml（最終濃度）のクロラムフエニ
コールを含むＬ培地（トリプトン10g、酵母エキス5g、N
aCl5g、純水１、pH7.2）で37℃にて24時間培養し、生
育株として得られた。得られた生育株から各々プラスミ
ドをアルカリ−SDS法［T.Maniatis、E.F.Fritsch、J.Sa
mbrook,“Molecular cloning"（1982）p.90〜91参照］
により抽出した。

（Ｂ）プラスミドのコリネ型細菌への形質転換形質転換は実施例１（Ｄ）項記載の電気パルス法を用
いて行なつた。出現したクロラムフエニコール耐性株よ
り、上記（Ａ）項記載の方法を用いてプラスミドを得
た。該プラスミドを各種制限酵素で分子量を測定した結
果を下記の表４に示す。

上記制限酵素で特徴づけられるプラスミドを“pCRY−
31−trp1"と命名した。なお、プラスミドpCRY−31−trp
1により形質転換されたブレビバクテリウム・フラバムM
J233GE1004は、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番地３
号の工業技術院微生物工業技術研究所に、昭和63年５月
26日付で受託番号：微工研菌寄第10035号（FERM Ｐ−1
0035）として寄託されている。

実施例５プラスミドpCRY−31 trp1の安定性前記のＡ培地100mlを500ml容三角フラスコに分注し、
120℃で15分間滅菌処理したものに、実施例４（Ｂ）項
で得た形質転換株を植菌し、30℃にて24時間振盪培養を
行なつた後、同様にして調製したＡ培地100mlを500ml容
三角フラスコに分注し120℃で15分間滅菌したものに1ml
当たり50cellsの割合になるように植継し、同じく30℃
にて24時間振盪培養を行なつた。次に遠心分離を用いて
集菌し、菌体を洗浄後、クロラムフエニコール５μg/ml
の割合で添加したＡ培地および無添加のＡ培地として調
製した平板培地に一定量塗抹し、30℃にて１日培養後後
生育コロニーをカウントする。

この結果、クロラムフエニコール添加および無添加培
地に生育したコロニーは同数であること、さらにＡ培地
生育コロニーは全てクロラムフエニコール添加培地に生
育すること、すなわち該プラスミドの高度の安定性を確
認した。

実施例６トリプトフアンシンターゼの製造法及び本菌体を用いる
Ｌ−トリプトフアンの生産培地（尿素0.4％、硫酸アンモニウム1.4％、KH₂PO₄0.
5％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、CaCl₂・2H₂
O 2ppm、FeSO₄・7H₂O 2ppm、MnSO₄・４〜6H₂O 2pp
m、ZnSO₄・7H₂O 2ppm、NaCl2ppm、ビオチン200μg/
、チアミン・HCl100μg/、トリプトン0.1％、酵母
エキス0.1％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅
菌（滅菌後pH7.0）した後、本発明のプラスミドpCRY−3
1−trp1を保持する菌株（FERM Ｐ−10035）を植菌し無
菌的にグルコースを最終濃度２％（w/v）となるように
加え30℃にて15時間振とう培養を行なつた。

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム2.3％、KH₂PO
₄0.05％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、FeSO₄
・7H₂O 20ppm、MnSO₄・nH₂O 20ppm、ビオチン200μg/
、チアミン・HCl100μg/、トリプトン0.3％、酵母
エキス0.3％）の1000mlを２容通気撹拌槽に仕込み、
滅菌（120℃、20分間）後、無菌的にグルコースを最終
濃度２％（w/v）となるように加え、さらに前記培養物
を20ml添加して、回転数1000rpm、通気量1vvm、温度33
℃pH7.6にて18時間培養を行つた。

尚、グルコースは、培養中培地の濃度が２重量％を越
えないように、約１〜２時間ごと断続的に添加した。

培養終了後、培養物400mlから遠心分離にて集菌後、
脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液［インドール
5g、DL−セリン20g、ピリドキサール−５′−リン酸10m
g、KCl2g、蒸留水1000ml（pH8.0に5N−KOHにて調整）］
の1000mlに懸濁後、該懸濁液を２容通気撹拌槽に仕込
み、回転数300rpm、温度37℃、pH8.0で10時間反応させ
た。反応終了後、反応液から遠心分離（6000rpm、15分
間、４℃）により上澄液を調製し、該上澄液中のＬ−ト
リプトフアンを液体クロマトグラフイーにより測定し
た。

また、反応終了液500mlをアンモニア型強酸性イオン
交換樹脂（「ダイヤイオンSK−1B」、三菱化成社製）の
カラムを通したのち、アルカリ溶液で溶出後、濃縮しＬ
−トリプトフアンの粗結晶を析出させた。

その結果、Ｌ−トリプトフアンの生成濃度は、3g/
で、精製量は1gであつた。また比較としてプラスミドpC
RY−31−trp1を保持しない宿主菌体を用いて上記方法で
反応を実施例した結果、Ｌ−トリプトフアンの生成濃度
は0.05g/であつた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:13）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくともトリプトフアンシンターゼ遺伝
子を含むDNA領域（ａ）と、該遺伝子の発現を制御しう
るプロモーター及びオペレーターを含むDNA領域（ｂ）
と、ブレビバクテリウム・スタチオニス（Brevibacteri
um stationis）IFO12144（FERM Ｐ−10136）が保有す
るプラスミドpBY503をKpn Iで切り出すことにより得ら
れる約7.4kbの大きさのDNA断片を含むコリネ型細菌細胞
内での自律増殖能及び安定化機能を有するDNA領域
（ｃ）とから成るプラスミドで形質転換されたトリプト
フアンシンターゼ産生能を有するコリネ型細菌を培地で
培養し、培養物からトリプトフアンシンターゼを採取す
ることを特徴とするトリプトフアンシンターゼの製造
法。
【請求項２】トリプトフアンシンターゼ遺伝子を含むDN
A領域（ａ）が、エシエリヒア・コリ染色体由来のtrpA
及びtrpBを含むDNA領域である特許請求の範囲第１項記
載の方法。
【請求項３】トリプトフアンシンターゼ遺伝子を発現制
御しうるプロモーター及びオペレーターを含むDNA領域
（ｂ）が、トリプトフアンオペロン由来である特許請求
の範囲第１項記載の方法。
【請求項４】プラスミドが、ブレビバクテリウム・フラ
バム（Brevibacterium flavum）MJ233GE1004（FERM Ｐ
−10035）が保有するプラスミドpCRY−31 trp1である
特許請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項５】コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フラ
バムMJ233由来の菌株である特許請求の範囲第１項記載
の方法。
【請求項６】少なくともトリプトフアンシンターゼ遺伝
子を含むDNA領域（ａ）と、該遺伝子の発現を制御しう
るプロモーター及びオペレーターを含むDNA領域（ｂ）
と、ブレビバクテリウム・スタチオニス（Brevibacteri
um stationis）IFO12144（FERM Ｐ−10136）が保有す
るプラスミドpBY503をKpn Iで切り出すことにより得ら
れる約7.4kbの大きさのDNA断片を含むコリネ型細菌細胞
内での自律増殖能及び安定化機能を有するDNA領域
（ｃ）とから成るプラスミドで形質転換されたトリプト
フアンシンターゼ産生能を有するコリネ型細菌。
【請求項７】少なくともトリプトフアンシンターゼ遺伝
子を含むDNA領域（ａ）と、該遺伝子の発現を制御しう
るプロモーター及びオペレーターを含むDAN領域（ｂ）
と、ブレビバクテリウム・スタチオニス（Brevibacteri
um stationis）IFO12144（FERM Ｐ−10136）が保有す
るプラスミドpBY503をKpn Iで切り出すことにより得ら
れる約7.4kbの大きさのDNA断片を含むコリネ型細菌細胞
内での自律増殖能及び安定化機能を有するDNA領域
（ｃ）とから成るプラスミドで形質転換されたブレビバ
クテリウム・フラバムMJ233GE1004（FERM Ｐ−1003
5）。