[go: up one dir, main page]

JP2528721B2 - セルロ―ス結合融合タンパク質 - Google Patents

セルロ―ス結合融合タンパク質

Info

Publication number
JP2528721B2
JP2528721B2 JP1507496A JP50749689A JP2528721B2 JP 2528721 B2 JP2528721 B2 JP 2528721B2 JP 1507496 A JP1507496 A JP 1507496A JP 50749689 A JP50749689 A JP 50749689A JP 2528721 B2 JP2528721 B2 JP 2528721B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
matrix
fusion protein
substrate
cellulase
cellulose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP1507496A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH03501261A (ja
Inventor
ジー キルバーン，ダグラス
シー ミラー，ロバート
エイ ジェイ ウォレン，リチャード
アール ジルクス，ネイル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of British Columbia
Original Assignee
University of British Columbia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of British Columbia filed Critical University of British Columbia
Publication of JPH03501261A publication Critical patent/JPH03501261A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2528721B2 publication Critical patent/JP2528721B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08H—DERIVATIVES OF NATURAL MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08H8/00—Macromolecular compounds derived from lignocellulosic materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B15/00—Preparation of other cellulose derivatives or modified cellulose, e.g. complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
    • C12N11/12—Cellulose or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21H—PULP COMPOSITIONS; PREPARATION THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASSES D21C OR D21D; IMPREGNATING OR COATING OF PAPER; TREATMENT OF FINISHED PAPER NOT COVERED BY CLASS B31 OR SUBCLASS D21G; PAPER NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D21H17/00—Non-fibrous material added to the pulp, characterised by its constitution; Paper-impregnating material characterised by its constitution
    • D21H17/005—Microorganisms or enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/813—Carrier is a saccharide
    • Y10S530/814—Cellulose or derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の技術分野 本発明は、ポリサッカロイドマトリックスに結合可能
なキメラポリペプチドを含むポリペプチド組成物（セル
ロース結合融合タンパク質）および組換えDNA技術を用
いた該組成物の製造方法に関するものである。
本発明の技術的背景 微生物系における遺伝子発現よる外来タンパク質の生
産は、大量に同一のタンパク質を得るうえで重要であ
る。遺伝子組換えによって生産されるタンパク質（組換
えタンパク質;recombinant protein）の精製およびその
再生は発酵工程をデザインする際に考慮すべきものの中
で重要課題である。組換えタンパク質を単離する手段と
して伝統的なタンパク質精製手段のみならず、融合タン
パク質（fusion protein）を用いる方法がある。この融
合タンパク質はアフィニテイクロマトグラフィによって
精製することが可能で、目的とする融合タンパク質の構
成成分はアフニテイマトリックスへのポリペプチドの共
有結合にもとづく結合によって精製される。例えば、β
−ガラクトシダーゼと融合した目的とするタンパク質か
らなる融合タンパク質はｐ−アミノ−フェニル−β−Ｄ
−チオ−ガラクトシド−セファロースカラムによって精
製することができる。このような方法はウイルス抗原の
ような免疫原性ポリペプチドを精製するのに用いられて
きた。また、免疫グロブリンのFc領域に対して特異的に
結合するスタフイロコッカス（ブドウ球菌）プロテイン
Ａも、その特異的性質を利用してアフィニテイ精製に用
いることができる。
精製に加えて、融合したものから元の構成成分を回収
することはしばしば必要とされることである。そこで、
化学的および生物学的方法によって融合タンパク質を分
割し、その構成成分または断片に分けることが行なわれ
てきた。例えば、低pH環境によって酸に不安定なアスパ
ラチルプロリンによって連結された２つの断片からなる
融合タンパク質を分割することができる。この方法を用
いることができるのは主に目的とする断片が酸に対して
不安定なものではない場合である。また、インシュリン
やソマトスタチンのようなホルモンから構成される融合
タンパク質の場合は臭化シアンによって分割することが
可能である。この臭化シアンはメチオニン残基のカルボ
キシル側に特異的に作用し、融合タンパク質を分割して
目的とするホルモンを離す。しかし、この方法は目的と
するタンパク質がメチオニン残基を含む場合には適当で
ない。
部位特異的なタンパク質加水分解による融合タンパク
質の分割についても研究されてきた。例えば、ニワトリ
α−２コラーゲン前駆体リンカー（chicken pro α−2
collagen linker）を挿入した融合タンパク質は微生物
由来の精製コラーゲナーゼによって特異的に分解され、
その分解にともなって構成成分が放出される。
組換えタンパク質の精製および回収のための他の方法
として、タンパク質のカルボキシル末端にポリアルギニ
ン鎖を設ける方法もある。
アルギニン残基はタンパク質の全体的な塩基性（base
icity）を増大させてイオン交換クロマトグラフィによ
る目的とするタンパク質の精製を可能にさせるものであ
る。カルボキシルペプチダーゼＢによるポリアルギニン
末端の連続的な切断によって目的とするタンパク質の回
収が可能となり、また目的とするタンパク質のpI値を減
少させることによって塩基性コンタミからの精製を可能
とする。
目的とするタンパク質の精製または固定のための安価
で、かつ簡易な方法を開発することは大変興味の持たれ
ることである。セルロースのような炭水化物ポリマー
は、大量入手可能で安価なものであり、さらに特異的に
結合する酵素が豊富に存在することが知られていること
から、融合タンパク質の精製および（または）固定化の
ための材料として好適である。そこで、酵素のようなも
のが結合する炭水化物ポリマーからなる部位を少なくと
も部分的に有する融合タンパク質を調製することが注目
されている。
関連文献 セルロースの精製に用いられるセルラーゼの親和性に
関する文献： Boyer et al.,Biotechnol.Bioeng.(1987)29:176-179 Halliwell et al.,Biochem J.(1978)169:713-735 Mar'yanov et al.,Biokhimiya(1984)19:405-104 Nummi et al.,Anal.Biochem.(1981)116:137-141 van Tilbeurgh et al.,FEBS letters(1986)204:223-227 Cellulomonas fimiから得たいくつかのセルロース遺
伝子をE. coliにクローン化することに関する文献： Whittle et al.,Gene(1982)17:139-145 Gilkes et al..,J.Gen.Microbiol.(1984)130:1377-1384 アビセル（Avicel;微結晶セルロース）をネイテイブ
な酵素を精製するのに用いることに関する文献： Gilkes et al.,J.Biol.Chem.(1984)259:10455-10459 アビセル（Avicel;微結晶セルロース）を組換え酵素
を精製するのに用いることに関する文献： Owolabi et al.,Appl.Environ.Microbiol.(1988)54:518
-523 マルトースに結合する二価性（bifunctional）ハイブ
リッドタンバク質について記載した文献： Bedouelle et al.,Eur.J.Biochem.(1988)171:541-549 C. fimiの２種類のセルラーゼ、すなわちエクソグル
カンアーゼ（Cex）およびエンドグルカンアーゼ（Cen
A）についての特長が記載され、かつそれらの遺伝子cex
およびcenAの配列決定がされたことに関する文献： Wong et al.,Gene(1986)44:315-324 O'Neill et al.,Gene(1986)44:325-330 推測されたアミノ酸配列がそれらの酵素のドメイン構
造を明らかにすることに関する文献： Warren et al.,PROTEINS:Structure,Function,and Gene
tics(1986)1:335-341 他のセルラーゼにおいてもドメイン構造が調べられた
ことに関する文献： Teeri et al.,Publications(1987)38:Technical center
of Finland Teeri et al.,Gene(1987)51:43-52 加水分解による分割によって分離したドメインによっ
てドメイン構造についてのいくつかの知見が得られたこ
とを報告する文献： Langsford et al.,FEBS Letters(1986)204:223-227 Tomme et al.,Eur.J.Biolchem.(1988)170:575-581 van Tilbeurgh et al.,Eur.J.Biochem.(1988)170:575-5
81 van Tilbeurgh et al.,FEBS letters(1986)204:223-227 C. fimi培養液上清中に見いだされたセリンプロテア
ーゼに関する文献： Langsford et al.,J.Gen.Microbiol.(1984)130:1367-13
76 前記セリンプロテアーゼが基質結合した組換え体cenA
およびCexを分割し、セルロースに対する親和性の著し
い減少を伴って触媒的に活性な断片（catalytically-ac
tive fragments）を放出することに関する文献： Langsford et al.,ERBS letters(1987)225:163-167 残りの断片は両酵素の低電荷密度の変化領域（irregu
lar regions of low charge density）に該当し、かつ
それらの酵素のセルロース結合ドメインをなすと考えら
れている。
本発明の要約 本発明の目的はポリサッカライドマトリックスに結合
可能な融合タンパク質（セルロース結合融合タンパク
質;cellulose binding fusion protein）とそのための
調製方法とを提供することである。本発明にもとづくセ
ルロース結合融合タンパク質（以下、融合タンパク質と
呼ぶ）はポリサッカロイドの基質結合領域から少なくと
もなるものである。融合タンパク質は、目的とするポリ
ペプチドをコードする遺伝子に連結（ligated）し、か
つポリサッカロイダーゼの基質結合領域をコードするDN
A断片から少なくともなるDNAを宿主細胞に導入して形質
転換させて調製される。これによって得られた融合タン
パク質はポリサカロイダーゼの基質からなる固形支持体
（solid support）に容易に結合する。その組成物は種
々の興味あるポリペプチドのどれかを含むポリサッカロ
イドマトリックスを調製するために用いられるか、ある
いは融合タンパク質または興味あるポリペプチドの精製
方法に用いられる。
図の詳細な説明 第１図はCex発現プラスミドpeC-1.1およびpUC12-1.1c
exの構成を示すものである。β−ラクタマーゼ(Apr)、C
ex（クロスハッチスクエア）およびlac遺伝子のプロモ
ーターをコードする遺伝子の機能的位置関係は矢印で示
してある。制限酵素による切断部位はそれぞれＢ＝BamH
I、Ｅ＝EcoRI、H3＝Hind III、Ｓ＝Sal Iの略号で示
す。
第２図はRBS、翻訳開始部位、さらにβGal-exg発現プ
ラスミドpUC12-1.1 cex、pUC12-1.1（737）およびpUC12
-1.1（PTIS）の融合結合部のアミノ末端に関するDNA配
列を示すものである。
第３図はpUCEC2の構成を示すものである。
第４図は（Ａ）pcEC2および（Ｂ）pUCEC2におけるlac
ZとcenAとの融合部分の核酸およびアミノ酸配列を示す
ものである。
第５図はpEO1の構成を示すものである。
Sp＝SphI、Ss＝ハイブリッドSmaI、Sa＝SalI、PS＝Ps
tI、ABG＝β−ガラクトシダーゼ遺伝子Cexエクソグルコ
ナーゼ遺伝子、SED＝基質結合ドメイン、PT＝プロリン
−スレオニンボックスハッチドボックスマルチプルクロ
ーニング部位。
第６図はpUC12-1.1cex（PTIS）を直線状にして制限酵
素による切断部位を表した概略説明図である。
第７図は（Ａ）融合酵素のフェド−バッチ生産（fed-
batch production）、精製および固定についての概略説
明図、（Ｂ）セルロース様物質をグルコースに加水分解
するための再利用可能なファーメンター・固定カラム
（fermentor-immobilization column）の概略説明図で
ある。
実施態様の説明 融合タンパク質は幅広い分野に利用でき、例えばタン
パク質の精製や固定化、さらに固形診断剤（solid phas
e diagnostics）の調製方法において融合タンパク質の
利用が求められている。また、目的とする化合物をポリ
サッカロイドに結合させるための手段として融合タンパ
ク質を利用することも求められている。そこで、本発明
にもとづく実施態様においてはセルラーゼの基質結合部
分が少なくとも目的とするタンパク質に融合した融合タ
ンパク質からなる新規な組成物およびその調製方法を提
供する。
少なくとも、目的とするポリペプチドをコードする遺
伝子を含むDNA断片と連結（ligated）させたポリサッカ
ロイダーゼの基質結合領域をコードする遺伝子を含むDN
A断片とからなるDNAを宿主細胞に導入する。そしてそれ
らの遺伝子を導入された宿主細胞を増殖させ、かつそれ
らの遺伝子を発現させることによって、それの遺伝子に
もとづく組成物、すなわち融合タンパク質の調製をおこ
なう。このような系に用いることが可能な宿主細胞は大
腸菌などの原核細胞のみならず酵母などの真核細胞でも
よい。このようにして調製される融合タンパク質はその
大部分が以下の式によって表すことが可能である。
SBR-MR-X この式で、SBRは、ポリペプチドのＮ末端叉はＣ末端領
域であり、少なくともポリサッカロイダーゼの基質結合
領域を含む108から134のアミノ酸からなるアミノ酸配列
である。
MRは中間に位置する領域で、炭素数が２ないし30また
はアミノ酸が２ないし20からなるSBRとＸとを結合する
部位である。この領域は融合タンパク質が特異的に切断
されるためのアミノ酸配列を含む部分で、そのアミノ配
列はイムノグロブリンA1プロテアーゼのような高特異性
タンパク質分解酵素によって認識される部位と一致す
る。
ＸはＮ−末端またはＣ−末端領域にあたる部分で、目
的とするポリペプチド全体あるいはその断片を含む。目
的とするポリペプチドとしては、酵素、ホルモン、イム
ノグロブリン、色素等が考えられる。
融合タンパク質の調製 セルロース遺伝子の単離方法は従来技術、すなわちゲ
ノムDNAあるいはcDNAにもとづく方法、またはそれらの
組み合わせを含む方法等によって行なった。また、多く
の遺伝子操作技術が知られており、それらの方法として
例えば消化、連結、制限、in vitroにおける突然変異誘
発、プライマー修復、リンカーおよびアダプターの利用
などがある(Maniatis et al.,Molecular Clonig,Cold S
pring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New Yor
k,1982)。
ゲノムDNAを利用する方法は、本発明の実施に好適な
セルラーゼ遺伝子を有する生物からゲノムDNAライブラ
リーを調製して行なう。例えば、そのようなセルラーゼ
遺伝子はCellulomonas fimi、Trichoderma resei等の菌
株から得ることができる。そのような菌株からゲノムDN
Aを単離し、適当な制限酵素、例えばBam HIによって切
断する。得られた断片はベクターに組み込む。好ましい
ベクターとしてはプラスミドpBR332があり、制限エンド
ヌクレアーゼBam HIによって切断して前記断片が挿入で
きるようにする。セルラーゼのアミノ酸配列をもとにし
て、前記断片を組み込まれたベクターを導入された宿主
細胞が生産するセルラーゼ遺伝子に関係したmRNAまたは
DNAから調製されたcDNAまたはゲノムライブラリーをス
クリーニングするためのプローブをデザインすることが
できる。
セルラーゼcDNAまたはその断片をハイブリダイゼーシ
ョンのためのプローブとして用いることによって、他の
微生物に存在する構造的に類似した遺伝子をクローン化
することができる。例えば、Cellulomonas fimiのセル
ラーゼ遺伝子に関するヌクレオチド配列をもとにしてオ
リゴヌクレオチドプローブを調製し、このプローブによ
ってセルラーゼ活性を有する生物から、その活性に関係
する遺伝子を単離することが可能である。そのようなプ
ローブは実際の配列よりも短いものだが、少なくとも10
塩基、好ましくは、14塩基からなるヌクレオチド配列を
有するものが考えられる。実際の遺伝子と同じくらいま
で、あるいはそれより長いヌクレオチド配列も利用可能
であり、好ましくは500塩基、寄り好ましくは250塩基の
ヌクレオチド配列の長さのものを利用することが可能で
ある。もちろん、プローブはRNAまたはDNAのどちらでも
よい。
プローブとして利用するに当たっては、プローブを標
識（例えば32P、3H、ビオチンまたはアビジンによる標
識）し、目的とする遺伝子を有する生物から得た一重鎖
DNAまたはRNAとともにインキュベートしてハイブリダイ
ズさせる。ハイブリダイゼーションは一重鎖DNAと二重
鎖（ハイブリッド）DNA（またはRNA/DNA）とを分離（普
通はニトロセルロース紙による）したのち、プローブに
付けられた標識によって検知することができる。なお、
このようなハイブリダイゼーション方法は当業者にとっ
ては既知のことである。
一般的にはプローブは同定を容易ならしめる検知可能
な標識を付けて用いられるのだが、未標識のオリゴヌク
レオチドも利用可能で、二重鎖DNA（またはDNA/RNA）を
直接的に検知する方法に利用できる。したがって、「オ
リゴヌクレオチドプローブ」という言葉の中には標識さ
れたものと標識されないものとが含まれる。
セルラーゼのセルロース結合ドメインを単離するため
に、いくつかの遺伝学的アプローチを試みた。
ひとつの方法は制限方法を用いるもので、制限酵素に
よって遺伝子の一部分を切り取り、そして遺伝子の一部
分を欠失した遺伝子をベクターに挿入することによって
特定遺伝子由来の欠損タンパク質を得ることである。他
の方法はエクソヌクレアーゼを用いるもので、例えばBa
l31のようなエクソヌクレアーゼを用いて遺伝子中に生
じた制限酵素による切断欠失部分の内側から、あるいは
３′末端および５′末端の外側からヌクレオチドを取り
除いて遺伝子の特定部分を欠失させる。このような遺伝
子の欠失による方法によって得られた変異遺伝子由来の
欠損タンパク質の基質結合能を調べることによって元の
タンパク質の基質結合部位等を推測することができる。
基質結合能、結合活性等を調べるための好適な基質と
してはアビセル（Avicel）、コットンファイバー、フイ
ルターペーパー、クラフトまたはグラウンドウッドパル
プなどがある。
基質結合領域をコードするヌクレオチド配列をcDNAま
たは染色体DNAとして同定することができたら、このヌ
クレオチド配列を含種々の方法を用いて目的とするポリ
ペプチドをコードする遺伝子を含むDNA配列に融合させ
る。つぎに、ポリサッカロイド結合をコードする断片と
目的とするポリペプチドをコードするDNAとを連結させ
る。そして、種々の方法を用いて連結されたDNAに含ま
れる遺伝子をベクターを介して宿主細胞に導入し、この
宿主細胞の翻訳系を利用して発現させる。宿主細胞とし
ては、例えばE.coliなどの原核生物や、例えばSaccharo
myces cerevisiaeがなどの真核生物を用いることができ
る。
用いる制限酵素に合わせてそのアミノ酸配列を変えた
複数のポリペプチド断片のアミノ酸配列を持つ融合タン
パク質を発現することのできるプラスミドの調製は実施
例のところで詳細に説明する。
細菌に含まれる転写調節領域またはプロモーターは、
lacプロモーター、TACプロモーター、ラムダレフトおよ
びライトプロモーター、trpおよびlacプロモーター、ta
cプロモーターなどを含む。転写調節領域は融合タンパ
ク質の生産に関係した遺伝子発現を調節する配列を含む
もので、この遺伝子発現は成長培地中における温度条
件、栄養条件あるいは遺伝子産物の存在によって制御さ
れる。例えば、融合タンパク質の生産に関連した遺伝子
の発現はラムダファージのPLプロモーター、OLオペレー
ターおよび温度感受性リプレッサー含む調節領域を利用
することによって、温度条件を変えることによって制御
することができる。プロモーターの調節はレセプターと
オペレーターとの相互作用によって達成される。
発現カセット（expression cassette）は宿主細胞に
おいてプラスミドとして維持されるための複製系のなか
に含まれるかあるいは含まれないで、宿主ゲノムに挿入
（integrate）される。宿主細胞に外来DNAを導入する方
法として、例えばリン酸カルシウム共沈殿法、ウイルス
とその宿主となる細胞との接触による感染、細胞へのマ
イクロインジェクションによるDNA導入などが知られて
いる。融合遺伝子を適当な宿主細胞に導入すると、宿主
細胞は融合遺伝子を発現するために成長する。このこと
は、例えば、構造遺伝子をリーデイングフレーム中に挿
入し、このリーデイングフレームから上流にはシグナル
配列（セクレタリリーダー）を置く必要がある。実例と
して挙げられるセクレタリリーダーはペニシリナーゼ、
イムノグロブリン、Ｔ細胞レセプター、外被タンパク質
などのセクレタリリーダーがある。適当なリーデイング
フレーム内での融合によって、キメラペプチドを培地中
に分泌させることが可能となる。
目的とする遺伝子産物が細胞外に分泌されずに宿主細
胞中に残されている場合は、細胞を飢餓状態にして溶菌
して細胞外に出す。そして遺伝子産物をポリサカロイド
基質に結合させることによって単離および精製を行な
う。
前記遺伝子産物が活性タンパク質である場合、その活
性タンパク質の活性機能が野生型のものと同等となるよ
うにするためには野生型と同等の立体構造をとるような
形で生産、分泌される必要があろう。
前記の組換えによって得られた遺伝子産物はグリコシ
ル化または非グリコシル化されたものである。グリコシ
ル化の度合は、部分的には遺伝子産物であるポリペプチ
ドのアミノ酸配列にもとづき、さらに宿主細胞の種類に
よって決まる。例えば、E.coli細胞においてはグリコシ
ル化されることなく非グリコシル化遺伝子産物が得ら
れ、昆虫細胞においては哺乳類細胞における場合よりも
グリコシル化の度合いが少ない。叉、酵母の場合はグリ
コシレーション過剰となる。
さらに、融合遺伝子から融合タンパク質を生産するこ
とに加えて、融合タンパク質を化学合成することも可能
である。すなわち、基質結合領域またはその集まったも
のを精製し、当業者において既知の方法によって目的と
するポリペプチドに化学的に結合させることができる。
融合タンパク質の利用 本発明にもとづく組成物の適用範囲は広範囲にわた
る。例えば、インターロイキン２、第VIII因子、リグニ
ナーゼ、TPAなどの生物学的試料を精製する際に、該試
料を含む組換えタンパク質を既知のタンパク質精製方法
にもとづいてセルロースのポリサッカロイド結合領域に
結合させたのち、組換えタンパク質のセルロース結合領
域に存在するアミノ酸配列に特異的に作用するプロテア
ーゼを用いてポリサッカロイド結合領域から離すして単
離および精製することが可能である。
本発明にもとづく組成物はセルロース性支持体上に目
的とするポリペプチドを固定する手段として用いること
ができる。なぜなら、基質結合領域はセルロースに強固
にかつ特異的に吸着するからで、以下のような種々の利
用法がある。
臨床検査のための固体状剤、例えば、酵素、抗体フラ
グメント、ペプチドホルモンなどの調製に利用すること
ができる。
クリアランス値を減少させるために薬物を結合させる
ために利用することもでき、そのような薬物としてイン
ターロイキン２のようなポリペプチド、またセルロース
は溶解可能なもの（例えば、カルボキシルメチルセルロ
ース）または固体状支持体（例えば、微結晶セルロース
（アビセル））が考えられる。
薬物を運ぶために、その薬物を単独であるいは免疫原
性を高めるためにアジュバントとともにカルボキシメチ
ルセルロースに結合させることもできる。
色素の結合にも利用できる。すなわち、紙とか生地
（綿）などのようなセルロース性表面に印刷あるいは塗
装することに利用できる。
加水分解や相乗効果を与えるために利用することが可
能で、例えば木材の加工のためにリグニナーゼのような
酵素を結合させたり、木材パルプを漂白するためにポル
フィリンを結合させたりすることができる。
農業上の利用方法としては、例えば、BTトキシンや他
の抗微生物剤を植物表面に結合させることができる。ま
た、窒素固定のために、根表面に窒素固定細菌を結合さ
せるの利用できる。さらに、肥料の放出や、抗菌剤の放
出を維持するのに利用できる。海水のような高塩濃度条
件下で表面が汚れるのを防ぐことにも利用可能で、この
ような場合には淡水に移すことによって融合タンパク質
を取り除くことができよう。
セルロース支持体に結合させるポリペプチドはその使
用方法や目的に合わせて標識したり、あるいは未標識の
まま使用することができる。標識物質としては、例え
ば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発色物質、粒
子、酵素基質または補酵素、酵素阻害剤、磁性粒子など
がある。また、これらの標識物質をポリペプチドに結合
させる方法も色々あり、例えば他のアミノ酸を保護した
状態で、末端にあるアミノ酸にピロレゾンを形成させ
て。このピロレゾンに種々の標識物質を結合させること
ができる。
以下の実施例は本発明の限界を示すものではなく、具
体的な説明を行なうためのものである。
実験 略語について pNPC＝ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシド、 HPA＝アズール粉末、 gCenAおよびgCex＝C.fimiから得たCenAおよびCexのグ
リコシル化したもの、 ngCenAおよびngCex＝組換えE.coliから得たCenAおよ
びCexのグリコシル化したもの、 RPC＝逆相クロマトグラフィ、 SDS-PAGE＝ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動、 α−Pro/Thr＝合成Pro/Thrボックスに対するウサギ抗
血清、PMSF＝フェニルメチルサルホニルフルオライド。
提供を受けた生物学的系統 以下のものをアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン（ATCC、所在地：米国 20852メリーランド州ロック
ビル、パークローンドライブ12301番地）から提供して
いただいた。
プラスミドpEC-1含有大腸菌（Escherichia coli C60
0）:1986年３月27日供託、ATCC承認番号第67120号、 クローン化したCex遺伝子を挿入したプラスミドpCEC-
2含有大腸菌（Escherichia coli C600）の継代培養株:
1986年４月23日供託、ATCC承認番号第67101号、 クローン化したCex遺伝子を挿入したプラスミドpEC-1
（pUC12-1.1cex）含有大腸菌（Escherichia coli JM8
3）の継代培養株:1986年４月23日供託、ATCC承認番号第
67102号。
実施例１ Cex遺伝子発現プラスミドの構成 A.細菌の株およびプラスミド 宿主細胞として用いる大腸菌株C600（thr-1,leu-6,th
i-1,supE44,lacyY1およびtonA21）およびプラスミドpcI
857およびpCP3はエリックレモー（Erik Remaut）から入
手した。また、これらの細菌およびプラスミドについて
は「遺伝子（Gene）」（1983年発行、第22巻、第103-11
3頁）に記載されている。
B.組換えDNA技術 DNAの調製および酵素反応に関してはコールドスプリ
ングハーバー研究所が出版したマニュアル（Maniatis e
t al.,Molecular Cloning:A laboratory Manual,Cold
Spring Harbor labo.,Cold Spring Harbor,MY.）にもと
づいた。
制限エンドヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼＩ（クレ
ノーフラグメント）、T4DNAリガーゼおよび簡易翻訳開
始部位（PTIS;portable translation initiation sit
e）はファルマシア（Pharmasia Inc.）製品を購入し
た。
ラムダファージの左方向プロモーター（PL）を持つプ
ラスミドをラムダファージのcI857遺伝子を持つ株へ導
入して遺伝子発現（細菌性形質転換;bacterial transfo
rmation）させる方法は以下の点を除いて前記マニュア
ルに記載された方法にもとづいた。すなわち、本実施例
では細菌細胞に34℃、２分の熱刺激（ヒートショック）
を与え、LB培地で１時間インキュベートしたのち選択培
地上に移した。
C.細菌の増殖と誘導 細菌はLB培地（前記マニュアル参照のこと）に0.4％
グルコース、50μm/mlカナマイシンおよび75μm/mlアン
ピシリンを加えてオートクレーヴした後、該培地におい
て細菌を増殖させる。この増殖は30℃で行ない、吸光度
が600nmにおいて0.3の値になるまで増殖させる。増殖
後、培地上の増殖した菌株を二分して一方は30℃（非誘
導）で増殖を行ない、他方は41℃（誘導）で増殖させ
た。
D.cex遺伝子の単離 C．fimiからcex遺伝子を単離する方法は米国特許出願
第859,042号（1986年５月２日出願）にもとづいて行な
った。詳細は該特許出願を参照するとよい。
E.プラスミドの構成 1.pUC12-1.1cex 、C．fimi由来DNA断片（6.6kbp.の長さ）上にクロー
ン化されたcex遺伝子を、BamHIによって切り取り、かつ
プラスミドpBR322のBamHI部位に挿入してpEC-1プラスミ
ドを形成する。
cex遺伝子の位置はpEC-1.1プラスミドとなる2.56kbp
からなるBam HI-Sal I DNA断片に対する欠失地図作成に
よって決定することができる（第１図）。
pUC12-1.1cexプラスミドは第１図に示すように、pEC-
1.1から単離した2.56kbp断片をpUC12プラスミド上のE．
coliラクトースオペロン（lacZp/o）のプロモーター・
オペレーター領域から反対側下流に位置するところに挿
入して得られた（Gene（1982）19:259-268）。pEC-1プ
ラスミドについてはホワイトルらの論文（Whittle et
al.,Gene（1982）130:139-145）およびギルケスらの論
文（Gilkes et al.,J.Gen.Microbiol.（1984）130:137
7-1384）を参照するとよい。
RBS、転写開始部位およびβGal-Exg発現プラスミドpU
C12-1.1cexの融合結合部アミノ末端のDNA塩基配列は第
２図に示した。
2.pUC12-1.1（737） pUC12-1.1（737）を構成するために、５′末端側塩基
配列の未翻訳部分、リボゾーム結合部位（RBS）およびc
ex遺伝子の翻訳開始コドンを除去し、プロモーター・オ
ペレーター領域およびE．coliラクトースオペロンのア
ミノ酸末端（βGal）を挿入し、つづいてPTISのRBS-ATG
と置き換えた。
第一段階は、プラスミドpUC12-1.1cexをSty IおよびB
am HIによって切断して生じた付着端（stagered ends）
をDNAポリメラーゼＩ（クレノー酵素）によって修復し
た。そしてプラスミドDNAを希釈条件下で連結してpUC12
-1.1（737）を得た。この操作によって、 （ｉ）Cexリーダー配列のコドン２とpUC12によってコー
ドされたβGalαフラグメントのコドン11との間におけ
るフレーム内融合（in-frame fusion）； （ii）Sty I切断部位の再生；および （iii）Bam HI切断部位とcex遺伝子翻訳開始コドンとの
置換が行なわれた。pUC12-1.1（737）のβGal-Cex融合
領域の塩基配列およびその配列から考えられるアミノ酸
配列を第２図に示した。
3.pUC12-1.1（PTIS） pUC12-1.1（PTIS）を得るためにpUC12-1.1（737）をE
coRIおよびBam HIによって切断し、EcoRI付着端およびB
am HI付着端を有する17bpのPTISを挿入した。これによ
って、PTISのイニシエターATGに対するcexリーダー配列
第２コドンのフレーム内融合が行なわれた（第２図参
照）。PTS AATTTGGAAAAATTAG ACCTTTTTAATACCTAG RBS、転写開始部位、βGal-Exg発現プラスミドの融合
結合部アミノ末端のDNA塩基配列。プラスミドpUC12-1.1
cexは未融合のcex遺伝子産物をコードする。プラスミド
pUC12-1.1cexにおける天然cex遺伝子産物のコドンはリ
ーダー配列の開始部位ATGを−41とし、成熟したExgの第
１コドンを＋１として番号が付けられた。βGal ‐Exg
融合遺伝子における第１cexコドンはもとの位置番号で
ある。想定されるアミノ酸配列はDNA塩基配列の上に一
文字で表した。βGal由来のヌクレオチドおよびアミノ
酸には下線を引いた。まれに現われるアミノ酸はlac遺
伝子由来ではなく、pUC12の結合領域から由来するもの
である。
cex遺伝子のアミノ末端におけるSty I、Ava IIおよび
EcoRIIの制限部位をpUC12におけるβGalのアミノ末端に
対するcex遺伝子の融合に用いた。
Exg活性は細胞タンパク質全体の重さ（mg）に対する
単位時間（分）当たりのｐ−ニトロフェニルの放出量
（ng）によって表した。
実施例２ CenA発現プラスミドの構成 A.細菌および培地 CenＡ発現実験においてE．coli JM101を使用した。培
養はすべてLB培養液によって行い、必要に応じて1.5％
（w/V）寒天によって培養液を固化させた。さらにこの
培養液にアンピシリンを終濃度が100μg/mlとなるよう
に添加した。CexA活性は1.0％（W/V）寒天および1.0％
（W/V）カルボキシメチルセルロース（CMC）含有LB培地
上のコロニー増殖後、コンゴ赤によって染色することに
よって検知した。液体培養は容量が50または250mlのエ
ーレンマイヤーフラスコに10または50mlの培養液を加え
て、振とう式ウオーターバス（New Brunswick Gyrotory
water bath）により200rpmで振とうさせておこなっ
た。
B.DNA技術 プラスミドはE．coliをアルカリ処理によって溶菌さ
せ、さらにCsCl−エチジウムブロマイド勾配下における
遠心によって収集した。制限エンドヌクレアーゼによる
消化、断片の連結（リゲーション）およびE．coliの形
質転換（transformation）は記載通りに行なった。
C.他の方法 フレンチプレスによって細胞を破壊することによって
抽出物を調製した。細胞の表層を被う内膜と外膜との間
（ペリプラズム）に存在する酵素を浸透圧ショックによ
って放出させた。培養液上清は遠心によって得た。すべ
ての酵素は30℃でアッセイした。E．coli JM101/pUC18-
1.6CenＡからのエンドグルカナーゼは陰イオン交換クロ
マトグラフィー（モノＱレシン（MonoQ resin）上で、2
0mMピペラジン中に0-0.1M NaClの勾配、pH9.8の条件下
で行なった）によって分離した後、免疫吸着クロマトグ
ラフィーによって精製した。アミノ酸配列は気相アミノ
酸配列分析装置（Applied Biosysems社製、470A gaspha
se sequenator）によるエドマン分解にもとづく方法に
よって自動測定した。
D.CeA遺伝子の単離 C．fimiからCenA遺伝子を単離する方法は米国特許出
願第895,352号（1986年８月11日出願）にもとづいた。
E.プラスミドの構成 第３図はpUCEC2の構成の概略説明図である。pcEC2に
ある6.0kbからなるC．fimiDNA挿入断片から1.6kbからな
るSstＩ断片を精製し、pUC18のSstＩ部位に挿入してpUC
EC2を形成した。第４図はその概略説明図で、（Ａ）はp
cUC2を示し、（Ｂ）はpUCEC2のlacＺとCenＡとの融合部
分の塩基配列およびそれにもとづくアミノ酸配列を表し
たものである。第４図（Ａ）において、細線の部分はpB
R322由来DNAを示し、箱状部分はC．fimi由来DNAを示
す。斜線の部分はCenＡをコードする配列を有する部分
で、横方向に延びた矢印は転写方向を示す。矢印Ｓが指
し示す部分はSstＩ部位である。
実施例３ cex SBD遺伝子断片とアグロバクテリアのβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子（abg）とを含む発現カセットの構成な
らびに融合タンパク質の特性 A.発現カセットの構成 第５図はpEO1の構成を示す概略説明図である。プラス
ミドpUC12-1.1cex（PTIS）をPstＩで切断した。これに
よって、２つの大きさの異なる断片が得られ、それぞれ
の断片はPstＩ制限部位を有した。そして、この断片の
うちの小さいほう（およそ1071bp）を単離した。このDN
A断片は1515bpにある挿入断片のPstＩ部位からベクター
のPstＩ部位の部分に一致する。そこで、このPstI-Pst
Ｉ断片をSphＩによる完全消化によって３つの断片（55b
p、72bpおよび944bp）にした。このうちもっとも大きい
SphI-PstＩ断片を単離した。
つぎに、大きいabg遺伝子断片（PstI-SphＩ）および
小さいcexSBD断片（SphI-PstＩ）（第５図参照）を同一
フレーム上で連結して、目的とするプラスミド構成（約
4954bp）、すなわちpEO1にした。pEO1プラスミドは2254
bpからなるベクターで、このベクターに挿入されている
cexSBD-abg挿入断片は2254bpである。pEO1プラスミドは
E．coli JM101に導入した。
B.酵素およびPAGEによる融合タンパク質の特性分析 pEO1にコードされた融合タンパク質はアビセルに対す
る結合能および元のAbgと比較した触媒活性によって特
徴づけられる。触媒活性による融合タンパク質の特性分
析はカイネテイックス（例えばKm値やVmax値）を調べる
ことや融合タンパク質の基質特異性を調べることによっ
て行なった。酵素活性は、時間、温度、pH、イオン強度
および緩衝液に関する標準的な測定条件下において一定
濃度のセロビオースから生産できるグルコース量によっ
て決定した。このグルコース濃度はグルコースアナライ
ザー（ベックマン社製）による測定結果をもとにした。
この装置による分析は、グルコースからグルコン酸に変
換される際の酸素消費量を酸素電極によって測定するこ
とにもとづいて行なわれるもので、この酸素消費量は既
知の濃度のグルコースを含む標準液の酸素消費量と正比
例の関係にあるので、この関係を利用してグルコース濃
度を決定することができる。
また、SDS-PAGEによって融合タンパク質の分子量を調
べた。すなわち、精製された融合タンパク質をC．fimi
から得たプロテアーゼによって２ないしそれ以上のタン
パク質断片にしたあとSDS-PAGEに流し、MUG（4-methylu
mbelliferyl-8-D-glucoside）あるいはX-glu（5-bromo-
4-chloro-3-indolyl−λ−D-glucopyranoside）のよう
な螢光グルコシド誘導体を用いてザイモグラム（量比の
検討）を行なうことによって調べた。なお、これによっ
て他の小さな活性酵素断片の形成およびその分子量を決
定することも可能である。
C.融合タンパク質の吸着性 セルラーゼのセルロースに対する吸着は不溶性セルロ
ーズ基質の加水分解に必要とされる第１段階と考えられ
る。酵素の種類、濃度、組み合わせおよびその比、温
度、pH、緩衝液のイオン強度などの因子がどのようにセ
ルラーゼの吸着カイネテイックスおよびセルロースの分
解速度に対して影響を及ぼすかについて知るために、い
くつかの微生物のセルラーゼについて、その酵素のセル
ロースへの結合が調べられてきた（Chose＆Bisaria,197
9;Moloney＆Coughlan,1983;Ooshima et al.,1983;Ryu
et al.,1984;Andrease et al.,1987;Williamson＆Stut
zenberge,1987）。
セルロース基質に対する融合酵素の結合能は吸着平衡
定数（Ka）を求めることによって調べた。すでにセルロ
ースへのセルラーゼの吸着はラングミュアの吸着等温式
（Langumuir,1916）に従うことが知られている。
Cb＝（Cmax・Ka・Cf）／（１＋Ka・Cf）（１） Cbは反
応が平衡状態に達した際のセルロース単位重量当たりの
結合酵素量を示し、Cfは結合していない酵素量、Cmaxは
酵素の最大吸着量、そしてKaは吸着平衡定数を示す。等
式（１）からより利用価値の高い等式（２）が導きだせ
る。この等式（２）はプロットしやすいことから等式
（１）に比べてkaやCmaxを容易に求めることができる。
（Cf/Cb）＝（Cf/Cmax）＋（1/（Ka・Cmax）） （２） 等式（２）は等式ｙ＝mx＋ｂによって与えられる直線
を得るためにCfに対してCf/Cbをプロットするのに用い
られる。傾き（ｍ）は1/（Ka・Cmax）によって与えられ
る。KaおよびCmaxとして求められた値は重要なもので、
それらの値によって基質に対する酵素の吸着親和性や吸
着剤単位表面当たりの吸着部位数がそれぞれわかる。特
にKa値が必要で、それによってセルラーゼに対する融合
酵素の吸着に関する化学的および物理的パラメーターを
比較検討することができる。
アビセルに対する酵素の結合能は、実験系に加えられ
た酵素の活性濃度に対する結合にあずかった酵素、上清
中に含まれる結合にあずからなった酵素および蒸留水中
に洗い流された結合酵素のそれぞれの百分率によって表
した。種々の酵素濃度で行なわれるセルロース基質に対
する酵素の吸着プロセスにおけるケイネテイックスに関
する調査は異なるpH、濃度および緩衝液のイオン強度条
件下におけるKa値の決定を含むものである。固定化融合
タンパク質の安定性（操作時および貯蔵時）はバッチま
たはカラムに存在するアビセルに対する酵素の結合と時
間経過にともなって起こる酵素反応とによって決定し
た。単位時間当たりの回収グルコース量、融合タンパク
質の活性濃度および洗い流されたタンパク質量を固定化
方法の安定性を示す指標とした。
実施例４ 基質結合に関与するDNA断片の単離 基質との結合に関与する特異的SBDペプチドを同定す
るのに、いくつかの遺伝学的アプローチを試みることは
可能である。その一つの方法として、遺伝子のある部分
を制限酵素によって取り除き、残された部分を繋ぎ合わ
せて特定の遺伝子断片に関連した欠陥を持つタンパク質
をコードする変異遺伝子を得る方法がある。他の方法と
しては、エクソヌクレアーゼ（例えばBal31）によってD
NAの５′および３′の両末端外側からあるいは遺伝子の
制限酵素によって切断されて生じたギャップ内側から計
画的にヌクレオチドを取り除く方法がある。これらの遺
伝子欠失方法は、野生型タンパク質よりも短く、かつ野
生型が持つ本来の機能とは異なる機能を有すると思われ
る欠損タンパク質をコードする変異遺伝子を作り出すこ
とが最終目的である。欠損タンパク質の機能は、特定の
ペプチド断片それ自体の除去あるいはあるアミノ酸の欠
失の結果によって生じた修飾タンパク質の形態変化にも
とづくものと考えられる。
A.XmaIII制限酵素を用いた欠失 第６図に示したpUC12-1.1cex（PTIS）プラスミドは関
連した制限部位および大きさを有する。SalＩ（Ｓ）に
よってプラスミドを部分消化し、1962ヌクレオチドと25
80ヌクレオチドとの間にある遺伝子部分を除去すると、
得られた欠損タンパク質はアビセルに結合できなかっ
た。この結果はSalＩ部位（1962ヌクレオチド）から終
止コドン（2189ヌクレオチドの所にあるTGA）に到るま
での配列によってコードされるペプチドが酵素の結合に
重要な領域であることを証明するものではない。欠失開
始の部分よりも直前にある領域がセルラーゼの結合に重
要な部分であろう。SalＩによる欠失突然変異体による
セルロースへの非結合にとって他の重要な要因はベクタ
ーの欠失Cexとβ−ガラクトシダーゼとによって形成さ
れる融合タンパク質である。
アミノ酸の平均分子量を110と仮定すると、SalＩによ
る欠失突然変異体において欠失されたペプチドは約8kD
（キロダルトン）の大きさとなる。この予想される大き
さは、タンパク質加水分解的に切断したエクソグルカナ
ーゼからなる試料によってFPLC（ファルマシア社製）に
より精製され、かつアビセルに強固に結合することがで
きるペプチドの大きさに大変よく一致していた。このこ
とは、特異的SBDペプチドが明らかにこの8kDに含まれる
ことを強く示唆している。プロテナーゼ切断部位かどう
かを正確に未極めるためにFPLCによって精製された約8k
DからなるペプチドのＮ−末端の配列を調べた。その結
果、アミノ酸切断部位はPTボックスの端（最後のスレオ
ニンとセリンとの間）から始まることがわかった。この
アミノ酸配列をもとにして、計算によって求めらたSBD
ペプチドの大きさは11.3kDであった。FPLC精製SBDペプ
チドの大きさとアミノ酸切断部位から予想される計算上
の大きさとの不一致はポリアクリルアミドゲルにおいて
ペプチドの移動が正常に行なわれないことが原因として
考えられる。
さらに、基質結合部に含まれるアミノ酸配列を調べる
ために、XmaIIIにおって部分消化下（第６図）。大きさ
が5107bpに一致する線状の断片を単離し、その断片の両
端を連結してE．coli JM101に導入した。なお、この断
片には1873ヌクレオチドと2074ヌクレオチドとの間の遺
伝子部分が欠失しており、その結果、欠損タンパク質が
生産された。そこで、この欠損タンパク質のアビセルに
対する結合親和性について調べ、かつ野生型のcexタン
パク質と比較した。
B.Bal31を用いた欠失 Bal31は二重鎖DNAの３′および５′末端の両方を、内
側の一重鎖切断をすることなしに、ほぼ同時に分解して
いく高特異性のヌクレアーゼである。この酵素はCaイオ
ンの存在を必要とするので、この酵素による欠失の程度
を反応溶液に二価イオンのキレート剤であるEGTAを加え
ることによってコントロールすることができ、またモニ
ターすることも可能である（Maniatis et al.,1982）。
cex遺伝子をBal31による消化処理にかけるまえに、以
下の領域を含むループアウト断片を合成した。すなわ
ち、その領域とは （１）欠失が開始される制限部位（ベクターのみにあ
り、かつC．fami遺伝子挿入断片の数ヌクレオチドほど
下流にあるXbaＩ認識切断部位）、 （２）ベクターおよび挿入断片のどちらにも存在しない
第２制限部位（NcoＩ）、および （３）すべての３つのリーデイングフレームにある終止
コドンを含むヌクレオチド配列である。
まずはじめに、ループアウト断片は挿入断片を含むM1
3ssDNAテンプレートとアニーリングさせた。この断片は
ｄ（A,T,G,C）三リン酸、クレノーポリメラーゼ、リガ
ーゼを加えて延長した。その後、この断片をE．coli JM
101に導入し、プラークハイブリダイゼーションによっ
て標識ループアウトプライマーと雑種形成するものをス
クリーニングした。DNAの複製型をE．coli形質転換株か
ら単離した。まず、二重鎖DNAをXbaＩで切断して線状の
DNAにし、それをNcoＩで切断した。一端がNcoＩ部位に
よって切断されたC．fimiDNA含有スタッファーDNA断片
を線状のDNAに連結してNcoＩ部位を再生させた。このよ
うに構成されたものを両端（スタッファーDNA内およびc
ex遺伝子挿入断片内で）からほぼ同じ速度で消化するこ
とが可能なBal 31によって消化した。この消化によって
反応試料の部分を取り除き、EGTAを含むDNA緩衝液に入
れてBal31による消化を停止させた。スタッッファーDNA
は不活性化されたBal 31消化DNA混合物にNcoＩを加える
ことによって取り除いた。このDNAはクレノーポリメラ
ーゼ処理し、アガロースゲルによって分画し、さらにpU
C12に連結して二重鎖閉環状DNAとした。この二重鎖閉環
状DNAを含む溶液を数μｍほど取って、挿入断片の長さ
におけるわずかな違いがBal 31による欠失の結果である
ことを確かめるために、２種類の制限酵素によて処理し
た。前記二重鎖閉環状DNAはE．coli JM101に導入した。
cex遺伝子の３′末端に欠失のある突然変異体ファミリ
ーをスクリーニングするために、8kd SBDに対する抗体
を用いて欠失の認められるクローンを同定した。
異なる欠失突然変異体によって産生される欠損タンパ
ク質の前記アビセルへの結合能および触媒活性について
検討した。
実施例５ アビセルに固定されたβ−グリコシダーゼ融合タンパク
質を用いたセロビオースからのグルコースの生産 第７図はβ−グルコシダーゼ融合タンパク質を利用す
る概略説明図をである。
ここでは得られたセロビオース混合物をエンドグルカ
ナーゼ−エクソグルカナーゼ混合溶液とともにβ−グル
コシダーゼを固定したアビセルカラムに連続して流す方
法を用いた。
分解されるべきセルロース原料を含む溶液にエンドグ
ルカナーゼとエクソグルカナーゼとを適当な比率で発酵
槽に加えた。
つぎに一定時間酵素反応させて、溶液中にセルビオー
スを産生させた。その後、この溶液をアビセルカラムに
流し、エンドグルカナーゼとエクソグルカナーゼとを吸
着させ、かつ濃縮した。セロビオースを含む流出液をβ
−グルコシダーゼ融合タンパク質を固定した第２のカラ
ムに流し、該融合タンパク質によってセルビオースをグ
ルコース単位にまで加水分解した。エンドグルカナーゼ
とエクソグルカナーゼとを最初のカラムにおいて蒸留水
を流すことによって流出させて再生した。両方のカラム
は精製および酵素による変換に数回再利用することが可
能である。
実施例６ cenA-アルカリホスファターゼ融合タンパク質発現カセ
ットの調製 Tn phoＡはE．coliのシグナル配列欠損アルカリホス
ファターゼ遺伝子（′phoＡ）を含むトランスポゾンTn5
の誘導体である。リーデイングフレーム内にある発現遺
伝子への転移による挿入はphoA融合タンパク質を作りだ
すことができる。もし、標的遺伝子がタンパク質エクス
ポートシグナルを含む場合、標的遺伝子は融合タンパク
質の分泌に関与することができる。この融合タンパク質
の分泌はアルカリホスファターゼによって検知すること
がき、この酵素の活性は、酵素がペリプラズムに位置す
るときだけ認められた。TnphoＡはマルチプルクローニ
ング部位を有するプラスミドにおいてC．fimi cenＡと
融合したphoＡ遺伝子を作るのに用いられる。目的とす
るタンパク質をコードする遺伝子はマルチプルクローニ
ング部位にクローンすることが可能で、かつ融合タンパ
ク質として発現させることができた。この遺伝子産物は
アビセルのようなセルロースカラムへの結合によって精
製することができ、C．fimiプロテアーゼによってcenA
融合パートナーを切断することができた。
A.遺伝子融合の調製とその解析 TnphoＡの転位よる突然変異誘発はcenＡとの遺伝子融
合を行なう際に利用される。cenＡを含むプラスミドはp
UCEC2、pTZ18Uにクローン化された1.6kb Sst I cenA断
片、pUC18の多機能性誘導体である（Yanisch-Perron et
al.,Gene（1985）33:103-119）。pTZ18UはU.S.バイオ
ケミカルズ社から入手可能である。
オリゴヌクレオチドに直接突然変異誘発を行なう方法
（Zoller et al.,Nucleic Acids Res.（1982）10:6487
-6500およびZoller et al.,Methods Enzymol.（1983）
100:468-500）はcenＡ遺伝子のカルボキシル末端部分を
欠失させることおよびpTZ18UのPro-Thrボックスとマル
チプルクローニング部位とを並べて置くことに利用され
る。スクリーニング方法として、プローブとして変異オ
リゴヌクレオチドを用いたドットブロットハイブリダイ
ゼーションや制限酵素による分析がある。鎖伸張停止方
法によるDNAの塩基配列決定を、欠失領域の配列を確か
めるために行なった（Yanisch-Perron、前掲）。
転位はトランスポゾン、λTnphoA-1、を含む欠損ラム
ダファージをE．coli CC118（pUCEC2）に感染させて行
なった（Gutierrez et al.,J.Mol.Bio.（1987）195:28
9-297）。E．coliCC118はphoＡ遺伝子に欠失部分が存在
する。cenＡと同一フレーム上へのcenＡ遺伝子の転位に
よる挿入はCenA-PhoＡ融合タンパク質を作る。このCenA
-PhoＡ融合タンパク質はペリプラズムに運ばれ、cenＡ
シグナルペプチドによってその分泌が促進される。カナ
マイシン（トランスポゾン由来）およびアンピシリン抵
抗性によって選択されたコロニーをインジコ系基質であ
る５−ブロモ−４−クロロ−３−ヨードイルホスフェー
ト（XP）に対するアルカリホスファターゼ活性によって
スクリーニングした。phoA+コロニーから得たプラスミ
ドDNAは再びE．coliに導入され、上記のように選択およ
びスクリニーングされる。phoＡ＋コロニーはカルボキ
シメチルセルロース（CMC）プレート上におけるエンド
グルカナーゼ活性をコンゴレッドによる染色により調べ
ることによってスクリーニングする（Gilkes et al.,Bi
o/Technology（1984）2:259-263）。表現型としてpho
A+ 、Eng -、そしてアンピシリンおよびカナマイシン耐性
であることが要求される。
プラスミドDNAをphoA+ 、Eng -コロニーから単離し、制
限酵素によって消化してからアガロースゲル電気泳動に
かけた。55個のコロニーをスクリーニングした結果、34
個のコロニーにおいて正しい方向にあるcenＡに挿入さ
れたTnphoＡ挿入断片を有することがわかった。挿入はc
enＡ遺伝子全体にわたって行なわれていた。それらのク
ローンのうちのいくつかはずれてた位置に挿入が起こっ
ており、その可能性は融合のタンパク質産物をみれば明
らかである。CenA-PhoA融合タンパク質のセルロースに
対する結合を調べてみると、融合タンパク質は50mMリン
酸緩衝液（pH7.0）および0.5M NaClによる洗浄にもかか
わらず、濾紙に結合していた。
引き続いて行なわれる実験のために、セルロースに結
合した融合タンパク質を選択した。TnphoＡの正確な挿
入位置を知るために鎖伸張停止方法によるDNA塩基配列
の決定を行なった。アビセルへの結合を促進させ、かつ
アビセルからの流出を起こさせる緩衝液の状態は実施例
３において述べたのでそれを参照されたい。
アビセル結合融合タンパク質をC．fimiプロテアーゼ
とともにインキュベートし、このプロテアーゼによる分
解によって生じた断片をSDS-PAGEおよびphoＡザイモグ
ラムまたはウエスタンイムノブロット、またはゲル濾過
クロマトグラフィーによって分析した。基質結合断片を
SDSに溶解し、プローブとしてPro-Thrボックスに対する
抗血清を用いてSDS-PAGEおよびウエスタンイムノブロッ
トによって分析した（Langsford et al.,FEBS letters
（1987）225:163-167）。
B.融合タンパク質の精製 融合タンパク質を含むE．coli抽出物をアビセルマト
リックスへの融合タンパク質の結合を促進させる緩衝液
とともにアビィセルカラムにのせる。非特異的な結合タ
ンパク質を緩衝液で洗い流したのち、C．fimiプロテア
ーゼをカラムにのせ、緩衝液で洗った。集められた分画
についてアルカリホスホターゼ活性を調べ、酵素活性が
ピークに達した分画をイオン交換またはゲル濾過クロマ
トグラフィによって精製した。プロテアーゼ濃度および
流速のような精製条件はアルカリホスホターゼ活性が最
も良く再現されるように色々と変えた。
実施例７ 薬物誘導に対するCellulomoas fimiセルロース結合ドメ
インの利用 A.溶解性／持続性 インターロイキン２ C．fimiのセルロース結合領域に連結したインターロ
イキン２（IL-2）を含む融合タンパク質は、少なくとも
cexAまたはcexセルロース結合領域をコードするDNA塩基
配列と、IL-2またはその機能性部分をコードする遺伝子
とからなる融合遺伝子の調製とその融合遺伝子をE．col
iのような発現宿主へ導入することとによって上記方法
により調製した。融合タンパク質はセルロース（アビセ
ルまたはコットン）によるアフィニテイクロマトグラフ
ィによって精製した。蒸留水を流すことによって融合タ
ンパク質を流出させた後、この融合タンパク質を可溶性
（カルボキシルメチル）または不溶性（アビセル）セル
ロースに結合させた。それらの結合物をマウス（i.p.）
に注射し、腹腔内液を採取してIL-2のクリアランスカイ
ネテイックスを決定した。その結果、結合物は循環によ
ってIL-2のクリアランス速度を減少させることがわかっ
た。
B.免疫原性／アジュバント活性 前記のようにして調製され、かつC．fimiセルラーゼ
のセルローズ結合領域に結合しているIL-2およびアルカ
リホスファターゼを含む２つの融合タンパク質は、それ
ぞれの融合タンパク質のセルロース結合領域によって同
じセルローズ結合領域に結合にした。ここでは、可溶性
（例えば、カルボキシルメチル）および不溶性（アビセ
ル）セルロースマトリックスを用いて、混合マトリック
ス（IL-2-CBR＋セルロース＋CBR−アルカリホスファタ
ーゼ）を作製し、それをマウスに注射した。１〜２週間
後に免疫応答（Ｔ細胞増殖およびアルカリホスファター
ゼ抗体濃度）について調べた。そして、同量のアルカリ
ホスファターゼ−CBRを注射した際の同免疫応答と比較
した。さらに、HIVgp120-CBRおよびPseudomonas porin
CBRをアルカリホスファターゼと置き換えて同様の系で
実験した。その結果、抗原に非常に近接したIL-2の組み
合わせは抗原に対する免疫応答増幅に利用できることが
わかった。
以上説明したように、本発明の組成物は目的とするペ
プチドに結合するポリサカロイドのポリサカロイド結合
ドメインを含むものである。また、本発明の組成物は可
溶性または不溶性のポリサッカロイドマトリックスに対
する種々のリガンドとして利用できる。このようなマト
リックスへの結合は薬輸送システム、発酵槽などに利用
することができ、またリガンドの精製または単離手段と
しても利用でき、リガンドとマトリックスとの結合は特
異的なプロテアーゼ処理によって切断することができる
のでリガンドを回収することができる。
この明細書に示したすべての出版物および特許出願は
本発明の内容に対する従来技術のレベルを示したもので
ある。すべての出版物および特許出願はあたかも個々の
出版物または特許出願が特別に、かつ個々に引用されて
いるかのようにして本願明細書に引用された。以上、添
付した請求の範囲に開示された本発明の目的から外れる
ことなく実施態様にもとづいて本発明の新規性および進
歩性を開示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 ミラー，ロバート シー カナダ国 Ｖ７Ｒ ４Ｎ９ ブリティッ シュ コロンビア ノース バンクーバ ー ハックルベリー レーン 5535 (73)特許権者 999999999 ウォレン，リチャード エイ ジェイ カナダ国 Ｖ５Ｚ １Ｚ１ ブリティッ シュ コロンビア バンクーバー ダブ リュ 21スト アヴェニュ 942 (73)特許権者 999999999 ジルクス，ネイル アール カナダ国 Ｖ６Ｒ ３Ｂ１ ブリティッ シュ コロンビア バンクーバー ダブ リュ 15ス アヴェニュ 4423 (72)発明者 キルバーン，ダグラス ジー カナダ国 Ｖ６Ｓ １Ｔ４ ブリティッ シュ コロンビア バンクーバー ダブ リュ 29ス アベニュ 3728 (72)発明者 ミラー，ロバート シー カナダ国 Ｖ７Ｒ ４Ｎ９ ブリティッ シュ コロンビア ノース バンクーバ ー ハックルベリー レーン 5535 (72)発明者 ウォレン，リチャード エイ ジェイ カナダ国 Ｖ５Ｚ １Ｚ１ ブリティッ シュ コロンビア バンクーバー ダブ リュ 21スト アヴェニュ 942 (72)発明者 ジルクス，ネイル アール カナダ国 Ｖ６Ｒ ３Ｂ１ ブリティッ シュ コロンビア バンクーバー ダブ リュ 15ス アヴェニュ 4423 (56)参考文献 特開 昭62−259596（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．61，Ｎｏ．３, Ｐ．421−427（1987)

Claims (21)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】融合タンパク質を含むポリサッカロイドマ
    トリックスを調製する方法において、 セルラーゼの基質結合領域と所望のポリペプチドとを含
    み、前記ポリサッカロイドマトリックスを加水分解しな
    い融合タンパク質を調製し、 前記セルラーゼに対する基質を含む前記ポリサッカロイ
    ドマトリックスに、前記融合タンパク質を、前記基質結
    合領域が該ポリサッカロイドマトリックスに結合する条
    件下で接触させることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】前記融合タンパク質の調製において、５′
    末端から３′末端への転写方向で、転写開始調節部位、
    翻訳開始部位、融合タンパク質をコードするDNA配列、
    および翻訳と転写の終止部位を含み、前記開始及び終止
    部位は前記融合タンパク質の発現を制御する、DNA構造
    物を有する宿主細胞を増殖し、前記融合タンパク質を単
    離する、請求の範囲第１項に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記単離において、前記融合タンパク質
    と、前記セルラーゼの基質を含むマトリックスを接触さ
    せる請求の範囲第２項に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記セルラーゼがCellulomonas fimiから
    得られるものである請求の範囲第１ないし３項の何れか
    １項に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記セルラーゼがエンドグルカナーゼ（E.
    C.3.2.1.4）またはセロビオハイドロラーゼ（E.C.3.2.
    1.91）である請求の範囲第１ないし３項の何れか１項に
    記載の方法。
  6. 【請求項６】前記ポリサッカロイドマトリックスが不溶
    性セルロースである請求の範囲第１ないし５項の何れか
    １項に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記不溶性セルロースが微結晶性セルロー
    ス、リグノセルロース性物質、または綿である請求の範
    囲第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】前記リグノセルロース性物質が、木材、木
    材パルプ、または植物組織を含む請求の範囲第７項記載
    の方法。
  9. 【請求項９】前記ポリサッカロイドマトリックスが可溶
    性ポリサッカロイドである請求の範囲第１ないし５項の
    何れか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記可溶性ポリサッカロイドがカルボキ
    シルメチルセルロースである請求の範囲第９項記載の方
    法。
  11. 【請求項１１】アフィニティーマトリックスを用いて所
    望のポリペプチドを固定化する方法において、 セルラーゼの基質結合領域のアミノ酸配列と前記所望の
    ポリペプチドとを含み、前記アフィニティーマトリック
    スを加水分解しない融合タンパク質を調製し、 前記セルラーゼに対する基質を含むアフィニティーマト
    リックスに、前記融合タンパク質を、前記基質結合領域
    が該アフィニティーマトリックスに結合する条件下で接
    触させることを特徴とする方法。
  12. 【請求項１２】前記所望のポリペプチドがβ−グルコシ
    ダーゼまたはインターロイキン−２である請求の範囲第
    11項記載の方法。
  13. 【請求項１３】アフィニティーマトリックスを用いて所
    望のポリペプチドを精製する方法において、 セルラーゼの基質結合領域のアミノ酸配列と前記所望の
    ポリペプチドとを含み、前記アフィニティーマトリック
    スを加水分解しない融合タンパク質を調製し、 前記セルラーゼに対する基質を含むアフィニティーマト
    リックスに、前記融合タンパク質を、前記基質結合領域
    が該アフィニティーマトリックスに結合する条件下で接
    触させて前記融合タンパク質を前記アフィニティーマト
    リックスに結合させ、 前記アフィニティーマトリックスから前記融合タンパク
    質または所望のポリペプチドを分離させることを特徴と
    する方法。
  14. 【請求項１４】前記基質結合領域がCellulomonas fimi
    から得られるセルラーゼに含まれるものである請求の範
    囲第13項記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記セルラーゼがエンドグルカナーゼ
    （E.C.3.2.1.4）またはセロビオハイドラーゼ（E.C.3.
    2.1.91）である請求の範囲第14項記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記アフィニティーマトリックスが微結
    晶性セルロースである請求の範囲第13ないし15項の何れ
    か１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記所望のポリペプチドがアルカリホス
    ファターゼである請求の範囲第13ないし16項の何れか１
    項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】ハイブリッドタンパク質を含むポリサッ
    カロイドマトリックスにおいて、前記ハイブリッドタン
    パク質が、セルラーゼの基質結合領域と、該基質結合領
    域と通常結合するポリペプチドとは異なるものである所
    望のポリペプチドとを含み、ポリサッカロイドマトリッ
    クスを加水分解しないハイブリッドタンパク質であり、
    前記基質結合領域が該ポリサッカロイドマトリックスに
    結合しているポリサッカロイドマトリックス。
  19. 【請求項１９】前記ポリサッカロイドがセルロースであ
    る請求の範囲第18項に記載のポリサッカロイドマトリッ
    クス。
  20. 【請求項２０】セルロースマトリックスと少なくとも２
    つの異なるハイブリッドタンパク質とを含み、各ハイブ
    リッドタンパク質は、セルラーゼの基質結合領域と、イ
    ンターロイキン−２またはアルカリホスファターゼの活
    性を有するポリペプチドとを含み、各ハイブリッドタン
    パク質の前記基質結合領域が前記セルロースマトリック
    スに結合するとともに、前記ハイブリッドタンパク質が
    前記セルロースマトリックスを加水分解しないものであ
    ることを特徴とする組成物。
  21. 【請求項２１】セルロースマトリックスとハイブリッド
    タンパク質を含み、該ハイブリッドタンパク質が、セル
    ラーゼの基質結合領域と、アルカリホスファターゼまた
    はβ−ガラクトシダーゼの活性を有するポリペプチドと
    を含み、前記基質結合領域がセルロースマトリックスに
    結合するとともに、前記ハイブリッドタンパク質が前記
    セルロースマトリックスを加水分解しないものであるこ
    とを特徴とする組成物。
JP1507496A 1988-07-08 1989-06-28 セルロ―ス結合融合タンパク質 Expired - Fee Related JP2528721B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US216,794 1988-07-08
US07/216,794 US5137819A (en) 1988-07-08 1988-07-08 Cellulose binding fusion proteins for immobilization and purification of polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH03501261A JPH03501261A (ja) 1991-03-22
JP2528721B2 true JP2528721B2 (ja) 1996-08-28

Family

ID=22808538

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP1507496A Expired - Fee Related JP2528721B2 (ja) 1988-07-08 1989-06-28 セルロ―ス結合融合タンパク質

Country Status (7)

Country Link
US (2) US5137819A (ja)
EP (1) EP0381719B1 (ja)
JP (1) JP2528721B2 (ja)
AT (1) ATE142699T1 (ja)
CA (1) CA1335182C (ja)
DE (1) DE68927161T2 (ja)
WO (1) WO1990000609A1 (ja)

Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5340731A (en) * 1988-07-08 1994-08-23 University Of British Columbia Method of preparing a B-1,4 glycan matrix containing a bound fusion protein
US6174700B1 (en) * 1988-07-08 2001-01-16 University Of British Columbia Purification of a polypeptide compound having a polysaccharide binding domain by affinity phase separation
US6048715A (en) * 1988-07-08 2000-04-11 Univ. Of British Columbia Two-phase partition affinity separation system and affinity separated cell-containing composition
US5595887A (en) * 1990-07-16 1997-01-21 Bionebraska, Inc. Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment
EP0496861A1 (en) * 1990-08-17 1992-08-05 Her Majesty In Right Of Canada As Represented By The National Research Council Of Canada RECOMBINANT DNA PRODUCTION OF $g(b)-1,3-GLUCANASE
US6020540A (en) * 1993-04-14 2000-02-01 Cornell Research Foundation, Inc. Gene encoding endochitinase
US6512166B1 (en) 1991-06-17 2003-01-28 Cornell Research Foundation, Inc. Combinations of fungal cell wall degrading enzyme and fungal cell membrane affecting compound
CA2122717C (en) * 1991-11-08 2003-07-15 David C. Anderson Hemoglobins as drug delivery agents
US5872094A (en) * 1993-01-06 1999-02-16 The General Hospital Corporation Method for attaching cartilaginous tissue, cartilage matrix protein or link protein to a surface
US5496934A (en) * 1993-04-14 1996-03-05 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Nucleic acids encoding a cellulose binding domain
US5861271A (en) * 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
US7005128B1 (en) 1993-12-17 2006-02-28 Genencor International, Inc. Enzyme feed additive and animal feed including it
US6268196B1 (en) 1993-12-17 2001-07-31 Genencor International, Inc. Method and compositions for treating cellulose containing fabrics using truncated cellulase enzyme compositions
GB9400623D0 (en) * 1994-01-14 1994-03-09 Univ Leeds Exploitation of the cellulase enzyme complex of neurospora
IL111415A0 (en) * 1994-10-27 1994-12-29 Yeda Res & Dev Modified cellulose-binding domain (cbd) proteins and use thereof
US6750256B1 (en) * 1994-12-30 2004-06-15 Proguard, Inc. Use of aromatic aldehydes as insecticides
US5536501A (en) * 1994-12-30 1996-07-16 Proguard, Inc. Use of flavenoid aldehydes as insecticides and for killing arachnids
US6251951B1 (en) 1994-12-30 2001-06-26 Proguard, Inc Use of flavonoid and aromatic aldehydes as pesticides
CA2214116C (en) 1995-03-17 2011-05-24 Novo Nordisk A/S Novel endoglucanases
US5639794A (en) * 1995-06-07 1997-06-17 Proguard, Inc. Use of saponin in methods and compositions for pathogen control
US5843375A (en) * 1995-06-07 1998-12-01 Proguard, Inc. Method for decontamination of a liquid of gaseous environment
US5792467A (en) * 1995-06-07 1998-08-11 Proguard, Inc. Repellent compositions containing aromatic aldehydes
US5874308A (en) * 1996-01-16 1999-02-23 University Of British Columbia Compositions and methods for modulating cell proliferation using growth factor-polysaccharide binding fusion proteins
AU1438497A (en) * 1996-01-29 1997-08-22 Novo Nordisk A/S Process for removal or bleaching of soiling or stains from cellulosic fabric
AU1438397A (en) * 1996-01-29 1997-08-22 Novo Nordisk A/S Process for desizing cellulosic fabric
AU2382197A (en) * 1996-04-19 1997-11-12 Novo Nordisk A/S Fabric treated with a cellulase and a hybrid enzyme comprising a phenol oxidizing enzyme
WO1997040127A1 (en) * 1996-04-19 1997-10-30 Novo Nordisk A/S Bleaching of fabric with a hybrid enzyme containing a phenol oxidizing enzyme fused to a cellulose binding domain
GB9613758D0 (en) † 1996-07-01 1996-09-04 Unilever Plc Detergent composition
AU730427B2 (en) * 1996-09-30 2001-03-08 Exseed Genetics L.L.C. Encapsulation of polypeptides within the starch matrix
WO1998018905A1 (en) * 1996-10-28 1998-05-07 Novo Nordisk A/S Extracellular expression of cellulose binding domains (cbd) using bacillus
US20020168718A1 (en) * 1997-04-03 2002-11-14 California Institute Of Technology Enzyme-mediated modification of fibrin for tissue engineering
IL121404A0 (en) * 1997-07-27 1998-01-04 Yissum Res Dev Co Transgenic higher plants of altered structural morphology
GB9718415D0 (en) * 1997-08-29 1997-11-05 Smithkline Beecham Plc Formulation
TW552268B (en) 1997-10-08 2003-09-11 Yun-Ru Chen Chimeric proteins with a cellulose binding domain (CBD)
US6323023B1 (en) 1998-01-13 2001-11-27 Yissum Research Development Co., Ltd. Vectors containing nucleic acids coding for Arabidopsis thaliana endo-1,4-β-glucanase secretion signal peptide
EP2295065B1 (en) 1998-02-20 2013-10-09 The University of Miami Modified heat shock protein-antigenic peptide complex
US6315900B1 (en) 1998-06-03 2001-11-13 Accurate Polymers Static separation method using non-porous cellulose beads
AU755850B2 (en) 1998-06-10 2002-12-19 Novozymes A/S Novel mannanases
US7241730B2 (en) 1998-08-27 2007-07-10 Universitat Zurich Enzyme-mediated modification of fibrin for tissue engineering: fibrin formulations with peptides
US6894022B1 (en) 1998-08-27 2005-05-17 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
US7601685B2 (en) * 1998-08-27 2009-10-13 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
CA2390639C (en) * 1999-11-08 2009-04-28 Cbd Technologies Ltd. Process and composition for preparing a lignocellulose-based product, and the product obtained by the process
IL133134A0 (en) * 1999-11-25 2001-03-19 American Israeli Paper Mills Improved paper products
EA006879B1 (ru) 2001-01-19 2006-04-28 Вироновативе Б. В. Вирус, вызывающий заболевание дыхательных путей у восприимчивых млекопитающих
EP1365745A2 (en) 2001-02-15 2003-12-03 King Pharmaceuticals, Inc. Stabilized pharmaceutical and thyroid hormone compositions and method of preparation
MXPA03011194A (es) 2001-06-06 2004-02-26 Novozymes As Endo-beta-1,4-glucanasa.
GR20010100295A (el) 2001-06-18 2003-02-27 Εμμανουηλ Παττακος Μεταβλητο συστημα βαλβιδων
US7101569B2 (en) 2001-08-14 2006-09-05 Franz G Andrew Methods of administering levothyroxine pharmaceutical compositions
CA2458392A1 (en) * 2001-10-03 2003-04-17 Unilever Plc Carbohydrate binding domain containing fusion proteins for delivery of therapeutic and other agents, and compositions containing them
US7247609B2 (en) * 2001-12-18 2007-07-24 Universitat Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
AU2003219839B2 (en) 2002-02-21 2008-02-21 Medimmune, Llc Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from metapneumovirus
AU2003219477A1 (en) * 2002-03-07 2003-09-16 Zephyr Proteomix Ltd. Microarrays of cellulose binding chimeric proteins and methods of use thereof
US20060035342A1 (en) * 2002-09-12 2006-02-16 Withers Stephen G Engineered enzymes and their use for synthesis of thioglycosides
WO2004031379A1 (en) * 2002-10-01 2004-04-15 Unilever N.V. Proteins having polysaccharidase activity
US20070020630A1 (en) 2003-03-27 2007-01-25 Trotta Christopher R Methods of identifying compounds that target trna splicing endonuclease and uses of said compounds as anti-proliferative agents
JP2006521116A (ja) 2003-03-27 2006-09-21 ピーティーシー セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗真菌性および／または抗増殖性分子を同定するためのｔＲＮＡスプライシング経路の酵素の標的化
JP2007525178A (ja) 2003-04-25 2007-09-06 メッドイミューン バクシーンズ，インコーポレイティド メタニューモウイルス株、そのワクチン製剤における用途、抗原性配列の発現のためのベクターとしての用途、並びにウイルス増殖方法
ATE510925T1 (de) 2003-06-25 2011-06-15 Novozymes As Stärkehydrolyseverfahren
JP2007526748A (ja) 2003-06-25 2007-09-20 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 澱粉加工用酵素
US20050054752A1 (en) * 2003-09-08 2005-03-10 O'brien John P. Peptide-based diblock and triblock dispersants and diblock polymers
WO2005023981A2 (en) * 2003-09-09 2005-03-17 Zephyr Proteomix Ltd. Libraries of chimeric cellulose binding proteins and methods of use thereof
WO2005028496A2 (en) 2003-09-12 2005-03-31 Antigenics, Inc. Vaccine for treatment and prevention of herpes simplex virus infection
ATE457034T1 (de) 2003-10-28 2010-02-15 Novozymes North America Inc Hybridenzyme
US8846340B2 (en) 2003-10-30 2014-09-30 Novozymes A/S Carbohydrate-binding modules of a new family
US8097445B2 (en) * 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
RU2278160C2 (ru) * 2004-04-13 2006-06-20 Институт Молекулярной Генетики Российской Академии Наук (Имг Ран) РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК LACspCBD, ОБЛАДАЮЩИЙ БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБНОСТЬЮ САМОПРОИЗВОЛЬНО СВЯЗЫВАТЬСЯ С ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИМИ СОРБЕНТАМИ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА LACspCBD, ШТАММ Escherichia coli M15 [pREP4, pLACspCBD] - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА LACspCBD, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА LACspCBD НА ЦЕЛЛЮЛОЗЕ И СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ ЛАКТОЗЫ
WO2006069289A2 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Novozymes North America, Inc Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
JP2008529972A (ja) * 2004-12-22 2008-08-07 クロス・バイオサージェリー・アクチェンゲゼルシャフト 酵素的に分解可能な連結を通じて生物活性因子が組み入れられている合成バイオマテリアル
EP1926753B1 (en) 2004-12-22 2010-11-24 Novozymes A/S Hybrid enzymes consisting of an endo-amylase first amino acid sequence and a carbohydrate-binding module as second amino acid sequence
ES2593051T3 (es) * 2005-01-06 2016-12-05 Kuros Biosurgery Ag Matrices suplementadas para la reparación de fracturas óseas
WO2006073711A2 (en) * 2005-01-06 2006-07-13 Kuros Biosurgery Ag Use of a matrix comprising a contrast agent in soft tissues
US8575101B2 (en) 2005-01-06 2013-11-05 Kuros Biosurgery Ag Supplemented matrices for the repair of bone fractures
US7662918B2 (en) * 2005-03-03 2010-02-16 Simpson Biotech Co., Ltd. Recombinant protein comprising starch binding domain and use thereof
PT103410B (pt) * 2005-12-23 2009-04-21 Univ Do Minho Proteínas modificadas compreendendo um péptido/proteína bioactivo(a) ligado(a) a uma sequência de aminoácidos que contém um módulo humano de ligação a carbohidratos (cbm), e desenvolvimento de um sistema de administração de proteínas terapeuticamente
US20100015607A1 (en) * 2005-12-23 2010-01-21 Nanostring Technologies, Inc. Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof
JP5081232B2 (ja) * 2006-05-22 2012-11-28 ナノストリング テクノロジーズ， インコーポレイテッド ナノレポーターを分析するためのシステムおよび方法
US20090286302A1 (en) 2006-06-21 2009-11-19 Novosymes A/S Desizing and Scouring Process
DE102007002580A1 (de) * 2007-01-11 2008-07-17 C-Lecta Gmbh Proteolytische Abspaltung von Protein-Tags in der rekombinanten Protein-Herstellung
EP2155899A2 (en) * 2007-04-10 2010-02-24 Nanostring Technologies, Inc. Methods and computer systems for identifying target-specific sequences for use in nanoreporters
PT2136850E (pt) 2007-04-13 2012-04-27 Kuros Biosurgery Ag Selante tecidual polimérico
EP2220112B1 (en) * 2007-11-26 2015-08-26 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Compositions comprising fibrous polypeptides and polysaccharides
WO2009083544A2 (en) * 2007-12-28 2009-07-09 Kuros Biosurgery Ag Pdgf fusion proteins incorporated into fibrin foams
AU2009223838B2 (en) 2008-03-03 2012-07-26 The University Of Miami Allogeneic cancer cell-based immunotherapy
CN102036677A (zh) 2008-03-20 2011-04-27 迈阿密大学 热休克蛋白gp96的疫苗接种及其使用方法
JP5265762B2 (ja) 2008-05-13 2013-08-14 ユニバーシティ・オブ・カンザス 金属抽出ペプチド（ｍａｐ）タグおよび関連する方法
CA2733609C (en) * 2008-08-14 2018-03-06 Nanostring Technologies, Inc. Stable nanoreporters
WO2010115118A2 (en) 2009-04-03 2010-10-07 Antigenics, Inc. Methods for preparing and using multichaperone-antigen complexes
RU2428477C2 (ru) * 2009-05-15 2011-09-10 Дмитрий Викторович Гришин РЕКОМБИНАНТНАЯ БЕЛКОВАЯ КОНСТРУКЦИЯ ДСД-сп-β-ГАЛ, ОБЛАДАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬЮ ФЕРМЕНТА ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ β-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ (ЛАКТАЗЫ) И СПОСОБНОСТЬЮ АФФИННО СВЯЗЫВАТЬСЯ С ДЕКСТРАНОМ, ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pGD-10, ОПРЕДЕЛЯЮЩАЯ БИОСИНТЕЗ ДСД-сп-β-ГАЛ, И ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ Escherichia coli DH5α/PGD-10
US20100291656A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Simpson Biotech Co., Ltd. Method and system for protein purification
US8785159B2 (en) * 2009-11-25 2014-07-22 Alliance For Sustainable Energy, Llc Extracellular secretion of recombinant proteins
ES2377617B1 (es) 2010-08-31 2012-11-23 Iden Biotechnology, S.L. Procedimiento para la producción y purificación de proteínas recombinantes en plantas.
WO2012123028A1 (en) 2011-03-16 2012-09-20 Kuros Biosurgery Ag Pharmaceutical formulation for use in spinal fusion
WO2012149317A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing bacillus agaradhaerens mannanase and methods of use thereof
EP2702152A1 (en) 2011-04-29 2014-03-05 Danisco US Inc. Detergent compositions containing bacillus sp. mannanase and methods of use thereof
US20140135252A1 (en) 2011-04-29 2014-05-15 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing geobacillus tepidamans mannanase and methods of use thereof
WO2013181461A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 University Of Kansas Metal abstraction peptide with superoxide dismutase activity
EP2904099B1 (en) 2012-10-05 2018-12-19 Novozymes A/S Preventing adhesion of bacteria
EP2935573A1 (en) 2012-12-19 2015-10-28 Danisco US Inc. Novel mannanase, compositions and methods of use thereof
JP2016521575A (ja) 2013-06-14 2016-07-25 ナノストリング テクノロジーズ，インコーポレイティド 多重化可能なタグベースのレポーターシステム
WO2015049370A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Novozymes A/S Detergent composition and use of detergent composition
US10568948B2 (en) 2015-05-13 2020-02-25 Agenus Inc. Vaccines for treatment and prevention of cancer
EP4141113A1 (en) 2015-11-05 2023-03-01 Danisco US Inc Paenibacillus sp. mannanases
EP4483721A3 (en) 2015-11-05 2025-04-16 Danisco US Inc. Paenibacillus and bacillus spp. mannanases
EP3181153A1 (en) 2015-12-18 2017-06-21 BSN medical GmbH Wound care product comprising ecm-functionalized nanocellulose
IL247569A0 (en) 2016-08-30 2016-11-30 Yeda Res & Dev An enzymatic complex for the breakdown of lignocellulosic material
EP3315145B2 (en) 2016-10-28 2025-07-16 BSN medical GmbH Multi-layer wound care product with perforated collagen layer
MX2020010526A (es) 2018-04-09 2021-01-08 Novozymes As Polipéptidos que tienen actividad alfa-amilasa ypolinucleótidos que los codifican.
JP2021522239A (ja) 2018-04-26 2021-08-30 アジェナス インコーポレイテッド 熱ショックタンパク質結合ペプチド組成物およびその使用方法
US11920290B2 (en) 2020-01-14 2024-03-05 Sanko Tekstil Isletmeleri San. Ve Tic A.S. Process for dyeing textiles and enzymes used therein
WO2024050339A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Mannanase variants and methods of use

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3410437A1 (de) * 1984-03-22 1985-09-26 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur herstellung von proteinen
JPS61264000A (ja) * 1985-03-21 1986-11-21 イミユネツクス　コ−ポレイシヨン 標識ペプチドによるタンパク質の合成
US4745055A (en) * 1985-05-07 1988-05-17 California Biotechnology Inc. Fused protein for enzyme immunoassay system
EP0244147A3 (en) * 1986-04-28 1989-04-05 Merck & Co. Inc. Purification process for hybrid proteins
DE286239T1 (de) * 1987-03-10 1994-02-24 New England Biolabs Inc Herstellung und Reinigung eines Proteins, das mit einem Bindungsprotein fusioniert ist.

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．６１，Ｎｏ．３，Ｐ．４２１−４２７（１９８７）

Also Published As

Publication number Publication date
CA1335182C (en) 1995-04-11
EP0381719A1 (en) 1990-08-16
DE68927161D1 (de) 1996-10-17
ATE142699T1 (de) 1996-09-15
DE68927161T2 (de) 1997-01-30
JPH03501261A (ja) 1991-03-22
EP0381719B1 (en) 1996-09-11
US5137819A (en) 1992-08-11
US5202247A (en) 1993-04-13
WO1990000609A1 (en) 1990-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2528721B2 (ja) セルロ―ス結合融合タンパク質
US6124117A (en) Polysaccharide binding fusion proteins and conjugates
Morag et al. Expression, purification, and characterization of the cellulose-binding domain of the scaffoldin subunit from the cellulosome of Clostridium thermocellum
US5837814A (en) Cellulose binding domain proteins
Gilkes et al. The adsorption of a bacterial cellulase and its two isolated domains to crystalline cellulose.
Francisco et al. Specific adhesion and hydrolysis of cellulose by intact Escherichia coli expressing surface anchored cellulase or cellulose binding domains
Blaak et al. Binding and substrate specificities of a Streptomyces olivaceoviridis chitinase in comparison with its proteolytically processed form
JP3791622B2 (ja) アルカリセルラーゼおよびその製造方法
AU718247B2 (en) Separation and concentration systems based on soluble oligosaccharide binding domains
JP2000512842A (ja) エンドグルカナーゼ
JPS60500480A (ja) 蛋白質とポリペプチドを製造及び分離する方法
JP2703770B2 (ja) 結合タンパク質に融合されたタンパク質の生産及びその精製
US6048715A (en) Two-phase partition affinity separation system and affinity separated cell-containing composition
JP2000503206A (ja) 成長因子―多糖結合融合タンパクを使用して細胞増殖を調節する組成物および方法
NO313884B1 (no) Fusjonsproteiner for promedikament-aktivering
WO1996013524A1 (en) Modified cellulose-binding domain (cbd) proteins and use thereof
JPH04502260A (ja) Ｎ―アセチルムラミダーゼ　ｍ１
Chetty et al. Characterization of pneumococcal purpura-producing principle
Murotsu et al. Purification and properties of a λ operator-binding protein which is expected to be autorepressor (tof protein) from E. coli carrying λdv plasmid
EP1067181A1 (en) Enzyme selection
Kim et al. Adsorption of Bacillus subtilis endo‐β‐1, 4‐glucanase to cellulosic materials
Greenwood Use of the cellulose-binding domain of a cellulase from cellulomonas fimi for affinity purification of fusion preteins
Hirose et al. Increased extracellular recovery of recombinant thermostable α-amylase from protein-excreting Escherichia coli cells by a simple water-wash procedure
Zhang Protein-cellulose interactions in the spore coat of Dictyostelium discoideum
JPH0728746B2 (ja) 新規プラスミド、微生物細胞及びヒト免疫グロブリンＧ Ｆｃ領域蛋白質の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080614

Year of fee payment: 12

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080614

Year of fee payment: 12

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090614

Year of fee payment: 13

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees