JP2520881B2 - キサントモナスによつて製造される多糖類ポリマ− - Google Patents
キサントモナスによつて製造される多糖類ポリマ−Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 キサンテン ガムは、キサントモナス(Xanthomonas)
属、たとえばカンペストリス(campestris)種、アルビリ
ニアンズ(albilineans)種、フラガリア(fragaria)種、
ベシカトリア(vesicatoria)種、及び同様のものの細菌
によって生成される。キサンテン ガムは、その珍しい
物理的性質：すなわち非常に高い比粘度及び偽塑性のた
めに広く使用される生成物である。それは、増粘剤とし
て食物中に及び移動度調整剤及びプロフィール改質剤と
して二次オイル回収に並びに石油の掘削用液体に通常使
用される。
属、たとえばカンペストリス(campestris)種、アルビリ
ニアンズ(albilineans)種、フラガリア(fragaria)種、
ベシカトリア(vesicatoria)種、及び同様のものの細菌
によって生成される。キサンテン ガムは、その珍しい
物理的性質：すなわち非常に高い比粘度及び偽塑性のた
めに広く使用される生成物である。それは、増粘剤とし
て食物中に及び移動度調整剤及びプロフィール改質剤と
して二次オイル回収に並びに石油の掘削用液体に通常使
用される。
化学的に、キサンテン ガムは陰イオン性ヘテロポリ
−サッカリドである。そのポリマーの反復単位は、５個
の糖成分：すなわち２個のグルコース成分、１個のグル
コウロン酸成分及び２個のマンノース成分から成るペン
タマーである。それらは、グルコース成分がポリマー鎖
の主鎖を形成し、そしてマンノース−グルコウロン酸−
マンノースの側鎖が一般的に、１つ置きにグルコース成
分から延長するように配列されている。しばしば、この
基本構造体は特別にアセチル化及び／又はピルビン化さ
れる〔（Janson,P.E.,Kenne,L.,及びLindberg,B.,carbo
hydrate Research,45,275〜282（1975）;Melton,L.D.,M
inolt,L.,Reses,D.A.,及びSanderson,G.R.,Carbohyolra
te Research,46,245〜257（1976））〕。この明細書に
参照されているすべての出版物を、特に引用によりこの
明細書に組み入れる。その構造を下に示す： 天然に存在するキサンテン ガムの広い利用性にもか
かわらず、その物理的性質が制限となるいくらかの状況
が存在する。特に、二次オイル回収において、通常、オ
イル産生リザーバの温度及びリザーバブライン中の塩濃
度がキサンテン溶液のために最適であるよりも高い。こ
れらの状態が存在する場合、キサンテンは沈殿し、凝集
しそして／又は粘性を失う。従って、高温度及び高塩濃
度状態で十分に作用する新規の増粘性生成物が必要であ
る。
−サッカリドである。そのポリマーの反復単位は、５個
の糖成分：すなわち２個のグルコース成分、１個のグル
コウロン酸成分及び２個のマンノース成分から成るペン
タマーである。それらは、グルコース成分がポリマー鎖
の主鎖を形成し、そしてマンノース−グルコウロン酸−
マンノースの側鎖が一般的に、１つ置きにグルコース成
分から延長するように配列されている。しばしば、この
基本構造体は特別にアセチル化及び／又はピルビン化さ
れる〔（Janson,P.E.,Kenne,L.,及びLindberg,B.,carbo
hydrate Research,45,275〜282（1975）;Melton,L.D.,M
inolt,L.,Reses,D.A.,及びSanderson,G.R.,Carbohyolra
te Research,46,245〜257（1976））〕。この明細書に
参照されているすべての出版物を、特に引用によりこの
明細書に組み入れる。その構造を下に示す： 天然に存在するキサンテン ガムの広い利用性にもか
かわらず、その物理的性質が制限となるいくらかの状況
が存在する。特に、二次オイル回収において、通常、オ
イル産生リザーバの温度及びリザーバブライン中の塩濃
度がキサンテン溶液のために最適であるよりも高い。こ
れらの状態が存在する場合、キサンテンは沈殿し、凝集
しそして／又は粘性を失う。従って、高温度及び高塩濃
度状態で十分に作用する新規の増粘性生成物が必要であ
る。
発明の要約 天然に存在するキサンテン ガムよりも良好な水の増
粘剤である多糖類ポリマーを供給することが本発明の目
的である。
粘剤である多糖類ポリマーを供給することが本発明の目
的である。
高温で及び／又は塩の存在において、天然に存在する
キサンテン ガム以上に改良された流動学的性質を有す
る多糖類ポリマーを供給することが、さらに本発明の目
的である。
キサンテン ガム以上に改良された流動学的性質を有す
る多糖類ポリマーを供給することが、さらに本発明の目
的である。
多糖類ポリマーを生成するための能力を有する微生物
を提供することが、さらに本発明の目的である。
を提供することが、さらに本発明の目的である。
多糖類ポリマーを生成するための能力を有する微生物
を好気性的に発酵することによって多糖類ポリマーを製
造するための方法を提供することが、さらに本発明の目
的である。
を好気性的に発酵することによって多糖類ポリマーを製
造するための方法を提供することが、さらに本発明の目
的である。
本発明によれば、Ｄ−グルコース:D−マンノースの比
が約2:1である、グルコウロン酸成分を本質的に含まな
い多糖類ポリマー（ここで、Ｄ−グルコース成分はポリ
マー主鎖を形成するためにβ−〔1,4〕配置で結合さ
れ、そしてＤ−マンノース成分は、一般的に１つ置きに
グルコース成分にα−〔1,3〕配置でそれぞれ結合され
ている）を含有する組成物が提供される。本発明はま
た、多糖類ポリマーを製造するための方法、多糖類ポリ
マーを製造する微生物及び多糖類ポリマーを用いての方
法を企図する。
が約2:1である、グルコウロン酸成分を本質的に含まな
い多糖類ポリマー（ここで、Ｄ−グルコース成分はポリ
マー主鎖を形成するためにβ−〔1,4〕配置で結合さ
れ、そしてＤ−マンノース成分は、一般的に１つ置きに
グルコース成分にα−〔1,3〕配置でそれぞれ結合され
ている）を含有する組成物が提供される。本発明はま
た、多糖類ポリマーを製造するための方法、多糖類ポリ
マーを製造する微生物及び多糖類ポリマーを用いての方
法を企図する。
本発明の多糖類ポリマーは、キサンテン ガムの生合
成における段階の１つをブロックすることによって製造
され得る。従って、キサンテン ガムとしてβ−〔1,
4〕−Ｄ−グルコースの主鎖から延長する３個の糖の側
鎖を有するよりかむしろ、本発明の多糖類ポリマーは、
主鎖のグルコース成分に１つ置きに一般的に結合される
単糖成分を有する。本発明の多糖類ポリマーを、この明
細書で“ポリトリマー”と呼ぶ。なぜならば、それは、
反復のトリマー単位、すなわち、グルコース−グルコー
ス−マンノースから成るからである。その構造〔ここで
ｎはポリマーにおける反復単位である〕を下に示す。
成における段階の１つをブロックすることによって製造
され得る。従って、キサンテン ガムとしてβ−〔1,
4〕−Ｄ−グルコースの主鎖から延長する３個の糖の側
鎖を有するよりかむしろ、本発明の多糖類ポリマーは、
主鎖のグルコース成分に１つ置きに一般的に結合される
単糖成分を有する。本発明の多糖類ポリマーを、この明
細書で“ポリトリマー”と呼ぶ。なぜならば、それは、
反復のトリマー単位、すなわち、グルコース−グルコー
ス−マンノースから成るからである。その構造〔ここで
ｎはポリマーにおける反復単位である〕を下に示す。
上に示されるように、ポリトリマーは、β−〔1,4〕配
置で結合するＤ−グルコースの１つ置きの成分にα−
〔1,3〕配置で一般的に結合されるＤ−マンノースから
成る。常にではないが、キサンテン ガムにおけるよう
に、酢酸成分が、Sutherlancl,I.W.,Carbohydrate Poly
mers,1,107〜115（1981）に記載されているようにマン
ノースの６−０位置でエステル化され得る。多糖類ポリ
マーの構造は、示されたようであると思われるが、合成
の一定の条件下で、マンノース成分が１つ置きのグルコ
ース残基で必ずしも結合され得ない。
置で結合するＤ−グルコースの１つ置きの成分にα−
〔1,3〕配置で一般的に結合されるＤ−マンノースから
成る。常にではないが、キサンテン ガムにおけるよう
に、酢酸成分が、Sutherlancl,I.W.,Carbohydrate Poly
mers,1,107〜115（1981）に記載されているようにマン
ノースの６−０位置でエステル化され得る。多糖類ポリ
マーの構造は、示されたようであると思われるが、合成
の一定の条件下で、マンノース成分が１つ置きのグルコ
ース残基で必ずしも結合され得ない。
発明の具体的な説明 本発明の多糖類ポリマーを、無細胞酵素系により製造
することができ又適切な突然変異体株の細胞を増殖する
ことによって製造することができる。多糖類ポリマーを
製造するための他の手段もまた、下に記載する。
することができ又適切な突然変異体株の細胞を増殖する
ことによって製造することができる。多糖類ポリマーを
製造するための他の手段もまた、下に記載する。
キサンテン ガムを製造するための無細胞系の使用に
関する基本方法は、Ielpi,L.,Couso,R.O.,及びDankert,
M.A.〔FEBS Letters,130,253〜256,（1981）〕に記載さ
れ、そして、本発明の多糖類ポリマーを製造するために
もまた使用され得る。たとえば、野生型キサントモナス
カンペストリス細胞を、冷凍−融解方法によって溶解す
ることができ、そしてポリトリマー合成のための基質、
すなわちUDP−グルコース及びGDP−マンノースをアセチ
ル−CoAと共に又はアセチル−CoAなしに該溶解物に添加
することができる。音波処理、界面活性剤処理、酵素処
理及びそれらの組み合わせを含む、別の手段の細胞溶解
を用いることができるが、しかしこれだけには限定され
ない。溶解物を粗性の形で使用することができ、又は酵
素の精製法を用いることができる。キサンテン ガムの
生合成経路の酵素は、通常の経路におけるようにグルコ
ース成分及びマンノース成分を共有的に結合する。その
酵素は新生鎖に付加するUDP−グルコウロン酸を持たな
いので、その経路は反応IV（第１図の経路を参照のこ
と）でブロックされ、そして中間体のイソプレノイド脂
質−ピロホスフェート−グルコース−グルコース−マン
ノースが蓄積する。意外なことには、脂質結合のペンタ
マー（グルコース−グルコース−マンノース−グルコウ
ロン酸−マンノース）上に通常作用するキサンテンポリ
マラーゼが脂質結合のトリマー（グルコース−グルコー
ス−マンノース）を重合することができる。従って、本
発明のポリトリマーはインビトロで合成され得る。
関する基本方法は、Ielpi,L.,Couso,R.O.,及びDankert,
M.A.〔FEBS Letters,130,253〜256,（1981）〕に記載さ
れ、そして、本発明の多糖類ポリマーを製造するために
もまた使用され得る。たとえば、野生型キサントモナス
カンペストリス細胞を、冷凍−融解方法によって溶解す
ることができ、そしてポリトリマー合成のための基質、
すなわちUDP−グルコース及びGDP−マンノースをアセチ
ル−CoAと共に又はアセチル−CoAなしに該溶解物に添加
することができる。音波処理、界面活性剤処理、酵素処
理及びそれらの組み合わせを含む、別の手段の細胞溶解
を用いることができるが、しかしこれだけには限定され
ない。溶解物を粗性の形で使用することができ、又は酵
素の精製法を用いることができる。キサンテン ガムの
生合成経路の酵素は、通常の経路におけるようにグルコ
ース成分及びマンノース成分を共有的に結合する。その
酵素は新生鎖に付加するUDP−グルコウロン酸を持たな
いので、その経路は反応IV（第１図の経路を参照のこ
と）でブロックされ、そして中間体のイソプレノイド脂
質−ピロホスフェート−グルコース−グルコース−マン
ノースが蓄積する。意外なことには、脂質結合のペンタ
マー（グルコース−グルコース−マンノース−グルコウ
ロン酸−マンノース）上に通常作用するキサンテンポリ
マラーゼが脂質結合のトリマー（グルコース−グルコー
ス−マンノース）を重合することができる。従って、本
発明のポリトリマーはインビトロで合成され得る。
上記のポリトリマーの無細胞合成は、キサントモナス
カンペストリス細胞がポリトリマーを合成するのに必
要なすべての酵素を有することを示す。しかしながら、
全細胞を使用してインビボでポリトリマーを合成するた
めには、反応IV（第１図を参照のこと）でキサンテン
ガム合成をブロッキングする手段が必要である。突然変
異誘発が反応IVをブロックするために使用され得る。
カンペストリス細胞がポリトリマーを合成するのに必
要なすべての酵素を有することを示す。しかしながら、
全細胞を使用してインビボでポリトリマーを合成するた
めには、反応IV（第１図を参照のこと）でキサンテン
ガム合成をブロッキングする手段が必要である。突然変
異誘発が反応IVをブロックするために使用され得る。
トランスポゾン（Tn10及びTn903を含むが、それだけ
に限定されない）を使用して、キサントモナスを突然変
異誘発することができる。これらのトランスポゾンは、
それぞれテトラサイクリン及びカナマイシンに対する耐
性を与える。トランスポゾンは遺伝子中にそれら自身を
挿入する能力を有する。すなわち、それらが挿入される
場合、それらはコード配列を分断することによって突然
変異を引き起こす〔Kleckner,N.,Annual Reviews of Ge
netics,15,341（1981）〕。そのトランスポゾンは、い
わゆる自殺ベクター、たとえばpRK2013に基づいてキサ
ントモナス中に導入され得る。このベクターは、非腸内
細菌、たとえばキサントモナス中にそれ自体を移行する
能力を有するが、しかしその宿主中においてそれ自体
（複製体）を保持することはできない〔Ditta,G.,Corbi
n,D.,Helinski,D.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,7347
〜7351（1980）〕。従って、その自殺ベクターが集団の
キサントモナス細胞中に導入され、そして続いて、その
集団がテトラサイクリン又はカナマイシンのいづれかに
より攻撃される場合、残存する個体は、トランスポゾン
の１つがキサントモナスのゲノム中にそれ自体を挿入し
た個体である。そのような攻撃の残存体（キサンテン
ガムを製造する能力を失った）についてスクリーンする
ことができる。そのような突然変異体は、野生型のキサ
ントモナスよりもムコイドを出現しない。
に限定されない）を使用して、キサントモナスを突然変
異誘発することができる。これらのトランスポゾンは、
それぞれテトラサイクリン及びカナマイシンに対する耐
性を与える。トランスポゾンは遺伝子中にそれら自身を
挿入する能力を有する。すなわち、それらが挿入される
場合、それらはコード配列を分断することによって突然
変異を引き起こす〔Kleckner,N.,Annual Reviews of Ge
netics,15,341（1981）〕。そのトランスポゾンは、い
わゆる自殺ベクター、たとえばpRK2013に基づいてキサ
ントモナス中に導入され得る。このベクターは、非腸内
細菌、たとえばキサントモナス中にそれ自体を移行する
能力を有するが、しかしその宿主中においてそれ自体
（複製体）を保持することはできない〔Ditta,G.,Corbi
n,D.,Helinski,D.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,7347
〜7351（1980）〕。従って、その自殺ベクターが集団の
キサントモナス細胞中に導入され、そして続いて、その
集団がテトラサイクリン又はカナマイシンのいづれかに
より攻撃される場合、残存する個体は、トランスポゾン
の１つがキサントモナスのゲノム中にそれ自体を挿入し
た個体である。そのような攻撃の残存体（キサンテン
ガムを製造する能力を失った）についてスクリーンする
ことができる。そのような突然変異体は、野生型のキサ
ントモナスよりもムコイドを出現しない。
本発明の他の態様においては、突然変異誘発の他の方
法を使用して、キサンテン ガムを製造するための能力
を失った突然変異体を生成することができる。そのよう
な方法は、容易に当業者によって行なうことができ、そ
して照射、組換えDNA技法及び化学的な突然変異誘発物
質による処理を含む（それだけに限定されない）〔Mill
er,J.H.,Experiments in Molecular Genetics（1972）;
Davis,R.W.,Botstein,D.,及びRoth,J.R.,Advanced Bac
terial Genetics（1980）;Maniatis,T.,Fritsch,E.F.,S
ambrook.J.,Moleculan Cloning（1982）,Cold Spring H
arror〕。
法を使用して、キサンテン ガムを製造するための能力
を失った突然変異体を生成することができる。そのよう
な方法は、容易に当業者によって行なうことができ、そ
して照射、組換えDNA技法及び化学的な突然変異誘発物
質による処理を含む（それだけに限定されない）〔Mill
er,J.H.,Experiments in Molecular Genetics（1972）;
Davis,R.W.,Botstein,D.,及びRoth,J.R.,Advanced Bac
terial Genetics（1980）;Maniatis,T.,Fritsch,E.F.,S
ambrook.J.,Moleculan Cloning（1982）,Cold Spring H
arror〕。
野生型よりもムコイドを出現しない突然変異体をまず
選択するたとができるが、所望の変異体は、ある多糖類
を製造するための能力を保持する。キサンテン ガム欠
失突然変異体のそれぞれの無細胞抽出物を調製すること
ができ、そして異なった組み合せの基質を添加し、そし
てその生成物を分析することによって試験する。たとえ
ば、UDP−グルコース、GDP−マンノース及びUDP−グル
コウロン酸を基質として添加するなら、生成物は、UDP
−グルコース及びGDP−マンノースが添加される場合に
生成される生成物と同一であろう。他方、適切な突然変
異体は、おのおのの突然変異体の培養ブイヨンを検定す
ることによって、ポリトリマーの存在について検出され
得る。従ってキサンテン ガム欠失突然変異体は、キサ
ンテン ガム経路の反応IVでブロックされているらしい
ことが見出され得る。この記載の突然変異体は、Americ
an Type Culture Collection,Rockville,MarylandにATC
C番号53195としてブタペスト条約に基づいて国際寄託さ
れた。そのような突然変異体を使用して、インビボでポ
リトリマーを合成することができる。
選択するたとができるが、所望の変異体は、ある多糖類
を製造するための能力を保持する。キサンテン ガム欠
失突然変異体のそれぞれの無細胞抽出物を調製すること
ができ、そして異なった組み合せの基質を添加し、そし
てその生成物を分析することによって試験する。たとえ
ば、UDP−グルコース、GDP−マンノース及びUDP−グル
コウロン酸を基質として添加するなら、生成物は、UDP
−グルコース及びGDP−マンノースが添加される場合に
生成される生成物と同一であろう。他方、適切な突然変
異体は、おのおのの突然変異体の培養ブイヨンを検定す
ることによって、ポリトリマーの存在について検出され
得る。従ってキサンテン ガム欠失突然変異体は、キサ
ンテン ガム経路の反応IVでブロックされているらしい
ことが見出され得る。この記載の突然変異体は、Americ
an Type Culture Collection,Rockville,MarylandにATC
C番号53195としてブタペスト条約に基づいて国際寄託さ
れた。そのような突然変異体を使用して、インビボでポ
リトリマーを合成することができる。
グリコシルトランスフェラーゼIV突然変異体を、本発
明のポリトリマーを製造するために例において使用した
が、本発明の他の態様は、UDP−グルコウロン酸代謝に
おける突然変異体の使用を企図する。そのような突然変
異体は単離され、そしてAmerican Type Culture Collec
tion,Rockville,MarylandにATCC番号53196としてブタペ
スト条約に基づいて国際寄託された。
明のポリトリマーを製造するために例において使用した
が、本発明の他の態様は、UDP−グルコウロン酸代謝に
おける突然変異体の使用を企図する。そのような突然変
異体は単離され、そしてAmerican Type Culture Collec
tion,Rockville,MarylandにATCC番号53196としてブタペ
スト条約に基づいて国際寄託された。
同じ生成物に到達するために、野生型グリコシルトラ
ンスフエラーゼIV又はUDP−グルコウロン酸生合成の酵
素阻害物質を使用することは、本発明の範囲外ではな
い。たとえば、キサンテン ガムの側鎖から末端のマン
ノース成分及びグルコウロン酸成分を除去することによ
るような、天然のキサンテン ガムの酵素的及び化学的
分解を含む、ポリトリマーを生成するための他の変法が
なお企画される。
ンスフエラーゼIV又はUDP−グルコウロン酸生合成の酵
素阻害物質を使用することは、本発明の範囲外ではな
い。たとえば、キサンテン ガムの側鎖から末端のマン
ノース成分及びグルコウロン酸成分を除去することによ
るような、天然のキサンテン ガムの酵素的及び化学的
分解を含む、ポリトリマーを生成するための他の変法が
なお企画される。
キサントモナスの菌株を突然変異誘発するための類似
するスケムを用いて、他の新規の多糖類ポリマーを生成
する突然変異体を得ることが可能である。たとえば、ア
セチラーゼ遺伝子の突然変異は、完全にアセチル化され
ていないキサンテン ガムを生成する。アセチラーゼ突
然変異及びグリコシルトランスフェラーゼIV突然変異を
同じ菌株（二重突然変異体）に行なう場合、アセチル化
されていないポリトリマーが生成される。他の突然変異
及びキサンテン経路の突然変異の組み合せは新規生成物
を得るために可能である。
するスケムを用いて、他の新規の多糖類ポリマーを生成
する突然変異体を得ることが可能である。たとえば、ア
セチラーゼ遺伝子の突然変異は、完全にアセチル化され
ていないキサンテン ガムを生成する。アセチラーゼ突
然変異及びグリコシルトランスフェラーゼIV突然変異を
同じ菌株（二重突然変異体）に行なう場合、アセチル化
されていないポリトリマーが生成される。他の突然変異
及びキサンテン経路の突然変異の組み合せは新規生成物
を得るために可能である。
その突然変異体を、野生型キサントモナスの増殖のた
めに当業界で知られている条件下で増殖することができ
る。たとえば、それらは、適切な同化できる炭素源、た
とえばグルコース、スクロース、マルトース、澱粉、転
化糖、複合糖質たとえば、糖密又はコーンシロップ、種
々の有機酸類及び同様のもの上で増殖され得る。炭素源
の混合物もまた、使用され得る。供給される炭素源の濃
度は、しばしば１当り約10〜60gの間である。さら
に、増殖のために必要なものは、一般的に１当り約0.
1〜1.0gの濃度の同化できる有機又は無機窒素源及び鉱
物（その選択は当業者の間で容易である）である。適切
な窒素源の例は、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、酵母
抽出物、ペプトン又は他の加水分解されるタンパク質性
物質もしくはその混合物である。適切な鉱物の例は、リ
ン、硫黄、カリウム、ナトリウム、鉄、マグネシウムを
含み、そしてこれらはしばしば、キレート剤たとえば、
EDTA又はクエン酸と共に添加される。
めに当業界で知られている条件下で増殖することができ
る。たとえば、それらは、適切な同化できる炭素源、た
とえばグルコース、スクロース、マルトース、澱粉、転
化糖、複合糖質たとえば、糖密又はコーンシロップ、種
々の有機酸類及び同様のもの上で増殖され得る。炭素源
の混合物もまた、使用され得る。供給される炭素源の濃
度は、しばしば１当り約10〜60gの間である。さら
に、増殖のために必要なものは、一般的に１当り約0.
1〜1.0gの濃度の同化できる有機又は無機窒素源及び鉱
物（その選択は当業者の間で容易である）である。適切
な窒素源の例は、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、酵母
抽出物、ペプトン又は他の加水分解されるタンパク質性
物質もしくはその混合物である。適切な鉱物の例は、リ
ン、硫黄、カリウム、ナトリウム、鉄、マグネシウムを
含み、そしてこれらはしばしば、キレート剤たとえば、
EDTA又はクエン酸と共に添加される。
一般的にキサントモナスの増殖のための適温は、約18
〜35℃、好ましくは約28〜32℃の間である。キサントモ
ナス細胞は、適切なレベルの溶解酸素、たとえば約10％
以上の飽和度を維持するために、空気又は酵素を供給す
ることによって好気的に増殖される。好ましくは、その
レベルは約20％以上に保持される。しばしばpHは約6.0
〜8.0、好ましくは約6.5〜7.5で維持される。
〜35℃、好ましくは約28〜32℃の間である。キサントモ
ナス細胞は、適切なレベルの溶解酸素、たとえば約10％
以上の飽和度を維持するために、空気又は酵素を供給す
ることによって好気的に増殖される。好ましくは、その
レベルは約20％以上に保持される。しばしばpHは約6.0
〜8.0、好ましくは約6.5〜7.5で維持される。
本発明の多糖類ポリマーは、適切な方法によって発酵
ブイヨンから回収され得る。イソプロパノール、エタノ
ール又は他の適切なアルコールによる沈殿によって、ポ
リトリマーガムを容易に収得する。一般的に、アルコー
ルは、体積に基づいて、約50〜75％の濃度に、好ましく
は塩化カリウム、塩化ナトリウム又は他の塩の存在下で
添加される。他方、そのポリマーは、限外濾過によって
ブイヨンから回収され得る。
ブイヨンから回収され得る。イソプロパノール、エタノ
ール又は他の適切なアルコールによる沈殿によって、ポ
リトリマーガムを容易に収得する。一般的に、アルコー
ルは、体積に基づいて、約50〜75％の濃度に、好ましく
は塩化カリウム、塩化ナトリウム又は他の塩の存在下で
添加される。他方、そのポリマーは、限外濾過によって
ブイヨンから回収され得る。
グルコース：マンノースの比を測定するために化学的
分析をポリトリマーガムに対して実施する場合、2:1の
理論値からの変動が見出される。キサンテン ガムを分
析する場合、同じタイプの変動が見出される。グルコー
ス：マンノースの比の測定範囲は、一般的に約1.4:1〜
約2.4:1の間であろう。好ましくは、その比は1.7:1〜2.
1:1の間であろう。
分析をポリトリマーガムに対して実施する場合、2:1の
理論値からの変動が見出される。キサンテン ガムを分
析する場合、同じタイプの変動が見出される。グルコー
ス：マンノースの比の測定範囲は、一般的に約1.4:1〜
約2.4:1の間であろう。好ましくは、その比は1.7:1〜2.
1:1の間であろう。
多糖類ポリマーのマンノース残基のアセチル化のレベ
ルは一様でない。さらに、微生物、たとえばマンノース
残基をアセチル化することができないアセチラーゼ−欠
失突然変異体を用いて、多糖類ポリマーを製造すること
は、本発明の範囲外でない。そのような場合、多糖類ポ
リマー中にアセチル化されていないマンノース残基が存
在する。
ルは一様でない。さらに、微生物、たとえばマンノース
残基をアセチル化することができないアセチラーゼ−欠
失突然変異体を用いて、多糖類ポリマーを製造すること
は、本発明の範囲外でない。そのような場合、多糖類ポ
リマー中にアセチル化されていないマンノース残基が存
在する。
典型的には、発酵ブイヨン中のポリトリマーの濃度
は、約0.1％（w/w）である。発酵条件の通常の試験及び
典型且つ組換えDNA株の改良技法（すべては当業者に知
られている）を用いて、収率を改良することができる。
は、約0.1％（w/w）である。発酵条件の通常の試験及び
典型且つ組換えDNA株の改良技法（すべては当業者に知
られている）を用いて、収率を改良することができる。
重量を基準に、ポリトリマーは水性媒体の増粘剤とし
てキサンテンよりすぐれている。ポリトリマー溶液の粘
度は、高温及び／又は高い塩度の状態で保持される。そ
のような溶液は、いづれか所望の濃度、好ましくは約0.
01〜約15％の間で、水性媒体中に多糖類ポリマーを溶解
することによって調製され得る。本発明の生成物は、二
次オイル回収に使用のために理想的である。当業界にお
いてキサンテン ガムにより使用され、そして二次オイ
ル回収において良く知られているような技法は、多糖類
ポリマーに関して適切である。たとえば、Lindblom,G.
P.,など.,アメリカ3,198,268を参照のこと。
てキサンテンよりすぐれている。ポリトリマー溶液の粘
度は、高温及び／又は高い塩度の状態で保持される。そ
のような溶液は、いづれか所望の濃度、好ましくは約0.
01〜約15％の間で、水性媒体中に多糖類ポリマーを溶解
することによって調製され得る。本発明の生成物は、二
次オイル回収に使用のために理想的である。当業界にお
いてキサンテン ガムにより使用され、そして二次オイ
ル回収において良く知られているような技法は、多糖類
ポリマーに関して適切である。たとえば、Lindblom,G.
P.,など.,アメリカ3,198,268を参照のこと。
高められたオイル回収に使用のために移動度調整溶液
を、多糖類ポリマーから調製することができる。約100
〜約3,000ppmの濃度の多糖類ポリマーがそのような移動
度調整溶液のためにふさわしい。他の既知の添加剤もま
た、オイル回収をさらに増すためにこれらの溶液中に、
又はこれらの溶液と一緒に使用することができる。たと
えば、そのような添加剤、界面活性剤及びアルカリ剤を
含む。
を、多糖類ポリマーから調製することができる。約100
〜約3,000ppmの濃度の多糖類ポリマーがそのような移動
度調整溶液のためにふさわしい。他の既知の添加剤もま
た、オイル回収をさらに増すためにこれらの溶液中に、
又はこれらの溶液と一緒に使用することができる。たと
えば、そのような添加剤、界面活性剤及びアルカリ剤を
含む。
キサンテン ガムのような多糖類ポリマーはまた、食
物、化粧品、医薬配合物、紙サイジング剤、でい水、印
刷インキ、及び同様のものにおける増粘剤としても使用
され得る。さらに、それは、パイプ中における流体の流
れの摩擦抵抗を減ずるために使用され得る。
物、化粧品、医薬配合物、紙サイジング剤、でい水、印
刷インキ、及び同様のものにおける増粘剤としても使用
され得る。さらに、それは、パイプ中における流体の流
れの摩擦抵抗を減ずるために使用され得る。
次の例は、例的に記載されているか、この発明の範囲
を限定するものではない。
を限定するものではない。
例１ この例は、本発明の生成物をインビトロでどのように
して調製することができるかを示し、そしてそれをキサ
ンテン経路の不完全な生成物として同定する。
して調製することができるかを示し、そしてそれをキサ
ンテン経路の不完全な生成物として同定する。
細胞溶解物の調製 キサントモナスカンペストリスB1459 S4-Ｌを、アメ
リカ農務省のNorthern Regional Research Laboratorie
sから得た。Jaanes,A.,など。〔アメリカ農務省、ARS-N
C-51、14ページ（1976）〕によって記載されているよう
に、細菌を、２％（w/v）グルコースにより補われてい
るYM（酵母−麦芽培地）において増殖した。培養物を30
℃で300rpmで後期対数増殖期に増殖する。その細胞を30
℃でYM＋２％（w/v）グルコースプレート上で力価し
た。その細胞を遠心分離によって収得し、そして70mM冷
Tris-HCl（pH8.2）により洗浄した。洗浄された細胞
を、10mMのEDTAを含む70mMのTris-HCl（pH8.2）中に再
懸濁し、そしてGarcia,R.C.,など．〔European Journal
of Biochemistry 43,93〜105（1974）〕に類似する方
法によって３回凍結融解した。この処理の後、懸濁液の
上昇した粘度及び細胞の生存度の完全な喪失（106個の
細胞のうち１個の生存細胞）によって明示されるよう
に、この方法は細胞を破裂せしめた。アリコートの凍結
融解された細胞溶解物を−80℃で凍結した。タンパク質
濃度を、BIO RAD検定（BIO RAD Laboratories,リッチモ
ンド、カルフォルニア）により測定し、そして細胞溶解
物1ml当り５〜7mgの細胞タンパク質が存在することが見
出された。
リカ農務省のNorthern Regional Research Laboratorie
sから得た。Jaanes,A.,など。〔アメリカ農務省、ARS-N
C-51、14ページ（1976）〕によって記載されているよう
に、細菌を、２％（w/v）グルコースにより補われてい
るYM（酵母−麦芽培地）において増殖した。培養物を30
℃で300rpmで後期対数増殖期に増殖する。その細胞を30
℃でYM＋２％（w/v）グルコースプレート上で力価し
た。その細胞を遠心分離によって収得し、そして70mM冷
Tris-HCl（pH8.2）により洗浄した。洗浄された細胞
を、10mMのEDTAを含む70mMのTris-HCl（pH8.2）中に再
懸濁し、そしてGarcia,R.C.,など．〔European Journal
of Biochemistry 43,93〜105（1974）〕に類似する方
法によって３回凍結融解した。この処理の後、懸濁液の
上昇した粘度及び細胞の生存度の完全な喪失（106個の
細胞のうち１個の生存細胞）によって明示されるよう
に、この方法は細胞を破裂せしめた。アリコートの凍結
融解された細胞溶解物を−80℃で凍結した。タンパク質
濃度を、BIO RAD検定（BIO RAD Laboratories,リッチモ
ンド、カルフォルニア）により測定し、そして細胞溶解
物1ml当り５〜7mgの細胞タンパク質が存在することが見
出された。
生合成検定方法 Ielpi,L.,Couso,R.D.,及びDankert,M.A.,FEBS Letter
s,130,253〜256（1981）に記載されるように、アリコー
トの凍結融解された細胞溶解物（300〜400μｇのタンパ
ク質に等しい）、DNAase I（10μg/ml）及びMgCl2（8m
M）を、20分間20℃でプレインインキュベートした。目
的とする放射性糖ヌクレオチド（UDP−グルコース及びG
DP−マンノース）を含むpH8.2で70mMのTris-HCl（UDP−
グルコウロン酸を含むか又は含まない）の同体積を添加
し、そして20℃でインキュベートした。種々の時間で、
4mMのEDTAを添加することによってその反応を停止し
た。そのサンプルを遠心分離し、そしてそのペレットを
緩衝液により２度洗浄した。上清液を集め、キャリアキ
サンテン（100μｇ）を添加し、そしてキサンテン＋合
成されたポリマーをエタノール（60％）-KCl（0.8％）
により沈澱せしめた。この沈澱したポリマーを水中に再
懸濁し、そしてさらに２度再沈殿せしめ、導入されなか
ったラベルを除去した。そのガム画分に取り込まれた放
射能を液体シンチレーションカウンターで測定し、そし
てそのデータを処理し、ピコモルに換算してその取込み
を得た。
s,130,253〜256（1981）に記載されるように、アリコー
トの凍結融解された細胞溶解物（300〜400μｇのタンパ
ク質に等しい）、DNAase I（10μg/ml）及びMgCl2（8m
M）を、20分間20℃でプレインインキュベートした。目
的とする放射性糖ヌクレオチド（UDP−グルコース及びG
DP−マンノース）を含むpH8.2で70mMのTris-HCl（UDP−
グルコウロン酸を含むか又は含まない）の同体積を添加
し、そして20℃でインキュベートした。種々の時間で、
4mMのEDTAを添加することによってその反応を停止し
た。そのサンプルを遠心分離し、そしてそのペレットを
緩衝液により２度洗浄した。上清液を集め、キャリアキ
サンテン（100μｇ）を添加し、そしてキサンテン＋合
成されたポリマーをエタノール（60％）-KCl（0.8％）
により沈澱せしめた。この沈澱したポリマーを水中に再
懸濁し、そしてさらに２度再沈殿せしめ、導入されなか
ったラベルを除去した。そのガム画分に取り込まれた放
射能を液体シンチレーションカウンターで測定し、そし
てそのデータを処理し、ピコモルに換算してその取込み
を得た。
B1459 S4-Ｌの細胞溶解物を20℃で30分間インキュベー
トし、そしてこの明細書に記載されているようにして処
理し、ガム画分を得た。マンノースに対するグルコース
のモル比は、ガム画分中に取込まれたトリチウムにより
ラベルされた糖に対する14Cによりラベルされた糖のピ
コモルの比である。
トし、そしてこの明細書に記載されているようにして処
理し、ガム画分を得た。マンノースに対するグルコース
のモル比は、ガム画分中に取込まれたトリチウムにより
ラベルされた糖に対する14Cによりラベルされた糖のピ
コモルの比である。
すべての３種の糖成分の存在においては、キサンテン
ガムのために予期した通り、グルコース：マンノース
の比は1.0:1であった。UDP−グルコウロン酸がない場
合、その比は2.1:1であった。第１表を参照のこと。こ
の比は、多糖類ポリマーが、キサンテン ガムの生合成
経路において中間体であるトリマー単位から構成される
という仮説に矛盾しない。
ガムのために予期した通り、グルコース：マンノース
の比は1.0:1であった。UDP−グルコウロン酸がない場
合、その比は2.1:1であった。第１表を参照のこと。こ
の比は、多糖類ポリマーが、キサンテン ガムの生合成
経路において中間体であるトリマー単位から構成される
という仮説に矛盾しない。
パルス−チェイス インビトロ実験は、脂質結合のセ
ロビオース（グルコースダイマー）が脂質結合のトリマ
ー（グルコース−グルコース−マンノース）及び続いて
ポリトリマーガムに加工されたことを示した。菌株B145
9 S4−Ｌの凍結融解細胞溶解物を上記のようにして調製
した。
ロビオース（グルコースダイマー）が脂質結合のトリマ
ー（グルコース−グルコース−マンノース）及び続いて
ポリトリマーガムに加工されたことを示した。菌株B145
9 S4−Ｌの凍結融解細胞溶解物を上記のようにして調製
した。
UDP−〔14C〕グルコースをその細胞溶解物に添加し、
“パルス”を行ない、そして放射性ラベルされたセロビ
オースを、13分のインキュベーションの間に脂質キャリ
アー上に蓄積せしめた。“チェイス”は、100倍過剰の
ラベルされていないUDP−グルコース及びGDP−〔3H〕マ
ンノースの添加から成る。細胞溶解物及び糖ヌクレオチ
ドのイキュベーション混合物のアリコートを種々の時間
で取り、そして有機抽出物（脂質キャリアー結合の画
分）及び水性画分（ガムを含む）を生成するために処理
する。有機抽出物のオリゴ糖を脂質キャリアーから酸加
水解し、脱リン酸化し、薄層クロマトグラフィーによっ
て分離し、クロマトグラムから除去し、そして放射性ラ
ベルを定量した。
“パルス”を行ない、そして放射性ラベルされたセロビ
オースを、13分のインキュベーションの間に脂質キャリ
アー上に蓄積せしめた。“チェイス”は、100倍過剰の
ラベルされていないUDP−グルコース及びGDP−〔3H〕マ
ンノースの添加から成る。細胞溶解物及び糖ヌクレオチ
ドのイキュベーション混合物のアリコートを種々の時間
で取り、そして有機抽出物（脂質キャリアー結合の画
分）及び水性画分（ガムを含む）を生成するために処理
する。有機抽出物のオリゴ糖を脂質キャリアーから酸加
水解し、脱リン酸化し、薄層クロマトグラフィーによっ
て分離し、クロマトグラムから除去し、そして放射性ラ
ベルを定量した。
実験条件及び有機画分及び可溶性ガム画分の加工は例１
に記載されている。
に記載されている。
第２表に見られるようにUDP−〔14C〕グルコースから
のラベルされたグルコースは、“パルス”において直ち
に、脂質結合のセロビオース中に取込まれた。GDP−マ
ンノース及び過剰のUDP−グルコースの添加後（チェイ
ス）、ラベルされたセロビオースは、急速にラベルされ
た脂質結合のトリマーに転換され、そしてこれは後で、
チェイスが始まった後約16分で水性画分中にポリトリマ
ーガムとして検出された。これは、UDP−グルコース、
脂質結合のセロビオース、脂質結合のトリマー及びポリ
トリマーガムの前駆体−生成物関係及びキサンテンの生
合成経路に対するそれらの関係を示す。
のラベルされたグルコースは、“パルス”において直ち
に、脂質結合のセロビオース中に取込まれた。GDP−マ
ンノース及び過剰のUDP−グルコースの添加後（チェイ
ス）、ラベルされたセロビオースは、急速にラベルされ
た脂質結合のトリマーに転換され、そしてこれは後で、
チェイスが始まった後約16分で水性画分中にポリトリマ
ーガムとして検出された。これは、UDP−グルコース、
脂質結合のセロビオース、脂質結合のトリマー及びポリ
トリマーガムの前駆体−生成物関係及びキサンテンの生
合成経路に対するそれらの関係を示す。
例２ この例は、グリコシルトランスフェラーゼIV欠失突然
変異体によってインビトロで合成されたポリトリマーガ
ムにおけるグルコース：マンノースのモル比を示す。
変異体によってインビトロで合成されたポリトリマーガ
ムにおけるグルコース：マンノースのモル比を示す。
細胞溶解物を調製するための方法は上の例１に記載さ
れている。その細胞溶解物を調製するために使用される
菌株は、ATCC番号53195と示される菌株であった。UDP−
〔14C〕グルコースのみ、UDP−〔14C〕グルコース及びG
DP−〔3H〕マンノース、又はUDP−〔14C〕グルコース、
GDP−〔3H〕マンノース及びラベルされていないUDP−グ
ルコウロン酸から成る、1,2又は３ヌクレオチド付加の
糖のいづれかを、その細胞溶解物に添加した。その糖基
質の添加の後30分で、水性画分を処理し、そして例１に
記載しているようにして分析した。結果は第３表に示さ
れる。２種の糖基質、すなわちUDP−グルコース及びGDP
−マンノースが、インキュベーション混合物中に存在す
る場合、グルコース：マンノースのモル比はガム中で2.
4:1であった。すべての３種の糖基質を細胞溶解物と共
にインキュベートする場合、得られるガムはグルコー
ス：マンノースのモル比が2.3:1であった。
れている。その細胞溶解物を調製するために使用される
菌株は、ATCC番号53195と示される菌株であった。UDP−
〔14C〕グルコースのみ、UDP−〔14C〕グルコース及びG
DP−〔3H〕マンノース、又はUDP−〔14C〕グルコース、
GDP−〔3H〕マンノース及びラベルされていないUDP−グ
ルコウロン酸から成る、1,2又は３ヌクレオチド付加の
糖のいづれかを、その細胞溶解物に添加した。その糖基
質の添加の後30分で、水性画分を処理し、そして例１に
記載しているようにして分析した。結果は第３表に示さ
れる。２種の糖基質、すなわちUDP−グルコース及びGDP
−マンノースが、インキュベーション混合物中に存在す
る場合、グルコース：マンノースのモル比はガム中で2.
4:1であった。すべての３種の糖基質を細胞溶解物と共
にインキュベートする場合、得られるガムはグルコー
ス：マンノースのモル比が2.3:1であった。
省略形は第１表の凡例に説明されている。ATCC番号5319
5の細胞溶解物を、示されている反応混合物中で30分間2
0℃でインキュベートし、そして例２に記載されている
ようにして処理し、ガム画分を得た。示されるグルコー
ス：マンノースのモル比は、処理された画分中に取込ま
れたトリチウムによりラベルされた糖に対する、14Cに
よりラベルされた糖のピコモルの比である。
5の細胞溶解物を、示されている反応混合物中で30分間2
0℃でインキュベートし、そして例２に記載されている
ようにして処理し、ガム画分を得た。示されるグルコー
ス：マンノースのモル比は、処理された画分中に取込ま
れたトリチウムによりラベルされた糖に対する、14Cに
よりラベルされた糖のピコモルの比である。
グリコシルトランスフェラーゼIV欠失の突然変異体か
らの無細胞溶解物を使用する場合、UDP−グルコウロン
酸の存在は、多糖類ポリマー中に取込まれるグルコー
ス：マンノースの比に影響を及ぼさなかった。すべての
３種の糖と共にインキュベートされた場合の突然変異体
の細胞溶解物の生化学的表現型は、２種の糖基質だけと
インキュベートされた場合の野生型細胞溶解物の表現型
に類似し、そしてここで、インビトロで生成されるガム
の両者は、グルコース成分：マンノース成分のモル比が
およそ2:1であった。
らの無細胞溶解物を使用する場合、UDP−グルコウロン
酸の存在は、多糖類ポリマー中に取込まれるグルコー
ス：マンノースの比に影響を及ぼさなかった。すべての
３種の糖と共にインキュベートされた場合の突然変異体
の細胞溶解物の生化学的表現型は、２種の糖基質だけと
インキュベートされた場合の野生型細胞溶解物の表現型
に類似し、そしてここで、インビトロで生成されるガム
の両者は、グルコース成分：マンノース成分のモル比が
およそ2:1であった。
例３ この例は、ポリトリマーガムを形成するために重合さ
れるトリマー中間体がキサンテン ガムにおけるのと同
じ糖のアノマー配置を有することを示す。さらに、それ
は、トリマーのマンノースが脂質結合の中間体において
非還元グルコースのセロビオースに付加されていること
を示す。
れるトリマー中間体がキサンテン ガムにおけるのと同
じ糖のアノマー配置を有することを示す。さらに、それ
は、トリマーのマンノースが脂質結合の中間体において
非還元グルコースのセロビオースに付加されていること
を示す。
α−マンノシダーゼ（EC 3.2.1.24）及びβ−グルコ
シダーゼ（EC 3.2.1.21）を用いて、例１において記載
しているようにして合成され、そして二重にラベルされ
たトリマー性オリゴ糖を別々に又は連続的に処理した。
α−マンノシダーゼは、α−１結合によって付加されて
いる、末端の非置換マンノース残基を加水分解するであ
ろう。β−グルコシダーゼは、β−１結合で付加されて
いる、末端の非置換Ｄ−グルコシル残基を加水分解する
であろう。
シダーゼ（EC 3.2.1.21）を用いて、例１において記載
しているようにして合成され、そして二重にラベルされ
たトリマー性オリゴ糖を別々に又は連続的に処理した。
α−マンノシダーゼは、α−１結合によって付加されて
いる、末端の非置換マンノース残基を加水分解するであ
ろう。β−グルコシダーゼは、β−１結合で付加されて
いる、末端の非置換Ｄ−グルコシル残基を加水分解する
であろう。
トリマーを脂質から除去し、そして脱リン酸化した。
次に、α−マンノシダーゼがアセチル化したマンノース
成分を認識することができないので、これを、たとえば
pH12で２〜３時間塩基処理することによって脱アセチル
化した。
次に、α−マンノシダーゼがアセチル化したマンノース
成分を認識することができないので、これを、たとえば
pH12で２〜３時間塩基処理することによって脱アセチル
化した。
その結果は次のとおりであった。β−グルコシダーゼ
によるトリマー性オリゴ糖の処理は、それに変化を与え
なかった。トリマー性オリゴマーをまずα−マンノシダ
ーゼ及び次にβ−グルコシダーゼにより処理する場合、
グルコース及びマンノースが形成された。その結果は、
マンノースがトリマー性中間体においてα−結合によっ
て非還元性グルコースに付加され、そしてそのグルコー
ス成分がβ−結合されていることを確かにする。これ
は、トリマーが正常なキサンテン酵素経路の中間生成物
であることを確かにする。
によるトリマー性オリゴ糖の処理は、それに変化を与え
なかった。トリマー性オリゴマーをまずα−マンノシダ
ーゼ及び次にβ−グルコシダーゼにより処理する場合、
グルコース及びマンノースが形成された。その結果は、
マンノースがトリマー性中間体においてα−結合によっ
て非還元性グルコースに付加され、そしてそのグルコー
ス成分がβ−結合されていることを確かにする。これ
は、トリマーが正常なキサンテン酵素経路の中間生成物
であることを確かにする。
例４ この例は、グリコシルトランスフェラーゼIVのための
遺伝子の障害により不完全なキサンテン ガムである突
然変異菌株を生成するために使用された突然変異誘発及
びそのスクリーニングの方法を示す。
遺伝子の障害により不完全なキサンテン ガムである突
然変異菌株を生成するために使用された突然変異誘発及
びそのスクリーニングの方法を示す。
ストレプトマイシンに対する染色体耐性により遺伝学
的に標識されたキサントモナス カンペストリスを、プ
ラスミドpRK2013::Tn10を含むEA.コリLE392と接合する
受容菌として使用した。プラスミドpRK2013は、カナマ
シン耐性をコードするTn903を含み〔Figurski,D.H.,及
びHelinski,D.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,76,1648
〜1652（1979）〕、そしてそのプラスミドはキサントモ
ナス中において複製することができない（Ditta,G.,な
ど.,前記）。トランポゾンTn10はテトラサイクリン耐性
をコードする。ストレプトマイシン及びカナマイシン、
又はストレプトマイシン及びテトラサイクリンに対して
耐性であるトランスコンジュガント（transconjugant
s）を選択した。前者は約４×10-6／受容菌の頻度で生
じ、そして多分、Tn903のトランスポジションに起因し
た。後者は約３×10-6／受容菌の頻度で生じ、そして多
分、キサントモナスカンペストリスのゲノム中へのTn10
のトランスポジションに起因した。
的に標識されたキサントモナス カンペストリスを、プ
ラスミドpRK2013::Tn10を含むEA.コリLE392と接合する
受容菌として使用した。プラスミドpRK2013は、カナマ
シン耐性をコードするTn903を含み〔Figurski,D.H.,及
びHelinski,D.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,76,1648
〜1652（1979）〕、そしてそのプラスミドはキサントモ
ナス中において複製することができない（Ditta,G.,な
ど.,前記）。トランポゾンTn10はテトラサイクリン耐性
をコードする。ストレプトマイシン及びカナマイシン、
又はストレプトマイシン及びテトラサイクリンに対して
耐性であるトランスコンジュガント（transconjugant
s）を選択した。前者は約４×10-6／受容菌の頻度で生
じ、そして多分、Tn903のトランスポジションに起因し
た。後者は約３×10-6／受容菌の頻度で生じ、そして多
分、キサントモナスカンペストリスのゲノム中へのTn10
のトランスポジションに起因した。
栄養要求株が約２％の頻度でこれらのトランスコンジ
ュガントの間に見出された。それらの要求は種々の栄養
要求物の間で広く異なった。このことは、これらのトラ
ンスポゾンがキサントモナス中への挿入のために特に好
ましい遺伝子座を持たないことを示す。その栄養要求株
の原栄養性復帰細胞が選択され、そしてほとんどが薬物
感受性であることが見出された。このことは、栄養要求
株がトランスポゾン挿入によって引き起こされたことを
示す。
ュガントの間に見出された。それらの要求は種々の栄養
要求物の間で広く異なった。このことは、これらのトラ
ンスポゾンがキサントモナス中への挿入のために特に好
ましい遺伝子座を持たないことを示す。その栄養要求株
の原栄養性復帰細胞が選択され、そしてほとんどが薬物
感受性であることが見出された。このことは、栄養要求
株がトランスポゾン挿入によって引き起こされたことを
示す。
二重耐性トランスコンジガントの間のキサンテン ガ
ム欠失の突然変異体についてスクリーンするために、キ
サント ガム産生コロニィとキサント ガム非産生コロ
ニィと間に形態的な区別を高めるコンゴレッドダイ（Co
ngo Reod dye）を、固形培地に添加した。コロニィの形
態を、30℃で７〜12日間インキュベートした後、試験し
た。キサンテン ガム欠失の突然変異体がおよそ10-4の
頻度で見出された。
ム欠失の突然変異体についてスクリーンするために、キ
サント ガム産生コロニィとキサント ガム非産生コロ
ニィと間に形態的な区別を高めるコンゴレッドダイ（Co
ngo Reod dye）を、固形培地に添加した。コロニィの形
態を、30℃で７〜12日間インキュベートした後、試験し
た。キサンテン ガム欠失の突然変異体がおよそ10-4の
頻度で見出された。
キサンテン ガム欠失の突然変異体の中からグリコシ
ルトランスフェラーゼIV突然変異体を同定するために、
おのおのの凍結融解細胞溶解体を調製した。放射性ラベ
ルされたUDP−グルコース及びGDP−マンノースをUDP−
グルコウロン酸と共に又はなしに添加した。目的とする
突然変異体は、UDP−グルコウロン酸の存在に関係な
く、約2:1のグルコース：マンノースの比を有するガム
を製造した。この説明のいくつかの突然変異体が見出さ
れた。それらはTn10挿入による障害を含む。Tn904によ
って誘発された突然変異体もまた、この表現型を有する
ことが見出された。さらに、ニトロソグアニジンによっ
て誘発された、この表現型を有する突然変異体を単離し
た。
ルトランスフェラーゼIV突然変異体を同定するために、
おのおのの凍結融解細胞溶解体を調製した。放射性ラベ
ルされたUDP−グルコース及びGDP−マンノースをUDP−
グルコウロン酸と共に又はなしに添加した。目的とする
突然変異体は、UDP−グルコウロン酸の存在に関係な
く、約2:1のグルコース：マンノースの比を有するガム
を製造した。この説明のいくつかの突然変異体が見出さ
れた。それらはTn10挿入による障害を含む。Tn904によ
って誘発された突然変異体もまた、この表現型を有する
ことが見出された。さらに、ニトロソグアニジンによっ
て誘発された、この表現型を有する突然変異体を単離し
た。
例５ この例は、インビボでポリトリマーガムを生成するた
めのグリコシルトランスフェラーゼIV欠失突然変異体の
使用を示す。
めのグリコシルトランスフェラーゼIV欠失突然変異体の
使用を示す。
インビボで合成されるガムを得るために、野生型NRRL
B-1459 S4-Ｌ及び例４のグリコシルトランスフェラー
ゼIV欠失突然変異体（ATCC番号53195）のそれぞれ5l
を、pH6.0〜8.0に調整されたpHにより28℃〜32℃で発酵
槽中において好気的に増殖せしめた。10g/lのリン酸カ
リウム、1.43g/lの硫酸アンモニウム、2g/lのクエン
酸、30g/lのグルコース及び微量元素を含む最少培地を
使用した。145時間後、そのガムを回収し、そして精製
した。細胞を遠心分離によって除去し、そしてイソプロ
パノール（55％v/v）及び塩化ナトリウム（0.5％w/v）
の添加によってブイヨンからガムを沈殿せしめた。沈殿
物を濾過することによって集め、そして水に再溶解し
た。ガムを塩なしでイソプロパノール（55％v/v）によ
り沈殿せしめ、そして水に再溶解した。その調製物を、
12,000MWカットオフ膜透析チューブを用いて３日間水に
対して透析した。
B-1459 S4-Ｌ及び例４のグリコシルトランスフェラー
ゼIV欠失突然変異体（ATCC番号53195）のそれぞれ5l
を、pH6.0〜8.0に調整されたpHにより28℃〜32℃で発酵
槽中において好気的に増殖せしめた。10g/lのリン酸カ
リウム、1.43g/lの硫酸アンモニウム、2g/lのクエン
酸、30g/lのグルコース及び微量元素を含む最少培地を
使用した。145時間後、そのガムを回収し、そして精製
した。細胞を遠心分離によって除去し、そしてイソプロ
パノール（55％v/v）及び塩化ナトリウム（0.5％w/v）
の添加によってブイヨンからガムを沈殿せしめた。沈殿
物を濾過することによって集め、そして水に再溶解し
た。ガムを塩なしでイソプロパノール（55％v/v）によ
り沈殿せしめ、そして水に再溶解した。その調製物を、
12,000MWカットオフ膜透析チューブを用いて３日間水に
対して透析した。
高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によっての続
く分析による多糖類ポリマーの完全な酸加水分解によっ
て、グルコース：マンノース比を測定し、そしてインビ
トロで合成されたポリマーのために見出された比と一致
することが見出された。約2.15:1のグルコース：マンノ
ース比を有するガムを製造する、グリコシルトランスフ
ェラーゼIV欠失の突然変異体をATCC番号53195と名づ
け、そして他方、野生型は約0.96:1の比のガムを製造し
た。
く分析による多糖類ポリマーの完全な酸加水分解によっ
て、グルコース：マンノース比を測定し、そしてインビ
トロで合成されたポリマーのために見出された比と一致
することが見出された。約2.15:1のグルコース：マンノ
ース比を有するガムを製造する、グリコシルトランスフ
ェラーゼIV欠失の突然変異体をATCC番号53195と名づ
け、そして他方、野生型は約0.96:1の比のガムを製造し
た。
インビボで産生された他のポリトリマーガムのサンプ
ルを、HPLC又は酸加水分解後の糖の酵素分析によって検
定した。行なわれた24種の分析に関しては、ゴルコー
ス：マンノースのモル比の範囲は1.43:1〜2.44:1であっ
た。グリコシルトランスフェラーゼIV欠失の突然変異株
によって製造されたポリトリマーのための平均比は1.90
±0.15:1であった。
ルを、HPLC又は酸加水分解後の糖の酵素分析によって検
定した。行なわれた24種の分析に関しては、ゴルコー
ス：マンノースのモル比の範囲は1.43:1〜2.44:1であっ
た。グリコシルトランスフェラーゼIV欠失の突然変異株
によって製造されたポリトリマーのための平均比は1.90
±0.15:1であった。
また、適度に検出できる、インビボで産生されたポリ
トリマーのHPLC分析によって示されるように、第１に、
グルコウロン酸の非存在、第２に、ピルビン酸の非存
在、第３に、アセテートの存在及び第４に、グルコース
及びマンノースよりも他の糖の非存在があった。
トリマーのHPLC分析によって示されるように、第１に、
グルコウロン酸の非存在、第２に、ピルビン酸の非存
在、第３に、アセテートの存在及び第４に、グルコース
及びマンノースよりも他の糖の非存在があった。
例６ この例は、温度及び無機塩濃度の範囲にわたって、ポ
リトリマーがキサンテン ガムに比較して、改良された
流動学的性質を示す水溶液を提供することを示す。
リトリマーがキサンテン ガムに比較して、改良された
流動学的性質を示す水溶液を提供することを示す。
ポリトリマーガム（例５に従ってインビボで合成され
た）及びキサンテン ガム（精製されたPfize Flocon 4
800）の溶液を、10重量％の塩化ナトリウムを含む水中
において1,000ppmの濃度で製造した。
た）及びキサンテン ガム（精製されたPfize Flocon 4
800）の溶液を、10重量％の塩化ナトリウムを含む水中
において1,000ppmの濃度で製造した。
ポリトリマーガムは、広い範囲の剪断速度にわたって
キサンテン ガムよりれも実質的に高い粘度を示す（第
２図）。
キサンテン ガムよりれも実質的に高い粘度を示す（第
２図）。
室温でキサンテンの粘度に対するポリトリマーの粘度
の比は、水塩度により異なり、そして第３図に示される
ように、０〜20重量％の塩化ナトリウムの塩度範囲にわ
たって、２〜2.5の間に存在する。キサンテンの粘度に
対するポリトリマーの粘度の比はまた、ポリマー濃度に
より異なる（第４図）。最後に、キサンテンの粘度より
もすぐれたポリトリマーの粘度の改良が、０〜20重量％
の塩化ナトリウムの水塩度について、25〜75℃の範囲に
わたる温度により増大する（第５図）。
の比は、水塩度により異なり、そして第３図に示される
ように、０〜20重量％の塩化ナトリウムの塩度範囲にわ
たって、２〜2.5の間に存在する。キサンテンの粘度に
対するポリトリマーの粘度の比はまた、ポリマー濃度に
より異なる（第４図）。最後に、キサンテンの粘度より
もすぐれたポリトリマーの粘度の改良が、０〜20重量％
の塩化ナトリウムの水塩度について、25〜75℃の範囲に
わたる温度により増大する（第５図）。
本発明の変法は当業者にとって明らかであろうから、
本発明を、特許請求の範囲によってのみ限定する。
本発明を、特許請求の範囲によってのみ限定する。
第１図は、キサンテン ガムの生合成の推定される経路
を示す。それはいくつかの実験所のデータに基づかれ
る。Ielpi,L.,Couso,R.O.,及びDankert,M.A.,Biochem.B
iophy.Res.Comm.,102,1400〜1408（1981）,FEBS Letter
s,130,253〜256（1981）,Biochem.Intern.,6,323〜333
（1983）;Osborn,M.J.及びWeiner,I.M.,J.Biol.Chem.,2
43,2631〜2639（1967）;Troy,F.A.,Annual Reviews of
Microbiology,33,519〜560（1979）を参照のこと。使用
される省略形は、glu＝グルコース、gluA＝グルコウロ
ン酸、man＝マンノース、glu-glu＝セロビオース、Ｐ＝
リン酸、PP＝ピロリン酸、C55＝イソプレノイド脂質キ
ャリアー、PEP＝ホスホエノールピルビン酸、AcCoA＝ア
セチル補酵素Ａ、Ｉ−Ｖ＝グリコシルトランスフェラー
ゼ、UDP＝ウリジン５′−二リン酸、及びGDP＝グアノシ
ン５′−二リン酸である。 第２図は、10重量％のNaClブライン中においてそれぞれ
1000ppmでのポリトリマー溶液の粘度及びキサンテン
ガム溶液の粘度を剪断速度の関数として示す。 第３図は、それぞれ1000ppmのキサンテン ガム溶液の
粘度に対するポリトリマー溶液の粘度の比をブライン塩
度の関数として示す。 第４図は、10重量％のNaClブライン中においてキサンテ
ン ガム溶液の粘度に対するポリトリマー溶液の粘度の
比をポリマー濃度の関数として示す。 第５図は、種々の塩度のブライン中においてそれぞれ10
00ppmのキサンテン ガム溶液の粘度に対するポリトリ
マー溶液の粘度の比を温度の関数として示す。
を示す。それはいくつかの実験所のデータに基づかれ
る。Ielpi,L.,Couso,R.O.,及びDankert,M.A.,Biochem.B
iophy.Res.Comm.,102,1400〜1408（1981）,FEBS Letter
s,130,253〜256（1981）,Biochem.Intern.,6,323〜333
（1983）;Osborn,M.J.及びWeiner,I.M.,J.Biol.Chem.,2
43,2631〜2639（1967）;Troy,F.A.,Annual Reviews of
Microbiology,33,519〜560（1979）を参照のこと。使用
される省略形は、glu＝グルコース、gluA＝グルコウロ
ン酸、man＝マンノース、glu-glu＝セロビオース、Ｐ＝
リン酸、PP＝ピロリン酸、C55＝イソプレノイド脂質キ
ャリアー、PEP＝ホスホエノールピルビン酸、AcCoA＝ア
セチル補酵素Ａ、Ｉ−Ｖ＝グリコシルトランスフェラー
ゼ、UDP＝ウリジン５′−二リン酸、及びGDP＝グアノシ
ン５′−二リン酸である。 第２図は、10重量％のNaClブライン中においてそれぞれ
1000ppmでのポリトリマー溶液の粘度及びキサンテン
ガム溶液の粘度を剪断速度の関数として示す。 第３図は、それぞれ1000ppmのキサンテン ガム溶液の
粘度に対するポリトリマー溶液の粘度の比をブライン塩
度の関数として示す。 第４図は、10重量％のNaClブライン中においてキサンテ
ン ガム溶液の粘度に対するポリトリマー溶液の粘度の
比をポリマー濃度の関数として示す。 第５図は、種々の塩度のブライン中においてそれぞれ10
00ppmのキサンテン ガム溶液の粘度に対するポリトリ
マー溶液の粘度の比を温度の関数として示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 19/04 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:64） Ｃ１２Ｒ 1:64） Ｅ２１Ｂ 43/16
Claims (14)
- 【請求項１】グルコウロン酸成分を本質的に含まない、
Ｄ−グルコース:D−マンノースの比が約2:1の水溶性多
糖類ポリマーを含有する組成物であって、前記Ｄ−グル
コース成分がβ−〔1,4〕配置で結合され、そして前記
Ｄ−マンノース成分が一般的に１つ置きにグルコース成
分にα−〔1,3〕配置で結合されていることを特徴とす
る組成物。 - 【請求項２】前記多糖類ポリマーのマンノース成分が６
−０位置でアセチル化されている特許請求の範囲第１項
記載の組成物。 - 【請求項３】前記多糖類ポリマーのマンノース成分が６
−０位置でアセチル化されていない特許請求の範囲第１
項記載の組成物。 - 【請求項４】前記多糖類ポリマーが約0.001重量％より
も多い量で水溶液中に存在する特許請求の範囲第１項記
載の組成物。 - 【請求項５】前記多糖類ポリマーが約１重量％よりも多
い量で水溶液中に存在する特許請求の範囲第１項記載の
組成物。 - 【請求項６】グルコウロン酸成分を本質的に含まない、
Ｄ−グルコース:D−マンノースの比が約2:1であり、前
記Ｄ−グルコース成分がβ−〔1,4〕配置で結合され、
そして前記Ｄ−マンノース成分が一般的に１つ置きにグ
ルコース成分にα−〔1,3〕配置で結合されている水溶
性多糖類ポリマーの製造方法であって、 グルコウロン酸を多糖類ポリマー中に導入することがで
きないキサントモナス（Xanthomonas）属の微生物を適
切な増殖培地に接種し、そして該接種された増殖培地を
適切な温度及び溶解酸素レベルで、インキュベートし
て、Ｄ−グルコース:D−マンノースの比が約2:1である
多糖類ポリマーを生成することを含んで成る方法。 - 【請求項７】前記多糖類ポリマーを、沈殿又は限外濾過
によって増殖培地から回収する特許請求の範囲第６項記
載の方法。 - 【請求項８】前記微生物がキサントモナス カンペスト
リス（Xanthomonas campestris）種からである特許請求
の範囲第６項記載の方法。 - 【請求項９】前記微生物がキサントモナスのグリコシル
トランスフェラーゼIV欠失の突然変異体である特許請求
の範囲第６項記載の方法。 - 【請求項１０】前記微生物がキサントモナスのUDP−グ
ルコウロン酸欠失の突然変異体である特許請求の範囲第
６項記載の方法。 - 【請求項１１】キサントモナス カンペストリスのトラ
ンスフェラーゼIV突然変異体をNRRL B-1459 S4-Ｌとし
てATCCに寄託し、そしてATCC番号53195を得る特許請求
の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１２】キサントモナス カンペストリスのUDP
−グルコウロン酸突然変異体をNRRL B-1459 S4-Ｌとし
てATCCに寄託し、そしてATCC番号53196を得る特許請求
の範囲第10項記載の方法。 - 【請求項１３】グルコウロン酸成分を本質的に含まな
い、Ｄ−グルコース:D−マンノースの比が約2:1であ
り、前記Ｄ−グルコース成分がβ−〔1,4〕配置で結合
され、そして前記Ｄ−マンノース成分が一般的に１つ置
きにグルコース成分にα−〔1,3〕配置で結合されてい
る水溶性多糖類ポリマーを、所望の濃度で水性培地中に
溶解することを含んで成る水性培地の粘度を増すための
方法。 - 【請求項１４】オイル産生地下形成体からオイルの回収
のための方法であって、グルコウロン酸成分を本質的に
含まない、Ｄ−グルコース:D−マンノースの比が約2:1
であり、前記Ｄ−グルコース成分がβ−〔1,4〕配置で
結合され、そして前記Ｄ−マンノース成分が一般的に１
つ置きにグルコース成分にα−〔1,3〕配置で結合され
ている多糖類ポリマーを含む溶液を穴に注入し、多孔質
岩石から閉じ込められたオイルを置換し、そしてその置
換されたオイルを集めることを含んで成る方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/762,878 US4713449A (en) | 1985-08-06 | 1985-08-06 | Polysaccharide polymer made by xanthomonas |
| US762878 | 1985-08-06 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7341723A Division JP2746560B2 (ja) | 1985-08-06 | 1995-12-27 | 微生物学的に純粋な培養物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6284102A JPS6284102A (ja) | 1987-04-17 |
| JP2520881B2 true JP2520881B2 (ja) | 1996-07-31 |
Family
ID=25066264
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61178978A Expired - Lifetime JP2520881B2 (ja) | 1985-08-06 | 1986-07-31 | キサントモナスによつて製造される多糖類ポリマ− |
| JP7341723A Expired - Lifetime JP2746560B2 (ja) | 1985-08-06 | 1995-12-27 | 微生物学的に純粋な培養物 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7341723A Expired - Lifetime JP2746560B2 (ja) | 1985-08-06 | 1995-12-27 | 微生物学的に純粋な培養物 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4713449A (ja) |
| EP (1) | EP0211288B1 (ja) |
| JP (2) | JP2520881B2 (ja) |
| AT (1) | ATE81672T1 (ja) |
| CA (1) | CA1247033A (ja) |
| DE (1) | DE3686986T2 (ja) |
| DK (1) | DK174575B1 (ja) |
| FI (1) | FI92719C (ja) |
| NO (1) | NO170858C (ja) |
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| US5102561A (en) * | 1985-08-06 | 1992-04-07 | Getty Scientific Development Company | Processes of thickening and of oil recovery using polysaccharide polymer made by xanthomonas |
| US5514791A (en) | 1986-03-26 | 1996-05-07 | Getty Scientific Development Company | Genetic control of acetylation and pyruvylation of xanthan based polysaccharide polymers |
| US4868293A (en) * | 1985-08-06 | 1989-09-19 | Getty Scientific Development Company | Polysaccharide polymer made by xanthomonas |
| DE3752096T2 (de) * | 1986-03-24 | 1997-11-13 | Getty Scient Dev Co | Familie von auf Xanthan basierenden Polysaccharidpolymeren, welche Nichtacetylierten und/oder Nichtpyruvylierten Gum beeinhalten |
| ATE118548T1 (de) * | 1986-03-24 | 1995-03-15 | Getty Scient Dev Co | Herstellungsverfahren von zuckernukleotiden mittels rekombinantverfahrens. |
| US5559015A (en) * | 1986-03-26 | 1996-09-24 | Getty Scientific Development Company | Recombinant-DNA mediated production of xanthan gum |
| US5091376A (en) * | 1986-07-28 | 1992-02-25 | Massachusetts Institute Of Technology | Non-capsule exopolysaccharide from Zoogloea ramigera |
| US4948733A (en) * | 1986-07-28 | 1990-08-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Zoogloea transformation using exopoly saccharide non-capsule producing strains |
| US5194386A (en) * | 1987-04-14 | 1993-03-16 | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | Xanthomonas campestris strain expressing xanthan gum |
| US5518907A (en) * | 1989-06-07 | 1996-05-21 | Center For Innovative Technology | Cloning and expression in Escherichia coli of the Alcaligenes eutrophus H16 poly-beta-hydroxybutyrate biosynthetic pathway |
| US5334520A (en) * | 1990-05-25 | 1994-08-02 | Center For Innovative Technology | Production of poly-beta-hydroxybutyrate in transformed escherichia coli |
| US5015577A (en) * | 1989-08-29 | 1991-05-14 | Board Of Regents, The University Of Texas System | DNA encoding hyaluronate synthase |
| IT1245385B (it) * | 1991-03-28 | 1994-09-20 | Eniricerche Spa | Procedimento migliorato per la preparazione di polipeptidi maturi |
| SG48883A1 (en) * | 1991-05-07 | 1998-05-18 | Texaco Development Corp | Genetic control of acetylation and pyruvylation of xanthan based polysaccharide polymers |
| US5224544A (en) * | 1992-02-26 | 1993-07-06 | Bj Services Company | Enzyme complex used for breaking crosslinked cellulose based blocking gels at low to moderate temperatures |
| US5247995A (en) * | 1992-02-26 | 1993-09-28 | Bj Services Company | Method of dissolving organic filter cake obtained from polysaccharide based fluids used in production operations and completions of oil and gas wells |
| GB9301894D0 (en) * | 1993-01-30 | 1993-03-17 | Cerestar Holding Bv | Fermentation feedstock |
| US5591699A (en) * | 1993-02-24 | 1997-01-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Particle transport fluids thickened with acetylate free xanthan heteropolysaccharide biopolymer plus guar gum |
| ES2160792T3 (es) * | 1995-04-20 | 2001-11-16 | Clariant Finance Bvi Ltd | Suspensiones liquidas estables de colorantes al azufre y metodo para analizar las mismas. |
| US5881813A (en) * | 1996-11-06 | 1999-03-16 | Bj Services Company | Method for improved stimulation treatment |
| US6110875A (en) * | 1997-03-07 | 2000-08-29 | Bj Services Company | Methods and materials for degrading xanthan |
| US6138760A (en) * | 1998-12-07 | 2000-10-31 | Bj Services Company | Pre-treatment methods for polymer-containing fluids |
| US6818594B1 (en) | 1999-11-12 | 2004-11-16 | M-I L.L.C. | Method for the triggered release of polymer-degrading agents for oil field use |
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