JP2501801B2

JP2501801B2 - γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼ定量用試薬

Info

Publication number: JP2501801B2
Application number: JP61239648A
Authority: JP
Inventors: 秋男本山; 仁司近藤; 登業白石; 和彦永田; 耕右冨田
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1986-10-07
Filing date: 1986-10-07
Publication date: 1996-05-29
Anticipated expiration: 2011-05-29
Also published as: EP0266905A1; JPS6394998A; US5126245A; EP0266905B1; DE3778297D1

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は，生体液中のγ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼ活性の定量用試薬に関するものである。

（従来の技術） γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下γ−GTP
と略記する。）は，生体内の各組織に広く分布し，γ−
グルタミルペプチドの代謝に関与する酵素である。臨床
検査の領域において，γ−GTP活性は肝硬変，アルコー
ル性肝炎，肝癌，閉塞性黄疸などの肝疾患の診断及び病
態把握の手段として日常的に広く測定されている重要な
項目の１つである。

γ−GTP活性の定量用試薬としては，合成基質である
γ−グルタミルアミドをγ−グルタミル供与体として用
い，γ−GTPの作用によって遊離するアミン類を定量す
る試薬が一般に用いられている。代表的なものとして
は，γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを基質とする
試薬，γ−グルタミル−α−ナフチルアミドを基質とす
る試薬が知られている。前者の基質の場合，γ−GTPの
作用によって遊離するｐ−ニトロアニリンを直接比色定
量する試薬，このｐ−ニトロアニリンをｐ−ジメチルア
ミノシンナムアルデヒドなどのアルデヒド系化合物によ
って赤色系色素に導いて比色する試薬が用いられてい
る。また，γ−グルタミル−α−ナフチルアミドを基質
とする試薬では，γ−GTPの作用によって遊離するナフ
チルアミンをジアゾニウム塩として比色定量する試薬，
又は３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンと
酸化縮合させて赤紫色色素に導いて比色定量する試薬が
採用されている。

一方，共役酵素を用いてγ−GTP活性を定量する試薬
も提案されている。その１つは，基質としてγ−グルタ
ミル−置換メチルアミド化合物を用い，γ−GTPの作用
によって生成する置換メチルアミン化合物にアミンオキ
シダーゼを作用させ，酵素反応の進行に伴う溶存酸素の
消費量あるいは過酸化水素又はアンモニアの生成量を常
法に従って定量するというものである（特開昭58−9698
号公報参照）。また，特開昭60−34200号公報には，基
質として天然基質に近いγ−グルタミル−Ｌ−グルタミ
ン酸を用い，γ−GTPの作用によって遊離するＬ−グル
タミン酸にＬ−グルタミン酸オキシダーゼを作用させ，
反応に伴う溶存酸素の消費量あるいは過酸化水素，アン
モニア又はα−ケトグルタル酸の生成量を常法に従って
定量する試薬が提案されている。

（発明が解決しようとする問題点）しかしながら，前記の合成基質を用いるγ−GTP定量
用試薬は，γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドなどの
溶解性が，これら化合物の安定なpH域及びγ−GTP反応
の至適pH付近で極めて悪く，充分量の基質を使用し難い
こと，これら合成基質が不安定なこと，ビリルビンや溶
血（ヘモグロビン）などの影響を受け易い波長域に吸収
変化があるため，正確な定量が困難であることなどの欠
点を有している。さらに，γ−グルタミル−α−ナフチ
ルアミドを基質とする定量用試薬は，上記問題点の他
に，操作が煩雑であるなどの欠点も有している。

これらの欠点を克服するため種々の改善策（例えば，
界面活性剤の使用，置換基質の使用，シクロデキストリ
ンの添加など）が提案されているが，未だ日常検査法に
広く適用するに充分なほどには解決されていない。

一方，アミンオキシダーゼやＬ−グルタミン酸オキシ
ダーゼを用いる酵素的定量用試薬は，これら酵素の比較
的低い基質異性及び測定波長域の吸光度が，血中や尿中
に予め共存するビリルビンやヘモグロビンなどにより強
く影響を受けるなど，臨床検査の現場で日常的に使用す
るには信頼性に欠けるという欠点を有している。

また，これら従来技術では，いずれも活性既知の標準
物質を用いなければならないという，操作上の煩雑さも
有している。

それゆえに，γ−GTPの本来の基質に類似したペプチ
ド化合物を基質として用い，操作が簡便で，かつ連続的
反応経過から直接γ−GTP活性を求めることのできるγ
−GTP定量用試薬の開発が強く望まれている。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは，このような要求を満足するγ−GTP定
量用試薬を提供することを目的として種々検討した結
果，γ−グルタミルジペプチドを基質として用い，共役
酵素としてアミノ酸脱水素酵素を用いた定量用試薬が，
上記の目的を達成し，操作が簡便で，かつ日常検査に使
用するのに充分な精度を有する定量用試薬であることを
見い出し，本発明を完成するに到った。

すなわち，本発明は，（ａ）脂肪族Ｌ−アミノ酸，芳
香族Ｌ−アミノ酸及び水酸基を有するＬ−アミノ酸より
なる群から選択されるアミノ酸を一成分とするγ−グル
タミルジペプチド，（ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド（リン酸），及び（ｃ）γ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼの作用により前記γ−グルタミルジペ
プチドから遊離されるアミノ酸に特異的なアミノ酸脱水
素酵素とからなることを特徴とするγ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼ定量用試薬を要旨とするものである。

本発明のγ−GTP定量用試薬は，アミノ酸脱水素酵
素，γ−グルタミルジペプチド，受容体，ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔以下NAD(P)⁺と
略記する。〕を主成分とし，その他に通常，促進剤，賦
活剤などの添加剤なるものも含ませることもできる。添
加剤としては，例えば，塩化ナトリウム，塩化カリウム
などの塩類やトリトンＸ−100などの界面活性剤など
を，また，防腐剤としては，例えば，アジ化ナトリウム
などの公知のものを支障なく使用することができる。

本発明に用いられるアミノ酸脱水素酵素としては，γ
−GTPの作用により遊離されるアミノ酸に特異的なアミ
ノ酸脱水素酵素であればいかなるものでもよい。このよ
うな酵素の例としては，ロイシン脱水素酵素，アラニン
脱水素酵素，フェニルアラニン脱水素酵素，グリシン脱
水素酵素，バリン脱水素酵素，セリン脱水素酵素があげ
られ，中でも，前２者が好ましい。例えば，γ−GTPの
作用により遊離されるアミノ酸がロイシンであればロイ
シン脱水素酵素を用いればよく，遊離されるアミノ酸が
アラニンであればアラニン脱水素酵素を用いればよい。
また，γ−GTPに特異的に作用する基質として，例え
ば，γ−グルタミルジペプチドであるγ−グルタミル−
Ｌ−−ロイシン，γ−グルタミル−Ｌ−アラニン，γ−
グルタミル−Ｌ−フエニルアラニン，γ−グルタミル−
グリシン，γ−グルタミル−Ｌ−バリン，γ−グルタミ
ル−Ｌ−セリンなどを用いることができる。さらに，受
容体としては，種々のアミノ酸やジペプチドなどを用い
ることが出来るが，中でも，グリシルグリシンやルリシ
ルアラニンを使用するのが，好ましい。

本発明に用いられるロイシン脱水素酵素としては，そ
の給源が特に限定されるものではなく，バチルス・スフ
エリカス(Bacillus sphaericus)などの微生物由来のも
のなど，種々の起源のものを使用することができる。中
でも，安定性，保存性に富む好熱性細菌，例えば，バチ
ルス・ステアロサーモフイルス（Bacillus stearotherm
ophilus）やクロストリジウム・サーモアセテイカム（C
lostridium thermoaceticum）由来のロイシン脱水素酵
素が望ましい。

また，アラニン脱水素酵素も，その給源が特に限定さ
れるものではなく，バチルス・ズブチリス（Bacillus s
ubtilis），バチルス・スフエリカス（Bacillus sphaer
icus）などの微生物由来のものなど，種々の起源のもの
を使用することができる。中でも，安定性，保存性に富
む好熱性細菌，例えば，バチルス・ステアロサーモフイ
ルス（Bacillus stearothermophilus）由来のアラニン
脱水素酵素が望ましい。

さらに，グルタミン酸脱水素酵素も，その給源が特に
限定されるものではなく，プロテウス・インコンスタン
ス（Proteus inconstans）などの細菌，カビ，酵母など
の微生物，あるいは植物など，種々の起源のものを使用
することができる。

本発明の試薬の各成分の濃度としては，γ−グルタミ
ルジペプチドを３〜300mM（例えば，γ−グルタミル−
Ｌ−ロイシンの場合,3〜150mM,γ−グルタミル−Ｌ−ア
ラニンの場合,10〜300mM,γ−グルタミル−Ｌ−グルタ
ミン酸の場合,3〜300mM），受容体を３〜500mM,NAD(P)⁺
を0.1〜20mM,塩類を５〜500mM,界面活性剤を0.01〜２
％，アジ化ナトリウムを0.5〜50mM,アミノ酸脱水素酵素
を0.1〜100ユニツト/mlとなるように使用すればよく，
γ−グルタミルジペプチドを7.5〜250mM（例えば，γ−
グルタミル−Ｌ−ロイシンの場合,7.5〜100mM,γ−グル
タミル−Ｌ−アラニンの場合,15〜250mM,γ−グルタミ
ル−Ｌ−グルタミン酸の場合,7.5〜250mM），受容体を
５〜350mM,NAD(P)⁺を0.2〜15mM,塩類を10〜350mM,界面
活性剤を0.02〜1.5％，アジ化ナトリウムを1.0〜30mM,
アミノ酸脱水素酵素を0.2〜50ユニツト/mlとなるように
使用することが好ましい。

本発明の試薬の測定原理を次に示す。

このように，γ−GTP活性はNAD（Ｐ）Ｈの340nmにお
ける吸光度増加を測定することにより求めることができ
る。

さらに，（２）式で生成するNAD（Ｐ）Ｈを，ジアホ
ラーゼ，フエナジンメトサルフエイト，あるいは１−メ
トキシフエナンジンメトサルフエイトの中から選ばれる
１種を介して，ジホルマザンに導く方法を採用すること
もできる。

本発明の試薬を用いて血清や尿などの生体液中のγ−
GTP活性を測定するときの反応温度としては，通常の酵
素反応の20〜45℃を使用すればよい。

（実施例）次に，本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１ γ−グルタミル−Ｌ−ロイシン（バツケム社より購
入）20mM,グリシルグリシン75mM（pH8.5）,NAD（ベーリ
ンガー・マンハイム山之内株式会社より購入）6mM,ロイ
シン脱水素酵素〔バチルス属（Bacillus sp.）由来，東
洋紡績株式会社より購入〕５ユニツト/mlとからなるγ
−GTP定量用試薬を調製した。

次に，上記で調製した試薬3.0mlを光路長1cmのセルに
入れ，コントロール血清0.05mlを添加し，セル室を37℃
の恒温に保った分光光度計にて340nmの吸光度変化によ
り試料中のγ−GTP活性を求めた。

なお，試料として，種々のγ−GTP活性を有するコン
トロール血清を用いた。

その結果を第１図に示す。

第１図は，本発明の試薬の定量性を示すもので，縦軸
には１分間当りの340nmにおける吸光度変化量を，横軸
には血清サンプルの希釈率を示しており，良好な直線性
を有する試薬であることがわかった。

実施例２実施例１と同様のγ−GTP定量用試薬を調製した。

次に，試料として40ユニツト/l及び100ユニツト/lの
γ−GTP活性を含んだコントロール血清を用い，上記の
試薬で各々50回γ−GTP活性を測定した。

その結果，測定平均値は39.7ユニツト/lと101.1ユニ
ツト/lであり，標準偏差は各々1.0ユニツト/lと1.3ユニ
ツト/lであることがわかった。

このことから，測定の正確性を示すC.V.値〔（標準偏
差÷測定平均値）×100（％）〕は，各々2.52％と1.29
％であり，本発明の試薬が実用に供するのに充分な正確
性を有していることがわかった。

実施例３実施例１と同様のγ−GTP定量用試薬を調製した。

次に，試料として，ビリルビン（デード社製，国際試
薬株式会社より購入）０〜20mg/dl,ヘモグロビン（ヘモ
グロビンコントロール，ヘモコンN,日本商事株式会社よ
り購入）０〜500mg/dlを含む40ユニツト/lのγ−GTP活
性の血清を調製した。

この試料を用い，上記の試薬でγ−GTP活性を測定し
た。

その結果，ビリルビン20mg/dl,ヘモグロビン500mg/dl
までγ−GTP活性測定値に影響を与えないことがわか
り，合成基質を用いた試薬や従来の酵素法による試薬で
認められた両物質による正の誤差が認められず，本発明
の試薬の有用性が確認された。

実施例４グリシルグリシンの代わりにグルシルアラニン（pH8.
5,100mM）を用いた以外は，実施例１と同様にしてγ−G
TP定量用試薬を調製し，実施例１と同様にしてγ−GTP
活性を求めた。

その結果を第２図に示す。

第２図は，第１図と同様に本発明の試薬の定量性を示
すもので，実用に供するのに充分な測定範囲を有する試
薬であることがわかった。

実施例５ γ−グルタミル−Ｌ−アラニン（バツケム社より購
入）50mM,グリシルグリシン100mM（pH8.5）,NAD5mM,ア
ラニン脱水素酵素〔バチルス・ズブチルス（Bacillus s
ubtilis）由来，シグマ社より購入〕６ユニツト/mlから
なるγ−GTP定量用試薬を調製した。

次に，実施例１と同様にしてγ−GTP活性を求めた。

その結果を第３図に示す。

第３図は，第１図と同様に本発明の試薬の定量性を示
すもので，実用に供するのに充分な測定範囲の性能をも
つ試薬であることがわかった。

（発明の効果）本発明の試薬は，アミノ酸脱水素酵素とγ−GTPに特
異的に作用する基質を用いた，従来にない新規な定量用
試薬であって，従来の合成基質を用いた試薬における基
質に関する問題点を克服し，また，従来の試薬で認めら
れたビリルビンやヘモグロビンなどの血中共存物質の影
響も受けず，さらに，煩雑な操作を必要とせず，操作性
がよいものとなった。その上，本発明の試薬は，日常検
査に供しえる再現性も有している。

このように，本発明の試薬は，臨床検査分野への寄与
に多大なものがある。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は，本発明の試薬の定量性を示すもので
あり，縦軸には１分間当りの340nmにおける吸光度変化
量を，横軸には血清サンプルの希釈率を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者冨田耕右宇治市宇治小桜23番地ユニチカ株式会社中央研究所内審査官伊藤明 (56)参考文献特開昭56−35050（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−34200（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）脂肪族Ｌ−アミノ酸，芳香族Ｌ−ア
ミノ酸及び水酸基を有するＬ−アミノ酸よりなる群から
選択されるアミノ酸を一成分とするγ−グルタミルジペ
プチド，（ｂ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（リン酸），及び（ｃ）γ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼの作用により前記γ−グルタミルジペプチドから
遊離されるアミノ酸に特異的なアミノ酸脱水素酵素とか
らなることを特徴とするγ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼ定量用試薬。