JP2570651B2 - Ｍｅｔ−インスリン様成長因子Ｉの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インスリン様成長
因子Ｉ誘導体の製造に関し、さらに詳しくは、インスリ
ン様成長因子ＩのＮ末端にメチオニンがついたメチオニ
ルインスリン様成長因子(以下、Ｍet−ＩＧＦ−Ｉとい
う)のＤＮＡ組換え法による製造方法に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決すべき課題】インスリン様
成長因子(以下ＩＧＦという)は、血中に存在するインス
リン類似のペプチドの内、酸−エタノール画分から同定
された物質であり、インスリン様成長因子(以下、ＩＧ
Ｆ−Ｉという)とインスリン様成長因子ＩＩ(以下、ＩＧ
Ｆ−ＩＩという)が含まれる。これらは種々の細胞の増
殖促進作用を有しており、その産生および分泌は成長ホ
ルモンに依存している。これらのＩＧＦはいずれも成長
ホルモンの骨成長促進作用を仲介する物質であるソマト
メジン群に含まれているが、特に、ＩＧＦ−Ｉは成長ホ
ルモン依存性が高く、ソマトメジンＣと同一の物質であ
り、成長ホルモンの作用の発現に深く関与していること
がわかっている。従って、ＩＧＦ−Ｉを大量生産し、治
療や研究に供することは、極めて有意義といえる。しか
しながら、これまでＩＧＦ−Ｉの調製は、血清から単離
する方法によっていたため、収率が低く、需要に充分応
えることができなかった。しかも、この方法は、極めて
非能率的である上、得られる物質中に様々な不純物が含
まれている恐れがあった。しかるに、近年、遺伝子操作
技術の発展に伴って、様々な生理活性物質を大量に生合
成することが可能となり、ＩＧＦ−Ｉに関しても、その
様な試みがなされている。しかしながら、ＩＧＦ−Ｉの
ごとく、比較的低分子量(約７０００〜７５００)のペプ
チドをＤＮＡ組換え法で合成する場合、直接発現法によ
ると、生成物が細胞内のタンパク分解酵素(プロテアー
ゼ)により分解されてしまうので、収率が著しく低下す
るという問題点がある。そこで、適当な他のペプチドと
の融合物として発現させる工夫がなされている。融合ペ
プチドとして発現された生成物は、インビトロでの切断
により、ＩＧＦ−Ｉを与える。

【０００３】上記の方法を利用したＩＧＦの製造例が特
開昭５９−２０５９９７号等に見られる。ここでは、複
製系、プロモーター、リーダー配列およびプロセッシン
グシグナルを含む構造遺伝子、並びに転写終結配列を含
むＤＮＡ構成物で酵母を形質転換し、得られた形質転換
体を適当な条件下で培養することにより、プレ−ＩＧＦ
を発現させていた。次いで、発現されたプレ−ＩＧＦは
プロセッシングされ、成熟ＩＧＦが培地中に分泌される
ことになる。

【０００４】本出願人も大腸菌内でＩＧＦ−Ｉを保護ペ
プチドとの融合物として発現させ得る発現ベクターを組
立て、該ベクターを用いてＩＧＦ−Ｉを大腸菌内で生産
させることに成功した(特開昭６１−１３９６号)。即
ち、上記のベクターで大腸菌を形質転換し、得られた形
質転換体を適当な条件下で培養することにより、ＩＧＦ
−Ｉを含む融合ペプチドを生産させ、該融合ペプチドを
臭化シアンやコラゲナーゼを用いた脱離反応に付し、Ｉ
ＧＦ−Ｉを分離した。しかしながら、ＩＧＦ−Ｉを含む
融合ペプチドとしてＩＧＦ−Ｉを発現させる方法は、融
合物からのＩＧＦ−Ｉの分離工程等を要し、工程が複雑
である。従って、目的物質ＩＧＦ−Ｉを効率良く発現さ
せ、しかも容易に回収することのできる発現系を得るこ
とが望まれている。

【０００５】本発明者らは、ＩＧＦ−Ｉを、簡単に、し
かも高収率で製造する方法を確立することを目的として
研究を重ねた結果、ポリシストロン性の発現系によっ
て、ＩＧＦ−Ｉとある種の“他のペプチド"とを同時に
発現させると、この“他のペプチド"の存在により、Ｉ
ＧＦ−Ｉがプロテアーゼによる分解から保護され得ると
いうことを発見し、本発明を完成するに至った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、大腸菌
を、 (a) プロモーター遺伝子: (b) Ｍet−ＩＧＦ−Ｉのプロテアーゼによる分解を阻
止しうる分子量約５００〜５０,０００の他のペプチド
をコードする遺伝子を含む第１シストロン:および (c) Ｍet−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含む第２シストロン をこの順に含み、各シストロンの上流にＳＤ配列をそれ
ぞれ有するポリシストロン性発現ベクターであって、大
腸菌内でＩＧＦ−Ｉを生産するための発現ベクターで形
質転換し、得られた形質転換体を遺伝子の発現に適した
条件下で培養した後、細胞を溶解し、得られたリゼイト
から、Ｍet−ＩＧＦ−Ｉを分離することからなるＭet−
ＩＧＦ−Ｉの製造方法を提供するものである。

【０００７】本発明の方法に用いる本発明のベクター
は、ＩＧＦ−Ｉ、および該ＩＧＦ−Ｉのプロテアーゼに
よる分解を阻止し得る“他のペプチド"とをコードして
おり、大腸菌内で機能的かつ複製可能なポリシストロン
性発現ベクターである。また本発明方法に用いる宿主細
胞は、この発現ベクターによって形質転換された宿主細
胞である。

【０００８】ポリシストロン性の発現系を用いた発現ベ
クターの例は、ショーナー(Ｂ．Ｅ．Ｓchoner)により開
示されている[プロシーディングス・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミィ・オブ・サイエンセズ(Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad．Ｓci．)ＵＳＡ８１、５４０３〜５４０７(１
９８４)]。この報告では、第１シストロンにアミノ酸数
２０〜２５程度の適当なペプチドの暗号配列であってm
ＲＮＡの転写時のステム・アンド・ループ構造の形成を
阻止し得る暗号配列を含有させることにより、mＲＮＡ
をリボソームと結合し易くし、第２シストロンにコード
されているウシ成長ホルモン(bＧＨ)の発現を促進する
様に構成させた発現ベクターが示されている。

【０００９】これに対し、本発明の発現ベクターは、第
１シストロンにコードされている“他のペプチド"によ
って第２シストロンにコードされているＩＧＦ−Ｉを酵
素分解から保護する様に設計されたものである。ＩＧＦ
−Ｉは、アミノ酸７０個からなる分子量約７５００の、
タンパク分解酵素に不安定な塩基性ペプチドである。本
発明者らは、この様な酵素に不安定なＩＧＦ−Ｉを、
“他のペプチド"と共にポリシストロン系ベクターを用
いて発現させることにより、ＩＧＦ−Ｉを分解から保護
し得ることを見い出し、本発明を完成するに至った。

【００１０】この様な“他のペプチド"としては、分子
量約５００〜５０,０００、好ましくは３０００〜１５,
０００の酸性ペプチドが挙げられる。ここでいう酸性ペ
プチドとはpＩ(等電点)が４.０〜７.０、好ましくは５.
０〜６.０のペプチドである。“他のペプチド"の例とし
ては、例えば、ペプチドＣd(以下、Ｃdという、後述の
Ｆra−Ｂ−７、図２２及び図２３参照)、ペプチドＬＨ
(以下、ＬＨという、Ｆra−Ｂ−４、図１５〜１９参
照)、Ｃd−ＬＨ融合ペプチド(以下、Ｃd−ＬＨという、
Ｆra−Ｂ−８参照)(以下、必要に応じて同様の略号を用
いる)等を挙げることができる。これらの内、等電点を
考慮すると、発現効率の高いペプチドであると思われる
Ｃd−ＬＨが最も好ましい。

【００１１】本発明方法に用いる発現ベクターの具体例
であるプラスミドpＣＥ−ＳＭtrp(図２の（１)）および
プラスミドpＣＥ−ＳＭ３t(図２の（２）)は、いずれ
も、第１シストロンにＣd−ＬＨ遺伝子(本明細書中、Ｃ
d−ＬＨをコードする遺伝子をＣd−ＬＨ遺伝子といい、
以下、同様にこの表現法を用いる)を、第２シストロン
にＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有しており、適当な宿主に導入
されて転写されることにより、２シストロン性mＲＮＡ
を生成する。このmＲＮＡが翻訳されると、それぞれの
ペプチドが同時に発現されることになる。

【００１２】さらに詳しくは、本発明の発現ベクターの
シストロン部分は、以下の模式図で示される。

【化１】

【００１３】本明細書中、プロモーター遺伝子とは転写
活性化配列から始まり、下流の翻訳開始信号に至る配列
(翻訳開始信号はプロモーター遺伝子には含まれない)を
含む遺伝子単位を指す。また本明細書中、シストロンと
は翻訳開始信号(ＡＴＧ)、何らかのペプチドをコードす
る遺伝子および翻訳停止信号(本明細書中に記載の式あ
るいは添付の図面では翻訳停止信号を“終止"と表示す
る)をこの順番で含む遺伝子の機能単位を指す。またそ
れぞれのシストロン中のペプチドをコードする遺伝子が
翻訳されるためには、それぞれのシストロンの上流にシ
ャインダルガノ配列(以下、ＳＤ配列という)が存在する
ことが必須である。

【００１４】本発明ベクターにおいては第１シストロン
の上流であって、かつプロモーター遺伝子の下流に、ま
た第２シストロンの上流であって、かつ第１シストロン
の下流にＳＤ配列が存在する。第１シストロンの下流の
ＳＤ配列は“他のペプチド"をコードする遺伝子の一部
でもある。

【００１５】第１シストロンの翻訳停止信号は第２シス
トロンの翻訳開始信号の下流に隣接して存在していても
よく、その場合には、第１シストロンの翻訳停止信号は
第２シストロンのペプチドをコードする遺伝子の一部で
もある。２個のシストロン間のヌクレオチド配列は、さ
らに詳しくは、式:

【化２】

【００１６】(式中、Ａはデオキシアデニル酸、Ｇはデ
オキシグアニル酸、Ｃはデオキシシチジル酸、Ｔはデオ
キシチミジル酸を表す)で示される。上記の、または以
後のアミノ酸の略語による表示は、周知の表示方法に従
う。上記の式において、第２シストロンのＩＧＦ−Ｉの
第１番目のアミノ酸であるグリシンをコードするヌクレ
オチド配列(具体的にはＧＧＴ等)の上流にあるメチオニ
ンをコードするヌクレオチド配列ＡＴＧは、同時に第２
シストロンの翻訳開始信号でもある。本明細書中では、
このヌクレオチド配列と第１シストロンの翻訳停止信号
(具体的にはＴＡＡ等)とが一体となって形成されるヌク
レオチド配列を、便宜上、“シストロン連結配列"と呼
称する。

【００１７】“シストロン連結配列"は上記式ではその
具体例としてＴＡＡＴＧで示されているが、この具体例
のように、翻訳停止信号(ＴＡＡ)と翻訳開始信号(ＡＴ
Ｇ)が重複したヌクレオチド配列の外、隣接したヌクレ
オチド配列、１〜２個の両者が塩基対を介して接してい
るヌクレオチド配列も含まれる。重複したヌクレオチド
配列としては、上述のＴＡＡＴＧの外、ＴＧＡＴＧや、
翻訳停止信号と翻訳開始信号の位置が逆転したＡＴＧＡ
等が挙げられる。隣接したヌクレオチド配列としてはＴ
ＡＧＡＴＧ、ＴＡＡＡＴＧ、ＴＧＡＡＴＧ等が挙げられ
る。

【００１８】“シストロン連結配列"はその上流の第１
シストロンの“他のペプチド"をコードする遺伝子の一
部でもあるＳＤ配列と一体となって、第１シストロンと
第２シストロン間のヌクレオチド配列を形成する。この
場合、ＳＤ配列と“シストロン連結配列"の距離は５〜
１５塩基対、好ましくは６〜８の塩基対である。ＳＤ配
列と“シストロン連結配列"を含むヌクレオチド配列を
含む好ましいリンカーＤＮＡ断片としては例えば、後述
のＦra−Ａ−３等が挙げられる。このＳＤ配列と“シス
トロン連結配列"を含むリンカーＤＮＡ断片をＩＧＦ−
Ｉ遺伝子の５'末端に結合させることにより、２シスト
ロン性発現ベクターを得るためのＤＮＡ断片(後述のＦr
a−Ａ−７等)を構築した。次いで、例えば、本出願人の
出願(特願昭６１−１４１９００号)に係るα−hＡＮＰ
発現ベクターpＣＬaＨtrpＳd(Ｃd−ＬＨとα−hＡＮＰ
との融合ペプチドをコードしている発現ベクター)にお
いて、α−hＡＮＰ遺伝子(ＨindＩＩＩ−ＢamＨＩ部位)
を該ＤＮＡ断片で置き換えることにより、本発明の所望
の２シストロン性発現ベクターを得ることができる。

【００１９】従って、本発明の発現ベクターで宿主細胞
を形質転換し、得られた形質転換体を適当な条件下で培
養すると、２種のポリペプチド、即ち“他のペプチド"
例えばＣd−ＬＨと、ＩＧＦ−Ｉとが同時に、独立して
発現される。但し、ＩＧＦ−Ｉの場合、翻訳開始信号で
あるＡＴＧがそのコードするメチオニンとして発現され
たまま残るので、得られるペプチドはＩＧＦ−Ｉの５'
末端にメチオニンのついたＭet−ＩＧＦ−Ｉである。こ
のとき、単独の直接発現においては、細胞内プロテアー
ゼで分解され易いＩＧＦ−Ｉが“他のペプチド"例えば
Ｃd−ＬＨの存在により、安定に細胞内に保持されるこ
とが示された。この“他のペプチド"によるＩＧＦ−Ｉ
の安定化は、塩基性のＩＧＦ−Ｉと酸性のペプチド、例
えばＣd−ＬＨとの会合によってプロテアーゼの分解作
用が阻止されることによると思われる。次いで本発明の
２シストロン性発現ベクターで形質転換された形質転換
体を溶解し、リゼイト中に存在する会合した２種のペプ
チドを、例えば、酸に対する溶解性(ＩＧＦ−Ｉは可溶
性であり、Ｃd−ＬＨは不溶性である)に基づいて分離す
ることができる。

【００２０】ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を宿主微生物、特に大腸
菌内で効率良く発現させるために最も一般的に用いられ
ているプラスミドは、大腸菌由来のプラスミドpＢＲ３
２２である。本発明においてもこのプラスミドを出発プ
ラスミドとして用いるが、その他のプラスミドであって
も、大腸菌内で複製保持される限り、使用し得る。その
ようなプラスミドには、例えば、pＵＣ９、pＡＴ１５３
等が含まれる。また、バクテリオファージも使用し得
る。

【００２１】本発明の発現ベクターに用いるプロモータ
ー遺伝子は、通常用いられる種々のプロモーター系から
適宜選択されるものであってよいが、本明細書において
は、大腸菌のトリプトファンプロモーターのヌクレオチ
ド配列に基づいて、本発明者らが新たに合成した合成tr
pプロモーター遺伝子を用いて示した。

【００２２】また本発明ベクターに用いる転写終結配列
としては発現ベクターの組み立てに用いるプラスミドも
しくはファージ由来の転写終結配列をそのまま用いても
よいが、第２シストロンの下流に、合成ターミネーター
遺伝子、例えば合成fdファージターミネーター遺伝子等
を挿入することによって転写終結配列としてもよい。

【００２３】本明細書において具体的に示した合成trp
プロモーター遺伝子は、３種あり、それぞれ、転写活性
化配列は同一であるが３'末端の構造が異なっている。
それらは、合成trpプロモーターＩ遺伝子、合成trpプロ
モーターＩＩ遺伝子および合成trpプロモーターＩＩＩ
遺伝子である。これらを総称して、また例えば合成プロ
モーターＩ遺伝子と合成プロモーターＩＩＩ遺伝子を同
時に用いる場合等も含めて合成trpプロモーター遺伝子
という。また“合成"の語は適宜省略する場合もある。

【００２４】本発明の発現ベクターの組立て方法を以下
に具体的に示す。まず出発プラスミドpＢＲ３２２[テト
ラサイクリン耐性付与遺伝子(以下^RＴｅｔという)およ
びアンピシリン耐性付与遺伝子(以下^RＡｍｐという)を
含む]をＥcoＲＩおよびＢamＨＩ消化に付し、得られた
大きいＤＮＡ断片と、trpプロモーターＩＩ遺伝子(Ｆra
−Ｉ、１６３bp)とをライゲートさせることにより、^RＴ
ｅｔを欠失したプラスミドpＴrpＥＢ７を得る。次い
で、このpＴrpＥＢ７をＥcoＲＩ−ＢamＨＩ消化に付
し、trpプロモーターＩＩ遺伝子内のＥcoＲＩ部位から
下流を欠失させ、(かくして得られるプロモーターＩＩ
遺伝子から、ＥcoＲＩ部位から下流を欠失させた断片を
プロモーターＩ遺伝子という)これに、pＢＲ３２２をＥ
coＲＩ−ＢamＨＩで消化して得られる小さいＤＮＡ断片
を挿入すると、trpプロモーターＩ遺伝子を含有し、^RＴ
ｅｔおよび^RＡｍｐを有するプラスミドpＢＲ３２２trp
が得られる。このpＢＲ３２２trpをＥcoＲＩ−ＣlaＩ消
化に付し、大きいＤＮＡ断片とtrpプロモーターＩＩＩ
遺伝子(Ｆra−Ｂ−３)とをライゲートさせると、trpプ
ロモーターＩ遺伝子およびtrpプロモーターＩＩＩ遺伝
子をこの順番で含むプラスミドp３２２dtrpＳが得られ
る。trpプロモーターＩＩおよびＩＩＩ遺伝子(Ｆra−Ｂ
−１およびＦra−Ｂ−３)のヌクレオチド配列並びに制
限部位、およびプラスミドpＢＲ３２２をＥcoＲＩ−Ｂa
mＨＩ消化に付して得られる小さいＤＮＡ断片の制限部
位を以下に示す。

【００２５】

【化３】

【化４】

【００２６】

【化５】

【００２７】trpプロモーターＩおよびＩＩＩ遺伝子を
含有するプラスミドpＢＲ３２２dtrpＳの組立て模式図
を図４に、そして中間体プラスミドpＴrpＥＢ７の組立
て模式図を図３に示す。

【００２８】次いで、ＣdとＬＨ−ＲＨ(ペプチドＬＨと
後述のペプチドＲＨが結合したペプチド)との融合ペプ
チドをコードしているプラスミドpＣdγを、以下の如く
にして組立てる。出発プラスミドpＢＲ３２２をＥcoＲ
ＩおよびＢamＨＩ消化に付し、大きいＤＮＡ断片を回収
してＬＨ遺伝子(Ｆra−Ｂ−４)とライゲートさせる。得
られたプラスミドpＬＨ１０７をＨindＩＩＩおよびＢam
ＨＩ消化に付すことによりＦra−Ｂ−４のＨindＩＩＩ
部位から下流を除去し、ＲＨ遺伝子(Ｆra−Ｂ−５)を挿
入してＬＨ−ＲＨ遺伝子を含むプラスミドpγＦ−３を
得る。次いで、このpγＦ−３をＥcoＲＩおよびＢamＨ
Ｉで消化してＬＨ−ＲＨ遺伝子(Ｆra−Ｂ−６)を得る。

【００２９】次に、このＦra−Ｂ−６を、pＴrpＥＢ７
のＥcoＲＩおよびＢamＨＩ消化により得た、trpプロモ
ーターＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片とライゲートさせ、tr
pプロモーターＩ遺伝子の下流にＬＨ−ＲＨ遺伝子を含
有するプラスミドpγtrpを得る。このプラスミドpγtrp
をＨpaＩおよびＥcoＲＩで消化して大きいＤＮＡ断片を
回収し、これをtrpプロモーターＩＩＩ遺伝子の一部
と、Ｃd遺伝子とを含むＤＮＡ断片(Ｆra−Ｂ−７)とラ
イゲートさせ、trpプロモーターＩ、trpプロモーターＩ
ＩＩ、Ｃd遺伝子およびＬＨ−ＲＨ遺伝子をこの順番で
含有するプラスミドpＣdγを得る。Ｆra−Ｂ−４、Ｆra
−Ｂ−５、Ｆra−Ｂ−６およびＦra−Ｂ−７のアミノ酸
配列およびヌクレオチド配列、並びに制限部位を以下に
示す。また、プラスミドpＣdγの組立て模式図を図５及
び図６に示す。

【００３０】

【化６】

【化７】

【００３１】

【化８】

【化９】

【００３２】

【化１０】

【化１１】

【化１２】

【００３３】

【化１３】

【００３４】Ｃd−ＬＨとペプチドα−hＡＮＰ(ヒト−
心房性ナトリウム排泄増加ポリペプチドの一部)との融
合タンパク質の遺伝子を含有するプラスミドpＣＬaＨtr
pＳｄを以下の如くにして組立てた。まず、プラスミド
ｐＣdγのＣlaＩ−ＢamＨＩＤＮＡ断片であるＦra−Ｂ
−８を、プラスミドp３２２dtrpＳのＣlaＩ−ＢamＨＩ
部位に挿入し、ＣdγとＬＨ−ＲＨとの発現ベクターpＣ
dγtrpＳdを得る。

【００３５】次いで、pＣdγtrpＳdをＨindＩＩＩおよ
びＢamＨＩで消化して得られた大きいＤＮＡ断片と、リ
ンカーＤＮＡ断片を伴ったα−hＡＮＰ遺伝子(Ｆra−Ｂ
−９)とをライゲートさせ、Ｃd−ＬＨ−α−hＡＮＰ(Ｃ
d,ＬＨ,α−hＡＮＰがこの順番で並んだ融合ペプチド)
の発現ベクター、pＣＬaＨtrpＳdを得る。ＤＮＡ断片Ｆ
ra−Ｂ−８およびＦra−Ｂ−９を以下に示す。プラスミ
ドpＣdγtrpＳdおよびpＣＬaＨtrpＳdの組立て模式図を
図７に示す。

【００３６】

【化１４】

【化１５】

【化１６】

【化１７】

【００３７】

【化１８】

【００３８】次に、前記の２シストロン性発現ベクター
を得るためのＤＮＡ断片、Ｆra−Ａ−７を調製し、ＩＧ
Ｆ−Ｉ発現ベクターpＬＨＳdＭmtrpを組立てる。まず、
プラスミドpＴrpＥＢ７をＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消
化し、大きいＤＮＡ断片とＬＨ遺伝子を含むＦra−Ｂ−
４とをライゲートさせてtrpプロモーターＩ遺伝子とＬ
Ｈ遺伝子とを含むプラスミドpＬＨtrpを得る。

【００３９】次に、ベクターの組立てに用いるためのＩ
ＧＦ−Ｉ遺伝子を以下の如くにして調製した。まずプラ
スミドpＢＲ３２２をＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化
し、大きい方のＤＮＡ断片にＩＧＦ−Ｉ遺伝子(Ｆra−
Ｂ−１０)をライゲートさせてプラスミドpＳdＭ１を得
る。このpＳdＭ１をＢamＨＩおよびＥcoＲＩで消化して
ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得、これにオリゴ
ヌクレオチドm₁およびm₂をライゲートし、Ｆra−Ｂ−１
１を得る。このＦra−Ｂ−１１を、前記のプラスミドp
ＬＨtrpのＨindＩＩＩおよびＢamＨＩ消化により得た大
きいＤＮＡ断片とライゲートさせ、プラスミドpＬＨＳd
Ｍmtrpを得る。Ｆra−Ｂ−１０およびＦra−Ｂ−１１の
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列、並びに制限部位を以
下に示す。また、プラスミドpＬＨＳdＭmtrpの組立て模
式図を図８および図９に示す。

【００４０】

【化１９】

【化２０】

【００４１】

【化２１】

【化２２】

【００４２】次に、pＬＨＳdＭmtrpをＨindＩＩＩおよ
びＢamＨＩで消化し、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子とリンカーＤＮ
Ａ断片を含むＦra−Ａ−４(Ｆra−Ｂ−１１と同様)を
得、これをＡvaＩＩ消化に付してＩＧＦ−Ｉをコードし
ているＦra−Ａ−５を得る。このＦra−Ａ−５は、その
３'末端に翻訳停止信号を含有している。他方、ＤＮＡ
断片Ｆra−Ａ−１をＣlaＩで消化してＦra−Ａ−２を
得、このＦra−Ａ−２にオリゴヌクレオチドＣＴ５およ
びＣＴ６をライゲートすることにより、ＳＤと、３'末
端に翻訳停止信号を含有するＤＮＡ断片、Ｆra−Ａ−３
を得る。このＦra−Ａ−３と前記Ｆra−Ａ−５とをＡva
ＩＩ部位でライゲートさせ、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有す
ると共に、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の上流にＳＤと“シストロ
ン連結配列"を有するＦra−Ａ−６を得る。このＦra−
Ａ−６をＨindＩＩＩ消化に付し、２シストロン性発現
ベクターを得るためのＤＮＡ断片、Ｆra−Ａ−７を得
る。Ｆra−Ａ−１、Ｆra−Ａ−２、Ｆra−Ａ−３、Ｆra
−Ａ−５、Ｆra−Ａ−６およびＦra−Ａ−７のヌクレオ
チド配列およびアミノ酸配列、並びに制限部位を以下に
示す。Ｆra−Ａ−７の組立て模式図を図１０に示す。

【００４３】

【化２３】

【００４４】

【化２４】

【００４５】

【化２５】

【００４６】

【化２６】

【化２７】

【００４７】

【化２８】

【化２９】

【００４８】

【化３０】

【化３１】

【００４９】次にα−hＡＮＰ発現ベクター、pＣＬaＨt
rpＳdをＨindＩＩＩおよびＢamＨＩ消化に付し、得られ
た大きいＤＮＡ断片と前記Ｆra−Ａ−７とをライゲート
させることにより、α−hＡＮＰ遺伝子と置換し、本発
明の目的プラスミドであるpＣＥ−ＳＭtrpを得る。プラ
スミドpＣＥ−ＳＭtrpの組立て模式図を図１１に示す。
もう一つのＩＧＦ−Ｉ発現ベクター、プラスミドpＣＥ
−ＳＭ３tは、前記のプラスミドpＣＥ−ＳＭtrpから以
下の如くにして組立てられる。まず、プラスミドpＢＲ
３２２のＥcoＲＩ−ＣlaＩ部位にtrpプロモーターＩＩ
Ｉ遺伝子(Ｆra−Ｂ−３)を挿入し、^RＡｍｐおよび^RＴｅ
ｔを有するプラスミドpＢＲ３２２trpＳsを得る。次い
で、pＢＲ３２２trpＳsのＣlaＩおよびＢamＨＩ消化に
より生じた大きいＤＮＡ断片と前記のα−hＡＮＰ発現
ベクターpＣＬaＨtrpＳdのＣlaＩ−ＢamＨＩ断片(Ｆra
−Ｃ−２、Ｃd−ＬＨとα−hＡＮＰとをコードしてい
る)とをライゲートさせることにより、trpプロモーター
ＩＩＩ遺伝子のコントロール下にこれらのペプチドをコ
ードしている発現ベクター、pＣＬaＨtrp−２を得る。
Ｆra−Ｃ−２のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、
並びに制限部位を以下に示す。プラスミドpＣＬaＨtrp
−２を組立て模式図を図１２に示す。

【００５０】

【化３２】

【化３３】

【化３４】

【００５１】他方、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の３'末端に合成f
dファージターミネーター遺伝子を導入するために、プ
ラスミドpＢＲ３２２をＢamＨＩおよびＳalＩで消化し
て得た大きいＤＮＡ断片と、合成fdファージターミネー
ター遺伝子(Ｆra−Ｃ−１)とをライゲートさせ、プラス
ミドpter２１を得る。次に、前記プラスミドpＣＬaＨtr
p−２をＢamＨＩおよびＰstＩ消化に付して得られた大
きいＤＮＡ断片と、プラスミドpter２１のＰstＩおよび
ＢamＨＩ消化による合成fdターミネーター遺伝子含有Ｄ
ＮＡ断片とをライゲートさせ、所望のプラスミドpＣＬa
Ｈtrp３tを得る。Ｆra−Ｃ−１のアミノ酸およびヌクレ
オチド配列、並びに制限部位を以下に示す。プラスミド
pＣＬaＨtrp３tの組立て模式図を図１３に示す。

【００５２】

【化３５】

【００５３】さらに、このプラスミドpＣＬaＨtrp３tを
ＢamＨＩおよびＨindＩＩＩで消化し、得られた大きい
ＤＮＡ断片に、前記の２シストロン性発現ベクターを得
るためのＤＮＡ断片Ｆra−Ａ−７をライゲートすること
により、trpプロモーターＩＩＩのコントロール下でＣd
−ＬＨおよびＩＧＦ−Ｉをコードすると共に、fdファー
ジターミネーター遺伝子を含有している、所望のプラス
ミドpＣＥ−ＳＭ３tを得る。プラスミドpＣＥ−ＳＭ３t
の組立て模式図を図１４に示す。本発明のベクターの組
立てに用いた各ＤＮＡ断片は、後述する如く、対応する
各種オリゴヌクレオチドブロックのアニール化、並びに
ライゲーションにより合成した。また、これらの各オリ
ゴヌクレオチドは、イトウ(Ｈ．Ｉto)、イケ(Ｙ．Ｉk
e)、イクタ(Ｓ．Ｉkuta)およびイタクラ(Ｋ．Ｉtakura)
の方法に従って合成した[ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ(Ｎucleic Ａcids Ｒesearch,１０,１,７５５
(１９８２)]。本発明のＩＧＦ−１発現ベクターは、大
腸菌宿主の形質転換に用いられるが、好ましい株は、
Ｅ．coli(Ｅsherichia coli、エシエリヒア・コリ)Ｋ
株、Ｅ．coli Ｂ株である。特に、Ｅ．coli ＭＭ２９
４が好ましい。

【００５４】発現ベクターの導入は、クシャナー(Ｋush
ner)法等の常法に従って行うことができる。この様にし
て得られた形質転換体を好適な条件下で培養するとＣd
−ＬＨとＭet−ＩＧＦ−Ｉとが独立に発現され、このと
き、Ｃd−ＬＨによってＭet−ＩＧＦ−Ｉは、細胞内に
安定的に保持されることになる。好適な培養方法は良く
知られており、通常、同化可能な炭素源および窒素源を
含有する栄養培地中で好気性条件下に(たとえば振とう
培養、深部培養など)培養することからなる。栄養培地
中の好ましい炭素源は、グルコース、フルクトース、ス
クロース、グリセリン、でん粉などの炭水化物であり、
包含されうる他の炭素源は、キシロース、ガラクトー
ス、マルトース、デキストリン、ラクトースなどであ
る。好ましい窒素源は、酵母エキス、ペプトン、グルテ
ン粉、綿実粉、大豆粉、コーンスチーブリカー、乾燥酵
母、小麦の麦芽など、ならびに、硝酸アンモニウム、硫
酸アンモニウム、燐酸アンモニウム、尿素、アミノ酸な
どの無機および有機の窒素化合物である。

【００５５】炭素源および窒素源は、これらを組合わせ
て用いるのが有利であるが、微量の成長因子およびかな
りの量の無機栄養源を含有する相対的に低純度の材料も
使用に適しているので、必ずしも純粋な形で使用されな
くともよい。所望により、炭酸カルシウム、燐酸ナトリ
ウムまたはカリウム、塩化ナトリウムまたはカリウム、
マグネシウム塩類、銅塩類などの無機塩類を培地に添加
してもよい。培養混合物の撹拌および通気は種々の方法
で達成できる。撹拌は、プロペラまたは類似の機械的撹
拌装置により、醗酵槽の回転または振とうにより、種々
のポンプ装置により、または無菌の空気を培地に通すこ
とにより、もたらされる。通気は、醗酵混合物に無菌空
気を通過させることにより達成される。醗酵は、通常約
２０℃〜４２℃間の温度で、好ましくは３５〜３８℃の
間の温度で、数時間ないし５０時間にわたって行う。こ
うして産生されたＩＧＦ−Ｉは、Ｃd−ＬＨと一緒に安
定に宿主細胞内に保持されている。ＩＧＦ−Ｉは、他の
既知の生理学的活性物質の回収に一般的に用いられる慣
用の手段に準じて培養培地から回収できる。一般的に
は、産生されたタンパク質は宿主生物の細胞中に見出さ
れる。従って、培養液を濾過または遠心分離して得られ
る細胞から、減圧下の濃縮、超音波処理などの細胞破
砕、ＨＰＬＣ、凍結乾燥、pＨ調節、樹脂(たとえばアニ
オンまたはカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂)を
用いての処理、慣用の吸着剤(たとえば活性炭、珪酸、
シリカゲル、セルロース、アルミナ)での処理、ゲル濾
過、晶出などの常法によって分離することができる。但
し、本発明においては、リゼイトを１Ｎ酢酸に対して透
析し、酢酸に可溶のＩＧＦ−Ｉと不溶のＣd−ＬＨとを
分離した後、精製工程に付す。

【００５６】本発明の方法によれば、血清からの単離に
よる従来の方法よりも高収率でＭet−ＩＧＦ−Ｉを大量
生産することができるばかりか、不純物の含有率を低下
させることができる。従って、本発明方法によって得ら
れたＭet−ＩＧＦ−Ｉは、種々の研究分野は勿論、骨細
胞の増殖および成長異常に係る種々の疾患、その他骨粗
鬆症、糖尿病、創傷、潰瘍等の治療に有用である。例え
ば、本発明のＭet−ＩＧＦ−Ｉを製薬業界周知の方法で
適当な剤形に製剤化し、経口または非経口的に用いるこ
とができる。

【００５７】

【実施例】以下、実施例および製造例を挙げ、本発明を
さらに詳しく説明する。なお、以下の記載に用いた略語
は次の意味を有する。 ＤＴＴ: ジチオスレイトール ＰＡＧＥ: ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＥtＯＨ: エチルアルコール ＡcＯＨ: 酢酸

【００５８】製造例１ ＬＨ−ＲＨ遺伝子の調製 Ａ．ＬＨ遺伝子(Ｆra−Ｂ−４)の調製 Ａ．１ 化学合成オリゴヌクレオチドのライゲーション 各オリゴヌクレオチド(Ａ２−Ｌ２)(０．４nＭ)を、５
０mＭＴris−ＨＣl(pＨ７．６)、２０mＭＤＴＴ、５０
μg／ml牛血清アルブミン(以下、ＢＳＡという)、１mＭ
スペルミジン、１０mＭ ＭｇＣｌ₂および２mＭ ＡＴＰ
を含有する溶液４０μl中でＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ２．５単位を用いて３７℃で３時間りん酸化した。
反応終了後、１００℃で５分間インキュベートして反応
混合物中の酵素を不活化した。りん酸化されたオリゴヌ
クレオチドと２種のオリゴヌクレオチド(Ａ１およびＬ
３)のライゲーションは図１９に示すようにして行い、
まず６断片を得、最終的にはクローニング用のＬＨ遺伝
子(２３６bp)を得た。ライゲーションはＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ(５単位)を用い、５０mＭ ＡＴＰ(１μl)含有溶液
中に１６℃で５時間行った。各段階におけるオリゴヌク
レオチドのライゲーション生成物は、Ｔris−ＥＤＴＡ
緩衝液中２−１６％グラジェントＰＡＧＥで溶出した
後、臭化エチジウム染色により同定した。

【００５９】Ａ．２ ＬＨ遺伝子のクローニング プラスミドpＢＲ３２２をＢamＨＩおよびＥcoＲＩで消
化した。６５℃で５分間加熱して反応を終了させ、０．
５％アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し
た。大きなＤＮＡ断片を回収し、ＬＨ遺伝子とＴ４ＤＮ
Ａリガーゼとの存在下において１２℃で１８時間ライゲ
ートさせ、２３６bpのＬＨ遺伝子を含むプラスミドpＬ
Ｈ１０７を得た。ライゲーション混合物を用いてクッシ
ョナー(Ｋushner)法[マニアティス(Ｔ．Ｍaniatis)ら、
モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)
p．２５２(１９８２)コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリィ参照]により、Ｅ．coli ＨＢ１０１を
形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体をテトラサイ
クリン(２５μg／ml)含有プレート上で選択した。アン
ピシリンに耐性でテトラサイクリンに感受性を示すクロ
ーンから分離したプラスミドを、ＥcoＲＩおよびＢamＨ
Ｉで消化し、適当なサイズマーカーと比較すると予期し
た２３６bpのＬＨ遺伝子断片が生じていた。Ｅ．coli
ＨＢ１０１形質転換体から得たプラスミド(pＬＨ１０
７)は、制限酵素分析により、ＬＨ遺伝子(２３６bp)を
有することが特徴づけられた。

【００６０】Ｂ．１ ＲＨ遺伝子（Ｆra−Ｂ−５）の調
製 各オリゴヌクレオチド(Ｄ３〜Ｊ５)(０．４mＭ)をＡ．
１．に記載のようにりん酸化した。りん酸化されたオリ
ゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドＪ６のライゲーシ
ョンを図１９に示すようにして行い、まず断片７プロッ
クを得、最終的にＲＨ遺伝子(２７０bp)を得た。ＲＨ遺
伝子をＰＡＧＥにより精製し、ＬＨ−ＲＨ遺伝子のクロ
ーニングに使用した。

【００６１】Ｆra−Ｂ−４およびＦra−Ｂ−５の合成に
用いたオリゴヌクレオチドおよび組立て模式図を図１５
〜１９に示す。 Ｂ．２ ＬＨ−ＲＨ遺伝子のクローニング Ａ．２で得たプラスミド(pＬＨ１０７)をＨindＩＩＩお
よびＢamＨＩで消化した。大きい方のＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動により回収し、続いてＢ．１に記載
のＲＨ遺伝子(２７０bp)と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在
下にライゲートさせた。このライゲーション混合物を用
いＥ．coliＨＢ１０１を形質転換した。この形質転換体
から得たプラスミドpγＦ−３をＥcoＲＩ−ＢamＨＩ消
化に付し、ＬＨ−ＲＨ遺伝子(４５０bp)(Ｆra−Ｂ−６)
を得た。

【００６２】製造例２ trpプロモーターＩＩ遺伝子の
構築およびクローニング 製造例１と同様にしてtrpプロモーターＩＩ遺伝子(Ｆra
−Ｂ−１)を構築した。trpプロモーターＩＩ(Ｆra−Ｂ
−１)をpＢＲ３２２のＥcoＲＩ−ＢamＨＩ断片とライゲ
ートし、続いてライゲーション生成物でＥ．coliＨＢ１
０１を形質転換した。^RＡｍｐおよび^SＴｅｔの形質転換
体から得たプラスミドをＨpaＩで消化してバンド(４.１
Ｋbp)を確認し、続いてＢamＨＩで消化し、ＰＡＧＥで
９０bpのバンドを確認した。さらに、ＥcoＲＩ−ＢamＨ
Ｉ消化で得た５６bpの断片をＰＡＧＥでサイズマーカー
と比較することにより確認した。このプラスミドをpＴr
pＥＢ７と命名し、発現ベクターの構築に使用した(図
３)。Ｆra−Ｂ−１の合成に用いたオリゴヌクレオチド
およびその組立て模式図を図２０に示す。

【００６３】製造例３ trpプロモーター１およびtrpプ
ロモーターＩＩＩを含有するプラスミドp３２２dtrpＳ
の構築 Ａ．プラスミドpＢＲ３２２trp プラスミドpＢＲ３２２(９μg)をＥcoＲＩおよびＢamＨ
Ｉで消化した。６５℃で５分間加熱して反応を止め、
０.８％アガロースゲル電気泳動によって分離し、３７
５bpの小さいＤＮＡ断片(５００ng)を得た。一方、製造
例２で調製したプラスミドpＴrpＥＢ７(１０μg)をＥco
ＲＩおよびＢamＨＩ消化に付し、次いで、ゲル電気泳動
にかけて大きいＤＮＡ断片(４０９４bp、５μg)を得
た。このpＴrpＥＢ７のＥcoＲＩ−ＢamＨＩ断片(４０９
４bp、２００μg)をpＢＲ３２２のＥcoＲＩ−ＢamＨＩ
断片(Ｆra−Ｂ−２、３７５bp、１００ng)と、Ｔ４リガ
ーゼ(宝酒造、３６０unit)を含有するライゲーション緩
衝液(５０mＭ Ｔris−ＨＣl、pＨ７.６、１０mＭ ＭgＣ
l₂、２０mＭ ＤＴＴ、１mＭ ＡＴＰ、１mＭスペルミジ
ンおよび５０μg／ml ＢＳＡ)(２０μl)中、１５℃で
一夜ライゲーションを行った。ライゲーション混合物で
Ｅ．coli ＨＢ１０１を形質転換し、テトラサイクリン
含有(２５μg／ml)プレート上でテトラサイクリン耐性
形質転換体を得た。形質転換体から単離した生成プラス
ミドpＢＲ３２２trpを、ＥcoＲＩおよびＢamＨＩ消化
(３７５bp、４０９４bp)、並びにＨpaＩ消化(４４６９b
p)に付し、７.５％ＰＡＧＥ並びに０.８％アガロースゲ
ル電気泳動により、trpプロモーターＩ遺伝子の存在を
確認した。

【００６４】Ｂ．trpプロモーターＩＩＩ遺伝子(Ｆra−
Ｂ−３)の構築 図２１に示した、ブロックＩ',ＩＩ'およびＩＩＩ'の各
オリゴヌクレオチド(Ｂ−Ｍ')(各０.２nモル)をライゲ
ーション緩衝液(７０μl)中、Ｔ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ(ＢＲＬ、２.５単位)により、３７℃において１
時間、りん酸化した。各ブロックの反応混合物にＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ(３００単位)と２０mＭ ＡＴＰ(２μl)と
を加え、得られた混合物を１５℃で３０分間インキュベ
ートした。６５℃で１０分間加熱して反応を止めた。こ
れらのブロック(Ｉ'、ＩＩ'、およびＩＩＩ')の反応混
合物を一緒にし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(３６０単位)と２
０mＭ ＡＴＰ(２μl)との存在下、非りん酸化オリゴヌ
クレオチド(ＡおよびＮ')と混合した。１５℃で１時間
インキュベーションした後、最終ライゲーション混合物
を、２〜１６％グラディエントＰＡＧＥにかけて精製
し、trpプロモーターＩＩＩ遺伝子(１０５bp)(Ｆra−Ｂ
−３)を得た。Ｆra−Ｂ−３の合成に用いたオリゴヌク
レオチド、並びに組立て模式図を図２１に示す。

【００６５】Ｃ．プラスミドp３２２dtrpＳの組立て プラスミドpＢＲ３２２trpをＥcoＲＩおよびＣlaＩ消化
に付し、次いで、アガロースゲル電気泳動にかけ、大き
いＤＮＡ断片(４４４６bp)を得た。この断片と、上記Ｂ
で得たtrpプロモーターＩＩＩ遺伝子(１０５bp)とを、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、ライゲートさせた。この
ライゲーション混合物でＥ．coli ＨＢ１０１を形質転
換し、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の形質
転換体を得た。この形質転換体から分離したプラスミド
p３２２dtrpＳを、ＣlaＩ−ＢamＨＩ(３５２bp)、Ｈpa
Ｉ(１０７bp)およびＡatＩＩ−ＣlaＩ(２８７bp)による
制限エンドヌクレアーゼ分析に基づいて確認した。p３
２２dtrpＳの組立て模式図を図４に示す。

【００６６】製造例４ ＬＨ−ＲＨ遺伝子とＣd遺伝子
の発現ベクターpＣdγの構築 Ａ．ＬＨ−ＲＨ発現ベクター(pγtrp)の構築 製造例２で調製したtrpプロモーターＩＩベクター(pＴr
pＥＢ７)をＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化し、アガロー
スゲル電気泳動により大きなＤＮＡ断片(４.１kbp)を得
た。このＤＮＡ断片を、ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ消化により
プラスミドpγＦ−３から調製したＬＨ−ＲＨ遺伝子と
ライゲートした。このライゲーション混合物を用いＥ．
coli ＨＢ１０１を形質転換して、アンピシリン耐性で
テトラサイクリン感受性の形質転換体を得た。この形質
転換体から得たプラスミドpγtrpをＥcoＲＩおよびＢam
ＨＩで消化し、７.５％ＰＡＧＥでＬＨ−ＲＨ遺伝子(Ｆ
ra−Ｂ−６、４５０bp)を確認した。

【００６７】Ｂ．プラスミドpＣdγの構築 Ｂ．１ trpプロモーターＩＩＩ遺伝子の一部とＣd遺伝
子とを含むＤＮＡ断片(Ｆra−Ｂ−７)の調製 ブロックＩ"、ＩＩ"およびＩＩＩ"の各オリゴヌクレオ
チド(Ｎp１−Ｃd８)(各０.２nモル)をライゲーション緩
衝液(６０μl)中、Ｔ４ヌクレオチドキナーゼ(２.５単
位)により、３７℃で１時間、りん酸化した。各ブロッ
クの反応混合物に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(３６０単位)と
ＡＴＰ(２μl)とを加え、混合物を１５℃で１時間、イ
ンキュベートした。これら各ブロック(Ｉ"、ＩＩ"およ
びＩＩＩ")の反応混合物を一緒にし、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ(３６０単位)と２０mＭ ＡＴＰ(２μl)との存在下、
１５℃で一夜インキュベートした後、８０℃で１０分間
加熱した。この混合物に５００mＭ ＮaＣl(２０μl)と
ＥcoＲＩ(２０単位)とを加えた。３７℃で２時間インキ
ュベートした後、この最終ライゲーション産物を１５％
ＰＡＧＥで精製し、trpプロモーターＩＩＩ遺伝子の一
部とＣd遺伝子を含むＤＮＡ断片(１２４bp)(Ｆra−Ｂ−
７)を得た。Ｆra−Ｂ−７の合成に用いたオリゴヌクレ
オチドおよび組立て模式図を図２２及び図２３に示す。

【００６８】Ｂ．２ プラスミドpＣdγの構築およびク
ローニング Ａ．で調製したプラスミドpγtrp(４５４４bp)をＨpaＩ
およびＥcoＲＩ消化に付し、大きいＤＮＡ断片(４５１
０bp)を得た。このＤＮＡ断片とＢ．１．で調製した合
成trpプロモーターＩＩＩ遺伝子の一部とＣd遺伝子とを
含むＤＮＡ断片(１２４bp)とをＴ４ＤＮＡリガーゼの存
在下でライゲートさせた。このライゲーション混合物を
Ｅ．coli ＨＢ１０１に導入した。^RＡｍｐを示す形質転
換体から得たプラスミドpＣdγを、制限エンドヌクレア
ーゼ分析にかけ、ＣlaＩ−ＢamＨＩ(５４３bp)、ＣlaＩ
−ＨindＩＩＩ(２７３bp)、ＣlaＩ−ＥcoＲＩ(９３bp)
およびＡatＩＩ−ＣlaＩ(１８０bp)の各ＤＮＡ断片によ
り、確認した。プラスミドpＣdγの組立て模式図を図５
及び図６に示す。

【００６９】製造例５ プラスミドpＣdγtrpＳdの構築
およびクローニング 製造例４で調製したプラスミドpＣdγをＣlaＩおよびＢ
amＨＩで消化し、小さい断片(５４２bp、Ｆra−Ｂ−８)
を得た。このＦra−Ｂ−８を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存
在下、製造例３．Ｃで調製したプラスミドp３２２dtrp
ＳのＣlaＩ−ＢamＨＩ断片(４２２３bp)とライゲートさ
せた。このライゲーション混合物をＥ．coli ＨＢ１０
１に導入した。^RＡｍｐを示す形質転換体からプラスミ
ドpＣdγtrpＳdを得、制限エンドヌクレアーゼ分析にか
けて確認した。ＨpaＩ−ＢamＨＩ(１０７、５７５bp)、
ＣlaＩ−ＢamＨＩ(５４３bp)、ＰstＩ−ＥcoＲＩ(１０
５７bp)、ＥcoＲＩ−ＢamＨＩ(４５０bp)、ＨindＩＩＩ
−ＢamＨＩ(２７０bp)およびＣlaＩ−ＨindＩＩＩ(２７
３bp)。プラスミドpＣdγtrpＳdの組立て模式図を図７
に示す。

【００７０】製造例６ α−hＡＮＰ発現ベクターpＣＬ
aＨtrpＳdの構築およびクローニング Ａ．リンカーＤＮＡ断片を伴ったα−hＡＮＰ遺伝子(Ｆ
ra−Ｂ−９)の調製 ブロックＩ'''およびＩＩ'''の各オリゴヌクレオチド
(ＡＨ２−ＡＨ１７)(各０.２nモル)を、ライゲーション
緩衝液(７０μl)中、３７℃において１時間、Ｔ４ヌク
レオチドキナーゼ(２.５単位)により、りん酸化した。
各ブロックの反応混合物にＴ４ＤＮＡリガーゼ(３００
単位)と２０mＭ ＡＴＰ(２μl)とを加え、混合物を１５
℃で３０分間インキュベートした。６５℃で１０分間加
熱して反応を止めた。２ブロック(１'''およびＩＩ''')
の反応混合物を一緒にし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(３００
単位)と２０mＭ ＡＴＰ(２μl)との存在下、非りん酸化
オリゴヌクレオチド(ＡＨ１、ＡＨ１８)と混合した。こ
の混合物を１５℃で１時間インキュベートした後、最終
ライゲーション産物を２−１６％グラディエントＰＡＧ
Ｅにかけて精製し、リンカーＤＮＡ断片を伴ったα−h
ＡＮＰ遺伝子(１３４bp、Ｆra−Ｂ−９)を得た。Ｆra−
Ｂ−９の合成に用いたオリゴヌクレオチドおよび組立て
模式図を図２４〜２５に示す。

【００７１】Ｂ．プラスミドpＣＬaＨtrpＳdの構築およ
びクローニング 製造例５で調製したプラスミドpＣdγtrpＳdをＨindＩ
ＩＩおよびＢamＨＩで消化して大きいＤＮＡ断片(４７
４３bp)を得、これと、Ａ．で調製したリンカーＤＮＡ
断片を伴ったαhＡＮＰ遺伝子(１３４bp)とをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼの存在下、ライゲートさせた。このライゲー
ション混合物をＥ．coli ＨＢ１０１に導入し、形質転
換体Ｅ．coli Ｈ１を得た。^RＡｍｐを示す形質転換体
(Ｅ．coli Ｈ１)から、Ｃd−ＬＨ−α−hＡＮＰ遺伝子
(Ｃd−ＬＨとα−hＡＮＰとの融合ペプチドをコードす
る遺伝子)を含むプラスミドpＣＬaＨtrpＳdを得た。こ
のプラスミドを制限エンドヌクレアーゼ分析にかけて確
認した。ＡatＩＩ−ＣlaＩ(２８７bp)、ＣlaＩ−ＢamＨ
Ｉ(４０７bp)、ＣlaＩ−ＥcoＲＩ(９３、１９８bp)、Ｅ
coＲＩ−ＢamＨＩ(１１６、１９８bp)、ＨindＩＩＩ−
ＢamＨＩ(１３４bp)およびＨpaＩ−ＢamＨＩ(１０７、
４３９bp)。プラスミドpＣＬaＨtrpＳdの組立て模式図
を図７に示す。

【００７２】製造例７ ＬＨ発現ベクター(pＬＨtrp)の
構築 製造例２で製造したtrpプロモーターＩＩベクター(pＴr
pＥＢ７)をＥcoＲＩとＢamＨＩで消化し、アガロースゲ
ル電気泳動により大きなＤＮＡ断片(４.１kbp)を得た。
このＤＮＡ断片をＥcoＲＩ−ＢamＨＩ消化によりプラス
ミドpＬＨ１０７から調製したＬＨ遺伝子(Ｆra−Ｂ−
４)とライゲートさせた。ライゲーション混合物を用い
てＥ．coli ＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリンに
耐性でテトラサイクリン感受性を示す形質転換体を得
た。形質転換体から得たプラスミドpＬＨtrpをＥcoＲＩ
とＢamＨＩで消化し、７.５％ＰＡＧＥにＬＨ遺伝子(２
３６bp)を確認した。プラスミドpＬＨtrpの組立て模式
図を図８及び図９に示す。

【００７３】製造例８ ＩＧＦ−Ｉ発現ベクターpＬＨ
ＳdＭmtrpの構築 Ａ．ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の製造 Ａ．１ ＩＧＦ−Ｉ遺伝子(Ｆra−Ｂ−１０)の調製 各オリゴヌクレオチド(Ａ１−０１)(０.４nＭ)を、７４
mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.６),１０mＭ ＤＴＴ,１.６mＭ
メルカプトエタノール,１０mＭ ＭgＣl₂および０.５mＭ
ＡＴＰを含有する溶液１００μl中でＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ(ＢＲＬ製)を用い３７℃で２０分間りん酸
化した。反応終了後、１００℃で５分間インキュベート
して反応混合物中の酵素を不活性化した。りん酸化オリ
ゴヌクレオチドのライゲーションは図２８に示すように
して行い、まず１０ブロックを得、最終的にはクローニ
ング用のＩＧＦ−Ｉ遺伝子を得た。ライゲーションはＴ
４ＤＮＡリガーゼ(７単位)を用い、１００mＭ ＡＴＰ
(０.５μl)含有溶液中にて４℃で２３時間(標準条件)行
った。各段階におけるオリゴヌクレオチドのライゲーシ
ョン生成物を、Ｔris−ＥＤＴＡ緩衝溶液中２−１６％
グラディエントＰＡＧＥで、臭化エチジウム染色により
同定した。

【００７４】Ａ．２ ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のクローニング プラスミドpＢＲ３２２をＢamＨＩおよびＥcoＲＩで消
化した。反応を６５℃で５分間加熱して終了させ、得ら
れたＤＮＡ断片を０.５％アガロースゲル電気泳動によ
り分離した。pＢＲ３２２由来の大きなＤＮＡ断片３９
８５bpを回収し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと１２℃で１８時
間ライゲートし、２２４bpＩＧＦ−Ｉ遺伝子を得た。ラ
イゲーション混合物を用いてクッシュナー法により、
Ｅ．coli ＨＢ１０１を形質転換し、アンピシリン耐性
形質転換体をテトラサイクリン(２５μg／ml)を含有す
るプレート上で選択した。アンピシリンに耐性でテトラ
サイクリンに感受性を示す５クローンの１つから分離し
たプラスミドをＥcoＲＩおよびＢamＨＩで消化し、適当
なサイズマーカーと比較すると予期した２２４bpＩＧＦ
−Ｉ遺伝子が生じていた。ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の完全なヌ
クレオチド配列によって特徴づけられるこのプラスミド
をpＳdＭ１と命名した。

【００７５】ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列およ
びアミノ酸配列並びに制限部位を図１に示す。 Ｂ．ＩＧＦ−Ｉ発現ベクターpＬＨＳdＭmtrpの構築 Ａ．２で調製したプラスミドpＳdＭ１をＥcoＲＩとＢam
ＨＩで消化し、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子(２２４bp)を得た。一
方、オリゴヌクレオチドm２を製造例８、Ａ．１に記載
したようにＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでりん酸化し
た。このりん酸化オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオ
チドm１およびＩＧＦ−Ｉ遺伝子(２２４bp)を混合し、
１００mＭ ＡＴＰを含有する溶液中でＴ４リガーゼを用
い４℃で２０時間処理した。ライゲーション混合物をＢ
amＨＩで消化し、次いでＰＡＧＥで精製し、リンカーＤ
ＮＡ断片を伴ったＩＧＦ−Ｉ遺伝子(２４２bp、Ｆra−
Ｂ−１１)を得た。この遺伝子を、ＨindＩＩＩ−ＢamＨ
Ｉ消化によりpＬＨtrpから得たＤＮＡ断片とライゲート
し、ライゲーション混合物を用いてＥ．coli ＨＢ１０
１を形質転換した。生成プラスミドpＬＨＳdＭmtrpを含
有するＥ．coli ＨＢ１０１をＥ．coli Ｆ−６と命名し
た。形質転換体から得たプラスミドpＬＨＳdＭmtrpをＥ
coＲＩ−ＢamＨＩ(１９８、２２４bp)、ＨindＩＩＩ−
ＢamＨＩ(２４２bp)およびＨpaＩ−ＢamＨＩ(４５６bp)
で消化し、７.５％ＰＡＧＥにてtrpプロモーターＩ遺伝
子、ＬＨおよびＩＧＦ−Ｉ遺伝子を確認した。プラスミ
ドpＬＨＳdＭmtrpの組立て模式図を図８及び図９に示
す。Ｆra−Ｂ−１０およびＦra−Ｂ−１１のためのオリ
ゴヌクレオチド、並びにＦra−Ｂ−１０の組立て模式図
を図２６〜２８に示す。

【００７６】製造例９ trpプロモーターＩＩＩ遺伝子
を有するプラスミドpＢＲ３２２trpＳsの構築およびク
ローニング プラスミドpＢＲ３２２をＥcoＲＩおよびＣlaＩで消化
した。大きいＤＮＡ断片(４３４０bp)を０.８％アガロ
ースゲル電気泳動にかけて精製し、１mＭ ＡＴＰの存在
下、合成trpＩＩＩプロモーター遺伝子(Ｆra−Ｂ−３)
とライゲートした。ライゲーション混合物を用いてＥ．
coli ＨＢ１０１を形質転換した。形質転換体のクロー
ンからプラスミドpＢＲ３２２trpＳsを単離し、制限エ
ンドヌクレアーゼ分析により、確認した。ＨpaＩ(４４
４５bp)、ＣlaＩ−ＰstＩ(８３４bp)。pＢＲ３２２trp
Ｓsの組立て模式図を図１２に示す。

【００７７】製造例１０ プラスミドpＣＬaＨtrp−２
の構築 trpプロモーターＩＩＩ遺伝子のコントロール下に、Ｃd
とＬＨの融合ペプチドをコードする遺伝子、並びにα−
hＡＮＰをコードする遺伝子を含むプラスミドpＣＬaＨt
rp−２を以下の如くにして組立てた。即ち、製造例６．
Ｂで調製したプラスミドpＣＬaＨtrpＳdをＣlaＩおよび
ＢamＨＩで消化し、小さいＤＮＡ断片(406bp、Ｆra−Ｃ
−２)を得た。他方製造例９で調製したプラスミドpＢＲ
３２２trpＳsをＣlaＩおよびＢamＨＩで消化して大きい
ＤＮＡ断片(４０９３bp)を得た。これらの断片をライゲ
ートし、ライゲーション混合物を用いてＥ．coli ＨＢ
１０１を形質転換し、形質転換体クローンから所望のプ
ラスミドpＣＬaＨtrp−２を単離し、制限エンドヌクレ
アーゼにより、特性化を行った。ＣlaＩ−ＰstＩ(８３
４bp)、ＣlaＩ−ＢamＨＩ(４０６bp)。プラスミドpＣＬ
aＨtrp−２の組立て模式図を図１２に示す。

【００７８】製造例１１ fdファージターミネーターを
有するα−hＡＮＰ発現ベクターpＣＬaＨtrp３tの構築 Ａ．fdファージターミネーターの調製およびクローニン
グ fdファージターミネーター(Ｆra−Ｃ−１)を、製造例
３．Ｂ．と同様にして調製した。用いたオリゴヌクレオ
チドを以下に示す。Ｆra−Ｃ−１

【化３６】 (式中、Ａp、Ｇp、ＣpおよびＴpは、それぞれデオキシ
アデニル酸、デオキシグアニル酸、デオキシシチジル酸
およびデオキシチミジル酸を表す。) なお、Ａp、Ｇp、ＣpおよびＴpの意味するところは図１
５〜２９においても同様である。

【００７９】ＤＮＡオリゴマーＴ２、Ｔ３、Ｔ４および
Ｔ５(各０.４nモル)を混合し、１mＭ ＡＴＰの存在下、
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより、りん酸化した。
反応混合物を６５℃で１０分間加熱して酵素を不活化し
た。得られた混合物に、ＤＮＡオリゴマーＴ１およびＴ
６(０.８nモルづつ)、並びにＴ４ＤＮＡリガーゼを加え
た。混合物を１５℃で３０分間インキュベートし、２→
１６％グラディエント・ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけた。所望のＤＮＡ断片(４７bp)を溶出して回収
し、ＢamＨＩおよびＳalＩ消化pＢＲ３２２の大きいＤ
ＮＡ断片(４０８８bp)とライゲートし、プラスミドpter
２１を得た。このプラスミドを制限酵素分析にかけ、Ｂ
amＨＩ−ＳalＩ(４７bp)、ＡvaＩ(８１７bp)を確認し
た。

【００８０】Ｂ．プラスミドpＣＬaＨtrp３tの構築およ
びクローニング 製造例１０で調製したプラスミドpＣＬaＨtrp−２をＰs
tＩおよびＢamＨＩで消化し、小さいＤＮＡ断片(１２４
１bp)を単離し、プラスミドpter２１のＰstＩおよびＢa
mＨＩ消化による制限フラグメント(３００５bp)とライ
ゲートした。

【００８１】ライゲーション混合物をＥ．coli ＨＢ１
０１に導入して形質転換体Ｅ．coliＨ２を得た。^RＡｍ
ｐを示す形質転換体(Ｅ．coli Ｈ２)から得たプラスミ
ドpＣＬaＨtrp３t(Ｃd−ＬＨとα−hＡＮＰの融合ペプ
チドをコードする遺伝子を含有)を、制限エンドヌクレ
アーゼ分析に付し、ＣlaＩ−ＥcoＲＩ(９３９bp、１９
８bp)、ＨindＩＩＩ−ＢamＨＩ(１３４bp)およびＰstＩ
−ＣlaＩ−ＸhaＩ(８３４bp、４１１bp)の各ＤＮＡ断片
を確認した。プラスミドpＣＬaＨtrp３tの組立て模式図
を図１３に示す。

【００８２】実施例１ ＩＧＦ−Ｉ発現ベクター、プラ
スミドpＣＥ−ＳＭtrpの構築 Ａ．２シストロン性発現ベクターを得るためのＤＮＡ断
片(Ｆra−Ａ−７)の調製 Ａ．１ ＳＤ配列を含むＦra−Ａ−２の調製 ＤＮＡオリゴマーＳ、Ｔ、ＣＴ₁、ＣＴ₂、ＣＴ₃、ＣＴ₄
(各０.４nmol)をライゲーション緩衝液[５０mＭ ＴＲＩ
Ｓ−ＨＣl(pＨ７.６),１０mＭ ＭgＣl₂,２０mM ジチオ
スレイトール,１mＭ ＡＴＰ,１mＭ スペルミジン,５０
μg牛血清アルブミン,液量１３０μl]に移し、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ(宝酒造,５unit)を加えて３７℃
で１時間インキュベーションした。反応液に２０mＭ Ａ
ＴＰ(３μl)とＴ４リガーゼ(宝酒造,８７５unit)を加え
１５℃で３０分インキュベーションした。生成した４６
bpＤＮＡ断片(Ｆra−Ａ−１)を含むライゲーション混合
液を６５℃で２０分加熱して酵素を失活させてのち、５
００mＭ ＮaＣl(１４μl)とＣlaＩ(１０unit)を加えて
３７℃で２時間インキュベーションした。反応混合物を
２→１６％グラディエントＰＡＧＥで精製し、３５bpの
ＤＮＡフラグメント(Ｆra−Ａ−２、３００ng)を得た。

【００８３】Ａ．２ Ｆra−Ａ−３(４４bpのＤＡＮ断
片)の調製 Ｆra−Ａ−２(３００ng)、ＣＴ₅、ＣＴ₆(各０.４nmol)
とＴ４リガーゼ(３５０unit)をライゲーション緩衝液
(２０μl)に移し、１５℃で３０分インキュベーション
した。ライゲーション混合物を２.２５％アガロースゲ
ル電気泳動(２.２５％ＡＧＥ)で精製し、４４bpのＤＮ
Ａフラグメント(Ｆra−Ａ−３、１００ng)を得た。

【００８４】Ａ．３ Ｆra−Ａ−５の調製 製造例８．Ｂで調製したpＬＨＳdＭmtrp(ＩＧＦ−Ｉ融
合物発現ベクター４.５kbp、１０μg)をＨindＩＩＩと
ＢamＨＩで処理して２４２bpのＩＧＦ−Ｉ−ＤＮＡ断片
(Ｆra−Ａ−４、３００ng)を得た。このＤＮＡを更にＡ
vaＩＩで切断して２１５bpのＤＮＡ断片(Ｆra−Ａ−
５、１００ng)を得た。

【００８５】Ａ．４ ２シストロン性発現ベクターを得
るためのＤＮＡ断片(Ｆra−Ａ−７)の調製 Ｆra−Ａ−３(１００ng)、Ｆra−Ａ−５(１００ng)及び
Ｔ４リガーゼ(３５０unit)をライゲーション緩衝液(１
２μl)に移し、４℃で一夜インキュベーションした。反
応混合液(Ｆra−Ａ−６を含有)を６５℃で１０分加熱し
た後、ＢamＨＩ(５unit)とＨindＩＩＩ(５unit)で処理
した。反応混合物を２.２５％ＰＡＧＥで精製して２３
８bpのＦra−Ａ−７(３０ng)を得た。

【００８６】Ｂ．pＣＥ−ＳＭtrpの構築 製造例６で調製したα−hＡＮＰ発現ベクター、pＣＬa
ＨtrpＳd(約４.６kbp、１０μg)をＨindＩＩＩとＢamＨ
Ｉで切断した。０.８％ＰＡＧＥで精製し大きい方のＤ
ＮＡ断片(約４.５kb,５μg)を得た。このＤＮＡ断片(２
００ng)とＦra−Ａ−７(３０ng)とをライゲーション緩
衝液(２０μl)に移し、Ｔ４リガーゼ(３５０unit)を加
えて１５℃で３０分インキュベーションした。ライゲー
ション混合物を用いてＥ．coli ＤＨ−１を形質転換し
た。^RＡｍｐを有する形質転換体からプラスミドを抽出
し、制限酵素分析により目的とするプラスミドpＣＥ−
ＳＭtrpであることを確認した。pＣＥ−ＳＭtrpの組立
て模式図を図１１に示す。制限酵素分析:ＣlaＩ−Ｅco
ＲＩ:９３,１９３bp、ＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ:１８０b
p、ＨindＩＩＩ−ＢamＨＩ:２３８bp、ＨpaＩ−ＢamＨ
Ｉ:１０７、５４４bp。プラスミドpＣＥ−ＳＭtrpを
Ｅ．coli ＨＢ１０１に導入し、形質転換体ＨＢ１０１
／pＣＥ−ＳＭtrpを調製した。

【００８７】実施例２ ＩＧＦ−Ｉ発現ベクター、プラ
スミドpＣＥ−ＳＭ３tの構築 trpプロモーターＩＩＩ遺伝子(１０５bp)、融合α−hＡ
ＮＰ遺伝子(４０６bp)、およびfdファージターミネータ
ー(４７bp)を含有するプラスミドpＣＬaＨtrp３t(製造
例１１において調製)をＨindＩＩＩおよびＢamＨＩで消
化し、０.８％アガロースゲル電気泳動にかけて大きい
断片(４１３７bp)を単離した。次いで、実施例１で調製
したプラスミドpＣＥ−ＳＭtrpをＨindＩＩＩとＢamＨ
Ｉで消化し、得られた小さいＤＮＡ断片(２３８bp)(Ｆr
a−Ａ−７)を上記のＤＮＡフラグメント(４１３７bp)に
ライゲートさせた。このライゲーション混合物を用いて
Ｅ．coli ＨＢ１０１を形質転換した。形質転換体クロ
ーンから組換えプラスミドを単離し、制限エンドヌクレ
アーゼ分析によって確認した(ＣlaＩ、２８６bp)。プラ
スミドpＣＥ−ＳＭ３tの組立て模式図を図１４に示す。

【００８８】実施例３ Ｅ．coli ＨＢ１０１／pＣＥ−
ＳＭtrpによるＩＧＦ−Ｉの生産 Ａ．ＩＧＦ−Ｉ遺伝子の発現 Ｅ．coli ＨＢ１０１をプラスミドpＣＥ−ＳＭtrpで形
質転換し、得られた形質転換体Ｅ．coli ＨＢ１０１／p
ＣＥ−ＳＭtrpの単一コロニーを５０μg／mlのアンピシ
リンを含むＬ培地(ＬＡブロス:５ml)に移し３７℃で８
時間培養した。培養液をＬＡブロス(１００ml)に移し３
７℃で終夜培養した。終夜培養液(２０ml)をＭ９ＣＡ培
地[０.５％カザミノ酸、０.２％グルコース、チアミン
ＨＣl(５０μg／ml),アンピシリン(２５μg／ml);４０
０ml]に添加し、３７℃でＡ６００(６００nmにおける吸
光度)が０.５になるまで培養した。培地にＩＡＡ(β−
インドールアクリル酸、２ｍｇ／ml ＥtＯＨ;２ml)を加
え、更に３時間培養した(最終Ａ₆₀₀＝１.４０)。培養液
を４℃、６０００rpmで５分間遠心し、集菌した。

【００８９】Ｂ．発現したタンパク質の単離、精製 湿菌体を１.０mＭ ＰＢＳ−ＥＤＴＡ緩衝液[ＮaＣl(８.
０g),ＫＣl(０.２g),Ｎa₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ(２.９g),
ＫＨ₂ＰＯ₄(０.２g),ＥＤＴＡ(３.７３g)／l(ＮaＯＨで
pＨ８.０に調節);８ml]に懸濁し、０℃で超音波処理し
た。処理液を遠心(４℃,１５０００rpm,２０分)して上
清を除いた。残渣をＧn・ＨＣl緩衝液(６Ｍグアニジン
・ＨＣl,１０mＭ ＰＢＳ−ＥＤＴＡ,２mＭ β−メルカ
プトエタノール;８ml]に懸濁し、再び０℃で超音波処理
した。この懸濁液を遠心(４℃,１５０００rpm,２０min)
して、上清を１Ｍ ＡcＯＨ各１０００mlに対して３回
透析した。透析液を遠心(４℃,１５０００rpm,２０min)
して、上清を７０％ＥtＯＨ(７００ml)に対して透析し
た。透析液にアセトン(３０ml)を加え−７８℃で１０分
静置したのち、遠心(４℃,１５０００rpm,２０min)し
た。沈澱物を減圧乾燥して粗Ｍet−ＩＧＦ−Ｉを得た。

【００９０】粗生成物を１０％β−メルカプトエタノー
ルを含むＧn・ＨＣl緩衝液に溶解し、逆相ＨＬＣ［カラ
ム;ベックマンＲＰＳＣ、流速，１ml／min；溶出，０.
０８％トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)／１０％ＣＨ₃ＣＮ−
（５０分間）→０.０８％ＴＦＡ／６０％ＣＨ₃ＣＮ；検
出波長，２１４nm］で精製した。収量１.６mg。

【００９１】Ｃ．発現タンパク質の同定 精製したタンパク質を、Ｎ末端分析及びキモトリプシン
消化によるペプチドマッピングにかけ、Ｍet−ＩＧＦ−
Ｉであることを確認した。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＩＧＦ−Ｉ遺伝子のヌクレオチド配列およびア
ミノ酸配列の模式図。

【図２】プラスミドpＣＥ−ＳＭtrp、及びプラスミドp
ＣＥ−ＳＭ３tの制限部位および機能地図。

【図３】 プラスミドptrpＥＢ７の組立て模式図。

【図４】 プラスミドp３２２dtrpＳの組立て模式図。

【図５】 プラスミドpＣdγの組立て模式図。

【図６】 プラスミドpＣdγの組立て模式図。

【図７】 プラスミドpＣＬaＨtrpＳdの組立て模式図。

【図８】 プラスミドpＬＨtrpの組立模式図。

【図９】 プラスミドpＬＨＳdＭmtrpの組立模式図。

【図１０】 ２シストロン性発現ベクターを得るための
ＤＮＡ断片(Ｆra−Ａ−７)の組立て模式図。

【図１１】 プラスミドpＣＥ−ＳＭtrpの組立て模式
図。

【図１２】 プラスミドpＣＬaＨtrp２の組立て模式
図。

【図１３】 プラスミドpＣＬaＨtrp３tの組立て模式
図。

【図１４】 プラスミドpＣＥＳＭ３tの組立て模式図。

【図１５】 ＬＨ遺伝子およびＲＨ遺伝子、Ｆra−Ｂ−
４およびＦra−Ｂ−５の構築に用いたオリゴヌクレオチ
ドを示す模式図。

【図１６】 ＬＨ遺伝子およびＲＨ遺伝子、Ｆra−Ｂ−
４およびＦra−Ｂ−５の構築に用いたオリゴヌクレオチ
ドを示す模式図。

【図１７】 ＬＨ遺伝子およびＲＨ遺伝子、Ｆra−Ｂ−
４およびＦra−Ｂ−５の構築に用いたオリゴヌクレオチ
ドを示す模式図。

【図１８】 ＬＨ遺伝子およびＲＨ遺伝子、Ｆra−Ｂ−
４およびＦra−Ｂ−５の構築に用いたオリゴヌクレオチ
ドを示す模式図。

【図１９】 ＬＨ遺伝子およびＲＨ遺伝子、Ｆra−Ｂ−
４およびＦra−Ｂ−５の構築工程の模式図。

【図２０】 Ｆra−Ｂ−１の構築工程および用いたオリ
ゴヌクレオチドを示す模式図。

【図２１】 Ｆra−Ｂ−３の構築工程および用いたオリ
ゴヌクレオチドを示す模式図。

【図２２】 Ｆra−Ｂ−７の構築に用いたオリゴヌクレ
オチドを示す模式図。

【図２３】 Ｆra−Ｂ−７の構築工程を示す模式図。

【図２４】 Ｆra−Ｂ−９の構築に用いたオリゴヌクレ
オチドを示す模式図。

【図２５】 Ｆra−Ｂ−９の構築工程を示す模式図。

【図２６】 Ｆra−Ｂ−１０の構築に用いたオリゴヌク
レオチドを示す模式図。

【図２７】 Ｆra−Ｂ−１０の構築に用いたオリゴヌク
レオチドを示す模式図。

【図２８】 Ｆra−Ｂ−１１の構築に用いたオリゴヌク
レオチドを示す模式図、並びに内部ＳＤ配列を含有する
リンカーＤＮＡを伴ったＩＧＦ−Ｉ遺伝子(Ｆra−Ｂ−
１１)の構築模式図。

【図２９】 Ｆra−Ａ−Ｉ、Ｆra−Ａ−ＩＩおよびＦra
−Ａ−ＩＩＩの構築に用いたオリゴヌクレオチドを示す
模式図。

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 大腸菌を、 (a) プロモーター遺伝子: (b) Ｍet−ＩＧＦ−Ｉのプロテアーゼによる分解を阻
   止しうる分子量約５００〜５０,０００の他のペプチド
   をコードする遺伝子を含む第１シストロン:および (c) Ｍet−ＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含む第２シストロン をこの順に含み、各シストロンの上流にＳＤ配列をそれ
   ぞれ有するポリシストロン性発現ベクターであって、大
   腸菌内でＩＧＦ−Ｉを生産するための発現ベクターで形
   質転換し、得られた形質転換体を遺伝子の発現に適した
   条件下で培養した後、細胞を溶解し、得られたリゼイト
   から、Ｍet−ＩＧＦ−Ｉを分離することからなるＭet−
   ＩＧＦ−Ｉの製造方法。
2. 【請求項２】 発現ベクターにおける他のペプチドが酸
   性ペプチドである請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 発現ベクターにおける他のペプチドがＣ
   ｄ−ＬＨである請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 発現ベクターにおける第１シストロンと
   第２シストロンが、シストロン連結配列によって連結さ
   れており、該シストロン連結配列は、第１シストロンに
   含まれる翻訳停止信号と第２シストロンに含まれる翻訳
   開始信号とが重複しているか、隣接しているか、または
   １または２個のヌクレオチドを介して接しているヌクレ
   オチド配列で示されるものである、請求項１〜３のいず
   れかに記載の方法。
5. 【請求項５】 発現ベクターにおけるプロモーター遺伝
   子がtrpプロモーター遺伝子である請求項１〜４のいず
   れかに記載の方法。
6. 【請求項６】 発現ベクターにおけるシストロン連結配
   列がＴＡＡＴＧである請求項１〜５のいずれかに記載の
   方法。
7. 【請求項７】 発現ベクターにおける第２シストロンの
   転写終止配列がプラスミドｐＢＲ３２２由来の終止配列
   またはｆｄファージ由来の終止配列である請求項１〜６
   のいずれかに記載の方法。
8. 【請求項８】 発現ベクターがプラスミドである請求項
   １〜７のいずれかに記載の方法。
9. 【請求項９】 発現ベクターがプラスミドｐＣＥ−ＳＭ
   ｔｒｐまたはプラスミドｐＣＥ−ＳＭ３ｔである請求項
   １〜８のいずれかに記載の方法。
10. 【請求項１０】 大腸菌がエシェリヒア・コリ ＨＢ１
    ０１である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。