JP2025063142A - 細胞治療のための構造的に活性なサイトカイン受容体 - Google Patents

Abstract

【課題】免疫療法のための免疫細胞の増殖を増強するための方法および組成物を提供する。
【解決手段】特定の実施形態では免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は膜貫通ドメインおよびエンドドメインが、それらが作動可能に連結される対応するエキソドメインへの任意の入力とは別に活性化シグナルを提供し得る、構成的に活性なサイトカイン受容体を発現する。特定の実施形態において、ＩＬ－７Ｒα由来の膜貫通ドメインおよびエンドドメインが、ＣＤ３４のエキソドメインとともに利用される。
【選択図】なし

Description

本出願は２０１６年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／３８０，０２１号
の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、免疫学、および少なくとも
癌医学を含む医学の分野を含む。

抗原特異的Ｔ細胞による細胞療法は前臨床モデルおよび早期臨床試験において有望であ
ることが示されているが、大きな疾患を有する患者はほとんど治癒していない。この効力
の欠如は、注入後の制限されたｉｎ ｖｉｖｏ Ｔ細胞増殖を含むいくつかの因子のため
である。化学療法および／または放射線療法によるＴ細胞移植の前にリンパを枯渇させる
患者はｉｎ ｖｉｖｏでのＴ細胞増殖を大いに増強するが、これらの薬剤は望ましくない
副作用を有する。このような毒性物質なしにＴ細胞増殖を可能にするための手段が必要と
されている。

本開示は、インビボでＴ細胞増殖を安全に増強するための方法および組成物を提供する
ための当該分野における必要性を満たす。

本開示の実施形態は、注入後のインビボを含む、免疫細胞の拡大および／または増殖を
増強するための方法および組成物に関する。特定の場合において、Ｔ細胞は特定の構成的
に活性なサイトカイン受容体分子を発現し、癌を含む医学的状態のための治療としての使
用のためのインビボでのＴ細胞の拡大を促進する。構成的に活性なサイトカイン受容体は
、特定の実施形態において、少なくとも１つのエンドドメイン、膜貫通ドメイン、および
少なくとも１つのエキソドメインを含む。

第１の局面において、本明細書中で提供されるのは、関連するサイトカインの結合を必
要とせずにホモ二量体化して下流のシグナル伝達を促進する、操作されたサイトカイン受
容体ポリペプチドである。このような操作されたサイトカイン受容体の共通の特徴は、（
例えば膜貫通ドメインに）対応するサイトカインの結合の非存在下で、ホモ二量体化、さ
らに結果としてシグナルを、引き起こすかまたは促進する、１つ以上の変異を含むように
操作されることである。このように、サイトカインのシグナル伝達に関して、それらは構
成的に活性である（すなわち、突然変異は「機能獲得」突然変異である）。

特定の場合、操作されたサイトカイン受容体ポリペプチドは、受容体の膜貫通ドメイン
が外部シグナル（例えば、サイトカイン）が膜貫通ドメインおよびエンドドメインを活性
化するために必要とされないように、受容体がホモ二量体化することを可能にする１つ以
上の変異を含むので、構成的に活性である。少なくともいくつかの場合において、膜貫通
ドメインにおける１つ以上の変異は、そのシグナルが作用する所望の標的分子により近接
して分子を位置決めする構造的立体配置を膜貫通ドメイン／エンドドメインに付与する。
特定の例において、膜貫通ドメインにおける突然変異はジスルフィド架橋の形成を可能に
する（それによってポリペプチドのホモ二量体化を促進する）ための膜貫通ドメインアミ
ノ酸配列における少なくとも１つのシステインの挿入であるか、またはそれを含み、およ
び／またはコンフォメーション変化を誘導するための少なくとも１つのプロリンの挿入（
例えば、分子を受容体分子を通る軸を中心にキンクさせる、ねじらせるか、または回転さ
せる）を含み、その両方の突然変異は、分子の性質、したがってそのシグナル伝達に構造
的に影響を及ぼす。

特定の実施形態では、膜貫通ドメインが対応する野生型ＩＬ－７サイトカイン受容体α
膜貫通ドメインと比較して、１つまたは複数の変異を含むＩＬ－７サイトカイン受容体α
膜貫通ドメインである。特定の実施形態では、膜貫通ドメインがＩＬ－７サイトカイン受
容体α由来である場合、変異は配列LLTISILSFFSVALLVILACVLW（配列番号２５）にある。
特定の局面において、変異は少なくとも１つのシステインを膜貫通ドメインに導入し、お
よび／または変異は、プロリンを膜貫通ドメインに導入する。膜貫通ドメインは、場合に
よっては２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、
または３３アミノ酸長である。

膜貫通ドメインの特定の実施形態では、ドメインは自己二量体化し、特定の場合におい
て、膜貫通ドメインは本開示の１つ以上のサイトカイン受容体エンドドメインの内因性膜
貫通ドメインであるか、またはその自己活性化誘導体である。自己活性化誘導体は対応す
る野生型膜貫通ドメインと比較して１つ以上の突然変異を含んでもよく、１つまたは複数
の突然変異は受容体をホモ二量体化することを可能にする。特定の場合において、突然変
異は、受容体を膜貫通成分およびエンドドメイン成分を通してホモ二量体化することを可
能にする。特定の実施形態において、例えば、ヤヌスキナーゼがエンドドメイン／ポリペ
プチドをリン酸化および活性化し得るように、１つまたは複数の変異は膜貫通およびエン
ドドメインを構造的に配向（例えば、ねじれ）させ得る。特定の実施形態において、１つ
または複数の変異は、膜貫通ドメインおよびエンドドメインをらせん様式で集合的に構造
的にねじれ得るようにする。

特定の実施形態では、操作されたサイトカイン受容体ポリペプチドが少なくとも１つの
エンドドメイン、少なくとも１つの膜貫通ドメイン、および少なくとも１つのエキソドメ
インを含み、任意で１つまたは複数のエキソドメインを含む。いくつかの実施形態では、
エンドドメインは野生型であり、すなわち、サイトカインシグナル伝達に関して機能的に
活性である。具体的な実施形態では操作されたサイトカイン受容体ポリペプチドが正常な
（野生型）エキソドメインを含み、この実施形態ではポリペプチドが対応するサイトカイ
ンの存在下または非存在下でホモ二量体化し、シグナルを伝達する。別の特定の実施形態
では、操作されたサイトカイン受容体ポリペプチドが、このような受容体についての野生
型エキソドメインではないエキソドメインを含む。より具体的な実施形態では、エキソド
メインは、受容体が存在する細胞に通常有害であるリガンド（例えば、通常は細胞をダウ
ンレギュレートするか、または細胞のアネルギーを引き起こすか、または細胞のアポトー
シスを引き起こすリガンド）に結合する。例えば、このような非野生型エキソドメインは
例えば、チェックポイントタンパク質に対するデコイ受容体であり得るか、またはデコイ
受容体として役立ち得る；例えば、エキソドメインは、チェックポイントタンパク質ＰＤ
－１に対する受容体を含む。場合によっては、非野生型エキソドメインは、エキソドメイ
ンに結合した場合に、操作されたサイトカイン受容体ポリペプチドを含む細胞を破壊する
ために標的化する抗体の標的である。別の特定の実施形態では、操作されたサイトカイン
受容体ポリペプチドがエキソドメインを欠く。特定の実施形態において、サイトカインは
インターロイキン（例えば、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、またはＩＬ－１２）で
ある。

本開示の特定の局面において、構成的に活性なサイトカイン受容体は、構成的ＩＬ－７
受容体活性を誘導する。特定の実施形態において、ＩＬ－７Ｒαの膜貫通ドメインにおけ
る１つ以上の変異または改変は、受容体をホモ二量体化状態においてシグナル伝達を誘導
可能にする。特定の実施形態では、インターロイキンはＩＬ－７である。特定の実施形態
において、操作されたサイトカイン受容体ポリペプチドは、操作されたＩＬ－７受容体ポ
リペプチドである。

他の実施形態では、そのような操作されたサイトカイン受容体ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含む細胞、そのようなポリペプチド
を発現する細胞（例えば、キメラ抗原受容体をさらに発現する細胞）、および疾患（例え
ば、癌（例えば、血液癌または固形腫瘍））を処置するためのそのような細胞の使用が本
明細書に提供される。

一実施形態では、操作されたサイトカイン受容体ポリペプチドをコードするポリヌクレ
オチドがあり、ポリペプチドは以下の作動可能に連結された成分を含む：
ａ）１つ以上のサイトカイン受容体エンドドメイン；
ｂ）操作された受容体のホモ二量体化を促進する１つまたは複数の変異を含む膜貫通ド
メイン；および
ｃ）成分ａ）における対応する１つ以上のサイトカイン受容体エンドドメインの内因性
細胞外ドメインではない１つ以上の細胞外ドメインであって、細胞外ドメインがサイトカ
イン受容体に由来しないもの。特定の実施形態において、このようなポリヌクレオチドを
含む１つまたは複数の細胞が存在する。

特定の実施形態において、１つ以上のサイトカイン受容体エンドドメインは、細胞中の
ＳＴＡＴ５経路または細胞中のＳＴＡＴ３経路を介してシグナル伝達を誘発する。特定の
場合において、サイトカイン受容体エンドドメインは、ＩＬ－７受容体α、ＩＬ－２１受
容体α、ＣＤ１２２、ＩＬ－２３受容体α、ＩＬ－１２受容体α、またはそれらの組み合
わせに由来する。

一実施形態では、細胞外ドメインは球状である。細胞外ドメインは、シグナル伝達活性
を欠くデコイ受容体であり得る。細胞外ドメインは、細胞傷害性抗体の標的であり得る。
特定の場合において、細胞外ドメインは、少なくとも７０アミノ酸および／または２００
０アミノ酸以下である。細胞外ドメインの長さは、７０～２０００アミノ酸、１００～１
０００アミノ酸、５００～２０００アミノ酸、５０～５００アミノ酸、１００～７５０ア
ミノ酸、２００～２０００アミノ酸、または５００～２０００アミノ酸であり得る。場合
によっては、細胞外ドメインはＣＤ３４の細胞外ドメインである。特定の実施形態では、
細胞外ドメインがＣＤ３０、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＴＧＦ－β受容
体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－１３受容体α１およびα２、ＩＬ－８受容体、ＩＬ－１０受
容体、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＡＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２７、Ｃ
Ｄ２８、ＣＤ５２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＮＧＦＲ、またはそ
れらの組み合わせに由来する。

特定の実施形態では、構成的に活性なサイトカイン受容体を発現する細胞が免疫細胞で
ある。細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、αβ細胞、γδＴ細胞、粘膜関連インバ
リアントＴ細胞（ＭＡＩＴ Ｔ細胞）、自然リンパ球、幹細胞、または前駆細胞であり得
る。特定の実施形態では、細胞が細胞に対して抗原特異性を付与する非天然分子を含む。
細胞は少なくとも１つのさらなる操作された受容体、例えば、別の構成的に活性なサイト
カイン受容体、キメラ抗原受容体、組換えＴ細胞受容体、二重特異性Ｔ細胞係合体（Ｂｉ
ＴＥまたはＴ細胞ＥＮＧ）、デュアルアフィニティー再標的化（ＤＡＲＴ）タンパク質、
またはそれらの組み合わせをさらに含み得る。

構成的に活性なサイトカイン受容体を発現する細胞に関連するいくつかの実施形態にお
いて、この細胞は、受容体ポリペプチドを発現するポリヌクレオチドを有する。ポリヌク
レオチドは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターなどの発現ベクターとしてさら
に定義することができる。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデ
ノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターであり得る。非ウイルスベクターは、例
えばプラスミドであり得る。

一実施形態では構成的に活性なサイトカイン受容体を発現する本開示の複数の細胞があ
り、細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、粘膜関連インバリ
アントＴ細胞（ＭＡＩＴ Ｔ細胞）、先天性リンパ球細胞、幹細胞、前駆細胞、または免
疫エフェクター細胞のうちの１つまたは複数の混合物を含む。

一実施形態では、本開示に包含される細胞においてポリヌクレオチドを発現させる工程
を含む、細胞集団を拡大する方法がある。細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ
（例えば、ヒトを含む哺乳動物）であり得る。特定の実施形態において、ヒトには、細胞
外ドメインに結合すると、破壊のために細胞を標的化する細胞外ドメインの１つ以上の阻
害剤の有効量が提供される。インヒビターは、任意の種類の１つ以上の抗体であり得る。
特定の実施形態では、ヒトは治療を必要としており、治療有効量の細胞がヒトに提供され
る。特定の局面において、ヒトは、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、免疫不全を有するか
、または固形臓器移植もしくは幹細胞移植の前または後である。

特定の実施形態では、構成的に活性なサイトカイン受容体が構成的に活性なサイトカイ
ン受容体を発現する細胞に有害である１つ以上の分子を結合することなどによって、シン
クまたはリガンドトラップとして利用されるエキソドメインを利用する。このようなリガ
ンドは、例えば免疫抑制の場合のように、Ｔ細胞を止めるためにシグナル伝達経路を通常
活性化するので、免疫抑制性であり得る。いくつかのそのような場合では、エキソドメイ
ンはデコイ受容体として有害なリガンドに結合するが、膜貫通／エンドドメインはなお独
立して正のサイトカインシグナルを与えることができる。いくつかの実施形態では、正常
な環境下でそうであるように、デコイ受容体は対応するリガンドがＴ細胞を抑制するのを
妨げる。デコイ受容体のエキソドメインは例えば、阻害性サイトカインに結合し得る。デ
コイ受容体が結合し得る有害なリガンドの例には、ＴＧＦ－β、ＰＤ－Ｌ１、ＩＬ－４、
ＩＬ－１３、ＩＬ－８およびＩＬ－１０が含まれる。いくつかの実施形態では、デコイ受
容体エキソドメインがＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＡＳなどのＴ細胞によって
通常発現される阻害受容体の１つである。

上記は以下の本発明の詳細な説明がよりよく理解され得るように、本発明の特徴および
技術的利点をかなり広く概説した。本発明の特許請求の範囲の主題を形成する本発明の追
加の特徴および利点を以下に説明する。開示される概念および特定の実施形態は本発明の
同じ目的を実行するための他の構造を修正または設計するための基礎として容易に利用さ
れ得ることが、当業者によって理解されるべきである。当業者なら、添付の特許請求で説
明したような本発明の精神および範囲から、このような等価な構成が、逸脱しないことも
認識すべきである。本発明の特徴であると考えられる新規な特徴はその構成および動作方
法の両方に関して、更なる目的および利点と共に、添付の図面と関連して考慮されるとき
、以下の説明からより良く理解されるのであろう。しかしながら、図面の各々は、例示お
よび説明の目的のみのために提供され、本発明の限定の定義として意図されないことが明
確に理解されるべきである。

本発明をより完全に理解するために、添付の図面と共に以下の説明を参照する。

正常なＩＬ－７サイトカイン／受容体シグナル伝達のスキーム。

ＩＬ７ＲＰ２受容体におけるシグナル伝達のスキーム。

Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２タンパク質のシグナル伝達のスキーム。

図４Ａおよび図４Ｂ： ＳＴＡＴ５は、ＩＬ７ＲＰ２形質導入Ｔ細胞において構成的に活性である。図４Ａは代表的なドナーからのデータであり、図４Ｂは、３人のドナーの平均結果である。

ＩＬ７ＲＰ２形質導入抗原特異的Ｔ細胞は、抗原特異的刺激後に非修飾抗原特異的Ｔ細胞よりも増殖能が高い。

図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ： Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２を共発現するＧＤ２．ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏでＧＤ２．ＣＡＲ Ｔ細胞よりも大きな増殖および抗腫瘍効果を有する。ＧＤ２．ＣＡＲ－Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２ Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏで有意に増殖し、ＧＤ２．ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して腫瘍部位でＴ細胞の持続期間が延長した（図６Ａ）。ＬＡＮ－１腫瘍はＧＤ２．ＣＡＲ Ｔ細胞を投与したマウスで増殖し、腫瘍はＧＤ２．ＣＡＲ－Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２ Ｔ細胞で消失した（図６Ｂ）。その結果、ＧＤ２．ＣＡＲ－Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２ Ｔ細胞を投与したマウスの生存率優位性が有意に高まった（図６Ｃ）。

Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２形質導入Ｔ細胞は、抗原刺激の非存在下では限られた持続性を有する。

Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２は、ＥｐｈＡ２．ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害能および増殖を延長する。

Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２はｉｎ ｖｉｖｏでＥｐｈＡ２．ＣＡＲ Ｔ細胞のアンチグリオーマ活性を増強する。

図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃ：Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２タンパク質は、ＩＬ－２１Ｒα細胞質ドメインと融合されて、構成的に活性なコンビナトリアルサイトカイン受容体を生成し得る。Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２－リンカー－ＩＬ２１Ｒαの活性化の模式図（図１０Ａ）．Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２およびΔ３４．ＩＬ７ＲＰ２－リンカー－ＩＬ２１Ｒα Ｔ細胞によるＳＴＡＴ５の構成的活性化（図１０Ｂ）、およびΔ３４．ＩＬ７ＲＰ２－リンカー－ＩＬ２１ＲαのみによるＳＴＡＴ３の構成的活性化（図１０Ｃ）。

ＩＬ７ＲＰ２は、ＮＫ細胞の抗原媒介性増殖を増強する。

構成的に活性なサイトカイン受容体が２つのエキソドメインから構成される一実施形態の図解。

構成的に活性なサイトカイン受容体が、エキソドメインをデコイ受容体として利用して、受容体を発現する細胞に有害または潜在的に有害なリガンドを結合する実施形態の図解。

図１４Ａ～１４Ｉ：Ｃ７Ｒからの構成的シグナル伝達はＴ細胞においてＳＴＡＴ５を活性化するが、自律的細胞増殖を支持しない。 （１４Ａ）操作されたＣ７Ｒホモ二量体化受容体と比較した、ヘテロ二量体化されたＩＬ７Ｒαおよびγｃからなる天然のＩＬ－７受容体に結合したＩＬ－７の概略比較。 （１４Ｂ、１４Ｃ）非形質導入（ＮＴ）細胞に対する（１４Ｂ）ＣＤ４および（ｃ）ＣＤ８ Ｔ細胞におけるΔ３４およびＣ７Ｒ（３を表す）の形質導入効率。 （１４Ｄ、１４Ｅ）Δ３４またはＣ７Ｒで形質導入した（１４Ｄ）ＣＤ４および（１４Ｅ）ＣＤ８ Ｔ細胞におけるリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）の代表的なフローサイトメトリー比較。細胞を、分析前に２４～７２時間、ＩＬ－１５およびＩＬ－７なしで培養した。 （１４Ｆ、１４Ｇ）複数のドナーを用いて１４Ｄおよび１４Ｅにおける実験を繰り返す場合の平均ｐＳＴＡＴ５ ＭＦＩ値。 （１４Ｈ，１４Ｉ）さらなる抗原刺激なしで、ＰＢＭＣ活性化の９～１２日後に開始する、サイトカインを含まない完全細胞培養培地で培養したΔ３４またはＣ７Ｒ形質導入（１４Ｈ）ＣＤ４または（１４Ｉ）ＣＤ８ Ｔ細胞のインビトロ持続性の定量。トリパンブルー排除法を用いて生細胞を毎週計数した。Ｘ軸は、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を培養培地から取り出した後の日数を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）値を両側ｔ検定と比較した： １０．５ ±０．６６１６（ＣＤ８ Δ３４）、５６．３７±７．９７２（ＣＤ８ Ｃ７Ｒ）、ｐ＜０．０５；１０．２２±１．６９４（ＣＤ４ Δ３４）および３１．３６±２．５９０（ＣＤ４ Ｃ７Ｒ）、ｐ＜０．０５。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１（両側対ｔ検定、１４Ｆ‐１４Ｉ）。グラフ１４Ｆ～１４Ｉは、異なるドナーからの平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。

図１５Ａ～１５Ｉ：Ｃ７Ｒは、連続腫瘍攻撃中にＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞活性を増強する。 （１５Ａ）ＬＡＮ－１腫瘍細胞との共培養の２４時間後にＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞またはＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞によって分泌されるサイトカインをＥＬＩＳＡによって決定した。 （１５Ｂ）ＬＡＮ－１腫瘍細胞を死滅させるＴ細胞の４時間ルシフェラーゼベースの細胞毒性アッセイ。 （１５Ｃ）連続共培養概略図。最初の共培養（ＣＣ１）は、ＩＬ－１５またはＩＬ－７の非存在下で、０．５×１０^６個のＬＡＮ－１ ＧＦＰ－ＦＦｌｕｃ腫瘍細胞と共に１×１０６ ＧＤ２－ＣＡＲまたはＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞の存在下で、７日間開始した。第２および第３の共培養物（ＣＣ２およびＣＣ３）について、Ｔ細胞を前の共培養物から回収し、次いで、同じ２：１のＥ：Ｔ比で新鮮な腫瘍細胞を有する新しい培養培地中で再播種した。 （１５Ｄ）連続共培養中のＧＤ２－ＣＡＲまたはＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞の累積増殖。矢印は、腫瘍細胞によるＴ細胞再刺激の時点を示す。 （１５Ｅ）ＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞をそれぞれ有するＣＣ３後に残存するＬＡＮ－１腫瘍細胞。 （１５Ｆ、１５Ｇ）増殖分析のために、ＣＣ１の終わりに収集したＧＤ２－ＣＡＲおよびＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞を、ＣＣ２の間に再チャレンジする前にＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識した。 （１５Ｇ）Ｆにおける実験を複数のドナーで繰り返し、分裂指数をＧＤ２－ＣＡＲおよびＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ増殖ヒストグラムから編集した。 （１５Ｈ）生存分析のために、ＬＡＮ－１腫瘍細胞での２回の連続腫瘍チャレンジ後に、ＧＤ２－ＣＡＲおよびＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞を、アネキシンＶおよび７－ＡＡＤで染色した。棒グラフは、アネキシンＶ、７－ＡＡＤ、両方、またはどちらも陽性であるＴ細胞染色の頻度を示す。アネキシンＶ（＋）７－ＡＡＤ（－）およびアネキシンＶ（－）７－ＡＡＤ（＋）の平均比較はｎ．ｓであった。 （１５Ｉ）ＣＣ２終了後、腫瘍をＧＤ２特異的抗体で標識し、ＣＡＲ Ｔ細胞から磁気的に分離した。Ｔ細胞から全ＲＮＡを単離し、その後、Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｐａｎｅｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２およびｎＣｏｕｎｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）を用いて遺伝子発現分析を行った。表示されたヒートマップは、０．０２未満のＰ値を有するｌｏｇ２倍変化（ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ／ＧＤ２－ＣＡＲ）を有する遺伝子を示す。５人のドナー（１０対のサンプル）からデータを作成した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（両側対ｔ検定、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｄ、１５Ｅ、１５Ｇ、１５Ｈ）。グラフ１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｅ、１５Ｇ、１５Ｈは、異なるドナーからの平均± ＳＥＭ（ｎ＝６、１５Ａ、１５Ｄ、１５Ｅ； ｎ＝３、１５Ｇ、１５Ｈ）を表す。

図１６Ａ～１６Ｇ： Ｃ７Ｒは転移性および頭蓋内悪性腫瘍に対する養子Ｔ細胞免疫療法を増強する。 （１６Ａ）および（１６Ｂ）１×１０^６個のＣＨＬＡ－２５５ ＦＦｌｕｃ細胞を雌ＮＳＧマウスに静脈内注射し、７日後に無関係なＣＡＲ、ＧＤ２－ＣＡＲΔ．Ｃ７Ｒ、ＧＤ２－ＣＡＲ、またはＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒを発現する１×１０^６個のＴ細胞を注射した。（１６Ａ）経時的な神経芽細胞腫増殖の代表的な生物発光画像。（１６Ｂ）ＣＨＬＡ－２５５ ＦＦｌｕｃチャレンジマウスのカプラン・マイヤー生存分析。 （１６Ｃ，１６Ｄ）Ｔ細胞の移動および持続を追跡するために、並行試験において、１×１０^６個のＣＨＬＡ－２５５細胞をＮＳＧマウスに静脈内注射し、７日後にＧＤ２－ＣＡＲまたはＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒを共発現する１×１０^６個の ＧＦＰ－ＦＦｌｕｃ Ｔ細胞を注射した。（１６Ｃ）Ｔ細胞の逐次生物発光イメージング。（１６Ｄ）経時的なＴ細胞の定量化生物発光シグナル。（１６Ｅ）１×１０^５ Ｕ３７３ ＧＦＰ－ＦＦｌｕｃ細胞を、雄ＳＣＩＤマウスに頭蓋内注射した。７日後、ＥｐｈＡ２－ＣＡＲΔ．Ｃ７Ｒ、ＥｐｈＡ２－ＣＡＲを発現する１×１０^４のＴ細胞。Ｃ７Ｒ、ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ、またはＥｐｈＡ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒを腫瘍に頭蓋内注射した。各処置群からの定量Ｕ３７３ ＧＦＰ－ＦＦｌｕｃ生物発光を経時的に示す。 （１６Ｆ）Ｔ細胞で処置した後のＵ３７３ ＧＦＰ－ＦＦｌｕｃチャレンジマウスのカプラン・マイヤー生存分析。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（Ｗｅｌｃｈのｔ検定、Ｄ；ペアの両側ｔ検定、１６Ｇ）。５匹のマウスを全群に使用した。グラフＤは、実験反復からの平均± ＳＥＭを表す。Ｄに示す実験ではＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ群の１匹のマウスが腫瘍負荷とは関係のない理由で５日目の画像化中に死亡したため、９～１６日目のＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒにおける平均生物発光シグナルはｎ＝４から計算される。

図１７Ａ～１７Ｄ： Ｃ７Ｒ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉＣ９自殺スイッチを用いて欠失させることができる。 （１７Ａ）ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７ＲおよびｉＣ９－ＣＤ１９ｔベクターで二重形質導入したＴ細胞を、ＣＤ１９特異的Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズを用いてｉＣ９発現について選択した。次いで、細胞を完全培養培地中でＡＰ２０１８７と共に２４時間インキュベートし、次いで、アネキシンＶおよび７－ＡＡＤで染色した。棒グラフは、アネキシンＶ、７－ＡＡＤ、両方、またはどちらも陽性であるか、またはどちらも陽性でないＴ細胞染色の相対頻度を示す。アネキシンＶ（＋）７－ＡＡＤ（－）およびアネキシンＶ（－）７－ＡＡＤ（＋）の比較はｎ．ｓであった。 （１７Ｂ、１７Ｃ）ＮＳＧマウスにおいて、ＧＦＰ－ＦＦｌｕｃ、並びに、ＧＤ２－ＣＡＲΔ.Ｃ７Ｒ、ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７ＲまたはＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ＋ｉＣ９－ＣＤ１９ｔ、で形質導入した１×１０^６ Ｔ細胞を静脈内注入してから８日後に、ＬＡＮ－１腫瘍を皮下樹立した。ＧＤ２－ＣＡＲΔ．Ｃ７Ｒを、１７Ｂおよび１７Ｃにおいて同じ対照として使用した。腫瘍容積を経時的に測定した。ＧＤ２－ＣＡＲΔ．Ｃ７Ｒ群の２匹のマウスは腫瘍負荷のため２１日後に安楽死させ、２４日目に残りの３匹のマウスの腫瘍サイズをＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ群およびＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ＋ｉＣ９－ＣＤ１９ｔ群と比較した。Ｔ細胞注入３２日後の平均腫瘍体積：ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒについては２３６±１１ｍｍ３、ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ＋ｉＣ９－ΔＣＤ１９ｔについては１９６±１８ｍｍ３、ｎ．ｓ（ｐ＝０．１８５７）。 （１７Ｄ）腫瘍部位からのＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞（ｉＣ９－ＣＤ１９Ｔの有無にかかわらず）の生物発光シグナルを経時的に定量した。赤色の矢印は、合計３回の投与のための、２４時間毎の２８日目のＡＰ２０１８７投与の開始を示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（両側ｔ検定、１７Ａ、１７Ｄ； Ｗｅｌｃｈのｔ検定、１７Ｂ、１７Ｃ）。群当たりｎ＝５のマウス。１７Ａのグラフは、異なるドナーからの平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。

図１８Ａ～１８Ｄ：ＣＤ３４‐ＩＬ７Ｒ^＊（Ｃ７Ｒ）はＴ細胞において安定に発現し、そしてＩＬ７Ｒ^＊と比較して構成的ＳＴＡＴ５活性化を増強する。 （１８Ａ）ＩＬ７Ｒ^＊融合構築物およびΔ３４の模式図。全てのＩＬ７Ｒ^＊構築物は、修飾ＩＬ－７Ｒα膜貫通ドメイン（ＩＬ－７ＲαにおけるＴｈｒ２４４とＩｌｅ２４５の間のシステイン、プロリン、およびトレオニンの挿入）および未修飾のＩＬ－７Ｒαエンドドメインを含む。Δ３４構築物はＣＤ３４の外部ドメインおよび膜貫通を含むが、エンドドメインの一部のみを保持する。 （１８Ｂ）形質導入細胞をＱＢＥＮＤ１０に特異的な抗ＣＤ３４抗体（Ｑ８で使用されるＣＤ３４エピトープを検出する）で染色して、ＮＴ細胞と比較して、ａにおける構築物の形質導入効率を比較した。培養ＮＴ細胞上のＩＬ－７Ｒαのバックグラウンド発現のために、ＩＬ７Ｒ^＊形質導入は、バイシストロン性ベクター中のＱ８タグによって間接的に検出された。形質導入効率の差はΔ３４とＩＬ７Ｒ^＊（ｐ ＝０．２９５１）とを比較したときおよびＩＬ７Ｒ^＊とＣ７Ｒ（ｐ＝０．１７３６）を比較したとき、ｎ．ｓ．であった。 （１８Ｃ）異なる構築物のＭＦＩを、Ｂから比較した。Δ３４とＩＬ７Ｒ^＊のＭＦＩ比較から、およびΔ３４とＣ７Ｒの間のＭＦＩ比較からは、ｎ．ｓ．であった。 （１８Ｄ）Ｔ細胞によるＳＴＡＴ５リン酸化の比較を行った。細胞を、分析前に２４～７２時間、ＩＬ－１５およびＩＬ－７なしで培養した。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（両側ｔ‐検定、１８Ｂ‐１８Ｄ）。グラフ１８Ｂ～１８Ｄは、異なるドナーからの平均（ｎ＝３）±ＳＥＭを表す。

図１９Ａ～１９Ｂ：ＣＤ４およびＣＤ８選択Ｔ細胞の両方におけるＣ７ＲおよびΔ３４の効率的なレトロウイルス形質導入。ＣＤ３４の発現をフローサイトメトリーにより評価し、ＮＴ Ｔ細胞対照と比較して、（１９Ａ）ＣＤ４および（１９Ｂ）ＣＤ８ Ｔ細胞におけるＣ７ＲおよびΔ３４形質導入を検出した。両側ｔ検定（ｎ＝３）と比較した場合、差はｎ．ｓ．であった。

図２０Ａ～２０Ｄ：Ｃ７Ｒシグナル伝達は、培養中にＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の表現型組成を変化させない。 （２０Ａ）ＧＤ２－ＣＡＲおよびＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒベクターのスキーム。ＧＤ２－ＣＡＲ構築物は、１４ｇ２ａ ｓｃＦｖ、ＣＤ８細胞外スペーサー、ＣＤ８膜貫通ドメイン、および４１ＢＢζエンドドメイン、続いてＩＲＥＳおよび短縮型ＮＧＦＲから構成される。ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ構築物はＩＲＥＳおよび短縮型ＮＧＦＲを２Ａ配列で置換し、続いてＣ７Ｒがある以外は同一である。 （２０Ｂ、２０Ｃ）ＧＤ２－ＣＡＲまたはＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒを発現するＴ細胞の記憶表現型の比較。棒グラフは、ＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７－（ターミナルエフェクター様、ＴＥ）、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７－（エフェクターメモリー、ＥＭ）、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋（セントラルメモリー、ＣＭ）、またはＣＤ４５ＲＯ－ＣＣＲ７＋（ナイーブ）である（２０Ｂ）ＣＤ４ Ｔ細胞および（２０Ｃ）ＣＤ８ Ｔ細胞の相対頻度を示す。ＧＤ２－ＣＡＲとＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒの差は、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の４つすべての記憶亜集団についてｎ．ｓ．であった。（２０Ｄ）ＣＤ４およびＣＤ８のパーセンテージをＧＤ２－ＣＡＲとＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞間で比較した。差異はｎ．ｓ．であった。グラフ２０Ｂ～２０Ｄは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表し、集団を、両側ｔ検定を用いて比較した。

図２１Ａ～２１Ｂ：Ｃ７Ｒは、Ｕ３７３腫瘍に対する頭蓋内ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ Ｔ細胞増殖を有意に増加させない。（２１Ａ，２１Ｂ）Ｔ細胞を追跡するために、１×１０^５ Ｕ３７３細胞をＳＣＩＤマウスに頭蓋内注射し、７日後に、ＥｐｈＡ２－ＣＡＲまたはＥｐｈＡ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒを発現する１×１０^４個のＴ細胞、ＧＦＰ－ＦＦｌｕｃを発現するｃｏ３を頭蓋内注射した。（２１Ａ）生物発光画像を経時的に収集し，定量した。（２１Ｂ）ＡＵＣ分析を実施し、両群間でｎ．ｓ．であることが判明した（両側ｔ検定）。ｎ＝群当たり５匹のマウス。

ＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞と比較によるＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞の遺伝子発現の差異。ＣＣ２の終了後、腫瘍をＧＤ２特異的抗体で標識し、ＣＡＲ Ｔ細胞から磁気的に分離した。Ｔ細胞から全ＲＮＡを単離し、その後、Human Immunology Panel Version 2およびｎＣｏｕｎｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）を用いて遺伝子発現分析を行った。表示された表は、０．０２未満のＰ値を有する遺伝子（ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ／ＧＤ２－ＣＡＲ）の倍数変化を示す。５人のドナー（１０対のサンプル）からデータを作成した。

図２３Ａ～２３Ｂ： ３４．ＩＬ７ＲＰ２－ＥＢＶＳＴによるＬＣＬ腫瘍の治療。図２３Ａにおいて、３４．ＩＬ７ＲＰ２－ＥＢＶＳＴで処置したマウスにおけるルシフェラーゼのイメージングがある。図２３Ｂは、３４．ＩＬ７ＲＰ２－ＥＢＶＳＴ処置マウスにおける腫瘍増殖の測定を示す。

本出願の範囲は、明細書に記載されたプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法
およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図していない。

長年にわたる特許法の慣例に従い、「ａ」および「ａｎ」という用語は、特許請求の範
囲を含む単語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」と一緒に本明細書で使用される場合、「１つまた
は複数」を意味する。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つまたは複数の要素、
方法ステップ、および／または方法からなるか、または本質的にそれらからなることがで
きる。本明細書中に記載されるいずれの方法または組成物も、本明細書中に記載される任
意の他の方法または組成物に関して使用され得ることが意図される。

本明細書で使用される「サイトカイン」という用語は炎症および感染に対する免疫系の
応答を調節し、免疫応答において細胞間連絡を助ける細胞シグナル伝達分子を指す。例と
しては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍
壊死因子が挙げられる。

Ｉ 一般的実施形態

本開示は、細胞性免疫療法剤を必要とする個体への送達後のｉｎ ｖｉｖｏを含む、そ
の増殖を増強するための細胞性免疫療法剤の改善に関する。このような改善はサイトカイ
ン受容体の少なくとも１つのエンドドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも１つの
エキソドメインを含む複数の成分からなる構成的に活性なサイトカイン受容体を利用する
が、場合によっては、エキソドメインは受容体において欠損している。一実施形態では、
構成的に活性なサイトカイン受容体がＩＬ－７サイトカイン受容体α鎖のエンドドメイン
を利用する。非天然キメラＩＬ７Ｒ含有受容体を発現するように遺伝的に改変された抗原
特異的Ｔ細胞は、未改変Ｔ細胞とは対照的に、細胞培養研究および動物モデルにおいて強
力な増殖を示した。

ＩＩ 構成的に活性なサイトカイン受容体分子

特定の実施形態では構成的に活性なサイトカイン受容体（タンパク質および／または核
酸形態で）、それらを作製する方法、およびそれらを使用する方法は本開示によって包含
される。受容体は少なくとも１つのエキソドメイン、膜貫通ドメイン、および少なくとも
１つのエンドドメインを含み、エンドドメインはサイトカイン受容体に由来し、エキソド
メインは膜貫通およびエンドドメイン成分と同じまたは異なる分子に由来する。別の態様
において、膜貫通ドメインおよびエキソドメインは同じ分子由来であり、エンドドメイン
は異なる分子由来であるが、分子が膜貫通ドメインおよび／またはエンドドメインをねじ
る変異を含むため、受容体は依然として構成的に活性である。

特定の場合において、構成的に活性なサイトカイン受容体は、それらの膜貫通ドメイン
および／またはエンドドメイン成分が、それらが作動可能に連結されているエキソドメイ
ンからの対応するシグナルの受信なしに活性化シグナルを伝達するように構成されるので
、構成的に活性である。すなわち、受容体の特定の態様において、サイトカイン受容体に
対するリガンドの必要性はない。場合によっては、本開示の構成的に活性なサイトカイン
受容体の膜貫通ドメインおよび／またはエンドドメインは、それらが非天然の様式または
状況または環境でホモ二量体化することができ、それにより、エキソドメインがシグナル
伝達経路において下流の対応する実体に活性化シグナルを伝達する状態に留まることを可
能にするように構成され得る。特定の実施形態では、構成的に活性なサイトカイン受容体
の膜貫通／エンドドメインは、それらが作動可能に連結されるエキソドメインによるサイ
トカインの結合の非存在下で、独立して正のサイトカインシグナルを与える。

特定の実施形態において、特定の構成的に活性なサイトカイン受容体が、本開示の方法
において利用される。

ｄＣＤ３４．ＩＬ７ＲＰ２ ｃＤＮＡ配列は配列番号２に提供され、対応するタンパク
質配列は配列番号３に提供される。構築物ｄＣＤ３４．ＩＬ７ＲＰ２は、ＣＤ３４エキソ
ドメイン全体；システイン、プロリン、トレオニン（ＣＰＴ）挿入；および正常なＩＬ７
Ｒエンドドメイン、を含む。

ＩＬ７ＲＰ２ ｃＤＮＡ配列は配列番号４に提供され、対応するタンパク質配列は配列
番号５に提供される。構築物ＩＬ７ＲＰ２は、ＩＬ７Ｒエキソドメイン；ＣＰＴ挿入を伴
う膜貫通ドメイン；および正常なＩＬ７Ｒエンドドメイン、を含む。

Ｑ８Ｅ．ＩＬ７ＲＰ２ ｃＤＮＡ配列は配列番号６に提供され、対応するタンパク質配
列は配列番号７に提供される。構築物Ｑ８Ｅ．ＩＬ７ＲＰ２は、ＣＤ３４細胞外ドメイン
プラスＣＤ８ストークのフラグメント；ＣＰＴ挿入を有するＩＬ７Ｒ膜貫通ドメイン；お
よび正常なＩＬ７Ｒエンドドメインを有する。

１９ＡＡ．ＩＬ７ＲＰ２ ｃＤＮＡ配列は配列番号８に提供され、対応するタンパク質
配列は配列番号９に提供される。１９ＡＡ．ＩＬ７ＲＰ２構築物は、（ＩＬ７Ｒ膜貫通ド
メインが開始する前のＩＬ７Ｒエクトドメイン中の最後の１９アミノ酸に由来する）ＩＬ
７Ｒエキソドメインの１９アミノ酸残基；ＣＰＴ挿入を有するＩＬ７Ｒ膜貫通ドメイン；
および正常なＩＬ７Ｒエンドドメインを含む。

Ａ．エキソドメイン
特定の実施形態では、構成的に活性なサイトカイン受容体が１つ、２つ、またはそれ以
上のエキソドメインを含む。特定の実施形態ではエキソドメインがリガンドに結合するこ
とができるが、シグナル自体は例えば、構造的理由または他の理由のために、伝達されな
い。エキソドメインは、特定の実施形態において、その対応する膜貫通および／またはエ
ンドドメインと同じ天然分子由来であってもよく、または天然分子由来でなくてもよい。
エキソドメインは、それが作動可能に連結されるエンドドメインと同じ天然分子由来であ
ってもよく、またはそうでなくてもよい。

場合によっては、エキソドメインはＩＬ７受容体エキソドメインおよびＣＤ３４エキソ
ドメインの三次元幾何学構造に類似した球状形態である。エキソドメインによって提供さ
れる１つの特徴は、少なくともいくつかのデータが少なくとも特定のエキソドメインが高
タンパク質発現および付随する高シグナル活性化（例えば、ｐＳＴＡＴ５活性化）を可能
にすることを示すので、タンパク質安定化を提供することであり得る。

場合によっては、エキソドメインがタンパク質を安定化し、シグナル伝達を増加させ得
る高グリコシル化を含む。

いくつかの実施形態において、エキソドメインは、形質導入された細胞の同定を可能に
する。例えば、エキソドメインが通常Ｔ細胞上で発現されない場合、エキソドメインは例
えば、フローサイトメトリー分析の間にゲートアウトすることによって、形質導入された
細胞が同定されることを可能にし、そしてまた、例えば、富化のために磁気的に選択され
る（例えば、対応する抗体に結合した磁気ビーズを使用する）。

いくつかの実施形態では、構成的に活性なサイトカイン受容体が構成的に活性なサイト
カイン受容体を発現する細胞に有害である１つ以上の分子の結合などのシンクまたはリガ
ンドトラップ機能を付与するエキソドメインを利用する。ある態様において、リガンドは
例えば、通常はシグナル伝達経路を活性化してＴ細胞を止める（免疫抑制）ので、免疫抑
制性である。いくつかのそのような場合において、エキソドメインはデコイ受容体として
有害なリガンドに結合するが、膜貫通／エンドドメインは依然として独立して正のサイト
カインシグナルを与えることができる。特定の実施形態では、正常な状況下でそうである
ように、デコイ受容体に対応するリガンドがＴ細胞を抑制するのを妨げる。特定の場合に
おいて、デコイ受容体エキソドメインは、例えば阻害性サイトカインに結合することがで
きる。有害なリガンドの例には、ＴＧＦ－β、ＰＤ－Ｌ１、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ
－８、およびＩＬ－１０が含まれる。さらに、デコイ受容体エキソドメインはＬＡＧ３、
ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４、ＦＡＳなどのＴ細胞によって通常発現される阻害性受容体のエ
キソドメインをコードし得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では受容体は構
成的にシグナル伝達し、シグナル伝達は指定されたトリガーの存在下でさらに増大する。
別の態様において、エキソドメインは例えば、ＩＬ－４サイトカイン受容体またはＩＬ－
１３サイトカイン受容体からのものを含まないことを含めて、サイトカイン受容体からの
ものではない。場合によっては、エキソドメインがｓｃＦｖなどの抗体を含んでも含まな
くてもよい。

特定の局面において、エキソドメインは、細胞の破壊のための標的である。例えば、エ
キソドメインは、受容体を発現する細胞のアポトーシスを直接的または間接的にもたらす
分子の標的として利用することができる。例えば、エキソドメインは、エキソドメインに
結合する対応する抗体で標的化され得、細胞の最終的な破壊を生じる。

構成的に作用する受容体は抑制リガンドのデコイ受容体として働くエキソドメインを有
し、自殺を標的とするドメインも有する場合もあるが、デコイ受容体エキソドメインと自
殺を標的とするエキソドメインとはまったく同じ場合もある。

特定の実施形態では、エキソドメインがＣＤ３０、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、Ｃ
Ｄ３４、ＣＤ３４、ＴＧＦ－β受容体、ＩＬ－４受容体、ＩＬ－１３受容体α１およびα
２、ＩＬ－８受容体、ＩＬ－１０受容体、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＣＴＬＡ４
、ＦＡＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５２、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＨＥＲ
２、ＥＧＦＲ、またはＮＧＦＲの細胞外ドメインを含む。さらに、エキソドメインはモノ
クローナル抗体もしくはそれらの誘導体（例えば、ｓｃＦＶに限定されない）、または二
量体化ドメイン（例えば、ＦＫＢＰに限定されない）を含み得る。

特定の場合において、エキソドメインは、ポドカリキシン（ポドカリキシン様タンパク
質１としても知られる）；ＰＯＤＸＬ（ＰＣＬＰ１としても知られる）；トロンボムチン
；ｇｐ１３５；ＧＣＴＭ２；ＴＲＡ－１－６０；ＴＲＡ－１－８１；またはエンドグリカ
ン（ポドカリキシン様タンパク質２、ＰＯＤＸＬ２またはＰＣＬＰ２としても知られる）
を含む。

いくつかの実施形態では受容体のエキソドメイン成分が天然に存在する分子由来であり
、野生型であるが、他の場合にはエキソドメインが対応する野生型天然に存在する分子と
比較して、１つ以上の変異を含む。１つ以上の変異は例えば、受容体をさらに安定化する
ように機能し得る。エキソドメインが対応する野生型配列と比較して１つ以上の変異を含
む場合、変異バージョンは、対応する野生型タンパク質または核酸配列と比較して、配列
の一部または全部にわたって、例えば少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、
８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同
一である。

いくつかの実施形態では、細胞外ドメインがある長さのものである。特定の実施形態で
は、細胞外ドメインの長さは１０～２７５アミノ酸、１０～２２５アミノ酸、１０～２０
０アミノ酸、１０～１７５アミノ酸、１０～１５０アミノ酸、１０～１２５アミノ酸、１
０～１００アミノ酸、１０～５０アミノ酸、５０～２５０アミノ酸、５０～２２５アミノ
酸、５０～２００アミノ酸、５０～１７５アミノ酸、５０～１５０アミノ酸、５０～１０
０アミノ酸、９０～２５０アミノ酸、９０～２２５アミノ酸、９０～２００アミノ酸、９
０～１７５アミノ酸、９０～１５０アミノ酸、９０～１２５アミノ酸、９０～１００アミ
ノ酸、１００～２５０アミノ酸、１００～２２５アミノ酸、１００～２００アミノ酸、１
００～１７５アミノ酸、１００～１５０アミノ酸、１００～１２５アミノ酸、１２５～２
５０アミノ酸、１２５～２２５アミノ酸、１２５～２００アミノ酸、１２５～１７５アミ
ノ酸、１２５～１５０アミノ酸、１５０～２５０アミノ酸、１５０～２２５アミノ酸、１
５０～２００アミノ酸、１５０～１７５アミノ酸、１７５～２５０アミノ酸、１７５～２
２５アミノ酸、１７５～２００アミノ酸、２００～２５０アミノ酸、２００～２２５アミ
ノ酸である。

代替の実施形態において、受容体は、エキソドメインを欠く。

Ｂ．膜貫通ドメイン
特定の実施形態では、構成的に活性なサイトカイン受容体は、エキソドメインおよびエ
ンドドメインに作動可能に連結された膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、それが
作動可能に連結されるエンドドメインと同じ天然分子由来であってもなくてもよい。特定
の実施形態では、膜貫通は、それが作動可能に連結されるエキソドメインと同じ天然分子
に由来しない。膜貫通ドメインは分子のねじれを引き起こす突然変異を必要とするので、
特定の実施形態では天然ではない。膜貫通ドメインは、少なくとも特定の実施形態におい
て、膜貫通が自己活性であることを可能にするように、その対応する野生型分子と比較し
て、１つ以上の変異を含む。本明細書中で使用される場合、用語「自己活性」はそれが作
動可能に連結されるエンドドメインと共に、それが作動可能に連結されるエキソドメイン
からの対応する活性化シグナルの非存在下で、細胞にシグナルを伝達する膜貫通を指す。
特定の実施形態では、膜貫通ドメインがホモ二量体化を引き起こすかまたは促進する１つ
以上の突然変異を含む。

特定の場合において、膜貫通ドメインは受容体に機能的立体配置を与えて、自己活性化
を可能にし、例えば、シグナル伝達を導く様式で、下流エンドドメインが互いに対して配
向されることを可能にし、例えば、エンドドメインと会合したヤヌスキナーゼが互いに相
互作用し、互いに交差活性化することを可能にする。特定の局面において、膜貫通ドメイ
ンは、膜貫通ドメインおよびエンドドメインが自然には作用しない場合、非一過性の様式
で一緒に作用することを可能にするような、１つまたは複数の変異を含む。少なくともい
くつかの局面において、変異は、膜貫通および外部ドメインを人工的にホモ二量体化する
ことを可能にする。例えば、膜貫通ドメインは、それぞれが膜貫通ドメインおよび少なく
とも１つのエンドドメインを含む２つの別個の分子のホモ二量体化を可能にする１つ以上
の変異を含んでもよく、このような分子のホモ二量体化は天然では起こらない。特定の実
施形態では、膜貫通ドメインにおける１つまたは複数の突然変異は、例えば受容体ホモダ
イマーの膜貫通ドメインおよびエンドドメインの構造的ねじれを誘導して、自己活性化ら
せん構造を形成する。特定の実施形態において、膜貫通ドメインにおける１つ以上の変異
は、受容体分子（またはその１つ以上の成分）の一部または全部の、垂直軸の周りのらせ
ん状のねじれを誘導する。特定の変異が、膜貫通ドメインおよびエンドドメインが自己活
性化するような構造的立体配置を誘導するか否かは、通常の方法（例えば、増殖因子の非
存在下で、試験される特定の受容体を有する細胞を増殖させた後のＳＴＡＴ３またはＳＴ
ＡＴ５リン酸化についてアッセイする）を用いて決定され得る。

特定の実施形態では、そのような１つ以上の機能獲得突然変異を有する膜貫通ドメイン
成分が本開示の方法および組成物において使用され得る。突然変異は例えば、置換、挿入
、欠失、またはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、１つ以上の突然変
異が少なくとも１つのシステインおよび／または少なくとも１つのプロリンの含有を含む
。いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインにおける機能獲得変異と
して腫瘍患者において同定された変異を利用する。少なくともいくつかの場合において、
変異体バージョンは、膜貫通ドメインにおけるジスルフィド結合形成を誘導するシステイ
ン挿入を含む。しかし、他の実施形態において、１つ以上の変異は、システインの挿入を
欠く。例えば、突然変異が膜貫通ドメインの天然バージョンと比較して膜貫通ドメインを
コンフォメーション的に変化させ、それによってシグナル伝達の誘導を可能にするため、
依然としてシグナルを伝達し、構成的に活性であるシステイン挿入を有さない（したがっ
て、ジスルフィド結合を有さない）膜貫通誘導体を利用することができる。例えば、プロ
リンのようなアミノ酸の挿入は膜貫通ドメインをねじる「キンク」を生じ、これは、シグ
ナル伝達を誘導する（例えば、Shochatら、2011, J Exp Med.2011 May 9;208(5):901-8;
Zenatti et al., 2011, Nat Genet. 2011年9月4日;43(10): 932-9を参照のこと）。

特定の実施形態では膜貫通ドメインがＩＬ－７Ｒα受容体由来であり、膜貫通ドメイン
における変異は配列PILLTISILSFFSVALLVILACVLW（配列番号１）にある。特定の実施形態
では、突然変異が配列番号のアミノ酸配列への１つ以上のシステインおよび／または１つ
以上のプロリンの挿入であるか、またはそれを含む。ここで、突然変異は受容体のホモ二
量体化を可能にするまたは促進する。ある場合には、突然変異がシステイン、プロリン、
トレオニン（ＣＰＴ）の三量体ペプチドの膜貫通ドメインへの挿入を含む。このような突
然変異は２つの分子（例えば、２つのＩＬ７ＲＰ２受容体α鎖）のシステイン残基の－Ｓ
Ｈ（チオール）基間にジスルフィド結合形成を付与し、ホモ二量体をそれらの間に形成さ
せる（特定の実施形態では、システインの直後のプロリンがホモ二量体を正しい配向にね
じるのを助ける）。特定の実施形態ではＣＰＴ挿入のトレオニンがトレオニンではなく別
のアミノ酸であり、少なくとも特定の場合、他のアミノ酸はシステインまたはプロリンで
あるか、またはシステインまたはプロリンでない。

１つ以上のアミノ酸が受容体における使用のために配列番号１に挿入される実施形態に
おいて、挿入は、配列番号１の任意の２つのアミノ酸の間であり得る。特定の実施形態で
は、挿入が配列番号の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０
、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０
、第２１、第２２、第２３または第２４のアミノ酸の後に位置する。

本明細書中に記載される例示的な構築物（Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２）において使用される
変異したＴＭ配列の例（ここで、配列は、下記の下線配列の付加によって変異される）は
以下の通りである。
PILLTCPTISILSFFSVALLVILACVLW （配列番号２）
他の構成的に活性なＩＬ－７受容体における変異ＴＭ配列1. PILNPCLTISILSFFSVALLVIL
ACVLW (配列番号３)2. PTCLTISILSFFSVALLVILACVLW (配列番号４)3. PSANCGAISILSFFSVAL
LVILACVLW (配列番号５)4. PILLVSCPTISILSFFSVALLVILACVLW (配列番号６)5. PILLIISI
QWLSFFSVALLVILACVLW (配列番号７)6. NSPSCLTISILSFFSVALLVILACVLW (配列番号８)7. PC
LEGLTISILSFFSVALLVILACVLW (配列番号９)8. PILLTISILSFFWNLLVILACVLW (配列番号１０)
9. RFCPHISILSFFSVALLVILACVLW (配列番号１１)10. IKCILSFFSVALLVILACVLW (配列番号１
２)11. PIFHPFNCGPISILSFFSVALLVILACVLW (配列番号１３)12. PILLMCPTISILSFFSVALLVILA
CVLW (配列番号１４)13. PILLTISILSFFSGPSLALLVILACVLW (配列番号１５)14. PILRLGCVTI
SILSFFSVALLVILACVLW (配列番号１６)15. PIPQGGCILSFFSVALLVILACVLW (配列番号１７)16
. LQSCILSFFSVALLVILACVLW (配列番号１８)17. PIFPHQHCTISILSFFSVALLVILACVLW (配列番
号１９)18. PILLTISKCHLSFFSVALLVILACVLW (配列番号２０)19. PILLTCHLISILSFFSVALLVIL
ACVLW (配列番号２１)20. PIFSCGPLTISILSFFSVALLVILACVLW (配列番号２２)21. PILLPPCL
TISILSFFSVALLVILACVLW (配列番号２３)22. PILLTPPVCSVTISILSFFSVALLVILACVLW (配列番
号２４)

特定の実施形態において、１つ以上の膜貫通ドメイン変異は二量体化アルファ鎖（例示
的なＩＬ－７Ｒαについて）を構造的に改変して、結合したヤヌスキナーゼが近接するよ
うに自身を配向させ、交差リン酸化および活性化を可能にし；このような構造的改変は特
定の実施形態において、二量体化鎖のねじれに由来する（Ｓｈｏｃｈａｔら、２０１１；
Ｄｕｒｕｍ、２０１４）。

特定の実施形態では、膜貫通ドメインがその対応する野生型成分と比較して１つ以上の
突然変異を含み、その対応する野生型のコンポーネントと比較して一定のパーセント同一
性を有する。特定の場合において、膜貫通ドメインは、対応する野生型膜貫通ドメインと
少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４
、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である。

膜貫通は任意の適切な長さであり得るが、特定の実施形態では２１、２２、２３、２４
、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３アミノ酸の長さである
。

Ｃ．エンドドメイン
構成的に活性なサイトカイン受容体は、１つ以上のエンドドメインを含む。エンドドメ
インは膜貫通ドメインと同じ分子に由来する場合もあるが、そうでない場合もある。特定
の実施形態では、エンドドメインが免疫刺激性サイトカイン受容体を含むサイトカイン受
容体に由来する。特定の実施形態では、サイトカイン受容体は、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ３
などを含むシグナル伝達経路において作用する。本開示の受容体に有用な免疫刺激性サイ
トカインエンドドメインとしては、例えば、ＩＬ－７Ｒａ受容体α、ＣＤ１２２（ＩＬ－
２およびＩＬ－１５の共通受容体β）、ＩＬ－２１受容体α、ＩＬ－２３受容体α、およ
びＩＬ－１２受容体α、およびＩＬ－６受容体が挙げられる。

いくつかの実施形態では、エンドドメインが所望の下流経路に基づいて選択される。例
えば、エンドドメインは、ＪＡＫ１、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ４、ＪＡＫ３、ＳＴＡＴ３な
どを介して送信されるべき信号に対する要望に基づいて選択され得る。

ある場合には、シグナル伝達経路はＳＴＡＴ５を含む。ＳＴＡＴ５は免疫刺激性サイト
カインＩＬ－１５およびＩＬ－７の主要な下流シグナル伝達ノードであり、いずれも免疫
療法の状況においてＴ細胞を活性化するのに有用であることが知られている。いくつかの
刊行物はサイトカインおよびサイトカイン受容体相互作用を迂回し、ＳＴＡＴ５を直接活
性化する（構成的に活性なＳＴＡＴ５突然変異体を用いる）と、ＣＤ８ Ｔ細胞機能が、
前臨床モデルを用いてｉｎ ｖｉｖｏでの持続性の増加およびｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍
効果の増強を介して増強されることを既に示している。同じ概念は、ＩＬ－１２の下流に
あるＳＴＡＴ４などの他の既知の免疫刺激サイトカインの下流でＳＴＡＴタンパク質を活
性化することに拡張することができる。

特定の実施形態ではエンドドメインがＩＬ７受容体α鎖由来のエンドドメインを含み、
これは１つ以上の突然変異を含んでも含まなくてもよい。特定の場合において、それは、
ホモ二量体化を引き起こすかまたは促進することを可能にする変異を含む膜貫通ドメイン
に作動可能に連結される。

いくつかの実施形態では、エンドドメインが特定の長さのものである。特定の実施形態
では、エンドドメインの長さは、７０～２５０アミノ酸、７０～２２５アミノ酸、７０～
２００アミノ酸、７０～１７５アミノ酸、７０～１５０アミノ酸、７０～１２５アミノ酸
、７０～１００アミノ酸、８０～２５０アミノ酸、８０～２２５アミノ酸、８０～２００
アミノ酸、８０～１７５アミノ酸、８０～１５０アミノ酸、８０～１００アミノ酸、９０
～２５０アミノ酸、９０～２２５アミノ酸、９０～２００アミノ酸、９０～１７５アミノ
酸、９０～１５０アミノ酸、９０～１２５アミノ酸、９０～１００アミノ酸、１００～２
５０アミノ酸、１００～２２５アミノ酸、１００～２００アミノ酸、１００～１７５アミ
ノ酸、１００～１５０アミノ酸、１００～１２５アミノ酸、１２５～２５０アミノ酸、１
２５～２２５アミノ酸、１２５～２００アミノ酸、１２５～１７５アミノ酸、１２５～１
５０アミノ酸、１５０～２５０アミノ酸、１５０～２２５アミノ酸、１５０～２００アミ
ノ酸、１５０～１７５アミノ酸、１７５～２５０アミノ酸、１７５～２２５アミノ酸、１
７５～２００アミノ酸、２００～２５０アミノ酸、２００～２２５アミノ酸などである。
特定の実施形態において、特定の長さのこれらのフラグメントは、シグナル伝達活性を保
持する。

ＩＩＩ 操作されたサイトカイン受容体を含む細胞

さらに、本開示の医薬組成物は、操作された受容体をコードするベクターで形質転換ま
たはトランスフェクトされたものなどの構成的に活性なサイトカイン受容体を発現する宿
主細胞を含むことが想定される。宿主細胞は、受容体をコードするベクターを導入するこ
とによって産生され得る。宿主細胞に導入された操作された受容体をコードする核酸分子
またはベクターは、宿主のゲノムに組み込まれ得るか、または染色体外で維持され得る。

宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得るが、特定の実施形態では真核細胞
である。特定の実施形態では、宿主細胞が細菌、昆虫、真菌、植物または動物細胞である
。宿主細胞は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞またはヒト細胞系であり得ること
が特に想定される。特に好ましい宿主細胞は免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、また
はＮＫＴ細胞）を含む。

一実施形態では、宿主細胞が操作されたサイトカイン受容体を含むＴ細胞である。場合
によっては、操作されたサイトカイン受容体を発現する細胞が操作されたＴ細胞受容体の
ような別の天然に存在しない分子も発現する。天然に存在するＴ細胞受容体は２つのサブ
ユニット（αサブユニットおよびβサブユニット）を含み、これらの各々は、各Ｔ細胞の
ゲノムにおいて組換え事象によって産生される独特のタンパク質である。ＴＣＲのライブ
ラリーは、特定の標的抗原に対するそれらの選択性についてスクリーニングされ得る。「
操作されたＴＣＲ」は、養子免疫療法に使用されるＴ細胞の集団に選択され、クローン化
され、および／または引き続いて導入される標的抗原に対して高い結合活性および反応性
を有する天然のＴＣＲを指す。場合によっては、操作されたサイトカイン受容体を発現す
る細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ：ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔ
ｏｒ）も発現する。操作されたＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、ＭＨＣ非依存的な様式で
標的抗原に結合するように操作される。特定の実施形態ではＣＡＲが限定されるものでは
ないが、ｓｃＦｖなどの抗体またはその抗原結合フラグメントを含む細胞外結合ドメイン
；膜貫通ドメイン；１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび一次シグナル伝
達ドメインを含む。

ＩＶ 受容体を発現する宿主Ｔ細胞の治療的使用

本明細書に提供される癌を治療する方法は、癌に特異的なＣＡＲを発現する有効量のＴ
細胞を、前記癌を有する個体に投与することを含み、前記ＣＡＲ Ｔ細胞が構成的に活性
なサイトカイン受容体をさらに発現する。より具体的な実施形態では、癌は例えば、膠芽
腫を含む固形腫瘍である。別の特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞が抗原ＧＤ２を標的
とする。より具体的な実施形態では、構成的に活性なサイトカイン受容体がＩＬ－７受容
体αに由来する膜貫通ドメインを含み、膜貫通ドメインはサイトカイン受容体のホモ二量
体化を促進する１つまたは複数の変異を含む。

癌の処置の特定の方法において、細胞は１つ以上の変異を有する膜貫通ドメインを有す
るサイトカイン受容体を含むＴ細胞であり、特定の実施形態では、膜貫通ドメインが配列
番号の配列を含む。特定の実施形態において、処置のためのＴ細胞における膜貫通ドメイ
ンは、配列番号２～配列番号２４のうちの１つの配列を含む。

構成的に活性なサイトカイン受容体を発現する細胞の有効量は、それを必要とする個体
に提供される。個体は特定の場合には癌を有し得るが、他の場合には個体は非癌性疾患の
処置を必要とする。治療有効量の細胞が個体に提供され、そして１回または複数回の投与
で提供され得る。場合によっては、本開示の細胞治療が個体に対して同時に提供されても
されなくてもよい１つ以上の他のタイプの治療に加えて、個体に提供される。

例として、癌患者、または癌に罹患しやすい患者、または癌を有する疑いのある患者は
、本明細書中に記載されるように処置され得る。本明細書に記載のように修飾された免疫
細胞を個体に投与し、長期間保持してもよい。種々の投与経路の１つを利用することがで
きる。いくつかの実施形態において、遺伝的に改変された細胞は免疫認識を阻害するため
にカプセル化され、そして局所的に（例えば、腫瘍の部位で）投与される。

種々の実施形態において、発現構築物、核酸配列、ベクター、宿主細胞および／または
それらを含む医薬組成物は癌性疾患（例えば、腫瘍性疾患）の予防、処置または改善のた
めに使用される。特定の実施形態では、本開示の細胞を含む医薬組成物が例えば、固形腫
瘍を有する癌を含む癌を予防、改善および／または治療するのに特に有用であり得る。

本明細書中で使用される場合、「処置」または「処置」は疾患または病理学的状態の症
状または病理学に対する任意の有益な効果または望ましい効果を含み、そして処置される
疾患または状態（例えば、癌）の１つ以上の測定可能なマーカーにおける最小の減少さえ
含み得る。処置は場合により、疾患または状態の症状の減少または改善、または疾患また
は状態の進行の遅延のいずれかを含み得る。「処置」は、必ずしも、疾患もしくは状態、
またはその関連症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。

本明細書中で使用される場合、「予防する」、および「予防される」、「予防している
」などの類似の単語は疾患または状態（例えば、癌）を予防、阻害、または発生もしくは
再発の可能性を低減するためのアプローチを示す。また、疾患または状態の発症または再
発を遅らせること、または疾患または状態の症状の発生または再発を遅らせることを指す
。本明細書中で使用される場合、「予防」および類似の単語はまた、疾患または状態の発
症または再発前の疾患または状態の強度、効果、症状および／または負担を減少させるこ
とを含む。

本明細書中に記載される方法および組成物は広範囲の免疫細胞（例えば、αβＴ細胞、
γδＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ Ｔ細胞
）、自然リンパ球、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない）に適
用され得る。さらに、本発明の受容体は幹細胞および／または前駆細胞中で発現され得、
これらは続いて、上記の免疫細胞に分化される。さらに、上記の全ての免疫細胞は第２の
遺伝子改変（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（
ＢｉＴＥまたはＴ細胞ＥＮＧ）、二重アフィニティー再標的化（ＤＡＲＴ）タンパク質、
またはαβＴ細胞受容体）を有する腫瘍細胞に再指向され得るが、これらに限定されない
。特定の実施形態では、細胞が上記で定義したようなＣＡＲ発現免疫細胞、または腫瘍を
標的とする抗原特異的免疫細胞（例えば、ウイルス特異的Ｔ細胞、または腫瘍抗原特異的
Ｔ細胞）である。構成的に活性なサイトカイン受容体発現細胞がＣＡＲも発現する例にお
いて、ＣＡＲは、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）、ＧＤ２、Ｇｌｙｐ
ｉｃａｎ－３、５Ｔ４、８Ｈ９、α_ｖβ_６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）
Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ軽
鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ
７０、ＣＤ９６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＬＬ－１、ＣＳＰＧ
４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、Ｅ
ＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、葉酸受容体α、Ｇ
Ｄ２、ＧＤ３、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ
、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣ
ＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＲＯ
Ｒ１、Ｓｐ１７、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ８、Ｔｎ－Ｏ－グリコペプチド、ＶＥＧＲＲ２、癌
胎児性抗原、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＶＥＧＦ受容体、ＴＳＨＲ、ＣＳ－１、ＣＭＡ、Ｔｎ Ａ
ｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＦＬＴ３、ＣＤ４４ｖ６、ＫＩＴ、インターロイ
キン－１１受容体ａ（ＩＬ－ｌｌＲａ）、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２４、血小
板由来増殖因子受容体－β（ＰＤＧＦＲ－β）、ＳＳＥＡ－４、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／
ｎｅｕ）、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体
、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコ
シルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ
１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、
ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、Ｕ
ＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２
、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａｌ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ
７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、
ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、ｐｒ
ｏｓｔｅｉｎ、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、
ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ
、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受
容体、サイクリンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ
、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ
－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、
ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、
ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰ
Ｃ３、ＦＣＲＬ５、ｌＧＬＬ１、および／または、フィブロネクチン、テネイシン、また
は壊死領域の癌胎児性領域および他の腫瘍関連抗原のような腫瘍の細胞外マトリックス内
に存在する他の例示的な抗原、もしくは例えば腫瘍のゲノム解析および／または差次的発
現研究を通して同定される実用的変異のような、腫瘍の細胞外マトリックス内に存在する
例示的な抗原などの任意の腫瘍抗原に対するものであり得る。

また、個体における癌を処置する方法であって、該癌が腫瘍抗原を発現し、（１）該腫
瘍抗原を標的とするキメラ抗原受容体、および（２）構成的に活性なサイトカイン受容体
、を発現する免疫細胞を該個体に投与する工程を包含する方法が、本明細書中に提供され
る。前記構成的に活性なサイトカイン受容体は、本明細書に包含される構成的に活性なサ
イトカイン受容体のいずれであってもよい。特定の実施形態では、構成的に活性なサイト
カイン受容体が、インターロイキン－７（ＩＬ－７）受容体エンドドメインと、サイトカ
イン受容体が構成的に活性であるようにサイトカイン受容体のホモ二量体化を促進する膜
貫通ドメインとを含む。特定の実施形態では、構成的に活性なサイトカイン受容体がイン
ターロイキン－２１（ＩＬ－２１）受容体エンドドメインと、サイトカイン受容体が構成
的に活性であるようにサイトカイン受容体のホモ二量体化を促進する膜貫通ドメインとを
含む。特定の実施形態では、構成的に活性なサイトカイン受容体がインターロイキン－２
３（ＩＬ－２３）受容体エンドドメインと、サイトカイン受容体が構成的に活性であるよ
うにサイトカイン受容体のホモ二量体化を促進する膜貫通ドメインとを含む。特定の実施
形態では、構成的に活性なサイトカイン受容体がインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）
受容体エンドドメインと、サイトカイン受容体が構成的に活性であるようにサイトカイン
受容体のホモ二量体化を促進する膜貫通ドメインとを含む。特定の実施形態では、膜貫通
ドメインが配列番号１～２４のいずれかの配列を含む。前述のいずれかの特定の実施形態
では、構成的に活性なサイトカイン受容体が、対応するサイトカインが細胞外ドメインに
結合した場合にシグナルを伝達しない細胞外ドメインを含む。例えば、より具体的な実施
形態では、構成的に活性なサイトカイン受容体はＩＬ－７受容体エンドドメインを含み、
対応するサイトカインはＩＬ－７である。前述のいずれかの特定の実施形態において、構
成的に活性なサイトカイン受容体は、ＣＤ３４由来の細胞外ドメインである細胞外ドメイ
ンを含む。前述のいずれかの別の特定の実施形態では、構成的に活性なサイトカイン受容
体がＰＤ－１またはＢ７由来の細胞外ドメインである細胞外ドメインを含む。

本明細書において提供される治療方法のいずれかの特定の実施形態では、癌は膠芽腫で
ある。本明細書中で提供される方法の特定の具体的な実施形態では、癌は乳癌、前立腺癌
、肺癌（例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌）、脳腫瘍、結腸癌、頭頸部癌、皮膚癌
（例えば、黒色腫）、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、腎臓癌、胃癌、小腸癌、肝臓癌、
膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、食道癌、唾液腺癌または甲状腺癌である。

本明細書に提供される方法のいずれかの特定の実施形態では、腫瘍抗原はＧＤ２である
。本明細書で提供される方法のいずれかの別の具体的な実施形態では、腫瘍抗原はＥｐｈ
Ａ２である。本明細書で提供される方法の他の具体的な実施形態では、腫瘍抗原がＥｐｈ
Ａ３、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）、ＧＤ２、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖ
β６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ） Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、
ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、
ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ９６、ＣＤ１２３、ＣＤ１
３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＬＬ－１、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｅ
ＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、
ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、葉酸受容体α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧ
Ｅ Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、Ｌａｍｂｄａ、Ｌｅｗｉｓ－Ｙ、Ｍ
ＣＳＰ、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド
、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＲＯＲ１、Ｓｐ１７、ＴＡＧ７
２、ＴＥＭ８、Ｔｎ－Ｏ－グリコペプチド、ＶＥＧＦＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ－ＭＡ
Ａ、ＶＥＧＦ受容体、ＴＳＨＲ、ＣＳ－１、ＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（
ＰＳＭＡ）、ＦＬＴ３、ＣＤ４４ｖ６、ＫＩＴ、インターロイキン１１受容体ａ（ＩＬ－
ｌ ｌＲａ）、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ２４、血小板由来成長増殖因子受容体
－β（ＰＤＧＦＲ－β）、ＳＳＥＡ－４、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、プロスター
ゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２
、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、
ＧＭ３、ＴＧＳ５、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥ
Ｍ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１ 、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬ
Ｋ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１ 、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣ
Ｒ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ
１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａｌ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６，Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａ
ｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１
、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、ｐｒｏｓｔｅｉｎ、サ
バイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／Ｍ
ＡＲＴ１、Ｒａｓ 変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭ
ＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリ
ンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、
ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロ
メラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ
７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、
ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ
５、またはｌＧＬＬ１である。

いくつかの実施形態において、構成的に活性なサイトカイン受容体発現細胞は、癌以外
に、リンパ球療法が治療的である別の疾患である感染性疾患、自己免疫疾患、ならびに固
形臓器および幹細胞移植後の合併症を含むがこれらに限定されない、別の疾患を含む医学
的状態のために個体に提供される。このような場合、Ｔ細胞は増強された拡大を有するこ
とが望ましく、したがって、構成的に活性なサイトカイン受容体分子は癌適応のためのも
のと同一または類似であるが、細胞は非悪性適応を標的化するために特異的に改変され得
る。個体が自己免疫疾患を有する実施形態において、例えば、細胞は例えば、抗原として
自己反応性Ｔ細胞を使用し（OPEXA Therapeutics; The Woodlands, TXにおけるように）
自己反応性Ｔ細胞に対してそれらのＴＣＲを介して広く特異的であり得る。

特定の実施形態では、本開示が部分的に、単独でまたは別の治療との任意の組み合わせ
のいずれかで投与され得る発現構築物、核酸分子、および／またはベクター、ならびに少
なくともいくつかの態様において、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と一緒に投
与され得る発現構築物、核酸分子、および／またはベクターを有する細胞を企図する。特
定の実施形態では、細胞の投与前に、前記核酸分子またはベクターを細胞のゲノムに安定
に組み込んでもよい。特定の実施形態では、特定の細胞または組織に特異的であり、前記
細胞中に存続するウイルスベクターが使用され得る。適切な医薬担体および賦形剤は、当
技術分野で周知である。本開示に従って調製された組成物は、上記で同定された疾患の予
防または処置または遅延のために使用され得る。

さらに、本開示は癌性（腫瘍を含む）疾患の予防、治療または改善のための方法であっ
て、それを必要とする被験体に、構成的に活性なサイトカイン受容体、それらをコードす
る核酸配列、それらをコードするベクター（単数または複数）を含む有効量の細胞を、本
明細書で企図されるように、および／または本明細書で企図される方法によって産生され
るように、投与する工程を含む方法に関する。

例示的な改変免疫細胞の組成物の投与のための可能な適応症は、癌性疾患（乳癌、前立
腺癌、肺癌、脳腫瘍、結腸癌、頭頸部癌、皮膚癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、腎臓
癌、肺癌、胃癌、小腸癌、肝臓癌、膵臓癌、胆嚢癌、胆管癌、食道癌、唾液腺癌および甲
状腺癌、ならびにＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および骨髄細胞またはそれらの前駆体の血液
学的悪性腫瘍を含む）である。細胞の組成物の投与の例示的な適応症は例えば、受容体発
現細胞が標的とする抗原を発現する細胞を有する任意の悪性腫瘍を含む、癌性疾患である
。さらに、それは、他の腫瘍抗原を異常に発現する悪性腫瘍を含み、それらもまた標的化
され得る。本開示の組成物の投与は例えば、最小残存疾患、早期癌、進行癌、および／ま
たは転移癌および／または難治性癌を含む、あらゆる段階および型の癌に有用である。

本開示は免疫細胞を介して作用する他の化合物、例えば、二重特異性抗体構築物、標的
毒素または他の化合物との同時投与プロトコルをさらに含む。本発明の化合物の同時投与
のための臨床レジメンは、他の成分の投与と同時、前および／または後における同時投与
を包含し得る。特定の併用療法には、化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法、また
は他のタイプの免疫療法が含まれる。

実施形態は、本明細書に記載の１つ以上の免疫細胞、本明細書に記載の核酸配列、本明
細書に記載のベクター、および／または本明細書に記載の宿主を含むキットに関する。ま
た、本開示のキットは、単独で、または医療処置または介入を必要とする個体に投与され
るさらなる薬剤と組み合わせて、本明細書において上記した医薬組成物を含むことが企図
される。

次いで、構築物（単数または複数）で修飾された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ
細胞）を選択的条件下（場合によってのみ）で培養して増殖させることができ、次いで、
構築物を有するものとして選択された細胞を、例えば、宿主細胞中の構築物（単数または
複数）の存在を決定するためのポリメラーゼ連鎖反応を使用して、増殖させ、さらに分析
することができる。改変された宿主細胞が同定された後、それらは、次いで、計画された
ように使用され得、例えば、培養において拡大され得るか、または宿主生物に導入され得
る。

細胞の性質に依存して、細胞は多種多様な方法で、宿主生物（例えば、哺乳動物）に導
入され得る。細胞は腫瘍の部位に導入され得るが、代替の実施形態では、細胞が癌にホー
ミングするか、または癌にホーミングするように改変される。使用する細胞の数は多くの
状況、導入の目的、細胞の寿命、使用するプロトコル、例えば、投与回数、細胞の増殖能
力、組換え構築物の安定性などに依存する。細胞は分散体として適用され得、一般的に、
目的の部位またはその近くに注射されるか、または静脈内に送達され得る。細胞は、生理
学的に許容される培地中にあってもよい。

投与経路としては、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、局所または皮内投与が挙
げられる。場合によっては、特定の投与量の細胞（例えば、総細胞数１０^４～１０^１１の
細胞）が個体に提供される。具体的な実施形態では、１×１０^５細胞／ｋｇ～１×１０^９
細胞／ｋｇの用量が用いられ得る。特定の用量には、１×１０^６細胞／ｍＬ～１×１０^８
細胞／ｍＬが含まれる。

ベクターの導入は、必ずしも全ての場合にインテグレーションをもたらす必要はない。
状況によっては、導入されたＤＮＡの一過性の維持で十分であり得る。このようにして、
細胞が宿主に導入され、次いで、所定の時間の後、例えば、細胞が特定の部位にホーミン
グできた後、オンにされ得る短期間の効果を有し得る。

この系は発現の効率、発現産物の活性、患者の特定の必要性（これは時間および環境と
ともに変化し得る）、細胞の損失または個々の細胞の発現活性の結果としての細胞活性の
損失の速度などの変数に供され得ることが理解されるべきである。したがって、個々の患
者ごとに、個々の患者に対する適切な投薬量について各患者をモニターすることが予想さ
れ、患者をモニターするそのような実施は、当該技術分野において日常的である。

Ｖ ベクター全般

本開示のベクターは構成的に活性なサイトカイン受容体を産生し、そして少なくともい
くつかの場合において発現させるための組換え工学のために使用され得る。

用語「ベクター」は、その中で核酸配列を、そこで細胞が複製できる該細胞への導入の
ために挿入することができるキャリアー核酸分子をいうのに用いられる。核酸配列は「外
因性」であり得、これはベクターが導入されている細胞に対して外来性であること、また
は配列が細胞中の配列に相同であるが、配列が通常は見出されない宿主細胞核酸内の位置
にあることを手段する。ベクターには、プラスミド、コスミド、トランスポゾン、ウイル
ス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および人工染色体（例
えば、ＹＡＣ）が含まれる。標準的な組換え技術によってベクターを構築するために当業
者は十分に備えられているであろう（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ、１９８８
およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ、１９９４（両方とも参照により本明細書に組み込ま
れる）を参照のこと）。

用語「発現ベクター」は、転写され得るＲＮＡをコードする核酸を含む任意のタイプの
遺伝子構築物を指す。いくつかの場合において、次いで、ＲＮＡ分子を蛋白質、ポリペプ
チドまたはペプチドに翻訳する。他の場合において、これらの配列は例えば、アンチセン
ス分子またはリボザイムの産生において翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主細胞
における作動可能に連結されたコード配列の転写および場合によっては翻訳に必要な核酸
配列を指す、種々の「制御配列」を含み得る。転写および翻訳を支配する対照配列に加え
て、ベクターおよび発現ベクターは同様に他の機能を発揮し、かつ後に記載された核酸配
列を含有することができる。

「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配
列である。それは、核酸配列の特異的転写を開始するために、ＲＮＡポリメラーゼおよび
他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る遺伝子エレメントを含み得る
。「作動可能に位置付けられる」、「作動可能に連結される」、「制御下にある」、およ
び「転写制御下にある」という語句は、プロモーターがその配列の転写開始および／また
は発現を制御するために、核酸配列に関して正しい機能的位置および／または配向にある
ことを意味する。

プロモーターは一般に、ＲＮＡ合成の開始部位を位置決めするように機能する配列を含
む。この最もよく知られた例はＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいく
つかのプロモーター、例えば、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
遺伝子のプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターでは開始部位自体の上に
重なる別個のエレメントが開始位置を固定するのに役立つ。さらなるプロモーターエレメ
ントは転写開始の頻度を調節する。典型的にはこれらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流
の領域に位置するが、多くのプロモーターは開始部位の下流にも機能的エレメントを含む
ことが示されている。コード配列をプロモーターの「制御下に置く」ために、転写リーデ
ィングフレームの転写開始部位の５’末端を、選択されたプロモーターの「下流」（すな
わち、プロモーターの３’）に位置付ける。「上流」プロモーターはＤＮＡの転写を刺激
し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。

プロモーターエレメント間の間隔はしばしば柔軟であり、その結果、エレメントが互い
に対して反転されるかまたは移動される場合にプロモーター機能は維持される。プロモー
ターに依存して、個々のエレメントは、協同的にまたは独立して機能して、転写を活性化
するように機能し得ると思われる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシ
ス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と組み合わせて用いても、用いなくてもよい。

プロモータはコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’－非コー
ド配列を単離することによって得られ得るように、核酸配列と天然に結合したものであり
得る。このようなプロモーターは、「内因性」と称され得る。同様に、エンハンサーは、
その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に会合したものであり
得る。あるいはコード核酸セグメントを、組換えまたは異種プロモーター（これはその天
然環境において核酸配列と通常結合しないプロモーターをいう）の制御下に配置すること
によって、特定の利点が得られであろう。組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーは
また、その天然環境において核酸配列と通常結合していないエンハンサーも指す。このよ
うなプロモーターまたはエンハンサーは他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、
および任意の他のウイルス、または原核細胞もしくは真核細胞から単離されたプロモータ
ーまたはエンハンサー、ならびに「天然に存在する」、すなわち、異なる転写調節領域の
異なるエレメントを含有しない、および／または発現を変化させる変異を含むプロモータ
ーまたはエンハンサーを含み得る。

当然ながら、発現のために選択されたオルガネラ、細胞型、組織、器官、または生物に
おけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指向するプロモーターおよび／またはエンハン
サーを使用することが重要であろう。分子生物学の当業者は一般に、タンパク質発現のた
めのプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組み合わせの使用を知っている（例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと
）。用いられるプロモーターは、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模産生
において有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指向するため
の適切な条件下で、構成的、組織特異的、誘導性、および／または有用であり得る。プロ
モーターは、異種または内因性であり得る。

組織特異的プロモーターまたはエレメントの同一性、ならびにそれらの活性を特徴付け
るためのアッセイは、当業者に周知である。特定の実施形態では、低酸素特異的調節エレ
メントなどの環境特異的プロモーターまたはエレメントが利用される。組織特異的、系統
特異的、および／または活性化特異的プロモーターを用いることができ、例としては、活
性化Ｔ細胞エレメント、ＮＦＡＴ（系統限定活性化）、早期成長応答遺伝子（活性化）、
肝臓Ｘ受容体応答エレメント（活性化）、低酸素応答エレメント（環境）などが挙げられ
る。

ベクターは複数の制限酵素部位を含む核酸領域である多重クローニング部位（ｍｕｌｔ
ｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）（ＭＣＳ）を含み得、そのいずれもが、ベクター
を消化するための標準的な組換え技術と組み合わせて使用され得る。「制限酵素消化」と
は、核酸分子の特定の位置のみで機能する酵素による核酸分子の触媒的切断をいう。これ
らの制限酵素の多くは市販されている。このような酵素の使用は、当業者によって広く理
解される。しばしば、ベクターは外因性配列がベクターに連結されることを可能にするた
めに、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を使用して、線状化またはフラグメント化される。「
ライゲーション」は、互いに隣接していても隣接していなくてもよい２つの核酸フラグメ
ント間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを指す。制限酵素およびライゲーショ
ン反応を含む技術は、組換え技術の当業者に周知である。

スプライシング部位、終結シグナル、複製起点、および選択マーカーもまた使用され得
る。

特定の実施形態において、プラスミドベクターは、宿主細胞を形質転換するための使用
が意図される。一般に、宿主細胞と適合する種由来のレプリコンおよび制御配列を含むプ
ラスミドベクターは、これらの宿主と組み合わせて用いられる。ベクターは、通常、複製
部位、および形質転換細胞において表現型選択を提供し得るマーキング配列を有する。

さらに、宿主微生物と適合性であるレプリコンおよび制御配列を含むファージベクター
は、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、λファージ
ＧＥＭＴＭ１１は宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２）を形質転換するために
使用され得る組換えファージベクターを作製する際に利用され得る。

発現ベクターを含む細菌宿主細胞、例えば大腸菌を、任意の数の適切な培地、例えばＬ
Ｂで増殖させる。特定のベクターにおける組換えタンパク質の発現は当業者によって理解
されるように、宿主細胞を特定のプロモーターに特異的な薬剤と接触させることによって
、例えば、ＩＰＴＧを培地に添加することによって、またはインキュベーションをより高
い温度に切り替えることによって、誘導され得る。

Ｄ．ウイルスベクター
ある種のウイルスが受容体を介したエンドサイトーシスを介して細胞に感染したり、細
胞に侵入したりし、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に
発現する能力により、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に導入する魅力的な候補
となった。本開示の構成要素は、ヘパラナーゼをコードするウイルスベクターであり得る
。本開示の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例は、以下
に記載される。

１．アデノウイルスベクター
核酸の送達のための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノ
ウイルスベクターはゲノムＤＮＡへの組込みについて低い能力を有することが知られてい
るが、この特徴はこれらのベクターによって提供される遺伝子導入の高い効率によって相
殺される。「アデノウイルス発現ベクター」は（ａ）構築物のパッケージングを支持し、
そして（ｂ）その中にクローニングされた組織または細胞特異的構築物を最終的に発現す
るのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。３６ｋｂの直鎖状
二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝的構成の知識は、７ｋｂまでの外来配
列によるアデノウイルスＤＮＡの大きな断片の置換を可能にする（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ａ
ｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。

２．ＡＡＶベクター
核酸は、アデノウイルス支援トランスフェクションを用いて細胞に導入することができ
る。アデノウイルス結合系を使用する細胞系において、トランスフェクション効率の増加
が報告されている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ、１９９４； Ｃｏｔｔｅｎ ｅ
ｔ ａｌ、１９９２； Ｃｕｒｉｅｌ、１９９４）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は高
頻度の組込みを有し、非分裂細胞に感染し得るので、本開示の細胞において使用するため
の魅力的なベクター系であり、したがって、例えば、組織培養（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９
９２）またはインビボにおいて、哺乳動物細胞への遺伝子の送達に有用である。ＡＡＶは
、感染性について広い宿主範囲を有する（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ、１９８４；
Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ、１９８６； Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ、１９
８８； ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ、１９８８）。ｒＡＡＶベクターの生成およ
び使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号および第４，７９７，３６８号
に記載されており、各々が参照により本明細書に組み込まれる。

３．レトロウイルスベクター
レトロウイルスはそれらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来遺伝物質を移入
し、広範囲の種および細胞型に感染し、そして特殊な細胞系にパッケージングされるそれ
らの能力のために、送達ベクターとして有用である（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２）。

ヘパラナーゼレトロウイルスベクターを構築するために、核酸（例えば、ヘパラナーゼ
の一部または全部をコードする核酸）を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノム
に挿入して、複製欠損ウイルスを生成する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ
、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージ
ング細胞株を構築する（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ、１９８３）。ｃＤＮＡを含む組換えプラ
スミドがレトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共に（例えば、リン酸カルシ
ウム沈殿によって）特別な細胞系に導入される場合、パッケージング配列は組換えプラス
ミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子にパッケージングされることを可能にし、次いで、ウ
イルス粒子は培養培地に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９
８８； Ｔｅｍｉｎ、１９８６； Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、組換えレトロウイ
ルスを含有する培地を集め、所望により、濃縮し、遺伝子導入のために用いる。レトロウ
イルスベクターは広く種々の細胞型に感染することができる。しかし、組込みおよび安定
な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ、１９７５）。

レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ
、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節機能または構造機能を有する他の遺伝子を含む。
レンチウイルスベクターは当該分野で周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉら、１９９６
； Ｚｕｆｆｅｒｙら、１９９７； Ｂｌｏｍｅｒら、１９９７；米国特許第６，０１３
，５１６号および５，９９４，１３６号を参照のこと）。レンチウイルスのいくつかの例
には、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２およびサル免疫不全ウイルスＳＩＶ
が含まれる。レンチウイルスベクターはＨＩＶ毒性遺伝子を多重弱毒化することによって
作製され、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆが欠失され、ベ
クターを生物学的に安全にする。

組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染し得、そしてｉｎ ｖｉｖｏおよ
びｅｘ ｖｉｖｏの両方の遺伝子導入および核酸配列の発現のために使用され得る。例え
ば、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、ならびにｒｅｖおよ
びｔａｔを有する２つ以上のベクターで適切な宿主細胞がトランスフェクトされる、非分
裂細胞に感染し得る組換えレンチウイルスが、米国特許第５，９９４，１３６号に記載さ
れる。参照により本明細書に組み込まれる。エンベロープタンパク質と、特定の細胞型の
受容体を標的とするための抗体または特定のリガンドとの結合によって、組換えウイルス
を標的とすることができる。目的の配列（調節領域を含む）を、例えば、特定の標的細胞
上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子と共に、ウイルスベクターに挿入す
ると、今度はベクターが、標的特異的になる。

４．その他ウイルスベクター
他のウイルスベクターが、本開示におけるワクチン構築物として使用され得る。ワクシ
ニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８； Ｂａｉｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅ
ｎ、１９８６； Ｃｏｕｐａｒ ｅｔ ａｌ、１９８８）、シンドビスウイルス、サイト
メガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターが使用
され得る。それらは、種々の哺乳動物細胞に対していくつかの魅力的な特徴を提供する（
Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９； Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８； Ｂａｉｃｈｗａｌお
よびＳｕｇｄｅｎ、１９８６； Ｃｏｕｐａｒら、１９８８； Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９
９０）。

Ｅ．ベクター送達および細胞形質転換
細胞のトランスフェクションまたは形質転換のための核酸送達のための適切な方法は、
当業者に公知である。このような方法は限定されるものではないが、ｅｘ ｖｉｖｏトラ
ンスフェクション、注射などによるＤＮＡの直接送達を含む。当該分野で公知の技術の適
用を通して、細胞は、安定して、または一過性に形質転換され得る。

Ｆ．Ｅｘ Ｖｉｖｏ変換
ｅｘ ｖｉｖｏ環境において生物から除去された真核細胞および組織をトランスフェク
トする方法は、当業者に公知である。従って、細胞または組織は、本開示のヘパラナーゼ
または他の核酸を使用して、エキソビボで取り出され得、そしてトランスフェクトされ得
ることが意図される。特定の局面において、移植された細胞または組織は、生物内に配置
され得る。好ましい局面において、核酸は、移植された細胞において発現される。

ＶＩ 併用療法

本開示の特定の実施形態において、臨床的側面のための本開示の方法（例えば、構成的
に活性なサイトカイン受容体を発現する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）のような構成的に活
性なサイトカイン受容体を発現する細胞を有する個体への投与）は個体の医学的状態の処
置において有効な１つ以上の他の薬剤（例えば、抗癌剤を含む過剰増殖性疾患の薬剤）と
組み合わせられ得る。「抗癌」剤は例えば、癌細胞を殺傷すること、癌細胞においてアポ
トーシスを誘導すること、癌細胞の増殖速度を低下させること、転移の発生率または数を
低下させること、腫瘍サイズを減少させること、腫瘍増殖を阻害すること、腫瘍または癌
細胞への血液供給を減少させること、癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進すること
、癌の進行を予防または阻害すること、または癌を有する被験体の寿命を増加させること
によって、被験体において癌に負の影響を及ぼすことができる。より一般的には、これら
の他の組成物が細胞の増殖を殺すかまたは阻害するのに有効な組み合わせ量で提供される
。このプロセスは、癌細胞を発現構築物および薬剤または複数の因子と同時に接触させる
ことを含み得る。これは細胞を、両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的処方物と
接触させることによって、または同時に、細胞を２つの異なる組成物または処方物と接触
させることによって達成され得、ここで、一方の組成物は発現構築物を含み、他方の組成
物は第２の薬剤を含む。

癌を有する個体が併用療法を必要とする、本開示の実施形態において、以下のうちの１
つ以上が、本開示の治療細胞に加えて、個体に提供される：化学療法または他の薬物、ｔ
ｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドなどの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、免疫療
法、放射線療法、手術、ホルモン療法、およびそれらの組み合わせ。免疫療法が個体に提
供される場合、免疫療法は、構成的に活性なサイトカイン受容体発現細胞の一部であって
もなくてもよい。場合によっては、構成的に活性なサイトカイン受容体発現細胞が腫瘍抗
原またはウイルス抗原に結合するなどの、それ自体が個体に対する治療を提供する他の受
容体または分子を含む。

化学療法剤および放射線療法剤に対する腫瘍細胞耐性は、臨床腫瘍学における主要な問
題である。現在の癌研究の目標の１つは、化学療法および放射線療法を他の療法と組み合
わせることによって、化学療法および放射線療法の有効性を改善する方法を見出すことで
ある。本開示の文脈において、細胞治療は、他のアポトーシス促進剤または細胞周期調節
剤に加えて、化学療法介入、放射線療法介入、または免疫療法介入と併せて同様に使用さ
れ得ることが意図される。

本開示の方法および組成物は１つまたは複数の他の薬剤処置の前または後に、数分から
数週間の範囲の間隔で存在し得る。他の薬剤および本開示の薬剤が個体に別々に適用され
る実施形態では一般的に、有意な期間が各送達の時間の間に満了しないことを確実にし、
その結果、薬剤および本発明の治療はなお細胞に有利に組み合わされた効果を発揮し得る
。このような場合、互いに約１２～２４時間以内、より好ましくは互いに約６～１２時間
以内に、両方の様式で細胞を接触させることができると考えられる。状況によっては治療
のための期間を有意に延長することが望ましい場合があるが、それぞれの投与の間に数日
（２、３、４、５、６または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）が
経過する。

治療サイクルは必要であれば反復されると予測される。また、種々の標準的な治療、な
らびに外科的介入が、本発明の細胞治療と組み合わせて適用され得ることが企図される。

別の治療が本開示の細胞と共に提供され、そして一方または両方の複数回の投与が必要
とされる場合、薬剤の投与は、異なる投与経路および異なる時間であり得る。

Ａ．化学療法
癌治療はまた、例えば、化学的および放射線ベースの治療の両方を用いる、種々の組み
合わせ治療を含む。本開示の治療細胞と共に利用され得る化学療法の例としては、例えば
、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデ
スロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アムサクリン；ア
ナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；
アゼテパ；アゾトマイシン。バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン
塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナールナ
トリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド
；カルベティマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；
セデフィンゴル；セレコキシブ（ＣＯＸ－２阻害剤）；クロラムブシル；シロレマイシン
；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタ
ラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デクスホ
ルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジコン；ドセタキセル；ド
キソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；ド
ロモスタノロンプロピオネート；デュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロミチン塩
酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビ
シン塩酸塩；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラヌスチン；エストラムスチン
リン酸ナトリウム、エストルヌスチン。エストラムスチンリン酸ナトリウム。エタニダゾ
ール；エトポシド；エトポシドホスフェート；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザ
ラビン；フェンレチニド；フロクスリジン；フルダラビンホスフェート；フルオロウラシ
ル；フルオロシタビン；フォスキドン;ホストリシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシ
タビン塩酸塩；ヒドロキシウレア；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン
；イプロプラチン；イリノテカン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール
；酢酸ロイプロリド；リアロゾール塩酸塩。ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；
ロキソキサントロン塩酸塩；メソプロコール;メイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸
メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリ
ン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メチュレデパ；ミチ
ンドマイド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン
；ミトスパー；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；
ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパラゲース；
ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルフォスファミド；ピポブロ
マン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポル
フィマーナトリウム；ポルフィロマイシン。プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピ
ューロマイシン；塩酸ピューロマイシン。ピラゾフリン；リボプリン；サフィンゴール；
サフィンゴール塩酸塩；セムスティン；シムトラゼン；スパルホセートナトリウム；スパ
ルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプ
トニグリン；ストレプトゾシン；スルホフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウ
ム；タクソテレ；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テ
ロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；
チラパザミン；クエン酸トレミフェン；トレストロンアセテート；トリシリビンホスフェ
ート；トリメトレキセート；グルクロン酸トリメトレキセート；トリプトレリン；塩酸チ
ューブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫
酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン
；硫酸ビングリシネート；硫酸ビネロウシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；
硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン；２０－
エピ－１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５－エチニルウラシル；アビラテロン；アク
ラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬ
Ｌ－ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチ
ン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール
；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；拮抗薬Ｄ；アンタゴニストＧ；アンタレリック
ス；背側背部形成タンパク質－１；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン；アンチ
ネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシネート；アポ
トーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシスレギュレーター；アプリン酸；ａｒａ－Ｃ
ＤＰ－ＤＬ－ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリ
ムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２； アキシナスタチン３； アザセト
ロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンIII誘導体；バラノール；バチマスタッ
ト；ＢＣＲ／ＡＢＬ拮抗薬；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラク
タム誘導体；β-アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカル
タミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストレンＡ;ビ
ゼレシン；ブレフレート；ブロピリミンブドチタン。ブチオニンスルホキシミン。カルシ
ポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カペシタビン；カルボキサミド
－アミノ－トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ Ｍ３；ＣＡＲ
Ｎ ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カ
スタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリンス
ルホンアミド；シカプロスト；シスポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；
クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コ
ンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クラムベシジン８１６；クリスナトール；クリプ
トフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；キュラシンＡ；シクロペンタアントラキノン
類；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスフェート；細胞溶解因子;サイ
トスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデンミンＢ；デスロレリン；デキ
サメタゾン；デキスフォスファミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオ
ン：ジデムニンＢ；ディドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ－５－アザシチジ
ン；ジヒドロタキソール；９－ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキ
セル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドキソルビシン；ドロロキシフ
ェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルフ
ォシン；エドレコロマブ；エフルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エピス
テリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲン拮抗薬；エタ
ニダゾール；エトポシドホスフェート；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン
；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラス
チン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルニシン塩酸塩；フォルフェニメ
ックス；フォルメスタン；ホストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリ
ン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；
グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；
ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモ
ホシン；イロマスタット；イマチニブ（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ）；イミキモド；免疫刺
激ペプチド；インスリン様成長因子－１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；イ
ンターフェロン；インターロイキン；イオベングアーン；ヨードドキソルビシン；イポメ
アノール；４－イロプラクト；イルグラグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコン
ドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン－Ｎトリアセ
テート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸；レプトルス
タチン；レトロゾール；白血病抑制因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリ
ド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン；レバミゾール；リアロゾール；直
鎖状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７；ロ
バプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロキソ
リビン；ルルトテカン；ルテチウム；テキサフィリン；リゾフィリン；溶解ペプチド；マ
イタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリラ
イシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；マーバロン；メ
テレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミル
テフォシン；ミリモスチム；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミ
トナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子－サポリン；ミトキサントロン；モファ
ロテン；モルグラモスチム；エルビタックス、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリ
ルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；マスタード抗がん剤；マイカ
ペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ－アセチルジナリン
；Ｎ－置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスティップ；ナロキソン＋ペンタゾシン
；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン：ネリドロ
ン酸；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；ニトロキシド酸化防止剤
；ニトルリン；オブリマーセン（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；Ｏ６－ベンジルグ
アニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダン
セトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導剤；オルマプラチン；オ
サテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類
似体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；
パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ぺガスパルガーゼ；
ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフ
ルブロン；ペルフォスファミド。ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；酢酸フェニ
ル；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニル；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレ
キシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤；白金錯
体；白金化合物；白金－トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン
；プレドニゾン；プロピルビス－アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム
阻害剤；プロテインＡに基づく免疫調節剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤；微細藻類；タ
ンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；パ
ープリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン結合体
；ｒａｆ拮抗薬；ラルチトレクセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トラ
ンスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ－ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン
；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ロ
ヒツカイン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビジノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴー
ル；セイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１ミ
メティック；セムスチン；老化誘導阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達
阻害剤；シゾフラン；ソブゾキサン；ボロカプテートナトリウム；フェニル酢酸ナトリウ
ム；ソル
ベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホシン酸；スピカマイシン
Ｄ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクアラミン；スチピア
ミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作用性腸管ペプチドアンタゴ
ニスト；スラディスタ；スラミン；スワインソニン；タリムスチン；タモキシフェンメチ
オジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリ
リウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テニポシド：テトラクロロデカオキシド
；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン
模倣物；チマルファシン；チモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激
ホルモン；スズエチルエチオプルプリン；チラパザミン；チタノセン二塩化物；トプセン
チン；トレミフェン；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン
；トリメトレキセート；トリプトレリン；トロピセトロン；トロステリド；チロシンキナ
ーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメックス；泌尿生殖腺由来成長阻害因
子；ウロキナーゼ受容体拮抗薬；バプレオチド；バリオリンＢ；ベラレゾール；ベラミン
；ベルディン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾ
ール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジノスタチン；およびジノスタチンスチマラマー、ま
たは前述のいずれかの類似体もしくは誘導体の変異体が含まれる。

Ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範に使用されてきた他の因子としては、γ線、Ｘ線、およ
び／または腫瘍細胞への放射性同位体の指向性送達として一般に知られているものが挙げ
られる。マイクロ波およびＵＶ照射のようなＤＮＡ損傷因子の他の型もまた企図される。
最もありそうには、これらの因子の全てはＤＮＡに対する、ＤＮＡの前駆体に対する、Ｄ
ＮＡの複製および修復に対する、および染色体の組立および維持に対する広い範囲の損傷
を行う。Ｘ線についての用量範囲は長時間の（３ないし４週間の）５０～２００レントゲ
ンの一日量から、２０００～６０００レントゲンの単回量の範囲である。放射性同位体に
ついての用量範囲は広く変化し、同位体の半減期、発せられる放射線の強度およびタイプ
、および新生物細胞による取込に依存する。

用語「接触」および「曝露」は細胞に適用される場合、治療薬構築物および化学療法剤
または放射線治療薬剤が標的細胞に送達されるか、または標的細胞と直接並置されるプロ
セスを記載するために、本明細書中で使用される。細胞死滅または停滞を達成するために
、両方の薬剤は、細胞を死滅させるか、または細胞が分裂するのを妨げるのに有効な組み
合わせ量で細胞に送達される。

Ｃ．免疫療法
一実施形態では、構成的に活性なサイトカイン受容体特異的発現細胞以外の免疫療法が
本開示の方法および組成物とともに用いられる。このような治療は、細胞自体であっても
なくてもよい。

免疫療法は一般に、癌細胞を標的とし、破壊するための免疫エフェクター細胞および分
子の使用に依存する。免疫エフェクターは例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカ
ーに特異的な抗体であり得る。抗体は単独で療法のエフェクターとして働くことができる
か、あるいはそれは他の細胞を動員して、細胞殺傷を現実に行うことができる。抗体は薬
物またはトキシン（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラトキシン、１００日咳
トキシン等）にコンジュゲートさせ、単に標的化剤として提供することができる。別法と
して、エフェクターは、直接的にまたは間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を
運ぶリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞には、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞
、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞またはマクロファージが含まれる。

したがって、免疫療法は、本細胞療法と併用した併用療法の一部として用いることがで
きる。組合せ療法のための一般的アプローチは後に議論する。一般に、腫瘍細胞はターゲ
ティングを受けやすい、すなわち、他の細胞の大部分には存在しない何らかのマーカーを
有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれも、本開示の
文脈における標的化に適切であり得る。一般的な腫瘍マーカーには、前立腺特異抗原、尿
中腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦ
Ｇ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニ
ン受容体、ｅｒｂ Ｂ、ｐ１５５、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、黒色腫の優先的発
現抗原（ＰＲＡＭＥ）、サバイビン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ｋ軽鎖、ＣＤ３０
、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥｒｂＢ
二量体、ＥＧＦｒ ｖＩＩＩ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡ
Ｇ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＭＵＣ１
、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ Ｙ
、ＣＬＬ－１、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａ１、ＨＬＡ－Ａ２ Ｎ
Ｙ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣＡ、葉酸受容体－α、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ａｖｂ
６インテグリン、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２
Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、二重抗原、ユニバーサル、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＨＥＲ
２（ＥＲＢＢ２）、ＧＤ２、グリピカン－３、５Ｔ４、８Ｈ９、α_ｖβ_６インテグリン、
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、Ｃ
Ｄ２０、ＣＤ２２、カッパ軽鎖、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０
、ＣＤ９６、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＬＬ－１、ＣＳＰＧ４、
ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、
ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＩＬ１１Ｒａ、ＫＤＲ、Ｌａｍｂｄａ、ＭＣＳＰ、ＮＣＡＭ、Ｐ
ＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、Ｓｐ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８
、Ｔｎ－Ｏ－グリコペプチド、ＶＥＧＲＲ２、およびＨＭＷ－ＭＡＡが含まれる。

別のタイプの免疫療法は、ＰＡＭＰを使用する。これらは自然免疫を活性化するために
腫瘍に注入され得、次いで、この自然免疫は本発明の構成的に活性なサイトカイン受容体
特異的発現細胞を含む適応免疫を動員し活性化する。

Ｄ．遺伝子
さらに別の実施形態では、二次治療は、治療用ポリヌクレオチドが本開示の臨床実施形
態前、後、または同時に投与される遺伝子治療である。細胞増殖の誘導因子、細胞増殖の
阻害因子、またはプログラムされた細胞死の調節因子を含む種々の発現産物が、本開示内
に包含される。

Ｅ．手術
癌を持つ個人のほぼ６０％がいくつかのタイプの外科的処置を受け、これは、予防的、
診断的またはステージング、治癒的および緩和的外科的処置を含む。治癒的外科手術は、
本開示の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／
または代替療法などの他の療法と併用することができる癌治療である。

治癒的外科的処置は切除を含み、そこでは、癌性組織の全てまたは一部が物理的に除去
され、切り出され、および／または破壊される。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の
物理的除去をいう。腫瘍切除に加えて、手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、
電気外科手術、および鏡視下手術（モース手術）が含まれる。本開示は、表在性癌、前癌
、または付随する量の正常組織の除去と併せて使用され得ることがさらに企図される。

癌性細胞、組織または腫瘍の全ての一部の切り出しに際して、キャビティーを身体中に
形成することができる。治療は、当該領域のさらなる抗癌療法での灌流、直接的注射また
は局所的適用によって達成することができる。そのような治療は例えば、１、２、３、４
、５、６、７日毎に、または１、２、３、４および５週間毎に、または１、２、３、４、
５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月毎に反復することができる。これらの治
療は同様に投与量が変化するものとすることができる。

ＶＩＩ 医薬組成物

本開示によれば、用語「医薬組成物」は、個体に投与するための組成物に関する。本開
示の特定の局面において、医薬組成物は、１つ以上の構成的に活性なサイトカイン受容体
を発現する複数の免疫細胞を含む。好ましい実施形態において、医薬組成物は、非経口、
経皮、管腔内、動脈内、髄腔内または静脈内投与のための組成物、または癌への直接注射
のための組成物を含む。特に、前記医薬組成物は、注入または注射によって個体に投与さ
れることが想定される。適切な組成物の投与は異なる方法によって、例えば、静脈内、皮
下、腹腔内、筋肉内、局所または皮内投与によって行うことができる。

本開示の薬学的組成物は、薬学的に受容可能な担体をさらに含み得る。適切な医薬担体
の例は当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどの
エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などを含む。このような担体を含む組成
物は、周知の従来の方法によって製剤化することができる。これらの医薬組成物は、適切
な用量で対象に投与することができる。

投薬レジメンは、主治医および臨床因子によって決定されるであろう。医療分野で周知
のように、任意の１人の患者に対する投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与さ
れる特定の化合物、性別、投与の時間および経路、一般的な健康状態、ならびに同時に投
与される他の薬物を含む、多くの因子に依存する。投与に好ましい投与量は、１×１０^７
／ｍ^２～１×１０^１０／ｍ^２である。進行は、定期的な評価によってモニターすることが
できる。構成的に活性のあるサイトカイン受容体修飾細胞（Ｔ細胞など）を静脈内注入に
より投与してもよい。投与量は１×１０^７／ｍ^２～１×１０^１０／ｍ^２である。

本開示の組成物は、局所的にまたは全身的に投与され得る。投与は一般に、非経口（例
えば、静脈内）であり；ＤＮＡはまた、標的部位に直接（例えば、内部または外部標的部
位へのバイオリスティック送達によって、または動脈中の部位へのカテーテルによって）
投与され得る。好ましい実施形態において、医薬組成物は、皮下に投与され、さらにより
好ましい実施形態において静脈内に投与される。非経口投与のための調製物の例は、滅菌
水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピ
レングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エ
チルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール性／水性溶
液、乳液または懸濁液が含まれ、食塩水、緩衝性媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、
塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、
乳酸リンゲルまたは不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルとしては、体液および栄養補
給剤、電解質補給剤（例えば、リンゲルデキストロースをベースとするもの）などが挙げ
られる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような保存剤
および他の添加剤が存在してもよい。さらに、本開示の医薬組成物は、タンパク質性担体
（例えば、好ましくはヒト由来の、血清アルブミンまたは免疫グロブリンなど）を含んで
もよい。本開示の医薬組成物は、構成的に活性なサイトカイン受容体構築物またはそれを
コードする核酸分子もしくはベクターに加えて、医薬組成物の意図される使用に依存して
、さらなる生物学的に活性な薬剤を含み得ることが想定される。

本明細書に記載される組成物のいずれも、構成的に活性なサイトカイン受容体を発現す
る癌を治療するためのキットに含まれ得る。非限定的な例において、細胞治療における使
用のための１つ以上の構成的に活性なサイトカイン受容体指向性免疫細胞、および／また
は組換え発現ベクターを保持する細胞治療における使用のための１つ以上の細胞を生成す
るための試薬は、キットに含まれ得る。キット構成物は、適切な容器手段で提供される。

キットのいくつかの構成物は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装され得る
。キットの容器手段は一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射
器または他の容器を含み、その中に構成要素を配置し、好ましくは適切に等分することが
できる。キット中に２つ以上の成分がある場合、キットは一般に、第２、第３、または他
の追加の容器も含み、その中に追加の成分を別々に配置することができる。しかし、成分
のさまざまな組み合わせを１つのバイアル中に含めてもよい。キットはまた、典型的には
、商業的販売のために成分を密閉して収容するための手段を含む。このような容器は、所
望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。

キットの成分が１つおよび／または複数の液体溶液で提供される場合、液体溶液は水溶
液であり、無菌水溶液が特に有用である。場合によっては、容器手段がそれ自身、注射器
、ピペット、および／または他の同様の器具であってもよく、そこから製剤を身体の感染
領域に適用し、動物に注射し、および／またはさらにはキットの他の成分に適用し、およ
び／またはそれと混合してもよい。

特定の実施形態では細胞治療に使用される細胞がキットで提供され、場合によっては細
胞が本質的に、キットの唯一の構成要素である。キットは、所望の細胞を作製するための
試薬および材料を含み得る。特定の実施形態において、試薬および材料は所望の配列、ヌ
クレオチド、適切な緩衝液または緩衝試薬、塩などを増幅するためのプライマーを含み、
そしていくつかの場合において、試薬は、本明細書中に記載されるエンゲージャー分子を
コードするベクターおよび／またはＤＮＡ、ならびに／またはそのための調節エレメント
を含む。

特定の実施形態では、個体から１つ以上のサンプルを抽出するのに適した１つ以上の装
置がキット中に存在する。装置は、注射器、メス等であってもよい。

特定の態様において、キットは、本開示の細胞療法、および細胞が免疫性である化学療
法も含む。場合によっては、キットが細胞療法の実施形態に加えて、例えば、化学療法、
ホルモン療法、および／または免疫療法などの第２の癌療法も含む。キット（複数可）は
、個体についての特定の癌に合わせて調整され得、そして個体についてのそれぞれの第２
の癌治療を含む。

以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例
において開示される技術は本開示の実施において良好に機能することが本発明者によって
発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成すると考え
られ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照
らして、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態にお
いて多くの変更がなされ得、依然として同様の結果または類似の結果を得ることを理解す
るべきである。

［細胞治療のための構成的に活性なサイトカイン受容体］
本実施例は、構成的に活性なサイトカイン受容体の特定の実施形態の生成および活性を
実証する。本開示は、非天然であり、シグナル伝達特性の変化をもたらす野生型と比較し
て改変された、構成的に活性なサイトカイン受容体に関する。図１は、正常なＩＬ－７サ
イトカイン／受容体シグナル伝達において起こるものを例示する。安静時、ＩＬ－７受容
体α（ＩＬ－７Ｒα）タンパク質はγ鎖受容体（γｃ）タンパク質から分離されたままで
ある。これは、細胞外ＩＬ－７が両受容体の細胞外ドメインに結合すると変化し、ＩＬ－
７Ｒαとγｃのヘテロ二量体化を誘導し、ＪＡＫ１／ＪＡＫ３シグナル伝達を活性化して
ＳＴＡＴ５リン酸化を活性化する。ＳＴＡＴ５は、ＩＬ－７受容体によって活性化される
主要な下流シグナル伝達ノードである。図２は、ＩＬ７ＲＰ２受容体におけるシグナル伝
達を示す。細胞外ＩＬ－７とは無関係に、ＩＬ７ＲＰ２モノマータンパク質の膜貫通ドメ
インのシステイン残基は、別のＩＬ７ＲＰ２モノマーのシステイン残基とジスルフィド結
合を形成する。これは、ＳＴＡＴ５リン酸化をもたらすＪＡＫ１／ＪＡＫ１シグナル伝達
を構成的に活性化するホモ二量体タンパク質の形成を誘導する。

従って、本開示はいくつかの場合において、特定の細胞外ドメインおよび特定の膜貫通
ドメインを有する操作されたサイトカイン受容体の実施形態を包含し、その結果、操作さ
れた受容体は、受容体についての最初のシグナルの非存在下でさえ、構成的に活性である
。図３に、Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２タンパク質の特定の例におけるシグナル伝達を示す。Ｉ
Ｌ７ＲＰ２受容体の細胞外ドメインをＣＤ３４の細胞外ドメインと置換して、Δ３４．Ｉ
Ｌ７ＲＰ２を形成した。これは、ＩＬ－７などの細胞外サイトカインに対する感受性を除
去し、その一方で、タンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを無傷で維持して
、ＳＴＡＴ５を構成的に活性化する。図４は、ＳＴＡＴ５がＩＬ７ＲＰ２形質導入Ｔ細胞
において構成的に活性であることを示す。Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２（ＳＦＧΔ３４．ＩＬ７
ＲＰ２）をコードする発現カセットを有するレトロウイルスベクターを作製した。ＯＫＴ
３／ＣＤ２８活性化Ｔ細胞をＲＤ１１４シュードタイプＳＦＧ△３４．ＩＬ７ＲＰ２レト
ロウイルス粒子で形質導入した。ネガティブコントロールとして、Ｔ細胞を、細胞外ドメ
インおよび膜貫通ドメインならびにＣＤ３４の細胞質ドメインの一部を発現する非シグナ
ル伝達ＳＦＧ．Δ３４ベクターで別々に形質導入した。１人のドナーからの代表的なＦＡ
Ｃデータ（図４Ａ）において、構成的ＳＴＡＴ５活性化は、ＳＦＧ．Δ３４（黒色）で形
質導入されたＴ細胞と比較して、２４時間サイトカインなしで休止したΔ３４．ＩＬ７Ｒ
Ｐ２形質導入Ｔ細胞（白色）におけるより高いリン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）シグ
ナルによって実証される。ｎ＝３のドナーの平均結果は、Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２形質導入
Ｔ細胞におけるｐＳＴＡＴ５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）がＳＦＧ．Δ３４よりも有意に高
いことを示した（図４Ｂ）。

本開示の修飾されたサイトカイン受容体を含み、またキメラ抗原受容体（例えば）も含
む細胞は、サイトカインの非存在下でさえ増殖する能力を維持する。図５において、ＩＬ
７ＲＰ２形質導入された抗原特異的Ｔ細胞は抗原特異的刺激後に、未修飾の抗原特異的Ｔ
細胞よりも大きな増殖能を有することが示される。水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）特異
的Ｔ細胞（ＶＺＶＳＴ）を、固形腫瘍抗原ＧＤ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
で遺伝的に修飾した。この系におけるＩＬ７ＲＰ２の利益を評価した。ＶＺＶＳＴは、Ｃ
Ｄ２８－ζシグナル伝達ドメイン（ＳＦＧ．ＧＤ２．ＣＡＲ．ＣＤ２８ζ）またはＳＦＧ
．ＧＤ２．ＣＡＲ．ＣＤ２８ζおよびＳＦＧ．ＩＬ７ＲＰ２－ｍＯｒａｎｇｅ（ｍＯ）を
有するＧＤ２－ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターで遺伝的に修飾した。両方の
Ｔ細胞集団を、ＩＬ２の非存在下でＧＤ２＋ＬＡＮ－１腫瘍細胞に繰り返し曝露した。Ｌ
７ＲＰ２形質導入ＧＤ２．ＣＡＲ ＶＺＶＳＴは増殖し続けたが、未修飾ＧＤ２．ＣＡＲ
ＶＺＶＳＴは増殖しなかった。

本開示の構成的に活性なサイトカイン受容体は、受容体を欠く細胞と比較して、増大し
た増殖および癌細胞毒性を可能にする。図６は、Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２を共発現するＧＤ
２．ＣＡＲ Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏでＧＤ２．ＣＡＲ Ｔ細胞よりも大きな増殖および
抗腫瘍効力を有することを示す。Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２がｉｎ ｖｉｖｏで抗原再指向性
Ｔ細胞の増殖を増強するかどうかを評価するために、ＯＫＴ３／ＣＤ２８活性化Ｔ細胞を
、ＯＸ４０．ＣＤ２８ζシグナル伝達ドメイン（ＳＦＧ．ＧＤ２．ＣＡＲ．ＯＸ４０．Ｃ
Ｄ２８．ζ）またはＧＤ２．ＣＡＲ．ＯＸ４０．ＣＤ２８．ζとΔ３４．ＩＬ７ＲＰ２を
共発現するバイシストロニックＳＦＧベクター（２Ａ配列を間に挟む）を有するＧＤ２．
ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。さらに、両方のＴ細胞集団
を、ホタルルシフェラーゼをコードするレトロウイルスベクターで形質導入して、非侵襲
的な生物発光イメージングを可能にした。８日齢の左側腹部ＧＤ２＋ ＬＡＮ－１腫瘍を
有するＮＳＧマウスに、２００万個のＧＤ２．ＣＡＲ Ｔ細胞または２００万個のＧＤ２
．ＣＡＲ－Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２ Ｔ細胞を静脈内注射した。ＧＤ２．ＣＡＲ－Δ３４．
ＩＬ７ＲＰ２ Ｔ細胞はｉｎ ｖｉｖｏで有意に増殖し、ＧＤ２．ＣＡＲ Ｔ細胞と比較
して腫瘍部位でＴ細胞の持続期間が延長した（図６Ａ）ＬＡＮ－１腫瘍はＧＤ２．ＣＡＲ
Ｔ細胞を投与したマウスで増殖し、腫瘍はＧＤ２．ＣＡＲ－Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２ Ｔ
細胞で消失した（図６Ｂ）。これは、ＧＤ２・ＣＡＲΔ３４・ＩＬ７ＲＰ２ Ｔ細胞を受
けたマウスにおいて有意に増強された生存優位性をもたらした（図６Ｃ）。

Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２形質導入Ｔ細胞は、抗原刺激の非存在下では持続性が限られる。
Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２が抗原またはサイトカイン刺激の非存在下でＴ細胞の構成的増殖を
誘導するかどうかを評価するために、Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２形質導入Ｔ細胞を、ヒトサイ
トカインサプリメントまたは抗原刺激を欠く完全培養培地中で培養した（ＰＢＭＣ単離お
よび活性化の１０日後）。対照として、Δ３４形質導入Ｔ細胞および非形質導入（ＮＴ）
Ｔ細胞を同じ方法で培養した。Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２形質導入Ｔ細胞は培養の最初の１４
日間で１倍に拡大し、その後細胞は収縮した（図７Ａ）。Δ３４およびＮＴ Ｔ細胞は、
培養の過程の間に拡大および収縮はしなかった。このことは、Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２単独
ではＴ細胞において構成的細胞増殖を誘導することができず、Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２形質
導入Ｔ細胞は依然として増殖のために抗原を必要とすることを実証する。

Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２は、ＥｐｈＡ２．ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害能および増殖を延長
する。Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２がＥｐｈＡ２－ＣＡＲを介してＥｐｈＡ２発現標的に対して
向けられたＴ細胞の増殖を増強するかどうかを評価するために、ＯＫＴ３／ＣＤ２８活性
化Ｔ細胞を、４１ＢＢ．ζシグナル伝達領域を有するＥｐｈＡ２．ＣＡＲをコードし、２
Ａ配列によって切断型ＣＤ１９分子、ΔＣＤ１９（ＳＦＧ．ＥｐｈＡ２．４１ＢＢ．ζ－
２ＡΔＣＤ１９）が連結されたバイシストロン性ＳＦＧベクター、またはＳＦＧ．Ｅｐｈ
Ａ２．４１ＢＢζおよびΔ３４．ＩＬ７ＲＰ２を、間に２Ａ配列を伴って共発現するバイ
シストロン性ＳＦＧベクター（ＳＦＧ．ＥｐｈＡ２．４１ＢＢ．ζ－２Α－ζ－２Α－Δ
３４．ＩＬ７ＲＰ２）で形質転換した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＥｐｈＡ２陽性Ｕ３７３膠芽
腫細胞で毎週チャレンジする連続殺傷アッセイ（２Ｔ細胞対１腫瘍細胞比）に供した場合
、ＳＦＧ．ＥｐｈＡ２．４１ＢＢ．ζ－２Ａ－Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２ Ｔ細胞は腫瘍細胞
を排除し、８回の刺激（黒色）で増殖することができ、一方、ＳＦＧ．ＥｐｈＡ２．４１
ＢＢ．ζ－２Ａ－ΔＣＤ１９ Ｔ細胞（灰色）は、２回の刺激後に機能不全になった（図
８）。

Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２はｉｎ ｖｉｖｏでＥｐｈＡ２．ＣＡＲ Ｔ細胞のアンチグリオ
ーマ活性を増強する。マウスにＵ３７３細胞を発現するホタルルシフェラーゼを注射し、
７日目にＥｐｈＡ２．ＣＡＲ Ｔ細胞またはＥｐｈＡ２．ＣＡＲ．Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２
Ｔ細胞を腫瘍内注射した。腫瘍増殖の後に、連続的な生物発光イメージングを行った。
腫瘍はＥｐｈＡ２・ＣＡＲ・Δ３４・ＩＬ７ＲＰ２ Ｔ細胞で処置した４匹のマウスすべ
てで退縮し、再発しなかった（図９）。対照的に、ＥｐｈＡ２．ＣＡＲ Ｔ細胞療法後に
腫瘍の退縮が認められたのはわずか４／５匹のマウスであり、Ｔ細胞注射後４週間以内に
４つの応答性腫瘍すべてが再発した。

コンビナトリアル構成的活性サイトカイン受容体は、本開示の実施形態に包含される。
例えば、Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２タンパク質は、ＩＬ－２１Ｒα細胞質ドメインと融合され
て、構成的に活性なコンビナトリアルサイトカイン受容体を生成し得る。Δ３４．ＩＬ７
ＲＰ２はＣ末端でＩＬ－２１受容体の細胞質ドメインに融合し、ＳＴＡＴ５結合の立体障
害を回避する２つの細胞質ドメインの間に柔軟なリンカーがあり、Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２
リンカー－ＩＬ２１Ｒαを生成した（図１０Ａ）。ＳＴＡＴ活性化能を評価するために、
Ｔ細胞（ＮＴ、Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２形質導入Ｔ細胞、またはΔ３４．ＩＬ７ＲＰ２－リ
ンカー－ＩＬ２１Ｒα形質導入Ｔ細胞）をサイトカインなしで２４時間静置した。Δ３４
．ＩＬ７ＲＰ２およびΔ３４．ＩＬ７ＲＰ２－リンカー－ＩＬ２１Ｒα Ｔ細胞はＳＴＡ
Ｔ５を構成的に活性化することができたが（図１０Ｂ）、Δ３４．ＩＬ７ＲＰ２－リンカ
ー－ＩＬ２１Ｒαのみが構成的ＳＴＡＴ３活性を示した（図１０Ｃ）。ＳＴＡＴ３は、Ｉ
Ｌ－２１受容体によって活性化される重要な下流のシグナル伝達ノードである。

Ｔ細胞以外の細胞は、１つ以上の構成的に活性なサイトカイン受容体を発現するように
改変され得る。図１１において、ＩＬ７ＲＰ２は、ＮＫ細胞の抗原媒介性増殖を増強する
。ＮＫ細胞を、ＩＬ７ＲＰ２－ＩＲＥＳ－ｍＯｒａｎｇｅ（ＩＬ７ＲＰ２．ｍＯ）ベクタ
ーまたはコントロールベクターＩＲＥＳ－ｍＯｒａｎｇｅ（ｅｍｐｔｙ．ｍＯ）で形質導
入し、次いで、サイトカインの非存在下で７日間、照射したＫ５６２標的細胞で刺激した
。ＩＬ７ＲＰ２．ｍＯ ＮＫ細胞は増殖倍数の８倍の増加を示したが、空のｍＯ ＮＫ細
胞は増殖倍数の４倍のみであった。

［エキソドメインの特定の実施形態］
図１２は、構成的に活性なサイトカイン受容体において複数のエキソドメインが利用さ
れる特定の例を示す。そこではＰＤ１エキソドメインがΔ３４．ＩＬ７ＲＰ２のΔＣＤ３
４エキソドメインに連結され、この特定のＰＤ１エキソドメインはＰＤＬ１結合に関して
正常なＰＤ１と競合し（それによってデコイ受容体として作用する）、ＰＤ１免疫抑制を
減少させる。場合によっては、受容体がそのようなエキソドメインを単一のエキソドメイ
ンとして利用する（図１３）。デコイ受容体については、受容体はＣＤ３４またはその一
部を含んでも含まなくてもよい。デコイ受容体のエキソドメインの他の実施形態は、ＣＴ
ＬＡ４を含む。

［サイトカインシグナル伝達のリンパ球への構成的送達は、抗腫瘍効果の増強を促進す
る］
養子リンパ球療法は白血病およびリンパ腫に対しては成功しているが、固形腫瘍に対し
ては最小限の効果しか示していない。固形腫瘍が腫瘍特異的Ｔ細胞に与える課題は、Ｔ細
胞の活性化に必要な３つのシグナルパラダイムを調べることによって理解することができ
る: シグナル１（抗原によるＴ細胞受容体活性化）、シグナル２（共刺激）、シグナル３
（サイトカイン活性化）。これらのシグナルは一緒に作用して、ｉｎ ｖｉｖｏで養子移
入リンパ球を拡大し、腫瘍の除去を促進する。固形腫瘍は、腫瘍抗原をＴ細胞に提示する
ＭＨＣＩ分子のダウンレギュレーション、補助刺激リガンドの発現不全、および免疫抑制
性サイトカインの産生などの機構によって、Ｔ細胞の３シグナル活性化を妨げる。解決策
はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにＴ細胞を遺伝的に改変することであり、
ＣＡＲはＭＨＣＩ非依存性抗原ライゲーションに際してシグナル１および２を提供し、Ｉ
Ｌ－２分泌からいくらかのシグナル３を提供する。しかしながら、シグナル３は、このア
プローチによって不完全に活性化されたままである。この欠損は、ＩＬ－７サイトカイン
シグナル伝達を構成的に送達する遺伝子構築物の過剰発現によって矯正された。サイトカ
インの支持がなければ、サイトカイン送達戦略はｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＡＲ Ｔ細胞の抗
原依存性細胞毒性、増殖、および持続性を増強する。これは、異種移植片神経芽細胞腫お
よび膠芽腫マウスモデル（例としてのみ）を用いてｉｎ ｖｉｖｏで再現され、固形腫瘍
に対するシグナル３補充養子免疫療法の有意な改善された効力を実証した。

［実施例４］

［遺伝子操作されたＩＬ－７受容体からの構成的シグナル伝達は、腫瘍再指向性Ｔ細胞
による持続性腫瘍除去を促進する］

（イントロダクション）

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で修飾されたＴ細胞を用いた養子免疫療法は難治性白血病
およびリンパ腫に対して顕著な臨床的有効性を達成しているが、これらの成功を固形腫瘍
に転換するには課題が残っている。養子移入されたＴ細胞の実質的な拡大および持続性は
、持続的な抗腫瘍効果のために必要である。最適なＴ細胞活性化および拡大に必要な３つ
のシグナルのうち、ＣＡＲ活性化はシグナル１（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化）および
シグナル２（共刺激）を再現することができるが、腫瘍微小環境では乏しい免疫刺激性サ
イトカインに由来する正のシグナル３を維持することはできない。異種移植腫瘍モデルに
おいて、シグナル３は顕著な有害作用なしに、抗腫瘍活性を増大させるために、ＩＬ－２
のようなサイトカインの注射で補充されている。しかし、癌患者へのサイトカインの全身
投与は、有意な毒性を引き起こした。サイトカインを分泌またはトランス提示するための
Ｔ細胞の遺伝的修飾などの代替アプローチは神経毒性および分泌されたサイトカインの全
身性蓄積によるサイトカイン放出症候群を含む重篤な有害事象のリスクを伴うが、サイト
カイン受容体を過剰発現するＴ細胞は外因性サイトカインの必要性を排除しない。

本実施例は構成的に活性なＩＬ－７サイトカイン受容体（Ｃ７Ｒ）を有するシグナル３
をＴ細胞に選択的に提供する戦略を提供し、上記の問題を回避する。この新規なキメラ受
容体は外因性物質、またはトランスジェニックサイトカインの強制発現によって引き起こ
される非特異的バイスタンダーＴ細胞活性化を必要とせずに、シグナル３を提供する。Ｃ
７Ｒを発現するＣＡＲ Ｔ細胞の増殖および生存は抗原依存性のままであるが、腫瘍の存
在下ではこれらの細胞が複数のモデル系において優れた抗腫瘍活性を有する。

［Ｃ７ＲはＳＴＡＴ５を構成的に活性化し、細胞外リガンドに反応しないように操作さ
れる］

本実施例では、サイトカインが腫瘍特異的Ｔ細胞の持続性を強化するため、ＩＬ－７に
注目している。特定の突然変異を有するＩＬ－７受容体は膜貫通ドメインにおけるシステ
インおよび／またはプロリンの挿入に起因する機能の獲得をもたらし、ＩＬ－７Ｒαのホ
モ二量体化を引き起こす。一旦ホモダイマーが形成されると、ＪＡＫ１／ＪＡＫ１の交差
リン酸化は、ＩＬ－７の下流のコアシグナル伝達ノードであるＳＴＡＴ５を活性化する。

このクラスの受容体が最適なＣＡＲ Ｔ細胞活性のための３シグナル要件を完了するた
めに一貫したシグナル３を産生し得るかどうかを発見するために、有意なＳＴＡＴ５活性
化を有する構成的に活性なＩＬ－７受容体変異体（ＩＬ７Ｒ^＊）を選択した。外部配位子
による受容体のさらなる活性化を回避し、形質導入された細胞を検出する手段を提供する
ために、受容体の天然の細胞外ドメインを、ＣＤ３４由来のエクトドメインで置き換えた
。エクトドメインのサイズがタンパク質発現および機能に関わる因子となっているかどう
かを知るために、Ｑ８（６５アミノ酸）およびＣＤ３４（２５９アミノ酸）由来のエクト
ドメインを使用した。Ｑ８エクトドメインはＣＤ８スペーサーの上に載せられたＣＤ３４
エピトープを含み、抗ＣＤ３４抗体クローンＱＢＥＮＤ１０による検出を可能にする。健
康なドナーＴ細胞におけるＣＤ３４－ＩＬ７Ｒ^＊およびＱ８－ＩＬ７Ｒ^＊構築物のレトロ
ウイルス媒介発現は、Ｑ８－ＩＬ７Ｒ^＊融合タンパク質の乏しい発現および最適以下のＳ
ＴＡＴ５活性化を示した（図１８）。対照的に、ＣＤ３４－ＩＬ７Ｒ^＊は、Ｔ細胞におい
てロバストに発現され、機能的に活性であった。従って、ＣＤ３４－ＩＬ７Ｒ^＊は以後、
Ｃ７Ｒ（ただし本明細書ではΔ３４．ＩＬ７ＲＰ２とも呼ばれる）と称し、その後の全て
の研究のために使用された（図１４Ａ）。

ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞におけるＣ７Ｒの相対的効果を決定するために、抗体被覆
磁気ビーズを用いて２つの亜集団を分離し、それらを活性化および形質導入し、Ｔ細胞サ
ブセットを互いに別々に培養した。Ｃ７Ｒは、ＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の両方に
よって容易に発現され（図１４Ｂ、１４Ｃおよび図１９）、Ｔ細胞において、短縮型ＣＤ
３４（Δ３４）分子からなるコントロール構築物よりも大きなＳＴＡＴ５の構成的活性化
を生じた（Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉ、２００７）（図１４Ｄ～１４Ｇ）。重要なことに、
Ｃ７Ｒはｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の抗原非依存性増殖を促進しな
かった（図１４Ｈ，１４Ｉ）。Ｃ７Ｒ形質導入細胞はインビトロで対照細胞よりも抗原お
よびサイトカイン枯渇条件で有意に長く持続したが、Ｃ７Ｒ集団は１４～２１日までに収
縮し始め、全ての細胞は持続アッセイの開始後７０日までに死滅した。これにより、Ｃ７
Ｒ単独では、ＣＡＲ Ｔ細胞の安全性にとって重要な特性である自律的Ｔ細胞増殖を持続
させないことが確認された。

［一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞チャレンジの間、Ｃ７ＲはＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞
の生存を促進する］

われわれは、Ｃ７ＲがＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍効力を増加させることができるかどうか
を評価するために、ＧＤ２＋神経芽細胞腫細胞を、ＣＤ８αストークおよび膜貫通ドメイ
ンに結合した１４ｇ２ａ ｓｃＦｖ、および４１ＢＢ．ζシグナル伝達エンドドメインを
含むＧＤ２－ＣＡＲを発現するＴ細胞で分離した（図２０Ａ）。１４ｇ２ａベースのＧＤ
２－ＣＡＲ Ｔ細胞は神経芽細胞腫患者を治療する臨床試験において安全なプロファイル
を示しており、選択された患者で完全寛解が達成されているものの、より高い有効性が依
然として望める。ＧＤ２－ＣＡＲ単独またはＧＤ２－ＣＡＲおよびＣ７Ｒを含有するバイ
シストロン性構築物（ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ）のいずれかを発現するＴ細胞を比較する
と、Ｃ７Ｒは、ＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の記憶サブセット組成またはＣＤ４／ＣＤ８パー
センテージにおいて有意差を誘導しなかった（図１６Ｂ～１６Ｄ）。Ｃ７ＲはＬＡＮ－１
腫瘍での刺激後にＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αの分泌を
増加させたが（図１５Ａ）、これは４時間細胞毒性アッセイ（図１５Ｂ）中のＴ細胞殺傷
能のいかなる増加とも関連しなかった。しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏ逐次共培養死滅試験中
に腫瘍を反復攻撃した後、細胞毒性および増殖を維持する能力を測定したところ、ＧＤ２
－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞はＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞よりも有意に優れた性能を示した（
図１５Ｃ）。ＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞は３回目のチャレンジによって失敗し、腫瘍細胞を
拡大および排除する能力の両方を失った（図１５Ｄ、１５Ｅ）。対照的に、Ｃ７Ｒを発現
するＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞は、３つの連続した腫瘍チャレンジすべてに応答した。アポ
トーシスの減少に対して増殖の増加の、ＣＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞の拡大の改善に
対する相対的寄与を決定するために、最初の共培養後にＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌ
ｅｔ標識を使用した。その後腫瘍細胞で再刺激すると、ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞
は、ＧＤ２－ＣＡＲのみを発現するＴ細胞よりも大きな細胞分裂を示した（図１５Ｆ，１
５Ｇ）。Ｃ７ＲがＴ細胞アポトーシスも減少させるかどうかを評価するために、アネキシ
ンＶおよび７－ＡＡＤ染色を２回目の腫瘍再刺激後に使用した。フローサイトメトリー分
析は、ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞と比較して、アネキシンＶ（＋）／７－ＡＡＤ（
＋）ＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のより大きな集団を示し（図１５Ｈ）、連続的な腫瘍チャレ
ンジにもかかわらず、Ｃ７Ｒによって生成される生存能力の増加を示した。これらの結果
の分子的基礎をさらに理解するために、ナノストリング（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）技術を
用いて、第２の腫瘍再刺激後のＧＤ２－ＣＡＲおよびＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞の
遺伝子発現分析を行った（図１５Ｉおよび図２２）。ＩＬ－７の抗アポトーシス作用を媒
介するＢＣＬ２は、ＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞においてＣ７Ｒによってアップレギュレート
されるトップ遺伝子の１つであった。細胞アポトーシスおよび活性化誘導細胞死（ＡＩＣ
Ｄ）に関与する、細胞溶解性グランザイムＡ（ＧＺＭＡ）およびアポトーシス促進性ＦＡ
Ｓおよびカスパーゼ８（ＣＡＳＰ８）のダウンレギュレーションがあった（Ｋｒａｍｍｅ
ｒ、２００７）。従って、Ｃ７Ｒは、ＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖および生存の両方を
増大させ、腫瘍細胞との連続的な遭遇の間のそれらの性能を増強する。

［ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣ７Ｒ共発現は、異種移植腫瘍モデルに対する抗腫瘍活性を
増強する］

異種移植モデルにおいて、Ｃ７Ｒ増強ＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞が転移性神経芽細胞腫を
根絶する能力を試験した。神経芽細胞腫細胞を、ホタルルシフェラーゼ（ＣＨＬＡ－２５
５ ＦＦｌｕｃ）を発現するように改変された多剤耐性のＭＹＣ－Ｎ非増幅神経芽細胞腫
細胞系ＣＨＬＡ－２５５（Ｈｅｃｚｅｙ、２０１４、Ｂｌｏｏｄ。２０１４ Ｏｃｔ ３
０；１２４（１８）：２８２４－３３）の静脈内注射によって、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）
重症／複合免疫不全（ＳＣＩＤ）ＩＬ－２ｒγ－／（ＮＳＧ）マウスに生着させた．腫瘍
生着から１週間後に低用量のＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞で処置すると、無関係なＣＡＲを発
現するＴ細胞で処置した対照マウスと比較して、生存期間中央値が１週間増加した。Ｃ７
Ｒを発現するＴ細胞および短縮型エンドドメインを有する非機能性ＧＤ２－ＣＡＲ（ＧＤ
２－ＣＡＲΔ．Ｃ７Ｒ）を投与したマウスは、対照マウスと同一の生存率を示した（図１
６Ａ、１６Ｂ）。対照的に、ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞を注入したマウスでは、疾
患は消失した。ＣＨＬＡ－２５５細胞ではなくＴ細胞がＧＦＰ－ＦＦｌｕｃ形質導入され
た並行実験では、注入された用量が限られているＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖はなかっ
たが、ＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞の強力な増殖が見られ、広範な神経芽細胞腫転移部位であ
る肝臓にＴ細胞シグナルが蓄積した（図１６Ｃ，１６Ｄ）。これらの結果はＧＤ２－ＣＡ
Ｒ Ｔ細胞はｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍に対して存続することができなかったが、Ｃ７Ｒを発
現するＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞は増殖し、生存して転移性腫瘍クリアランスを媒介するこ
とを示した。

Ｃ７Ｒが他のＣＡＲ Ｔ細胞の性能を増強し得るかどうかを調べるために、この分子を
、膠芽腫を処置することを意図したＥｐｈＡ２－ＣＡＲと共発現させた。ＧＦＰ－ＦＦｌ
ｕｃで遺伝子修飾したＵ３７３膠芽腫細胞をＳＣＩＤマウスに頭蓋内注射した。７日後、
１０^４個のＥｐｈＡ２－ＣＡＲ Ｔ細胞を腫瘍内に投与した。これは以前の経験に基づい
て神経膠腫を根絶することができなかった投与量である。膠芽腫の生物発光はＣ７Ｒおよ
び非機能性ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ（ＥｐｈａＡ２－ＣＡＲΔ．Ｃ７Ｒ）を同時に発現する対
照Ｔ細胞で処置したマウスにおいて急速に増加し、ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ Ｔ細胞を受けた
マウスにおいては、抗腫瘍対照における有意な改善は見られなかった（図１６Ｅ、１６Ｆ
）。対照的に、低「ストレス」用量のＥｐｈＡ２－ＣＡＲ Ｔ細胞を注入したマウスにお
いて、それらがＣ７Ｒ（ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ）を同時発現した場合に腫瘍は完全
に排除され、これらのマウスは実験の終わりに無病のままであった。ＧＦＰＦＦｌｕｃで
も形質導入したＥｐｈＡ２－ＣＡＲ Ｔ細胞を用いて実験を繰り返した場合、ＣＡＲのみ
を発現するＴ細胞からの生物発光シグナルは、注入後４～６日で大部分消失した。比較す
ると、ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞は（頭蓋外）神経芽細胞腫モデルで観察され
た有意に大きな拡大を欠いていたが、ＥｐｈＡ２－ＣＡＲとＥｐｈＡ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ
Ｔ細胞との間の曲線下面積（ＡＵＣ）比較によって決定されるように、より大きなＴ細
胞の持続性の増大に向かう傾向があった（図２１）。

［ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞は、腫瘍クリアランス後にｉＣ９を用いて効率的に
欠失させることができる］

しかし、さらなる安全性測定として、選択的にＴ細胞を排除し得る臨床的に確認された
誘導性カスパーゼ９（ｉＣ９）自殺遺伝子（Ｄｉ Ｓｔａｓｉら、２０１１）を共発現す
るＴ細胞が生成された。ｉＣ９およびＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒによる二重形質導入後、Ｔ
細胞はｉＣ９シグナル伝達に対して感受性を維持し、二量体化ＡＰ２０１８７（ＣＩＤ）
の化学的誘導物質への曝露の２４時間以内にインビトロでアポトーシスを受けた（図１７
Ａ）。ｉＣ９が腫瘍退縮後にｉｎ ｖｉｖｏでＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞を効率的
に除去できるかどうかを検討した。Ｔ細胞活性および腫瘍増殖を同時に評価するために、
皮下ＬＡＮ－１神経芽細胞腫モデルを使用した。腫瘍細胞をＮＳＧマウスの左背脇部に注
射し、８日後、１×１０^６のＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞を単独で、またはｉＣ９で
二重形質導入して静脈内に注射した。対照マウスにはＧＤ２－ＣＡＲΔを与えた。Ｃ７Ｒ
Ｔ細胞を投与した。全てのＴ細胞を、インビボ可視化のためにＧＦＰ－ＦＦｌｕｃで同
時形質導入した。３週間後、ＬＡＮ－１腫瘍は、安楽死させた対照マウスにおいて出現し
た。ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞およびｉＣ９ベクターを共発現するＴ細胞は、ＧＤ
２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞単独と同様の抗腫瘍効力およびｉｎ ｖｉｖｏ拡大を示した
（図１７Ｂ，１７Ｃ）。免疫療法後に毒性を制御するのに必要なＴ細胞欠失をモデル化す
るために、同じ実験アプローチ内でＴ細胞注入の２８日後に開始する３用量のＣＩＤをマ
ウスに投与した。ＣＩＤ投与直後にＴ細胞生物発光シグナル（平均９３％）の損失があり
（図１７Ｄ）、シグナルは腫瘍再発なしに２週間後にベースラインにとどまり、その時点
で実験を終了した。これらの結果は、Ｃ７Ｒを共発現するＣＡＲ Ｔ細胞が必要に応じて
、有効性を損なうことなく、かつ選択的なＴ細胞欠失を許容することなく、ｉＣ９と一緒
に使用できることを確認した。

３４．ＩＬ７ＲＰ２形質導入ＥＢＶ特異的Ｔ細胞によるＬＣＬ腫瘍の治療は、抗腫瘍効
果を示す。ＬＣＬ腫瘍を雌ＮＳＧマウスの背側左側面に皮下注射した。８日後、５×１０
^６個のＥＢＶ特異的Ｔ細胞（ＥＢＶＳＴ）または３４．ＩＬ７ＲＰ２形質導入ＥＢＶＳＴ
（３４．ＩＬ７ＲＰ２－ＥＢＶＳＴ）、および同時発現するＧＦＰ－ホタルルシフェラー
ゼ（ＧＦＰ－Ｆｆｌｕｃ）を静脈内注射した。ＰＢＳを対照として腫瘍を有するマウスに
注射した。図２３Ａにおいて、マウスにおけるルシフェラーゼシグナルのイメージングは
、３４．ＩＬ７ＲＰ２－ＥＢＶＳＴがＥＢＶＳＴ単独と比較して、腫瘍部位において延長
された持続性を有することを明らかにする。同様に、図２３Ｂにおいて、腫瘍増殖の測定
は、３４．ＩＬ７ＲＰ２ ＥＢＶＳＴがＥＢＶＳＴ単独と比較して優れた抗腫瘍効力を有
することを示す。

［特定の実施形態の重要性］

結果は、Ｔ細胞活性化におけるシグナル３が固形腫瘍に対するＣＡＲ Ｔ細胞の活性の
維持を有意に改善し、構成的に活性なＩＬ－７受容体を用いて、養子免疫療法の増強のた
めのシグナル３を提供することができることを実証する。Ｔ細胞が固形悪性腫瘍内で遭遇
する可能性が高い反復抗原曝露のストレス下では、Ｃ７Ｒを共発現するＧＤ２－ＣＡＲ
Ｔ細胞のみが複数回の増殖を受け、抗腫瘍活性を保持することができた。Ｃ７Ｒ増強ＣＡ
Ｒ Ｔ細胞の優位性はインビボでの２つの異なるＣＡＲおよび腫瘍モデルについて示され
、無効用量で投与された機能的ＣＡＲ Ｔ細胞はＣ７Ｒと組み合わせた場合、確立された
腫瘍を根絶する能力を維持し得る。

遺伝子発現分析は、反復腫瘍細胞チャレンジの間のＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞のＣ７Ｒ促
進生存率がＢＣＬ２転写の増加およびＦＡＳおよびＣＡＳＰ８の発現の減少と相関するこ
とを明らかにした。このことは、Ｃ７ＲがＣＡＲ Ｔ細胞内で広範な抗アポトーシス作用
を発揮し、ＡＩＣＤに対する感受性を減少させることを示唆する。ＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７
Ｒ Ｔ細胞ではＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞単独と比較してＴＧＦ－βＲＩＩのダウンレギュ
レーションがあるため（図２２）、Ｃ７Ｒの他の潜在的な利益には腫瘍微小環境内のＴＧ
Ｆ－βなどの免疫抑制剤に対する耐性が含まれる（Ｐｉｃｋｕｐ、２０１３）。

特定の実施形態では、Ｃ７Ｒは、ＣＡＲ Ｔ細胞による抗原駆動性サイトカイン分泌を
中程度に増強するだけであるという観察に基づいて、サイトカイン放出症候群の重症度を
有意に増加させないだろう。さらに、神経膠芽腫患者における心室内ＩＬ－１３Ｒα２
ＣＡＲ Ｔ細胞注入による治療に成功した際に見られた低毒性（Ｂｒｏｗｎ、２０１６）
は、我々の同所性神経膠芽腫モデルでは、Ｃ７ＲがＥｐｈＡ２－ＣＡＲ Ｔ細胞を機能的
に増強したが、増殖を実質的に増加させなかったという観察とともに、神経膠芽腫の治療
にＣＡＲ Ｔ細胞およびＣ７Ｒの併用戦略が用いられた場合、有害事象のリスクが低いこ
とも示唆している。Ｃ７Ｒが抗原非依存性増殖を誘導できるという証拠はなかったが、Ｎ
ＳＧモデルはｉｎ ｖｉｖｏでのヒトＴ細胞の長期運命を評価するには明らかな限界があ
った。しかし、両方の懸念に対する追加の防御策として、二量体化可能なｉＣ９媒介安全
スイッチを含む得ることは、Ｃ７Ｒを発現するＣＡＲ Ｔ細胞の削除を可能にする。

転移性神経芽細胞腫および同所性神経膠芽腫に対するＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＥ
ｐｈＡ２－ＣＡＲ Ｔ細胞へのＣ７Ｒの効果的な適用を考えると、Ｃ７Ｒ分子は（単なる
一例として）、多くの他のＣＡＲ Ｔ細胞を増強するのに有用である。特定の実施形態で
は、この同じアプローチは、全てがＩＬ－７補充に応答することを前提として、ネイティ
ブ（Ｄｕｄｌｅｙ、２００８）またはトランスジェニックＴＣＲ（Ｏｂｅｎａｕｓ、２０
１５）の特異性に基づくもの、ならびにＮＫおよびＮＫＴ細胞の特性を利用するもの（Ｐ
ｅｌｌｅｇｒｉｎｉ、２００９）を含む、癌のための他の養子細胞治療の抗腫瘍活性を増
加させる。

［材料および方法の例］

（レトロウイルスベクターの生成）

ｐＳＦＧ．ΔＣＤ３４－ＩＬ７Ｒ^＊（ｐＳＦＧ．Ｃ７Ｒ）：塩基対７３１と７３２の間
にＴＴＧＴＣＣＣＣＡＣ挿入を有する突然変異体ＩＬ－７Ｒα（ＩＬ７Ｒ＊）（Zenatti
et al、Nat Genet.2011;43:932-9）をコードするｃＤＮＡを合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐ
ｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。ｐＳＦＧ．Ｃ７Ｒは、ＸｈｏＩおよびＭｌｕＩ消化
ＳＦＧベクター骨格、ＩＬ７Ｒ^＊ ｃＤＮＡ、およびＣＤ３４の細胞外ドメイン全長（Δ
ＣＤ３４）を使用するＩＮ－Ｆｕｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、
ＣＡ）クローニングによって生成した。

ｐＳＦＧ．ＧＤ２－ＣＡＲ、ｐＳＦＧ．ＧＤ２－ＣＡＲ－２Ａ－Ｃ７Ｒ（ＧＤ２－ＣＡ
Ｒ．Ｃ７Ｒ）、ｐＳＦＧ．ＧＤ２Δ－ＣＡＲ－２Ａ－Ｃ７Ｒ（ＧＤ２－ＣＡＲΔ．Ｃ７Ｒ
）：ｎ末端リーダーペプチド、ＧＤ２特異的１４ｇ２Ａ単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ
）、ＣＤ８ストークおよび膜貫通ドメイン、および４１ＢＢ．ζエンドドメインをコード
するｃＤＮＡを合成し（Ｂｉｏｂａｓｉｃ、Ｍａｒｈａｍ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）、内部
リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）および短縮型ＮＧＦＲの上流のＳＦＧレトロウイルスベ
クターにＩＮ－Ｆｕｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ）クローニングすることによってクローニン
グした。ｐＳＦＧ．ＧＤ２－ＣＡＲ－２Ａ－Ｃ７Ｒについては、ＧＤ２－ＣＡＲを２Ａ配
列およびＣ７Ｒの上流のＳＦＧベクターにサブクローニングした。ｐＳＦＧ．ＧＤ２Δ－
ＣＡＲ－２Ａ－Ｃ７Ｒについて、２Ａ－Ｃ７Ｒを、１４ｇ２ａ ｓｃＦｖ、短いＩｇＧ１
エキソドメインスペーサー、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、および短縮型ＣＤ２８エンドドメ
イン（ＲＳＫＲＳＲＬＬ；配列番号２６）からなる実験室で入手可能な非機能性ＧＤ２－
ＣＡＲの下流にクローニングした。

ｐＳＦＧ．ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ－２Ａ－ＣＤ１９ｔ（ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ）、ｐＳＦＧ
．ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ－２Ａ－Ｃ７Ｒ（ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒ）、およびｐＳＦＧ
．ＥｐｈＡ２－ＣＡＲΔ－２Ａ－Ｃ７Ｒ（ＥｐｈＡ２－ＣＡＲΔ．Ｃ７Ｒ）： ｐＳＦＧ
．ＥｐｈＡ２－ＣＡＲ－２Ａ－ＣＤ１９ｔは、ＥｐｈＡ２特異的４Ｈ５ ｓｃＦｖ（ｒｅ
ｆ ２５）、ＣＤ８細胞外スペーサー、ＣＤ８膜貫通ドメイン、４１ＢＢ．ζエンドドメ
イン、２Ａ配列、および短縮型ＣＤ１９分子（ＣＤ１９ｔ）からなるＥｐｈＡ２特異的Ｃ
ＡＲをコードする。ｐＳＦＧ．ＥｐｈＡ２‐ＣＡＲ‐２Ａ‐Ｃ７Ｒは、２Ａ‐ＣＤ１９ｔ
を２Ａ‐Ｃ７Ｒで置換するＩＮ‐Ｆｕｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ）クローニングにより生成
した。ｐＳＦＧ．ＥｐｈＡ２－ＣＡＲΔ－２Ａ－Ｃ７Ｒについて、２Ａ－Ｃ７Ｒを、外側
のＥｐｈＡ２特異的４Ｈ５ｓｃＦｖ、ＣＤ８細胞外スペーサー、ＣＤ８膜貫通ドメイン、
および切断型エンドドメインから構成される非機能性ＥｐｈＡ２－ＣＡＲの下流にクロー
ニングした。

ｐＳＦＧ．ｉＣ９－２Ａ－ＣＤ１９ｔ： ベクターは、他の場所（Ｄｉ Ｓｔａｓｉ、
２０１１）で以前に記載したように作製した。

全ての制限酵素はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）
から購入し、全てのクローン化構築物の配列をＳｅｑｗｒｉｇｈｔ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔ
Ｘ）により確認した。

（Ｔ細胞の生成）

健康なドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ヘルシンキ宣言に従って得られた
インフォームドコンセントと共に、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ ＩＲＢ承認プロトコル下で得られた。ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞を個々に評価し
た場合、ＰＢＭＣをＣＤ４またはＣＤ８磁気選択ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ａｕｂｕｒ
ｎ、ＣＡ）で標識し、製造業者の指示に従って積極的に選択した。０日目のＴ細胞活性化
のために、バルクまたは選択されたＴ細胞を、９０％ ＲＰＭＩ １６４０（Ｈｙｃｌｏ
ｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、および１％ Ｇｌ
ｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）からなる完全培地に懸濁
し、活性化のためにＯＫＴ３（ＣＲＬ－８００１、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ］、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）およびＣＤ２
８抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）でコーティングした
ウェル中で培養した。ＩＬ－１５およびＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ Ｈ
ｉｌｌ、ＮＪ）を活性化の１日後に添加し、細胞を２日目にレトロウイルス形質導入した
。Ｔ細胞を、ＯＫＴ３およびＣＤ２８活性化の９～１２日後に開始する実験に使用した。

（フロー・サイトメトリー）

蛍光色素結合抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ； ＣＣＲ７、
ＣＤ４５ＲＯ、ＮＧＦＲ）；Ａｂｎｏｖａ、（Ｔａｉｗａｎ Ｃｉｔｙ、Ｔａｉｗａｎ；
ＣＤ３４）； Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、
Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ；ＣＤ８）； ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
、ＣＡ； ＣＤ４）；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉ
Ｎ； ＣＤ３）；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、Ｃ
Ｄ３４、Ｓｔａｔ５（ｐＹ６９４）、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、７－ＡＡＤ）から購入した。
表面染色のために、細胞を抗体と共に１５分間、４℃でインキュベートし、Ｂｅｃｋｍａ
ｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇａｌｉｏｓ（１０，０００事象）上で細胞を獲得し、Ｆｌｏｗｊ
ｏ １０．０．７ｒ２（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて分析を行
った。増殖分析は、Ｆｌｏｗｊｏ ９．３．２（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて行った。

（細胞傷害性アッセイ）

４時間ルシフェラーゼベースの細胞毒性アッセイを、ＧＦＰ－ホタルルシフェラーゼ（
ＧＦＰ－ＦＦｌｕｃ）を発現するＬＡＮ－１神経芽細胞腫細胞株を使用して、少しの改変
を伴う以前に記載されたプロトコル（Ｌｉｕ、２０１３）に基づいて実施した。簡潔には
、ウェルあたり２×１０４ ＬＡＮ－１神経芽腫細胞を、９６ウェル黒色プレート（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）にプレートした。２４時間後、ＣＡＲ Ｔ細胞を種
々のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で添加した。ウェルあたりのＬＡＮ－１細胞の生存
数を、ＬＡＮ－１細胞の連続希釈によって作製された標準曲線を用いて決定した。パーセ
ント細胞傷害性を計算するために使用される式は、以下の通りである。（未処理ウェルに
おける細胞数－アッセイウェルにおける細胞数）／（未処理ウェルにおける細胞数）。

（連続腫瘍チャレンジ試験）

ＧＤ２－ＣＡＲまたはＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒで形質導入した０．５×１０６個のＬＡ
Ｎ－１細胞および１×１０６個のＴ細胞を、ＩＬ－１５およびＩＬ－７を含まない新鮮な
培地を用いて２４ウェルプレートで共培養した。７日後、細胞を、ＦＡＣ分析またはトリ
パンブルー排除によるＴ細胞定量のいずれかのために回収した。次いで、ＣＡＲ Ｔ細胞
を、２：１のＥ：Ｔ比で、新鮮な細胞培養培地中の新鮮なＬＡＮ－１細胞と再プレーティ
ングして、第２および第３の腫瘍共培養を開始した。３回目の共培養の終わりに、Ｔ細胞
を計数し、共培養物をＦＡＣＳによって分析した。

（定量的フロー分析）

抗体染色した細胞を計数するために、ＰＢＳ洗浄後、２５μＬの計数ビーズ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２μＬの７－ＡＡＤを（死細胞排除のために）添加
し、そして細胞を直ちに分析した。事象の獲得は、３０００個の計数ビーズの収集に基づ
いていた。

（サイトカイン産生の分析）

ＧＤ２－ＣＡＲまたはＧＤ２－ＣＡＲ．Ｃ７Ｒを発現するＴ細胞を、サイトカインを含
まない完全培養培地中の２４ウェルプレート中で、１：４のＥ：Ｔ比を用いてＬＡＮ－１
細胞と共に培養した。２４時間後、上清を回収した。ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いてＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α放出を
定量した。

（リン酸化ＳＴＡＴ５アッセイ）

形質導入したＴ細胞を回収し、サイトカインを含まない０．５×１０６細胞／ｍＬの完
全培地で再懸濁し、次いで、４８ウェル組織培養プレートにウェル当たり０．５×１０６
細胞でプレートした。２４～７２時間後、細胞をＦＡＣチューブに回収し、冷流緩衝液（
５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳ）で洗浄し、１００μＬのＦｉｘ ＆ Ｐｅｒｍ Ｒｅａｇｅｎ
ｔ Ａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を細胞に加え、穏やかにボルテックスし
、室温で３分間インキュベートした後、氷冷メタノール３ｍＬを一定のボルテックスでチ
ューブにゆっくり加えた。次いで、チューブを４℃で１０分間インキュベートした後、チ
ューブを遠心分離し、メタノールを廃棄し、続いて冷流緩衝液でもう一度洗浄ステップを
行った。次いで、１００μＬのＦｉｘ ＆ Ｐｅｒｍ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５μＬの抗ＳＴＡＴ５抗体を細胞に添加した。細胞を
穏やかにボルテックスし、次いで室温で３０分間暗所でインキュベートした。その後、細
胞を冷流緩衝液でもう１回洗浄し、次いで直ちに分析した。

（細胞痕跡バイオレット増殖アッセイ）

ＬＡＮ－１腫瘍細胞との単一共培養後、ＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＧＤ２－ＣＡＲ
．Ｃ７Ｒ Ｔ細胞を、製造業者の指示に従ってＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入した
キットを使用して、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで標識した。次いで、Ｔ細胞を
、分析前に１週間、腫瘍細胞で再チャレンジした。７－ＡＡＤを添加して、死細胞を排除
した。

（アポトーシス分析）

細胞をアネキシンＶ抗体および７－ＡＡＤと共にインキュベートし、フローサイトメト
リーによって分析した。ｉＣ９を用いた実験のために、二量体化の化学的誘導物質（ＣＩ
Ｄ）、ＡＰ２０１８７をＴａｋａｒａ Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した。

（細胞株）

ＬＡＮ－１およびＵ３７３をＡＴＣＣから購入し、ＬＡＮ－１ ＧＦＰ－ＦＦｌｕｃお
よびＵ３７３ ＧＦＰ－ＦＦｌｕｃを生成するために使用した。ＣＨＬＡ－２５５および
ＣＨＬＡ－２５５ ＦＦｌｕｃは、以前に記載されたように確立および維持された（Liu,
2012, J Clin Invest.2012 Jun 1;122(6)): 2221-223）。酵素ベースのアッセイ（Ｌｏｎ
ｚａ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）を用いてルーチンのマイコプラズマサーベイランスを実
施し、ＳＴＲプロファイリングを用いて記載した実験から１年以内に細胞を認証した。

（遺伝子発現解析）

全ＲＮＡを、Ｑｉａｚｏｌ試薬およびｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａ
ｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて回収した。遺伝子発現分析はＢａｙｌｏ
ｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ＲＮＡ Ｐｒ
ｏｆｉｌｉｎｇ ＣｏｒｅのＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｐａｎｅｌ ｖｅｒｓｉｏｎ ２（
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）を用い、ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いた。ｎＳｏｌｖｅｒ ３．０ソフトウェア（ＮａｎｏＳｔｒ
ｉｎｇ）を用いてデータを分析した。

（Ｉｎ ｖｉｖｏ実験）

全ての動物実験は、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ
によって承認されたプロトコルに従った。

皮下神経芽細胞腫マウスモデル：１０－１４週齢の雌ＮＳＧマウスに、１００μＬの基
底膜Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の２００万個のＬＡＮ－１神経芽細胞腫細胞
を背側左側腹部に皮下移植した。８日後、マウスを、群の腫瘍手段および分散が類似する
ように、腫瘍サイズに基づいて群に分けた。次いで、１００万個のＧＤ２－ＣＡＲ Ｔ細
胞を静脈内注射した（ＰＢＭＣ単離の１０～１２日後）。腫瘍サイズをキャリパーで週に
２回測定し、マウスを、マウスあたり１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリン（Ｘｅｎｏｇ
ｅｎ）を腹腔内に注射してから１０～１５分後に、ＩＶＩＳ（登録商標）システム（ＩＶ
ＩＳ、Ｘｅｎｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を使用して、
同じ時点でＴ細胞からの生物発光シグナルについて画像化した。腫瘍直径が１５ｍｍ以上
である場合、または腫瘍がマウス体重の１０％を超える場合、マウスを安楽死させた。

転移性神経芽細胞腫マウスモデル：１０－１４ 週齢の雌ＮＳＧマウスに、Ｆｉｒｅｆ
ｌｙ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを発現する１００万個のＣＨＬＡ－２５５細胞（ＣＨＬＡ－
２５５ ＦＦｌｕｃ）を静脈注射した。７日後、マウスに１００万個のＧＤ２－ＣＡＲ
Ｔ細胞を静脈内注射した（ＰＢＭＣ単離の１０－１２日後）。並行実験において、腫瘍増
殖またはＴ細胞増殖を、上記のように週１回の生物発光イメージングによって間接的に評
価した。腫瘍増殖を追跡した実験では、ＣＨＬＡ－２５５ ＦＦｌｕｃルミネセンスがＴ
細胞注射の時点で検出できなかったため、マウス群は腫瘍量について標準化されなかった
。

同所性膠芽腫マウスモデル：１０５ Ｕ３７３膠芽腫細胞を、８週齢の雄ＩＣＲ－ＳＣ
ＩＤマウスにおいて頭蓋内に、以前に記載したように樹立した（Chow,2013, Mol Ther.20
13 Mar;21(3):629-637）．腫瘍生着の７日後、１０４個のＴ細胞を頭蓋内に直接腫瘍に注
射した。腫瘍増殖またはＴ細胞増殖を、上記のように週１回の生物発光イメージングによ
って評価した。腫瘍増殖実験のマウスを、腫瘍負荷について標準化したが、分散について
は標準化しなかった。

（統計解析）

グラフおよび統計はＷｉｎｄｏｗｓ用のＰｒｉｓｍ ５．０ソフトウェア（Ｇｒａｐｈ
ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて作成し、測定デ
ータを平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示す。手段間の差異を、対になった両側ｔ
検定を用いて試験した。マウス実験では、各時点でのベースラインからの腫瘍放射輝度の
変化を計算し、適切な場合、両側対ｔ検定またはウェルチｔ検定を用いて群間で比較した
。一元配置分散分析およびＢａｒｔｌｅｔｔの等分散検定を適宜用いて、群間の腫瘍平均
および分散が同等であることを確認した。腫瘍細胞注射の時点から決定された生存を、カ
プラン・マイヤー法により分析し、そして群間の生存率の差異を、ログランク検定により
比較した。

Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。

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