JP2024119178A - Fish reproductive organ development promoter - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、魚類の生殖腺発育促進剤に関する。本発明はまた、魚類の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進剤に関する。 The present invention relates to a fish reproductive gland development promoter. The present invention also relates to a fish follicle-stimulating hormone (FSH) release promoter.
脊椎動物において、卵を成長させて排卵させる制御システムとして、脳下垂体で産生される卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）といった生殖腺刺激ホルモン（ＧＴＨ）が中心的役割を果たしている。魚類では、脳下垂体から分泌されたＦＳＨが血流に入り卵母細胞を取り囲む卵胞細胞に作用し、エストロジェンおよびビテロジェニンを介することにより、卵母細胞では卵黄形成が進み、卵母細胞が発育する。人工飼育環境下のウナギ等においては、生殖腺の成熟がほとんど進行しないため人為的な成熟誘導（人為催熟）が行われる。近年の人為催熟の研究により、ウナギやその他の魚類の発達中の卵巣において卵母細胞と、卵母細胞を取り囲む卵胞細胞の発育はＦＳＨのみによって促進され、ＬＨは卵母細胞の最終成熟・排卵の誘発のみに関わることが明らかとなってきた（非特許文献１および２）。人為催熟としては、これまでウナギの卵を得るためにＦＳＨの投与が行われてきたものの、ＦＳＨは複雑な糖タンパク質ホルモンであり、合成に莫大なコストがかかる。このため、ＦＳＨの比較的安価な代用として、サケ脳下垂体抽出物を使用する技術が用いられているが、排卵を促すホルモン等の夾雑物の影響による卵質の低下が課題となっている。 In vertebrates, gonadotropic hormones (GTHs), such as follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), produced by the pituitary gland, play a central role in the control system that develops eggs and causes ovulation. In fish, FSH secreted from the pituitary gland enters the bloodstream and acts on the follicle cells surrounding the oocyte, and via estrogen and vitellogenin, yolk formation in the oocyte progresses and the oocyte develops. In eels and other animals reared in an artificial environment, the maturation of the gonads hardly progresses, so artificial maturation induction (artificial maturation) is performed. Recent research on artificial maturation has revealed that in the developing ovaries of eels and other fish, the development of oocytes and the follicle cells surrounding the oocytes is promoted only by FSH, and LH is only involved in inducing the final maturation and ovulation of the oocyte (Non-Patent Documents 1 and 2). To artificially stimulate maturation, FSH has been administered to eels to obtain eggs, but FSH is a complex glycoprotein hormone and is extremely costly to synthesize. For this reason, a technology that uses salmon pituitary extract as a relatively inexpensive substitute for FSH has been used, but there is an issue of a decline in egg quality due to the influence of impurities such as hormones that stimulate ovulation.
魚類において、ＬＨの制御には視床下部ホルモンであるゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ／ＬＨＲＨ）が有効であることが古くから知られていた。一方で、卵胞細胞および卵母細胞の発達を促すＦＳＨの制御に関しては明らかとなっていなかった。 It has long been known that the hypothalamic hormone gonadotropin-releasing hormone (GnRH/LHRH) is effective in controlling LH in fish. However, the control of FSH, which promotes the development of follicular cells and oocytes, was unclear.
本発明は、魚類の生殖腺発育促進剤の提供を目的とする。 The present invention aims to provide a fish reproductive gland growth promoter.
本発明者らは今般、イン・サイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法および免疫組織化学により、メダカ成体脳下垂体においてＦＳＨ細胞がＣＣＫ受容体Ｂ１（ＣＣＫＲＢ１）を発現し、視床下部のＣＣＫニューロンからの支配を受けることを見出した。本発明者らはまた、ＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイにより、メダカＣＣＫ－８およびメダカガストリン－８がＣＣＫＲＢ１を介してｃＡＭＰ、Ｃａ２＋およびＭＡＰＫを賦活することを見出した。本発明者らはまた、ＣＣＫＲＢ１ノックアウトメダカの解析により、ＣＣＫＲＢ１ノックアウトメダカでは卵巣および精巣の発達が著しく阻害され、ＦＳＨ発現量も著しく低下することを見出した。本発明者らはまた、カルシウムイメージング解析により、メダカＣＣＫ－８およびメダカＣＣＫ－４がＦＳＨ細胞の細胞内カルシウム濃度を急激に上昇させること、すなわちＦＳＨ放出を促進することを見出した。本発明者らはまた、ＰＣＲ法および二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法により、メダカで見出した知見が魚類一般において保存された機構であって、魚類一般に適用できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。 The present inventors have now found by in situ hybridization and immunohistochemistry that FSH cells in the medaka adult pituitary gland express CCK receptor B1 (CCKRB1) and are controlled by CCK neurons in the hypothalamus. The present inventors have also found by CCKRB1 reporter assay that medaka CCK-8 and medaka gastrin-8 activate cAMP, Ca 2+ and MAPK via CCKRB1. The present inventors have also found by analysis of CCKRB1 knockout medaka that ovarian and testicular development is significantly inhibited and FSH expression is significantly reduced in CCKRB1 knockout medaka. The present inventors also found by calcium imaging analysis that medaka CCK-8 and medaka CCK-4 rapidly increase the intracellular calcium concentration in FSH cells, i.e., promote FSH release. The present inventors also found by PCR and double in situ hybridization that the findings found in medaka are a mechanism conserved in fish in general and can be applied to fish in general. The present invention is based on these findings.
本発明によれば以下の発明が提供される。
［１］コレシストキニン（ＣＣＫ）受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の生殖腺発育促進剤。
［２］生殖腺が卵巣である、上記［１］に記載の促進剤。
［３］卵胞細胞および／または卵母細胞の発育を促進するための、上記［１］または［２］に記載の促進剤。
［４］ＣＣＫ受容体作動剤がＣＣＫまたはガストリンである、上記［１］～［３］のいずれかに記載の促進剤。
［５］ＣＣＫまたはガストリンが、ヒトまたは魚類のＣＣＫまたはガストリンである、上記［４］に記載の促進剤。
［６］ＣＣＫおよびガストリンが、式（Ａ）ＤＸ１Ｘ２ＧＷＸ３ＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｘ１はＹまたはＡであり、前記Ｙは硫酸化されていてもよく、好ましくは硫酸化チロシンであり、Ｘ２およびＸ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は好ましくはＭ、Ｖ、Ｎ、Ａ、Ｑ、Ｒ、ＴまたはＮであり、Ｘ３は好ましくはＶ、ＬまたはＭである）（配列番号１３）のアミノ酸配列または式（Ｂ）ＷＸ４ＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｘ４は任意のアミノ酸であり、Ｘ４は好ましくはＭ、ＬまたはＶである）（配列番号１２）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチドである、上記［４］または［５］に記載の促進剤。
［７］前記式（Ａ）のアミノ酸配列が、
式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６）、
式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）、
式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５）、
式（４）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１８）、
式（５）ＤＹＶＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１９）、
式（６）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号２０）および
式（７）ＤＡＮＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２１）
からなる群から選択される、上記［６］に記載の促進剤。
［８］魚類が、下位条鰭類または真骨魚類である、上記［１］～［７］のいずれかに記載の促進剤。
［９］ＣＣＫ受容体作動剤を有効成分として含んでなる、魚類の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進剤。
［１０］ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、魚類卵母細胞の卵黄形成促進方法。
［１１］ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、生殖腺の発育が促進された魚類の生産方法。
［１２］魚類がウナギまたはチョウザメである、上記［１１］に記載の方法。
［１３］上記［１１］または［１２］に記載の方法を実施して生殖腺の発育が促進された魚類を生産し、次いで、生殖腺の発育が促進された魚類から卵を採取する、魚類の卵の採取方法。
［１４］上記［１３］に記載の方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させることを含む、魚類の受精卵の生産方法。
［１５］上記［１３］に記載の方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させ、さらに得られた受精卵を孵化させることを含む、魚類の仔魚の生産方法。
［１６］生殖腺の発育が促進された魚類が、早期催熟された魚類である、上記［１１］～［１５］のいずれかに記載の生産方法。
According to the present invention, the following inventions are provided.
[1] A fish gonad development promoter comprising a cholecystokinin (CCK) receptor agonist as an active ingredient.
[2] The promoter according to the above [1], wherein the gonad is an ovary.
[3] The promoter according to [1] or [2] above for promoting the development of follicle cells and/or oocytes.
[4] The enhancer according to any one of the above [1] to [3], wherein the CCK receptor agonist is CCK or gastrin.
[5] The enhancer according to the above-mentioned [4], wherein the CCK or gastrin is human or fish CCK or gastrin.
[6] The agent according to the above [ 4] or [5 ] , wherein the CCK and gastrin are peptides having at their C-terminus an amino acid sequence of the formula (A) DX1X2GWX3DF - NH2 (wherein X1 is Y or A, said Y may be sulfated and is preferably sulfated tyrosine, X2 and X3 are any amino acid, X2 is preferably M, V, N, A, Q, R, T or N, and X3 is preferably V, L or M) (SEQ ID NO: 13) or an amino acid sequence of the formula (B) WX4DF - NH2 (wherein X4 is any amino acid and X4 is preferably M, L or V) (SEQ ID NO: 12).
[7] The amino acid sequence of the formula (A) is
Formula (1) DYMGWMDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 6),
Formula (2) DYLGWMDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 4),
Formula (3) DYRGWLDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 5),
Formula (4) DYLGWMDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 18),
Formula (5) DYVGWMDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 19),
Formula (6) DYMGWMDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 20) and Formula (7) DANGWMDF-NH 2 (SEQ ID NO: 21)
The accelerator according to the above [6], selected from the group consisting of:
[8] The promoter according to any one of the above [1] to [7], wherein the fish is a lower actinopterygian or a teleost.
[9] A fish follicle-stimulating hormone (FSH) release promoter comprising a CCK receptor agonist as an active ingredient.
[10] A method for promoting vitellogenesis in fish oocytes, comprising administering a CCK receptor agonist to fish.
[11] A method for producing fish having enhanced gonad development, comprising administering a CCK receptor agonist to fish.
[12] The method according to [11] above, wherein the fish is an eel or a sturgeon.
[13] A method for harvesting fish eggs, comprising carrying out the method described in [11] or [12] above to produce fish in which gonad development has been promoted, and then harvesting eggs from the fish in which gonad development has been promoted.
[14] A method for producing fertilized eggs of fish, comprising carrying out the method according to [13] above to collect eggs from fish, and then artificially fertilizing the collected eggs.
[15] A method for producing fish larvae, comprising carrying out the method described in [13] above to collect eggs from fish, artificially fertilizing the collected eggs, and hatching the obtained fertilized eggs.
[16] The method according to any one of [11] to [15] above, wherein the fish in which gonad development has been promoted is a fish in which early maturation has been induced.
本発明によれば、魚類において生殖腺、特に卵胞細胞および卵母細胞の発育を、４ないし８アミノ酸からなる非常に安価なＣＣＫおよびガストリン等のＣＣＫ受容体作動剤の投与により促進できる点で有利である。 The present invention is advantageous in that it can promote the development of gonads, particularly follicular cells and oocytes, in fish by administering CCK, which is a very inexpensive compound consisting of 4 to 8 amino acids, and a CCK receptor agonist such as gastrin.
本発明において「コレシストキニン受容体作動剤」（本明細書において、「ＣＣＫ受容体作動剤」ともいう）は、ＣＣＫ受容体介在性シグナル伝達を活性化する薬剤をいう。 In the present invention, a "cholecystokinin receptor agonist" (also referred to as a "CCK receptor agonist" in the present specification) refers to a drug that activates CCK receptor-mediated signal transduction.
ＣＣＫ受容体介在性シグナル伝達の活性化は、後記実施例に記載されるように、ＣＣＫＲＢ１遺伝子を発現させた培養細胞を用いて、細胞内カルシウム濃度、細胞内ｃＡＭＰ濃度または細胞内ＭＡＰＫ濃度をモニターする方法により確認することができる。 Activation of CCK receptor-mediated signal transduction can be confirmed by monitoring intracellular calcium concentration, intracellular cAMP concentration, or intracellular MAPK concentration using cultured cells expressing the CCKRB1 gene, as described in the Examples below.
ＣＣＫ受容体作動剤としては、ＣＣＫ受容体に対してアゴニストとして作用するペプチド、タンパク質および化合物とすることができ、例えば、コレシストキニン（ｃｈｏｌｅｓｙｓｔｏｋｉｎｉｎ、本明細書において「ＣＣＫ」ということがある）、ガストリン（ｇａｓｔｒｉｎ）が挙げられる。本発明においては、コレシストキニン（ＣＣＫ）およびガストリン並びにそれらの断片からなる群から選択される１種以上のペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。なお、本発明において上記ペプチドを構成するアミノ酸は天然のＣＣＫおよびガストリンにおけるアミノ酸の修飾（例えば、Ｃ末端から７番目のチロシン残基の硫酸化、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシ基のアミド化）がなされているものとすることができる。 The CCK receptor agonist may be a peptide, protein, or compound that acts as an agonist on the CCK receptor, such as cholecystokinin (sometimes referred to as "CCK" in this specification) or gastrin. In the present invention, one or more peptides selected from the group consisting of cholecystokinin (CCK) and gastrin and fragments thereof may be used as the CCK receptor agonist. In the present invention, the amino acids constituting the above peptides may be modified amino acids in natural CCK and gastrin (e.g., sulfation of the seventh tyrosine residue from the C-terminus, amidation of the carboxy group of the C-terminal amino acid).
「コレシストキニン」（本明細書において、「ＣＣＫ」ともいう）は、消化管ホルモンおよび神経伝達物質として機能するペプチドである。ヒトでは、３３個のアミノ酸残基からなるコレシストキニンポリペプチド（ＣＣＫ－３３）は消化管ホルモンであり、Ｃ末端オクタペプチド（ＣＣＫ－８）がＣＣＫ－３３の生物活性に重要な役割を果たす。ヒトではまた、ＣＣＫは脳および末梢神経系にも存在し、ＣＣＫ－８の形でシナプス小胞内に存在し、睡眠や食欲に関与することが知られている。また、本明細書においてＣＣＫのＣ末端テトラペプチドをＣＣＫ－４という。 "Cholecystokinin" (also referred to as "CCK" in this specification) is a peptide that functions as a gastrointestinal hormone and a neurotransmitter. In humans, cholecystokinin polypeptide (CCK-33) consisting of 33 amino acid residues is a gastrointestinal hormone, and the C-terminal octapeptide (CCK-8) plays an important role in the biological activity of CCK-33. In humans, CCK is also present in the brain and peripheral nervous system, where it exists in synaptic vesicles in the form of CCK-8 and is known to be involved in sleep and appetite. In addition, the C-terminal tetrapeptide of CCK is referred to as CCK-4 in this specification.
「ガストリン」とは、ヒトでは消化管ホルモンであり、１７個のアミノ酸残基からなる直鎖のペプチドである。 Gastrin is a gastrointestinal hormone in humans, and is a linear peptide consisting of 17 amino acid residues.
天然に存在するＣＣＫおよびガストリンは、いずれもＣＣＫのアゴニスト活性を高める、硫酸化されたチロシン（Ｔｙｒ）残基を有することがあり、この場合、ＣＣＫではＣ末端から７番目のチロシン残基が、非哺乳類動物のガストリンではＣ末端から７番目のチロシン残基が硫酸化されている。天然に存在するＣＣＫとガストリンはまた、いずれも、Ｃ末端アミノ酸残基はアミド化されているという特徴を有する。天然に存在するＣＣＫとガストリンはさらに、ＣＣＫおよびガストリンと受容体との結合に寄与するＣ末端側の４アミノ酸残基において共通し、共通配列は式（Ｂ）ＷＸ４ＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｘ４は任意のアミノ酸であり、Ｘ４は好ましくはＭ、ＬまたはＶである）（配列番号１２）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（Ｂ）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（Ｂ）のアミノ酸配列を有するテトラペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。 Both naturally occurring CCK and gastrin may have a sulfated tyrosine (Tyr) residue that enhances the agonist activity of CCK, in which the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated in CCK and the seventh tyrosine residue from the C-terminus in non-mammalian gastrin. Both naturally occurring CCK and gastrin are also characterized in that the C-terminal amino acid residue is amidated. Naturally occurring CCK and gastrin further share four amino acid residues on the C-terminus side that contribute to the binding of CCK and gastrin to the receptor, and the consensus sequence can be represented by the amino acid sequence of formula (B) WX 4 DF-NH 2 (wherein X 4 is any amino acid, and X 4 is preferably M, L or V) (SEQ ID NO: 12). In the present invention, a peptide having the amino acid sequence of formula (B) at its C-terminus (the upper limit of the amino acid length can be 33 amino acid residues, 17 amino acid residues, 15 amino acid residues, 14 amino acid residues, 13 amino acid residues, 12 amino acid residues, 11 amino acid residues, 10 amino acid residues, or 9 amino acid residues) can be used as a CCK receptor agonist, and preferably a tetrapeptide having the amino acid sequence of formula (B) can be used as a CCK receptor agonist.
ＣＣＫとガストリンは、脊椎動物において共通祖先を有するペプチドであることが示唆され、軟骨魚類から哺乳類まで広い動物種で同定されている。魚類では多くの種において、ＣＣＫおよびガストリンの活性部位は共通し、該活性部位はＣ末端側の８アミノ酸残基からなる式（Ａ）ＤＸ１Ｘ２ＧＷＸ３ＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｘ１はＹまたはＡであり、前記Ｙは硫酸化されていてもよく、好ましくは硫酸化チロシンであり、Ｘ２およびＸ３は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は好ましくはＭ、Ｖ、Ｎ、Ａ、Ｑ、Ｒ、ＴまたはＮであり、Ｘ３は好ましくはＶ、ＬまたはＭである）（配列番号１３）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（Ａ）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（Ａ）のアミノ酸配列を有するオクタペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。 It has been suggested that CCK and gastrin are peptides that share a common ancestor in vertebrates, and they have been identified in a wide range of animal species, from cartilaginous fish to mammals. In many fish species, the active site of CCK and gastrin is common, and the active site can be represented by an amino acid sequence of the formula (A) DX 1 X 2 GWX 3 DF-NH 2 (wherein X 1 is Y or A, Y may be sulfated and is preferably sulfated tyrosine, X 2 and X 3 are any amino acid, X 2 is preferably M, V, N, A, Q, R, T or N, and X 3 is preferably V, L or M) (SEQ ID NO: 13) consisting of 8 amino acid residues on the C-terminus side. In the present invention, a peptide having the amino acid sequence of formula (A) at its C-terminus (the upper limit of the amino acid length can be 33 amino acid residues, 17 amino acid residues, 15 amino acid residues, 14 amino acid residues, 13 amino acid residues, 12 amino acid residues, 11 amino acid residues, 10 amino acid residues, or 9 amino acid residues) can be used as a CCK receptor agonist, and preferably an octapeptide having the amino acid sequence of formula (A) can be used as a CCK receptor agonist.
ヒトでは、ＣＣＫは消化管ホルモンおよび神経伝達物質であり、Ｃ末端の８個のアミノ酸残基からなる活性部位をもつ。この活性部位の８アミノ酸残基は式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（１）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（１）のアミノ酸配列を有するオクタペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。 In humans, CCK is a gastrointestinal hormone and neurotransmitter, and has an active site consisting of eight amino acid residues at the C-terminus. The eight amino acid residues at the active site can be represented by the amino acid sequence of formula (1) DYMGWMDF-NH 2 (the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 6). In the present invention, a peptide having the amino acid sequence of formula (1) at its C-terminus (the upper limit of the amino acid length can be 33 amino acid residues, 17 amino acid residues, 15 amino acid residues, 14 amino acid residues, 13 amino acid residues, 12 amino acid residues, 11 amino acid residues, 10 amino acid residues, or 9 amino acid residues) can be used as a CCK receptor agonist, and preferably an octapeptide having the amino acid sequence of formula (1) can be used as a CCK receptor agonist.
メダカでは、ＣＣＫはペプチドホルモン・神経伝達物質であり、Ｃ末端の８個のアミノ酸残基からなる活性部位をもつ。メダカではＣＣＫ遺伝子はＣＣＫＡおよびＣＣＫＢ遺伝子の２種類が存在し、いずれの遺伝子がコードするペプチドも、活性部位の８アミノ酸残基は式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）のアミノ酸配列で表すことができ、Ｃ末端側の４アミノ酸残基は式（８）ＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２２）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（２）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（２）のアミノ酸配列を有するオクタペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。本発明においては式（８）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基、９アミノ酸残基、８アミノ酸残基、７アミノ酸残基、６アミノ酸残基または５アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（８）のアミノ酸配列を有するテトラペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。 In medaka, CCK is a peptide hormone/neurotransmitter with an active site consisting of eight amino acid residues at the C-terminus. There are two types of CCK genes in medaka, CCKA and CCKB, and the eight amino acid residues at the active site of the peptides encoded by either gene can be represented by the amino acid sequence of formula (2) DYLGWMDF-NH 2 (the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 4), and the four amino acid residues on the C-terminus side can be represented by the amino acid sequence of formula (8) WMDF-NH 2 (SEQ ID NO: 22). In the present invention, a peptide having an amino acid sequence of formula (2) at its C-terminus (the upper limit of the amino acid length can be 33, 17, 15, 14, 13, 12, 11, 10, or 9 amino acid residues) can be used as a CCK receptor agonist, and preferably an octapeptide having the amino acid sequence of formula (2) can be used as a CCK receptor agonist. In the present invention, a peptide having an amino acid sequence of formula (8) at its C-terminus (the upper limit of the amino acid length can be 33, 17, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, or 5 amino acid residues) can be used as a CCK receptor agonist, and preferably a tetrapeptide having the amino acid sequence of formula (8) can be used as a CCK receptor agonist.
メダカではまた、ガストリンはペプチドホルモンであり、Ｃ末端の８個のアミノ酸残基からなる活性部位をもつ。この活性部位の８アミノ酸残基は式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（３）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（３）のアミノ酸配列を有するオクタペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。 In medaka, gastrin is a peptide hormone and has an active site consisting of eight amino acid residues at the C-terminus. The eight amino acid residues at the active site can be represented by the amino acid sequence of formula (3): DYRGWLDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO:5). In the present invention, a peptide having the amino acid sequence of formula (3) at its C-terminus (the upper limit of the amino acid length can be 17, 15, 14, 13, 12, 11, 10 or 9 amino acid residues) can be used as a CCK receptor agonist, and preferably an octapeptide having the amino acid sequence of formula (3) can be used as a CCK receptor agonist.
ウナギでは、ＣＣＫ遺伝子は２種類存在し、活性部位の８アミノ酸残基は、式（４）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１８）および式（５）ＤＹＶＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１９）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（４）または式（５）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（４）または式（５）のアミノ酸配列を有するオクタペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。 In eels, there are two types of CCK genes, and the eight amino acid residues in the active site can be represented by the amino acid sequences of formula (4) DYLGWMDF-NH 2 (the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 18) and formula (5) DYVGWMDF-NH 2 (the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 19). In the present invention, a peptide having the amino acid sequence of formula (4) or formula (5) at its C-terminus (the upper limit of the amino acid length can be 33, 17, 15, 14, 13, 12, 11, 10, or 9 amino acid residues) can be used as a CCK receptor agonist, and preferably an octapeptide having the amino acid sequence of formula (4) or formula (5) can be used as a CCK receptor agonist.
チョウザメ類、例えば、コチョウザメにおいてもＣＣＫ遺伝子が存在し、活性部位の８アミノ酸残基は式（６）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号２０）および式（７）ＤＡＮＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２１）のアミノ酸配列で表すことができる。本発明においては式（６）または式（７）のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは式（６）または式（７）のアミノ酸配列を有するオクタペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。 Sturgeons, for example, sterlet, also have a CCK gene, and the eight amino acid residues in the active site can be represented by the amino acid sequences of formula (6) DYMGWMDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 20) and formula (7) DANGWMDF-NH 2 (SEQ ID NO: 21). In the present invention, a peptide having the amino acid sequence of formula (6) or formula (7) at the C-terminus (the upper limit of the amino acid length can be 33, 17, 15, 14, 13, 12, 11, 10, or 9 amino acid residues) can be used as a CCK receptor agonist, and preferably an octapeptide having the amino acid sequence of formula (6) or formula (7) can be used as a CCK receptor agonist.
本明細書において、アミノ酸は以下の周知の３文字表記または１文字表記により特定することができる。
アラニン：Ａｌａ Ａ
アルギニン：Ａｒｇ Ｒ
アスパラギン：Ａｓｎ Ｎ
アスパラギン酸：Ａｓｐ Ｄ
システイン：Ｃｙｓ Ｃ
グルタミン：Ｇｌｎ Ｑ
グルタミン酸：Ｇｌｕ Ｅ
グリシン：Ｇｌｙ Ｇ
ヒスチジン：Ｈｉｓ Ｈ
イソロイシン：Ｉｌｅ Ｉ
ロイシン：Ｌｅｕ Ｌ
リシン：Ｌｙｓ Ｋ
メチオニン：Ｍｅｔ Ｍ
フェニルアラニン：Ｐｈｅ Ｆ
プロリン：Ｐｒｏ Ｐ
セリン：Ｓｅｒ Ｓ
トレオニン：Ｔｈｒ Ｔ
トリプトファン：Ｔｒｐ Ｗ
チロシン：Ｔｙｒ Ｙ
バリン：Ｖａｌ Ｖ
As used herein, amino acids can be identified by the following commonly known three letter or one letter symbols:
Alanine: Ala A
Arginine: Arg R
Asparagine: Asn N
Aspartic acid: Asp D
Cysteine: Cys C
Glutamine: Gln Q
Glutamic acid: Glu E
Glycine: Gly G
Histidine: His H
Isoleucine: Ile I
Leucine: Leu L
Lysine: Lys K
Methionine: Met M
Phenylalanine: Phe F
Proline: Pro P
Serine: Ser S
Threonine: Thr T
Tryptophan: Trp W
Tyrosine: Tyr Y
Valin: Val V
本発明において「任意のアミノ酸」は上記の２０種のアミノ酸から選択することができる。また、アミノ酸配列により特定されたペプチドは向かって左側がＮ末端であり、右側がＣ末端である。また、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基がアミド化されている場合には、本明細書ではペプチドのＣ末端を「－ＮＨ２」と表記する。 In the present invention, "any amino acid" can be selected from the above 20 types of amino acids. In addition, in a peptide specified by an amino acid sequence, the left side is the N-terminus and the right side is the C-terminus. In addition, when the C-terminal amino acid residue of a peptide is amidated, the C-terminus of the peptide is represented herein as "-NH 2 ".
本発明においてＣＣＫおよびガストリンは、魚類等の生物素材から単離または精製（粗精製を含む）したものを使用しても、化学的に合成したものを使用してもよい。コスト的観点から化学的に合成したものが好ましい。また本発明においてペプチドを構成するアミノ酸はＬ－アミノ酸とすることができるが、Ｄ－アミノ酸等の非天然アミノ酸も使用することができる。 In the present invention, CCK and gastrin may be isolated or purified (including crudely purified) from biological materials such as fish, or may be chemically synthesized. From the viewpoint of cost, chemically synthesized CCK and gastrin are preferable. In addition, the amino acids constituting the peptide in the present invention may be L-amino acids, but non-natural amino acids such as D-amino acids may also be used.
本発明において、ＣＣＫ受容体作動剤は、ＣＣＫおよびガストリンとすることができ、ＣＣＫおよびガストリンとしては、脊椎動物のＣＣＫおよびガストリンが挙げられ、脊椎動物としてはヒト等の哺乳類、下位条鰭類および真骨魚類などの魚類が挙げられ、ヒトまたは魚類のＣＣＫまたはガストリンとすることができる。本発明においてＣＣＫおよびガストリンは、下位条鰭類および真骨魚類のＣＣＫおよびガストリンとすることができる。下位条鰭類としては、例えば、チョウザメ目魚類が挙げられる。真骨魚類としては、例えば、ウナギ目魚類、スズキ目魚類、、カレイ目魚類、ダツ目魚類、サケ目魚類、フグ目魚類、タラ目魚類、コイ目魚類が挙げられ、本発明においてＣＣＫおよびガストリンは、真骨魚類のＣＣＫおよびガストリンとすることができ、ウナギ目魚類、スズキ目魚類、チョウザメ目魚類、カレイ目魚類、ダツ目魚類、サケ目魚類、フグ目魚類、タラ目魚類およびコイ目魚類からなる群から選択される真骨魚類のＣＣＫおよびガストリンとすることができる。 In the present invention, the CCK receptor agonist can be CCK and gastrin, and examples of the CCK and gastrin include CCK and gastrin of vertebrates, and examples of the vertebrates include mammals such as humans, and fish such as lower ray-finned fish and teleost fish, and the CCK or gastrin of humans or fish can be used. In the present invention, the CCK and gastrin can be CCK and gastrin of lower ray-finned fish and teleost fish. Examples of lower ray-finned fish include sturgeon fish. Examples of teleost fish include fish of the order Anguilliformes, fish of the order Perciformes, fish of the order Pleuronectiformes, fish of the order Garfish, fish of the order Salmoniformes, fish of the order Tetraodontiformes, fish of the order Gadiformes, and fish of the order Cypriniformes. In the present invention, the CCK and gastrin can be CCK and gastrin of teleost fish, and can be CCK and gastrin of teleost fish selected from the group consisting of fish of the order Anguilliformes, fish of the order Perciformes, fish of the order Sturgeon, fish of the order Pleuronectiformes, fish of the order Garfish, fish of the order Salmoniformes, fish of the order Tetraodontiformes, fish of the order Gadiformes, and fish of the order Cypriniformes.
本発明においてＣＣＫおよびガストリンは、例えば、表１に示されるデータベースおよびアクセッション番号により特定されるアミノ酸配列を基準とすることができる。すなわち本発明においては、表１により特定される全長アミノ酸を有するペプチドに加え、該ペプチドのＣ末端から８残基のアミノ酸配列または該ペプチドのＣ末端から４残基のアミノ酸配列をＣ末端に有するペプチド（アミノ酸長の上限は３３アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１５アミノ酸残基、１４アミノ酸残基、１３アミノ酸残基、１２アミノ酸残基、１１アミノ酸残基、１０アミノ酸残基または９アミノ酸残基とすることができる）をＣＣＫ受容体作動剤として使用することができ、好ましくは該ペプチドのＣ末端から８残基のアミノ酸配列からなるオクタペプチドまたは該ペプチドのＣ末端から４残基のアミノ酸配列からなるテトラペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができる。この場合、上記ペプチドのいずれにおいてもＣ末端アミノ酸残基はアミド化されており、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されたチロシン残基である。なお、表１に記載されていない生物種由来のＣＣＫおよびガストリン並びにそれらのＣ末端断片を含むペプチドを本発明においてＣＣＫ受容体作動剤として使用できることはいうまでもない。 In the present invention, the CCK and gastrin can be based on, for example, the amino acid sequence specified by the database and accession number shown in Table 1. That is, in the present invention, in addition to the peptide having the full-length amino acid sequence specified in Table 1, a peptide having an amino acid sequence of 8 residues from the C-terminus of the peptide or an amino acid sequence of 4 residues from the C-terminus of the peptide at the C-terminus (the upper limit of the amino acid length can be 33 amino acid residues, 17 amino acid residues, 15 amino acid residues, 14 amino acid residues, 13 amino acid residues, 12 amino acid residues, 11 amino acid residues, 10 amino acid residues, or 9 amino acid residues) can be used as a CCK receptor agonist, and preferably an octapeptide consisting of an amino acid sequence of 8 residues from the C-terminus of the peptide or a tetrapeptide consisting of an amino acid sequence of 4 residues from the C-terminus of the peptide can be used as a CCK receptor agonist. In this case, the C-terminal amino acid residue in any of the above peptides is amidated, and the seventh tyrosine residue from the C-terminus is a sulfated tyrosine residue. It goes without saying that CCK and gastrin derived from organisms not listed in Table 1, as well as peptides containing their C-terminal fragments, can be used as CCK receptor agonists in the present invention.
本発明においてＣＣＫ受容体作動剤の標的となるＣＣＫ受容体（ＣＣＫＲ）としては、例えば、脊椎動物のＣＣＫ受容体が挙げられ、脊椎動物としては下位条鰭類および真骨魚類などの魚類が挙げられるが、好ましくは生殖腺の発育促進の対象である魚類のＣＣＫ受容体とすることができる。例えば、生殖腺の発育促進の対象が下位条鰭類および真骨魚類である場合には、ＣＣＫ受容体を下位条鰭類および真骨魚類のＣＣＫ受容体Ａ（ＣＣＫＲＡ、ＣＣＫ１Ｒとも呼ばれる）およびＣＣＫ受容体Ｂ（ＣＣＫＲＢ、ＣＣＫ２Ｒとも呼ばれる）を含むＣＣＫ受容体とすることができ、好ましくは脳下垂体において発現するＣＣＫＲＡおよびＣＣＫＲＢからなる群から選択される１種以上とすることができる。ＣＣＫＲＢを複数有する種においては、ＣＣＫＲＢはいずれのＣＣＫＲＢ（動物種によっては、ＣＣＫＲＢ１およびＣＣＫＲＢ２等と呼ばれる場合がある）であってもよい。 In the present invention, the CCK receptor (CCKR) targeted by the CCK receptor agonist may be, for example, a CCK receptor of a vertebrate, and examples of the vertebrate include fish such as lower ray-finned fish and teleost fish, and preferably the CCK receptor of a fish that is the target of the promotion of gonad development. For example, when the target of the promotion of gonad development is lower ray-finned fish and teleost fish, the CCK receptor may be a CCK receptor including CCK receptor A (also called CCKRA or CCK1R) and CCK receptor B (also called CCKRB or CCK2R) of lower ray-finned fish and teleost fish, and preferably one or more types selected from the group consisting of CCKRA and CCKRB expressed in the pituitary gland. In species having multiple CCKRBs, the CCKRB may be any CCKRB (which may be called CCKRB1, CCKRB2, etc. depending on the animal species).
なお、ＣＣＫ－ＣＣＫＲファミリーの機能は脊椎動物を通じて保存されていることから（Sekiguchi, Handbook of Hormones, 2016 :177-178, e20B-1-e20B-3）、ＣＣＫ受容体作動剤のＦＳＨ細胞に対するＦＳＨホルモン放出の制御は、魚類全般で適応可能である。また、本発明の実施にあたっては適用対象の魚類の種と同じ種のＣＣＫまたはそのＣ末端ペプチドあるいはガストリンまたはそのＣ末端ペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することができるが、本発明においては、適用対象の魚類の種とは異なる種のＣＣＫまたはそのＣ末端ペプチドあるいはガストリンまたはそのＣ末端ペプチドをＣＣＫ受容体作動剤として使用することもできる。 Note that, because the function of the CCK-CCKR family is conserved among vertebrates (Sekiguchi, Handbook of Hormones, 2016:177-178, e20B-1-e20B-3), the control of FSH hormone release from FSH cells by a CCK receptor agonist can be applied to all fish. In carrying out the present invention, CCK or its C-terminal peptide, or gastrin or its C-terminal peptide of the same species as the target fish species can be used as the CCK receptor agonist, but in the present invention, CCK or its C-terminal peptide, or gastrin or its C-terminal peptide of a species different from the target fish species can also be used as the CCK receptor agonist.
本明細書において「生殖腺の発育促進」とは、生殖腺の発育を促進させることをいい、魚類においては卵胞の発育促進および卵母細胞の卵黄形成促進を含む意味である。生殖腺としては、卵巣および精巣が挙げられ、卵巣としては卵母細胞および卵胞（卵胞細胞）を含み、精巣としては精子、体細胞および生殖細胞を含む。 In this specification, "promotion of gonad development" refers to promoting the development of gonads, and in fish, this includes promotion of ovarian follicle development and promotion of yolk formation in oocytes. Examples of gonads include the ovaries and testes, with the ovaries including oocytes and follicles (follicular cells), and the testes including sperm, somatic cells, and germ cells.
後記実施例に示されるように、ＣＣＫ受容体作動剤はＦＳＨ放出促進作用を有する。魚類の卵巣では卵母細胞を取り囲む卵胞細胞の発育によって、卵母細胞の卵黄形成が促進されて卵母細胞が発育することが知られ、該卵胞の発育は、脳下垂体のＦＳＨ細胞から放出されたＦＳＨによって促進される（化学と生物、Ｖｏｌ．３９、Ｎｏ．１、２００１）。すなわち、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することにより、卵胞細胞の発育、卵母細胞の卵黄形成および生殖腺発育を促進することができる。 As shown in the Examples below, CCK receptor agonists have the effect of promoting FSH release. It is known that in fish ovaries, the development of follicular cells surrounding the oocyte promotes vitellogenesis in the oocyte, leading to the development of the oocyte, and the development of the follicles is promoted by FSH released from FSH cells in the pituitary gland (Chemistry and Biology, Vol. 39, No. 1, 2001). In other words, by administering a CCK receptor agonist to fish, it is possible to promote the development of follicular cells, vitellogenesis in the oocyte, and gonadal development.
本発明において魚類とは、特に限定されるものではなく、例えば硬骨魚類が挙げられ、好ましくは下位条鰭類および真骨魚類とすることができる。下位条鰭類としては、例えば、チョウザメ目魚類が挙げられ、チョウザメ目魚類としては、例えば、チョウザメが挙げられる。真骨魚類としては、例えば、ウナギ目魚類、スズキ目魚類、カレイ目魚類、ダツ目魚類、サケ目魚類、フグ目魚類、タラ目魚類、コイ目魚類が挙げられ、これらの魚類としては、ウナギ、マグロ、ブリ、シマアジ、アジ、ハタ、タイ、スズキ、ヒラメ、メダカ、サケ、フグ、タラ、ゼブラフィッシュが挙げられる。また、本発明において魚類は養殖魚とすることができる。 In the present invention, fishes are not particularly limited, and examples thereof include bony fishes, and preferably include lower ray-finned fishes and teleost fishes. Examples of lower ray-finned fishes include fishes of the order Acipenseriformes, and examples of the order Acipenseriformes include sturgeons. Examples of teleost fishes include fishes of the order Anguilliformes, fishes of the order Perciformes, fishes of the order Pleuronectiformes, fishes of the order Salmoniformes, fishes of the order Tetraodontiformes, fishes of the order Gadidae, and fishes of the order Cypriniformes, and examples of these fishes include eels, tuna, yellowtail, striped jack, horse mackerel, grouper, sea bream, sea bass, flounder, killifish, salmon, pufferfish, cod, and zebrafish. In the present invention, fishes can be farmed fish.
本発明の剤は魚類の生殖腺の発育を促進するホルモン剤としての側面を持つことから、水産用医薬品、飼料添加物等の形態で提供することができ、下記の記載に従って実施することができる。 The agent of the present invention acts as a hormone that promotes the development of fish gonads, and can therefore be provided in the form of aquatic medicines, feed additives, etc., and can be used according to the following description.
本発明においてＣＣＫ受容体作動剤は、魚類に経口投与することができる。ＣＣＫ受容体作動剤を含む剤を経口投与する場合は、ＣＣＫ受容体作動剤は飼料添加物として飼料の原料の形態であってもよい。 In the present invention, the CCK receptor agonist can be orally administered to fish. When an agent containing a CCK receptor agonist is orally administered, the CCK receptor agonist may be in the form of a feed ingredient as a feed additive.
本発明においてＣＣＫ受容体作動剤は、魚類に投与することができる。投与形態としては、例えば、注射による腹腔内、皮下または筋肉への注入投与、浸透圧ポンプによる持続投与および経口投与が挙げられる。ＣＣＫ受容体作動剤を含む剤を注入投与する場合は、ＣＣＫ受容体作動剤を生理食塩水に溶解させた液状組成物を調製し、該組成物を注射器により投与することができる。ＣＣＫ受容体作動剤を含む剤を浸透圧ポンプあるいはアジュバントにより持続投与する場合は、公知の方法により投与することができ、例えば、ＣＣＫ受容体作動剤をリン酸緩衝液に溶解させた組成物を市販の浸透圧ポンプにセットし、該浸透圧ポンプを腹腔内に埋め込むこと、あるいは、ＣＣＫ受容体作動剤をアジュバントに混合した組成物として投与することで、より持続的な投与をすることができる。 In the present invention, the CCK receptor agonist can be administered to fish. Examples of the administration form include intraperitoneal, subcutaneous or intramuscular injection, continuous administration by an osmotic pump, and oral administration. When administering an agent containing a CCK receptor agonist by injection, a liquid composition in which the CCK receptor agonist is dissolved in physiological saline can be prepared, and the composition can be administered by a syringe. When administering an agent containing a CCK receptor agonist continuously by an osmotic pump or an adjuvant, the agent can be administered by a known method. For example, a composition in which the CCK receptor agonist is dissolved in a phosphate buffer solution can be set in a commercially available osmotic pump and the osmotic pump can be embedded in the abdominal cavity, or a composition in which the CCK receptor agonist is mixed with an adjuvant can be administered to achieve more continuous administration.
本発明の剤の１日当たりの投与量は、対象魚類の魚種、年齢、体重、用途等によって異なるため、特に限定されない。生殖腺発育促進を目的とする投与の場合、成体１回当たりのＣＣＫ受容体作動剤の投与量（固形分換算）は、特に制限されないが、その下限は、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ・日または０．０１ｍｇ／ｋｇ・日とすることができる。また、その上限は、例えば、１００ｍｇ／ｋｇ・日、５０ｍｇ／ｋｇ・日、１０ｍｇ／ｋｇ・日または５ｍｇ／ｋｇ・日とすることができる。これらの下限値および上限値はそれぞれ任意に組み合わせることができる。また、投与の回数および頻度は、求められる生殖腺発育促進の程度に応じて適宜定めることができる。投与量ならびに投与間隔は、例えば、１日当たり１回、１週当たり１回とすることができる。本発明の剤はその効果をよりよく発揮させるために、投与期間は好ましくは２週間以上、より好ましくは３週間または４週間以上である。 The daily dose of the agent of the present invention is not particularly limited because it varies depending on the species, age, body weight, and use of the target fish. In the case of administration for the purpose of promoting gonad development, the dose of the CCK receptor agonist per adult (in terms of solid content) is not particularly limited, but the lower limit can be, for example, 0.001 mg/kg-day or 0.01 mg/kg-day. The upper limit can be, for example, 100 mg/kg-day, 50 mg/kg-day, 10 mg/kg-day, or 5 mg/kg-day. These lower and upper limits can be combined arbitrarily. The number and frequency of administration can be appropriately determined according to the degree of gonad development promotion required. The dosage and administration interval can be, for example, once per day and once per week. In order to better exert the effect of the agent of the present invention, the administration period is preferably 2 weeks or more, more preferably 3 weeks or 4 weeks or more.
本発明の剤は、他の投与できる組成物や剤と併用することに制限はない。例えば、生殖腺発育促進が期待できる素材や組成物と併用することで、生殖腺発育促進効果をさらに高めることができる。例えばまた、ＧｎＲＨ／ＬＨＲＨ、ＬＨおよびｈＣＧ等の卵の最終成熟・排卵を誘発する成分と組み合わせて用いることで、成熟した卵を適切に得ることができる。 There are no limitations on the use of the agent of the present invention in combination with other compositions or agents that can be administered. For example, the effect of promoting gonad development can be further enhanced by using the agent in combination with materials or compositions that are expected to promote gonad development. For example, mature eggs can be appropriately obtained by using the agent in combination with components that induce the final maturation and ovulation of eggs, such as GnRH/LHRH, LH, and hCG.
本明細書において「卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進」とは、脳下垂体のＦＳＨ細胞におけるＦＳＨの放出を促進させることをいう。本発明の卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）放出促進剤は、本発明の生殖腺発育促進剤の記載に従って実施することができる。 As used herein, "promoting follicle-stimulating hormone (FSH) release" refers to promoting the release of FSH from FSH cells in the pituitary gland. The follicle-stimulating hormone (FSH) release promoter of the present invention can be produced according to the description of the gonad development promoter of the present invention.
前述の通り、ＣＣＫ受容体作動剤はＦＳＨ放出促進作用を有するため、魚類卵母細胞の卵黄形成を促進する。従って、ＣＣＫ受容体作動剤は魚類卵母細胞の卵黄形成促進剤の有効成分として使用することができる。 As mentioned above, CCK receptor agonists have the effect of promoting FSH release, and therefore promote vitellogenesis in fish oocytes. Therefore, CCK receptor agonists can be used as an active ingredient in agents for promoting vitellogenesis in fish oocytes.
すなわち、本発明によれば、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、魚類卵母細胞の卵黄形成促進方法が提供される。本発明において「魚類卵母細胞の卵黄形成促進」とは、魚類の卵母細胞における卵黄形成を促進させることをいう。本発明の方法を実施する場合には魚類に有効量のＣＣＫ受容体作動剤を投与することにより実施することができる。魚類としては前記したものが挙げられ、好ましくは、ウナギまたはチョウザメとすることができる。本発明の卵黄形成促進方法は、本発明の生殖腺発育促進剤の記載に従って実施することができる。 That is, according to the present invention, there is provided a method for promoting vitellogenesis in fish oocytes, which comprises administering a CCK receptor agonist to fish. In the present invention, "promoting vitellogenesis in fish oocytes" refers to promoting vitellogenesis in fish oocytes. The method of the present invention can be carried out by administering an effective amount of a CCK receptor agonist to fish. Examples of fish include those mentioned above, and preferably eels or sturgeons. The method of promoting vitellogenesis of the present invention can be carried out according to the description of the gonadal development promoter of the present invention.
前述の通り、ＣＣＫ受容体作動剤はＦＳＨ放出促進作用を有するため、魚類の生殖腺の発育を促進する。従って、ＣＣＫ受容体作動剤は生殖腺の発育が促進された魚類の生産に用いる薬剤の有効成分として使用することができる。 As mentioned above, CCK receptor agonists promote the development of fish gonads because they have the effect of promoting FSH release. Therefore, CCK receptor agonists can be used as the active ingredient of drugs used to produce fish with promoted gonad development.
すなわち、本発明によれば、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、生殖腺の発育が促進された魚類の生産方法が提供される。本発明の生産方法を実施する場合には魚類に有効量のＣＣＫ受容体作動剤を投与することにより実施することができる。魚類としては前記したものが挙げられ、好ましくは、ウナギまたはチョウザメとすることができる。本発明の魚類の生産方法は、本発明の生殖腺発育促進剤の記載に従って実施することができる。 That is, according to the present invention, there is provided a method for producing fish with promoted gonad development, which comprises administering a CCK receptor agonist to fish. The production method of the present invention can be carried out by administering an effective amount of a CCK receptor agonist to fish. Examples of fish include those mentioned above, and preferably eels or sturgeons. The fish production method of the present invention can be carried out according to the description of the gonad development promoter of the present invention.
本発明によれば、本発明の生産方法を実施して生殖腺の発育が促進された魚類を生産し、次いで、生殖腺の発育が促進された魚類から卵を採取することができる。卵母細胞の最終成熟・排卵および卵の採取は公知の方法により行うことができる。 According to the present invention, the production method of the present invention is carried out to produce fish with accelerated gonad development, and then eggs can be harvested from the fish with accelerated gonad development. Final maturation and ovulation of oocytes and harvesting of eggs can be carried out by known methods.
すなわち、本発明によれば、本発明の生産方法を実施して生殖腺の発育が促進された魚類を生産し、次いで、生殖腺の発育が促進された魚類から卵を採取する、魚類の卵の採取方法が提供される。卵の採取方法は、卵母細胞の最終成熟および排卵させる工程を含むものとすることができる。魚類としては前記したものが挙げられ、好ましくは、ウナギまたはチョウザメとすることができる。本発明の魚類の卵の採取方法は、本発明の生殖腺発育促進剤および本発明の生産方法の記載に従って実施することができる。 That is, according to the present invention, there is provided a method for harvesting fish eggs, which involves carrying out the production method of the present invention to produce fish with accelerated gonad development, and then harvesting eggs from the fish with accelerated gonad development. The method for harvesting eggs can include the steps of final maturation and ovulation of oocytes. Examples of fish include those mentioned above, and preferably eels or sturgeons. The method for harvesting fish eggs of the present invention can be carried out in accordance with the description of the gonad development promoter of the present invention and the production method of the present invention.
本発明によれば、本発明の卵の採取方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵は人工受精させることができ、人工受精により受精卵を生産することができる。卵の人工受精は公知の方法により行うことができる。 According to the present invention, eggs are collected from fish by carrying out the egg collection method of the present invention, and the collected eggs can then be artificially fertilized to produce fertilized eggs by artificial fertilization. Artificial fertilization of eggs can be carried out by known methods.
すなわち、本発明によれば、本発明の卵の採取方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させることを含む、魚類の受精卵の生産方法が提供される。魚類としては前記した魚類が挙げられ、好ましくは、ウナギまたはチョウザメとすることができる。本発明の魚類の受精卵の生産方法は、本発明の生殖腺発育促進剤、本発明の生産方法および本発明の魚類の卵の採取方法の記載に従って実施することができる。 That is, according to the present invention, there is provided a method for producing fertilized fish eggs, which comprises carrying out the egg collection method of the present invention to collect eggs from fish, and then artificially fertilizing the collected eggs. Examples of fish include the fish mentioned above, and preferably eels or sturgeons. The method for producing fertilized fish eggs of the present invention can be carried out in accordance with the description of the gonad growth promoter of the present invention, the production method of the present invention, and the method for collecting fish eggs of the present invention.
本発明の卵の採取方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させることができ、さらに得られた受精卵を孵化させることにより、仔魚を生産することができる。仔魚の生産は公知の方法により行うことができる。 The egg harvesting method of the present invention is carried out to harvest eggs from fish, and the harvested eggs can then be artificially fertilized. The resulting fertilized eggs can then be hatched to produce larvae. Larvae can be produced by known methods.
すなわち、本発明によれば、本発明の卵の採取方法を実施して魚類から卵を採取し、次いで、採取された卵を人工受精させ、さらに得られた受精卵を孵化させることを含む、魚類の仔魚の生産方法が提供される。魚類としては前記した魚類が挙げられ、好ましくは、ウナギまたはチョウザメとすることができる。本発明の卵の採取方法は、本発明の生殖腺発育促進剤、本発明の生産方法および本発明の魚類の卵の採取方法の記載に従って実施することができる。 That is, according to the present invention, there is provided a method for producing fish larvae, which comprises carrying out the egg collection method of the present invention to collect eggs from fish, then artificially fertilizing the collected eggs, and further hatching the obtained fertilized eggs. Examples of fish include the fish mentioned above, and preferably eels or sturgeons. The egg collection method of the present invention can be carried out in accordance with the description of the gonad growth promoter of the present invention, the production method of the present invention, and the method of collecting fish eggs of the present invention.
前述の通り、ＣＣＫ受容体作動剤はＦＳＨ放出促進作用を有するため、魚類の生殖腺の発育を促進する。従って、ＣＣＫ受容体作動剤は早期催熟された魚類の生産に用いる薬剤の有効成分として使用することができる。 As mentioned above, CCK receptor agonists promote the development of fish gonads because they have the effect of promoting FSH release. Therefore, CCK receptor agonists can be used as the active ingredient of drugs used to produce early-ripened fish.
すなわち、本発明の魚類の生産方法の好ましい態様によれば、ＣＣＫ受容体作動剤を魚類に投与することを含んでなる、早期催熟された魚類の生産方法が提供される。本明細書において「早期催熟」とは、生殖腺の発育を促進させて性成熟を早めることをいう。本発明の生産方法を実施する場合には魚類に有効量のＣＣＫ受容体作動剤を投与することにより実施することができる。魚類としては前記したものが挙げられ、好ましくは、ウナギまたはチョウザメとすることができる。本発明の早期催熟された魚類の生産方法は、本発明の生殖腺発育促進剤および本発明の生産方法の記載に従って実施することができる。 That is, according to a preferred embodiment of the method for producing fish of the present invention, there is provided a method for producing early-matured fish, comprising administering a CCK receptor agonist to fish. In this specification, "early maturation" refers to promoting the development of the gonads to hasten sexual maturity. The production method of the present invention can be carried out by administering an effective amount of a CCK receptor agonist to fish. Examples of fish include those mentioned above, and preferably eels or sturgeons. The method for producing early-matured fish of the present invention can be carried out in accordance with the description of the gonad development promoter of the present invention and the production method of the present invention.
以下の例に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
例１：ＦＳＨ細胞におけるＣＣＫ受容体（ＣＣＫＲＢ１）発現および視床下部からのＣＣＫ入力の検証
例１では、ＦＳＨ細胞がＣＣＫ受容体を発現すること、また、ＦＳＨ細胞がＣＣＫニューロンの入力を受けることを検証した。
Example 1: Verification of CCK receptor (CCKRB1) expression in FSH cells and CCK input from the hypothalamus In Example 1, it was verified that FSH cells express CCK receptors and that FSH cells receive input from CCK neurons.
（１）方法
ア 二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法
メダカ成体をエチル３－アミノベンゾエートメタンスルホン酸塩（ＭＳ－２２２；０．０２％、Ｓｉｇｍａ）によって麻酔処理（以下、同様）した後、脳を摘出して４％ＰＦＡ／ＰＢＳにより４℃で固定し、次いで３０％スクロース／ＰＢＳに置換した。次いで、固定した脳を５％低融点アガロース（Ｔｙｐｅ ＩＸ、Sigma）・２０％スクロース／ＰＢＳにより包埋し、－８０℃に冷却したｎ－ヘキサンで凍結した後、クリオスタット（ＣＭ３０５０ Ｓ、Leica、Wetzlar, Germany）を用いて２５μｍ厚の脳凍結切片を作製した（Umatani et al., In: d'Angelo L, Girolamo Pd, eds. Laboratory Fish in Biomedical Research. Amsterdam: Elsevier; 2021:215-243.）。イン・サイチュハイブリダイゼーション法は、ＤＩＧラベルＣＣＫＲＢ１プローブおよびフルオレセインラベルＦＳＨｂプローブを用い、従来の方法に従って行った（Kanda et al., PLoS One. 2013; 8(4): e62776.）。なお、ＦＳＨｂ遺伝子はＦＳＨホルモンをコードし、ＣＣＫＲＢ１遺伝子はＣＣＫＲＢ１をコードする。それぞれのプローブ、ラベルされたプローブに対する抗体による標識の後、ＴＳＡ増感（ＴＳＡ ｐｌｕｓ ｂｉｏｔｉｎまたはｃｙ３、Perkin Elmer/Akoya）を行い、ＴＳＡ－ビオチンでラベルされたＣＣＫＲＢ１ ＤＩＧプローブは、ストレプトアビジンＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲートにより可視化した。両者のペルオキシダーゼ活性の検出の間に３％過酸化水素水による３０分間の処理を行い、シグナルの誤検出を防いだ。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８とｃｙ３の蛍光（それぞれＣＣＫＲＢ１ ｍＲＮＡ、ＦＳＨｂ ｍＲＮＡを標識）を、共焦点顕微鏡（ＦＶ－１０００、オリンパス）により観察した。
(1) Method A: Double in situ hybridization method. Medaka adults were anesthetized with ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS-222; 0.02%, Sigma) (hereinafter the same), and then the brain was removed and fixed in 4% PFA/PBS at 4°C, and then replaced with 30% sucrose/PBS. The fixed brains were then embedded in 5% low-melting agarose (Type IX, Sigma) and 20% sucrose/PBS, frozen in n-hexane cooled to -80°C, and 25-μm-thick brain cryosections were prepared using a cryostat (CM3050 S, Leica, Wetzlar, Germany) (Umatani et al., In: d'Angelo L, Girolamo Pd, eds. Laboratory Fish in Biomedical Research. Amsterdam: Elsevier; 2021:215-243.). In situ hybridization was performed according to conventional methods using a DIG-labeled CCKRB1 probe and a fluorescein-labeled FSHb probe (Kanda et al., PLoS One. 2013; 8(4): e62776.). The FSHb gene codes for the FSH hormone, and the CCKRB1 gene codes for CCKRB1. After labeling with antibodies against each probe and labeled probe, TSA sensitization (TSA plus biotin or cy3, Perkin Elmer/Akoya) was performed, and the CCKRB1 DIG probe labeled with TSA-biotin was visualized with a streptavidin Alexafluor488 conjugate. Between the detection of the peroxidase activity of both, a 30-minute treatment with 3% hydrogen peroxide solution was performed to prevent false detection of signals. The fluorescence of Alexafluor488 and cy3 (labeling CCKRB1 mRNA and FSHb mRNA, respectively) was observed using a confocal microscope (FV-1000, Olympus).
イ 免疫組織化学
上記の二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法に記載の方法によりメダカ成体脳の凍結切片を作成し、抗ヒトＣＣＫ抗体（Ｃ２５８１、sigma-aldrich）により標識した。具体的には、８０度に加熱した抗原賦活液（ＨｉｓｔｏＶＴ Ｏｎｅ）内で抗原賦活化処理を１５分間行った後、１０％正常ヤギ血清を含むＰＢＳで１／５，０００倍に希釈したＣＣＫ抗体を添加した。次いで、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Vector laboratory）により標識した後、ＡＢＣキット（Vector laboratory）で増感し、ストレプトアビジンａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８コンジュゲートで蛍光標識した。サンプルを封入した後、共焦点顕微鏡（ＦＶ－１０００、オリンパス）により観察した。
Immunohistochemistry: Frozen sections of medaka adult brain were prepared by the method described in the double in situ hybridization method above, and labeled with anti-human CCK antibody (C2581, Sigma-Aldrich). Specifically, antigen activation treatment was performed for 15 minutes in an antigen activation solution (HistoVT One) heated to 80 degrees, and then CCK antibody diluted 1/5,000 times with PBS containing 10% normal goat serum was added. Next, the sections were labeled with biotinylated anti-rabbit IgG secondary antibody (Vector laboratory), sensitized with ABC kit (Vector laboratory), and fluorescently labeled with streptavidin alexafluor 488 conjugate. After mounting the samples, they were observed with a confocal microscope (FV-1000, Olympus).
（２）結果
結果は、図１および図２に示す通りであった。図１では、二重イン・サイチュハイブリダイゼーションにより、メダカ成体において、ＦＳＨを発現する脳下垂体の細胞（本明細書において「ＦＳＨ細胞」ということがある）が、ＣＣＫ受容体であるＣＣＫＲＢ１遺伝子を発現していることが確認された（図１）。この結果から、ＦＳＨ細胞はＣＣＫＲＢ１を介して何らかの作用を受けることが示唆された。図２では、ＣＣＫ抗体を用いた免疫組織化学により、視床下部ＮＶＴ領域においてＣＣＫを発現するニューロン（本明細書において「ＣＣＫニューロン」ということがある）が局在すること、また、脳下垂体においてＣＣＫ免疫陽性である神経線維が密に存在することが確認された（図２）。なお、視床下部ＮＶＴ領域におけるＣＣＫニューロンの位置は、イン・サイチュハイブリダイゼーションにより確認されるＣＣＫＡおよびＣＣＫＢ ｍＲＮＡの局在と一致することが確認された（データ示さず）。以上の結果から、ＦＳＨ細胞は、視床下部のＣＣＫニューロンからの支配を受けるとともに、ＣＣＫをＦＳＨ細胞が発現するＣＣＫＲＢ１で受容していることが示された。なお、メダカには、ＣＣＫＡ遺伝子およびＣＣＫＢ遺伝子の２つのＣＣＫ遺伝子がありいずれも視床下部で発現しているが、ＣＣＫＡおよびＣＣＫＢペプチドにおいて活性を示す８アミノ酸残基である式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）のアミノ酸配列を有するメダカＣＣＫ－８は共通する。
(2) Results The results were as shown in Figures 1 and 2. In Figure 1, double in situ hybridization confirmed that FSH-expressing pituitary cells (sometimes referred to as "FSH cells" in this specification) in medaka adults express the CCKRB1 gene, which is a CCK receptor (Figure 1). This result suggested that FSH cells are affected in some way via CCKRB1. In Figure 2, immunohistochemistry using a CCK antibody confirmed that CCK-expressing neurons (sometimes referred to as "CCK neurons" in this specification) were localized in the hypothalamic NVT region, and that CCK-immunopositive nerve fibers were densely present in the pituitary gland (Figure 2). It was confirmed that the location of CCK neurons in the hypothalamic NVT region coincided with the localization of CCKA and CCKB mRNA confirmed by in situ hybridization (data not shown). These results indicate that FSH cells are controlled by CCK neurons in the hypothalamus and receive CCK via CCKRB1 expressed by FSH cells. Medaka has two CCK genes, CCKA and CCKB, both of which are expressed in the hypothalamus, but both have the same medaka CCK-8, which has the amino acid sequence of formula (2) DYLGWMDF-NH 2 (the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 4), which is eight amino acid residues that show activity in CCKA and CCKB peptides.
例２：ＣＣＫに対するＣＣＫＲＢ１活性の検証
例２では、ＣＣＫに対するＣＣＫＲＢ１の活性をＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイにより検証した。
Example 2: Verification of CCKRB1 activity against CCK In Example 2, the activity of CCKRB1 against CCK was verified by CCKRB1 reporter assay.
（１）方法
ＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイ
表２に示すメダカＣＣＫＢＲ１遺伝子のコード配列（配列番号１）を、Ｋｏｚａｋ配列を含む下記プライマーを用いてメダカ脳ｃＤＮＡにおいてＰＣＲ法により増幅した。
(1) Methods CCKRB1 Reporter Assay The coding sequence of the medaka CCKBR1 gene shown in Table 2 (SEQ ID NO: 1) was amplified by PCR in medaka brain cDNA using the following primers containing Kozak sequences.
＜メダカＣＣＫＢＲ１用プライマー＞
フォワード（配列番号２）：CTTGCCGCCATGGATACTTTGAGAAACGAGAC
リバース（配列番号３）：CTCTCAGCAGTTTCCCATGGTG
<Primer for medaka CCKBR1>
Forward (SEQ ID NO: 2): CTTGCCGCCATGGATACTTTGAGAAACGAGAC
Reverse (SEQ ID NO: 3): CTCTCAGCAGTTTCCCATGGTG
増幅したＣＣＫＢＲ１遺伝子コード配列をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯにクローニングすることにより、ＣＣＫＲＢ１発現ベクターを構築した。次いで、Ｈｅｌａ細胞に、ＣＣＫＲＢ１発現ベクターと、ｃＡＭＰ測定用コンストラクト（ｐＧＬ４．２９）、Ｃａ２＋測定用コンストラクト（ｐＧＬ４．３０）またはＭＡＰＫ測定用コンストラクト（ｐＧＬ４．３３）と、コントロールベクター（ｐＧＬ４．７４）との３つのコンストラクトをトランスフェクションし４２時間インキュベーションを行った。次いで、Ｈｅｌａ細胞を、０、１０－１１、１０－１０、１０－９、１０－８、１０－７、１０－６または１０－５Ｍの濃度の式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４、スクラム社受託合成品）のアミノ酸配列を有するメダカＣＣＫ－８または式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５、スクラム社受託合成品）のアミノ酸配列を有するメダカガストリン－８とそれぞれ６時間反応させた後、細胞を回収し、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。測定用ホタルベクター（ｐＧＬ４．２９、ｐＧＬ４．３０またはｐＧＬ４．３３）のシグナルを、コントロールベクター（ｐＧＬ４．７４）のシグナルで補正した。なお、本試験ではＣＣＫ受容体ファミリーのリガンドとなるＣＣＫ－８およびガストリン－８は、多くの魚類で保存されている活性部位である８アミノ酸残基（式（Ａ））に含まれるペプチドを用いた。 The amplified CCKRB1 gene coding sequence was cloned into pcDNA3.1/V5-His-TOPO to construct a CCKRB1 expression vector. Then, the CCKRB1 expression vector, the construct for measuring cAMP (pGL4.29), the construct for measuring Ca 2+ (pGL4.30) or the construct for measuring MAPK (pGL4.33), and the control vector (pGL4.74) were transfected into HeLa cells and incubated for 42 hours. Next, the HeLa cells were reacted with medaka CCK -8 having the amino acid sequence of formula (2) DYLGWMDF -NH 2 (the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (sequence number 4 , a product synthesized by Scrum) at concentrations of 0, 10 −11 , 10 −10 , 10 −9 , 10 −8 , 10 −7 , 10 −6 or 10 −5 M or medaka gastrin-8 having the amino acid sequence of formula (3) DYRGWLDF-NH 2 (the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (sequence number 5, a product synthesized by Scrum) for 6 hours, after which the cells were harvested and luciferase activity was measured using the Dual-Glo Luciferase Assay System. The signal of the firefly vector for measurement (pGL4.29, pGL4.30 or pGL4.33) was corrected with the signal of the control vector (pGL4.74). In this test, CCK-8 and gastrin-8, which are ligands of the CCK receptor family, were peptides containing eight amino acid residues (formula (A)), which are the active site conserved in many fishes.
（２）結果
結果は、図３に示す通りであった。図３では、ＣＣＫＲＢ１レポーターアッセイにより、メダカＣＣＫ－８およびメダカガストリン－８のいずれのペプチドも、ＣＣＫＲＢ１を介してｃＡＭＰ、Ｃａ２＋およびＭＡＰＫに対応するレポーターを生理的な濃度で賦活することが確認された。この結果は、哺乳類や鳥類などのＣＣＫＲＢで報告されている結果と整合することから、脊椎動物全般においてＣＣＫはＣＣＫＲＢに作用することが示された（Wan et al., Poult Sci. 2023 Jan;102(1):102273.、Zeng Q, Ou L, Wang W, Guo DY. Front Endocrinol (Lausanne). 2020 Mar 6;11:112.）。
(2) Results The results are shown in Figure 3. In Figure 3, it was confirmed that both peptides, medaka CCK-8 and medaka gastrin-8, activate reporters corresponding to cAMP, Ca 2+ and MAPK at physiological concentrations via CCKRB1 by CCKRB1 reporter assay. This result is consistent with the results reported for CCKRB in mammals and birds, and therefore it was shown that CCK acts on CCKRB in vertebrates in general (Wan et al., Poult Sci. 2023 Jan;102(1):102273., Zeng Q, Ou L, Wang W, Guo DY. Front Endocrinol (Lausanne). 2020 Mar 6;11:112.).
例３：ＣＣＫＲＢ１ノックアウトが生殖腺発育およびＦＳＨ ｍＲＮＡ発現に与える影響の検証
例３では、ＣＣＫＲＢ１ノックアウトが生殖腺発育およびＦＳＨ ｍＲＮＡ発現に与える影響を検証した。
Example 3: Examination of the effect of CCKRB1 knockout on gonadal development and FSH mRNA expression In Example 3, the effect of CCKRB1 knockout on gonadal development and FSH mRNA expression was examined.
（１）方法
ア ＣＣＫＲＢ１のノックアウト個体の作製および表現型の検証
ＣＣＫＲＢ１の第一エキソンに対するＣＲＩＳＰＲ（配列番号７：AAGCGTGGACGGGTTCACGCAGG）を設計し、Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ（Cas9 Nuclease protein NLS（１５μｇ／μｌ）、ニッポンジーン）およびｔｒａｃｒ ＲＮＡ（ＦＡＳＭＡＣ）とともに、１－２細胞期のメダカ胚にマイクロインジェクションした。該メダカ胚から発生した成体の交配後に得られた個体から、GAACCCGTの８塩基欠失を示すアリルを得て、野生型遺伝子座との交配を行い、系統化した。同腹由来の野生型、ヘテロノックアウト個体およびホモノックアウト個体について、卵巣および精巣の形態観察並びに脳下垂体におけるＦＳＨｂ ｍＲＮＡの発現解析を逆転写リアルタイムＰＣＲ法により行った。
(1) Method A: Creation of knockout individuals of CCKRB1 and verification of phenotype CRISPR (SEQ ID NO: 7: AAGCGTGGACGGGTCACGCAGG) for the first exon of CCKRB1 was designed and microinjected into 1-2 cell stage medaka embryos together with Cas9 protein (Cas9 Nuclease protein NLS (15 μg / μl), Nippon Gene) and tracr RNA (FASMAC). From the individuals obtained after mating of adults developed from the medaka embryos, alleles showing 8 base deletions of GAACCCGT were obtained, and crossed with wild-type loci to establish a lineage. For wild-type, hetero knockout individuals, and homo knockout individuals from the same litter, morphological observation of the ovaries and testes and expression analysis of FSHb mRNA in the pituitary gland were performed by reverse transcription real-time PCR.
イ ＦＳＨｂ ｍＲＮＡの逆転写リアルタイムＰＣＲによる発現解析
メダカ成体を麻酔処理し、脳下垂体を摘出した後、ＦａｓｔＧｅｎｅ ＲＮＡ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）を用いて脳下垂体からトータルＲＮＡを抽出した。得られたトータルＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ）を用いて逆転写し、ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）および下記プライマーを用いてＦＳＨｂ ｍＲＮＡおよび内部標準としてのａｃｔｂ ｍＲＮＡの定量的ＰＣＲを行った。
Expression analysis of FSHb mRNA by reverse transcription real-time PCR After anesthetizing the adult medaka and removing the pituitary gland, total RNA was extracted from the pituitary gland using FastGene RNA Basic Kit (Nihon Genetics). The total RNA obtained was reverse transcribed using PrimeScript RT Master Mix (Takara Bio), and quantitative PCR of FSHb mRNA and actb mRNA as an internal standard was performed using KAPA SYBR Fast qPCR Kit (Nihon Genetics) and the following primers.
＜ＦＳＨｂ用プライマー＞
フォワード（配列番号８）：TGGAGATCTACAGGCGTCGGTAC
リバース（配列番号９）：AGCTCTCCACAGGGATGCTG
＜ａｃｔｂ用プライマー＞
フォワード（配列番号１０）：GTGATGTTGATATCCGTAAGGATCTGTA
リバース（配列番号１１）：TCTGGTGGGGCAATGATCTTGA
<Primers for FSHb>
Forward (SEQ ID NO: 8): TGGAGATCTACAGGCGTCGGTAC
Reverse (SEQ ID NO: 9): AGCTCTCCACAGGGATGCTG
<Primer for actb>
Forward (SEQ ID NO: 10): GTGATGTTGATATCCGTAAGGATCTGTA
Reverse (SEQ ID NO: 11): TCTGGTGGGGCAATGATCTTGA
（２）結果
結果は、図４に示す通りであった。図４Ａでは、野生型およびＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体における生殖腺の表現型解析により、ＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体では野生型と比較して、卵巣および精巣の大きさが著しく小さくなることが確認された。卵巣重（体重比）を測定したところ、ＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体では野生型と比較して、７分の１へ減少した。この結果から、ＣＣＫＲＢ１ノックアウトにより卵巣において卵胞および卵母細胞の発達が阻害されることが示された。この結果はまた、ＦＳＨ（ＦＳＨｂ遺伝子）のノックアウトメダカ個体において生殖腺の大きさが著しく小さくなるという研究結果と類似していることから、ＣＣＫＲＢ１のノックアウトによりＦＳＨの分泌が阻害されることが示された（Takahashi et al., Endocrinology, Volume 157, Issue 10, 1 October 2016, Pages 3994-4002)。上記を確認するため、図４Ｂでは、ＣＣＫＲＢ１ノックアウト個体の脳下垂体におけるＦＳＨｂ ｍＲＮＡ発現の逆転写リアルタイムＰＣＲ法により、ＣＣＫＲＢ１ホモノックアウト個体ではヘテロノックアウト個体と比較して、ＦＳＨ遺伝子発現が４００分の１へ著しく低下することが確認された。これらの結果はまた、ＣＣＫＡおよびＣＣＫＢのダブルノックアウトメダカ個体において卵巣およびＦＳＨ発現が著しく阻害されるという結果と非常に類似する（データ示さず）。これらの結果から、メダカ生体内においてＣＣＫＲＢ１が卵巣において卵胞発育および卵母細胞の発達（すなわち、卵黄形成）を促すＦＳＨの正常な発現に必須であることが示された。
(2) Results The results are shown in FIG. 4. In FIG. 4A, phenotypic analysis of the gonads in wild-type and CCKRB1 homozygous knockout individuals confirmed that the size of the ovaries and testes was significantly smaller in CCKRB1 homozygous knockout individuals compared to the wild-type. When the ovary weight (body weight ratio) was measured, it was reduced to one-seventh of that in the CCKRB1 homozygous knockout individuals compared to the wild-type. This result indicated that the development of follicles and oocytes in the ovaries was inhibited by CCKRB1 knockout. This result was also similar to the research result that the size of the gonads was significantly reduced in FSH (FSHb gene) knockout medaka individuals, indicating that the secretion of FSH was inhibited by knockout of CCKRB1 (Takahashi et al., Endocrinology, Volume 157, Issue 10, 1 October 2016, Pages 3994-4002). To confirm the above, in Fig. 4B, reverse transcription real-time PCR of FSHb mRNA expression in the pituitary gland of CCKRB1 knockout individuals confirmed that FSH gene expression was significantly reduced to 1/400 in CCKRB1 homozygous knockout individuals compared to heterozygous knockout individuals. These results are also very similar to the results of CCKA and CCKB double knockout medaka individuals in which ovaries and FSH expression were significantly inhibited (data not shown). These results indicate that CCKRB1 is essential for normal expression of FSH in the ovary, which promotes follicular development and oocyte development (i.e., vitellogenesis) in the medaka body.
例４：ＣＣＫ受容体作動剤がＦＳＨ細胞におけるＦＳＨ放出に与える影響の検証
例４では、一般的にホルモンの放出は細胞内カルシウムの上昇によって引き起こされるため、ＣＣＫ受容体作動剤がＦＳＨの放出を促す可能性を検証するために、カルシウムイメージング実験により、ＣＣＫ受容体作動剤が細胞内カルシウムに与える影響を検証した。
Example 4: Verification of the effect of a CCK receptor agonist on FSH release in FSH cells In Example 4, since hormone release is generally caused by an increase in intracellular calcium, in order to verify the possibility that a CCK receptor agonist promotes FSH release, the effect of a CCK receptor agonist on intracellular calcium was verified by a calcium imaging experiment.
（１）方法
ＦＳＨ細胞のカルシウムイメージング解析
カルシウムインジケーターであるｉｎｖｅｒｓｅ ｐｅｒｉｃａｍをＦＳＨ細胞特異的に発現するトランスジェニックメダカ（Karigo et al., Endocrinology, Volume 155, 2014, 536-547、本明細書において「ＦＳＨ－ＩＰトランスジェニックメダカ」ということがある）を用いて、ＣＣＫ受容体作動剤に対する反応性および用量応答性をカルシウムイメージングにより試験した。ＦＳＨ－ＩＰトランスジェニックメダカを麻酔処理した後、脳下垂体を摘出し、灌流チューブへのペプチド吸着防止のために０．１％ＢＳＡを含む人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ、１３４ｍＭ ＮａＣｌ；２．９ｍＭ ＫＣｌ；２．１ｍＭ ＣａＣｌ２；１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１５ｍＭ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ｐＨ７．４）を満たしたチャンバーに移し、脳下垂体の腹側を上面にして露出した。次いで、チャンバー内に式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６、ペプチド研究所）のアミノ酸配列を有するヒトＣＣＫ－８、式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４、スクラム社受託合成品）のアミノ酸配列を有するメダカＣＣＫ－８、式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５、スクラム社受託合成品）のアミノ酸配列を有するメダカガストリン－８または式（８）ＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２２、ペプチド研究所）のアミノ酸配列を有するメダカＣＣＫ－４を含む上記ＡＣＳＦ溶液を灌流し、灌流投与時の蛍光強度の変化を、各ペプチドがＦＳＨ細胞の細胞内カルシウム濃度へ与える影響として解析した。各ペプチドの潅流投与の濃度は、反応性試験では１０００ｎＭとし、用量応答性試験では０ｎＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１０００Ｍの濃度とした。なお、式（１）のペプチドは終濃度０．１％のＤＭＳＯに溶解しているため、灌流時に使用したＡＣＳＦ溶液には同濃度のＤＭＳＯを含ませた。カルシウムイメージングは、正立蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ６００ＦＮ、Nikon）および励起光（Ｘ－Ｃｉｔｅ １１０ＬＥＤ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Excelitas Technologies）を用いて行い、蛍光画像はＺｙｌａ４．２Ｐ（Andor Technology）およびイメージングソフトウェア（Micro Manager）を用いて、ｅｘｐｏｓｕｒｅ：５０ｍｓ；ｉｎｔｅｒｖａｌ １００ｍｓにて撮影し、取得したイメージ画像をＩｍａｇｅ Ｊにより解析した。
(1) Method: Calcium imaging analysis of FSH cells. Using a transgenic medaka fish (Karigo et al., Endocrinology, Volume 155, 2014, 536-547; sometimes referred to as "FSH-IP transgenic medaka fish" in this specification) that specifically expresses inverse pericam, a calcium indicator, in FSH cells, the responsiveness and dose responsiveness to a CCK receptor agonist were examined by calcium imaging. After anesthetizing the FSH-IP transgenic medaka, the pituitary gland was removed and transferred to a chamber filled with artificial cerebrospinal fluid (ACSF, 134 mM NaCl; 2.9 mM KCl; 2.1 mM CaCl2; 1.2 mM MgCl2; 10 mM HEPES and 15 mM Glucose, pH 7.4) containing 0.1% BSA to prevent peptide adsorption to the perfusion tube, and the pituitary gland was exposed with the ventral side facing up. Next, the chamber was perfused with the above ACSF solution containing human CCK-8 having the amino acid sequence of formula (1) DYMGWMDF-NH 2 (the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (sequence number 6, Peptide Institute), medaka CCK-8 having the amino acid sequence of formula (2) DYLGWMDF-NH 2 (the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (sequence number 4, product synthesized by Scrum), medaka gastrin-8 having the amino acid sequence of formula (3) DYRGWLDF-NH 2 (the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (sequence number 5, product synthesized by Scrum), or medaka CCK-4 having the amino acid sequence of formula (8) WMDF-NH 2 (sequence number 22, Peptide Institute), and the change in fluorescence intensity during perfusion administration was analyzed as the effect of each peptide on the intracellular calcium concentration of FSH cells. The concentration of each peptide administered by perfusion was 1000 nM in the reactivity test, and 0 nM, 100 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, or 1000 M in the dose-response test. Since the peptide of formula (1) was dissolved in DMSO at a final concentration of 0.1%, the ACSF solution used during perfusion contained DMSO at the same concentration. Calcium imaging was performed using an upright fluorescent microscope (Eclipse E600FN, Nikon) and excitation light (X-Cite 110 LED Illumination System, Excelitas Technologies), and fluorescent images were taken using Zyla4.2P (Andor Technology) and imaging software (Micro Manager) at exposure: 50 ms; interval 100 ms, and the acquired images were analyzed by Image J.
（２）結果
結果は、図５に示す通りであった。図５Ａおよび図５Ｂでは、メダカＣＣＫ－８およびメダカＣＣＫ－４の投与に対する反応性をカルシウムイメージング解析したところ、１０００ｎＭのメダカＣＣＫ－８およびメダカＣＣＫ－４がＦＳＨ細胞の細胞内カルシウムを著しく上昇させることが確認された。図５Ｃでは、メダカＣＣＫ－８の投与に対する用量応答性をカルシウムイメージング解析したところ、メダカＣＣＫ－８の濃度に依存してＦＳＨ細胞の細胞内カルシウムが上昇することが確認された。なお、ヒトＣＣＫ－８およびメダカガストリン－８に対しても同様の反応性が観察された（データ示さず）。これらの結果から、ＣＣＫ－８およびガストリン－８がＦＳＨ細胞のＦＳＨホルモン放出を促進する作用を有すること、また、ＣＣＫ－４であっても上記作用を有することが示された。
(2) Results The results are shown in FIG. 5. In FIG. 5A and FIG. 5B, calcium imaging analysis was performed on the responsiveness to administration of medaka CCK-8 and medaka CCK-4, and it was confirmed that 1000 nM medaka CCK-8 and medaka CCK-4 significantly increased intracellular calcium in FSH cells. In FIG. 5C, calcium imaging analysis was performed on the dose responsiveness to administration of medaka CCK-8, and it was confirmed that intracellular calcium in FSH cells increased depending on the concentration of medaka CCK-8. Similar reactivity was observed to human CCK-8 and medaka gastrin-8 (data not shown). These results showed that CCK-8 and gastrin-8 have the effect of promoting FSH hormone release from FSH cells, and that CCK-4 also has the above effect.
例５：メダカ以外の魚類の脳下垂体におけるＣＣＫＲＢ発現の検証
例５では、逆転写ＰＣＲ法によってメダカ以外の魚類（ウナギおよびチョウザメ）の脳下垂体においてＣＣＫＲＢの発現を検証した。
Example 5: Verification of CCKRB expression in the pituitary gland of fish other than medaka In Example 5, the expression of CCKRB in the pituitary gland of fish other than medaka (eel and sturgeon) was verified by reverse transcription PCR.
（１）方法
ア ＣＣＫＢＲ１ ｍＲＮＡのＰＣＲ法による発現解析
未成熟個体のニホンウナギ（約２００～２６０ｇ）および未成熟個体のチョウザメ（１４０～２００ｇ）から例３（１）イに記載の方法と同様にして脳下垂体トータルＲＮＡの抽出および逆転写を行い、下記プライマーを用いてＣＣＫＲＢの増幅の可否をＰＣＲ法により検証した。
(1) Method A Expression analysis of CCKBR1 mRNA by PCR method Pituitary total RNA was extracted and reverse transcribed from immature Japanese eels (about 200-260 g) and immature sturgeons (140-200 g) in the same manner as described in Example 3(1)B, and the possibility of amplification of CCKRB was examined by PCR using the following primers.
＜ウナギＣＣＫＢＲ１用プライマー＞
フォワード（配列番号１４）：GCGATGGACGTACAGAAACTGAATG
リバース（配列番号１５）：CTTCCAGGTGTTGACGGAGTAG
<Primer for eel CCKBR1>
Forward (SEQ ID NO: 14): GCGATGGACGTACAGAAACTGAATG
Reverse (SEQ ID NO: 15): CTTCCAGGTGTTGACGGAGTAG
＜チョウザメＣＣＫＢＲ１用プライマー＞
フォワード（配列番号１６）：GTGGAAACGGCTCTGTGACAAG
リバース（配列番号１７）：GCTGACAGTGGTGTAGCTGAATTTAGAC
<Primer for sturgeon CCKBR1>
Forward (SEQ ID NO: 16): GTGGAAACGGCTCTGTGACAAG
Reverse (SEQ ID NO: 17): GCTGACAGTGGTGTAGGCTGAATTTAGAC
ＰＣＲ反応の増幅条件は、最初に９５℃、２分の変性を行った後、９５℃、１０秒（変性）、６８℃、１０秒（１サイクルごとに０．５℃低下）（アニーリング）、７２℃、３０秒（伸長）を２０サイクル、次いで、９５℃、１０秒（変性）、６０℃、１０秒（アニーリング）、７２℃、３０秒（伸長）を１６サイクルとした。 The amplification conditions for the PCR reaction were as follows: initial denaturation at 95°C for 2 minutes, followed by 20 cycles of 95°C for 10 seconds (denaturation), 68°C for 10 seconds (decreasing by 0.5°C per cycle) (annealing), and 72°C for 30 seconds (extension), followed by 16 cycles of 95°C for 10 seconds (denaturation), 60°C for 10 seconds (annealing), and 72°C for 30 seconds (extension).
イ ｃＤＮＡ配列の決定
ウナギおよびチョウザメの脳下垂体ｃＤＮＡから増幅してＣＣＫＢＲ１をクローニングし、各ＤＮＡの塩基配列を決定した。
B. Determination of cDNA sequence CCKBR1 was amplified from eel and sturgeon pituitary cDNA and cloned, and the base sequence of each DNA was determined.
（２）結果
結果は、図６に示す通りであった。図６では、ウナギおよびチョウザメにおいて、各ＣＣＫＲＢとして予想される長さ（１０７１ｂｐおよび１２０２ｂｐ）のＰＣＲ産物がそれぞれ増幅された。また、ウナギおよびチョウザメの各脳下垂体ｃＤＮＡから得られたＤＮＡ配列は、別種のＣＣＫＲＢとの配列類似性から、正しくＣＣＫＲＢ遺伝子であることが確認された。これらの結果から、ウナギおよびチョウザメ未成熟個体の脳下垂体においてＣＣＫＲＢ遺伝子が発現していることが示された。ここで、チョウザメは真骨魚類が出現する前の下位条鰭類（古代魚）であり、ウナギは真骨魚類の基部でメダカと分岐した下位真骨魚類である。したがって、以上の結果から、メダカにおいて証明された、ＣＣＫが脳下垂体におけるＦＳＨ放出を制御するというメカニズムがチョウザメを含む下位条鰭類および真骨魚類を含む魚類において広く保存されているメカニズムであることが示された。よって、本実施例（例１～５）により、メダカに加え、ウナギおよびチョウザメを含む魚類において広く、ＣＣＫ受容体作動剤が生殖腺発育促進作用を奏することが示された。
(2) Results The results were as shown in FIG. 6. In FIG. 6, PCR products of expected lengths (1071 bp and 1202 bp) for each CCKRB were amplified in eel and sturgeon, respectively. In addition, the DNA sequences obtained from the pituitary cDNAs of eel and sturgeon were confirmed to be the correct CCKRB gene due to their sequence similarity to CCKRB of other species. These results showed that the CCKRB gene was expressed in the pituitary glands of immature eel and sturgeon individuals. Here, sturgeon is a lower ray-finned fish (ancient fish) before the appearance of teleosts, and eels are lower teleosts that branched off from medaka at the base of teleosts. Therefore, the above results showed that the mechanism by which CCK controls FSH release in the pituitary gland, which was proven in medaka, is a mechanism widely conserved in fishes including lower ray-finned fishes and teleosts, including sturgeon. Therefore, this Example (Examples 1 to 5) demonstrated that the CCK receptor agonist exerts a gonadal development promoting effect not only in medaka but also in a wide range of fish including eels and sturgeons.
例６：ウナギ脳下垂体のＦＳＨ細胞におけるＣＣＫＲＢ発現の検証
例６では、例５におけるＰＣＲレベルのＣＣＫＲＢ検出結果が正しいことを確認するため、例としてウナギ脳下垂体のＦＳＨ細胞がＣＣＫＲＢを発現することを検証した。
Example 6: Verification of CCKRB expression in eel pituitary FSH cells In Example 6, in order to confirm that the PCR-level CCKRB detection results in Example 5 were correct, it was verified, as an example, that eel pituitary FSH cells expressed CCKRB.
（１）二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法
ニホンウナギの脳下垂体を用いて、例１アに記載の方法と同様にして二重イン・サイチュハイブリダイゼーション法を行った。ＤＩＧラベルＣＣＫＲＢプローブおよびフルオレセインラベルＦＳＨｂプローブは、ニホンウナギの脳下垂体ｃＤＮＡを材料にして、以下のプライマーを用いて増幅した配列から作製した。
(1) Double in situ hybridization method Double in situ hybridization was performed using the pituitary gland of the Japanese eel in the same manner as described in Example 1A. The DIG-labeled CCKRB probe and the fluorescein-labeled FSHb probe were prepared from sequences amplified using the pituitary gland cDNA of the Japanese eel with the following primers.
＜ウナギＣＣＫＢＲ１用プライマー＞
フォワード（配列番号１４）：GCGATGGACGTACAGAAACTGAATG
リバース（配列番号１５）：CTTCCAGGTGTTGACGGAGTAG
<Primer for eel CCKBR1>
Forward (SEQ ID NO: 14): GCGATGGACGTACAGAAACTGAATG
Reverse (SEQ ID NO: 15): CTTCCAGGTGTTGACGGAGTAG
＜ウナギＦＳＨｂ用プライマー＞
フォワード（配列番号２３）：CAGATTCACAGTTGCCATGCATCT
リバース（配列番号２４）：CATCTATCCCTTGCCGCAGTT
<Primer for eel FSHb>
Forward (SEQ ID NO: 23): CAGATTCACAGTTGCCATGCATCT
Reverse (SEQ ID NO:24): CATCTATCCCTTGCCGCAGTT
（２）結果
結果は、図７に示す通りであった。図７では、二重イン・サイチュハイブリダイゼーションにより、ニホンウナギ成体において、脳下垂体のＦＳＨ細胞が、ＣＣＫＲＢ遺伝子を発現していることが確認された。この結果から、ウナギにおいても、メダカと同様にＦＳＨ細胞がＣＣＫによって制御されていることが示された。この結果からまた、ウナギとメダカは真骨魚類の初期に分岐したため、ＦＳＨ細胞におけるＣＣＫＲＢを介する、ＣＣＫによるＦＳＨ放出制御は真骨魚類全般で共通していることが示された。さらに、ウナギと同様にＰＣＲレベルでＣＣＫＲＢの発現が脳下垂体で検出されたチョウザメにおいても、ＦＳＨ細胞におけるＣＣＫＲＢを介する、ＣＣＫによるＦＳＨ放出制御の機構が存在することが示唆された。
(2) Results The results are shown in FIG. 7. In FIG. 7, it was confirmed by double in situ hybridization that the FSH cells in the pituitary gland of the adult Japanese eel express the CCKRB gene. This result indicates that the FSH cells in the eel are controlled by CCK, as in the medaka. This result also indicates that the eel and the medaka diverged early in the teleost fishes, and therefore the control of FSH release by CCK via CCKRB in FSH cells is common to all teleost fishes. Furthermore, it was suggested that the mechanism of FSH release control by CCK via CCKRB in FSH cells exists in the sturgeon, in which the expression of CCKRB was detected in the pituitary gland at the PCR level, as in the eel.
Claims (16)
式（１）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号６）、
式（２）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号４）、
式（３）ＤＹＲＧＷＬＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号５）、
式（４）ＤＹＬＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１８）、
式（５）ＤＹＶＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号１９）、
式（６）ＤＹＭＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（式中、Ｃ末端から７番目のチロシン残基は硫酸化されている）（配列番号２０）および
式（７）ＤＡＮＧＷＭＤＦ－ＮＨ２（配列番号２１）
からなる群から選択される、請求項６に記載の促進剤。 The amino acid sequence of the formula (A) is
Formula (1) DYMGWMDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 6),
Formula (2) DYLGWMDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 4),
Formula (3) DYRGWLDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 5),
Formula (4) DYLGWMDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 18),
Formula (5) DYVGWMDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 19),
Formula (6) DYMGWMDF-NH 2 (wherein the seventh tyrosine residue from the C-terminus is sulfated) (SEQ ID NO: 20) and Formula (7) DANGWMDF-NH 2 (SEQ ID NO: 21)
7. The accelerator of claim 6 selected from the group consisting of:
13. The method according to claim 11 or 12, wherein the fish in which gonad development has been promoted are fish in which early maturation has been induced.
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