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JP2024038096A - ＶＩ－Ｅ型及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム並びにそれらの使用 - Google Patents

ＶＩ－Ｅ型及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム並びにそれらの使用 Download PDF

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Abstract

【課題】核酸を標的とするための新規のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ組成物及びその使用を提供する。
【解決手段】新規のＲＮＡ標的化Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、及び少なくとも１つの標的化核酸構成要素、例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｃｒＲＮＡを含む、天然に存在しないか、又は操作されたＲＮＡ標的化システムである。新規のＣａｓエフェクタータンパク質は、約８００アミノ酸サイズの、知られているＣａｓエフェクタータンパク質の最も小さなものの１つであるので、小さな収容能力のベクター、例えばＡＡＶベクターを用いた送達に一意的に適している。
【選択図】なし

Description

ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化規則的間隔短パリンドロームリピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ））は、原核生物、例えば細菌及び古細菌のゲノム内に見出されるＤＮＡ配列のファミリーである。当該配列は、以前に原核生物に感染したバクテリオファージのＤＮＡ断片に由来することが理解されており、そして原核生物への以降の感染の間に、類似のバクテリオファージ由来のＤＮＡを検出且つ破壊するのに用いられる。
ＣＲＩＳＰＲ関連システムは、一セットの相同遺伝子、又はＣａｓ遺伝子であり、それらの一部は、ヘリカーゼ及びヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質をコードする。Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ配列（ｃｒＲＮＡ）由来のＲＮＡをガイド配列として利用して、ｃｒＲＮＡと相補的であるポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）の特定の鎖を認識して切断する酵素である。
合わせて、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、外来の病原性遺伝的要素、例えば、染色体外ＤＮＡ（例えばプラスミド）及びバクテリオファージ、又は外来ＤＮＡによってコードされる外来ＲＮＡ内に存在する遺伝的要素に対する耐性又は獲得免疫を付与する原始的な原核生物の「免疫系」を構成する。
本来、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、外来の遺伝的物質に対する広範囲にわたる原核生物防御機構であるようであり、配列決定された細菌ゲノムのおおよそ５０％、及び配列決定された古細菌のほぼ９０％において見出される。この原核生物システムは、それ以来、基礎生物学的調査、バイオテクノロジー製品の開発、及び疾患処置が挙げられる多種多様な用途において、ヒトが挙げられる多数の真核生物における広範囲にわたる使用を見出したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓとして知られている技術の基礎を形成するために開発されてきた。
原核生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、タンパク質エフェクター、非コードエレメント、及び遺伝子座アーキテクチャの極めて多様な群を含んでおり、それらの一部の例が、重要なバイオテクノロジーをもたらすように操作且つ構成されている。
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座構造は、多くのシステムにおいて研究されてきた。当該システムにおいて、ゲノムＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲアレイは典型的に、ＡＴ－リッチリーダー配列に続く、固有のスペーサー配列によって分離された短いＤＲ配列を含む。このＣＲＩＳＰＲ ＤＲ配列は典型的に、２８～３７ｂｐのサイズに及ぶが、範囲は２３～５５ｂｐであり得る。ＤＲ配列には、ダイアド対称性を示すものがあり、ＲＮＡにおけるステム－ループ（「ヘアピン」）等の二次構造の形成を意味している。一方、構造化されないものもあるようである。様々なＣＲＩＳＰＲアレイ内のスペーサーのサイズは典型的に、３２～３８ｂｐ（２１～７２ｂｐの範囲）である。通常、ＣＲＩＳＰＲアレイ内に、５０単位未満のリピート－スペーサー配列が存在する。
ｃａｓ遺伝子の小さなクラスターが、多くの場合、そのようなＣＲＩＳＰＲリピート－スペーサーアレイの隣に見出される。これまで、同定された９３個のｃａｓ遺伝子が、コードされるタンパク質の配列類似性に基づいて、３５個のファミリーに分類されている。３５個のファミリーのうち１１個が、いわゆるｃａｓコアを形成し、これは、タンパク質ファミリーＣａｓ１～Ｃａｓ９を含む。完全ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ遺伝子座は、ｃａｓコ
アに属する少なくとも１つの遺伝子を有する。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、大まかには２つのクラスに分けることができる－クラス１システムは、複数のＣａｓタンパク質の複合体を用いて、外来の核酸を分解する一方、クラス２システムは、同じ目的のために単一の大きなＣａｓタンパク質を用いる。クラス２システムの単一サブユニットエフェクター組成物は、工学及びアプリケーション翻訳（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）に、より単純なコンポーネントセットを提供するので、これまでのところ、ゲノム工学のための、そしてそれ以上の新規の強力なプログラム可能技術の発見、工学、及び最適化の重要な源となってきた。
クラス１システムはさらに、Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型に分けられる；クラス２システムは、ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型に分けられる。これらの６つのシステム型は加えて、１９個のサブタイプに分けられる。また、分類は、存在するｃａｓ遺伝子の相補体に基づく。ほとんどのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１タンパク質を有する。多くの原核生物は、複数のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含有する。このことは、複数のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが和合性であり、且つ構成要素を共有し得ることを示唆している。
第１の最も良く特徴付けられたＣａｓタンパク質の１つ、Ｃａｓ９は、クラス２、ＩＩ型の典型的なメンバーであり、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する（ＳｐＣａｓ９）。Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡ配列及び別個のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を補完する低ｃｒＲＮＡ分子によって活性化されるＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡに結合するタンパク質を担うダイレクトリピート（ＤＲ）配列、及びスペーサー配列からなり、これらの配列は、所望されるあらゆる核酸標的配列と相補的であるように操作され得る。このように、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃｒＲＮＡのスペーサー配列を修飾することによって、ＤＮＡ標的又はＲＮＡ標的を標的とするようにプログラムすることができる。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、より良好な実用的有用性のために、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成するように融合されてきた。Ｃａｓ９と組み合わされる場合、ｓｇＲＮＡは、その標的ＤＮＡとハイブリダイズして、Ｃａｓ９をガイドして、標的ＤＮＡを切断する。また、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲシステム由来のＣａｓ９が挙げられる、他の種由来の他のＣａｓ９エフェクタータンパク質が同定されており、同様に用いられている。これらのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、パン酵母（出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、日和見主義的な病原体カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）、ミバエ（キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））、アリ（インドクワガタアリ（Ｈａｒｐｅｇｎａｔｈｏｓ ｓａｌｔａｔｏｒ）及びクビレハリアリ（Ｏｏｃｅｒａｅａ ｂｉｒｏｉ））、カ（ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ））、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、植物、マウス、サル、及びヒト胚が挙げられる多数の真核生物において、広く用いられている。
別の最近特徴付けられたＣａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ａ（以前はＣｐｆ１として知られていた）である。Ｃａｓ１２ａは、Ｃ２ｃ１及びＣ２ｃ３と共に、ＨＮＨヌクレアーゼを欠いているが、ＲｕｖＣヌクレアーゼ活性を有するクラス２、Ｖ型Ｃａｓタンパク質に属するメンバーである。Ｃａｓ１２ａは、細菌フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムにおいて最初に特徴付けられた。その原名は、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属及びフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属系統におけるそのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓサブタイプの保有率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）を反映している。Ｃａｓ１２ａは、Ｃａｓ９とのい
くつかの主要な差異を示した：Ｃａｓ９によってもたらされる「ブラント」カットとは対照的に、二本鎖ＤＮＡ内の「スタガー」カットを引き起こすこと、「Ｔリッチ」ＰＡＭ配列（Ｃａｓ９に代替の標的化部位を提供する）をあてにすること、及び標的化の成功に、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）のみを必要とし、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないことが挙げられる。Ｃａｓ１２ａの低分子ｃｒＲＮＡは、多重ゲノム編集について、Ｃａｓ９よりも十分に適している。というのも、Ｃａｓ９のｓｇＲＮＡよりも多く、１つのベクター内にパッケージされ得るからである。さらに、Ｃａｓ１２ａによって残された粘着性の５’突出部が、従来の制限酵素クローニングよりもずっと標的特異的であるＤＮＡアセンブリに用いられ得る。最後に、Ｃａｓ１２ａは、そのＰＡＭ部位から１８～２３塩基対下流側でＤＮＡを切断する。これは、ＮＨＥＪシステムによる二本鎖切断（ＤＳＢ）の作出後のＤＮＡ修復の後に、ヌクレアーゼ認識配列に中断がないことで、Ｃａｓ１２ａは、Ｃａｓ９切断後の可能性がある１ラウンドとは対照的に、ＤＮＡ切断の複数のラウンドを可能にすることを意味する。なぜなら、Ｃａｓ９切断配列は、ＰＡＭ部位の上流側に３塩基対しかなくて、ＮＨＥＪ経路は典型的に、認識配列を破壊するインデル変異が生じることによって、切断のさらなるラウンドを妨げるからである。理論的には、ＤＮＡ切断の反復ラウンドは、起こることが所望されるゲノム編集の見込みの増大と関連する。
より最近になって、Ｃａｓ１３（別名Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、及びＣａｓ１３ｄが挙げられるいくつかのクラス２、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質が同定された。各々は、ＲＮＡガイドＲＮａｓｅである（すなわち、これらのＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２ａにおいて、ｃｒＲＮＡを用いて、標的ＤＮＡ配列ではなく標的ＲＮＡ配列を認識する）。全体として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３システムは、従来のＲＮＡｉ及びＣＲＩＳＰＲｉ技術と比較して、より高いＲＮＡ消化効率を達成することができる一方、ＲＮＡｉと比較して、かなり少ないオフターゲット切断を同時に示す。
これらの現在同定されているＣａｓ１３タンパク質の一欠点が、それらの比較的大きなサイズである。Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、及びＣａｓ１３ｃは各々、１１００を超えるアミノ酸残基を有する。ゆえに、とにかく可能なら、コード配列（約３．３ｋｂ）及びｓｇＲＮＡを、必要とされるあらゆるプロモータ配列及び翻訳調節配列をプラスして、特定の小さな収容能力遺伝子治療ベクター、例えば、約４．７ｋｂのパッケージ収容能力を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく現在の最も有効且つ最も安全な遺伝子治療ベクター中にパッケージすることは、困難である。これまでで最も小さなＣａｓ１３タンパク質であるＣａｓ１３ｄのみが、約９２０個のアミノ酸（すなわち、約２．８ｋｂのコード配列）を有しており、理論的にはＡＡＶベクター中にパッケージすることができるが、ｄＣａｓ１３ｄ－ＡＤＡＲ２ＤＤ（約３．９ｋｂのコード配列を有する）等の単一塩基の編集機能を有するＣａｓ１３ｄベースの融合タンパク質を用いることを頼りにしている単一塩基の編集ベースの遺伝子治療に使用が制限されている。
さらに、現在知られているＣａｓ１３タンパク質／システムは全て、ｃｒＲＮＡベースの標的配列認識による活性化直後に、非特異的／コラテラルＲＮａｓｅ活性を有する。この活性は、Ｃａｓ１３ａ及びＣａｓ１３ｂにおいて特に強く、そしてＣａｓ１３ｄにおいてなお検出可能に存在する。この特性は、核酸検出方法に有利に用いられ得る一方、これらのＣａｓ１３タンパク質の非特異的／コラテラルＲＮａｓｅ活性は、遺伝子治療の使用にとって相当な潜在的危険を構成する。
本発明の一態様は：（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができるスペーサー配列、及びスペーサー配列に対して３’側にダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含むＲＮＡガイド配列；並びに（２）配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＣＲＩ
ＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）、又は前記Ｃａｓの誘導体若しくは機能断片を含み；Ｃａｓ、前記Ｃａｓの誘導体及び機能断片は、（ｉ）ＲＮＡガイド配列に結合すること、且つ（ｉｉ）標的ＲＮＡを標的とすることができるが、スペーサー配列は、複合体が配列番号１～７のいずれか１つのＣａｓを含む場合に、天然に存在するバクテリオファージ核酸と１００％相補的でないことを条件とし、又は標的ＲＮＡは、真核生物ＤＮＡによってコードされている、クラスター化規則的間隔短パリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ複合体を提供する。
特定の実施形態において、ＤＲ配列は、配列番号８～１４のいずれか１つの二次構造と実質的に同じ二次構造を有する。
特定の実施形態において、ＤＲ配列は、配列番号８～１４のいずれか１つによってコードされている。
特定の実施形態において、標的ＲＮＡは、真核生物ＤＮＡによってコードされている。
特定の実施形態において、真核生物ＤＮＡは、非ヒト哺乳動物ＤＮＡ、非ヒト霊長類ＤＮＡ、ヒトＤＮＡ、植物ＤＮＡ、昆虫ＤＮＡ、鳥類ＤＮＡ、爬虫類ＤＮＡ、齧歯類ＤＮＡ、魚類ＤＮＡ、蠕虫／線虫ＤＮＡ、酵母ＤＮＡである。
特定の実施形態において、標的ＲＮＡはｍＲＮＡである。
特定の実施形態において、スペーサー配列は、１５～５５ヌクレオチド、２５～３５ヌクレオチド、又は約３０ヌクレオチドである。
特定の実施形態において、スペーサー配列は、標的ＲＮＡと９０～１００％相補的である。
特定の実施形態において、誘導体は、配列番号１～７のいずれか１つの、１つ以上の残基の保存的アミノ酸置換を含む。
特定の実施形態において、誘導体は、保存的アミノ酸置換のみを含む。
特定の実施形態において、誘導体は、ＨＥＰＮドメイン又はＲＸＸＸＸＨモチーフ内に、配列番号１～７のいずれか１つの野生型Ｃａｓと同一の配列を有する。
特定の実施形態において、誘導体は、標的ＲＮＡにハイブリダイズするＲＮＡガイド配列に結合することができるが、ＣａｓのＲＮａｓｅ触媒部位内の変異に起因して、ＲＮａｓｅ触媒活性を有していない。
特定の実施形態において、誘導体は、２１０残基以下のＮ末端欠失及び／又は１８０残基以下のＣ末端欠失を有する。
特定の実施形態において、誘導体は、約１８０残基のＮ末端欠失及び／又は約１５０残基のＣ末端欠失を有する。
特定の実施形態において、誘導体はさらに、ＲＮＡ塩基－編集ドメインを含む。
特定の実施形態において、ＲＮＡ塩基－編集ドメインは、アデノシンデアミナーゼ、例えば二本鎖ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２）
；アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素；ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｉｋｅ（ＡＰＯＢＥＣ）；又は活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である。
特定の実施形態において、ＡＤＡＲは、Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ｇ二重変異を有するか、又はＡＤＡＲ２ＤＤである。
特定の実施形態において、塩基－編集ドメインはさらに、ＲＮＡ結合ドメイン、例えばＭＳ２に融合する。
特定の実施形態において、誘導体はさらに、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＲＮＡデメチラーゼ、ＲＮＡスプライシング修飾子、局在化因子、又は翻訳修飾因子を含む。
特定の実施形態において、Ｃａｓ、誘導体、又は機能断片は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列又は核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む。
特定の実施形態において、標的ＲＮＡの標的化は、標的ＲＮＡの修飾をもたらす。
特定の実施形態において、標的ＲＮＡの修飾は、標的ＲＮＡの切断である。
特定の実施形態において、標的ＲＮＡの修飾は、アデノシン（Ａ）の、イノシン（Ｉ）への脱アミノ化である。
特定の実施形態において、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体はさらに、スペーサー配列にハイブリダイズすることができる配列を含む標的ＲＮＡを含む。
本発明の別の態様は、（１）本発明のＣａｓ、その誘導体、又はその機能断片、及び（２）異種機能ドメインを含む融合タンパク質を提供する。
特定の実施形態において、異種機能ドメインは：核局在化シグナル（ＮＬＳ）、リポータータンパク質若しくは検出標識（例えば、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）、局在化シグナル、タンパク質標的化部分、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＢＰ、Ｌｅｘ Ａ ＤＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＢＤ）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘその他）、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＶＰＲ）、転写阻害ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ部分又はＳＩＤ部分）、ヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）、脱アミノ化ドメイン（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ、又はＴＡＤ）、メチラーゼ、デメチラーゼ、転写放出因子、ＨＤＡＣ、ｓｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｓｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ＤＮＡ若しくはＲＮＡリガーゼ、又はそれらのあらゆる組合せを含む。
特定の実施形態において、異種機能ドメインは、融合タンパク質内で、Ｎ末端に、Ｃ末端に、又は内部に融合している。
本発明の別の態様は、（２）異種機能部分にコンジュゲートした、（１）本発明のＣａｓ、その誘導体、又はその機能断片を含むコンジュゲートを提供する。
特定の実施形態において、異種機能部分は：核局在化シグナル（ＮＬＳ）、リポータータンパク質若しくは検出標識（例えば、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、
ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）、局在化シグナル、タンパク質標的化部分、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＢＰ、Ｌｅｘ Ａ ＤＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＢＤ）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘその他）、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＶＰＲ）、転写阻害ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ部分又はＳＩＤ部分）、ヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）、脱アミノ化ドメイン（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ、又はＴＡＤ）、メチラーゼ、デメチラーゼ、転写放出因子、ＨＤＡＣ、ｓｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｓｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ＤＮＡ若しくはＲＮＡリガーゼ、又はそれらのあらゆる組合せを含む。
特定の実施形態において、異種機能部分は、Ｃａｓ、その誘導体、又はその機能断片に対して、Ｎ末端に、Ｃ末端に、又は内部にコンジュゲートされている。
本発明の別の態様は、配列番号１～７のいずれか１つをコードするポリヌクレオチド、又はその誘導体、若しくはその機能断片、若しくはその融合タンパク質を提供するが、ポリヌクレオチドは、配列番号１５～２１のいずれでもないことを条件とする。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞内での発現のためにコドン最適化されている。
特定の実施形態において、細胞は真核細胞である。
本発明の別の態様は、配列番号８～１４のいずれか１つの誘導体を含む、天然に存在しないポリヌクレオチドを提供し、前記誘導体は、（ｉ）配列番号８～１４のいずれか１つと比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個）のヌクレオチドの付加、欠失、若しくは置換を有し；（ｉｉ）配列番号８～１４のいずれか１つに対して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９７％の配列同一性を有し；（ｉｉｉ）配列番号８～１４のいずれか１つ、若しくは（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし；又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの相補体であるが、誘導体は、配列番号８～１４のいずれでもないこと、そして誘導体は、配列番号８～１４によってコードされるＲＮＡのいずれかと実質的に同じ二次構造を維持しているＲＮＡをコードする（又はＲＮＡである）ことを条件とする。
特定の実施形態において、誘導体は、本発明のＣａｓ、その誘導体、又はその機能断片のいずれか１つのＤＲ配列として機能する。
本発明の別の態様は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモータ、及び場合によってはエンハンサーに作動可能に連結されている。
特定の実施形態において、プロモータは、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、ユビキタスプロモータ、又は組織特異的プロモータである。
特定の実施形態において、ベクターはプラスミドである。
特定の実施形態において、ベクターは、レトロウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ＡＡＶベクター、
又はレンチウイルスベクターである。
特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ１３の組換えＡＡＶベクターである。
本発明の別の態様は、（１）送達ビヒクル、及び（２）本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体、本発明の融合タンパク質、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを含む送達システムを提供する。
特定の実施形態において、送達ビヒクルは、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃である。
本発明の別の態様は、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体、本発明の融合タンパク質、本発明のコンジュゲート、本発明のポリヌクレオチド、又は本発明のベクターを含む細胞又はその後代を提供する。
特定の実施形態において、細胞又はその後代は、真核細胞（例えば、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、又は植物細胞）、又は原核細胞（例えば細菌細胞）である。
本発明の別の態様は、本発明の細胞を含む非ヒト多細胞真核生物を提供する。
特定の実施形態において、非ヒト多細胞真核生物は、ヒト遺伝的障害のための動物（例えば、齧歯類又は霊長類）モデルである。
本発明の別の態様は、標的ＲＮＡを修飾する方法を提供し、当該方法は、標的ＲＮＡを、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体と接触させることを含み、スペーサー配列は、標的ＲＮＡの少なくとも１５ヌクレオチドと相補的であり；Ｃａｓ、誘導体、又は機能断片は、ＲＮＡガイド配列と結合して、複合体を形成し；複合体は、標的ＲＮＡに結合し；標的ＲＮＡへの複合体の結合により、Ｃａｓ、誘導体、又は機能断片は、標的ＲＮＡを修飾する。
特定の実施形態において、標的ＲＮＡは、Ｃａｓによる切断によって修飾される。
特定の実施形態において、標的ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼを含む誘導体による脱アミノ化によって修飾される。
特定の実施形態において、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又は核ＲＮＡである。
特定の実施形態において、標的ＲＮＡへの複合体の結合により、Ｃａｓ、誘導体、及び機能断片は、実質的な（又は検出可能な）コラテラルＲＮａｓｅ活性を示さない。
特定の実施形態において、標的ＲＮＡは、細胞内にある。
特定の実施形態において、細胞は癌細胞である。
特定の実施形態において、細胞に、感染性因子が感染する。
特定の実施形態において、感染性因子は、ウイルス、プリオン、原虫、真菌、又は寄生
虫である。
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、配列番号１～７のいずれか１つをコードする第１のポリヌクレオチド、又はその誘導体若しくは機能断片、並びに配列番号８～１４のいずれか１つ、及び標的ＲＮＡに結合することができるスペーサーＲＮＡをコードする配列を含む第２のポリヌクレオチドによってコードされており、第１及び第２のポリヌクレオチドは、細胞中に導入される。
特定の実施形態において、第１及び第２のポリヌクレオチドは、同じベクターによって細胞中に導入される。
特定の実施形態において、方法は、以下の１つ以上を引き起こす：（ｉ）細胞の老化のインビトロ又はインビボ誘導；（ｉｉ）インビトロ又はインビボ細胞周期停止；（ｉｉｉ）インビトロ若しくはインビボ細胞増殖阻害及び／又は細胞増殖阻害；（ｉｖ）アネルギーのインビトロ又はインビトロ誘導；（ｖ）アポトーシスのインビトロ又はインビトロ誘導；及び（ｖｉ）壊死のインビトロ又はインビトロ誘導。
本発明の別の態様は、容体又は疾患の処置が必要な対象において容体又は疾患を処置する方法を提供し、当該方法は、対象に、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体、又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含み；スペーサー配列は、容体又は疾患と関連する標的ＲＮＡの少なくとも１５ヌクレオチドと相補的であり；Ｃａｓ、誘導体、又は機能断片は、ＲＮＡガイド配列と結合して複合体を形成し；複合体は、標的ＲＮＡに結合し；標的ＲＮＡへの複合体の結合により、Ｃａｓ、誘導体、又は機能断片は、標的ＲＮＡを切断することによって、対象における容体又は疾患を処置する。
特定の実施形態において、容体又は疾患は、癌又は感染症である。
特定の実施形態において、癌は、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮体癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、髄様甲状腺癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又は膀胱癌である。
特定の実施形態において、方法は、インビトロ方法、インビボ方法、又はエクスビボ方法である。
本発明の別の態様は、本発明の方法によって得られる細胞又はその後代を提供し、細胞及び後代は、天然に存在しない修飾（例えば、細胞／後代の転写されたＲＮＡ内の天然に存在しない修飾）を含む。
本発明の別の態様は、標的ＲＮＡの存在を検出する方法を提供し、当該方法は、標的ＲＮＡを、本発明の融合タンパク質、又は本発明のコンジュゲート、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物と接触させることを含み、融合タンパク質又はコンジュゲートは、検出可能な標識（例えば、蛍光、ノーザンブロット、又はＦＩＳＨによって検出され得るもの）及び標的ＲＮＡに結合することができる合成スペーサー配列を含む。
本発明の別の態様は、クラスター化規則的間隔短パリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ複合体を含む真核細胞を提供し、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は：（１
）標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができるスペーサー配列、及びスペーサー配列に対して３’側にダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含むＲＮＡガイド配列；並びに（２）配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）、又は前記Ｃａｓの誘導体若しくは機能断片を含み；Ｃａｓ、前記Ｃａｓの誘導体及び機能断片は、（ｉ）ＲＮＡガイド配列に結合すること、且つ（ｉｉ）標的ＲＮＡを標的とすることができる。
実施例若しくは特許請求の範囲にのみ、又は以下の一態様／セクションにのみ記載されているものが挙げられる、本明細書中に記載される本発明のあらゆる実施形態は、明示的に否定されていなければ、又は不適切でなければ、本発明の他のあらゆる１つ以上の実施形態と組み合わせることができることが理解されるべきである。
図１は、代表的なＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆファミリーメンバーのゲノム遺伝子座の概略（縮尺なし）図である。Ｃａｓコード配列（尖端を有する長いバー）に続く、複数の近くのダイレクトリピート（ＤＲ）（より短いバー）及びスペーサー配列（菱形）が示される。 図２は、各Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆタンパク質と関連するＤＲ配列の推定の二次構造を示す。それらのコード配列は、左から右に、配列番号８～１４によってそれぞれ表される。 図３は、本発明の新たに発見されたＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、並びに関連する以前に発見されたＣａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、及びＣａｓ１３ｄエフェクタータンパク質についての系統樹を示す。 図４は、Ｃａｓ１３ａ－Ｃａｓ１３ｆタンパク質についてのドメイン構造を示す。Ｃａｓタンパク質の各代表メンバーのサイズ全体、及び２つのＲＸＸＸＸＨモチーフの位置を示す。 図５は、Ｃａｓ１３ｅ．１エフェクタータンパク質の予測３Ｄ構造を示す。 図６は、（１）Ｃａｓ１３ｅエフェクタータンパク質、（２）ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡと相補的であり、且つＣａｓ１３ｅエフェクタータンパク質との複合体を形成することができるガイドＲＮＡを生成することができるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のコード配列、及び（３）ｍＣｈｅｒｒｙリポーター遺伝子をそれぞれコードする３つのプラスミドが、細胞に形質移入されて、各遺伝子産物を発現して、リポーターｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡの分解が生じ得ることを示す概略図である。 図７は、蛍光顕微鏡下でのｍＣｈｅｒｒｙ発現の引下げによって明示される、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡと相補的なガイドＲＮＡによるｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡのノックダウンを示す。ネガティブ対照としての、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡとハイブリダイズ／結合しない非標的化（ＮＴ）ガイドＲＮＡは、ｍＣｈｅｒｒｙ発現をノックダウンできなかった。 図８は、図６の実験において、ｍＣｈｅｒｒｙ発現の約７５％のノックダウンを示す。 図９は、Ｃａｓ１３ｅが、（ガイドＲＮＡの５’末端のＤＲ配列と対照的に）３’末端にＤＲ配列を有するガイドＲＮＡを利用することを示す。 図１０は、非標的化（ＮＴ）対照と比較した、スペーサー配列長と、標的ＲＮＡに対して特異的な（ガイドＲＮＡ依存性）ＲＮａｓｅ活性との相関を示す。 図１１は、非標的化（ＮＴ）対照と比較した、スペーサー配列長と、標的ＲＮＡに対して非特異的な／コラテラルな（ガイドＲＮＡ非依存性）ＲＮａｓｅ活性との相関を示す。 図１２は、ｄＣａｓ１３ｅ．１－ＡＤＡＲ２ＤＤ融合体が、ＲＮＡ塩基編集活性を有することを示す。具体的に、（１）単一塩基ＲＮＡエディタＡＤＡＲ２ＤＤに融合するｄＣａｓ１３ｅ（ＲＮａｓｅデッド）タンパク質、（２）ＧからＡへの点変異を有するミュータントｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡと相補的であり、且つｄＣａｓ１３ｅエフェクタータンパク質との複合体を形成することができるガイドＲＮＡを生成することができるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のコード配列、及び（３）ＧからＡへの点変異を有するｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをコードするミュータントｍＣｈｅｒｒｙリポーター遺伝子をそれぞれコードする３つのプラスミドが、細胞に形質移入されて、それらの各遺伝子産物を発現することができる。ミュータントｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡは通常、点変異に起因して、蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を生成することができない。ガイドＲＮＡがミュータントｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡに結合すると、融合ＡＤＡＲ２ＤＤ塩基エディタは、ＡをＩ（Ｇ等価物）に変換するので、蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードするｍＲＮＡの能力を回復する。 図１３は、ＲＮＡ塩基編集が成功した結果としての、ｍＣｈｅｒｒｙの発現の回復を示す。図１２の実験では、ミュータントｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈｅｒｒｙ＊）を単独でコードするプラスミドが、蛍光ｍＣｈｅｒｒｙを発現しなかった。ｄＣａｓ１３ｅ－ＡＤＡＲ２ＤＤ塩基エディタを単独でコードするプラスミドもまた、蛍光ｍＣｈｅｒｒｙを発現しなかった。ｇＲＮＡ－１又はｇＲＮＡ－２のいずれかを単独でコードするプラスミド（ＧＦＰリポーターも発現する）もまた、蛍光ｍＣｈｅｒｒｙを発現しなかったが、ＧＦＰが傑出して発現された。しかしながら、３つ全てのプラスミドが同じ細胞中に形質移入された場合、有意な蛍光ｍＣｈｅｒｒｙ発現が（ＧＦＰリポーター発現と共に）観察された。 図１４は、早期終止コドンＴＡＧを有するミュータントｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の関連セグメント、ｄＣａｓ１３ｅ－ＡＤＡＲ２ＤＤ ＲＮＡ塩基エディタと複合体形成され得る２つのｇＲＮＡの配列、及び「補正された」ＴＧＧコドンを示す。 図１５は、ＡＤＡＲ２ＤＤ ＲＮＡ塩基エディタ（「ＡＤＡＲ２」として示す）及び他の転写制御要素に融合するｄＣａｓ１３ｅ．１の一連の漸進性Ｃ末端欠失構築体を示す概略（縮尺なし）図である。 図１６は、図１５における一連のＣ末端欠失ミュータントについて、野生型ｍＣｈｅｒｒｙに戻るｍＣｈｅｒｒｙミュータント変換結果のパーセンテージを示す。 図１７は、ＡＤＡＲ２ＤＤ ＲＮＡ塩基エディタに融合するｄＣａｓ１３ｅ．１の一連の漸進性Ｃ末端及び場合によってはＮ末端欠失構築体を示す概略（縮尺なし）図である。 図１８は、図１７における選択されたＣ末端及びＮ末端欠失ミュータントについて、野生型ｍＣｈｅｒｒｙに戻るｍＣｈｅｒｒｙミュータント変換結果のパーセンテージを示す。 図１９は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓ１３ｅ．１、及びＣａｓ１３ｆ．１、ｍＣｈｅｒｒｙリポーター遺伝子、並びにＡＮＸＡ４－標的化ｇＲＮＡコード配列、又は対照として非標的化ｇＲＮＡをコードする一連のプラスミドを示す。 図２０は、Ｃａｓ１３ｅ．１、Ｃａｓ１３ｆ．１、Ｃａｓ１３ａ、及びＣａｓ１３ｄによるＡＮＸＡ４発現の有効なノックダウンを示す。
１．概説
本明細書に記載される本発明は、本明細書においてＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆと呼ばれることがある、新規なクラス２、ＶＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質を提供する。本発明の新規なＣａｓ１３タンパク質は、それらが、それらのｃｒＲＮＡコード配列と共に、ＡＡＶベクターなどの低容量遺伝子治療ベクター中に容易にパッケージングされ得るように、以前に発見されたＣａｓ１３エフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ａ－Ｃａｓ１３ｄ）よりはるかに小さい。さらに、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、及びＣａｓ１３ｄエフェクタータンパク質と比較して、新たに発見されたＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質は、ＲＮＡ標的配列をノックダウンする際により強力であり、ＲＮＡ
単一塩基編集においてより効率的である一方、スペーサー配列が特定の狭い範囲（例えば、約３０ヌクレオチド）内にある場合を除いて、ｃｒＲＮＡベースの標的認識による活性化後に、ごくわずかな非特異的／コラテラルＲＮａｓｅ活性を示す。したがって、これらの新たなＣａｓタンパク質は、遺伝子治療に理想的に適している。
したがって、第１の態様において、本発明は、Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、例えば、配列番号１～７のアミノ酸配列を有するもの、又はそのオルソログ、ホモログ、様々な誘導体（本明細書において後述される）、機能断片（本明細書において後述される）を提供し、ここで、前記オルソログ、ホモログ、誘導体及び機能断片は、配列番号１～７のタンパク質のいずれか１つの少なくとも１つの機能を維持していた。このような機能としては、限定はされないが、本発明のガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ（本明細書において後述される）に結合して複合体を形成する能力、ＲＮａｓｅ活性、及び、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的なｃｒＲＮＡの誘導の下で、特定の部位において標的ＲＮＡに結合し、それを切断する能力が挙げられる。
特定の実施形態において、本発明のＣａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質は、（ｉ）配列番号１～７のいずれか１つ；（ｉｉ）配列番号１～７のいずれか１つの付加、欠失、及び／又は置換（例えば、保存された置換）の１つ以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個の残基）を有する誘導体；又は（ｉｉｉ）配列番号１～７のいずれか１つと比較して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する誘導体であり得る。
特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、そのオルソログ、ホモログ、誘導体及び機能断片は、天然に存在せず、例えば、天然に存在する配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸差を有する。
関連する態様において、本発明は、別の共有結合若しくは非共有結合されたタンパク質又はポリペプチド或いは他の分子（検出試薬又は薬剤／化学部分など）を含む、配列番号１～７のいずれか１つをベースとするさらなる誘導体Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、又はその上記のオルソログ、ホモログ、誘導体及び機能断片を提供する。このような他のタンパク質／ポリペプチド／他の分子は、例えば、化学的結合、遺伝子融合、又は他の非共有結合（ビオチン－ストレプトアビジン結合など）を介して連結され得る。このような誘導タンパク質は、元のタンパク質の機能、例えば、本発明のガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ（本明細書において後述される）に結合して、複合体を形成する能力、ＲＮａｓｅ活性、及び、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的なｃｒＲＮＡの誘導の下で、特定の部位において標的ＲＮＡに結合し、それを切断する能力に影響を与えない。
このような誘導を用いて、例えば、核局在化シグナル（ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳなどのＮＬＳ）を付加して、本発明のＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質の、細胞核に入る能力を強化し得る。また、このような誘導を用いて、標的分子又は部分を付加して、本発明のＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質を、特定の細胞又は細胞内位置に向けることができる。また、このような誘導を用いて、検出可能な標識を付加して、本発明のＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質の検出、監視、又は精製を容易にすることができる。さらに、このような誘導を用いて、脱アミノ化酵素部分（アデニン又はシトシン脱アミノ化活性を有するものなど）を付加して、ＲＮＡ塩基編集を容易にすることができる。
誘導は、本発明のＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質のＮ末端若し
くはＣ末端に、又は内部に（例えば、内部融合又は内部アミノ酸の側鎖を介した結合）、さらなる部分のいずれかを付加することによって行われ得る。
関連する第２の態様において、本発明は、配列番号１～７のいずれか１つをベースとする本発明のＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、又はその上記のオルソログ、ホモログ、誘導体及び機能断片のコンジュゲートを提供し、これは、他のタンパク質若しくはポリペプチド、検出可能な標識、又はそれらの組合せなどの部分とコンジュゲートされる。このようなコンジュゲート部分は、限定はされないが、局在化シグナル、レポーター遺伝子（例えば、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）、標識（例えば、ＦＩＴＣ、若しくはＤＡＰＩなどの蛍光色素）、ＮＬＳ、標的化部分、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＢＰ、Ｌｅｘ Ａ ＤＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＢＤ）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘなど）、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＶＰＲ）、転写阻害ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ部分又はＳＩＤ部分）、ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）、脱アミノ化ドメイン（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ、若しくはＴＡＤ）、メチラーゼ、デメチラーゼ、転写放出因子、ＨＤＡＣ、ｓｓＲＮＡ切断活性、ｄｓＲＮＡ切断活性、ｓｓＤＮＡ切断活性、ｄｓＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼ、それらの任意の組合せなどを含み得る。
例えば、コンジュゲートは、Ｎ末端、Ｃ末端に若しくはその付近に、内部に、又はそれらの組合せで位置し得る１つ以上のＮＬＳを含み得る。結合は、アミノ酸（Ｄ若しくはＥ、又はＳ若しくはＴなど）、アミノ酸誘導体（Ａｈｘ、β－Ａｌａ、ＧＡＢＡ若しくはＡｖａなど）、又はＰＥＧ結合を介して行われ得る。
特定の実施形態において、コンジュゲーションは、元のタンパク質の機能、例えば、本発明のガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ（本明細書において後述される）に結合して、複合体を形成する能力、ＲＮａｓｅ活性、及び、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的なｃｒＲＮＡの誘導の下で、特定の部位において標的ＲＮＡに結合し、それを切断する能力に影響を与えない。
関連する第３の態様において、本発明は、配列番号１～７のいずれか１つをベースとする本発明のＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、又はその上記のオルソログ、ホモログ、誘導体及び機能断片の融合を提供し、この融合は、局在化シグナル、レポーター遺伝子（例えば、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）、ＮＬＳ、タンパク質標的化部分、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＢＰ、Ｌｅｘ Ａ ＤＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＢＤ）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘなど）、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＶＰＲ）、転写阻害ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ部分若しくはＳＩＤ部分）、ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）、脱アミノ化ドメイン（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ、若しくはＴＡＤ）、メチラーゼ、デメチラーゼ、転写放出因子、ＨＤＡＣ、ｓｓＲＮＡ切断活性、ｄｓＲＮＡ切断活性、ｓｓＤＮＡ切断活性、ｄｓＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼ、それらの任意の組合せなどの部分との融合である。
例えば、融合は、Ｎ末端、Ｃ末端に若しくはその付近に、内部に、又はそれらの組合せで位置し得る１つ以上のＮＬＳを含み得る。特定の実施形態において、コンジュゲーションは、元のタンパク質の機能、例えば、本発明のガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ（本明細書において後述される）に結合して、複合体を形成する能力、ＲＮａｓｅ活性、及び、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的なｃｒＲＮＡの誘導の下で、特定の部位において標的ＲＮＡに結合し、それを切断する能力に影響を与えない。
第４の態様において、本発明は、（ｉ）配列番号８～１４のいずれか１つ；（ｉｉ）配列番号８～１４のいずれか１つと比較して、欠失、付加、及び／又は置換の１、２、３、４、若しくは５つのヌクレオチドを有するポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）配列番号８～１４のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性を共有するポリヌクレオチド；（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、（ｉ）～（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドのいずれか１つ又はその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド；（ｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかのポリヌクレオチドの相補配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
（ｉｉ）～（ｉｖ）のいずれかのポリヌクレオチドは、元の配列番号８～１４の機能を維持しており、これは、本発明のＣａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆシステムにおいてｃｒＲＮＡのダイレクトリピート（ＤＲ）配列をコードするためのものである。
本明細書において使用される際、「ダイレクトリピート配列」は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＤＮＡコード配列、又はｃｒＲＮＡにおいてそれによってコードされるＲＮＡを指し得る。したがって、配列番号８～１４のいずれかが、ｃｒＲＮＡなどのＲＮＡ分子の文脈において言及される場合、各Ｔは、Ｕを表すことが理解される。
したがって、特定の実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、本発明のＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆシステムのｃｒＲＮＡのためのＤＲ配列をコードするＤＮＡである。
特定の他の実施形態において、単離ポリヌクレオチドは、本発明のＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆシステムのｃｒＲＮＡのためのＤＲ配列であるＲＮＡである。
第５の態様において、本発明は、（ｉ）本発明のＣａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質のいずれか１つ、又はそのオルソログ、ホモログ、誘導体、コンジュゲート、機能断片、そのコンジュゲート、又はその融合であり得るタンパク質組成物；並びに（ｉｉ）本発明の第４の態様に記載される単離ポリヌクレオチド（例えば、ＤＲ配列）、及び標的ＲＮＡの少なくとも一部に相補的なスペーサー配列を含むポリヌクレオチド組成物を含む複合体を提供する。特定の実施形態において、ＤＲ配列は、スペーサー配列の３’末端にある。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド組成物は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含まない、本発明のＣａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆシステムのガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡである。
特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、そのホモログ、オルソログ、誘導体、融合、コンジュゲート、又はＲＮａｓｅ活性を有する機能断片と共に使用するために、スペーサー配列は、少なくとも約１０ヌクレオチド、又は１０～６０、１５～５０、２０～５０、２５～４０、２５～５０、若しくは１９～５０ヌクレオチドである。特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、又はそのホモログ、オルソログ、誘導体、融合、コンジュゲート、若しくはＲＮａｓｅ活性を有さないが、ガイドＲＮＡ及びガイドＲＮＡに相補的な標的ＲＮＡに結合する能力を有する機能断片と共に使用するために、スペーサー配列は、少なくとも約１０ヌクレオチド、又は約１０～２００、１５～１８０、２０～１５０、２５～１２５、３０～１１０、３５～１００、４０～８０、４５～６０、５０～５５、若しくは約５０ヌクレオチドである。
特定の実施形態において、ＤＲ配列は、１５～３６、２０～３６、２２～３６、又は約
３６ヌクレオチドである。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ中のＤＲ配列は、配列番号８～１４のいずれか１つのＲＮＡ形態と実質的に同じ二次構造（ステム、バルジ、及びループを含む）を有する。
特定の実施形態において、ガイドＲＮＡは、上記のスペーサー配列長さのいずれかより長い約３６ヌクレオチド、例えば、４５～９６、５５～８６、６０～８６、６２～８６、又は６３～８６ヌクレオチドである。
第６の態様において、本発明は、（ｉ）配列番号１～７のＣａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質のいずれか１つをコードするポリヌクレオチド、又はそのオルソログ、ホモログ、誘導体、機能断片、融合；（ｉｉ）配列番号８～１４のいずれか１つのポリヌクレオチド；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）を含むポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１５～２１などを除いて、天然でない／天然に存在しない。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、原核生物の発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、真核生物、例えば、ヒト又はヒト細胞などにおける発現のためにコドン最適化される。
第７の態様において、本発明は、第６の態様のポリヌクレオチドのいずれかを含むか又は包含するベクターを提供する。ベクターは、クローニングベクター、又は発現ベクターであり得る。ベクターは、ほんの数例を挙げると、プラスミド、ファージミド、又はコスミドであり得る。特定の実施形態において、ベクターは、ヒト細胞などの哺乳動物細胞内でポリヌクレオチド、配列番号１～７のＣａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質のいずれか１つ、又はそのオルソログ、ホモログ、誘導体、機能断片、融合；又は第４の態様のポリヌクレオチドのいずれか；又は第５の態様の複合体のいずれかを発現するのに使用され得る。
第８の態様において、本発明は、第４若しくは第６の態様のポリヌクレオチドのいずれか、及び／又は本発明の第７の態様のベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物、又は酵母、昆虫、植物、動物（例えば、ヒト及びマウスを含む哺乳動物）などの真核生物に由来する細胞であり得る。宿主細胞は、単離初代細胞（生体外治療のための骨髄細胞など）、又は腫瘍細胞株、２９３Ｔ細胞、若しくは幹細胞、ｉＰＣなどの樹立細胞株であり得る。
関連する態様において、本発明は、クラスター化規則的間隔短パリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ複合体を含む真核細胞を提供し、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、（１）標的ＲＮＡをハイブリダイズすることが可能なスペーサー配列、及びスペーサー配列に対して３’側のダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含むＲＮＡガイド配列；並びに、（２）配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）、又は前記Ｃａｓの誘導体若しくは機能断片を含み；ここで、Ｃａｓ、前記Ｃａｓの誘導体、及び機能断片は、（ｉ）ＲＮＡガイド配列に結合し、（ｉｉ）標的ＲＮＡを標的にすることが可能である。
第９の態様において、本発明は、（ｉ）配列番号１～７のＣａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質のいずれか１つから選択される第１の（タンパク質）組成物、又はそのオルソログ、ホモログ、誘導体、コンジュゲート、機能断片、融合；及び（ｉｉ）ガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡを包含するＲＮＡ、特に、そのためのスペーサー配列、
又はコード配列を含む第２の（ヌクレオチド）組成物を含む組成物を提供する。ガイドＲＮＡは、ＤＲ配列、及び標的ＲＮＡを補完するか又は標的ＲＮＡとハイブリダイズし得るスペーサー配列を含み得る。ガイドＲＮＡは、（ｉ）の第１の（タンパク質）組成物と複合体を形成し得る。ある実施形態において、ＤＲ配列は、本発明の第４の態様のポリヌクレオチドであり得る。ある実施形態において、ＤＲ配列は、ガイドＲＮＡの３’末端にあり得る。いくつかの実施形態において、組成物（（ｉ）及び／又は（ｉｉ）など）は、非天然であるか、又は天然組成物から修飾される。いくつかの実施形態において、組成物の少なくともある成分が、非天然であるか、又は組成物の天然成分から修飾される。いくつかの実施形態において、標的配列は、天然に存在しないＲＮＡなどの、原核生物又は真核生物からのＲＮＡである。標的ＲＮＡは、サイトゾル中又はオルガネラの内部などの、細胞の内部に存在し得る。いくつかの実施形態において、タンパク質組成物は、そのＮ末端若しくはＣ末端に、又は内部に位置し得るＮＬＳを有し得る。
第１０の態様において、本発明は、本発明の第７の態様の１つ以上のベクターを含む組成物を提供し、前記１つ以上のベクターは、（ｉ）任意に、第１の調節要素に動作可能に連結された；配列番号１～７のＣａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質のいずれか１つ、又はそのオルソログ、ホモログ、誘導体、機能断片、融合をコードする第１のポリヌクレオチド；及び（ｉｉ）任意に、第２の調節要素に動作可能に連結された；本発明のガイドＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチドを含む。第１及び第２のポリヌクレオチドは、異なるベクター上、又は同じベクター上にあり得る。ガイドＲＮＡは、第１のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質産物と複合体を形成し得、標的ＲＮＡに結合し／標的ＲＮＡを補完し得るＤＲ配列（第４の態様のいずれか１つなど）及びスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の調節要素は、誘導性プロモータなどのプロモータである。いくつかの実施形態において、第２の調節要素は、誘導性プロモータなどのプロモータである。いくつかの実施形態において、組成物（（ｉ）及び／又は（ｉｉ）など）は、非天然であるか、又は天然組成物から修飾される。いくつかの実施形態において、組成物の少なくともある成分が、非天然であるか、又は組成物の天然成分から修飾される。いくつかの実施形態において、標的配列は、天然に存在しないＲＮＡなどの、原核生物又は真核生物に由来するＲＮＡである。標的ＲＮＡは、サイトゾル中又はオルガネラの内部などの、細胞の内部に存在し得る。いくつかの実施形態において、タンパク質組成物は、そのＮ末端若しくはＣ末端に、又は内部に位置し得るＮＬＳを有し得る。
いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミドである。ある実施形態において、ベクターは、レトロウイルス、複製不全レトロウイルス、アデノウイルス、複製不全アデノウイルス、又はＡＡＶをベースとするウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、宿主細胞内で自己複製可能である（例えば、細菌の複製起点配列を有する）。いくつかの実施形態において、ベクターは、宿主ゲノムに統合し得、宿主ゲノムで複製され得る。ある実施形態において、ベクターは、クローニングベクターである。ある実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。
本発明はさらに、本発明の第１～３の態様の配列番号１～７のＣａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質のいずれか、又はそのオルソログ、ホモログ、誘導体、コンジュゲート、機能断片、融合；本発明の第４及び／又は第６の態様のポリヌクレオチド；本発明の第５の態様の複合体；本発明の第７の態様のベクター；本発明の第８の態様の細胞、並びに本発明の第９及び／又は第１０の態様の組成物を送達するための送達組成物を提供する。送達は、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、遺伝子銃又は１つ以上のウイルスベクターなどのビヒクルを用いて、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、超音波処理、リン酸カルシウムトランスフェクション、カチオントランスフェクション、ウイルスベ
クター送達などの、当該技術分野において公知のいずれか１つによって行われ得る。
本発明はさらに、以下のもの：本発明の第１～３の態様の配列番号１～７のＣａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質のいずれか、又はそのオルソログ、ホモログ、誘導体、コンジュゲート、機能断片、融合；本発明の第４及び／又は第６の態様のポリヌクレオチド；本発明の第５の態様の複合体；本発明の第７の態様のベクター；本発明の第８の態様の細胞、並びに本発明の第９及び／又は第１０の態様の組成物のうちのいずれか１つ以上を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、キットの構成要素の使用方法、及び／又はキットの構成要素と共に使用するために第三者から追加の構成要素を入手する方法についての説明書をさらに含み得る。キットのいずれの構成要素も、任意の好適な容器中に貯蔵され得る。
本発明は、本明細書において上記に一般に説明されているが、本発明の様々な態様についてのより詳細な説明が、以下の別個の項において提供される。しかしながら、簡潔にするために及び冗長性を軽減するために、本発明の特定の実施形態が、１つの項のみに記載されるか、又は特許請求の範囲若しくは実施例のみに記載されることが理解されるべきである。したがって、特に否定されていないか又は組合せが不適切でない限り、１つの態様、項のみに、又は特許請求の範囲若しくは実施例のみに記載されるものを含む、本発明のいずれか１つの実施形態が、本発明のいずれかの他の実施形態と組み合わされ得ることも理解されるべきである。
２．新規なクラス２、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイドＲＮａｓｅ、及びその誘導体
一態様において、本明細書に記載される本発明は、高等真核生物及び原核生物のヌクレオチド結合（ＨＥＰＮ）ドメインに特徴的な、２つの厳密に保存されたＲＸ４－６Ｈ（ＲＸＸＸＸＨ）モチーフを有するＣＲＩＳＰＲクラス２、ＶＩ型エフェクターの２つの新規なファミリーを提供する。２つのＨＥＰＮドメインを含有する同様のＣＲＩＳＰＲクラス２、ＶＩ型エフェクターが、以前に特徴付けられており、例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、及びＣａｓ１３ｄを含む。
ＨＥＰＮドメインは、ＲＮａｓｅドメインであり、標的ＲＮＡ分子に結合し、それを切断する能力を与えることが示されている。標的ＲＮＡは、限定はされないが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ（長鎖型ノンコーディングＲＮＡ）、及び核内ＲＮＡを含む、任意の好適な形態のＲＮＡであり得る。例えば、いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）のコード鎖に位置するＲＮＡ標的を認識し、それを切断する。
一実施形態において、本開示は、本明細書において一般にＶＩ－Ｅ及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｃａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆと呼ばれる、ＣＲＩＳＰＲクラス２、ＶＩ型エフェクターの２つのファミリーを提供する。ＶＩ－Ｅ及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質と、これらの他の系のエフェクターとの直接の比較は、ＶＩ－Ｅ及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、以前に同定された最小のＶＩ－Ｄ型／Ｃａｓ１３ｄエフェクター（図４を参照）よりかなり小さく（例えば、約２０％少ないアミノ酸）、系統発生学的に最も近い近縁種Ｃａｓ１３ｂ（図３を参照）を含む他の以前に記載されたエフェクタータンパク質と、１対１対応の配列アラインメントで３０％未満の配列類似性を有することを示す。
ＣＲＩＳＰＲクラス２、ＶＩ型エフェクターのこれらの２つの新たに同定されたファミリーは、様々な用途に使用され得、治療用途に特に好適であるが、その理由は、それらが、他のエフェクター（例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、及びＣａｓ１３ｄエフェクター）よりかなり小さく、それにより、ＡＡＶベクターな
どの、サイズ制限を有する送達系中への、エフェクター及びそれらのガイドＲＮＡコード配列をコードする核酸のパッケージングが可能になるためである。さらに、スペーサー配列長さの選択された範囲（約３０ヌクレオチドなど、図１１を参照）における検出可能なコラテラル／非特異的ＲＮａｓｅ活性がないことにより、特異的ＲＮａｓｅ活性の活性化後、これらのＣａｓエフェクターは、破壊されないのが望ましい標的細胞内の（免疫がない場合）潜在的に危険な全般的なオフターゲットＲＮＡ消化を起こしにくくなる。一方、約３０ヌクレオチドなどの他の選択されたスペーサー長さにおいて、かなりのコラテラルＲＮａｓｅ活性が、これらのＣａｓエフェクターについて存在し、したがって、本発明のＣａｓエフェクターはまた、このようなコラテラルＲＮａｓｅ活性に依存する実用において使用され得る。
細菌において、ＶＩ－Ｅ及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲアレイ（図１を参照）にごく近接して単一のエフェクター（それぞれ、約７７５個の残基及び７９０個の残基）を含む。ＣＲＩＳＰＲアレイは、典型的に３６ヌクレオチド長のダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含み、これは、配列及び二次構造（図２を参照）の両方において、一般に十分に保存されている。
本明細書に示されるデータは、ＤＲ配列が成熟ｃｒＲＮＡの３’末端において終わるように、ｃｒＲＮＡが５’末端からプロセシングされることを実証する。
Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆ ＣＲＩＳＰＲアレイに含まれるスペーサーは、最も一般的には３０ヌクレオチド長であり、長さの変動の大部分が、２９～３０ヌクレオチドの範囲内に含まれる。しかしながら、広範囲のスペーサー長さが、許容され得る。例えば、機能的なＣａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、又はそのホモログ、オルソログ、誘導体、融合、コンジュゲート、若しくは機能断片において使用するために、スペーサーは、１０～６０ヌクレオチド、２０～５０ヌクレオチド、２５～４５ヌクレオチド、２５～３５ヌクレオチド、又は約２７、２８、２９、３０、３１、３２、若しくは３３ヌクレオチドであり得る。しかしながら、上記のいずれかのｄＣａｓ形態において使用するために、スペーサーは、１０～２００ヌクレオチド、２０～１５０ヌクレオチド、２５～１００ヌクレオチド、２５～８５ヌクレオチド、３５～７５ヌクレオチド、４５～６０ヌクレオチド、又は約４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、若しくは５５ヌクレオチドであり得る。
例示的なＶＩ－Ｅ及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質が、以下の表中に示される。
上記の配列において、各エフェクター中の２つのＲＸ４－６Ｈ（ＲＸＸＸＸＨ）モチーフに二重下線が引かれている。Ｃａｓ１３ｅ．１において、Ｃ末端モチーフは、モチーフに隣接するＲＲ及びＨＨ配列により２つの可能性を有し得る。１つ又は両方のこのようなドメインにおける変異は、Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、そのホモログ、オルソログ、融合、コンジュゲート、誘導体、又は機能断片のＲＮａｓｅデッド形態（又は「ｄＣａｓ）を生み出し得る一方、ガイドＲＮＡ及びガイドＲＮＡに相補的な標的ＲＮＡに結合するそれらの能力を実質的に維持する。
Ｃａｓエフェクターの対応するＤＲコード配列が、以下に列挙される：
ステップ、バルジ、及びループ構造の位置及びサイズを含む、ＤＲ配列の二次構造が、このような二次構造を形成する特定のヌクレオチド配列より重要である可能性が高いため、代替的な又は誘導体ＤＲ配列がまた、これらの誘導体又は代替的なＤＲ配列が、配列番号８～１４のいずれか１つによってコードされるＲＮＡの二次構造に実質的に類似する二次構造を有する限り、本発明のシステム及び方法において使用され得る。例えば、誘導体ＤＲ配列は、１つ又は両方のステム（図２を参照）中に±１又は２つの塩基対を有し得、バルジ中の一本鎖のいずれか若しくは両方に±１、２、若しくは３つの塩基を有し得、及び／又はループ領域中に±１、２、３、若しくは４つの塩基を有し得る。
いくつかの実施形態において、ＶＩ－Ｅ及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、上記の配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）を有するアミノ酸配列を有する「誘導体」を含む。配列番号１～７のいずれか１つに対してかなりのタンパク質配列同一性を共有するこのような誘導体Ｃａｓエフェクターは、配列番号１～７（以下を参照）のＣａｓの機能の少なくとも１つ、例えば、配列番号８～１４のＤＲ配列の少なくとも１つを含むｃｒＲＮＡに結合し、それと複合体を形成する能力を保持していた。例えば、Ｃａｓ１３ｅ．１誘導体は、配列番号１、２、３、４、５、６、又は７のそれぞれに対して８５％のアミノ酸配列同一性を共有し得、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４のそれぞれのＤＲ配列を有するｃｒＲＮＡに結合し、それと複合体を形成する能力を保持する。
いくつかの実施形態において、誘導体は、保存的アミノ酸残基置換を含む。いくつかの実施形態において、誘導体は、保存的アミノ酸残基置換のみを含む（すなわち、誘導体中の全てのアミノ酸置換が、保存された置換であり、保存されていない置換はない）。
いくつかの実施形態において、誘導体は、配列番号１～７の野生型配列のいずれか１つの中への１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下のアミノ酸挿入又は欠失を含む。挿入及び／又は欠失は、野生型配列の機能の少なくとも１つが保存される限り、一緒に集められてもよく、又は配列の全長にわたって分離されてもよい。このような機能は、ガイド／ｃｒＲＮＡに結合する能力、ＲＮａｓｅ活性、ガイド／ｃｒＲＮＡに相補的な標的ＲＮＡに結合し、及び／又はそれを切断する能力を含み得る。いくつかの実施形態において、挿入及び／又は欠失は、ＲＸＸＸＸＨモチーフ中、又はＲＸＸＸＸＨモチーフから５、１０、１５、若しくは２０個の残基内に存在しない。
いくつかの実施形態において、誘導体は、ガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡに結合する能力を
保持していた。
いくつかの実施形態において、誘導体は、ガイド／ｃｒＲＮＡ活性化ＲＮａｓｅ活性を保持していた。
いくつかの実施形態において、誘導体は、配列中の、標的ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な結合されたガイド／ｃｒＲＮＡの存在下で、標的ＲＮＡに結合し、及び／又は標的ＲＮＡを切断する能力を保持していた。
他の実施形態において、誘導体は、例えば、ＲＮＡガイドＲＮａｓｅの１つ以上の触媒残基中の変異のため、ガイド／ｃｒＲＮＡ活性化ＲＮａｓｅ活性を完全に又は部分的に失っていた。このような誘導体は、ｄＣａｓ、例えば、ｄＣａｓ１３ｅ．１などと呼ばれることがある。
したがって、特定の実施形態において、誘導体は、低下したヌクレアーゼ／ＲＮａｓｅ活性、例えば、対応する野生型タンパク質と比較して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は１００％のヌクレアーゼ不活性化を有するように修飾され得る。ヌクレアーゼ活性は、当該技術分野において公知のいくつかの方法、例えば、変異を、タンパク質のヌクレアーゼ（触媒）ドメイン中に導入することによって低下され得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ活性のための触媒残基が同定され、これらのアミノ酸残基は、ヌクレアーゼ活性を低下させるために、様々なアミノ酸残基（例えば、グリシン又はアラニン）で置換され得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、保存アミノ酸置換である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、非保存アミノ酸置換である。
いくつかの実施形態において、修飾は、少なくとも１つのＨＥＰＮドメイン中に１つ以上の変異（例えば、アミノ酸欠失、挿入、又は置換）を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＨＥＰＮドメイン中に１、２、３、４、５、６、７、８、９つ、又はそれ以上のアミノ酸置換がある。例えば、いくつかの実施形態において、１つ以上の変異は、配列番号１のＲ８４、Ｈ８９、Ｒ７３９、Ｈ７４４、Ｒ７４０、Ｈ７４５、又は配列番号２のＲ９７、Ｈ１０２、Ｒ７７０、Ｈ７７５、又は配列番号３のＲ７７、Ｈ８２、Ｒ７６４、Ｈ７６９、又は配列番号４のＲ７９、Ｈ８４、Ｒ７６６Ａ、Ｈ７７１、又は配列番号５のＲ７９、Ｈ８４、Ｒ７６６、Ｈ７７１、又は配列番号６のＲ８９、Ｈ９４、Ｒ７７３、Ｈ７７８、又は配列番号７のＲ８９、Ｈ９４、Ｒ７７７、Ｈ７８２に対応するアミノ酸残基における置換（例えば、アラニン置換）を含む。
特定の実施形態において、１つ以上の変異又は２つ以上の変異は、ＨＥＰＮドメイン、又はＨＥＰＮドメインと相同の触媒活性ドメインを含むエフェクタータンパク質の触媒活性ドメイン中であり得る。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、以下の変異の１つ以上を含む：Ｒ８４Ａ、Ｈ８９Ａ、Ｒ７３９Ａ、Ｈ７４４Ａ、Ｒ７４０Ａ、Ｈ７４５Ａ（ここで、アミノ酸位置は、Ｃａｓ１３ｅ．１のアミノ酸位置に対応する）。当業者は、異なるＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆタンパク質中の対応するアミノ酸位置が、同じ効果を有するように変異され得ることを理解するであろう。特定の実施形態において、１つ以上の変異は、タンパク質の触媒活性を完全に又は部分的になくす（例えば、変化した切断速度、変化した特異性など）。
他の例示的な（触媒）残基変異は、Ｃａｓ１３ｅ．２のＲ９７Ａ、Ｈ１０２Ａ、Ｒ７７０Ａ、Ｈ７７５Ａ、又はＣａｓ１３ｆ．１のＲ７７Ａ、Ｈ８２Ａ、Ｒ７６４Ａ、Ｈ７６９Ａ、又はＣａｓ１３ｆ．２のＲ７９Ａ、Ｈ８４Ａ、Ｒ７６６Ａ、Ｈ７７１Ａ、又はＣａｓ
１３ｆ．３のＲ７９Ａ、Ｈ８４Ａ、Ｒ７６６Ａ、Ｈ７７１Ａ、又はＣａｓ１３ｆ．４のＲ８９Ａ、Ｈ９４Ａ、Ｒ７７３Ａ、Ｈ７７８Ａ、又はＣａｓ１３ｆ．５のＲ８９Ａ、Ｈ９４Ａ、Ｒ７７７Ａ、Ｈ７８２Ａを含む。特定の実施形態において、本明細書におけるＲ及び／又はＨ残基のいずれも、ＡではなくＧ、Ｖ、又はＩで置換され得る。
これらの変異の少なくとも１つの存在は、変異を欠く対応する野生型タンパク質と比較して、減少又は低下されたＲＮａｓｅ活性を有する誘導体をもたらす。
特定の実施形態において、本明細書に記載されるエフェクタータンパク質は、デッドＣａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質（すなわち、ｄＣａｓ１３ｅ及びｄＣａｓ１３ｆ）などの「デッド」エフェクタータンパク質である。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＨＥＰＮドメイン１（Ｎ末端）中の１つ以上の変異を有する。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＨＥＰＮドメイン２（Ｃ末端）中の１つ以上の変異を有する。特定の実施形態において、エフェクタータンパク質は、ＨＥＰＮドメイン１及びＨＥＰＮドメイン２中の１つ以上の変異を有する。
不活性化Ｃａｓ又は誘導体又はその機能断片は、（例えば、融合タンパク質、リンカーペプチド、「ＧＳ」リンカーなどを介して）１つ以上の非相同／機能的ドメインと融合又は会合され得る。これらの機能的ドメインは、様々な活性、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、塩基編集活性、及びスイッチ活性（例えば、光誘導性）を有し得る。いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、クルペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）、ＳＩＤ（例えばＳＩＤ４Ｘ）、ＶＰ６４、ＶＰＲ、ＶＰ１６、Ｆｏｋ１、Ｐ６５、ＨＳＦ１、ＭｙｏＤ１、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２などのＲＮＡ上で作用するアデノシンデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ、シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ＴＡＤ、ミニ－ＳＯＧ、ＡＰＥＸ、及びビオチン－ＡＰＥＸである。
いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、塩基編集ドメイン、例えば、ＡＤＡＲ１（Ｅ１００８Ｑを有するか若しくは有さない、野生型又はそのＡＤＡＲ１ＤＤ形態を含む）、ＡＤＡＲ２（Ｅ４８８Ｑ変異を有するか若しくは有さない、野生型又はそのＡＤＡＲ２ＤＤ形態を含む）、ＡＰＯＢＥＣ、又はＡＩＤである。
いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインを含み得る。１つ以上の非相同機能的ドメインは、少なくとも２つ以上のＮＬＳドメインを含み得る。１つ以上のＮＬＳドメインは、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ｅ／Ｃａｓ１３ｆエフェクタータンパク質）の末端に又はその付近若しくは近傍に位置してもよく、２つ以上のＮＬＳの場合、２つのうちのそれぞれが、エフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ｅ／Ｃａｓ１３ｆエフェクタータンパク質）の末端に又はその付近若しくは近傍に位置してもよい。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つ以上の非相同機能的ドメインは、エフェクタータンパク質のアミノ末端又はその付近にあり得、及び／又は少なくとも１つ以上の非相同機能的ドメインが、エフェクタータンパク質のカルボキシ末端又はその付近にある。１つ以上の非相同機能的ドメインは、エフェクタータンパク質に融合され得る。１つ以上の非相同機能的ドメインは、エフェクタータンパク質にテザーされ得る。１つ以上の非相同機能的ドメインは、リンカー部分によってエフェクタータンパク質に連結され得る。
いくつかの実施形態において、複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８つ、又はそれ以上）の同一又は異なる機能的ドメインが存在する。
いくつかの実施形態において、機能的ドメイン（例えば、塩基編集ドメイン）は、ＲＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＳ２）にさらに融合される。
いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、リンカー配列（例えば、フレキシブルリンカー配列又は剛性リンカー配列）に会合されるか又はそれを介して融合される。例示的なリンカー配列及び機能的ドメイン配列は、以下の表中に提供される。
不活性化Ｃａｓタンパク質における１つ以上の機能的ドメインの位置決めは、それに起
因する機能的効果を標的に与えるような、機能的ドメインの適切な空間的定位を可能にするものである。例えば、機能的ドメインが、転写活性化因子（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、又はｐ６５）である場合、転写活性化因子は、それが標的の転写に影響を与えるのを可能にする空間的定位に配置される。同様に、転写リプレッサが、標的の転写に影響を与えるように位置決めされ、ヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）が、標的を切断又は部分的に切断するように位置決めされる。いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、Ｃａｓ／ｄＣａｓのＮ末端に位置決めされる。いくつかの実施形態において、機能的ドメインは、Ｃａｓ／ｄＣａｓのＣ末端に位置決めされる。いくつかの実施形態において、不活性化ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ｄＣａｓ）は、Ｎ末端に第１の機能的ドメイン及びＣ末端に第２の機能的ドメインを含むように修飾される。
１つ以上の機能的ドメインと融合される不活性化ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びそれを使用する方法の様々な例が、例えば、特に、本明細書に記載される特徴に関して、全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０１７／２１９０２７号パンフレットに記載される。
いくつかの実施形態において、ＶＩ－Ｅ及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、上記の配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＶＩ－Ｅ及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、上記の配列番号１～７のいずれか１つの天然アミノ酸配列を除く。
いくつかの実施形態において、完全長野生型（配列番号１～７）又は誘導体ＶＩ－Ｅ及びＶＩ－Ｆ型Ｃａｓエフェクターを使用する代わりに、その「機能断片」が使用され得る。
本明細書において使用される際の「機能断片」は、配列番号１～７のいずれか１つの野生型タンパク質の断片、又は完全長未満の配列を有するその誘導体を指す。機能断片中の欠失した残基は、Ｎ末端、Ｃ末端に、及び／又は内部にあり得る。機能断片は、野生型ＶＩ－Ｅ又はＶＩ－Ｆ Ｃａｓの少なくとも１つの機能、又はその誘導体の少なくとも１つの機能を保持する。したがって、機能断片は、当該機能に関して具体的に定義される。例えば、機能がｃｒＲＮＡ及び標的ＲＮＡに結合する能力である機能断片は、ＲＮａｓｅ機能に関して機能断片でないことがあるが、これは、Ｃａｓの両端におけるＲＸＸＸＸＨモチーフを失うことが、ｃｒＲＮＡ及び標的ＲＮＡに結合するその能力に影響を与えることはないが、ＲＮａｓｅ活性をなくし破壊し得るためである。
いくつかの実施形態において、完全長配列の配列番号１～７と比較して、ＶＩ－Ｅ又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質若しくはその誘導体又はその機能断片は、Ｎ末端から約３０、６０、９０、１２０、１５０、又は約１８０個の残基を欠く。
いくつかの実施形態において、完全長配列の配列番号１～７と比較して、ＶＩ－Ｅ又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質若しくはその誘導体又はその機能断片は、Ｃ末端から約３０、６０、９０、１２０、又は約１５０個の残基を欠く。
いくつかの実施形態において、完全長配列の配列番号１～７と比較して、ＶＩ－Ｅ又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質若しくはその誘導体又はその機能断片は、Ｎ末端から約３０、６０、９０、１２０、１５０、又は約１８０個の残基を欠き、Ｃ末端から約３０、６０、９０、１２０、又は約１５０個の残基を欠く。
いくつかの実施形態において、ＶＩ－Ｅ又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェク
タータンパク質又はその誘導体又はその機能断片は、ＲＮａｓｅ活性、例えば、ガイド／ｃｒＲＮＡ活性化特異的ＲＮａｓｅ活性を有する。
いくつかの実施形態において、ＶＩ－Ｅ又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質又はその誘導体又はその機能断片は、実質的な／検出可能なコラテラルＲＮａｓｅ活性を有さない。
本明細書において、「コラテラルＲＮａｓｅ活性」は、特定の他のクラス２、ＶＩ型ＲＮＡガイドＲＮａｓｅｓ、例えば、Ｃａｓ１３ａにおいて観察される非特異的ＲＮａｓｅ活性を指す。Ｃａｓ１３ａを含む複合体は、例えば、標的核酸（例えば、標的ＲＮＡ）への結合による活性化の後、構造変化を生じ、それにより、今度は、複合体が、非特異的ＲＮａｓｅとして作用し、ＲＮＡ分子（例えば、ｓｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡ分子）の近くを切断及び／又は分解する（すなわち、「コラテラル」効果）。
特定の実施形態において、（限定はされないが）ＶＩ－Ｅ又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質又はその誘導体又はその機能断片及びｃｒＲＮＡから構成される複合体は、標的認識の後にコラテラルＲＮａｓｅ活性を示さない。この「コラテラル効果を含まない（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ－ｆｒｅｅ）」実施形態は、野生型、操作された／誘導体エフェクタータンパク質、又はその機能断片を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＶＩ－Ｅ又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質又はその誘導体又はその機能断片は、プロトスペーサーに隣接若しくは近接するさらなる要件（すなわち、プロトスペーサー隣接モチーフ「ＰＡＭ」又はプロトスペーサー近接配列「ＰＦＳ」要件）なしに、標的ＲＮＡを認識し、それを切断する。
本開示はまた、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、ＶＩ－Ｅ又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質）の分割形態を提供する。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の分割形態は、送達のために有利であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、酵素の２つの部分に分割され、それが、一緒に、機能的ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を実質的に含む。
分割は、触媒ドメインが影響を受けない方法で行われ得る。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ヌクレアーゼとして機能し得、又は不活性化酵素であり得、これは、実質的に、（例えば、その触媒ドメイン中の変異のため）ごくわずかな触媒活性を有するか又は有さないＲＮＡ結合タンパク質である。分解酵素は、例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１２（１０）：２９８４－２９８９，２０１５に記載されている。
例えば、いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼローブ及びα－らせんローブが、別個のポリペプチドとして発現される。ローブは、それら自体で相互作用しないが、ｃｒＲＮＡは、それらを三元複合体へと動員し、これは、完全長ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の活性を再現し（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ）、部位特異的ＤＮＡ切断を触媒する。修飾ｃｒＲＮＡの使用は、二量化を防ぐことによって分解酵素活性をなくして、誘導性二量化系の発生を可能にする。
いくつかの実施形態において、分割ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、例えば、ラパマイシン感受性二量化ドメインを用いることによって、二量化相手に融合され得る。これは、タンパク質の活性の時間的制御のための化学的誘導性ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の生成を可能にする。したがって、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、２つの断片へと分割するこ
とによって化学的誘導性にされ得、ラパマイシン感受性二量化ドメインは、タンパク質の制御される再構成に使用され得る。
分割点は、典型的に、インシリコで設計され、構築物へとクローニングされる。このプロセス中、変異が、分割ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質中に導入され得、非機能的ドメインが除去され得る。
いくつかの実施形態において、分割ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の２つの部分又は断片（すなわち、Ｎ末端及びＣ末端断片）は、例えば、野生型ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の配列の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％を含む完全なＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を形成し得る。
本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、ＶＩ－Ｅ又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質）は、自己活性化性又は自己不活性化性であるように設計され得る。例えば、標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のコード構築物へと導入され得る。したがって、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、標的配列、並びにタンパク質をコードする構築物を切断し、それによって、それらの発現を自己不活性化し得る。自己不活性化性ＣＲＩＳＰＲシステムを構築する方法が、例えば、参照により本明細書に援用される、Ｅｐｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２４：Ｓ５０，２０１６に記載されている。
いくつかの他の実施形態において、弱いプロモータ（例えば、７ＳＫプロモータ）の制御下で発現されるさらなるｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸配列を標的として、（例えば、核酸の転写及び／又は翻訳を防ぐことによって）その発現を防止及び／又は阻止し得る。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を発現するベクター、ｃｒＲＮＡ、及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸を標的とするｃｒＲＮＡによる細胞のトランスフェクションは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸の効率的な破壊をもたらし、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のレベルを低下させ、それによって、ゲノム編集活性を制限し得る。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のゲノム編集活性は、哺乳類細胞内の内因性ＲＮＡシグネチャ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を介して調節され得る。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質スイッチは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードするｍＲＮＡの５’－ＵＴＲにおいてｍｉＲＮＡ相補配列を使用することによってなされ得る。スイッチは、標的細胞内のｍｉＲＮＡに選択的に及び効率的に応答する。したがって、スイッチは、不均一な細胞集団内の内因性ｍｉＲＮＡ活性を感知することによって、ゲノム編集を異なって制御し得る。したがって、スイッチ系は、細胞内ｍｉＲＮＡ情報に基づいて、細胞型選択的ゲノム編集及び細胞工学のための枠組みを提供することができる（例えば、Ｈｉｒｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４５（１３）：ｅ１１８，２０１７を参照）。
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（例えば、ＶＩ－Ｅ及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質）は、誘導的に発現され得、例えば、それらの発現は、光誘導性又は化学的誘導性であり得る。この機構は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質中の機能的ドメインの活性化を可能にする。光誘導性は、当該技術分野において公知の様々な方法によって、例えば、ＣＲＹ２ ＰＨＲ／ＣＩＢＮ対合が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を分割するのに使用される融合複合体を設計することによって、達成され得る（例えば、Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ ５００：７４６３，２０１３を参照。
化学的誘導性は、例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ（ＦＫ５０６結合タンパク質／ＦＫＢＰラパマイシン結合ドメイン）対合が、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を分割するのに使用される融合複合体を設計することによって、達成され得る。ラパマイシンが、融合複合体を形成するのに必要とされ、それによって、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を活性化する（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｓｐｌｉｔ－Ｃａｓ９ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３３：２：１３９－４２，２０１５を参照）。
さらに、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の発現は、誘導性プロモータ、例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリン制御される転写活性化（Ｔｅｔ－Ｏｎ及びＴｅｔ－Ｏｆｆ発現システム）、ホルモン誘導性遺伝子発現システム（例えば、エクジソン誘導性遺伝子発現システム）、及びアラビノース誘導性遺伝子発現システムによって調節され得る。ＲＮＡとして送達されるとき、ＲＮＡ標的化エフェクタータンパク質の発現は、テトラサイクリンのような小分子を感知し得るリボスイッチを介して調節され得る（例えば、Ｇｏｌｄｆｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ”，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４０：９：ｅ６４－ｅ６４，２０１２を参照）。
誘導性ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及び誘導性ＣＲＩＳＰＲシステムの様々な実施形態が、例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第８，８７１，４４５号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３号明細書、及び国際公開第２０１６／２０５７６４号パンフレットに記載されている。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、タンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合される少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個）の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。ＮＬＳの非限定的な例としては、以下のものに由来するＮＬＳ配列が挙げられる：アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルス大型Ｔ－抗原のＮＬＳ；核質に由来するＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有する核質二分（ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチン－αからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ及びＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ－ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ及びＰＫＱＫＫＲＫ；デルタ肝炎ウイルス抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；並びにヒトグルココルチコイド受容体の配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、タンパク質のＮ末端又はＣ末端に結合される少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個）の核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む。好ましい実施形態において、Ｃ末端及び／又はＮ末端ＮＬＳ又はＮＥＳは、真核細胞、例えば、ヒト細胞内で最適な発現及び核標的化のために結合される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、１つ以上の機能的活性を改変するために、１つ以上のアミノ酸残基において変異される。
例えば、いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、そのヘリカーゼ活性を改変するために、１つ以上のアミノ酸残基において変異される。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、そのヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ活性又はエキソヌクレアーゼ活性）を改変するために、１つ以上のアミノ酸残基において変異される。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ガイドＲＮＡと機能的に関連するその能力を改変するために、１つ以上のアミノ酸残基において変異される。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、標的核酸と機能的に関連するその能力を改変するために、１つ以上のアミノ酸残基において変異される。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、標的ＲＮＡ分子を切断することが可能である。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、その切断活性を改変するために、１つ以上のアミノ酸残基において変異される。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、酵素が標的核酸を切断できなくする１つ以上の変異を含み得る。
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な標的核酸の鎖を切断することが可能である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、１つ以上の所望の機能的活性（例えば、ヌクレアーゼ活性及びガイドＲＮＡと機能的に相互作用する能力）を保持しながら、酵素のサイズを減少させるために、１つ以上のアミノ酸残基中に欠失を有するように操作され得る。切断されたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、負荷限度（ｌｏａｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を有する送達系と組み合わせて有利に使用され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、Ｈｉｓ－タグ、ＧＳＴ－タグ、Ｖ５－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＨＡ－タグ、ＶＳＶ－Ｇ－タグ、Ｔｒｘ－タグ、又はｍｙｃ－タグを含む１つ以上のペプチドタグに融合され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＧＳＴ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、若しくはＢＦＰ）、又は酵素（ＨＲＰ若しくはＣＡＴなど）などの検出可能な部分に融合され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＭＢＰ、ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメイン、又はＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメインに融合され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＦＩＴＣ及びＤＡＰＩを含む、蛍光色素などの検出可能な標識に連結されるか又はそれとコンジュゲートされ得る。
本明細書における実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ関
連タンパク質と他の部分との間の結合は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のＮ末端又はＣ末端にあり得、共有化学結合を介して内部にあることもある。結合は、ペプチド結合、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、又はアミノ酸誘導体などのアミノ酸の側鎖を介した結合（Ａｈｘ、β－Ａｌａ、ＧＡＢＡ若しくはＡｖａ）、又はＰＥＧ結合などの、当該技術分野において公知の任意の化学結合によって行われ得る。
３．ポリヌクレオチド
また、本発明は、本明細書中に記載されるタンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又は付属タンパク質）及びガイドＲＮＡ（例えばｃｒＲＮＡ）をコードする核酸を提供する。
一部の実施形態において、核酸は合成核酸である。一部の実施形態において、核酸はＤＮＡ分子である。一部の実施形態において、核酸はＲＮＡ分子（例えば、Ｃａｓ、その誘導体又は機能断片をコードするｍＲＮＡ分子）である。一部の実施形態において、ｍＲＮＡはキャップされており、ポリアデニル化されており、５－メチルシチジンで置換されており、シュードウリジンで置換されており、又はこれらが組み合わされている。
一部の実施形態において、核酸（例えばＤＮＡ）は、核酸の発現を制御するために、調節要素（例えばプロモータ）に作動可能に連結されている。一部の実施形態において、プロモータは構成的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは誘導性プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは細胞特異的プロモータである。一部の実施形態において、プロモータは生物特異的プロモータである。
適切なプロモータが当該技術において知られており、例えば、ｐｏｌ Ｉプロモータ、ｐｏｌ ＩＩプロモータ、ｐｏｌ ＩＩＩプロモータ、Ｔ７プロモータ、Ｕ６プロモータ、Ｈ１プロモータ、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモータ、及びβ－アクチンプロモータが挙げられる。例えば、Ｕ６プロモータは、本明細書中に記載されるガイドＲＮＡ分子の発現を調節するのに用いることができる。
一部の実施形態において、核酸はベクター（例えば、ウイルスベクター又はファージ）内に存在する。ベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり得る。ベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミドその他であり得る。ベクターは、注目する細胞（例えば、細菌細胞又は哺乳動物細胞）内でのベクターの増殖を可能にする１つ以上の調節要素を含んでもよい。一部の実施形態において、ベクターは、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムの単一の構成要素をコードする核酸を含む。一部の実施形態において、ベクターは、複数の核酸（各々、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムの構成要素をコードする）を含む。
一態様において、本開示は、本明細書中に記載される核酸配列、すなわち、配列番号８～１４のＤＲ配列を含むＣａｓタンパク質、誘導体、機能断片、又はガイド／ｃｒＲＮＡをコードする核酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一の核酸配列を提供する。
別の態様において、本開示はまた、本明細書中に記載されるアミノ酸配列、例えば配列番号１～７と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する。
一部の実施形態において、核酸配列は、本明細書中に記載される配列と同じ少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド、例えば、連続ヌクレオチド又は非連続ヌクレオチド）を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、本明細書中に記載される配列と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ヌクレオチド、例えば、連続ヌクレオチド又は非連続ヌクレオチド）を有する。
関連する実施形態において、本発明は、本明細書中に記載される配列と同じ少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００アミノ酸残基、例えば、連続アミノ酸残基又は非連続アミノ酸残基）を有するアミノ酸配列を提供する。一部の実施形態において、アミノ酸配列は、本明細書中に記載される配列と異なる少なくとも一部（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００アミノ酸残基、例えば、連続アミノ酸残基又は非連続アミノ酸残基）を有する。
２つのアミノ酸配列の、又は２つの核酸配列の同一性パーセントを判定するために、配列は、最適な比較目的のためにアラインされる（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸及び第２のアミノ酸の一方若しくは双方、又は第１の核酸配列及び第２の核酸配列の一方若しくは双方に導入され得、そして非相同配列が、比較目的のために、無視され得る）。一般に、比較目的のためにアラインした参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも８０％であるべきであり、一部の実施形態において、参照配列の長さの少なくとも９０％、９５％、又は１００％である。続いて、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、分子は、その位置にて同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数である。本開示の目的のために、２つの配列間での配列の比較及び同一性パーセントの判定は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、及びフレームシフトギャップペナルティ５のＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスを用いて達成することができる。
本明細書中に記載されるタンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質又は付属タンパク質）は、核酸分子又はポリペプチドとして送達且つ使用することができる。
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をコードする核酸分子、その誘導体又は機能断片は、宿主細胞又は生物における発現のためにコドン最適化される。宿主細胞として、確立された細胞株（例えば２９３Ｔ細胞）又は単離された一次細胞が挙げられ得る。核酸は、注目するあらゆる生物、特にヒト細胞又は細菌での使用のためにコドン最適化され得る。例えば、核酸は、あらゆる原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等）、又はあらゆる真核生物、例えば、ヒト、並びに酵母、蠕虫、昆虫、植物、及び藻類（食用作物、イネ、トウモロコシ、野菜、果実、樹木、イネ科植物が挙げられる）、脊椎動物、魚類、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、鳥類（ニワトリ等）、家畜（ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギその他）、又は非ヒト霊長類）が挙げられる他の非ヒト真核生物のためにコドン最適化され得る。コドン使用頻度表が、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／にて入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」にて容易に利用可能であり、当該表は、いくつかの方法で構成され得る。Ｎ
ａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２，２０００（その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）参照。また、特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するコンピュータアルゴリズム、例えばＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，Ｐａ．）が利用可能である。
コドン最適化された配列の例が、この場合、本明細書中で考察されるように、真核生物、例えばヒトにおける発現のために（すなわち、ヒトにおける発現のために最適化されている）、又は別の真核生物、動物、若しくは哺乳動物のために最適化されている配列である；例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）におけるＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列参照。これが好まれる一方、他の例が可能であることは勿論であり、ヒト以外の宿主種のためのコドン最適化、又は特定の器官のためのコドン最適化が知られている。一般に、コドン最適化は、注目する宿主細胞内での発現の増強のために、当該宿主細胞の遺伝子においてより高頻度で、又は最も高頻度で用いられるコドンにより、本来のアミノ酸配列を維持しながら、本来の配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個、又はそれを超えるコドン）を置換することによって核酸配列を修飾するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸の特定のコドンについて、特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差異）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関する。これは逆に、とりわけ、翻訳されることとなるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用能に依存すると考えられている。細胞内での選択されたｔＲＮＡの優位性は、通常、ペプチド合成において最も高頻度で用いられるコドンの反映である。したがって、遺伝子を、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表が、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／にて入手可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」にて容易に利用可能であり、当該表は、いくつかの方法で構成され得る。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）参照。また、特定の宿主細胞における発現のために特定の配列をコドン最適化するコンピュータアルゴリズム、例えばＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）が利用可能である。一部の実施形態において、Ｃａｓをコードする配列内の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個、又はそれを超える、又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸のために最も高頻度で使用されるコドンに相当する。
４．ＲＮＡガイド又はｃｒＲＮＡ
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、少なくともＲＮＡガイド（例えば、ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）を含む。
複数のＲＮＡガイドのアーキテクチャは、当該技術（例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット及び国際公開第２０１５／０７００８３号パンフレット（これらの各々の全体の内容が、参照によって本明細書に組み込まれる）参照）において知られている。
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、複数のＲＮＡガイド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８つ、又はそれを超えるＲＮＡガイド）を含む。
一部の実施形態において、ＲＮＡガイドはｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態において
、ＲＮＡガイドは、ｔｒａｃｒＲＮＡではなくｃｒＲＮＡを含む。
複数のＣＲＩＳＰＲシステム由来のガイドＲＮＡの配列は、通常、当該技術において知られている。例えば、Ｇｒｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５（ウェブサーバー刊行物）：Ｗ５２－７，２００７；Ｇｒｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８：１７２，２００７；Ｇｒｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６（ウェブサーバー刊行物）：Ｗ１４５－８，２００８；及びＭｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｌｉａｎｇ，ＰｅｅｒＪ ５：ｅ３７８８，２０１７；ｃｒｉｓｐｒ．ｉ２ｂｃ．ｐａｒｉｓ－ｓａｃｌａｙｆｒ／ｃｒｉｓｐｒ／ＢＬＡＳＴ／ＣＲＩＳＰＲｓＢｌａｓｔ．ｐｈｐでのＣＲＩＳＰＲデータベース；及びｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｍｏｌｌｅｒａｊ／ＭｅｔａＣＲＡＳＴにて入手可能なＭｅｔａＣＲＡＳＴ）参照。全てが参照によって本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート（ＤＲ）配列及びスペーサー配列を含む。特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、好ましくはスペーサー配列の３’末端にて、ガイド配列又はスペーサー配列に連結されたダイレクトリピート配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
一般に、Ｃａｓタンパク質は、成熟ｃｒＲＮＡとの複合体を形成し、スペーサー配列は、複合体を、スペーサー配列と相補的な、且つ／又はスペーサー配列にハイブリダイズする標的ＲＮＡとの配列特異的結合に導く。結果として生じた複合体は、標的ＲＮＡに結合されるＣａｓタンパク質及び成熟ｃｒＲＮＡを含む。
Ｃａｓ１３ｅシステム及びＣａｓ１３ｆシステムについてのダイレクトリピート配列は、通常、とりわけ末端にて、十分に保存されており、５’末端では、Ｃａｓ１３ｅについてはＧＣＴＧ、そしてＣａｓ１３ｆについてはＧＣＴＧＴを有し、３’末端では、Ｃａｓ１３ｅについてはＣＡＧＣ、そしてＣａｓ１３ｆについてはＡＣＡＧＣと逆相補的である。この保存は、遺伝子座内のタンパク質と潜在的に相互作用するＲＮＡステム－ループ構造について、強い塩基対形成を示唆している。
一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、ＲＮＡにおける場合、５’－Ｓ１ａ－Ｂａ－Ｓ２ａ－Ｌ－Ｓ２ｂ－Ｂｂ－Ｓ１ｂ－３’の一般的な二次構造を含み、セグメントＳ１ａ及びＳ１ｂは、逆相補的配列であり、Ｃａｓ１３ｅにおいて４つのヌクレオチドを、そしてＣａｓ１３ｆにおいて５つのヌクレオチドを有する第１のステム（Ｓ１）を形成し；セグメントＢａ及びＢｂは、互いに塩基対形成せずに、対称形であるか又はほぼ対称形のバルジ（Ｂ）を形成し、Ｃａｓ１３ｅにおいてそれぞれ５つのヌクレオチドを、そしてＣａｓ１３ｆにおいてそれぞれ５つ（Ｂａ）及び４つ（Ｂｂ）の、又は６つ（Ｂａ）及び５つ（Ｂｂ）のヌクレオチドを有し；セグメントＳ２ａ及びＳ２ｂは、逆相補的配列であり、Ｃａｓ１３ｅにおいて５つの塩基対を、そしてＣａｓ１３ｆにおいて６つ又は５つの塩基対を有する第２ステム（Ｓ２）を形成し；Ｌは、Ｃａｓ１３ｅにおいて８－ヌクレオチドループであり、そしてＣａｓ１３ｆにおいて５－ヌクレオチドループである。図２参照。
特定の実施形態において、Ｓ１ａは、Ｃａｓ１３ｆにおいて一連のＧＣＵＧを、そしてＣａｓ１３ｅにおいて一連のＧＣＵＧＵを有する。
特定の実施形態において、Ｓ２ａは、Ｃａｓ１３ｆにおいて一連のＧＣＣＣＣを、そしてＣａｓ１３ｅにおいて一連のＡ／Ｇ ＣＣＵＣ Ｇ／Ａを有する（式中、最初のＡ又はＧは、不在であってもよい）。
一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号８～１４の核酸配列を含むか、又はそれからなる。
本明細書中で用いられる「ダイレクトリピート配列」は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内のＤＮＡコード配列を、又はｃｒＲＮＡ内の同じものによってコードされるＲＮＡを指し得る。ゆえに、配列番号８～１４のいずれかが、ＲＮＡ分子、例えばｃｒＲＮＡの文脈において言及される場合、各ＴはＵを表すことが理解される。
一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号８～１４の最大１、２、３、４、５、６、７、又は８ヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を有する核酸配列を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号８～１４との配列同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９７％である（例えば、配列番号８～１４におけるヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換に起因する）核酸配列を含むか、又はそれからなる。一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号８～１４のいずれかの１つと同一でないが、配列番号８～１４のいずれか１つの相補体と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることができるか、又は配列番号８～１４のいずれか１つの相補体に、生理学的条件下で結合することができる核酸配列を含むか、又はそれからなる。
特定の実施形態において、欠失、挿入、又は置換は、配列番号８～１４の全体的な二次構造を変えない（例えば、ステム、バルジ、及びループの相対的な位置及び／又はサイズは、元々のステム、バルジ、及びループから大きく逸脱しない）。例えば、欠失、挿入、又は置換は、バルジ又はループ領域内に、バルジの全体的な対称性が大部分は同じままであるようにあり得る。欠失、挿入、又は置換は、ステム内に、ステムの全長が元々のステムから大きく逸脱しないようにあり得る（例えば、２つのステムの各々において１塩基対を加えること、又は欠失させることは、４つの総塩基変化に相当する）。
特定の実施形態において、欠失、挿入、又は置換は、一方若しくは双方のステムにおいて±１若しくは２塩基対を有し得（図２参照）、バルジ内の単鎖の一方若しくは双方のステムにおいて±１、２、若しくは３塩基を有し得、且つ／又はループ領域において±１、２、３、若しくは４塩基を有し得る派生的なＤＲ配列をもたらす。
特定の実施形態において、配列番号８～１４のいずれか１つと異なる先のダイレクトリピート配列はいずれも、配列番号８～１４のＤＲ配列として、Ｃａｓ１３ｅタンパク質又はＣａｓ１３ｆタンパク質内のダイレクトリピート配列として機能する能力を保持する。
一部の実施形態において、ダイレクトリピート配列は、配列番号８～１４のいずれか１つの核酸配列を有する核酸を含むか、又はそれからなり、最初の３、４、５、６、７、又は８つの３’ヌクレオチドのトランケーションがある。
一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、そしてｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号８の核酸配列を含むか、又はそれからなる。
一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、そしてｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号９の核酸配列を含むか、又はそれからなる。
一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、そしてｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番
号１０の核酸配列を含むか、又はそれからなる。
一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、そしてｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号１１の核酸配列を含むか、又はそれからなる。
一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含み、そしてｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号１２の核酸配列を含むか、又はそれからなる。
一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含み、そしてｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号１３の核酸配列を含むか、又はそれからなる。
一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、そしてｃｒＲＮＡは、ダイレクトリピート配列を含み、ダイレクトリピート配列は、配列番号１４の核酸配列を含むか、又はそれからなる。
古典的なＣＲＩＳＰＲシステムでは、ガイド配列（例えばｃｒＲＮＡ）と、その対応する標的配列との相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又は１００％であり得る。一部の実施形態において、相補性の程度は、９０～１００％である。
ガイドＲＮＡは、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、又はそれを超えるヌクレオチド長であり得る。例えば、機能Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、又はそのホモログ、オルソログ、誘導体、融合体、コンジュゲート、若しくは機能断片に用いられるスペーサーは、１０～６０ヌクレオチド、２０～５０ヌクレオチド、２５～４５ヌクレオチド、２５～３５ヌクレオチド、又は約２７、２８、２９、３０、３１、３２、若しくは３３ヌクレオチドであり得る。しかしながら、先のいずれかのｄＣａｓバージョンに用いられるスペーサーは、１０～２００ヌクレオチド、２０～１５０ヌクレオチド、２５～１００ヌクレオチド、２５～８５ヌクレオチド、３５～７５ヌクレオチド、４５～６０ヌクレオチド、又は約４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、若しくは５５ヌクレオチドであり得る。
オフターゲット相互作用を引き下げるために、例えば、相補性が低い標的配列とのガイド相互作用を引き下げるために、ＣＲＩＳＰＲシステムが、標的と、８０％、８５％、９０％、又は９５％を超える相補性を有するオフターゲット配列とを区別することができるように、変異をＣＲＩＳＰＲシステムに導入することができる。一部の実施形態において、相補性の程度は、８０％～９５％、例えば、約８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％である（例えば、１、２、又は３つのミスマッチを有する１８ヌクレオチドのオフターゲットから、１８ヌクレオチドを有する標的を区別する）。したがって、一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との相補性の程度は、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、又は９９．９％よりも大きい。一部の実施形態において、相補性の程度は１００％である。
当該分野において、機能的であるほど十分な相補性があるならば、完全な相補性が必要
とされないことが知られている。切断効率の調節は、スペーサー配列と標的配列との間で、ミスマッチ、例えば１つ又は２つのミスマッチ等の１つ以上のミスマッチの導入（スペーサー／標的に沿うミスマッチの位置を含む）によって開発することができる。ミスマッチ、例えば二重ミスマッチが、より中心（すなわち、３’又は５’末端ではない）に位置決めされる；切断効率は、より影響される。したがって、スペーサー配列に沿ってミスマッチ位置を選択することによって、切断効率を調節することができる。例えば、標的の１００％未満の切断が（例えば細胞集団において）所望されるならば、スペーサーと標的配列との間の１つ又は２つのミスマッチが、スペーサー配列内に導入され得る。
ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクターは、複数のＲＮＡガイドを使用することで、当該エフェクター、並びにこれを含むシステム及び複合体の、複数の核酸を標的とする能力を可能にすることが実証されている。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、又はそれを超える）ＲＮＡガイドを含む。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、単ＲＮＡ鎖、又は単ＲＮＡ鎖をコードする核酸を含み、ＲＮＡガイドは、縦一列になって配置されている。単ＲＮＡ鎖は、同じＲＮＡガイドの複数のコピー、異なるＲＮＡガイドの複数のコピー、又はそれらの組合せを含み得る。本明細書中に記載されるＶＩ－Ｅ型及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質のプロセシング能力は、これらのエフェクターが、活性の損失なく複数の標的核酸（例えば標的ＲＮＡ）を標的とすることができるのを可能にする。一部の実施形態において、ＶＩ－Ｅ型及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、異なる標的ＲＮＡに向けられる複数のＲＮＡガイドと複合体形成されて送達され得る。一部の実施形態において、ＶＩ－Ｅ型及びＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質は、各々が異なる標的核酸に特異的である複数のＲＮＡガイドと共に送達され得る。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を用いた多重化の方法が、例えば、米国特許第９，７９０，４９０ Ｂ２号明細書及び欧州特許第３００９５１１ Ｂ１号明細書に記載されており、これらの特許の各々の全体の内容は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
ｃｒＲＮＡのスペーサー長は、約１０～６０ヌクレオチド、例えば、１５～５０ヌクレオチド、２０～５０ヌクレオチド、２５～５０ヌクレオチド、又は１９～５０ヌクレオチドに及び得る。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのスペーサー長は、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、又は少なくとも２２ヌクレオチドである。一部の実施形態において、スペーサー長は、１５～１７ヌクレオチド（例えば、１５、１６、又は１７ヌクレオチド）、１７～２０ヌクレオチド（例えば、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド）、２０～２４ヌクレオチド（例えば、２０、２１、２２、２３、又は２４ヌクレオチド）、２３～２５ヌクレオチド（例えば、２３、２４、又は２５ヌクレオチド）、２４～２７ヌクレオチド、２７～３０ヌクレオチド、３０～４５ヌクレオチド（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５ヌクレオチド）、３０又は３５～４０ヌクレオチド、４１～４５ヌクレオチド、４５～５０ヌクレオチド（例えば、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチド）であり、又はそれよりも長い。一部の実施形態において、スペーサー長は、約１５～約４２ヌクレオチドである。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのダイレクトリピート長は、１５～３６ヌクレオチドであり、少なくとも１６ヌクレオチドであり、１６～２０ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド）であり、２０～３０ヌクレオチド（例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド）であり、３０～４０ヌクレオチド（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３
５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチド）であり、又は約３６ヌクレオチド（例えば、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９ヌクレオチド）である。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのダイレクトリピート長は３６ヌクレオチドである。
一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡ／ガイドＲＮＡの全長は、本明細書中で先に記載されるスペーサー配列長のいずれか１つよりも約３６ヌクレオチド長い。例えば、ｃｒＲＮＡ／ガイドＲＮＡの全長は、４５～８６ヌクレオチド、６０～８６ヌクレオチド、６２～８６ヌクレオチド、又は６３～８６ヌクレオチドであり得る。
ｃｒＲＮＡ配列は、ｃｒＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質との複合体の形成及び標的への結合の成功を可能にするのと同時に、ヌクレアーゼ活性の成功を可能にしない（すなわち、ヌクレアーゼ活性なし／インデルを引き起こさない）ように修飾され得る。これらの修飾ガイド配列は、「デッドｃｒＲＮＡ」、「デッドガイド」、又は「デッドガイド配列」と称される。これらのデッドガイド又はデッドガイド配列は、ヌクレアーゼ活性に関して、触媒的に不活性であり得、又は高次構造的に不活性であり得る。デッドガイド配列は典型的に、活性があるＲＮＡ切断をもたらす各ガイド配列よりも短い。一部の実施形態において、デッドガイドは、ヌクレアーゼ活性を有する各ガイドＲＮＡよりも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％短い。ガイドＲＮＡのデッドガイド配列は、１３～１５ヌクレオチド長（例えば、１３、１４、又は１５ヌクレオチド長）、１５～１９ヌクレオチド長、又は１７～１８ヌクレオチド長（例えば、１７ヌクレオチド長）であり得る。
ゆえに、一態様において、本開示は、本明細書中に記載される機能ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及びｃｒＲＮＡを含む、天然に存在しないか、又は操作されたＣＲＩＳＰＲシステムを提供し、ｃｒＲＮＡは、デッドｃｒＲＮＡ配列を含むことによって、ｃｒＲＮＡは、標的配列に、検出可能なヌクレアーゼ活性（例えばＲＮａｓｅ活性）なしで、細胞内の注目するゲノム遺伝子座にＣＲＩＳＰＲシステムが向けられるようにハイブリダイズすることができる。
デッドガイドの詳細な説明は、例えば、国際公開第２０１６／０９４８７２号パンフレットに記載されており、この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ガイドＲＮＡ（例えばｃｒＲＮＡ）は、誘導システムの構成要素として生成することができる。システムの誘導性質は、遺伝子編集又は遺伝子発現の時空制御（ｓｐａｔｉｏ－ｔｅｍｐｏｒａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）を可能にする。一部の実施形態において、誘導システム用の刺激の例として、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー、及び／又は熱エネルギーが挙げられる。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ（例えばｃｒＲＮＡ）の転写は、誘導性プロモータ、例えば、テトラサイクリン又はドキシサイクリン制御転写活性化（Ｔｅｔ－Ｏｎ及びＴｅｔ－Ｏｆｆ発現システム）、ホルモン誘導遺伝子発現システム（例えば、エクジソン誘導遺伝子発現システム）、及びアラビノース誘導遺伝子発現システムによって調節することができる。誘導システムの他の例として、低分子２－ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡその他）、光誘導システム（フィトクローム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）、又は光誘導転写エフェクター（ＬＩＴＥ）が挙げられる。これらの誘導システムは、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット及び米国特許第８７９５９６５号明細書に記載されており、これらは双方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
化学修飾は、ｃｒＲＮＡのリン酸骨格、糖、及び／又は塩基に施すことができる。ホス
ホロチオアート等の骨格修飾は、リン酸骨格上の電荷を修飾し、且つオリゴヌクレオチドの送達及びヌクレアーゼ耐性を補助する（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，“Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ，ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ．，２４，ｐｐ．３７４－３８７，２０１４参照）；糖、例えば２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｆ、及びロック核酸（ＬＮＡ）の修飾は、塩基対形成及びヌクレアーゼ耐性の双方を増強する（例えば、Ａｌｌｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．“Ｆｕｌｌｙ ２’－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８．４：９０１－９０４，２００５参照）。２－チオウリジン又はＮ６－メチルアデノシン等の化学修飾塩基は、とりわけ、より強い、又はより弱い塩基対形成を可能にし得る（例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ－ｇｒａｄｅ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡｓ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１２年８月２０日；３：１５４参照）。加えて、ＲＮＡは、蛍光色素、ポリエチレングリコール、又はタンパク質が挙げられる種々の機能部分との５’及び３’末端コンジュゲーションに適用可能である。
多種多様な修飾を、化学的に合成されたｃｒＲＮＡ分子に施すことができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性を向上させるような２’－ＯＭｅによるオリゴヌクレオチドの修飾は、ワトソン－クリック塩基対形成の結合エネルギーを変えることができる。さらに、２’－ＯＭｅ修飾は、細胞内の形質移入試薬、タンパク質、又は他のあらゆる分子とのオリゴヌクレオチドの相互作用の仕方に影響を与え得る。当該修飾の影響は、実験に基づく試験によって判定することができる。
一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、１つ以上のホスホロチオアート修飾を含む。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡは、塩基対形成を増強し、且つ／又はヌクレアーゼ耐性を高める目的で、１つ以上のロック核酸を含む。
これらの化学修飾についての要約を、例えば、Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｇｕｉｄｅ
ＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ”，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３３：７４－８３，２０１６；国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット；及び米国特許第８，７９５，９６５ Ｂ２号明細書において見出すことができる；これらは各々、その全体が参照によって組み込まれる。
本明細書中に記載されるＲＮＡガイド（例えばｃｒＲＮＡ）の配列及び全長を最適化することができる。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドの最適化された全長は、ｃｒＲＮＡのプロセシングされた形態（すなわち成熟ｃｒＲＮＡ）を同定することによって、又はｃｒＲＮＡテトラループについての実験に基づく全長研究によって判定することができる。
また、ｃｒＲＮＡは、１つ以上のアプタマー配列を含み得る。アプタマーはオリゴヌクレオチド分子又はペプチド分子であり、特定の三次元構造を有しており、特定の標的分子に結合することができる。アプタマーは、遺伝子エフェクター、遺伝子アクティベータ、又は遺伝子リプレッサに特異的であり得る。一部の実施形態において、アプタマーは、特定の遺伝子エフェクター、遺伝子アクティベータ、又は遺伝子リプレッサに特異的であり、且つこれを動員し、且つ／又はこれに結合するタンパク質に特異的であり得る。エフェクター、アクティベータ、又はリプレッサは、融合タンパク質の形態で存在し得る。一部
の実施形態において、ガイドＲＮＡは、同じアダプタータンパク質に特異的である２つ以上のアプタマー配列を有する。一部の実施形態において、２つ以上のアプタマー配列は、異なるアダプタータンパク質に特異的である。アダプタータンパク質の例として、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φｋＣｂ５、φｋＣｂ８ｒ、φｋＣｂ１２ｒ、φｋＣｂ２３ｒ、７ｓ、及びＰＲＲ１が挙げられ得る。したがって、一部の実施形態において、アプタマーは、本明細書中に記載されるアダプタータンパク質のいずれか１つに特異的に結合する結合タンパク質から選択される。一部の実施形態において、アプタマー配列は、ＭＳ２結合ループ（５’－ｇｇｃｃｃＡＡＣＡＵＧＡＧＧＡＵＣＡＣＣＣＡＵＧＵＣＵＧＣＡＧｇｇｇｃｃ－３’）である。一部の実施形態において、アプタマー配列は、ＱＢｅｔａ結合ループ（５’－ｇｇｃｃｃＡＵＧＣＵＧＵＣＵＡＡＧＡＣＡＧＣＡＵｇｇｇｃｃ－３’）である。一部の実施形態において、アプタマー配列は、ＰＰ７結合ループ（５’－ｇｇｃｃｃＵＡＡＧＧＧＵＵＵＡＵＡＵＧＧＡＡＡＣＣＣＵＵＡｇｇｇｃｃ－３’）である。アプタマーの詳細な説明を、例えば、Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ Ｃａｓ９ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ”，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，４４（２０）：９５５５－９５６４，２０１６；及び国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレットにおいて見出すことができ、これらは、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態において、方法は、化学修飾ガイドＲＮＡを使用する。ガイドＲＮＡ化学修飾の例として、以下に限定されないが、１つ以上の末端ヌクレオチドでの２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオアート（ＭＳ）、又は２’－Ｏ－メチル３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）の組込みが挙げられる。そのような化学修飾ガイドＲＮＡは、非修飾ガイドＲＮＡと比較した、安定性の増大及び活性の増大を含み得るが、オンターゲット対オフターゲットの特異性は、予測可能でない。Ｈｅｎｄｅｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（９）：９８５－９，２０１５（参照によって組み込まれる）参照。さらに、化学修飾ガイドＲＮＡとして、限定されないが、ホスホロチオアート結合、及びリボース環の２’炭素と４’炭素間のメチレン架橋を含むロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを有するＲＮＡが挙げられ得る。
また、本発明は、複数の核酸構成要素を送達する方法を包含し、各核酸構成要素は、注目する様々な標的遺伝子座に特異的であることによって、注目する複数の標的遺伝子座を修飾する。複合体の核酸構成要素は、１つ以上のタンパク質結合ＲＮＡアプタマーを含んでもよい。１つ以上のアプタマーは、バクテリオファージコートタンパク質に結合することができる。バクテリオファージコートタンパク質は、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、ＭＳ２、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、及びＰＲＲ１を含む群から選択され得る。特定の実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質はＭＳ２である。
５．標的ＲＮＡ
標的ＲＮＡは、注目するあらゆるＲＮＡ分子であり得、天然に存在するＲＮＡ分子及び操作されたＲＮＡ分子が挙げられる。標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボザイム、リボスイッチ、サテライトＲＮＡ、マイクロスイッチ、マイクロザイム、又はウイルスＲＮＡであり得る。
一部の実施形態において、標的核酸は、容体又は疾患（例えば、感染症又は癌）と関連
する。
ゆえに、一部の実施形態において、本明細書中に記載されるシステムは、これらの核酸を標的とすることによって容体又は疾患を処置するのに用いることができる。例えば、容体又は疾患と関連する標的核酸として、罹患細胞（例えば、癌又は腫瘍細胞）内で過剰発現されるＲＮＡ分子があり得る。また、標的核酸として、毒性ＲＮＡ及び／又は変異ＲＮＡ（例えば、スプライシング欠損又は変異を有するｍＲＮＡ分子）があり得る。また、標的核酸として、特定の微生物（例えば病原性細菌）に特異的なＲＮＡがあり得る。
６．複合体及び細胞
本発明の一態様は、（１）本明細書中に記載されるあらゆるＣａｓ１３ｅ／Ｃａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、そのホモログ、オルソログ、融合体、誘導体、コンジュゲート、又は機能断片、及び（２）本明細書中に記載されるあらゆるガイドＲＮＡ（各々、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に相補的であるように設計されたスペーサー配列を含む）、及びＣａｓ１３ｅ／Ｃａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、そのホモログ、オルソログ、融合体、誘導体、コンジュゲート、又は機能断片と和合性のＤＲ配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｅ複合体又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｆ複合体を提供する。
特定の実施形態において、複合体はさらに、ガイドＲＮＡによって結合される標的ＲＮＡを含む。
特定の実施形態において、複合体は、天然に存在しない／生じない。例えば、複合体の構成要素の少なくとも１つが、天然に存在しない／生じない。特定の実施形態において、Ｃａｓ１３ｅ／Ｃａｓ１３ｆエフェクタータンパク質、そのホモログ、オルソログ、融合体、誘導体、コンジュゲート、又は機能断片は、例えば、野生型タンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異（欠失、挿入、及び／又は置換）の存在に起因して、天然に存在しない／生じない。特定の実施形態において、ＤＲ配列は、例えば、野生型配列内の少なくとも１つのヌクレオチド塩基の付加、欠失、及び／又は置換に起因して、天然に存在しない／生じない、すなわち、配列番号８～１４のいずれでもない。特定の実施形態において、スペーサー配列は、存在しないか、又は対象Ｃａｓ１３ｅ若しくはＣａｓ１３ｆが存在する原核生物の野生型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座内に存在するあらゆるスペーサー配列によってコードされないという点で、天然に存在しない。スペーサー配列は、天然に存在するバクテリオファージ核酸と１００％相補的でない場合、天然に存在し得ない。
関連する態様において、本発明はまた、本発明の複合体のいずれかを含む細胞を提供する。
特定の実施形態において、細胞は原核生物である。
特定の実施形態において、細胞は真核生物である。細胞が真核生物である場合、真核細胞内の複合体は、Ｃａｓ１３ｅ／Ｃａｓ１３ｆが単離される原核生物において、天然に存在するＣａｓ１３ｅ／Ｃａｓ１３ｆ複合体であり得る。
７．ＣＲＩＳＰＲシステムを用いる方法
本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、細胞型の多重化の際に標的ポリヌクレオチド又は核酸を修飾する（例えば、欠失させる、挿入する、転座させる、不活化する、又は活性化する）ことを含む多種多様な有用性を有する。ＣＲＩＳＰＲシステムは、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ検出（例えば、特異的高感度酵素リポーターアンロック（ＳＨＥＲＬＯＣＫ））、核酸の追跡及び標識化、富化アッセイ（所望の配列を背景から抽出）、干渉ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの制御、循環腫瘍ＤＮＡの検出、次世代ライブラリの調製、薬物
スクリーニング、疾患診断及び予測、並びに種々の遺伝的障害の処置における広範囲の用途がある。
ＤＮＡ／ＲＮＡ検出
一態様において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、ＤＮＡ又はＲＮＡ検出に用いることができる。実施例に示されるように、本発明のＣａｓ１３ｅタンパク質及びＣａｓ１３ｆタンパク質は、スペーサー配列が約３０ヌクレオチドである場合、そのガイドＲＮＡ依存性特異的ＲＮａｓｅ活性の活性化により、非特異的／コラテラルＲＮａｓｅ活性を示す。ゆえに、本発明のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡｓ）により再プログラム化されて、特異的ＲＮＡ検知用のプラットフォームを提供することができる。特定のスペーサー配列長を選択するによって、そしてそのＲＮＡ標的の認識により、活性化されたＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、直ぐ近くの非標的ＲＮＡの「コラテラル」切断に携わる。このｃｒＲＮＡプログラム化コラテラル切断活性により、ＣＲＩＳＰＲシステムは、プログラム細胞死をトリガーすることによって、又は標識されたＲＮＡの非特異的分解によって、特定のＲＮＡの存在を検出することができる。
ＳＨＥＲＬＯＣＫ法（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ＵｎＬＯＣＫｉｎｇ）は、リポーターＲＮＡの核酸増幅及びコラテラル切断に基づくアトモル感度でのインビトロ核酸検出プラットフォームを提供し、標的のリアルタイム検出が可能となる。シグナル検出を達成するために、検出は、様々な等温増幅工程と組み合わせることができる。例えば、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を、Ｔ７転写とカップリングして、増幅されたＤＮＡを、以降の検出のためにＲＮＡに変換することができる。ＲＰＡによる増幅、増幅されたＤＮＡの、ＲＮＡへのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写、及びリポーターシグナルのコラテラルＲＮＡ切断媒介放出による標的ＲＮＡの検出の組合せが、ＳＨＥＲＬＯＣＫと称される。ＳＨＥＲＬＯＣＫにＣＲＩＳＰＲを用いる方法が、例えばＧｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．“Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７年４月２８日；３５６（６３３６）：４３８－４４２において詳細に記載されており、この文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を、ノーザンブロットアッセイに用いることができ、これは、電気泳動を用いて、ＲＮＡサンプルをサイズによって分離するものである。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を用いて、標的ＲＮＡ配列に特異的に結合させて、これを検出することができる。また、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）に融合することができ、そしてこれを用いて、生細胞内のＲＮＡ局在化を追跡することができる。より詳細には、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、先に記載するようにＲＮＡをもはや切断しないという点で、不活化することができる。ゆえに、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を用いて、ＲＮＡ又は特定のスプライスバリアントの局在化、ｍＲＮＡ転写産物のレベル、転写産物のアップレギュレーション又はダウンレギュレーション、及び疾患特有の診断を判定することができる。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、例えば、細胞のハイスループットスクリーニング、及びセルソーティング後の生細胞の回収を可能にする、蛍光顕微鏡観察又はフローサイトメトリー、例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、（生）細胞内のＲＮＡの視覚化に用いることができる。ＤＮＡ及びＲＮＡを如何に検出するかに関する詳細な説明を、例えば、国際公開第２０１７／０７０６０５号パンフレットにおいて見出すことができ、この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを、マルチプ
レックスエラーロバスト蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＭＥＲＦＩＳＨ）に用いることができる。当該方法は、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｏｌｖｅｄ， ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５年４月２４日；３４８（６２３３）：ａａａ６０９０に記載されており、この文献はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、サンプル（例えば、臨床サンプル、細胞、又は細胞溶解液）内の標的ＲＮＡを検出することができる。本明細書中に記載されるＶＩ－Ｅ型及び／又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質のコラテラルＲＮａｓｅ活性は、スペーサー配列が、特定の選択された長さ（例えば約３０ヌクレオチド）のものである場合にエフェクタータンパク質が標的核酸に結合する場合、活性化される。注目する標的ＲＮＡに結合することにより、エフェクタータンパク質は、標識されたディテクタＲＮＡを切断して、シグナル（例えば、増大したシグナル又は低下したシグナル）を生成することによって、サンプルにおける標的ＲＮＡの定性的且つ定量的な検出を可能にする。サンプル内のＲＮＡの特異的検出及び定量化により、診断法が挙げられる多数の用途が可能となる。一部の実施形態において、方法は、サンプルを以下と接触させることを含む：ｉ）ＲＮＡガイド（例えばｃｒＲＮＡ）、及び／又はＲＮＡガイドをコードする核酸；ＲＮＡガイドは、標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができるダイレクトリピート配列及びスペーサー配列からなる；（ｉｉ）ＶＩ－Ｅ型若しくはＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆ）、及び／又はエフェクタータンパク質をコードする核酸；並びに（ｉｉｉ）標識されたディテクタＲＮＡ；エフェクタータンパク質は、ＲＮＡガイドと結合して、複合体を形成し；ＲＮＡガイドは、標的ＲＮＡにハイブリダイズし；複合体の、標的ＲＮＡへの結合により、エフェクタータンパク質は、コラテラルＲＮａｓｅ活性を示して、標識されたディテクタＲＮＡを切断する；並びにｂ）標識されたディテクタＲＮＡの切断によって生成される検出シグナルを測定することであり、前記測定することは、サンプル内の一本鎖標的ＲＮＡの検出を実現する。一部の実施形態において、方法はさらに、検出シグナルを参照シグナルと比較することと、サンプル内の標的ＲＮＡの量を判定することとを含む。一部の実施形態において、測定することは、金ナノ粒子検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学的検出、及び半導体ベースの検知を用いて実行される。一部の実施形態において、標識されたディテクタＲＮＡは、蛍光発光色素対、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）対、又はクエンチャ／蛍石対を含む。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質による標識されたディテクタＲＮＡの切断により、標識されたディテクタＲＮＡによって生成される検出シグナルの量が、低下するか、又は増大する。一部の実施形態において、標識されたディテクタＲＮＡは、エフェクタータンパク質による切断前の第１の検出シグナル、及びエフェクタータンパク質による切断後の第２の検出シグナルを生成する。一部の実施形態において、標識されたディテクタＲＮＡがエフェクタータンパク質によって切断された場合に、検出シグナルが生成される。一部の実施形態において、標識されたディテクタＲＮＡは、修飾核酸塩基、修飾糖部分、修飾核酸結合、又はそれらの組合せを含む。一部の実施形態において、方法は、複数のＶＩＥ型及び／又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（Ｃａｓ１３ｅ及び／又はＣａｓ１３ｆ）システム（各々が異なるオーソログエフェクタータンパク質及び対応するＲＮＡガイドを含む）を用いた、サンプル内の複数の独立した標的ＲＮＡ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、又はそれを超える標的ＲＮＡ）のマルチチャンネル検出を含み、サンプル内の複数の標的ＲＮＡの分化が可能となる。一部の実施形態において、方法は、ＶＩ－Ｅ型及び／又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの複数の例（各々が、コラテラルＲＮａｓｅ基質が区別可能なオーソログエフェクタータンパク質を含有する）を使った、サンプル内の複数の独立した標的ＲＮＡのマルチチャンネル検出を含む。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を用いてサンプル内のＲＮＡを検出する方法が、例
えば、米国特許出願公開第２０１７／０３６２６４４号明細書に記載されており、この出願の全体の内容が、参照によって本明細書に組み込まれる。
核酸の追跡及び標識化
細胞プロセスは、タンパク質とＲＮＡとＤＮＡ間の分子相互作用のネットワークによって決まる。タンパク質－ＤＮＡ相互作用及びタンパク質－ＲＮＡ相互作用の正確な検出が、そのようなプロセスを理解するための鍵である。インビトロ近接標識技術が、リポーター基、例えば、光活性化基と組み合わせた親和性タグを使用して、注目するタンパク質又はＲＮＡの近くでポリペプチド及びＲＮＡをインビトロ標識する。ＵＶ照射の後に、光活性化基は、タグ付けされた分子に近接するタンパク質及び他の分子と反応することによって、タグ付けされた分子を標識する。その後、標識された相互作用分子を回収して同定することができる。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、例えば、選択されたＲＮＡ配列にプローブを向けるのに用いることができる。また、当該用途は、疾患、又は培養が困難な細胞型のインビボ画像化用の動物モデルに応用することができる。核酸の追跡及び標識化の方法は、例えば、米国特許第８，７９５，９６５号明細書、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット、及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレットに記載されており、これらは各々、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡの単離、精製、富化、及び／又は枯渇
本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステム（例えばＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）を用いて、ＲＮＡを単離且つ／又は精製することができる。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＲＮＡ－ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質複合体を単離且つ／又は精製するのに用いることができる親和性タグに融合し得る。当該用途は、例えば、細胞内の遺伝子発現プロファイルの分析に有用である。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を用いて、特定の非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を標的とすることによって、その活性をブロックすることができる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を用いて、特定のＲＮＡを特異的に富化する（安定性その他を増大させることが挙げられるが、これに限定されない）ことができるか、又は代わりに、特定のＲＮＡ（例えば、特定のスプライスバリアント、アイソフォームその他）を特異的に枯渇させることができる。
これらの方法は、例えば、米国特許第８，７９５，９６５号明細書、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット、及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレットに記載されている；これらは各々、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ハイスループットスクリーニング
本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを、次世代配列決定（ＮＧＳ）ライブラリを調製するのに用いることができる。例えば、対費用効果の高いＮＧＳライブラリを生じさせるために、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、標的遺伝子のコード配列を崩壊させることができ、そしてＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質が形質移入されたクローンを、次世代配列決定（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭシステムによる）によって同時にスクリーニングすることができる。ＮＧＳライブラリを如何に調製するかに関する詳細な説明を、例えば、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１５．１（２０１４）：１００２において見出すことができ、この文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
操作される微生物
微生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、及び微細藻類）が、合成生物学に広く用いられている。合成生物学の開発は、種々の臨床用途が挙げられる広い有用性がある。例えば、プログラム可能なＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、標的細胞死についての毒性ドメインのタンパク質を、例えば標的転写産物として癌関連ＲＮＡを用いて、分割することができる。さらに、タンパク質－タンパク質相互作用に関与する経路が、例えばキナーゼ又は酵素等の適切なエフェクターとの融合複合体により、合成生体系において影響され得る。
一部の実施形態において、ファージ配列を標的とするｃｒＲＮＡを、微生物中に導入することができる。ゆえに、本開示はまた、微生物（例えば生成株）へのファージ感染の接種方法を提供する。
一部の実施形態において、本明細書中で提供されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、微生物を操作する、例えば、収量を向上させるか、又は発酵効率を向上させることができる。例えば、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、微生物、例えば酵母を操作して、発酵性糖からバイオ燃料若しくは生体ポリマーを生成することができ、又は発酵性糖の源として農業廃棄物に由来する植物由来リグノセルロースを分解することができる。より詳細には、本明細書中に記載される方法を用いて、バイオ燃料生成に必要とされる内因性遺伝子の発現を修飾することができ、且つ／又は内因性遺伝子を修飾することができ、これらは、バイオ燃料合成に干渉し得る。微生物を操作するこれらの方法が、例えば、Ｖｅｒｗａａｌ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ ｅｎａｂｌｅｓ ｆａｓｔ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ”，Ｙｅａｓｔ ｄｏｉ：１０．１００２／ｙｅａ．３２７８，２０１７；及びＨｌａｖｏｖａ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｆｏｒ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ｆｒｏｍ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｔｏ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，３３：１１９４－２０３，２０１５に記載されており、これらの文献は双方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、本明細書中で提供されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、細胞（例えば、微生物、例えば操作された微生物）の死亡又は休止状態を誘導することができる。当該方法を用いて、以下に限定されないが、哺乳動物細胞（例えば、癌細胞又は組織培養細胞）、原虫、真菌細胞、ウイルスが感染した細胞、細胞内細菌が感染した細胞、細胞内原虫が感染した細胞、プリオンが感染した細胞、細菌（例えば、病原性細菌及び非病原性細菌）、原虫、並びに単細胞寄生虫及び多細胞寄生虫が挙げられる原核細胞及び真核細胞が挙げられる多数の細胞型の休止状態又は死亡を誘導することができる。例えば、合成生物学の分野では、増殖又は伝播を妨げるように操作された微生物（例えば細菌）を制御する機構を有することが非常に所望される。本明細書中に記載されるシステムを、操作された微生物の増殖又は伝播を調節且つ／又は妨げる「キル－スイッチ」として用いることができる。さらに、現在の抗生物質処置の代替物が、当該技術において必要とされている。また、本明細書中に記載されるシステムは、特定の微生物集団（例えば細菌集団）を死滅させるか、又は制御することが所望される用途に用いることができる。例えば、本明細書中に記載されるシステムは、属、種、又は株特異的な核酸（例えばＲＮＡ）を標的とするＲＮＡガイド（例えばｃｒＲＮＡ）を含んでもよく、そして細胞に送達され得る。複合体形成して標的核酸に結合すると直ぐに、ＶＩ－Ｅ型及び／又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質のコラテラルＲＮａｓｅ活性が活性化されて、微生物内での非標的ＲＮＡの切断に至って、最終的に休止状態又は死亡に終わる。一部の実施形態において、方法は、細胞を、ＶＩ－Ｅ型及び／若しくはＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質、又はエフェクタータンパク質をコードする核酸、及びＲＮ
Ａガイド（例えばｃｒＲＮＡ）、又はＲＮＡガイドをコードする核酸を含む、本明細書中に記載されるシステムと接触させることを含み、スペーサー配列は、標的核酸（例えば、属、株、又は種特異的ＲＮＡガイド）の少なくとも１５ヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれを超えるヌクレオチド）と相補的である。特定のいかなる理論によっても拘束されることを望むものではないが、ＶＩ－Ｅ型及び／又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質による非標的ＲＮＡの切断は、プログラム細胞死、細胞毒性、アポトーシス、壊死、ネクロプトーシス、細胞死、細胞周期停止、細胞アネルギー、細胞成長の引下げ、又は細胞増殖の引下げを誘導し得る。例えば、細菌において、ＶＩ－Ｅ型及び／又はＶＩ－Ｆ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタータンパク質による非標的ＲＮＡの切断は、静菌性であっても殺菌性であってもよい。
植物における用途
本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、植物における多種多様の有用性がある。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、植物のゲノムを操作する（例えば、生産を向上させるか、所望の翻訳後修飾を有する生成物を製造するか、又は工業製品を生成するための遺伝子を導入する）ことができる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、所望の形質を植物（例えば、ゲノムへの遺伝性の修飾がある、又はない）に導入するか、又は植物細胞若しくは植物全体における内因性遺伝子の発現を調節することができる。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、特定のタンパク質、例えば、アレルゲンタンパク質（例えば、ピーナッツ、ダイズ、レンズマメ、エンドウ、緑莢インゲン、及びヤエナリ内のアレルゲンタンパク質）をコードする遺伝子を同定し、編集し、且つ／又はサイレンシングさせることができる。タンパク質をコードする遺伝子を如何に同定し、編集し、且つ／又はサイレンシングさせるかに関する詳細な説明が、例えば、Ｎｉｃｏｌａｏｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ａｎｄ ｌｅｇｕｍｅ ａｌｌｅｒｇｙ”，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（３）：２２２－８，２０１１、及び国際公開第２０１６２０５７６４ Ａ１号パンフレットに記載されており、これらは双方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
遺伝子ドライブ
遺伝子ドライブは、特定の遺伝子又は遺伝子のセットの遺伝が、好都合に偏る現象である。本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、遺伝子ドライブを構築することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムを、遺伝子の特定の対立遺伝子を標的として破壊するように設計して、これにより細胞は、第２の対立遺伝子をコピーして、配列を固定することができる。コピーのおかげで、第１の対立遺伝子は、第２の対立遺伝子に変換されて、第２の対立遺伝子が後代に伝えられる見込みが増すこととなる。本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを如何に用いて、遺伝子ドライブを構築するかに関する詳細な方法が、例えば、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，“Ａ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９
ｇｅｎｅ ｄｒｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｅｍａｌｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｌａｒｉａ ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｖｅｃｔｏｒ Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ”，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（１）：７８－８３，２０１６に記載されており、この文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
プールドスクリーニング
本明細書中に記載される、プールドＣＲＩＳＰＲスクリーニングは、生物学的機構、例えば、細胞増殖、薬剤耐性、及びウイルス感染に関与する遺伝子を同定するための強力な
ツールである。細胞に、本明細書中に記載されるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）コードベクターのライブラリが大量に形質導入されて、ｇＲＮＡの分布が、選択的チャレンジ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を施す前後に測定される。プールドＣＲＩＳＰＲスクリーンが、細胞の生存及び増殖に影響を与える機構に上手く機能し、そして個々の遺伝子の活性を測定するために（例えば、操作されたリポーター細胞株を用いて）伸長され得る。一度に１つの遺伝子のみが標的とされる、アレイドＣＲＩＳＰＲスクリーンにより、ＲＮＡｓｅｑをリードアウトとして用いることが可能となる。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを、単細胞ＣＲＩＳＰＲスクリーンに用いることができる。プールドＣＲＩＳＰＲスクリーニングに関する詳細な記載を、例えば、Ｄａｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｏｏｌｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｒｅａｄ－ｏｕｔ”，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１４（３）：２９７－３０１，２０１７において見出すことができ、この文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
飽和変異誘発（バッシング）
本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを、インサイチュ飽和変異誘発に用いることができる。一部の実施形態において、プールしたガイドＲＮＡライブラリを用いて、特定の遺伝子又は調節要素についてインサイチュ飽和変異誘発を実行することができる。そのような方法は、これらの遺伝子又は調節要素（例えばエンハンサー）の重要な最小の特徴及び別々の脆弱性を明らかにすることができる。当該方法は、例えば、Ｃａｎｖｅｒ
ｅｔ ａｌ．，“ＢＣＬ１１Ａ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｓ９－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”，Ｎａｔｕｒｅ ５２７（７５７７）：１９２－７，２０１５に記載されており、この文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡ関連用途
本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、種々のＲＮＡ関連用途があり得、例えば、遺伝子発現を調節すること、ＲＮＡ分子を分解すること、ＲＮＡ発現を阻害すること、ＲＮＡ若しくはＲＮＡ産物をスクリーニングすること、ｌｉｎｃＲＮＡ若しくは非コードＲＮＡの機能を判定すること、細胞休止状態を誘導すること、細胞周期停止を誘導すること、細胞成長及び／若しくは細胞増殖を引き下げること、細胞アネルギーを誘導すること、細胞アポトーシスを誘導すること、細胞壊死を誘導すること、細胞死を誘導すること、且つ／又はプログラム細胞死を誘導することがある。これらの用途の詳細な説明を、例えば、国際公開第２０１６／２０５７６４ Ａ１号パンフレットにおいて見出すことができ、この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。様々な実施形態において、本明細書中に記載される方法は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで実行することができる。
例えば、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、疾患又は障害を有する対象に投与されて、罹患状態にある細胞（例えば、癌細胞、又は感染性因子に感染した細胞）を標的として細胞死を誘導することができる。例えば、一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、癌細胞を標的として細胞死を誘導することができ、癌細胞は、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮体癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、髄様甲状腺癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又は膀胱癌を有する対象に由来する。
遺伝子発現を調節すること
本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、遺伝子発現を調節することができる。ＣＲＩＳＰＲシステムを、適切なガイドＲＮＡと共に用いて、ＲＮＡプロセシングの制御を介して、遺伝子発現を標的とすることができる。ＲＮＡプロセシングの制御の例として、ＲＮＡプロセシング反応、例えばＲＮＡスプライシング（例えば選択的スプライシング）、ウイルス複製、及びｔＲＮＡ生合成が挙げられ得る。また、ＲＮＡ標的タンパク質を、適切なガイドＲＮＡと組み合わせて用いて、ＲＮＡ活性化（ＲＮＡａ）を制御することができる。ＲＮＡ活性化は、プロモータ標的短二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が標的遺伝子発現を転写／エピジェネティックレベルにて誘導する低分子ＲＮＡガイド及びアルゴノート（Ａｇｏ）依存性遺伝子調節現象である。ＲＮＡａは、遺伝子発現の促進に至るので、遺伝子発現の制御は、ＲＮＡａの破壊又は引下げによって達成され得る。一部の実施形態において、方法は、ＲＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲを、例えば干渉リボ核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｄｓＲＮＡ）の代替物として使用することを含む。遺伝子発現を調節する方法は、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレットに記載されており、この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡ干渉を制御すること
干渉ＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の制御は、干渉ＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの寿命をインビボ又はインビトロで短くすることによって、オフターゲット効果を引き下げる一助とすることができる。一部の実施形態において、標的ＲＮＡとして、干渉ＲＮＡ、すなわち、ＲＮＡ干渉経路に関与するＲＮＡ、例えば低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉（ｓｉＲＮＡ）その他が挙げられ得る。一部の実施形態において、標的ＲＮＡの例として、ｍｉＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が挙げられる。
一部の実施形態において、ＲＮＡ標的化タンパク質及び適切なガイドＲＮＡは、選択的に（例えば、調節プロモータ、例えば組織又は細胞周期特異的プロモータ及び／又はエンハンサーの制御下で空間的又は時間的に）発現されるならば、細胞又はシステムを、当該細胞内でのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）から（インビボ又はインビトロで）保護するのに用いることができる。これは、ＲＮＡｉが必要とされない隣接する組織若しくは細胞において、又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及び適切なｃｒＲＮＡが発現され、そして発現されない（すなわち、それぞれ、ＲＮＡｉが制御されない、そして制御される）細胞若しくは組織の比較目的で、有用であり得る。ＲＮＡ標的化タンパク質を用いて、ＲＮＡを含むか、又はこれからなる分子、例えば、リボザイム、リボソーム、又はリボスイッチを制御することができるか、又はこれに結合することができる。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ標的化タンパク質を当該分子に、ＲＮＡ標的化タンパク質が当該分子に結合することができるように動員することができる。当該方法は、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレットに記載されており、これらの出願は双方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
リボスイッチを修飾して代謝調節を制御すること
リボスイッチは、低分子に結合して、次に遺伝子発現を調節する、メッセンジャーＲＮＡの調節セグメントである。この機構により、細胞は、当該低分子の細胞内濃度を検知することができる。特定のリボスイッチは典型的に、隣接する遺伝子の転写、翻訳、又はスプライシングを変更することによって、当該遺伝子を調節する。ゆえに、一部の実施形態において、リボスイッチ活性は、リボスイッチを標的とするのに適したガイドＲＮＡと組み合わせてＲＮＡ標的化タンパク質を用いることによって制御することができる。これは、リボスイッチの切断、又はリボスイッチへの結合を介して達成され得る。ＣＲＩＳＰＲシステムを用いてリボスイッチを制御する方法が、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレットに記載されており、これらの出願は双方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡ修飾
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、塩基－編集ドメイン、例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、又は活性化によって誘導されるシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）に融合することができ、そしてＲＮＡ配列（例えばｍＲＮＡ）を修飾するのに用いることができる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、１つ以上の変異を（例えば触媒ドメイン内に）含み、これによりＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＲＮＡを切断することができない。
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＭＳ２（別名、ＭＳ２コートタンパク質）、Ｑｂｅｔａ（別名、Ｑｂｅｔａコートタンパク質）、又はＰＰ７（別名、ＰＰ７コートタンパク質）等の、ＲＮＡ結合ドメインに融合する塩基－編集ドメイン（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、又はＡＩＤ）を含むＲＮＡ結合融合ポリペプチドに用いることができる。ＲＮＡ結合ドメインＭＳ２、Ｑｂｅｔａ、及びＰＰ７のアミノ酸配列は、以下に記載される：
ＭＳ２（ＭＳ２コートタンパク質）
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲＱＳＳＡＱＫＲＫＹＴＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ
Ｑｂｅｔａ（Ｑｂｅｔａコートタンパク質）
ＭＡＫＬＥＴＶＴＬＧＮＩＧＫＤＧＫＱＴＬＶＬＮＰＲＧＶＮＰＴＮＧＶＡＳＬＳＱＡＧＡＶＰＡＬＥＫＲＶＴＶＳＶＳＱＰＳＲＮＲＫＮＹＫＶＱＶＫＩＱＮＰＴＡＣＴＡＮＧＳＣＤＰＳＶＴＲＱＡＹＡＤＶＴＦＳＦＴＱＹＳＴＤＥＥＲＡＦＶＲＴＥＬＡＡＬＬＡＳＰＬＬＩＤＡＩＤＱＬＮＰＡＹ
ＰＰ７（ＰＰ７コートタンパク質）
ＭＳＫＴＩＶＬＳＶＧＥＡＴＲＴＬＴＥＩＱＳＴＡＤＲＱＩＦＥＥＫＶＧＰＬＶＧＲＬＲＬＴＡＳＬＲＱＮＧＡＫＴＡＹＲＶＮＬＫＬＤＱＡＤＶＶＤＣＳＴＳＶＣＧＥＬＰＫＶＲＹＴＱＶＷＳＨＤＶＴＩＶＡＮＳＴＥＡＳＲＫＳＬＹＤＬＴＫＳＬＶＶＱＡＴＳＥＤＬＶＶＮＬＶＰＬＧＲ
一部の実施形態において、ＲＮＡ結合ドメインは、本明細書中に記載されるシステムのｃｒＲＮＡ上の特定の配列（例えばアプタマー配列）又は二次構造モチーフに結合する（例えば、ｃｒＲＮＡがエフェクター－ｃｒＲＮＡ複合体内にある場合）ことによって、ＲＮＡ結合融合ポリペプチド（これは、塩基－編集ドメインを有する）をエフェクター複合体に動員することができる。例えば、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、アプタマー配列（例えば、ＭＳ２結合ループ、ＱＢｅｔａ結合ループ、又はＰＰ７結合ループ）を有するｃｒＲＮＡ、及びアプタマー配列に特異的に結合するＲＮＡ結合ドメインに融合する塩基－編集ドメインを有するＲＮＡ結合融合ポリペプチドを含む。このシステムでは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、アプタマー配列を有するｃｒＲＮＡとの複合体を形成する。さらに、ＲＮＡ結合融合ポリペプチドは、ｃｒＲＮＡに（アプタマー配列を介して）結合することによって、標的ＲＮＡを修飾することができる三分子複合体（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成する。
ＣＲＩＳＰＲシステムを塩基編集に用いる方法は、例えば、国際公開第２０１７／２１９０２７号パンフレットに記載されており、この出願は、その全体が、特にＲＮＡ修飾の考察に関して、参照によって本明細書に組み込まれる。
ＲＮＡスプライシング
一部の実施形態において、本明細書中に記載される不活化ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質
（例えば、触媒ドメイン内に１つ以上の変異を有するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）を用いて、ＲＮＡ転写産物上の特定のスプライシング部位を標的として、これに結合することができる。不活化ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の、ＲＮＡへの結合は、スプライセオソームの、転写産物との相互作用を立体配置的に阻害して、特定の転写産物アイソフォームの生成の頻度の改変が可能となる。そのような方法を用いて、エキソンスキッピングにより疾患を、変異を有するエキソンが、成熟タンパク質内でスキップされ得るように処置することができる。ＣＲＩＳＰＲシステムを用いてスプライシングを改変する方法が、例えば、国際公開第２０１７／２１９０２７号パンフレットに記載されており、この出願は、その全体が、特にＲＮＡスプライシングの考察に関して、参照によって本明細書に組み込まれる。
治療用途
本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、種々の治療用途があり得る。そのような用途は、対象ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｅ又はＣａｓ１３ｆシステムの、以下の能力の１つ以上に、インビトロ及びインビボ双方で基づき得る：細胞の老化を誘導し、細胞周期停止を誘導し、細胞の成長及び／又は増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、壊死を誘導する能力その他。
一部の実施形態において、新しいＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、種々の疾患及び障害、例えば、遺伝的障害（例えば単一遺伝子疾患）、ヌクレアーゼ活性（例えば、Ｐｃｓｋ９標的化、デュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）、ＢＣＬ１１ａ標的化）によって処置することができる疾患、及び種々の癌その他を処置することができる。
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、（例えば、１つ以上の核酸残基を挿入するか、欠失させるか、又は変異させることによって）標的核酸を編集して標的核酸を修飾することができる。例えば、一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、所望の核酸配列を含む外来ドナー鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子）を含む。本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムにより誘導される切断事象の解消（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）により、細胞の分子機構は、切断事象を修復且つ／又は解消するのに、外来ドナー鋳型核酸を利用することとなる。これ以外にも、細胞の分子機構は、切断事象を修復且つ／又は解消するのに、内因性鋳型を利用し得る。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、標的核酸を改変して、挿入、欠失、及び／又は点変異が生じ得る。一部の実施形態において、挿入は、スカーレス挿入（すなわち、切断事象の解消により、付加的な意図されない核酸配列が生じない、標的核酸中への意図される核酸配列の挿入）である。ドナー鋳型核酸は、二本鎖又は一本鎖の核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）であり得る。外来ドナー鋳型核酸を設計する方法が、例えば、国際公開第２０１６／０９４８７４ Ａ１号パンフレットに記載されており、この出願の全体の内容が、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
一態様において、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡ、毒性ＲＮＡ、及び／又は変異ＲＮＡの過剰発現によって引き起こされる疾患（例えば、スプライシング欠損又はトランケーション）を処置するのに用いることができる。例えば、毒性ＲＮＡの発現が、核封入体の形成、及び脳、心臓、又は骨格筋の遅発性退行性変化と関連し得る。一部の実施形態において、障害は、筋強直性ジストロフィである。筋強直性ジストロフィにおいて、毒性ＲＮＡの主要な病原性作用は、結合タンパク質を隔離（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）して、選択的スプライシングの調節を損なうことである（例えば、Ｏｓｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－ｄｏｍｉｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅｓ”，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２００９ Ａｐｒ．１５；１８（８）：１４７１－８１参照）。筋強直性ジストロフィ（ＤＭ）は、極めて広範囲の臨床的特徴をもたらすので、遺伝学者に特に
注目されている。現在ＤＭ１型（ＤＭ１）と呼ばれるＤＭの古典的形態は、サイトゾルプロテインキナーゼをコードする遺伝子、ＤＭＰＫの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内のＣＴＧリピートの拡大によって引き起こされる。本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、ＤＭ１骨格筋、心臓、又は脳内の過剰発現されたＲＮＡ又は毒性ＲＮＡ、例えば、ＤＭＰＫ遺伝子、又はミス調節されたあらゆる選択的スプライシングを標的とすることができる。
また、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムは、種々の疾患、例えば、プラダー・ウィリ症候群、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、及び先天性角化不全症を引き起こすＲＮＡ依存性機能に影響を与えるトランス作用変異を標的とすることができる。本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて処置することができる疾患のリストが、Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｃｅｌｌ，１３６．４（２００９）：７７７－７９３、及び国際公開第２０１６／２０５７６４ Ａ１号パンフレットに要約されており、これらは双方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。当業者であれば、新しいＣＲＩＳＰＲシステムを如何に用いてこれらの疾患を処置するかを理解するであろう。
また、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを、例えば、一次性タウオパシー及び二次性タウオパシー、例えば原発性年齢関連タウオパシー（ＰＡＲＴ）／神経原線維錯綜（ＮＦＴ）－優位型老人性痴呆症（アルツハイマー病（ＡＤ）で見られるものに類似するが、斑のないＮＦＴ）、ボクサー認知症（慢性外傷性脳症）、及び進行性核上性麻痺が挙げられる種々のタウオパシーの処置に用いることができる。タウオパシーの有用なリスト、及びこれらの疾患を処置する方法が、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレットに記載されており、この出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
また、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、スプライシング欠損及び疾患を引き起こし得る、シス作用スプライシングコードを破壊する変異を標的とすることができる。これらの疾患の例として、ＳＭＮ１遺伝子の欠失に由来する運動ニューロン退行性疾患（例えば脊髄性筋萎縮症）、デュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）、前頭側頭骨認知症、１７番染色体に関連するパーキンソン症候群（ＦＴＤＰ－１７）、及び嚢胞性線維症が挙げられる。
本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムはさらに、特にＲＮＡウイルスに対する、抗ウイルス活性に用いることができる。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ウイルスＲＮＡ配列を標的とするように選択された適切なガイドＲＮＡを用いて、ウイルスＲＮＡを標的とすることができる。
また、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、対象（例えばヒト対象）において癌を処置することができる。例えば、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、異常であり（例えば、点変異を含むか、又は代わりにスプライスされている）、且つ癌細胞内に見出されるＲＮＡ分子を標的とするｃｒＲＮＡでプログラムして、癌細胞において（例えばアポトーシスを介して）細胞死を誘導することができる。
また、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、対象（例えばヒト対象）において自己免疫疾患又は障害を処置することができる。例えば、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、異常であり（例えば、点変異を含むか、又は代わりにスプライスされている）、且つ自己免疫疾患又は障害を引き起こすことを担う細胞内に見出されるＲＮＡ分子を標的とするｃｒＲＮＡでプログラムすることができる。
さらに、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、対象において感染症を処置することもできる。例えば、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、感染性因子（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫、又は原虫）によって発現されるＲＮＡ分子を標的とするｃｒＲＮＡでプログラムして、感染性因子細胞を標的として、感染性因子細胞において細胞死を誘導することができる。また、ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、細胞内感染性因子が宿主対象の細胞に感染している疾患を処置し得る。感染性因子遺伝子によってコードされるＲＮＡ分子を標的とするようにＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質をプログラムすることによって、感染性因子に感染した細胞を標的として、細胞死を誘導することができる。
さらに、インビトロＲＮＡ検知アッセイを用いて、特定のＲＮＡ基質を検出することができる。ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を、生細胞におけるＲＮＡベースの検知に用いることができる。用途の例として、例えば疾患特異的ＲＮＡの検知による診断法がある。
本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムの治療的用途の詳細な説明を、例えば、米国特許第８，７９５，９６５号明細書、ＥＰ３００９５１１号明細書、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット、及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレットにおいて見出すことができ、これらは各々、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
細胞及びその後代
特定の実施形態において、本発明の方法を用いて、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを細胞中に導入して、細胞及び／又はその後代に、１つ以上の細胞生成物、例えば、抗体、デンプン、エタノール、又は他の所望のあらゆる生成物の生成を改変させることができる。そのような細胞及びその後代は、本発明の範囲内である。
特定の実施形態において、本明細書中に記載される方法及び／又はＣＲＩＳＰＲシステムは、細胞の１つ以上のＲＮＡ産物の翻訳及び／又は転写の修飾に至る。例えば、修飾は、ＲＮＡ産物の転写／翻訳／発現の増大に至り得る。他の実施形態において、修飾は、ＲＮＡ産物の転写／翻訳／発現の低下に至り得る。
特定の実施形態において、細胞は原核細胞である。
特定の実施形態において、細胞は、真核細胞、例えば、ヒト細胞（一次ヒト細胞又は確立されたヒト細胞株）が挙げられる哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、細胞は、非ヒト哺乳動物細胞、例えば、非ヒト霊長類（例えばサル）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、齧歯類（例えば、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターその他）由来の細胞である。特定の実施形態において、細胞は、魚類（例えばサケ）、鳥類（例えば、雛、カモ、ガチョウが挙げられる飼鳥類）、爬虫類、甲殻類（例えば、カキ、ハマグリ、ロブスター、エビ）、昆虫、蠕虫、酵母その他由来である。特定の実施形態において、細胞は、植物、例えば単子葉植物又は双子葉植物由来である。特定の実施形態において、植物は、食物作物、例えば、オオムギ、キャッサバ、ワタ、ラッカセイ又はピーナッツ、トウモロコシ、キビ、アブラヤシ果実、ジャガイモ、豆類、ナタネ又はキャノーラ、イネ、ライムギ、モロコシ、ダイズ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、及びコムギである。特定の実施形態において、植物は禾穀類（オオムギ、トウモロコシ、キビ、イネ、ライムギ、モロコシ、及びコムギ）である。特定の実施形態において、植物は塊茎（キャッサバ及びジャガイモ）である。特定の実施形態において、植物は糖作物（テンサイ及びサトウキビ）である。特定の実施形態において、植物は油含有作物（ダイズ、ラッカセイ又はピーナッツ、ナタネ又はキャノーラ、ヒマワリ、及びアブラヤシ果実）である。特定の実施形態において、植物は繊維作物（ワタ）である。特定の実施形態において、植物は、
樹木（モモ若しくはネクタリン樹木、リンゴ若しくは西洋ナシ樹木、ナット樹木、例えば、アーモンド、クルミ、若しくはピスタチオ樹木、又は柑橘類樹木、例えば、オレンジ、グレープフルーツ、若しくはレモン樹木等）、イネ科植物、野菜、果実、又は藻類である。特定の実施形態において、植物は、ナス科植物；アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属植物；アキノノゲシ（Ｌａｃｔｕｃａ）属植物；ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ）属植物；トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）属植物；ワタ、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、ストロベリー、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココアその他である。
関連する態様は、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いる本発明の方法によって修飾された細胞又はその後代を提供する。
特定の実施形態において、細胞は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボ修飾されている。
特定の実施形態において、細胞は幹細胞である。
７．送達
本開示及び当該技術における知識により、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステム、又は本明細書中に記載されるそのあらゆる構成要素（Ｃａｓタンパク質、その誘導体、機能断片、又は種々の融合体若しくは付加物、及びガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ）、その核酸分子、及び／又はその構成要素をコードしているか、若しくは提供する核酸分子は、当該技術における適切なあらゆる手段を用いて、ベクター、例えばプラスミドベクター及びウイルス送達ベクター等の種々の送達システムによって送達することができる。そのような方法として、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、形質移入、超音波処理、遺伝子銃その他が挙げられる（これらに限定されない）。
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及び／又はあらゆるＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）及び／又は付属タンパク質は、適切なベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルスベクター、及び他のウイルスベクター、又はそれらの組合せを用いて送達することができる。タンパク質及び１つ以上のｃｒＲＮＡを、１つ以上のベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクター中にパッケージすることができる。細菌の利用について、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素のいずれかをコードする核酸は、ファージを用いて細菌に送達することができる。例示的なファージとして、Ｔ４ファージ、Ｍｕ、λファージ、Ｔ５ファージ、Ｔ７ファージ、Ｔ３ファージ、Φ２９、Ｍ１３、ＭＳ２、Ｑβ、及びΦＸ１７４が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、ベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクターは、例えば、筋肉内注射、静脈内投与、経皮投与、鼻腔内投与、経口投与、又は粘膜投与によって、注目する組織に送達される。そのような送達は、単回用量又は複数回用量のいずれを介してもよい。当業者であれば、本明細書中の送達されることとなる実際の投薬量は、種々の要因、例えば、ベクターの選択、標的細胞、生物、組織、処置されることとなる対象の全身状態、求められる形質転換／修飾の程度、投与経路、投与モード、求められる形質転換／修飾のタイプその他に応じて大きく変わり得ることを理解する。
特定の実施形態において、送達は、アデノウイルスを介し、これは、少なくとも１×１０５粒子（粒子単位ｐｕとも称される）のアデノウイルスを含有する単回用量にてなされ
得る。一部の実施形態において、用量は好ましくは、少なくとも約１×１０６粒子、少なくとも約１×１０７粒子、少なくとも約１×１０８粒子、少なくとも約１×１０９粒子のアデノウイルスである。送達方法及び用量は、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４
Ａ１号パンフレット及び米国特許第８，４５４，９７２ Ｂ２号明細書に記載されており、これらは双方とも、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、送達はプラスミドを介する。投薬量は、応答を誘発するのに十分なプラスミド数であり得る。場合によっては、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの適切な量が、約０．１～約２ｍｇであり得る。プラスミドは、通常、（ｉ）プロモータ；（ｉｉ）各々がプロモータ（例えば、同じプロモータ又は異なるプロモータ）に作動可能に連結されている、核酸－標的化ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及び／又は付属タンパク質をコードする配列；（ｉｉｉ）選択マーカー；（ｉｖ）複製起点；並びに（ｖ）（ｉｉ）の下流側に、（ｉｉ）と作動可能に連結されている転写ターミネータを含むこととなる。また、プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ構成要素をコードし得るが、これらの１つ以上が、その代わりとして、異なるベクター上にコードされていてもよい。投与の頻度は、医学実務者若しくは獣医学実務者（例えば、医師、獣医）、又は当業者の範囲内である。
別の実施形態において、送達は、リポソーム又はリポフェクション製剤等を介し、当業者に知られている方法によって調製され得る。そのような方法が、例えば、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット、並びに米国特許第５，５９３，９７２号明細書；米国特許第５，５８９，４６６号明細書；及び米国特許第５，５８０，８５９号明細書に記載されており、これらは各々、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態において、送達は、ナノ粒子又はエキソソームを介する。例えば、エキソソームは、送達ＲＮＡに特に有用であることが示されている。
新しいＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の構成要素を細胞に導入するさらなる手段は、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を用いることによるものである。一部の実施形態において、細胞膜透過ペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質に連結されている。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及び／又はガイドＲＮＡは、１つ以上のＣＰＰに連結されて、細胞（例えば植物プロトプラスト）の内側に効果的に運搬される。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質及び／又はガイドＲＮＡは、細胞送達用の１つ以上のＣＰＰに連結されている１つ以上の環状又は非環状のＤＮＡ分子によってコードされている。
ＣＰＰは、受容体から独立して細胞膜を越えて生体分子を運搬することができるタンパク質又はキメラ配列のいずれかに由来する３５個未満のアミノ酸の短いペプチドである。ＣＰＰは、陽イオンペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリンリッチ配列及び抗微生物配列を有するペプチド、並びにキメラペプチド又は二部に分かれたペプチドであり得る。ＣＰＰの例として、Ｔａｔ（ＨＩＶ １型によるウイルス複製に必要とされる核転写活性化タンパク質である）、ペネトラチン、カポジ線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナルペプチド配列、インテグリンβ３シグナルペプチド配列、ポリアルギニンペプチドＡｒｇ配列、グアニンリッチ－分子トランスポータ、及びスイートアローペプチドが挙げられる。ＣＰＰ及びこれを用いる方法が、例えば、Ｈａｅｌｌｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ
ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１５；１３２４：３９－５８；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ
ｂｙ ｃｅｌｌ－ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ”，Ｇｅ
ｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２０１４ Ｊｕｎｅ；２４（６）：１０２０－７；及び国際公開第２０１６２０５７６４ Ａ１号パンフレットに記載されており、これらは各々、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
また、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムの種々の送達方法が、例えば、米国特許第８，７９５，９６５号明細書、ＥＰ ３００９５１１号明細書、国際公開第２０１６２０５７６４号パンフレット、及び国際公開第２０１７０７０６０５号パンフレットに記載されており、これらは各々、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
８．キット
本発明の別の態様は、本明細書中に記載される対象ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、例えばＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆタンパク質、それらの誘導体、機能断片、又は種々の融合体若しくは付加物、ガイドＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ、それらの複合体、これらを包含するベクター、或いはこれらを包含する宿主のいずれか２つ以上の構成要素を含むキットを提供する。
特定の実施形態において、キットはさらに、その中に包含される構成要素の使用説明書、及び／又は他の場所で入手可能な追加的な構成要素と組み合わせるための説明書を含む。
特定の実施形態において、キットはさらに、１つ以上のヌクレオチド、例えば、ベクター中にガイドＲＮＡコード配列を挿入するのに有用であり、且つベクターの１つ以上の制御要素に、コード配列を作動可能に連結するものに相当するヌクレオチドを含む。
特定の実施形態において、キットはさらに、構成要素のいずれかを溶解させ、且つ／又は構成要素の１つ以上に適した反応条件を提供するのに用いられ得る１つ以上のバッファを含む。そのようなバッファは、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ、トリス、ＭＯＰ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＮａＢの１つ以上、又はそれらの組合せを含んでもよい。特定の実施形態において、反応条件は、適切なｐＨ、例えば塩基性のｐＨを含む。特定の実施形態において、ｐＨは７～１０である。
特定の実施形態において、キット構成要素のいずれか１つ以上が、適切なコンテナ内に貯蔵されていてもよい。
実施例１ 新規のＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆシステムの同定
コンピュータパイプラインを用いて、ゲノム源及びメタゲノム源からクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの拡張データベースを生成した。ゲノム配列及びメタゲノム配列を、ＮＣＢＩ（Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、ＮＣＢＩ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＷＧＳ）、及びＤＯＥ ＪＧＩ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅｓ（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２）からダウンロードした。タンパク質を、少なくとも５ｋｂ長の全てのコンティグで予測して（ａｎｏｎモードのＰｒｏｄｉｇａｌ（Ｈｙａｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０））、重複排除して（すなわち、同一のタンパク質配列を除去する）、完全なタンパク質データベースを構築した。６００残基よりも大きなタンパク質を、ラージタンパク質（ＬＰ）とみなした。現在同定されているＣａｓ１３タンパク質は、大部分が、９００残基サイズよりも大きいので、算出の複雑性を減らすために、ラージタンパク質のみをさらに考慮した。
ＣＲＩＳＰＲアレイを、全てのデフォルトパラメータを用いるＰｉｌｅｒ－ＣＲ（Ｅｄ
ｇａｒ，ＰＩＬＥＲ－ＣＲ：Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ｒｅｐｅａｔｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８：１８，２００７）を用いて同定した。ＣＲＩＳＰＲアレイから±１０ｋｂ以内に位置決めされた非重複ラージタンパク質配列コードＯＲＦを、ＣＲＩＳＰＲ近位ラージタンパク質コードクラスターに分類して、コードされたＬＰを、Ｃａｓ－ＬＰと定義した。
最初に、ＢＬＡＳＰを用いて、Ｃａｓ－ＬＰ間のペアワイズアラインメントを実行して、Ｅｖａｌｕｅ＜１Ｅ－１０によるＢＬＡＳＴＰアラインメント結果を得た。続いて、ＭＣＬを用いて、ＢＬＡＳＴＰ結果に基づいてＣａｓ－ＬＰをさらにクラスター化して、Ｃａｓタンパク質のファミリーを生じさせた。
次に、ＢＬＡＳＴＰを用いて、Ｃａｓ－ＬＰを全てのＬＰに対してアラインして、Ｅｖａｌｕｅ＜１Ｅ－１０によるＢＬＡＳＰアラインメント結果を得た。Ｃａｓ－ＬＰファミリーを、ＢＬＡＳＴＰアラインメント結果に従ってさらに拡張した。拡張後に二倍増以下のＣａｓ－ＬＰファミリーを、さらなる分析のために得た。
候補Ｃａｓタンパク質の機能特性評価のために、タンパク質ファミリーデータベースＰｆａｍ（Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、ＮＲデータベース、及びＮＣＢＩにおけるＣａｓタンパク質を用いて、候補Ｃａｓタンパク質に注釈を付けた。続いて、多重配列アラインメントを、ＭＡＦＦＴ（Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｓｔａｎｄｌｅｙ，２０１３）を用いて、候補Ｃａｓエフェクタータンパク質毎に行った。続いて、ＪＰｒｅｄ及びＨＨｐｒｅｄを用いて、これらのタンパク質内の保存領域を分析して、２つの保存ＲＸＸＸＸＨモチーフを有する候補Ｃａｓタンパク質／ファミリーを同定した。
この分析により、以前に同定された全てのクラス２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと異なる２つの新しいＣａｓ１３ファミリーに入る７つの新規のＣａｓ１３エフェクタータンパク質の同定に至った。これらとして、新しいＣａｓ１３ｅファミリーのＣａｓ１３ｅ．１（配列番号１）及びＣａｓ１３ｅ．２（配列番号２）、並びに新しいＣａｓ１３ｆファミリーのＣａｓ１３ｆ．１（配列番号３）、Ｃａｓ１３ｆ．２（配列番号４）、Ｃａｓ１３ｆ．３（配列番号５）、Ｃａｓ１３ｆ．４（配列番号６）、及びＣａｓ１３ｆ．５（配列番号７）が挙げられる。
各プレｃｒＲＮＡ配列内の対応するダイレクトリピート（ＤＲ）配列をコードするＤＮＡは、それぞれ配列番号８～１４である。
ＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴＧＡＴＴＡＣＡＧＣ（配列番号８）
ＧＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＣＣＧＡＴＴＴＧＡＧＡＧＧＴＧＡＴＴＡＣＡＧＣ（配列番号９）
ＧＣＴＧＴＧＡＴＡＧＡＣＣＴＣＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＴＡＡＣＡＧＣ（配列番号１０）
ＧＣＴＧＴＧＡＴＡＧＡＣＣＴＣＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＴＡＡＣＡＧＣ（配列番号１１）
ＧＣＴＧＴＧＡＴＡＧＡＣＣＴＣＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＴＡＡＣＡＧＣ（配列番号１２）
ＧＣＴＧＴＧＡＴＧＧＧＣＣＴＣＡＡＴＴＴＧＴＧＧＧＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＣ（配列番号１３）
ＧＣＴＧＴＧＡＴＡＧＧＣＣＴＣＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴＡＧＴＡＡＣＡＧＣ（配列番号１４）
Ｃａｓ１３ｅ．１、Ｃａｓ１３ｅ．２、Ｃａｓ１３ｆ．１、Ｃａｓ１３ｆ．２、Ｃａｓ１３ｆ．３、Ｃａｓ１３ｆ．４、及びＣａｓ１３ｆ．５タンパク質の天然の（野生型）ＤＮＡコード配列は、それぞれ配列番号１５～２１である。
さらなる機能実験のために生成した７つのＣａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆタンパク質（すなわち、Ｃａｓ１３ｅ．１、Ｃａｓ１３ｅ．２、Ｃａｓ１３ｆ．１、Ｃａｓ１３ｆ．２、Ｃａｓ１３ｆ．３、Ｃａｓ１３ｆ．４、及びＣａｓ１３ｆ．５）のヒトコドン最適化コード配列は、それぞれ配列番号２２～２８である。
７つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆ遺伝子座構造を図１に示した。
プレｃｒＲＮＡ内の７つのＤＲ配列のＲＮＡ二次構造のさらなる分析を、ＲＮＡｆｏｌｄを用いて行った。結果を図２に示す。全てが、非常に保存された二次構造を共有したことが明らかである。
例えば、Ｃａｓ１３ｅファミリーにおいて、各ＤＲ配列は、４塩基対ステム（５’－ＧＣＵＧ－３’）に続く、５＋５ヌクレオチド（４ステムヌクレオチドを除外する）の対称形のバルジ、さらにこれに続く５塩基対ステム（５’－ＧＣＣ Ｃ／Ｕ Ｃ－３’）、及び末端の８塩基ループ（５’－ＣＧＡＵＵＵＧＵ－３’、２ステムヌクレオチドを除外する）からなる二次構造を形成する。
同様に、Ｃａｓ１３ｆファミリー（１つの例外がある（Ｃａｓ１３ｆ．４））において
、各ＤＲ配列は、５塩基対ステム（５’－ＧＣＵＧＵ３’）に続く、５＋４ヌクレオチド（４ステムヌクレオチドを除外する）のほぼ対称形のバルジ、さらにこれに続く６塩基対ステム（５’Ａ／Ｇ ＣＣＵＣＧ３’）、及び末端の５塩基ループ（５’ＡＵＵＵＧ３’、２ステムヌクレオチドを除外する）からなる二次構造を形成する。唯一の例外は、第２の工程が１塩基対短く、且つさらなる２塩基が第１のバルジに加えられて、大部分は対称形の６＋５バルジを形成している、Ｃａｓ１３ｆ．４のＤＲである。
ＭＡＦＦＴを用いた、Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆタンパク質、並びに以前に同定されたＣａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、及びＣａｓ１３ｄファミリータンパク質のマルチシーケンスアラインメントは、Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆタンパク質が系統樹上でＣａｓ１３ｂタンパク質に比較的最も近いことを明らかにした（図３）。
さらに、Ｃａｓタンパク質のＮ末端及びＣ末端に対するＲＸＸＸＸＨモチーフの位置に関して、Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆタンパク質、並びに比較的程度は低いがＣａｓ１３ｂタンパク質は、ＲＸＸＸＸＨモチーフが、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｃ、及びＣａｓ１３ｄと比較して、Ｎ末端及びＣ末端により近い（図４参照）。
続いて、Ｉ－ＴＡＳＳＥＲを用いて、Ｃａｓ１３ｅタンパク質の３Ｄ構造を予測してから、ＰｙＭＯＬを用い予測した構造を視覚化した。２つのＲＸＸＸＸＨモチーフは、Ｃａｓ１３ｅ．１のＮ末端及びＣ末端に非常に近く位置決めされているが、３Ｄ構造において非常に近い（図５）。
実施例２ Ｃａｓ１３ｅはエフェクターＲＮａｓｅである
新たに同定したＣａｓ１３ｅタンパク質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて機能する有効なＲＮａｓｅであることを確認するために、Ｃａｓ１３ｅ．１コード配列を、ヒト発現のためにコドン最適化して（配列番号２２）、ＧＦＰ遺伝子を有する第１のプラスミド中にクローニングした。一方、リポーター遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ）ｍＲＮＡを標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のコード配列を、ＧＦＰ遺伝子を有する第２のプラスミド中にクローニングした。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ１３ｅ．１用の２つのダイレクトリピート配列が側面に位置するスペーサーコード領域からなる（配列番号２９）。ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙリポーター遺伝子の配列は、それぞれ、配列番号３０～３１である。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２４－ウェル組織培養プレート内で標準的なプロトコールに従って培養して、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００及びＰ３０００（商標）試薬を用いる三重プラスミド形質移入に用いて、Ｃａｓ１３ｅ．１タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ－標的化ｇＲＮＡ、及びｍＣｈｅｒｒｙコード配列をそれぞれコードする３つのプラスミドを導入した。ネガティブ対照実験では、ｍＣｈｅｒｒｙ－標的化ｇＲＮＡをコードするプラスミドを用いる代わりに、非標的－ｇＲＮＡをコードする対照プラスミドを用いた。ＧＦＰコード配列は、Ｃａｓ１３ｅ．１及びｇＲＮＡプラスミド内に存在するので、ＧＦＰの発現を、形質移入の成功／効率についての内部対照として用いることができる。図６の概略図参照。続いて、形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５％ＣＯ２下で３７℃にて約２４時間インキュベートしてから、細胞を蛍光顕微鏡下で試験した。
図７に示すように、ｍＣｈｅｒｒｙ－標的化ｇＲＮＡで形質移入した細胞、及び対照非標的化（ＮＴ）ｇＲＮＡで形質移入した細胞は、明視野顕微鏡において、成長及び形態学が等しく、そして双方におけるＧＦＰ発現は、大部分が等しかった。しかしながら、ｍＣｈｅｒｒｙ発現由来のＲＦＰシグナルは、フローサイトメトリー分析に基づいて、最大７５％激減した（図８）。このことは、Ｃａｓ１３ｅが、ｍＣｈｅｒｒｙ－標的化ｇＲＮＡを利用して、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡレベル、及び結果的にｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現を効率的にノックダウンすることができることを示唆している。
実施例３ Ｃａｓ１３ｅについてのｓｇＲＮＡの有効な方向
Ｃａｓ１３ｅシステムは理論的に、ＤＲ＋スペーサー（５’ＤＲ）又はスペーサー＋ＤＲ（３’ＤＲ）のいずれかの向きを利用し得るので、どちらがＣａｓ１３ｅによって利用される正確な向きであるのかを判定するために、本実験を設計した。
実施例２と類似した三重形質移入実験設定を用いて、３’ＤＲの向き（スペーサー＋ＤＲ）だけが有意なｍＣｈｅｒｒｙノックダウンを支持することが見出された。このことは、Ｃａｓ１３ｅが、スペーサーの３’末端にてＤＲ配列を有するｃｒＲＮＡを利用することを実証した。図９参照。
ＤＲ＋スペーサー（５’ＤＲ）及びスペーサー＋ＤＲ（３’ＤＲ）のＳｇＲＮＡは、それぞれ配列番号３２及び３３である。
ＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴＧＡＴＴＡＣＡＧＣＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＧＣＧＴＣＧＧＡＡＧＡＣＣＴ（配列番号３２）
ＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＧＣＧＴＣＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧＧＴＧＡＴＴＡＣＡＧＣ（配列番号３３）
実施例４ Ｃａｓ１３ｅ．１の特異的活性及びコラテラル活性に及ぼすスペーサー配列長の影響
Ｃａｓ１３ｅ．１の特異的活性及びコラテラル活性に及ぼすスペーサー配列長の影響を研究するために、スペーサー配列長が２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、又は５０ｎｔの、ｍＣｈｅｒｒｙリポーター遺伝子を標的とする一セットのｓｇＲＮＡを設計した（配列番号３４～４０）。
ＴＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣ（配列番号３４）
ＴＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＴ（配列番号３５）
ＴＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧ（配列番号３６）
ＴＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣ（配列番号３７）
ＴＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＧＣＣＧＴ（配列番号３８）
ＴＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＧＣＣＧＴＣＣＴＧＣ（配列番号３９）
ＴＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣＧＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡ（配列番号４０）
実施例２と類似した三重形質移入実験設定を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰ遺伝子のノックダウン効率を、フローサイトメトリーによって分析した。
ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰノックダウン実験の結果は、それぞれＣａｓ１３ｅ．１の特異的活性及び非特異的活性（コラテラル活性）を示した。Ｃａｓ１３ｅ．１は、高い特異的活性を有し、スペーサー長が約３０ｎｔ～約５０ｎｔであることが見出された。図１０参照。一方、Ｃａｓ１３ｅ．１は、スペーサー長が約３０ｎｔである場合に最も高い非特異的活性を有する。図１１参照。
実施例５ ｄＣａｓ１３ｅ．１－ＡＤＡＲ２ＤＤ融合を用いた単一塩基ＲＮＡ編集
Ｃａｓ１３ｅをＲＮＡ単一塩基編集に用いることができるかを試験するために、２つのＲＸＸＸＸＨモチーフを変異させてＲＮａｓｅ活性を排除することによって、ｄＣａｓ１３ｅ．１を生成した。続いて、Ｅ４８８Ｑ及びＴ３７５Ｇの二重変異を有する高フィデリティＡＤＡＲ２ＤＤミュータントを、ｄＣａｓ１３ｅ．１（のＣ末端）に融合させて、推定のＡからＧへの単一塩基ＲＮＡエディタを生じさせて、ｄＣａｓ１３ｅ．１－ＡＤＡＲ２ＤＤと命名した。配列番号４１内のコード配列参照。
推定のＲＮＡ塩基－エディタの標的として用いるために、ＲＮＡ塩基エディタによってＡからＧに補正することなく機能ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質が生成されないように、野生型ｍＣｈｅｒｒｙコード配列を変異させて、早期終止コドンＴＡＧ（配列番号４２内の太字の二重下線を引いた配列参照）を生じさせた。図１２及び図１４参照。続いて、所望のＡからＧへの編集を生じさせるようにｇＲＮＡを設計して（図１２及び図１４）、ｄＣａｓ１３ｅ．１－ＡＤＡＲ２ＤＤ塩基エディタをコードするＣＸ５３０プラスミド、ｓｇＲＮＡをコードするＣＸ５３７／Ｃｘ５３８プラスミド、及び変異したｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子をコードするＣＸ３３７プラスミドを、標準的なプロトコールを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に三重形質移入した。形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５％ＣＯ２下で３７℃にて２４時間インキュベートしてから、細胞をフローサイトメトリーにかけて、補正されたｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを有し、且つｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を発現する細胞を
単離した。図１２の解説用図面参照。フローサイトメトリー分析の結果を図１３に示した。
ｇＲＮＡ－１（配列番号４３）及びｇＲＮＡ－２（配列番号４４）は双方とも、ＴＡＧ早期終止コドンを首尾よく補正して、機能ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を生成することは明らかである。
実施例６ 短ｄＣａｓ１３ｅ．１－ＡＤＡＲ２ＤＤ融合体を用いた単一塩基ＲＮＡ編集
ＲＮＡ単一塩基編集に用いることができるｄＣａｓ１３ｅ．１の最小サイズを判定するために、各々がＣ末端由来の３０未満の残基を有する、ｄＣａｓ１３ｅ．１の漸進的に大きくなるＣ末端欠失を発現する一連の５つの構築体を生成した（すなわち、３０－、６０－、９０－、１２０－、及び１５０－残基の欠失）。結果として生じた構築体を用いて、各Ｃ末端にて高フィデリティａｄａｒ２（ＡＤＡＲ２ＤＤ）と融合するｄＣａｓ１３ｅ．１のコード配列を生じさせた。これらの構築体を、実施例４と類似した実験に用いるＶｙｓｚ１５（「Ｖ１５」）～Ｖｙｓｚ－１９（「Ｖ１９」）プラスミド（図１５）中にクローニングした。これらの全ての構築体において、融合タンパク質を、ＣＭＶプロモータ（ｐＣＭＶ）、及びイントロンの直ぐ下流側にある、タンパク質発現をさらに増強するエンハンサー（ｅＣＭＶ）から発現させた。２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を、融合体のｄＣａｓ１３ｅ．１部分のＮ末端及びＣ末端に配置して、ＡＤＡＲ２ドメイン（例えばＡＤＡＲ２ＤＤ）を、ＮＬＳリンカーを介してＣ末端ＮＬＳに融合させて、ＨＡ－タグによってＣ末端にタグ付けした。ＥＦＳプロモータ（ｐＥＦＳ）の独立制御下のＥＧＦＰコード配列が、全てのプラスミドのポリＡ付加配列の下流側に存在した。
興味深いことに、漸進性Ｃ末端欠失は、絶え間なく、融合エディタ内のＲＮＡ塩基編集活性を、１５０Ｃ末端残基欠失（Ｖ１９内）を有するエディタが最も高い塩基編集活性を示すように増大させることが見出された。図１６参照。しかしながら、Ｃ末端からの１８０－残基の欠失は、塩基編集活性を無効にしたように見えた。このことは、Ｃａｓ１３ｅ．１のＣ末端からの最大の／最適な欠失は、１５０～１８０残基でありそうであることを示唆している。
この発見に基づいて、一連のＮ末端欠失ミュータントを、１５０Ｃ末端残基欠失を有するｄＣａｓ１３ｅ．１について生成した。３０－、６０－、９０－、１２０－、１５０－、１８０－、及び２１０－残基欠失をそれぞれ有するそのような７つのＮ末端欠失ミュータントを生成した。図１７参照。図１８の結果は、最良のＲＮＡ編集活性が、１８０Ｎ末端残基欠失及び１５０Ｃ末端残基欠失、すなわち７７５－残基Ｃａｓ１３ｅ．１タンパク質からの合計３３０－残基欠失（ＡＤＡＲ２ＤＤ融合体を生成するのに最適な４４５－残
基ｄＣａｓ１３ｅ．１を生成）を有するミュータントにおいて観察されることを示した。
実施例７ 様々なＣａｓ１３タンパク質を用いた哺乳動物内因性ｍＲＮＡノックダウン効率比較
この実験は、Ｃａｓ１３ｅ及びＣａｓ１３ｆタンパク質、とりわけＣａｓ１３ｆ．１が、以前に同定されたＣａｓ１３タンパク質よりも十分に、哺乳動物内因性標的ｍＲＮＡをノックダウンするのに非常に有効であることを実証した。
具体的に、各々がＣａｓ１３タンパク質、すなわち、Ｃａｓ１３ｅ．１（配列番号２２）、Ｃａｓ１３ｆ．１（配列番号２３）、ＬｗａＣａｓ１３ａ（配列番号４５）、ＰｓｐＣａｓ１３ｂ（配列番号４６）、及びＲｘＣａｓ１３ｄ（配列番号４７）の１つを発現する、５つのプラスミドを構築した。また、各プラスミドは、ｍＣｈｅｒｒｙリポーター遺伝子、及び２つの本来のＤＲ配列が側面に位置する各Ｃａｓ１３タンパク質のｓｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡコード配列をコードした。これらのｓｇＲＮＡは、ＡＮＸＡ４ ｍＲＮＡを標的とするスペーサー配列を有するように設計した。配列番号４８～５０参照。ネガティブ対照として、各々がＡＮＸＡ４－標的化ｓｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡの代わりに非標的化ｓｇＲＮＡ／ｃｒＲＮＡをコードする、５つの追加的なプラスミドを構築した（「対照ＮＴ構築体」）。図１９参照。
５つのＣａｓ１３／ｓｇＲＮＡ－コードプラスミドを、実施例４のように、ＨＥＫ２９３細胞中に形質移入した。２４時間培養した後に、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞を、フローサイトメトリーによって単離して、ＡＮＸＡ４ ｍＲＮＡの発現を、ＲＴ－ＰＣＲを用いて判定して、Ｃａｓ１３／ＮＴ－コードプラスミドによって形質移入した対照細胞と比較して、ノックダウン効率を評価した。
図２０は、Ｃａｓ１３ｂのみＡＮＸＡ４ ｍＲＮＡノックダウンがぎりぎり（ｍａｒｇｉｎａｌ）である一方、Ｃａｓ１３ｅ．１、Ｃａｓ１３ｆ．１、及びＣａｓ１３ｄが各々、ノックダウンが標的ＡＮＸＡ４ ｍＲＮＡの８０％超であることを示した。とりわけ、Ｃａｓ１３ｅ．１は、最もロバストなノックダウン効率を有するようであった。
特定の実施形態において、キット構成要素のいずれか１つ以上が、適切なコンテナ内に貯蔵されていてもよい。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができるスペーサー配列、及び前記スペーサー配列に対して３’側にダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含むＲＮＡガイド配列；並びに
（２）配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）、又は前記Ｃａｓの誘導体若しくは機能断片
を含む、クラスター化規則的間隔短パリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ複合体であって；
前記Ｃａｓ、前記Ｃａｓの前記誘導体及び前記機能断片は、（ｉ）前記ＲＮＡガイド配列に結合すること、且つ（ｉｉ）前記標的ＲＮＡを標的とすることができるが、
前記スペーサー配列は、前記複合体が配列番号１～７のいずれか１つの前記Ｃａｓを含む場合に、天然に存在するバクテリオファージ核酸と１００％相補的でないことを条件とする、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様２］
前記ＤＲ配列は、配列番号８～１４のいずれか１つの二次構造と実質的に同じ二次構造を有する、態様１に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様３］
前記ＤＲ配列は、配列番号８～１４のいずれか１つによってコードされている、態様１に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様４］
前記標的ＲＮＡは、真核生物ＤＮＡによってコードされている、態様１～３のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様５］
前記真核生物ＤＮＡは、非ヒト哺乳動物ＤＮＡ、非ヒト霊長類ＤＮＡ、ヒトＤＮＡ、植物ＤＮＡ、昆虫ＤＮＡ、鳥類ＤＮＡ、爬虫類ＤＮＡ、齧歯類ＤＮＡ、魚類ＤＮＡ、蠕虫／線虫ＤＮＡ、酵母ＤＮＡである、態様４に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様６］
前記標的ＲＮＡはｍＲＮＡである、態様１～５のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様７］
前記スペーサー配列は、１５～６０ヌクレオチド、２５～５０ヌクレオチド、又は約３０ヌクレオチドである、態様１～６のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様８］
前記スペーサー配列は、前記標的ＲＮＡと９０～１００％相補的である、態様１～７のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様９］
前記誘導体は、配列番号１～７のいずれか１つの、１つ以上の残基の保存的アミノ酸置換を含む、態様１～８のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様１０］
前記誘導体は、保存的アミノ酸置換のみを含む、態様９に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様１１］
前記誘導体は、ＨＥＰＮドメイン又はＲＸＸＸＸＨモチーフ内に、配列番号１～７のいずれか１つの野生型Ｃａｓと同一の配列を有する、態様１～１０のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様１２］
前記誘導体は、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする前記ＲＮＡガイド配列に結合することができるが、前記ＣａｓのＲＮａｓｅ触媒部位内の変異に起因して、ＲＮａｓｅ触媒活性を有していない、態様１～９のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様１３］
前記誘導体は、２１０残基以下のＮ末端欠失及び／又は１８０残基以下のＣ末端欠失を有する、態様１２に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様１４］
前記誘導体は、約１８０残基のＮ末端欠失及び／又は約１５０残基のＣ末端欠失を有する、態様１３に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様１５］
前記誘導体はさらに、ＲＮＡ塩基－編集ドメインを含む、態様１２～１４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様１６］
前記ＲＮＡ塩基－編集ドメインは、アデノシンデアミナーゼ、例えば二本鎖ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２）；アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素；ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｉｋｅ（ＡＰＯＢＥＣ）；又は活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である、態様１５に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様１７］
前記ＡＤＡＲ２は、Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ｇ二重変異を有するか、又はＡＤＡＲ２ＤＤである、態様１６に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様１８］
前記塩基－編集ドメインはさらに、ＲＮＡ結合ドメイン、例えばＭＳ２に融合する、態様１５～１７のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様１９］
前記誘導体はさらに、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＲＮＡデメチラーゼ、ＲＮＡスプライシング修飾子、局在化因子、又は翻訳修飾因子を含む、態様１２～１４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様２０］
前記Ｃａｓ、前記誘導体、又は前記機能断片は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列又は核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む、態様１～１９のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様２１］
前記標的ＲＮＡの標的化は、前記標的ＲＮＡの修飾をもたらす、態様１～２０のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様２２］
前記標的ＲＮＡの前記修飾は、前記標的ＲＮＡの切断である、態様２１に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様２３］
前記標的ＲＮＡの前記修飾は、アデノシン（Ａ）の、イノシン（Ｉ）への脱アミノ化である、態様２１に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様２４］
前記スペーサー配列にハイブリダイズすることができる配列を含む標的ＲＮＡをさらに含む、態様１～２３のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
［態様２５］
（１）態様１～２４のいずれか一項に記載のＣａｓ、その誘導体、又はその機能断片、及び（２）異種機能ドメインを含む融合タンパク質。
［態様２６］
前記異種機能ドメインは：核局在化シグナル（ＮＬＳ）、リポータータンパク質若しくは検出標識（例えば、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）、局在化シグナル、タンパク質標的化部分、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＢＰ、Ｌｅｘ Ａ ＤＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＢＤ）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘその他）、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＶＰＲ）、転写阻害ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ部分又はＳＩＤ部分）、ヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）、脱アミノ化ドメイン（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ、又はＴＡＤ）、メチラーゼ、デメチラーゼ、転写放出因子、ＨＤＡＣ、ｓｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｓｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ＤＮＡ若しくはＲＮＡリガーゼ、又はそれらのあらゆる組合せを含む、態様２５に記載の融合タンパク質。
［態様２７］
前記異種機能ドメインは、前記融合タンパク質内で、Ｎ末端に、Ｃ末端に、又は内部に融合している、態様２５又は２６に記載の融合タンパク質。
［態様２８］
（２）異種機能部分にコンジュゲートした、（１）態様１～２４のいずれか一項に記載のＣａｓ、その誘導体、又はその機能断片を含むコンジュゲート。
［態様２９］
前記異種機能部分は：核局在化シグナル（ＮＬＳ）、リポータータンパク質若しくは検出標識（例えば、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）、局在化シグナル、タンパク質標的化部分、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＢＰ、Ｌｅｘ Ａ ＤＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＢＤ）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘその他）、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＶＰＲ）、転写阻害ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ部分又はＳＩＤ部分）、ヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）、脱アミノ化ドメイン（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ、又はＴＡＤ）、メチラーゼ、デメチラーゼ、転写放出因子、ＨＤＡＣ、ｓｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｓｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ＤＮＡ若しくはＲＮＡリガーゼ、又はそれらのあらゆる組合せを含む、態様２８に記載のコンジュゲート。
［態様３０］
前記異種機能部分は、前記Ｃａｓ、前記その誘導体、又は前記その機能断片に対して、Ｎ末端に、Ｃ末端に、又は内部にコンジュゲートされている、態様２８又は２９に記載のコンジュゲート。
［態様３１］
配列番号１５～２１のいずれでもないことを条件とする、配列番号１～７のいずれか１つをコードするポリヌクレオチド、又はその誘導体、若しくはその機能断片、若しくはその融合タンパク質。
［態様３２］
細胞内での発現のためにコドン最適化されている、態様３１に記載のポリヌクレオチド。
［態様３３］
前記細胞は真核細胞である、態様３２に記載のポリヌクレオチド。
［態様３４］
配列番号８～１４のいずれか１つの誘導体を含む、天然に存在しないポリヌクレオチドであって、前記誘導体は、（ｉ）配列番号８～１４のいずれか１つと比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個）のヌクレオチドの付加、欠失、若しくは置換を有し；（ｉｉ）配列番号８～１４のいずれか１つに対して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９７％の配列同一性を有し；（ｉｉｉ）配列番号８～１４のいずれか１つ、若しくは（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし；又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの相補体であるが、前記誘導体は、配列番号８～１４のいずれでもないこと、及び前記誘導体は、配列番号８～１４によってコードされるＲＮＡのいずれかと実質的に同じ二次構造を維持しているＲＮＡをコードする（又はＲＮＡである）ことを条件とする、天然に存在しないポリヌクレオチド。
［態様３５］
前記誘導体は、態様１～２４のいずれか一項に記載のＣａｓ、その誘導体、又はその機能断片のいずれか１つのＤＲ配列として機能する、態様３４に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
［態様３６］
態様３１～３５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［態様３７］
前記ポリヌクレオチドは、プロモータ、及び場合によってはエンハンサーに作動可能に連結されている、態様３６に記載のベクター。
［態様３８］
前記プロモータは、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、ユビキタスプロモータ、又は組織特異的プロモータである、態様３７に記載のベクター。
［態様３９］
プラスミドである、態様３６～３８のいずれか一項に記載のベクター。
［態様４０］
レトロウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ＡＡＶベクター、又はレンチウイルスベクターである、態様３６～３８のいずれか一項に記載のベクター。
［態様４１］
前記ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ１３の組換えＡＡＶベクターである、態様４０に記載のベクター。
［態様４２］
（１）送達ビヒクル、及び（２）態様１～２４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体、態様２５～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、態様２８～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、態様３１～３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は態様３６～４１のいずれか一項に記載のベクターを含む送達システム。
［態様４３］
前記送達ビヒクルは、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃である、態様４２に記載の送達システム。
［態様４４］
態様１～２４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体、態様２５～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、態様２８～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、態様３１～３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は態様３６～４１のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞又はその後代。
［態様４５］
真核細胞（例えば、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、又は植物細胞）、又は原核細胞（例えば細菌細胞）である、態様４４に記載の細胞又はその後代。
［態様４６］
態様４４又は４５に記載の細胞を含む非ヒト多細胞真核生物。
［態様４７］
ヒト遺伝的障害のための動物（例えば、齧歯類又は霊長類）モデルである、態様４６に記載の非ヒト多細胞真核生物。
［態様４８］
標的ＲＮＡを修飾する方法であって、前記標的ＲＮＡを、態様１～２４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体と接触させることを含み、前記スペーサー配列は、前記標的ＲＮＡの少なくとも１５ヌクレオチドと相補的であり；前記Ｃａｓ、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記ＲＮＡガイド配列と結合して、前記複合体を形成し；前記複合体は、前記標的ＲＮＡに結合し；前記標的ＲＮＡへの前記複合体の結合により、前記Ｃａｓ、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記標的ＲＮＡを修飾する、方法。
［態様４９］
前記標的ＲＮＡは、前記Ｃａｓによる切断によって修飾される、態様４８に記載の方法。
［態様５０］
前記標的ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼを含む誘導体による脱アミノ化によって修飾される、態様４８に記載の方法。
［態様５１］
前記標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又は核ＲＮＡである、態様４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
［態様５２］
前記標的ＲＮＡへの前記複合体の結合により、前記Ｃａｓ、前記誘導体、及び前記機能断片は、実質的な（又は検出可能な）コラテラルＲＮａｓｅ活性を示さない、態様４８～５１のいずれか一項に記載の方法。
［態様５３］
前記標的ＲＮＡは、細胞内にある、態様４８～５２のいずれか一項に記載の方法。
［態様５４］
前記細胞は癌細胞である、態様５３に記載の方法。
［態様５５］
前記細胞に、感染性因子が感染する、態様５３に記載の方法。
［態様５６］
前記感染性因子は、ウイルス、プリオン、原虫、真菌、又は寄生虫である、態様５５に記載の方法。
［態様５７］
前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、配列番号１～７のいずれか１つをコードする第１のポリヌクレオチド、又はその誘導体若しくは機能断片、並びに配列番号８～１４のいずれか１つ、及び前記標的ＲＮＡに結合することができるスペーサーＲＮＡをコードする配列を含む第２のポリヌクレオチドによってコードされており、前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは、前記細胞中に導入される、態様５３～５６のいずれか一項に記載の方法。
［態様５８］
前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは、同じベクターによって前記細胞中に導入される、態様５７に記載の方法。
［態様５９］
（ｉ）細胞の老化のインビトロ又はインビボ誘導；（ｉｉ）インビトロ又はインビボ細胞周期停止；（ｉｉｉ）インビトロ若しくはインビボ細胞増殖阻害及び／又は細胞増殖阻害；（ｉｖ）アネルギーのインビトロ又はインビトロ誘導；（ｖ）アポトーシスのインビトロ又はインビトロ誘導；及び（ｖｉ）壊死のインビトロ又はインビトロ誘導の１つ以上を引き起こす、態様５３～５８のいずれか一項に記載の方法。
［態様６０］
容体又は疾患の処置が必要な対象において容体又は疾患を処置する方法であって、前記対象に、態様１～２４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体、又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含み；前記スペーサー配列は、前記容体又は疾患と関連する標的ＲＮＡの少なくとも１５ヌクレオチドと相補的であり；前記Ｃａｓ、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記ＲＮＡガイド配列と結合して前記複合体を形成し；前記複合体は、前記標的ＲＮＡに結合し；前記標的ＲＮＡへの前記複合体の結合により、前記Ｃａｓ、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記標的ＲＮＡを切断することによって、前記対象における前記容体又は疾患を処置する、方法。
［態様６１］
前記容体又は疾患は、癌又は感染症である、態様６０に記載の方法。
［態様６２］
前記癌は、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮体癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、髄様甲状腺癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又は膀胱癌である、態様６１に記載の方法。
［態様６３］
インビトロ方法、インビボ方法、又はエクスビボ方法である、態様６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
［態様６４］
態様４８～５９のいずれか一項に記載の方法によって得られる細胞又はその後代であって、天然に存在しない修飾（例えば、前記細胞／後代の転写されたＲＮＡ内の天然に存在しない修飾）を含む細胞及びその後代。
［態様６５］
標的ＲＮＡの存在を検出する方法であって、前記標的ＲＮＡを、態様２５～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は態様２８～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物と接触させることを含み、前記融合タンパク質又は前記コンジュゲートは、検出可能な標識（例えば、蛍光、ノーザンブロット、又はＦＩＳＨによって検出され得るもの）及び前記標的ＲＮＡに結合することができる合成スペーサー配列を含む、方法。
［態様６６］
クラスター化規則的間隔短パリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ複合体を含む真核細胞であって、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は：
（１）標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができるスペーサー配列、及び前記スペーサー配列に対して３’側にダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含むＲＮＡガイド配列；並びに
（２）配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）、又は前記Ｃａｓの誘導体若しくは機能断片を含み；
前記Ｃａｓ、前記Ｃａｓの前記誘導体及び前記機能断片は、（ｉ）前記ＲＮＡガイド配列に結合すること、且つ（ｉｉ）前記標的ＲＮＡを標的とすることができる、真核細胞。

Claims (66)

  1. （１）標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができるスペーサー配列、及び前記スペーサー配列に対して３’側にダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含むＲＮＡガイド配列；並びに
    （２）配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）、又は前記Ｃａｓの誘導体若しくは機能断片
    を含む、クラスター化規則的間隔短パリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ複合体であって；
    前記Ｃａｓ、前記Ｃａｓの前記誘導体及び前記機能断片は、（ｉ）前記ＲＮＡガイド配列に結合すること、且つ（ｉｉ）前記標的ＲＮＡを標的とすることができるが、
    前記スペーサー配列は、前記複合体が配列番号１～７のいずれか１つの前記Ｃａｓを含む場合に、天然に存在するバクテリオファージ核酸と１００％相補的でないことを条件とする、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  2. 前記ＤＲ配列は、配列番号８～１４のいずれか１つの二次構造と実質的に同じ二次構造を有する、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  3. 前記ＤＲ配列は、配列番号８～１４のいずれか１つによってコードされている、請求項１に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  4. 前記標的ＲＮＡは、真核生物ＤＮＡによってコードされている、請求項１～３のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  5. 前記真核生物ＤＮＡは、非ヒト哺乳動物ＤＮＡ、非ヒト霊長類ＤＮＡ、ヒトＤＮＡ、植物ＤＮＡ、昆虫ＤＮＡ、鳥類ＤＮＡ、爬虫類ＤＮＡ、齧歯類ＤＮＡ、魚類ＤＮＡ、蠕虫／線虫ＤＮＡ、酵母ＤＮＡである、請求項４に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  6. 前記標的ＲＮＡはｍＲＮＡである、請求項１～５のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  7. 前記スペーサー配列は、１５～６０ヌクレオチド、２５～５０ヌクレオチド、又は約３０ヌクレオチドである、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  8. 前記スペーサー配列は、前記標的ＲＮＡと９０～１００％相補的である、請求項１～７のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  9. 前記誘導体は、配列番号１～７のいずれか１つの、１つ以上の残基の保存的アミノ酸置換を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  10. 前記誘導体は、保存的アミノ酸置換のみを含む、請求項９に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  11. 前記誘導体は、ＨＥＰＮドメイン又はＲＸＸＸＸＨモチーフ内に、配列番号１～７のいずれか１つの野生型Ｃａｓと同一の配列を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  12. 前記誘導体は、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする前記ＲＮＡガイド配列に結合することができるが、前記ＣａｓのＲＮａｓｅ触媒部位内の変異に起因して、ＲＮａｓｅ触媒
    活性を有していない、請求項１～９のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  13. 前記誘導体は、２１０残基以下のＮ末端欠失及び／又は１８０残基以下のＣ末端欠失を有する、請求項１２に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  14. 前記誘導体は、約１８０残基のＮ末端欠失及び／又は約１５０残基のＣ末端欠失を有する、請求項１３に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  15. 前記誘導体はさらに、ＲＮＡ塩基－編集ドメインを含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  16. 前記ＲＮＡ塩基－編集ドメインは、アデノシンデアミナーゼ、例えば二本鎖ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２）；アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素；ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ－ｌｉｋｅ（ＡＰＯＢＥＣ）；又は活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である、請求項１５に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  17. 前記ＡＤＡＲ２は、Ｅ４８８Ｑ／Ｔ３７５Ｇ二重変異を有するか、又はＡＤＡＲ２ＤＤである、請求項１６に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  18. 前記塩基－編集ドメインはさらに、ＲＮＡ結合ドメイン、例えばＭＳ２に融合する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  19. 前記誘導体はさらに、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＲＮＡデメチラーゼ、ＲＮＡスプライシング修飾子、局在化因子、又は翻訳修飾因子を含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  20. 前記Ｃａｓ、前記誘導体、又は前記機能断片は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列又は核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  21. 前記標的ＲＮＡの標的化は、前記標的ＲＮＡの修飾をもたらす、請求項１～２０のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  22. 前記標的ＲＮＡの前記修飾は、前記標的ＲＮＡの切断である、請求項２１に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  23. 前記標的ＲＮＡの前記修飾は、アデノシン（Ａ）の、イノシン（Ｉ）への脱アミノ化である、請求項２１に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  24. 前記スペーサー配列にハイブリダイズすることができる配列を含む標的ＲＮＡをさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。
  25. （１）請求項１～２４のいずれか一項に記載のＣａｓ、その誘導体、又はその機能断片、及び（２）異種機能ドメインを含む融合タンパク質。
  26. 前記異種機能ドメインは：核局在化シグナル（ＮＬＳ）、リポータータンパク質若しくは検出標識（例えば、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）、局在化シグナル、タンパク質標的化部分、ＤＮＡ結合ドメイン（
    例えば、ＭＢＰ、Ｌｅｘ Ａ ＤＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＢＤ）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘその他）、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＶＰＲ）、転写阻害ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ部分又はＳＩＤ部分）、ヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）、脱アミノ化ドメイン（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ、又はＴＡＤ）、メチラーゼ、デメチラーゼ、転写放出因子、ＨＤＡＣ、ｓｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｓｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ＤＮＡ若しくはＲＮＡリガーゼ、又はそれらのあらゆる組合せを含む、請求項２５に記載の融合タンパク質。
  27. 前記異種機能ドメインは、前記融合タンパク質内で、Ｎ末端に、Ｃ末端に、又は内部に融合している、請求項２５又は２６に記載の融合タンパク質。
  28. （２）異種機能部分にコンジュゲートした、（１）請求項１～２４のいずれか一項に記載のＣａｓ、その誘導体、又はその機能断片を含むコンジュゲート。
  29. 前記異種機能部分は：核局在化シグナル（ＮＬＳ）、リポータータンパク質若しくは検出標識（例えば、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）、局在化シグナル、タンパク質標的化部分、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＢＰ、Ｌｅｘ Ａ ＤＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＢＤ）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘその他）、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＶＰＲ）、転写阻害ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ部分又はＳＩＤ部分）、ヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）、脱アミノ化ドメイン（例えば、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、ＡＰＯＢＥＣ、ＡＩＤ、又はＴＡＤ）、メチラーゼ、デメチラーゼ、転写放出因子、ＨＤＡＣ、ｓｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＲＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｓｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ｄｓＤＮＡ切断活性を有するポリペプチド、ＤＮＡ若しくはＲＮＡリガーゼ、又はそれらのあらゆる組合せを含む、請求項２８に記載のコンジュゲート。
  30. 前記異種機能部分は、前記Ｃａｓ、前記その誘導体、又は前記その機能断片に対して、Ｎ末端に、Ｃ末端に、又は内部にコンジュゲートされている、請求項２８又は２９に記載のコンジュゲート。
  31. 配列番号１５～２１のいずれでもないことを条件とする、配列番号１～７のいずれか１つをコードするポリヌクレオチド、又はその誘導体、若しくはその機能断片、若しくはその融合タンパク質。
  32. 細胞内での発現のためにコドン最適化されている、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
  33. 前記細胞は真核細胞である、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
  34. 配列番号８～１４のいずれか１つの誘導体を含む、天然に存在しないポリヌクレオチドであって、前記誘導体は、（ｉ）配列番号８～１４のいずれか１つと比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個）のヌクレオチドの付加、欠失、若しくは置換を有し；（ｉｉ）配列番号８～１４のいずれか１つに対して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９７％の配列同一性を有し；（ｉｉｉ）配列番号８～１４のいずれか１つ、若しくは（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし；又は（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの相補体であるが、前記誘導体は、配列番号８～
    １４のいずれでもないこと、及び前記誘導体は、配列番号８～１４によってコードされるＲＮＡのいずれかと実質的に同じ二次構造を維持しているＲＮＡをコードする（又はＲＮＡである）ことを条件とする、天然に存在しないポリヌクレオチド。
  35. 前記誘導体は、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＣａｓ、その誘導体、又はその機能断片のいずれか１つのＤＲ配列として機能する、請求項３４に記載の天然に存在しないポリヌクレオチド。
  36. 請求項３１～３５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  37. 前記ポリヌクレオチドは、プロモータ、及び場合によってはエンハンサーに作動可能に連結されている、請求項３６に記載のベクター。
  38. 前記プロモータは、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、ユビキタスプロモータ、又は組織特異的プロモータである、請求項３７に記載のベクター。
  39. プラスミドである、請求項３６～３８のいずれか一項に記載のベクター。
  40. レトロウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ＡＡＶベクター、又はレンチウイルスベクターである、請求項３６～３８のいずれか一項に記載のベクター。
  41. 前記ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はＡＡＶ１３の組換えＡＡＶベクターである、請求項４０に記載のベクター。
  42. （１）送達ビヒクル、及び（２）請求項１～２４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２８～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３６～４１のいずれか一項に記載のベクターを含む送達システム。
  43. 前記送達ビヒクルは、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃である、請求項４２に記載の送達システム。
  44. 請求項１～２４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２８～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、又は請求項３６～４１のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞又はその後代。
  45. 真核細胞（例えば、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、又は植物細胞）、又は原核細胞（例えば細菌細胞）である、請求項４４に記載の細胞又はその後代。
  46. 請求項４４又は４５に記載の細胞を含む非ヒト多細胞真核生物。
  47. ヒト遺伝的障害のための動物（例えば、齧歯類又は霊長類）モデルである、請求項４６に記載の非ヒト多細胞真核生物。
  48. 標的ＲＮＡを修飾する方法であって、前記標的ＲＮＡを、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体と接触させることを含み、前記スペーサー配列は
    、前記標的ＲＮＡの少なくとも１５ヌクレオチドと相補的であり；前記Ｃａｓ、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記ＲＮＡガイド配列と結合して、前記複合体を形成し；前記複合体は、前記標的ＲＮＡに結合し；前記標的ＲＮＡへの前記複合体の結合により、前記Ｃａｓ、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記標的ＲＮＡを修飾する、方法。
  49. 前記標的ＲＮＡは、前記Ｃａｓによる切断によって修飾される、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記標的ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼを含む誘導体による脱アミノ化によって修飾される、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、又は核ＲＮＡである、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記標的ＲＮＡへの前記複合体の結合により、前記Ｃａｓ、前記誘導体、及び前記機能断片は、実質的な（又は検出可能な）コラテラルＲＮａｓｅ活性を示さない、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記標的ＲＮＡは、細胞内にある、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記細胞は癌細胞である、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記細胞に、感染性因子が感染する、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記感染性因子は、ウイルス、プリオン、原虫、真菌、又は寄生虫である、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は、配列番号１～７のいずれか１つをコードする第１のポリヌクレオチド、又はその誘導体若しくは機能断片、並びに配列番号８～１４のいずれか１つ、及び前記標的ＲＮＡに結合することができるスペーサーＲＮＡをコードする配列を含む第２のポリヌクレオチドによってコードされており、前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは、前記細胞中に導入される、請求項５３～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドは、同じベクターによって前記細胞中に導入される、請求項５７に記載の方法。
  59. （ｉ）細胞の老化のインビトロ又はインビボ誘導；（ｉｉ）インビトロ又はインビボ細胞周期停止；（ｉｉｉ）インビトロ若しくはインビボ細胞増殖阻害及び／又は細胞増殖阻害；（ｉｖ）アネルギーのインビトロ又はインビトロ誘導；（ｖ）アポトーシスのインビトロ又はインビトロ誘導；及び（ｖｉ）壊死のインビトロ又はインビトロ誘導の１つ以上を引き起こす、請求項５３～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 容体又は疾患の処置が必要な対象において容体又は疾患を処置する方法であって、前記対象に、請求項１～２４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体、又はこれをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含み；前記スペーサー配列は、前記容体又は疾患と関連する標的ＲＮＡの少なくとも１５ヌクレオチドと相補的であり；前記Ｃａｓ、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記ＲＮＡガイド配列と結合して前記複合体を形成し；前記複合体は、前記標的ＲＮＡに結合し；前記標的ＲＮＡへの前記複合体の結合により、前記Ｃａｓ、前記誘導体、又は前記機能断片は、前記標的ＲＮＡを切
    断することによって、前記対象における前記容体又は疾患を処置する、方法。
  61. 前記容体又は疾患は、癌又は感染症である、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記癌は、ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮体癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、髄様甲状腺癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、又は膀胱癌である、請求項６１に記載の方法。
  63. インビトロ方法、インビボ方法、又はエクスビボ方法である、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 請求項４８～５９のいずれか一項に記載の方法によって得られる細胞又はその後代であって、天然に存在しない修飾（例えば、前記細胞／後代の転写されたＲＮＡ内の天然に存在しない修飾）を含む細胞及び後代。
  65. 標的ＲＮＡの存在を検出する方法であって、前記標的ＲＮＡを、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は請求項２８～３０のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組成物と接触させることを含み、前記融合タンパク質又は前記コンジュゲートは、検出可能な標識（例えば、蛍光、ノーザンブロット、又はＦＩＳＨによって検出され得るもの）及び前記標的ＲＮＡに結合することができる合成スペーサー配列を含む、方法。
  66. クラスター化規則的間隔短パリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓ複合体を含む真核細胞であって、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体は：
    （１）標的ＲＮＡにハイブリダイズすることができるスペーサー配列、及び前記スペーサー配列に対して３’側にダイレクトリピート（ＤＲ）配列を含むＲＮＡガイド配列；並びに
    （２）配列番号１～７のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）、又は前記Ｃａｓの誘導体若しくは機能断片を含み；
    前記Ｃａｓ、前記Ｃａｓの前記誘導体及び前記機能断片は、（ｉ）前記ＲＮＡガイド配列に結合すること、且つ（ｉｉ）前記標的ＲＮＡを標的とすることができる、真核細胞。
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