JP2024070581A - Biomarkers for als testing and testing method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ＡＬＳ検査用バイオマーカーと、該バイオマーカーの定性又は定量に使用する抗体を用いた免疫的測定方法及びキットに関する。 The present invention relates to a biomarker for ALS testing and an immunoassay method and kit using an antibody for qualitative or quantitative analysis of the biomarker.
筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ＡＬＳ）とは、筋肉を動かしている脳や脊髄の神経（運動ニューロン）が障害され、脳から筋肉に指令が伝わらなくなることで手足や喉、舌の筋肉や呼吸筋が徐々にやせていき、呼吸筋が弱まると人工呼吸器を使用しなければ発症から２～５年で死に至ることが多いといわれている進行性・致死性の神経変性疾患である。この疾患の日本における患者数は約１万人とされ、中年以降に発症することがほとんどであり、現在においても発症原因は解明されていない難病の１つである。 Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive and fatal neurodegenerative disease in which the nerves (motor neurons) in the brain and spinal cord that control muscles are damaged, preventing the brain from transmitting commands to the muscles, causing the muscles of the limbs, throat, tongue, and respiratory muscles to gradually weaken, and if the respiratory muscles weaken, death often occurs within 2 to 5 years from onset unless an artificial ventilator is used. There are approximately 10,000 patients with this disease in Japan, and most cases occur after middle age. It is one of the incurable diseases whose cause has yet to be elucidated.
現在、ＡＬＳを根治させる治療法は見つかっていないが、早期の治療が生命予後を大きく左右することから、早期の診断が極めて重要であると考えられている。一般的なＡＬＳの診断は、臨床症状（痙縮、腱反射亢進、線維束性収縮、歩行障害、言語障害、嚥下障害、呼吸障害等）の有無、進行速度、運動機能に障害をきたす他の疾患の除外等を組み合わせて行われる。例えば、神経伝導検査、筋電図検査、筋生検、髄液検査等を適宜組み合わせて行われる。 Currently, no cure for ALS has been found, but early treatment has a significant impact on prognosis, so early diagnosis is considered extremely important. ALS is generally diagnosed by combining the presence or absence of clinical symptoms (spasticity, increased tendon reflexes, fasciculations, gait disturbance, speech disorder, swallowing disorder, respiratory disorder, etc.), the rate of progression, and the exclusion of other diseases that impair motor function. For example, nerve conduction tests, electromyography, muscle biopsy, cerebrospinal fluid tests, etc. are appropriately combined.
ところが、早期のＡＬＳは、運動機能に障害をきたす他の疾患と区別することが難しく、専門医であっても、上述のように複数の検査を組み合わせた診断を試みたときに高い精度で診断を行うことは難しい。そのため、ＡＬＳの疑いがある患者がなんらかの症状を自覚してからＡＬＳが確定診断されるまでに要する時間が長くなり、これによりＡＬＳに対して早期に治療を開始することが困難となるケースがある。更に、他の病気を除外するために一般的に行われている神経伝導検査、筋電図検査、筋生検、髄液検査は、侵襲性が高く、患者への負担が非常に大きい。
このような背景から、ＡＬＳの診断に有用なバイオマーカーの探索研究が幅広く行われ、数多くのバイオマーカー候補が報告（非特許文献１）されているが、患者への負担が少なく、ＡＬＳの診断に利用できる有用なバイオマーカーは見出せていないのが現状である。
However, it is difficult to distinguish early ALS from other diseases that impair motor function, and even specialists find it difficult to diagnose with high accuracy when attempting to combine multiple tests as described above. Therefore, it takes a long time for a patient suspected of ALS to be diagnosed with ALS after he or she becomes aware of some symptoms, which makes it difficult to start treatment for ALS early. Furthermore, nerve conduction tests, electromyography, muscle biopsy, and cerebrospinal fluid tests, which are commonly performed to exclude other diseases, are highly invasive and place a great burden on patients.
Given this background, research has been widely conducted to discover biomarkers useful for diagnosing ALS, and many biomarker candidates have been reported (Non-Patent Document 1). However, at present, no useful biomarkers that impose a low burden on patients and can be used to diagnose ALS have been found.
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、患者への負担が少なくかつＡＬＳの検査に有用なバイオマーカーを提供することを課題とする。また、本発明は、該バイオマーカーを用いたＡＬＳの検査方法を提供することを課題とする。さらに、本発明は、生体検体中に存在するタウ蛋白質を測定するための抗タウ蛋白質抗体を含む試薬を含むキットを提供することを課題とする。 The present invention has been made in view of these circumstances, and aims to provide a biomarker that is useful for testing for ALS while minimizing the burden on patients. Another aim of the present invention is to provide a method for testing for ALS using the biomarker. Furthermore, an aim of the present invention is to provide a kit that includes a reagent containing an anti-tau protein antibody for measuring tau protein present in a biological sample.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＡＬＳ患者の血液検体中に存在するタウ蛋白質の量が、コントロール検体と比較して有意に多いことを見出し、
本発明に想到した。
As a result of intensive research to solve the above problems, the present inventors have found that the amount of tau protein present in blood samples from ALS patients is significantly higher than that in control samples,
We have come up with the present invention.
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］タウ蛋白質を含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の血液検査用バイオマーカー。［２］前記タウ蛋白質が、配列番号１で表されるアミノ酸配列若しくはその一部と同一のアミノ酸配列、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上同一のアミノ酸配列若しくはその一部と同一のアミノ酸配列を有する、［１］に記載のバイオマーカー。
［３］前記検査が、ＡＬＳ鑑別診断のための検査である、［１］又は［２］に記載のバイオマーカー。
［４］生体から採取された血液検体について、［１］～［３］の何れかに記載のバイオマーカーを測定する工程を含む、ＡＬＳの検査方法。
［５］ＡＬＳの鑑別診断のために使用される、［４］に記載の方法。
［６］前記血液検体が、全血、血清又は血漿である、［４］又は［５］に記載の方法。
［７］前記バイオマーカーの測定が、免疫学的方法により行われる、［４］～［６］の何れかに記載の方法。
［８］前記免疫学的方法が、タウ蛋白質を認識する２種類の抗体の組み合わせを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法であって、
前記２種類の抗体の組み合わせが、
（１）タウ蛋白質を認識する第一抗体；及び
（２）タウ蛋白質を認識する第二抗体であって、該抗体は前記第一抗体とは異なる部分を認識する抗体であり、かつ前記第一抗体と組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行ったとき、非神経変性疾患患者の血液検体に対する反応性と比較して、ＡＬＳ患者の血液検体に対して１．５倍以上高い反応性を示す抗体
の組み合わせである、［８］に記載の方法。
［９］タウ蛋白質を認識する２種類の抗体の組み合わせを含む、ＡＬＳの血液検査用キットであって、
前記キットは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いられるものであり、
前記２種類の抗体の組み合わせが、
（１）タウ蛋白質を認識する第一抗体；及び
（２）タウ蛋白質を認識する第二抗体であって、該抗体は前記第一抗体とは異なる部分を認識する抗体であり、かつ前記第一抗体と組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行ったとき、非神経変性疾患患者の血液検体に対する反応性と比較して、ＡＬＳ患者の血液検体に対して１．５倍以上高い反応性を示す抗体
の組み合わせである、前記キット。
That is, the present invention is as follows.
[1] A biomarker for blood testing for amyotrophic lateral sclerosis (ALS), comprising tau protein. [2] The biomarker according to [1], wherein the tau protein has an amino acid sequence identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a part thereof, or an amino acid sequence that is 90% or more identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a part thereof.
[3] The biomarker described in [1] or [2], wherein the test is a test for differential diagnosis of ALS.
[4] A method for testing for ALS, comprising a step of measuring the biomarker according to any one of [1] to [3] for a blood sample collected from a living body.
[5] The method according to [4], used for the differential diagnosis of ALS.
[6] The method according to [4] or [5], wherein the blood sample is whole blood, serum or plasma.
[7] The method according to any one of [4] to [6], wherein the measurement of the biomarker is carried out by an immunological method.
[8] The immunological method is a sandwich ELISA method using a combination of two types of antibodies that recognize tau protein,
The combination of the two types of antibodies is
The method according to [8], comprising a combination of: (1) a first antibody that recognizes tau protein; and (2) a second antibody that recognizes tau protein, the second antibody recognizing a part of the tau protein different from that of the first antibody, and which, when combined with the first antibody in a sandwich ELISA, shows a reactivity that is 1.5 times or more higher with blood samples from ALS patients than with blood samples from patients without neurodegenerative diseases.
[9] A blood test kit for ALS, comprising a combination of two types of antibodies that recognize tau protein,
The kit is used for a sandwich ELISA method,
The combination of the two types of antibodies is
The kit comprises: (1) a first antibody that recognizes tau protein; and (2) a second antibody that recognizes tau protein, the second antibody recognizing a part of the tau protein different from that of the first antibody, and when combined with the first antibody in a sandwich ELISA assay, the second antibody shows a reactivity that is 1.5 times or more higher with blood samples from ALS patients than with blood samples from patients without neurodegenerative diseases.
本発明によれば、血液検体中のタウ蛋白質をバイオマーカーとして定性的又は定量的に測定することにより、ＡＬＳの検査が可能となる。また、本発明の方法は、全血、血清又は血漿を生体検体として免疫学的方法でタウ蛋白質の定性的又は定量的な測定を行うことから、従来の検査方法と比較して患者への負担を軽減することが出来る。 According to the present invention, it is possible to test for ALS by qualitatively or quantitatively measuring tau protein in a blood sample as a biomarker. Furthermore, the method of the present invention uses whole blood, serum, or plasma as a biological sample to perform qualitative or quantitative measurement of tau protein by an immunological method, which reduces the burden on patients compared to conventional testing methods.
以下、本発明の実施形態について説明する。以下に説明は単なる例示であり、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施することができる。 The following describes an embodiment of the present invention. The following description is merely an example, and the scope of the present invention is not limited to these descriptions. The present invention can be modified and implemented as appropriate without departing from the spirit of the present invention.
特に指定がない場合、本発明に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解される意味を有する。 Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used in the present invention have the meaning commonly understood by those skilled in the art to which the present invention belongs.
本発明において、複数の数値の範囲が示された場合、それらの複数の範囲の任意の下限値および上限値の組み合わせからなる範囲も同様に意味する。 In the present invention, when multiple numerical ranges are indicated, the same applies to any combination of the lower and upper limits of those multiple ranges.
＜バイオマーカー＞
本発明の一実施形態は、タウ蛋白質を含む、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の血液検査用バイオマーカーである。
<Biomarkers>
One embodiment of the present invention is a blood biomarker for amyotrophic lateral sclerosis (ALS), which comprises tau protein.
本実施形態において、タウ蛋白質は血液検査用バイオマーカーとして使用できる限り特に限定されず、血液中に存在する何れの存在様式のタウ蛋白質であってもよい。例えば、ヒトの血液中には末梢性タウ蛋白質（タウ蛋白質７５８；ビッグタウとも称される）、及び選択的スプライシングによって得られる分子量が異なる６種類のアイソフォーム、並びにそれらの断片化されたタウ蛋白質等が存在し、これらの１種類以上をバイオマーカーとして測定することができる。
選択的スプライシングによって得られる分子量が異なる６種類のアイソフォームは、Ｎ末端近傍領域におけるＮ１及びＮ２という２種類のインサート配列の種類（すなわち、Ｎ１及びＮ２が存在しない０Ｎ型；Ｎ１のみが存在する１Ｎ型；Ｎ１及びＮ２が存在する２Ｎ型）、並びに微小管結合領域におけるＲ１～Ｒ４という微小管結合ドメインの種類（すなわち、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４が存在する３Ｒ型；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が存在する４Ｒ型）の組み合わせに基づき表すことができる。具体的には、これらのアイソフォームは、２Ｎ４Ｒ型アイソフォーム（タウ蛋白質４４１とも称される）、１Ｎ４Ｒ型アイソフォーム（タウ蛋白質４１２とも称される）、０Ｎ４Ｒ型アイソフォーム（タウ蛋白質３８３とも称される）、２Ｎ３Ｒ型アイソフォーム（タウ蛋白質４１０とも称される）、１Ｎ３Ｒ型アイソフォーム（タウ蛋白質３８１とも称される）、０Ｎ３Ｒ型アイソフォーム（タウ蛋白質３５２とも称される）である。
断片化されたタウ蛋白質は、血液中に存在し、ＡＬＳの血液検査用バイオマーカーとして使用できる限り、Ｎ末端側及び／又はＣ末端側において任意の数のアミノ酸が切断されたことにより断片化されたものであってもよい。
また、タウ蛋白質は、任意のアミノ酸がリン酸化されたものであってもよい。
In this embodiment, the tau protein is not particularly limited as long as it can be used as a biomarker for blood testing, and may be any form of tau protein present in blood. For example, peripheral tau protein (tau protein 758; also called big tau), six types of isoforms with different molecular weights obtained by selective splicing, and fragmented tau proteins thereof exist in human blood, and one or more of these can be measured as a biomarker.
The six types of isoforms obtained by alternative splicing, which differ in molecular weight, can be represented based on the combination of two types of insert sequences, N1 and N2, in the N-terminal vicinity region (i.e., 0N type in which N1 and N2 are not present; 1N type in which only N1 is present; 2N type in which N1 and N2 are present), and types of microtubule-binding domains, R1 to R4, in the microtubule-binding region (i.e., 3R type in which R1, R3 and R4 are present; 4R type in which R1, R2, R3 and R4 are present). Specifically, these isoforms are 2N4R type isoform (also referred to as tau protein 441), 1N4R type isoform (also referred to as tau protein 412), 0N4R type isoform (also referred to as tau protein 383), 2N3R type isoform (also referred to as tau protein 410), 1N3R type isoform (also referred to as tau protein 381), and 0N3R type isoform (also referred to as tau protein 352).
As long as the fragmented tau protein is present in blood and can be used as a biomarker for a blood test for ALS, it may be fragmented by cleavage of any number of amino acids on the N-terminus and/or C-terminus.
Furthermore, the tau protein may be one in which any amino acid is phosphorylated.
タウ蛋白質は、例えば配列番号１で表されるアミノ酸配列若しくはその一部と同一のアミノ酸配列を有してよい。または、血液中に存在し、ＡＬＳの血液検査用バイオマーカーとして使用できる限り、配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上同一、好ましくは９５％以上同一、さらに好ましくは９８％以上同一のアミノ酸配列若しくはその一部と同一のアミノ酸配列を有してもよい。
配列番号１で表されるアミノ酸配列の一部と同一のアミノ酸配列とは、例えば、配列番
号１に含まれるアミノ酸のうち、Ｎ１、Ｎ２、Ｒ２から選択される少なくとも１つを表すアミノ酸配列を含まないが、他のアミノ酸配列が同一の配列のことであってもよく、また配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側において任意の数のアミノ酸が切断されたことにより断片化された配列であってもよい。
配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上同一、好ましくは９５％以上同一、さらに好ましくは９８％以上同一のアミノ酸配列とは、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列における任意の箇所において置換、欠失、挿入、又は付加がなされた配列のことである。
なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、例えば配列番号２で表される塩基配列によってコードされるものであってよい。
The tau protein may have, for example, an amino acid sequence identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part thereof. Alternatively, as long as it is present in blood and can be used as a biomarker for a blood test for ALS, it may have an amino acid sequence that is 90% or more identical, preferably 95% or more identical, and more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part thereof.
An amino acid sequence identical to a portion of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1 may refer to, for example, a sequence that does not include an amino acid sequence representing at least one selected from N1, N2, and R2 among the amino acids contained in SEQ ID NO:1, but has the same other amino acid sequence, or may be a sequence fragmented by truncating any number of amino acids on the N-terminal and/or C-terminal side of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
An amino acid sequence that is 90% or more identical, preferably 95% or more identical, and more preferably 98% or more identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, is, for example, a sequence in which a substitution, deletion, insertion, or addition has been made at any position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1 may be encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO:2, for example.
本実施形態において血液検査は、採取された血液検体中におけるタウ蛋白質の定性的又は定量的な測定を行うものであってよい。 In this embodiment, the blood test may involve qualitative or quantitative measurement of tau protein in a collected blood sample.
当該血液検査はＡＬＳの検査のために行われるものであってよい。ＡＬＳの検査を行うことができる限り特に限定されないが、例えば、当該血液検査によって、タウ蛋白質の存在を確認することができたとき、検査対象がＡＬＳを有すると判断してもよく、ＡＬＳを有する可能性があると判断してもよい。また、例えば、タウ蛋白質の定量的な測定結果に基づき、血液中のタウ蛋白質の濃度が、ＡＬＳを有しないコントロール検体における測定結果と比較して大きいとき、または血液中のタウ蛋白質の濃度が一定濃度以上（すなわち、カットオフ値以上）であるとき、検査対象がＡＬＳを有すると判断してもよく、ＡＬＳを有する可能性があると判断してもよい。カットオフ値は予め定めておいてもよく、検査ごとに定めてもよい。
なお、ＡＬＳの検査において、ＡＬＳを有しないコントロール検体とは、健常者検体であってもよく、非神経変性疾患を有する患者の検体であってもよく、またはＡＬＳ以外の疾患を有する患者の検体であってもよい。
The blood test may be performed for the purpose of testing for ALS. There is no particular limitation as long as the test for ALS can be performed, but for example, when the presence of tau protein can be confirmed by the blood test, the test subject may be judged to have ALS, or may be judged to have ALS. In addition, for example, based on the quantitative measurement result of tau protein, when the concentration of tau protein in blood is greater than the measurement result in a control specimen that does not have ALS, or when the concentration of tau protein in blood is equal to or greater than a certain concentration (i.e., equal to or greater than a cutoff value), the test subject may be judged to have ALS, or may be judged to have ALS. The cutoff value may be determined in advance, or may be determined for each test.
In addition, in the case of testing for ALS, the control sample not having ALS may be a sample from a healthy person, a sample from a patient with a non-neurodegenerative disease, or a sample from a patient with a disease other than ALS.
また、当該血液検査は、検査対象がＡＬＳを有すると、アルツハイマー病や多発性硬化症などの他の疾患と区別して鑑別診断するための検査であってよい。ＡＬＳの鑑別診断を行うことができる限り特に限定されないが、例えば、当該血液検査によって、タウ蛋白質の存在を確認することができたとき、検査対象がＡＬＳを有する鑑別診断することができる。タウ蛋白質の定量的な測定結果に基づき、血液中のタウ蛋白質の濃度が、ＡＬＳを有しないコントロール検体における測定結果と比較して大きいとき、または血液中のタウ蛋白質の濃度が一定濃度以上（すなわち、カットオフ値以上）であるとき、検査対象がＡＬＳを有する鑑別診断することができる。カットオフ値は予め定めておいてもよく、検査ごとに定めてもよい。
なお、ＡＬＳの鑑別診断において、ＡＬＳを有しないコントロール検体とは、健常者検体であってもよく、非神経変性疾患を有する患者の検体であってもよく、ＡＬＳ以外の疾患を有する患者の検体であってもよく、またはＡＬＳ以外の疾患であってＡＬＳと鑑別する必要がある疾患（例えば、アルツハイマー病や多発性硬化症など）を有する患者の検体であってもよいが、好ましくは、ＡＬＳ以外の疾患であってＡＬＳと鑑別する必要がある疾患を有する患者の検体である。
ＡＬＳの鑑別診断における、血液中のタウ蛋白質濃度のカットオフ値は、特に限定されないが、例えば、６０ｐｇ／ｍｌとしてもよく、７０ｐｇ／ｍｌとしてもよい。
ＡＬＳの鑑別診断は、任意の他の検査と組み合わせて行ってもよい。
In addition, the blood test may be a test for differentially diagnosing the test subject having ALS, by distinguishing it from other diseases such as Alzheimer's disease and multiple sclerosis. There is no particular limitation as long as it can perform differential diagnosis of ALS, but for example, when the presence of tau protein can be confirmed by the blood test, the test subject can be differentially diagnosed as having ALS. Based on the quantitative measurement result of tau protein, when the concentration of tau protein in blood is greater than the measurement result in a control sample that does not have ALS, or when the concentration of tau protein in blood is equal to or greater than a certain concentration (i.e., equal to or greater than a cutoff value), the test subject can be differentially diagnosed as having ALS. The cutoff value may be determined in advance or may be determined for each test.
In the differential diagnosis of ALS, a control sample not having ALS may be a sample from a healthy person, a sample from a patient with a non-neurodegenerative disease, a sample from a patient with a disease other than ALS, or a sample from a patient with a disease other than ALS that needs to be differentiated from ALS (e.g., Alzheimer's disease, multiple sclerosis, etc.), but is preferably a sample from a patient with a disease other than ALS that needs to be differentiated from ALS.
The cutoff value of the blood tau protein concentration in the differential diagnosis of ALS is not particularly limited, but may be, for example, 60 pg/ml or 70 pg/ml.
The differential diagnosis of ALS may be performed in combination with any other test.
本実施形態のバイオマーカーは、任意の他のバイオマーカーや検査と組み合わせて用いてもよい。 The biomarkers of this embodiment may be used in combination with any other biomarkers or tests.
＜バイオマーカーの定性的又は定量的な測定方法＞
本発明の他の実施形態は、生体から採取された血液検体について、上記＜バイオマーカー＞の項に記載したバイオマーカーの定性的又は定量的な測定方法である。当該測定方法はＡＬＳの鑑別診断のために使用されるものであってもよい。
<Qualitative or quantitative measurement method of biomarkers>
Another embodiment of the present invention is a method for qualitatively or quantitatively measuring a biomarker described above in the <Biomarkers> section in a blood sample taken from a living body, which may be used for the differential diagnosis of ALS.
本実施形態において、血液検体は、全血、血清又は血漿である。好ましくは血清又は血漿である。 In this embodiment, the blood sample is whole blood, serum, or plasma. Preferably, it is serum or plasma.
本実施形態において、バイオマーカーは定性的又は定量的に測定されるものであってよく、該測定は免疫学的方法により行われるものであってよい。 In this embodiment, the biomarker may be measured qualitatively or quantitatively, and the measurement may be performed by an immunological method.
免疫学的方法としては、特に限定されないが、例えば、標識として酵素を用いるＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着測定法）、ＥＩＡ法（酵素免疫測定法）、ＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法）、標識として化学発光性化合物を用いるＣＬＩＡ法（化学発光免疫測定法）、ＲＩＡ法（放射免疫測定）、ラテックス凝集法、イムノクロマトグラフィー法等が挙げられる。 Immunological methods include, but are not limited to, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), EIA (enzyme immunoassay), CLEIA (chemiluminescent enzyme immunoassay), which use an enzyme as a label, CLIA (chemiluminescent immunoassay), RIA (radioimmunoassay), which uses a chemiluminescent compound as a label, and the like.
免疫学的方法は、高感度な検出感度が期待されるサンドイッチＥＬＩＳＡ法が好適である。サンドイッチＥＬＩＳＡ法においては、固相化した捕捉用抗体で検出対象物質を捕捉し、それに標識物質を結合させた抗体（認識抗体）を反応させて、洗浄後、標識物質の種類に応じた検出を行う。固相としては、例えば、プラスチックプレート、磁性粒子やラテックス粒子などの粒子を用いることができる。捕捉用抗体は固相に直接固定しても、間接的に固定してもよい。間接的に固定する場合は、例えば、補足抗体に対する二次抗体を固相に固定し、二次抗体を介して補足抗体を間接的に固定することができる。補足抗体を間接的に固相化する物質としては、プロテインＧ、プロテインＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。また、捕捉抗体がビオチン化されている場合には、アビジン化した固相を利用することができる。 As an immunological method, a sandwich ELISA method is suitable, which is expected to have high detection sensitivity. In the sandwich ELISA method, the detection target substance is captured by a solid-phased capture antibody, and an antibody (recognition antibody) bound to a labeling substance is reacted with it, and after washing, detection according to the type of labeling substance is performed. For example, a plastic plate, magnetic particles, latex particles, or other particles can be used as the solid phase. The capture antibody may be directly or indirectly immobilized on the solid phase. When immobilizing indirectly, for example, a secondary antibody against the capture antibody can be immobilized on the solid phase, and the capture antibody can be indirectly immobilized via the secondary antibody. Examples of substances that indirectly immobilize the capture antibody include, but are not limited to, protein G, protein A, etc. In addition, when the capture antibody is biotinylated, an avidinized solid phase can be used.
タウ蛋白質の測定方法は、後述のタウ蛋白質を認識する抗体を用いて、従来の任意の免疫学的測定方法により行うことができる。より具体的には、後述のタウ蛋白質を認識するモノクローナル抗体を、被検試料と反応させることを特徴とする免疫学的測定方法により行うことができる。 The measurement of tau protein can be carried out by any conventional immunological measurement method using an antibody that recognizes tau protein, which will be described later. More specifically, the measurement can be carried out by an immunological measurement method characterized by reacting a monoclonal antibody that recognizes tau protein, which will be described later, with a test sample.
タウ蛋白質の測定方法は、基本的な構成として、被検試料と後述のタウ蛋白質を認識する抗体を接触させるステップ、及び、後述のタウ蛋白質を認識する抗体に結合したタウ蛋白質を測定するステップを備える。また、本実施形態の測定方法はｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで行われる。また、当該測定方法は定性的又は定量的に行われるものであってよい。 The method for measuring tau protein basically comprises the steps of contacting a test sample with an antibody that recognizes tau protein, as described below, and measuring the tau protein bound to the antibody that recognizes tau protein, as described below. The measurement method of this embodiment is performed in vitro or ex vivo. The measurement method may be performed qualitatively or quantitatively.
また、免疫学的方法としては、通常の競合法、サンドイッチ法によるＲＩＡ又はＥＩＡ等が挙げられる。これらの方法において、抗体を標識して用いることもできる。また、抗体を各種プラスチックウェル、各種プラスチックビーズ等の担体に固相化して用いてもよい。より具体的には、当該測定方法は、例えば、以下のステップを含む方法であってもよい。
（ａ）タウ蛋白質を認識する抗体と被検試料とを接触させるステップ。
（ｂ）前記抗体へ結合したタウ蛋白質を定性的又は定量的に測定するステップ。
（ｃ）測定されたタウ蛋白質量から、被検試料中のタウ蛋白質のレベルを算出し、被検試料中のタウ蛋白質の定性的又は定量的にレベルを決定するステップ。
In addition, examples of the immunological method include a typical competitive method, a sandwich method using RIA or EIA, etc. In these methods, the antibody may be labeled and used. In addition, the antibody may be immobilized on a carrier such as various plastic wells or various plastic beads. More specifically, the measurement method may include, for example, the following steps:
(a) contacting a test sample with an antibody that recognizes tau protein.
(b) qualitatively or quantitatively measuring the amount of tau protein bound to the antibody.
(c) calculating the level of tau protein in the test sample from the measured amount of tau protein, and determining the level of tau protein in the test sample qualitatively or quantitatively;
本実施形態のバイオマーカーの測定を定量的に行う場合、予め適宜既知の濃度に段階希釈された標準物質（例えば、精製したリコンビナントタウ蛋白質）を被検試料の検出と同
時又は別々に用いて検量線を作成し、当該検量線を基に被検試料中の測定値からタウ蛋白質の濃度を計算して求めることができる。
When the biomarker of this embodiment is quantitatively measured, a calibration curve can be prepared by using a standard substance (e.g., purified recombinant tau protein) that has been serially diluted to known concentrations in advance, either simultaneously with or separately from the detection of the test sample, and the concentration of tau protein can be calculated from the measured values in the test sample based on the calibration curve.
上記「（ａ）タウ蛋白質を認識する抗体と被検試料とを接触させるステップ」及び「（ｂ）前記抗体へ結合したタウ蛋白質を定性的又は定量的に測定するステップ」は、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で行うことができる。ＥＬＩＳＡ法で測定する場合には、ＥＬＩＳＡプレートに固相化した後述のタウ蛋白質を認識するモノクローナル抗体に、被検試料又は希釈した被検試料を接触させて反応させること、洗浄すること、更に、タウ蛋白質と結合可能な酵素標識した異なる抗タウ蛋白質モノクローナル抗体と接触させて反応させること、非結合抗体を洗浄により除去すること、当該抗体の標識（例えば、色素等）の存在、量又は強度（例えば、発色等）を測定すること（例えば、吸光度の測定等）、及び、被検試料中に存在するタウ蛋白質を計算することを含むことができる。これらの測定は、通常の免疫学的測定法と同様に０～４０℃のいずれの温度で行うこともできる。 The above-mentioned "(a) step of contacting the test sample with an antibody that recognizes tau protein" and "(b) step of qualitatively or quantitatively measuring the tau protein bound to the antibody" can be performed, for example, by a sandwich ELISA method. When performing measurement by the ELISA method, the method can include contacting the test sample or a diluted test sample with a monoclonal antibody that recognizes tau protein, which is described below and immobilized on an ELISA plate, to cause a reaction, washing, and further contacting the test sample with a different anti-tau protein monoclonal antibody that is enzyme-labeled and capable of binding to tau protein to cause a reaction, removing unbound antibody by washing, measuring the presence, amount or intensity (e.g., color development, etc.) of the label (e.g., dye, etc.) of the antibody (e.g., measuring absorbance, etc.), and calculating the amount of tau protein present in the test sample. These measurements can be performed at any temperature between 0 and 40°C, as in the case of conventional immunological measurements.
免疫学的方法において使用する抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ等の何れのアイソタイプであってもよい。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってよい。抗体の由来に関しては、例えば、マウス抗体、ラット抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等が挙げられる。抗体は、完全抗体であってもよく、断片抗体であってもよい。断片抗体としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆａｂ３、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、タンデムバイスペシフィック一本鎖Ｆｖ（ｓｃ（Ｆｖ）２）、一本鎖トリプルボディ、ナノボディ、ダイバレントＶＨＨ、ペンタバレントＶＨＨ、ミニボディ、ダイアボディ、タンデムダイアボディ、バイスペシフィックトリボディ、バイスペシフィックバイボディ、デュアルアフィニティリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド結合Ｆｖ、コンパクトＩｇＧ、重鎖抗体、又はそれらの重合体等が挙げられる。抗体の由来としては、例えば、マウス抗体、ラット抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等が挙げられる。 The antibody used in the immunological method may be of any isotype, such as IgG, IgM, etc. The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. The origin of the antibody may be, for example, a mouse antibody, a rat antibody, a chimeric antibody, a humanized antibody, a human antibody, etc. The antibody may be a complete antibody or a fragment antibody. Examples of antibody fragments include F(ab') 2 , Fab', Fab, Fv, Fab3 , single-chain Fv (hereinafter referred to as "scFv"), tandem bispecific single-chain Fv (sc(Fv) 2 ), single-chain triple body, nanobody, divalent VHH, pentavalent VHH, minibody, diabody, tandem diabody, bispecific tribody, bispecific bibody, dual affinity retargeting molecule (DART), triabody, tetrabody, disulfide-linked Fv, compact IgG, heavy chain antibody, or polymers thereof. Examples of the origin of the antibody include mouse antibody, rat antibody, chimeric antibody, humanized antibody, and human antibody.
モノクローナル抗体は、市販のものを用いてもよく、製造したものを用いてもよい。例えば、次の方法で製造することができる。
免疫原としては、ヒト生体試料より調整されたタウ蛋白質、リコンビナントタウ蛋白質、または、タウ蛋白質ペプチドフラグメント等が挙げられる。免疫に使用する動物としては特に限定されないが、例えば、マウス、ラット等を用いることができる。
動物への免疫方法は、一般的な手法に従って行うことができる。例えば、免疫原を通常の緩衝液や生理食塩水に懸濁させた懸濁液、またはさらにフロインド・コンプリート・アジュバンド等の補液と混合させた混合物を、動物の皮下、皮内、腹腔等に投与して刺激した後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う方法が挙げられる。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宜決定できるが、通常の投与量は、１回当たり１０μｇ～１ｍｇ程度である。
細胞融合に用いる免疫細胞は、最終免疫の３～４日後に摘出した脾臓細胞およびリンパ節細胞が好適である。また、前記免疫細胞と融合させる他方の親細胞としての骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）としては既に確立されている公知の各種細胞株、例えば、マウスにおけるＮＳ１（Ｐ３／ＮＳＩ／Ｉ－Ａｇ４４４４－１）〔Eur. J. Immunol. 6:511-519(1976)〕、ＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４〔Nature 276:269(1978)〕、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８．６５３〔J. Immunol. 123:1548(1979)〕、Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ８Ｕ．１〔Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81:1(1978)〕等や、ラットにおけるＹ３－Ａｇ１．２．３〔Nature 277:131-133(1979)〕、ＹＢ２／Ｏ（ＹＢ２／３ＨＬ／Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０)〔Methods Enzymol. 73B:1(1981)〕等が挙げられる。細胞融合には通常用いられるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を使用することができる。細胞融合は通常の方法と同様にすればよく、例えば免疫細胞は骨髄細胞に対して約１～１０倍で、ポリエチレングリコールは平均分子量１０００～６０００のものを３０～６０％の濃度で使用し、免疫細胞と骨髄細胞の混合ペレットに滴下し混ぜ合わせる方法が挙げられる。
ハイブリドーマの選択は、通常の選択培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン含む培地）を用いて行うことができる。ＨＡＴ培地で培養後、得られたハイブリドーマの培養上清を、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、免疫沈降法で検索し、タウ蛋白質に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。モノクローナル抗体を選択する方法としては、抗体を産生するハイブリドーマを通常の限界希釈法でクローン化後、例えば、次のような方法が挙げられる。
一次選択法として、ＥＬＩＳＡプレートに固相化したタウ蛋白質に培養上清を反応させる。次に、酵素標識二次抗体を反応させ、タウ蛋白質と反応する抗体を産生するクローン化抗体産生株を選択する。
二次選択法として、上記の方法で一次選択されたハイブリドーマから産生される抗体を使用して、一方の抗体を固相化抗体、他方の抗体にペルオキシダーゼを標識した標識抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法で抗体の反応性を評価する。例えば、ＡＬＳ患者の血漿と、健常者、非神経変性疾患患者又はＡＬＳ以外の疾患を有する患者の血漿を試料として、試料中に存在するタウ蛋白質に対する反応性を比較した時に、ＡＬＳ患者の血漿に対して高い反応性を示す抗体を産生するクローン化抗体産生株を選択する。
The monoclonal antibody may be commercially available or may be prepared by the following method, for example.
Examples of immunogens include tau protein prepared from a human biological sample, recombinant tau protein, tau protein peptide fragments, etc. Animals used for immunization are not particularly limited, and for example, mice, rats, etc. can be used.
Immunization of animals can be carried out according to a general method. For example, a suspension of an immunogen in a normal buffer solution or physiological saline, or a mixture of the immunogen and a supplement such as Freund's complete adjuvant, is administered subcutaneously, intradermally, or intraperitoneally to an animal to stimulate it, and the same procedure is repeated as necessary. The dose of the antigen can be appropriately determined depending on the administration route and the animal species, but the usual dose is about 10 μg to 1 mg per administration.
The immune cells used for cell fusion are preferably spleen cells and lymph node cells extracted 3 to 4 days after the final immunization. In addition, the myeloma cells as the other parent cells to be fused with the immune cells may be any of various cell lines already established and known, such as mouse NS1 (P3/NSI/I-Ag4444-1) [Eur. J. Immunol. 6:511-519(1976)], SP2/O-Ag14 [Nature 276:269(1978)], P3X63-Ag8.653 [J. Immunol. 123:1548(1979)], P3X63-Ag8U. Examples of such fusion agents include Y3-Ag1.2.3 in rats [Nature 277:131-133(1979)] and YB2/O (YB2/3HL/P2.G11.16Ag.20) [Methods Enzymol. 73B:1(1981)]. Polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), and other commonly used agents can be used for cell fusion. Cell fusion can be performed in the same manner as in the conventional methods, for example, by using about 1 to 10 times the amount of immune cells relative to bone marrow cells and polyethylene glycol with an average molecular weight of 1000 to 6000 at a concentration of 30 to 60%, which is dropped onto a pellet of the mixture of immune cells and bone marrow cells and mixed.
Hybridomas can be selected using a conventional selection medium, such as HAT medium (medium containing hypoxanthine, aminopterin, and thymidine). After culturing in HAT medium, the culture supernatant of the obtained hybridomas can be screened by, for example, ELISA, RIA, or immunoprecipitation to select hybridomas that produce antibodies that react with tau protein. As a method for selecting monoclonal antibodies, the hybridomas that produce the antibodies can be cloned by a conventional limiting dilution method, and then, for example, the following method can be used.
In the first selection method, the culture supernatant is reacted with tau protein immobilized on an ELISA plate, and then an enzyme-labeled secondary antibody is reacted to select a cloned antibody-producing strain that produces an antibody that reacts with tau protein.
As a secondary selection method, the reactivity of the antibodies produced from the hybridomas primarily selected by the above method is evaluated by a sandwich ELISA method using one antibody as a solid-phase antibody and the other antibody as a labeled antibody labeled with peroxidase. For example, when the plasma of an ALS patient is used as a sample and the plasma of a healthy person, a patient with a non-neurodegenerative disease, or a patient with a disease other than ALS is used as a sample, and the reactivity to tau protein present in the sample is compared, a cloned antibody-producing strain that produces an antibody that shows high reactivity to the plasma of an ALS patient is selected.
本実施形態の免疫学的方法に用いられる抗体は、標識物を結合させた抗体を使用することが出来る。標識物としては、抗体に結合させて検出できるものであれば特に制限はないが、例えば、３２Ｐ、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃ、トリチウム等の放射能標識；β－ガラクトオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素；フルオレセイン誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオフルバミル等）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミン、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン１１０等）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｃｙ－クロム、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、プロピジウムイオダイド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ－フィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）等の蛍光標識；ルシフェラーゼ等の生物発光標識；あるいは、ルミノール、イソルミノール、Ｎ－（４－アミノブチル）－Ｎ－エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体、Ｎ－メチルアクリジニウムエステル、Ｎ－メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体、ルシゲニン、アダマンチルジオキセタン、インドキシル誘導体、ルテニウム錯体等の化学発光標識；金コロイド等の金属；アビジン；ラテックス等が挙げられる。 The antibody used in the immunological method of this embodiment may be an antibody bound to a label. There are no particular limitations on the label as long as it can be bound to an antibody and detected, and examples of the label include radioactive labels such as 32P, 3H, 125I, 131I, 14C, and tritium; enzymes such as β-galactoxidase, peroxidase, alkaline phosphatase, glucoamylase, glucose oxidase, lactate oxidase, alcohol oxidase, monoamine oxidase, and horseradish peroxidase; coenzymes such as FAD, FMN, ATP, biotin, and heme; fluorescein derivatives (fluorescein isothiocyanate (FITC), fluorescein thiofulvamyl, and the like), rhodamine derivatives (tetramethylrhodamine, trimethylrhodamine (RITC), Texas Red, rhodamine 1 10, etc.), fluorescent labels such as Cy dyes (Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7), Cy-chrome, spectrum green, spectrum orange, propidium iodide, allophycocyanin (APC), R-phycoerythrin (R-PE), etc.; bioluminescent labels such as luciferase; or luminol derivatives such as luminol, isoluminol, N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminose ester, etc., acridinium derivatives such as N-methylacridinium ester, N-methylacridinium acylsulfonamide ester, etc., chemiluminescent labels such as lucigenin, adamantyl dioxetane, indoxyl derivatives, ruthenium complexes, etc.; metals such as gold colloid; avidin; latex, etc.
抗体への標識物の結合は、当分野において一般的な方法により行うことができる。例えば、タンパク質又はペプチドを蛍光標識する場合、タンパク質又はペプチドをリン酸緩衝液で洗浄した後、ＤＭＳＯ、緩衝液等で調整した色素を加え、混合した後室温で１０分間静置することにより結合させることができる。また、市販の標識キットとして、ビオチン標識キット（Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ｂｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、アルカリフォスファターゼ標識用キット（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、ペルオキシダーゼ標識キット（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、フィコビリプロテイン標識キット（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＳＨ、Ｂ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ
Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ｂ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＳＨ、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２、Ｒ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＳＨ：株式会社同仁化学研究所）、蛍光標識キット（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５５５ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ６４７ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２：株式会社同仁化学研究所）、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、ＤｙＬｉｇｈｔ６４７（テクノケミカル株式会社）、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）抗体標識キット、Ｑｄｏｔ（登録商標）抗体標識キット（インビトロゲン社）、ＥＺ－Ｌａｂｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（フナコシ株式会社）等を用いて標識することもできる。また、標識した抗体又はその断片の検出は、適宜標識に適した機器を使用することにより行うことができる。
The label can be bound to the antibody by a method generally used in the art. For example, when a protein or peptide is fluorescently labeled, the protein or peptide is washed with a phosphate buffer, and then a dye adjusted with DMSO, a buffer, or the like is added, mixed, and then allowed to stand at room temperature for 10 minutes to bind the protein or peptide. Commercially available labeling kits include biotin labeling kits (Biotin Labeling Kit-NH2, Biotin Labeling Kit-SH: Dojindo Laboratories, Ltd.), alkaline phosphatase labeling kits (Alkaline Phosphatase Labeling Kit-NH2, Alkaline Phosphatase Labeling Kit-SH: Dojindo Laboratories, Ltd.), peroxidase labeling kits (Peroxidase Labeling Kit-NH2, Peroxidase Labeling Kit-SH: Dojindo Laboratories, Ltd.), phycobiliprotein labeling kits (Allophycocyanin Labeling Kit-NH2, Allophycocyanin Labeling Kit-SH: Dojindo Laboratories, Ltd.), and cytochrome P450 labeling kits (Cat. No. 136111, Cat ... Kit-SH, B-Phycoerythrin Labeling
Kit-NH2, B-Phycoerythrin Labeling Kit-SH, R-Phycoerythrin Labeling Kit-NH2, R-Phycoerythrin Labeling Kit-SH: Dojindo Laboratories, Ltd.), fluorescent labeling kits (Fluorescein Labeling Kit-NH2, HiLyte Fluor (registered trademark) 555 Labeling Kit-NH2, HiLyte Fluor (registered trademark) 647 Labeling Kit-NH2: Dojindo Laboratories, Ltd.), DyLight547, DyLight647 (Techno Chemical Co., Ltd.), Zenon (registered trademark) Alexa Labeling can also be performed using Fluor (registered trademark) antibody labeling kit, Qdot (registered trademark) antibody labeling kit (Invitrogen Corporation), EZ-Label Protein Labeling Kit (Funakoshi Co., Ltd.), etc. Furthermore, detection of the labeled antibody or a fragment thereof can be performed by using an appropriate device suitable for labeling.
本実施形態の免疫学的方法が、タウ蛋白質を認識する２種類の抗体の組み合わせを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法であってよい。
前記２種類の抗体の組み合わせは、
（１）タウ蛋白質を認識する第一抗体；及び
（２）タウ蛋白質を認識する第二抗体であって、該抗体は前記第一抗体とは異なる部分を認識する抗体であり、かつ前記第一抗体と組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行ったとき、非神経変性疾患患者の血液検体に対する反応性と比較して、ＡＬＳ患者の血液検体に対して１．５倍以上高い反応性を示す抗体の組み合わせである。
The immunological method of this embodiment may be a sandwich ELISA method using a combination of two types of antibodies that recognize tau protein.
The combination of the two types of antibodies is
(1) a first antibody that recognizes tau protein; and (2) a second antibody that recognizes tau protein, which antibody recognizes a part different from that of the first antibody, and which, when combined with the first antibody in a sandwich ELISA, shows a reactivity that is 1.5 times or more higher with blood samples from ALS patients than with blood samples from patients without neurodegenerative diseases.
本実施形態において、タウ蛋白質を認識する２種類の抗体の組み合わせは、これらの抗体を用いたサンドイッチ法による免疫学的方法で、ＡＬＳ患者（例えば、３検体を混和したもの）の血液検体と非神経変性疾患患者（例えば、３検体を混和したもの）の血液検体とを試料として反応性を比較した時に、ＡＬＳ患者の試料に対して高い反応性を示す抗体の組み合わせであり、非神経変性疾患患者の試料に対する反応よりも、例えば１．５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．７５倍以上の反応を示す抗体の組み合わせであり、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．６倍以上、さらに好ましくは１．７倍以上、またさらに好ましくは１．７５倍以上の反応を示す抗体の組み合わせである。 In this embodiment, the combination of two types of antibodies that recognize tau protein is a combination of antibodies that show high reactivity to samples from ALS patients when comparing reactivity using blood samples from ALS patients (e.g., a mixture of three samples) and blood samples from patients with non-neurodegenerative diseases (e.g., a mixture of three samples) in an immunological sandwich method using these antibodies, and is a combination of antibodies that show a reaction that is, for example, 1.5 times or more, 1.6 times or more, 1.7 times or more, or 1.75 times or more higher than the reaction to samples from patients with non-neurodegenerative diseases, and is preferably a combination of antibodies that show a reaction that is 1.5 times or more, more preferably 1.6 times or more, even more preferably 1.7 times or more, and even more preferably 1.75 times or more higher.
＜ＡＬＳの血液検査方法＞
本発明の他の実施形態は、上述のバイオマーカーの定性的又は定量的な測定方法を含む、ＡＬＳの血液検査方法である。
<ALS blood test method>
Another embodiment of the present invention is a blood test method for ALS, comprising a method for qualitatively or quantitatively measuring the biomarkers described above.
当該血液検査はＡＬＳの検査を行うことができる限り特に限定されないが、例えば、当該血液検査によって、タウ蛋白質の存在を確認することができたとき、検査対象がＡＬＳを有すると判断してもよく、ＡＬＳを有する可能性があると判断してもよい。また、例えば、タウ蛋白質の定量的な測定結果に基づき、血液中のタウ蛋白質の濃度が、ＡＬＳを有しないコントロール検体における測定結果と比較して大きいとき、または血液中のタウ蛋白質の濃度が一定濃度以上（すなわち、カットオフ値以上）であるとき、検査対象がＡＬＳを有すると判断してもよく、ＡＬＳを有する可能性があると判断してもよい。カットオフ値は予め定めておいてもよく、検査ごとに定めてもよい。
なお、ＡＬＳの検査において、ＡＬＳを有しないコントロール検体とは、健常者検体であってもよく、非神経変性疾患を有する患者の検体であってもよく、またはＡＬＳ以外の疾患を有する患者の検体であってもよい。
The blood test is not particularly limited as long as it can test ALS, but for example, when the presence of tau protein can be confirmed by the blood test, it may be determined that the test subject has ALS, or may be determined that the test subject may have ALS.In addition, for example, based on the quantitative measurement result of tau protein, when the concentration of tau protein in blood is larger than the measurement result of a control specimen that does not have ALS, or when the concentration of tau protein in blood is equal to or higher than a certain concentration (i.e., equal to or higher than a cutoff value), it may be determined that the test subject has ALS, or may be determined that the test subject may have ALS.The cutoff value may be determined in advance, or may be determined for each test.
In addition, in the case of testing for ALS, the control sample not having ALS may be a sample from a healthy person, a sample from a patient with a non-neurodegenerative disease, or a sample from a patient with a disease other than ALS.
また、当該血液検査は、検査対象がＡＬＳを有すると、アルツハイマー病や多発性硬化症などの他の疾患と区別して鑑別診断するための検査であってよい。ＡＬＳの鑑別診断を行うことができる限り特に限定されないが、例えば、当該血液検査によって、タウ蛋白質の存在を確認することができたとき、検査対象がＡＬＳを有する鑑別診断することができる。タウ蛋白質の定量的な測定結果に基づき、血液中のタウ蛋白質の濃度が、ＡＬＳを有
しないコントロール検体における測定結果と比較して大きいとき、または血液中のタウ蛋白質の濃度が一定濃度以上（すなわち、カットオフ値以上）であるとき、検査対象がＡＬＳを有する鑑別診断することができる。カットオフ値は予め定めておいてもよく、検査ごとに定めてもよい。
なお、ＡＬＳの鑑別診断において、ＡＬＳを有しないコントロール検体とは、健常者検体であってもよく、非神経変性疾患を有する患者の検体であってもよく、ＡＬＳ以外の疾患を有する患者の検体であってもよく、またはＡＬＳ以外の疾患であってＡＬＳと鑑別する必要がある疾患（例えば、アルツハイマー病や多発性硬化症など）を有する患者の検体であってもよいが、好ましくは、ＡＬＳ以外の疾患であってＡＬＳと鑑別する必要がある疾患を有する患者の検体である。
ＡＬＳの鑑別診断における、血液中のタウ蛋白質濃度のカットオフ値は、特に限定されないが、例えば、６０ｐｇ／ｍｌとしてもよく、７０ｐｇ／ｍｌとしてもよい。
ＡＬＳの鑑別診断は、任意の他の検査と組み合わせて行ってもよい。
In addition, the blood test may be a test for differentially diagnosing the test subject having ALS, by distinguishing it from other diseases such as Alzheimer's disease and multiple sclerosis. There is no particular limitation as long as it can perform differential diagnosis of ALS, but for example, when the presence of tau protein can be confirmed by the blood test, the test subject can be differentially diagnosed as having ALS. Based on the quantitative measurement result of tau protein, when the concentration of tau protein in blood is larger than the measurement result in a control sample that does not have ALS, or when the concentration of tau protein in blood is equal to or higher than a certain concentration (i.e., equal to or higher than a cutoff value), the test subject can be differentially diagnosed as having ALS. The cutoff value may be determined in advance or may be determined for each test.
In the differential diagnosis of ALS, a control sample not having ALS may be a sample from a healthy person, a sample from a patient with a non-neurodegenerative disease, a sample from a patient with a disease other than ALS, or a sample from a patient with a disease other than ALS that needs to be differentiated from ALS (e.g., Alzheimer's disease, multiple sclerosis, etc.), but is preferably a sample from a patient with a disease other than ALS that needs to be differentiated from ALS.
The cutoff value of the blood tau protein concentration in the differential diagnosis of ALS is not particularly limited, but may be, for example, 60 pg/ml or 70 pg/ml.
The differential diagnosis of ALS may be performed in combination with any other test.
本実施形態のバイオマーカーは、任意の他のバイオマーカーや検査と組み合わせて用いてもよい。 The biomarkers of this embodiment may be used in combination with any other biomarkers or tests.
本実施形態の検査方法により測定された血液検体中のタウ蛋白質濃度は、健常者、神経変性疾患以外の有病者、アルツハイマー病（ＡＤ）患者、多発性硬化症（ＭＳ）患者に比べて、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者で有意に高値を示す。従って、本実施形態の方法は、ＡＬＳの診断のために利用できる。特に鑑別が難しいＡＤやＭＳなどの神経変性疾患との鑑別診断のために有用である。 The tau protein concentration in blood samples measured by the testing method of this embodiment is significantly higher in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patients than in healthy individuals, individuals with diseases other than neurodegenerative diseases, Alzheimer's disease (AD) patients, and multiple sclerosis (MS) patients. Therefore, the method of this embodiment can be used to diagnose ALS. It is particularly useful for differential diagnosis from neurodegenerative diseases such as AD and MS, which are difficult to distinguish.
＜血液検査用キット＞
本発明の他の実施形態は、タウ蛋白質を認識する２種類の抗体の組み合わせを含む、ＡＬＳの血液検査用キットであって、
前記キットは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いられるものであり、
前記２種類の抗体の組み合わせが、
（１）タウ蛋白質を認識する第一抗体；及び
（２）タウ蛋白質を認識する第二抗体であって、該抗体は前記第一抗体とは異なる部分を認識する抗体であり、かつ前記第一抗体と組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行ったとき、非神経変性疾患患者の血液検体に対する反応性と比較して、ＡＬＳ患者の血液検体に対して１．５倍以上高い反応性を示す抗体
の組み合わせである、前記キット。である。
<Blood test kit>
Another embodiment of the present invention is a blood test kit for ALS, comprising a combination of two types of antibodies that recognize tau protein,
The kit is used for a sandwich ELISA method,
The combination of the two types of antibodies is
The kit comprises: (1) a first antibody that recognizes tau protein; and (2) a second antibody that recognizes tau protein, the second antibody recognizing a portion of the tau protein different from that of the first antibody, and when sandwich ELISA is performed in combination with the first antibody, the second antibody shows a reactivity that is 1.5 times or more higher with blood samples from ALS patients than with blood samples from patients without neurodegenerative diseases.
キットは、少なくとも上記２種類の抗体の組み合わせ含む、血液検体中のタウ蛋白質を測定することによってＡＬＳの血液検査を行うためのキットである。当該抗体は、上記＜バイオマーカーの定性的又は定量的な測定方法＞の項に記載した方法に従って作製されたものを用いることができる。その他にも免疫学的方法を実施するために必要な構成物品を含むことができ、例えば、検出用抗体、標識物質、標準品、ブロッキング剤、洗浄液、検出試薬、反応停止液、ＥＬＩＳＡプレート等を含んでもよい。キットは目的に応じて当業者に慣用の技術を用いて製造することができる。 The kit is for performing a blood test for ALS by measuring tau protein in a blood sample, and contains a combination of at least the above two types of antibodies. The antibody can be one produced according to the method described in the above section <Qualitative or quantitative measurement method of biomarkers>. In addition, the kit can contain other components necessary for carrying out an immunological method, such as a detection antibody, a labeling substance, a standard, a blocking agent, a washing solution, a detection reagent, a reaction stop solution, an ELISA plate, etc. The kit can be manufactured using techniques commonly known to those skilled in the art depending on the purpose.
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
＜実施例１．タウ蛋白質に特異的な抗体の取得＞
（１）マウス、ラットへの免疫
タウ蛋白質に特異的な抗体を取得するために、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有
するリコンビナントタウ蛋白質４４１（＃ＡＧ９６０ Ｔａｕ４４１／Ｅ．Ｃｏｌｉ（１ｍｇ／ｍＬ）：Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と完全フロイントアジュバンド（ＧＩＢＣＯ社）とを体積において１対１の割合で混和して乳化させた。得られたエマルジョンを１０μｇ／０．２ｍＬの量で、ＢＤＦ１マウス（６週齢；雌；入手元：チャールス・リバー）およびＷｉｓｔａｒラット（６週齢；雌；入手元：チャールス・リバー）に対して、１週間間隔で４回、皮下又は皮内に投与した。
Example 1. Obtaining an antibody specific to tau protein
(1) Immunization of Mice and Rats To obtain an antibody specific to tau protein, recombinant tau protein 441 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (#AG960 Tau441/E. Coli (1 mg/mL): Merck Millipore) was mixed with complete Freund's adjuvant (GIBCO) in a volumetric ratio of 1:1 to form an emulsifier. The resulting emulsion was administered subcutaneously or intradermally at 10 μg/0.2 mL to BDF1 mice (6 weeks old; female; obtained from Charles River) and Wistar rats (6 weeks old; female; obtained from Charles River) four times at weekly intervals.
（２）抗タウ蛋白質抗体産生ハイブリドーマの作製
最終免疫の２日後にリンパ節を摘出した。摘出したリンパ節から得られたリンパ節細胞と骨髄腫細胞Ｘ６３－Ａｇ８．６５３（入手元：ＡＴＣＣ）とを細胞数において５対１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ社）存在下にて細胞融合させた。得られたハイブリドーマはリンパ節細胞として２．５×１０６細胞／ｍＬになるようにＨＡＴ培地（入手元：ＡＴＣＣ）に懸濁し、９６穴培養プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に０．１ｍＬずつ分注した。５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて培養し、おおよそ２週間後に、ハイブリドーマが生育したウェルの培養上清について、下記のスクリーニング法に従って抗体産生株を選択した。次に、選択した抗体産生株を限界希釈法によりクローニングした後、同様のスクリーニング法によってクローン化抗体産生株を選択した。
(2) Preparation of anti-tau protein antibody-producing hybridomas Lymph nodes were excised two days after the final immunization. Lymph node cells obtained from the excised lymph nodes and myeloma cells X63-Ag8.653 (obtained from ATCC) were mixed in a ratio of 5:1 in terms of cell number, and cell fusion was performed in the presence of 50% polyethylene glycol 1500 (Roche). The obtained hybridomas were suspended in HAT medium (obtained from ATCC) to give 2.5 x 106 cells/mL as lymph node cells, and 0.1 mL was dispensed into 96-well culture plates (CORNING). The hybridomas were cultured at 37°C in a 5% CO2 incubator, and after approximately two weeks, antibody-producing strains were selected from the culture supernatant of the wells in which the hybridomas had grown, according to the screening method described below. Next, the selected antibody-producing strains were cloned by limiting dilution, and then cloned antibody-producing strains were selected by the same screening method.
［スクリーニング法］
リコンビナントタウ蛋白質４４１を１００ｍＭ－炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で２００ｎｇ／ｍＬの濃度に調整後、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社）に５０μＬ／ウェル加え、４℃で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェル加え、１時間ブロッキングした。ブロッキング液を除去後、細胞融合後の培養液を希釈液にて２倍に調整し、５０μＬ／ウェル加え室温で３０分間反応させた。洗浄液（１０ｍＭ－リン酸緩衝液（ｐＨ７．５），０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した後、マウスモノクローナル抗体に対してはペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を５０μＬ／ウェル加え、ラットモノクローナル抗体に対してはペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇＧヤギ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社）を５０μＬ／ウェル加え、室温で１５分間インキュベートした。洗浄液で５回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液（入手元：ＩＢＬ）を５０μＬ／ウェル加えた。１０分後、１．５Ｎ硫酸を５０μＬ／ウェル加え、波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、精製タウ蛋白質に対して高い反応を示す抗体産生株を選択した。
[Screening method]
Recombinant tau protein 441 was adjusted to a concentration of 200 ng/mL with 100 mM carbonate buffer (pH 9.5), and then added at 50 μL/well to a 96-well ELISA plate (Nunc) and incubated overnight at 4° C. The plate was washed twice with PBS, and then 200 μL/well of blocking solution (PBS containing 1% BSA) was added for blocking for 1 hour. After removing the blocking solution, the culture solution after cell fusion was adjusted to 2x with diluent, and 50 μL/well was added and reacted at room temperature for 30 minutes. After washing four times with a washing solution (10 mM phosphate buffer (pH 7.5), 0.05% Tween 20), 50 μL/well of peroxidase-labeled anti-mouse IgG goat antibody (SouthernBiotech) was added to the mouse monoclonal antibody, and 50 μL/well of peroxidase-labeled anti-rat IgG goat antibody (SouthernBiotech) was added to the rat monoclonal antibody, and incubated at room temperature for 15 minutes. After washing five times with a washing solution, 50 μL/well of peroxidase substrate solution (obtained from IBL) was added. After 10 minutes, 50 μL/well of 1.5 N sulfuric acid was added, and the absorbance at a wavelength of 490 nm was measured to select antibody-producing strains that showed a high reaction to purified tau protein.
（３）ウェスタンブロッティング法によるモノクローナル抗体の特異性の解析
ヒトタウ蛋白質４４１をコードする遺伝子であるヒトタウ４４１遺伝子のクローニングおよび哺乳類細胞系での発現を行った。配列番号２で表される塩基配列を有する既知のヒトＭｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｕ ｃＤＮＡ配列（ＲｅｆＳｅｑ：Ｐ１０６３６）に基づいて合成したフォワードプライマー（配列番号３）及びリバースプライマー（配列番号４）を用いて、ＰＣＲ法によりヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）からヒトタウ４４１遺伝子の全長ｃＤＮＡを増幅させた。増幅産物をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．４（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞（Ｔａｋａｒａ社）の形質転換に用いた。シーケンス解析の結果、ＰＣＲ法によってクローン化したヒトタウ４４１遺伝子のｃＤＮＡは完全に配列決定された。
次にＥｘｐｉ２９３ ｓｙｓｔｅｍ（入手元：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の指示に従い、Ｅｘｐｉ２９３細胞にヒトタウ４４１遺伝子発現ベクターをトランスフェクションし、その培養上清を回収した。培養上清をＳＤＳ－ＰＡＧＥ後、ウェスタンブロッティング法によりモノクローナル抗体を解析した。
その結果、後述の方法により調製した、抗タウ蛋白質抗体産生ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体であるＥ２２Ａ３抗体及びＲ１０３Ｃ１Ａ５抗体は、ヒトタウ蛋白質に特異的に反応した（図１）。
(3) Analysis of the specificity of monoclonal antibodies by Western blotting The human tau 441 gene, which is a gene encoding human tau protein 441, was cloned and expressed in a mammalian cell system. The full-length cDNA of the human tau 441 gene was amplified from human brain cDNA (Clonetech) by PCR using a forward primer (SEQ ID NO: 3) and a reverse primer (SEQ ID NO: 4) synthesized based on the known human Microtubule-associated protein Tau cDNA sequence (RefSeq: P10636) having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. The amplified product was digested with EcoRI and XhoI, inserted into pcDNA3.4(+) vector (Invitrogen), and used to transform E. coli JM109 cells (Takara). As a result of sequence analysis, the cDNA of the human tau 441 gene cloned by PCR was completely sequenced.
Next, using the Expi293 system (obtained from Thermo Fisher Scientific), the human tau441 gene expression vector was transfected into Expi293 cells according to the manufacturer's instructions, and the culture supernatant was collected. The culture supernatant was subjected to SDS-PAGE, and the monoclonal antibody was analyzed by Western blotting.
As a result, the E22A3 antibody and the R103C1A5 antibody, which are monoclonal antibodies produced by anti-tau protein antibody-producing hybridomas prepared by the method described below, reacted specifically with human tau protein (FIG. 1).
（４）モノクローナル抗体の調製
抗タウ蛋白質抗体産生ハイブリドーマＥ２２Ａ３、ｍ４０Ａ１及びＲ１０３Ｃ１Ａ５はそれぞれ、Ｉｎｔｅｇｒａ ｃｌａｓｓｉｃ１０００（Ｉｎｔｅｇｒａ社）において高密度培養し、上清を等量の吸着用緩衝液（２０ｍＭ－リン酸緩衝液ｐＨ７．０）と混和後、この培養上清を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインＧカラム（ファルマシア）に通して抗体をカラムに吸着させ、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させて、モノクローナル抗体であるＥ２２Ａ３抗体、ｍ４０Ａ１抗体及びＲ１０３Ｃ１Ａ５抗体を精製した。
(4) Preparation of Monoclonal Antibodies The anti-tau protein antibody-producing hybridomas E22A3, m40A1 and R103C1A5 were each cultured at high density in an Integra classic1000 (Integra). The supernatant was mixed with an equal volume of adsorption buffer (20 mM phosphate buffer, pH 7.0), and the culture supernatant was passed through a Protein G column (Pharmacia) equilibrated with the adsorption buffer to adsorb the antibody onto the column. The antibody was then eluted with 0.1 M citrate buffer (pH 3.0) to purify the monoclonal antibodies E22A3 antibody, m40A1 antibody and R103C1A5 antibody.
＜実施例２．モノクローナル抗体の選択＞
（１）サンドイッチＥＬＩＳＡ系の構築
実施例１で取得したモノクローナル抗体であるＥ２２Ａ３抗体及びｍ４０Ａ１抗体を、１００ｍＭ－炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で５μｇ／ｍＬの濃度に調整後、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社）に１００μＬ／ウェル加え、４℃で二夜インキュベートすることにより固相化した。プレートをＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェル加え、１時間ブロッキングした。ブロッキング液を除去後、リコンビナントタウ蛋白質４４１を標準品として、希釈液（５０μｇ／ｍＬ Ｎｏｒｍａｌ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， ０．５Ｍ ＮａＣｌ， ０．５％エマルゲン１０９Ｐ混合１％ ＢＳＡ， ０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０含有ＰＢＳ）にて希釈したヒト血漿（希釈倍率２～１２８倍）を１００μＬ／ウェル加え、４℃で一夜インキュベートした。洗浄液（１０ｍＭ－リン酸緩衝液（ｐＨ７．５），０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体であるＲ１０３Ｃ１Ａ５抗体を１００μＬ／ウェル加え、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄液で５回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液を１００μＬ／ウェル加えた。３０分後、１．５Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェル加え、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
Example 2. Selection of monoclonal antibodies
(1) Construction of a sandwich ELISA system The monoclonal antibodies E22A3 and m40A1 obtained in Example 1 were adjusted to a concentration of 5 μg/mL with 100 mM carbonate buffer (pH 9.5), added to a 96-well ELISA plate (Nunc) at 100 μL/well, and immobilized by incubating for two nights at 4° C. The plate was washed twice with PBS, and then a blocking solution (PBS containing 1% BSA) was added at 200 μL/well for blocking for 1 hour. After removing the blocking solution, human plasma (dilution ratio 2 to 128 times) diluted with diluent (50 μg/mL Normal Mouse IgG, 0.5 M NaCl, 0.5% Emulgen 109P mixed with 1% BSA, 0.05% Tween-20-containing PBS) using recombinant tau protein 441 as a standard was added at 100 μL/well and incubated overnight at 4° C. After washing four times with washing solution (10 mM phosphate buffer (pH 7.5), 0.05% Tween 20), 100 μL/well of R103C1A5 antibody, a peroxidase-labeled monoclonal antibody, was added and incubated at 4° C. for 30 minutes. After washing five times with washing solution, 100 μL/well of peroxidase substrate solution was added. After 30 minutes, 100 μL/well of 1.5 N sulfuric acid was added, and the absorbance at 450 nm was measured.
（２）抗体の選択
上述のＥＬＩＳＡ法により、ＡＬＳ患者プール血漿（Ｎ＝３）及び非神経変性疾患患者プール血漿（Ｎ＝３）との反応性を検討した。その結果、図２に示す通り、固相抗体（Ｅ２２Ａ３抗体）と標識抗体（Ｒ１０３Ｃ１Ａ５抗体）の組み合わせ（Ｍｅｔｈｏｄ １）及び固相抗体（ｍ４０Ａ１抗体）と標識抗体（Ｒ１０３Ｃ１Ａ５抗体）の組み合わせ(Ｍｅｔｈｏｄ２)は、共にＡＬＳ患者プール血漿及び非神経変性疾患患者プール血漿と反応することが示されたが、Ｍｅｔｈｏｄ ２の反応がＡＬＳ患者プール血漿と非神経変性疾患患者プール血漿に対して同等であるのに対して、Ｍｅｔｈｏｄ １はＡＬＳ患者プール血漿に対して高い反応を示した。具体的には、Ｍｅｔｈｏｄ ２の場合は、ＡＬＳ患者プール血漿に対する反応性と非神経変性疾患患者プール血漿に対する反応性を吸光度で表すとそれぞれ０．１００及び０．０９５であり、ＡＬＳ患者プール血漿に対する反応が非神経変性疾患患者プール血漿に対する反応と比較して同等（１．０５倍）であった。その一方で、Ｍｅｔｈｏｄ １の場合は、ＡＬＳ患者プール血漿に対する反応性と非神経変性疾患患者プール血漿に対する反応性を吸光度で表すとそれぞれ０．２９４及び０．１６８であり、ＡＬＳ患者プール血漿に対する反応が非神経変性疾患患者プール血漿に対する反応と比較して高い（１．７５倍）ものであった。
(2) Selection of Antibody The reactivity with pooled plasma of ALS patients (N=3) and pooled plasma of non-neurodegenerative disease patients (N=3) was examined by the above-mentioned ELISA method. As a result, as shown in FIG. 2, the combination of solid-phase antibody (E22A3 antibody) and labeled antibody (R103C1A5 antibody) (Method 1) and the combination of solid-phase antibody (m40A1 antibody) and labeled antibody (R103C1A5 antibody) (Method 2) were both shown to react with pooled plasma of ALS patients and pooled plasma of non-neurodegenerative disease patients, but while the reaction of Method 2 was equivalent to the pooled plasma of ALS patients and the pooled plasma of non-neurodegenerative disease patients, Method 1 showed a high reaction with pooled plasma of ALS patients. Specifically, in the case of Method 2, the reactivity to the pooled plasma of ALS patients and the reactivity to the pooled plasma of non-neurodegenerative disease patients were 0.100 and 0.095, respectively, expressed as absorbance, and the reaction to the pooled plasma of ALS patients was equivalent (1.05 times) to the reaction to the pooled plasma of non-neurodegenerative disease patients. On the other hand, in the case of Method 1, the reactivity to the pooled plasma of ALS patients and the reactivity to the pooled plasma of non-neurodegenerative disease patients were 0.294 and 0.168, respectively, expressed as absorbance, and the reaction to the pooled plasma of ALS patients was higher (1.75 times) than the reaction to the pooled plasma of non-neurodegenerative disease patients.
＜実施例３．モノクローナル抗体によるヒト血漿中のタウ蛋白質の測定＞
（１）対象検体
アルツハイマー病（ＡＤ）患者血漿：１２例
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者血漿：１０例
多発性硬化症（ＭＳ）患者血漿：８例
非神経変性疾患（コントロール）：９例
Example 3. Measurement of tau protein in human plasma using monoclonal antibodies
(1) Target specimens Plasma from patients with Alzheimer's disease (AD): 12 cases Plasma from patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS): 10 cases Plasma from patients with multiple sclerosis (MS): 8 cases Non-neurodegenerative disease (control): 9 cases
（２）ＥＬＩＳＡ法によるヒト血漿中のタウ蛋白質の測定
実施例１で取得したモノクローナル抗体であるＥ２２Ａ３抗体を、１００ｍＭ－炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で５μｇ／ｍＬの濃度に調整後、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社）に１００μＬ／ウェル加え、４℃で二夜インキュベートすることにより固相化した。プレートをＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェル加え、１時間ブロッキングした。ブロッキング液を除去後、リコンビナントタウ蛋白質４４１を標準品（５．０～３１７．０ｐｇ／ｍＬ）として、希釈液にて希釈したヒト血漿（希釈倍率２倍）を１００μＬ／ウェル加え、４℃で一夜インキュベートした。洗浄液で４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体であるＲ１０３Ｃ１Ａ５抗体を１００μＬ／ウェル加え、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄液で５回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液を１００μＬ／ウェル加えた。３０分後、１．５Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェル加え、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
(2) Measurement of tau protein in human plasma by ELISA The monoclonal antibody E22A3 antibody obtained in Example 1 was adjusted to a concentration of 5 μg/mL with 100 mM carbonate buffer (pH 9.5), and then added to a 96-well ELISA plate (Nunc) at 100 μL/well, and incubated at 4° C. for two nights to immobilize the antibody. The plate was washed twice with PBS, and then a blocking solution (PBS containing 1% BSA) was added at 200 μL/well, followed by blocking for one hour. After removing the blocking solution, recombinant tau protein 441 was used as a standard (5.0 to 317.0 pg/mL), and human plasma diluted with diluent (dilution ratio 2 times) was added at 100 μL/well, followed by incubation at 4° C. overnight. After washing four times with washing solution, a peroxidase-labeled monoclonal antibody R103C1A5 antibody was added at 100 μL/well, followed by incubation at 4° C. for 30 minutes. After washing five times with a washing solution, 100 μL/well of a peroxidase substrate solution was added. After 30 minutes, 100 μL/well of 1.5 N sulfuric acid was added, and the absorbance at 450 nm was measured.
（３）測定結果
図３に示す通り、ＡＬＳ患者血漿群におけるタウ蛋白質量は、ＡＤ患者血漿群、ＭＳ患者血漿群及びコントロール血漿群におけるタウ蛋白質量と比較して、有意に高値を示した（ｔ検定、ｐ＜０．００１）。また、表１に示す通り、タウ蛋白質量のカットオフを６０ｐｇ／ｍＬとしたとき、ＡＬＳ患者における陽性率は７０％であった。
(3) Measurement results As shown in Figure 3, the amount of tau protein in the ALS patient plasma group was significantly higher than the amount of tau protein in the AD patient plasma group, the MS patient plasma group, and the control plasma group (t test, p<0.001). In addition, as shown in Table 1, when the cutoff value of the amount of tau protein was set to 60 pg/mL, the positive rate in ALS patients was 70%.
＜実施例４．モノクローナル抗体の各種タウ蛋白質への反応性の検討＞
（１）ヒトタウ蛋白質４４１、ヒトタウ蛋白質７５８の発現
ヒトタウ蛋白質４４１をコードする遺伝子であるヒトタウ４４１遺伝子のクローニングおよび哺乳類細胞系での発現を行った。配列番号２で表される塩基配列を有する既知のヒトＭｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｕ ｃＤＮＡ配列（ＲｅｆＳｅｑ：Ｐ１０６３６）に基づいて合成したフォワードプライマー（配列番号３）及びリバースプライマー（配列番号４）を用いて、ＰＣＲ法によりヒト脳ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）からヒトタウ４４１遺伝子の全長ｃＤＮＡを増幅させた。増幅産物をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．４（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞（Ｔａｋａｒａ社）の形質転換に用いた。シーケンス解析の結果、ＰＣＲ法によってクローン化したヒトタウ４４１遺伝子のｃＤＮＡは完全に配列決定された。
また、ヒトタウ蛋白質７５８をコードする遺伝子であるヒトタウ７５８遺伝子の合成および哺乳類細胞系での発現を行った。既知のヒトＭｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔａｕ ｃＤＮＡ配列（ＲｅｆＳｅｑ：Ｐ１０６３６）に基づいて、ヒトタウ７５８遺伝子の全長ｃＤＮＡを得た（遺伝子合成はＦＡＳＭＡＣ社が行った）。その後、得られたｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．４（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞（Ｔａｋａｒａ社）の形質転換に用いた。シーケンス解析の結果、クローン化したヒトタウ７５８遺伝子のｃＤＮＡは完全に配列決定された。
次にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、製造業者の指示に従い、ＣＨＯ細胞(ＡＴＣＣ)にヒトタウ４４１遺伝子発現ベクターおよびヒトタウ７５８遺伝子発現ベクターをトランスフェクションし、その培養上清（Ｓｕｐ）を回収した。培養上清をＥＬＩＳＡ法（固相抗体（Ｅ２２Ａ３抗体）及び標識抗体（Ｒ１０３Ｃ１Ａ５抗体）の組み合わせ）の反応性確認に供した。
Example 4. Examination of reactivity of monoclonal antibodies to various tau proteins
(1) Expression of human tau protein 441 and human tau protein 758 The human tau 441 gene, which is a gene encoding human tau protein 441, was cloned and expressed in a mammalian cell system. The full-length cDNA of the human tau 441 gene was amplified by PCR from human brain cDNA (Clonetech) using a forward primer (SEQ ID NO: 3) and a reverse primer (SEQ ID NO: 4) synthesized based on the known human Microtubule-associated protein Tau cDNA sequence (RefSeq: P10636) having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2. The amplified product was digested with EcoRI and XhoI, inserted into pcDNA3.4(+) vector (Invitrogen), and used to transform E. coli JM109 cells (Takara). As a result of sequence analysis, the cDNA of the human tau 441 gene cloned by PCR was completely sequenced.
In addition, human tau 758 gene, which is a gene encoding human tau protein 758, was synthesized and expressed in a mammalian cell system. Based on the known human Microtubule-associated protein Tau cDNA sequence (RefSeq: P10636), a full-length cDNA of human tau 758 gene was obtained (gene synthesis was performed by FASMAC). The obtained cDNA was then inserted into a pcDNA3.4(+) vector (Invitrogen) and used to transform E. coli JM109 cells (Takara). As a result of sequence analysis, the cDNA of the cloned human tau 758 gene was completely sequenced.
Next, human tau 441 gene expression vector and human tau 758 gene expression vector were transfected into CHO cells (ATCC) using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions, and the culture supernatant (Sup) was collected. The culture supernatant was subjected to ELISA (combination of solid-phase antibody (E22A3 antibody) and labeled antibody (R103C1A5 antibody)) reactivity confirmation.
（２）ＥＬＩＳＡ法によるヒトタウ蛋白質４４１およびヒトタウ蛋白質７５８への反応性確認
実施例１で取得したモノクローナル抗体であるＥ２２Ａ３抗体を、１００ｍＭ－炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で５μｇ／ｍＬの濃度に調整後、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社）に１００μＬ／ウェル加え、４℃で二夜インキュベートすることにより固相化した。プレートをＰＢＳで２回洗浄後、ブロッキング液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を２００μＬ／ウェル加え、１時間ブロッキングした。ブロッキング液を除去後、ＣＨＯ細胞で発現させた培養上清、リコンビナントタウ蛋白質４４１およびリコンビナントタウ蛋白質７５８を希釈液にて希釈（希釈倍率２，５６０から２，６２１，４４０倍）を１００μＬ／ウェル加え、４℃で一夜インキュベートした。洗浄液で４回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識したモノクローナル抗体であるＲ１０３Ｃ１Ａ５抗体を１００μＬ／ウェル加え、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄液で５回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質溶液を１００μＬ／ウェル加えた。３０分後、１．５Ｎ硫酸を１００μＬ／ウェル加え、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果、図４に示す通り、固相抗体（Ｅ２２Ａ３抗体）及び標識抗体（Ｒ１０３Ｃ１Ａ５抗体）の組み合わせは、ヒトタウ蛋白質４４１およびヒトタウ蛋白質７５８の何れにも反応することが示された。よって、当該ＥＬＩＳＡ法はヒトタウ蛋白質４４１、ヒトタウ蛋白質７５８等の各種ヒトタウ蛋白質の測定に利用できることが示唆された。
(2) Confirmation of reactivity to human tau protein 441 and human tau protein 758 by ELISA The monoclonal antibody E22A3 antibody obtained in Example 1 was adjusted to a concentration of 5 μg/mL with 100 mM carbonate buffer (pH 9.5), and then added to a 96-well ELISA plate (Nunc) at 100 μL/well, and incubated at 4° C. for two nights to immobilize the antibody. The plate was washed twice with PBS, and then a blocking solution (PBS containing 1% BSA) was added at 200 μL/well, followed by blocking for one hour. After removing the blocking solution, the culture supernatant, recombinant tau protein 441, and recombinant tau protein 758 expressed in CHO cells were diluted with a diluent (dilution ratio 2,560 to 2,621,440 times) and added at 100 μL/well, followed by incubation at 4° C. overnight. After washing four times with the washing solution, 100 μL/well of the peroxidase-labeled monoclonal antibody R103C1A5 antibody was added and incubated at 4° C. for 30 minutes. After washing five times with the washing solution, 100 μL/well of the peroxidase substrate solution was added. After 30 minutes, 100 μL/well of 1.5 N sulfuric acid was added and the absorbance at 450 nm was measured.
As a result, as shown in Figure 4, it was shown that the combination of the solid-phase antibody (E22A3 antibody) and the labeled antibody (R103C1A5 antibody) reacted with both human tau protein 441 and human tau protein 758. Therefore, it was suggested that the ELISA method can be used to measure various human tau proteins such as human tau protein 441 and human tau protein 758.
Claims (9)
前記２種類の抗体の組み合わせが、
（１）タウ蛋白質を認識する第一抗体；及び
（２）タウ蛋白質を認識する第二抗体であって、該抗体は前記第一抗体とは異なる部分を認識する抗体であり、かつ前記第一抗体と組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行ったとき、非神経変性疾患患者の血液検体に対する反応性と比較して、ＡＬＳ患者の血液検体に対して１．５倍以上高い反応性を示す抗体
の組み合わせである、請求項７に記載の方法。 The immunological method is a sandwich ELISA method using a combination of two types of antibodies that recognize tau protein,
The combination of the two types of antibodies is
The method according to claim 7, comprising a combination of: (1) a first antibody that recognizes tau protein; and (2) a second antibody that recognizes tau protein, the second antibody recognizing a portion of the tau protein different from that of the first antibody, and which, when combined with the first antibody in a sandwich ELISA, shows a reactivity that is 1.5 times or more higher with blood samples from ALS patients than with blood samples from patients without neurodegenerative diseases.
前記キットは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いられるものであり、
前記２種類の抗体の組み合わせが、
（１）タウ蛋白質を認識する第一抗体；及び
（２）タウ蛋白質を認識する第二抗体であって、該抗体は前記第一抗体とは異なる部分を認識する抗体であり、かつ前記第一抗体と組み合わせてサンドイッチＥＬＩＳＡ法を行ったとき、非神経変性疾患患者の血液検体に対する反応性と比較して、ＡＬＳ患者の血液検体に対して１．５倍以上高い反応性を示す抗体
の組み合わせである、前記キット。 A blood test kit for ALS, comprising a combination of two types of antibodies that recognize tau protein,
The kit is used for a sandwich ELISA method,
The combination of the two types of antibodies is
The kit comprises: (1) a first antibody that recognizes tau protein; and (2) a second antibody that recognizes tau protein, the second antibody recognizing a part of the tau protein different from that of the first antibody, and when combined with the first antibody in a sandwich ELISA assay, the second antibody shows a reactivity that is 1.5 times or more higher with blood samples from ALS patients than with blood samples from patients without neurodegenerative diseases.
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