JP2023014146A

JP2023014146A - 工学的操作された血管組織の作製において気泡を除去するための信頼性が高く再現可能な工業化プロセス

Info

Publication number: JP2023014146A
Application number: JP2022184203A
Authority: JP
Inventors: クラウディア・トレソルディ; Tresoldi Claudia; クリスティーナ・ヴァンタッジャート; Vantaggiato Cristina
Original assignee: 1lab SA
Current assignee: 1lab SA
Priority date: 2017-08-16
Filing date: 2022-11-17
Publication date: 2023-01-26
Also published as: EP3669190B8; IL272577A; WO2019034966A1; IT201700093925A1; JP2020531049A; JP7322024B2; EP3669190A1; EP3669190B1; CA3072697A1; US20200208117A1; ES2970422T3

Abstract

【課題】インビトロでの工学的操作された血管構築物／組織の工業化のための、信頼性が高く、有効で、かつ再現可能な手順を提供すること。
【解決手段】本発明は、ヒトに使用するための医療製品、および動物に使用するための獣医学的製品のインビトロ試験用の、工学的操作された血管組織の作製において気泡を除去するための信頼性が高く再現可能な工業化方法に関する。
【選択図】図６

Description

本発明は、ヒトに使用するための医療製品、および動物に使用するための獣医学的製品のインビトロ試験用の、工学的操作された血管組織の作製において気泡を除去するための信頼性が高く再現可能な工業化方法に関する。

医療製品の開発は長くて難しいプロセスであることが知られている。実際、医療製品または獣医学的製品の開発において、薬であろうと、医療装置であろうと、ヒトまたは動物の被験者に使用することができる前に、接触する組織への影響を判定して、生物学的安全性の側面および医療製品の性能を評価し、その使用に関する潜在的な問題を予想することが重要である。

この文脈では、生物学的安全性および医療製品の性能の評価は広範囲で複雑であり、単一の構成材料の組織との相互作用の評価を、医療製品および獣医学的製品の全体設計から離して考えることはできず、全体的に、かつ、その使用の状態をできるだけ忠実に再現するように評価されなければならない。今日では、生物学的安全性および医療製品および獣医学的製品の性能の評価は、インビトロ、エクスビボ、および最終使用条件に関して著しい差のある動物モデルでの試験に基づいている。特に、動物モデルは著しい生理学的な差があり、それは、結果の妥当性をヒトの被験者に置き換えることを難しくする。このような差は、評価の対象が、心臓弁、ステント、グラフト、カテーテル、包帯、またはメッシュなど、ヒトに使用するための医療製品、または動物に使用するための獣医学的製品で、その意図される使用が心血管および末梢血管領域のときには、さらに顕著である。

残念なことに、ヒトに使用するための医療製品、および動物に使用するための獣医学的製品の、血管組織および血液との相互作用の評価は、生物学的安全性および性能を判定するためには限界があり、現在使用しているモデルは、解剖学的および構造的、ならびに血液組成に関してかなりの制限および欠点がある。

さらに、動物での実験が、動物を生体実験に使用することが倫理的に許されるかどうかに関して激しい論争の的となっている。この論争は早くも１９５９年の３Ｒの原則の制定につながり、それは、国際的な研究プログラムの議論および提案において非常に関連している。３Ｒの原則は、３つの重要な概念である代替、削減、および改善を指す。３Ｒの原則では、生物医学研究は、可能な限り、動物モデルを代替モデルに代替する、任意の所与の実験計画に使用される動物の数を削減する、動物が受ける実験条件を改善または改良すべきである
と述べられている。

血管組織工学の分野において、連続的（すなわち、コンフルエントな細胞の単層を有し）かつ機能的である内皮を生成することができること、すなわち、基本的に内皮細胞（EC:endothelial cell）から構成されることが重要であることが知られている。

連続した機能的な内皮の生成は、足場内皮化を促進し、（足場および細胞から構成される）工学的操作された血管構築物（組織工学的操作された構築物）の適正な性能を保証する上で重要な因子であり、これには、前記構築物が埋め込まれたときの血栓症および狭窄症の防止が含まれる。

血管内皮のインビトロ産生または工学的操作された血管構築物／組織は、簡単に言えば、次のステップを含む。
（１）足場の内腔に内皮細胞を播種して、前記細胞を接着
（２）細胞が受ける機械的刺激（流体の流れなど）に対する成長／増殖および細胞組織化
（３）機能的な内皮細胞の１つまたは複数の層の産生

播種ステップが非常に重要であることを考えて、最近、多くの大学の研究グループが、足場の内腔に内皮細胞を一様に播種して前記播種の効率を向上させるための様々な技法の開発に投資してきた。しかしながら、今のところ、得られた結果は完全に満足できるものではない。

現在のところ、内皮細胞を播種するために、静的播種および動的播種の２つの技法が用いられている。

より簡単な静的方法は、細胞の懸濁液を直接足場の内腔表面にピペッティングし、次いで、ペトリ皿内で短時間インキュベートすることにある。この方法は、操作者に大きく依存しており、内皮細胞の一様な層を得ることが困難であることによってこの方法はさらに悪化する。

対照的に、動的方法は主に、回転、吸引、および静電磁場に基づいており、一様性および接着性とともに細胞播種の効率を向上させる。これらの動的方法のいくつかは、直接灌流バイオリアクタに移行し、それと結合することができ、したがって、足場を取り扱う必要性を低減する。この場合、足場がバイオリアクタチャンバ内に固定されるとすぐに足場に播種することができる。

一方、他の研究グループは、ポンプまたはシリンジによる細胞の懸濁物の連続注入を用いる動的播種の方法、または、内皮細胞の懸濁物の注入後、蠕動ポンプを使用して、播種された足場の内腔を培地で連続灌流することを用いる動的播種の方法を使用している。これらの方法は、注入シリンジの容積に加えて、灌流ラインの容積を満たす必要があるため、ピペッティングまたは回転を用いる播種方法よりも多量の細胞懸濁物を必要とし、これは、コスト（細胞と培地）の削減に関して限界があり得ることを示している。

上記で論じた方法と全く異なる方法としては、足場の内腔に細胞懸濁物をたらす方法がある。この場合、主な不利な点は、初期の細胞の接着が低く、操作者に大きく依存するため、この方法の再現性が低いことである。さらに、足場、主に管状足場の灌流に必要な、灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法（灌流方法）の選択は、実験準備に適合させなければならない。上記の播種の方法および灌流回路の接続の方法（灌流方法）の範囲を考えると、強い限界および不利な点が依然として存在する。

したがって、再現可能で信頼性が高く有効である、播種のための方法、および灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法（灌流方法）を含むプロセスを提供する明らかな必要性があり、特に、先進的な前臨床試験および臨床試験に焦点を絞った、ＧＬＰ（Good Laboratory Practice：優良試験所基準）に認証された組織工学試験所にとっては、前記プロセスの適用に関しては必要性がある。

連続的で（すなわち、コンフルエントな細胞の単層を有し）かつ機能的である内皮を有する、工学的操作された血管組織／構築物の作製のためのプロセスの開発に対する必要性があり、ここで、前記プロセスは、簡単、迅速、有効、操作者に依存せず、明確、再現性が高く、かつ信頼性が高く、（１）足場の内腔に細胞、主に内皮細胞を播種するための方法であって、足場内の気泡を除去しながら、内皮細胞の同質性と一様な接着を保証する方法と、（２）灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法（灌流方法）であって、灌流回路とバイオリアクタ－足場システムよりなる組み立てられたシステムにおいて無菌状態を保証し気泡がないことを保つ、方法とを含む。

前臨床試験および臨床試験のために実験動物を使用することを避けて、先進的な前臨床試験および臨床試験に行うために、連続した機能的な内皮を含む、工学的操作された血管構築物／組織をインビトロで開発する必要もある。したがって、前記インビトロでの工学的操作された血管構築物／組織の工業化のための、信頼性が高く、有効で、かつ再現可能な手順が必要である。

本出願人は、長期間の懸命な研究開発活動の後、添付の請求項に請求される特性を有する、播種方法、および灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を含むプロセスを完成させた。

本発明の好ましい実施形態は、以下の詳細な説明から明らかとなろう。

以降、本説明において図１～図２７を説明する。

本発明の文脈では、「連続した機能的な内皮」は、生理学的な挙動を有し、内皮細胞が互いに隣接し、足場に接着し、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ：Von Willebrand factor）、クラスター分類３１（ＣＤ３１：cluster of differentiation 31）、および血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ－１：vascular cell adhesion molecule 1）などの内皮細胞の典型的なマーカーを発現する内皮を意味する。特に、「連続した内皮」は、コンフルエントな細胞の単層を有する内皮を意味する。

本発明の文脈では、「足場」は、内皮細胞の本場合には、細胞の接着および成長を促進することができる、生体適合性のある多孔性ポリマー基体を意味する。ポリマーの足場は、合成または天然由来で、電界紡糸絹フィブロインあるいはＰＧＡ／ＰＬＡ（polyglycolic acid/polylactic acid：ポリグリコール酸／ポリ乳酸）またはＰＧＡ／ＰＣＬ（polyglycolic acid/polycaprolactone：ポリグリコール酸／ポリカプロラクトン）など、単一ポリマーあるいはコポリマー（ポリマーの組）から形成されたものであってもよい。

本発明の文脈では、「内皮細胞」は、血管組織の内皮を構成する細胞を意味する。内皮細胞の例としては、ＨＡＯＥＣ（human aortic endothelial cell：ヒト大動脈内皮細胞）、ＨＣＡＥＣ（human coronary artery endothelial cell：ヒト冠状動脈内皮細胞）、ＨＭＥＶＥＣ（human dermal microvascular endothelial cell：ヒト皮膚微小血管内皮細胞）、およびＨＵＶＥＣ（human umbilical vein endothelial cell：ヒト臍帯静脈内皮細胞）が挙げられる。

本発明の文脈では、「工学的操作された血管構築物」は、インビトロ内皮化のプロセス後、機能的な内皮細胞によって主に被覆された内腔を有する足場を意味する。足場の内腔を覆う前記内皮細胞は、連続した内皮、すなわちコンフルエントな細胞の単層を有する内皮を構成する。

本発明の文脈では、「培地」は、細胞の各タイプに特化した細胞成長および維持の流体を意味する。特に、この特定の場合（ＨＵＶＥＣ－ヒト臍帯静脈内皮細胞、Sigma Aldrichから得られる、ｃｏｄｅ２００－０５ｎ）に使用される内皮細胞に対しては、培地は、Endothelial Growth Medium（ＥＧＭ、Sigma Aldrich、２１１－５００）である。ＥＧＭは、ウシ胎仔血清（２％）、アデニン（０．２μｇ／ｍｌ）、メタバナジン酸アンモニウム（０．０００６μｇ／ｍｌ）、アムホテリシンＢ（０．３μｇ／ｍｌ）、塩化カルシウム２Ｈ_２Ｏ（３００μｇ／ｍｌ）、塩酸コリン（２０μｇ／ｍｌ）、硫酸銅５Ｈ_２Ｏ（０．００２μｇ／ｍｌ）、チオクト酸ＤＬ－６，８（０．００３μｇ／ｍｌ）、ホリン酸（カルシウム）（０．６μｇ／ｍｌ）、ヘパリン（４μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（２μｇ／ｍｌ）、Ｌ－アスパラギン酸（１５μｇ／ｍｌ）、Ｌ－システイン（３０μｇ／ｍｌ）、Ｌ－チロシン（２０μｇ／ｍｌ）、硫酸第一マンガン一水和物（０．０００２μｇ／ｍｌ）、モリブデン酸アンモニウム４Ｈ_２Ｏ（０．００４μｇ／ｍｌ）、ニコチンアミド（８μｇ／ｍｌ）、塩化ニッケル６Ｈ_２Ｏ（０．０００１μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（６０μｇ／ｍｌ）、フェノールレッドナトリウム塩（１５μｇ／ｍｌ）、塩化カリウム（３００μｇ／ｍｌ）、プトレシン二塩酸塩（０．０００２μｇ／ｍｌ）、ピリドキシン塩酸塩（３μｇ／ｍｌ）、メタケイ酸ナトリウム９Ｈ_２Ｏ（３μｇ／ｍｌ）、硫酸ナトリウム７Ｈ_２Ｏ（２００μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（０．０１μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１００μｇ／ｍｌ）、塩酸チアミン（４μｇ／ｍｌ）、および硫酸亜鉛７Ｈ_２Ｏ（０．０００３μｇ／ｍｌ）を含む。新しい培地は、無菌で、製造者によって直接供給された、以前に使用されたことがない培地である。「温かい培地」は、３０℃から４５℃の間、好ましくは３７℃の温度に前もって加熱された培地を意味する。

本発明で考えられたプロセスは、血管組織の工学的操作と、その結果の医療製品を試験するための血管グラフト（工学的操作された血管構築物／組織）の作製のための、播種方法、およびバイオリアクタを、足場、好ましくは管状足場のための灌流回路に接続するための方法（灌流方法）を含む。播種方法、およびバイオリアクタ－足場システムのために灌流回路を接続するための方法（灌流方法）を含む前記プロセスは、下記のシステムから気泡を正確に除去することを保証し、したがってプロセスの再現性を最適化することが有利である。さらに、気泡が内皮細胞に接触する危険性を減らすことによって、内皮細胞を傷つけることを防ぎ、足場の内腔に接着している内皮細胞のコンフルエントな単層（連続した機能的な内皮）を得ることができる。この場合、前記の播種方法、および足場のための灌流回路を接続する方法（灌流方法）は、灌流のためのバイオリアクタの電界紡糸絹フィブロインの、好ましくは管状の足場に適用される。本発明によるプロセスは、現在利用できるモデルの限界を乗り越え、動物モデルの使用に対する妥当な代替を適用するので３Ｒ基準を満足する。

本発明は、工学的操作された血管組織または構築物の作製、好ましくは、コンフルエントな細胞の単層を有する機能的で連続した内皮で被覆された内腔を有する足場（図２、２１）の作製のためのプロセスに関し、好ましくは、医療モデルまたは獣医学的モデルを試験するために使用可能なプロセスに関し、前記プロセスは、
－足場（２１）の内腔に内皮細胞培養物を播種して、播種された足場（２１）を生じさせるための方法であって、前記播種された足場（２１）がバイオリアクタ（１１）内にあって、播種されたバイオリアクタ（図３、１１）－足場（２１）システムを生じさせ、
－バイオリアクタ（１１）の上流に配置されたＴコネクタ（図１０、Ｔ２）に取り付けられた容器（図１０、９１）内の新しい培地および内皮細胞を含む細胞懸濁物の形態の前記内皮細胞培養物を回転コネクタ（図１０、ＣＲ１）によって放出するステップと、それに続いて、
－前記細胞懸濁物が気泡を発生しないでＴコネクタ（Ｔ２）内を下り、足場（２１）の内腔内にある気泡をバイオリアクタ（１１）の下流に配置されたＴコネクタ（図１０、Ｔ３）の開口に向けて押して出すことができる流速になるように、前記内皮細胞培養物を、バイオリアクタチャンバ（１１）内の足場（２１）の内腔に連続流で放出するステップとを含む播種方法と、
引き続いて、
－３０℃から４５℃の間、好ましくは３７℃の温度の新しい培地で、前記播種された足場（２１）の内腔にある内皮細胞を灌流する方法であって、前記播種されたバイオリアクタ（１１）－足場（２１）システムに灌流回路（図６、５１、５２、５３、５４、５５、ならびに５１～５６または５１～５７およびＢＴ）を接続することによって実現され、
－灌流回路にある、気泡の除去のための要素（７１またはＢＴ）を前記新しい培地で部分的に満たすステップであって、泡の除去のための前記要素（７１またはＢＴ）が、チャンバ、前記チャンバを閉じるキャップ、入口通路（２１１）、および出口通路（２１２）を備え、気泡の除去のための前記要素（７１またはＢＴ）が容積を有し、前記容積の第１の部分が前記新しい培地で満たされ、前記容積の第２の部分が空気で満たされ、前記容積の前記第２の部分が、前記入口通路（２１１）および前記出口通路（２１２）を通って流れる前記新しい培地内にある気泡を捕捉する機能を有する、ステップ
を含む灌流方法とを適用する。

足場支持部を示す図である。足場支持部の取付部に取り付けられた足場を示す図である。バイオリアクタを示す図である。バイオリアクタのチャンバを示す図である。灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。Ｔコネクタを示す図である。プラスチックピペットを示す図である。Ｔコネクタの開口がキャップで閉じられている状態の、バイオリアクタの上流に配置されたＴコネクタを示す図である。約９０°回転させられた、細胞懸濁物が入ったシリンジを示す図である。足場支持部を示す図である。コネクタの端部がキャップで閉じられているＴコネクタを示す図である。３つの別々の実験におけるレサズリンアッセイから得られた値を示すグラフである。３つの別々の実験におけるレサズリンアッセイから得られた値を示すグラフである。内皮細胞が約７ｐｇのゲノムＤＮＡを含むという事実を考慮して計算されたゲノムＤＮＡの定量化を示すグラフである。内皮細胞が約７ｐｇのゲノムＤＮＡを含むという事実を考慮して計算されたゲノムＤＮＡの定量化を示すグラフである。イオリアクタの上流に配置されたＴコネクタの上端および側方端からキャップが取り外された図である。クランプで塞がれた灌流閉回路の管を示す図である。灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。気泡除去要素を示す図である。第２の好ましい実施形態による、灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。第２の好ましい実施形態による、灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。第２の好ましい実施形態による、灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。第２の好ましい実施形態による、灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。第２の好ましい実施形態による、灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。第２の好ましい実施形態による、灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法を示す図である。

好ましい実施形態を示すことを目的として、本発明の主題であるプロセスによって代表される、提案される技術的解決策は、理解しやすくするために、下記に詳細を別々に説明する２つの方法、（１）足場、好ましくは管状足場の内腔に細胞培養物を播種するための方法、（２）灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法（灌流方法）、に分割される。

（１）好ましい実施形態による、足場の内腔に細胞培養物を播種するための方法
バイオリアクタ－足場システムのために一様に内皮細胞を播種するための方法は、無菌条件下で順次実施される複数のステップを含む。

１．１足場支持部（図１、１３、１３ａ、１３ｂ）の取付部に取り付けられた足場（図２、２１）、好ましくは管状足場、例えば電界紡糸絹フィブロインの管状足場は、バイオリアクタのチャンバ内に固定されてバイオリアクタ－足場システムとなる。バイオリアクタの両方の先端（上流および下流）には、回転コネクタ（図４、ＣＲ１、ＣＲ２）およびＴコネクタ（図４、Ｔ２、Ｔ３）が取り付けられている。

本発明の文脈では、「バイオリアクタ－足場システム」は、バイオリアクタ（図３、１１）と、足場支持部（図１、１３、１３ａ、１３ｂ）の取付部によって固定および取り付けされ、次いでバイオリアクタ内に配置された足場（図３、２１）、好ましくは管状足場、例えば電界紡糸絹フィブロインの管状足場との組立体を意味する。足場、好ましくは管状足場は、無菌のテフロン（登録商標）テープで足場、この場合は電界紡糸絹フィブロインから作られた足場を保護した後、自己引締めひもを用いて足場支持部の取付部（足場の灌流を可能にするように中空である）によって保持される。

足場支持部１３は、バイオリアクタのチャンバの上流の入口（図４、ＣＲ１、４１）が足場の一端（図４、１３ａ）と一致し、バイオリアクタチャンバの下流開口（図４、ＣＲ２、４２）が足場の他端（図４、１３ｂ）と一致するように、バイオリアクタ１１に挿入される。これは、足場２１が、中空の足場支持部によって生成された灌流通路に対して完全に同軸であることを保証する。バイオリアクタの長手方向軸は、バイオリアクタ内に取り付けられた足場がそれに沿って向く主軸と規定される。

１．２足場は、Ｔコネクタ（図９、Ｔ２）によってバイオリアクタの２つの端部の一方とルアーロック取付で係合されたシリンジを用いてバイオリアクタ内に固定された足場の内腔に注入された新しい培地で前処理される。次いで、バイオリアクタの上流および下流に配置されたコネクタの開放端は、足場の内腔が空にならないようにキャップで閉じられる。さらに、バイオリアクタ内に固定された足場が完全に覆われるまで、新しい培地がバイオリアクタのチャンバ内に挿入される。このようにして、バイオリアクタのチャンバ内に固定された足場は、内部（内腔）も外部も新しい培地で、好ましくは２５℃で１時間、前処理される。

１．３足場の前処理に続いて、内腔に注入された培地で前処理されたバイオリアクタ内では、好ましくは無菌ピペットを使って空にされ、その前にチャンバ内に挿入された培地は好ましくは無菌ピペットを使って除去される。バイオリアクタの上流および下流のコネクタ（回転コネクタおよびＴコネクタ）内に残っている培地は、足場が壊れないようにピペットを使って吸い出して除去される。

１．４取付部に支持された足場が入っているバイオリアクタの端部の上流および下流に配置されたＴコネクタ（図９、Ｔ２およびＴ３）は、上部開口を上向き（バイオリアクタ－足場システムが横たわる平面に対して９０°）になるように回される。次いで、バイオリアクタの下流および上流に配置されたＴコネクタ（Ｔ３、Ｔ２）の側方開口はキャップで閉じられる。次いで、容器、好ましくはシリンジ（図９、９１）が、バイオリアクタの上流に配置された、上向きに回されたＴコネクタ（図９、Ｔ２）の開口にルアーロック取付具で取り付けられ、プランジャを外したとき、その容量は、例えば５ｍｌである。その代わりに、バイオリアクタの下流に配置されたＴコネクタ（図９、Ｔ３）の開口は開いたままである（図９）。

１．５ピペット、好ましくは、例えば２５ｍｌの容量の無菌のプラスチックピペット（図１０、１０１）を使って、新しい培地と内皮細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ）とから成る細胞懸濁物が、調合された容器から引き出される。その後、引き出された細胞懸濁物は、要素（図１０、ＣＲ１）によってバイオリアクタの上流のＴコネクタ（図１０、Ｔ２）に取り付けられた容器またはシリンジ（図１０、９１）内に放出される。細胞懸濁物が気泡を発生しないでＴコネクタ（図１０、Ｔ２）内を下り、足場内のいかなる気泡もバイオリアクタ１１の下流に配置されたＴコネクタＴ３（図１０、Ｔ３）の開口に向けて押してシステム（図１０）から出すことができる流速になるように、細胞懸濁物は、例えば２５ｍｌのピペット（図１０、１０１）を使って連続流で放出されなければならない。

１．６シリンジによって充填される細胞懸濁物が、気泡なしにバイオリアクタの下流に配置されたＴコネクタＴ３の開放端に達すると、バイオリアクタの上流に配置されたＴコネクタＴ２の開口はキャップで閉じられる（図１１）。

１．７次いで、残った細胞懸濁物が入ったシリンジ（９１）が、それが横たわる平面に対して約９０°回転させられ（図１２）、この位置で、足場内に圧力が生じないように黒い遮蔽先端だけを挿入するようにして、シリンジのプランジャ（１０２）がシリンジの開放端に再挿入される（図１２）。次いで、シリンジ（９１）は、気泡を形成することなくバイオリアクタの上流に配置されたＴコネクタＴ２からねじって外すことができ（図１３）、コネクタの端部はキャップで閉じられる（図１４）。

１．８温かい新しい培地（上記で定義）が、バイオリアクタのチャンバ内の播種された足場が培地に中間まで浸されるまで、バイオリアクタのチャンバ内に加えられる。

１．９次いで、足場は、２４時間の間、例えば、１．５から２ｒｐｍの間の回転速度でその長手方向軸の周りに連続的に回転される。この回転によって、足場の内腔への細胞の一様な接着が可能になり、足場自体がバイオリアクタのチャンバ内の培地で絶えず濡れた状態に保たれ、栄養物がチャンバ内（足場の外側）の培地から足場の内腔に播種された細胞懸濁物に流れることが可能になる。

１．１０好ましくは、５％ＣＯ_２、３７℃で２４時間、バイオリアクタのチャンバ内に固定された足場を（回転させながら）インキュベートする。

本出願人によって開発されたこの播種方法はシステムの無菌状態を保つことが有利である。さらに、本発明の主題であるこの播種法は、迅速で再現可能であり、足場の全長に沿って（近位部分から中間部分、遠位部分まで）一様で均一に接着している内皮細胞を有する内腔（内部）の表面を有する足場を準備することができることが有利である。本発明による播種法は、バイオリアクタ－足場システム内にすでに存在していた気泡を除去するとともに、新たな気泡の形成も防ぎながら、したがって、細胞を傷つけることを防ぎながら細胞を播種することができる。実際、本方法の各ステップは標準化され、再現可能であり、手順の時間とコストを最適化する。

播種方法の実験的立証
本発明による播種方法の効率を示すために、以下の分析が実施された。

足場に接着している細胞の活力が、反応物質としてレサズリン（商品名Alamar Blue、ＩＵＰＡＣ名７－ヒドロキシ－１０－オキシドフェノキサジン－１０－イウム－３－オン、ＣＡＳ５５０－８２－３）を用いて評価された。この評価は、生きている細胞の還元的環境の存在でピンク色になる蛍光化合物であるレゾフルーリン（resofluorine）に還元される指示薬（レサズリン）の酸化還元反応によって細胞の活力を定量化することを可能にする代謝反応にある。接着して２４時間後、播種された足場は取付部から取り外される。次いで、足場は、細胞懸濁物の注入の位置に対して近位、中間、遠位の、それぞれ２ｃｍの長さの３つの領域に分割（切断）される。次いで、各部分は、それぞれ約１ｃｍ^２の４つの部分に分割される。レサズリンアッセイに対して、内皮細胞が接着している足場の各領域（近位、中間、および遠位）をそれぞれ代表する３つの試料が選ばれる。各試料は、２４ウェルプレートのウェル内に配置され、新しい培地を含むレサズリンナトリウム塩（Sigma Aldrich、Ｒ７０１７）の０．０２ｍｇ／ｍｌ溶液の１ｍｌで、好ましくは、５％ＣＯ_２、３７℃で３時間、インキュベートされる。新しい培地を含むレサズリンナトリウム塩の０．０２ｍｇ／ｍｌ溶液と（内皮細胞が接着している）足場試料との間の反応は、分光蛍光光度計を用いて５９０ｎｍでＡ．Ｕ．（arbitrary unit of fluorescence、蛍光の任意単位）を測定することによって分析される。

さらなる分析としては、レサズリンアッセイですでに使用された試料と同じ足場試料に接着している細胞内に存在するゲノムＤＮＡの量評価がある。ゲノムＤＮＡは、接着している足場の細胞から溶解によって抽出され、核酸の蛍光性着色（PicoGreen）が、標準の基準曲線によって溶液中のゲノムＤＮＡの濃度を測定することを可能にするQuant-iT（商標）PicoGreen（商標）ｄｓＤＮＡアッセイ（Ｐ７５８９、Invitrogen、Molecular Probes）を使って定量化される。

図１５Ａおよび図１５Ｂは、３つの別々の実験（ＤＹＮ１、ＤＹＮ２、ＤＹＮ３と名付ける）において、内皮細胞を播種され、２４時間インキュベートされた足場の各領域（近位、中間、遠位）を代表する試料に対してレサズリンアッセイから得られた値のグラフである。図１５Ａおよび図１５Ｂのグラフは、内皮細胞の良好な接着および活力を示している。

これらのデータは、内皮細胞が約７ｐｇのゲノムＤＮＡを含むという事実を考慮して計算されたゲノムＤＮＡの定量化（図１５Ｃおよび図１５Ｄ）によって確認された。

内皮細胞を播種された足場の様々な近位区画と中間区画と遠位区画との間には、細胞の活力に大きな差は見出されなかった。特に、細胞の活力および数は、足場の近位部分、中間部分、および遠位部分における長さ（足場の主軸）に沿って同等である。この立証は、内皮細胞を播種され、２４時間インキュベートされた足場の各領域（近位、中間、遠位）を代表する試料をＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール、ジヒドロクロリド、Ｄ１３０６、ThermoFisher scientific）およびローダミンファロイジン（Ｒ４１５、ThermoFisher scientific）で共染色することによって裏付けられた。２つの試薬、ＤＡＰＩおよびローダミンファロイジンは、それぞれ細胞核、アクチンフィラメント（Ｆ－アクチン）の検出に特化されており、ともに、生きている細胞の形態学的成分で、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて、染色後に見ることができる。２４時間の成長後のこれらの結果は、内皮細胞が活力があり、足場の内腔にわたって一様に分布していることを示している。特に、これらの結果は９０％の細胞コンフルエンスを示している。

さらに、内皮細胞を播種され、２４時間インキュベートされた足場の各領域（近位、中間、遠位）を代表する試料に関して、例えば、フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、クラスター分類３１（ＣＤ３１）、および血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ－１）などの内皮細胞の典型的なマーカーで遺伝子発現分析が行われた。遺伝子発現は、細胞（この場合は内皮細胞）から全ＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、特定のＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（ThermoFisher Scientific）でｃＤＮＡへの逆転写後に定量化することによって評価された。上記のマーカーの遺伝子発現の機能レベルは、足場の内腔に接着している細胞の良好な機能性および活力を示す。

最後に、本発明による内皮細胞を播種された足場の試料に関して、Ｈ＆Ｅ染色「ヘマトキシリンエオジン（Haematoxylin and Eeosin）染色」が細胞の分布およびそれらの形態を評価するために行われ、免疫蛍光染色アッセイが特定の内皮機能性マーカーに対して行われた。

結論として、本発明による播種方法は、内腔の全長にわたって均一、一様、および再現可能な活力のある内皮細胞の播種を保証するので有効であることが示された。

（２）第１の実施形態による、灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法（灌流方法）（図５～図８、図１８～図２１）
本接続方法は、播種（（１）項において上記した実施形態による、足場の内腔に細胞培養物を播種するための方法）後、内皮細胞の接着の２４時間後の以下の一連のステップに基づく。

２．１作動させると、流体を、この場合は温かい新しい培地を吸引および送出することができる蠕動力を発生する蠕動ポンプ（図５、５５）の圧力がかかるように灌流閉回路の管またはポンプループ配管（図５、５２）を配置する。灌流閉回路は、貯槽（図５、５６）に接続された灌流回路の管（図５、５１）によって、温かい新しい培地が吸引および送出されて満たされる。この温かい新しい培地は前もって貯槽に注がれ、次いで貯槽は閉じられている。新しい培地が、灌流閉回路の管５４（図５、５４）を経て貯槽に戻るまで、灌流回路の管すべてを温かい新しい培地で満たす。灌流回路と同じ無菌状態で、バイオリアクタ－足場システムを配置する。

２．２バイオリアクタの上流に配置されたＴコネクタＴ２の上端および側方端を開ける。

２．３バイオリアクタの上流に配置されたＴコネクタＴ２の上端および側方端からキャップを取り外すとき、泡が形成されていれば、温かい新しい培地の同等な量を手で加える（パスツールピペットを用いることが好ましい）ことによって泡の形成を補償する（図１６）。

２．４灌流閉回路の管５４を、好ましくは、灌流回路自体の管５４と管５３との間のコネクタの近くに配置されたクランプ（図１７、１７１）で塞ぐ（図１７）。灌流閉回路の管５３が空にならないようにポンプのヘッドの閉止を保つことに気を付ける。

２．５灌流閉回路の管５３を鉛直位置に保って、灌流回路の管５３と管５４との間のコネクタをねじって外し、好ましくは、灌流回路の管５４をキャップで蓋をする。

２．６バイオリアクタの上流のＴコネクタＴ２の側方通路につながるその開いた側方端に灌流閉回路の管５３をねじって取り付ける。バイオリアクタの上流のコネクタは、常に鉛直位置を保たなければならない（図１８）。

２．７バイオリアクタの下流のＴコネクタＴ３を、側方開口のキャップをねじって外すことによって開ける。

２．８灌流回路の管５４のコネクタからキャップを外し（図１９Ａ）、それをバイオリアクタの下流のＴコネクタの側方開口にねじ込む（図１９Ｂ）。

２．９灌流回路の管５４を塞いでいるクランプ１７１を取り外す（図２０）。

２．１０本発明において泡トラップという技術用語で規定された気泡除去要素（図２１、７１）を満たす。泡トラップは、キャップで閉じられたチャンバによって代表され、入口と出口の機能を有する２つの通路を有する要素よりなる。泡トラップのチャンバには、ある量の流体（この場合は温かい新しい培地）およびある量の空気が入っており、泡トラップのチャンバの２つの通路を通って流れる灌流の流体中のいかなる泡も捕捉する。

特定の量の空気を残すように温かい新しい培地で泡トラップを満たし、チャンバおよびその２つの通路をそれらのキャップで閉じる。

２．１１以下のように、その前にバイオリアクタ－足場システムに接続された灌流回路に泡トラップを接続する（図７）。
ａ．管５３を（灌流回路の管５３と管５２との間に配置された）ＴコネクタＴ１の側方端に接続するコネクタの近くに配置されたクランプで灌流回路の管５３を閉じて、それ（図７、５２）をねじって外す。
ｂ．灌流回路の管５３をキャップで閉じることが好ましい。この操作は、灌流回路の管５３が空になるのを防ぐ。
ｃ．（灌流回路の管５３と管５２との間に配置された）ＴコネクタＴ１の側方端の蓋をして、その上端を開ける。
ｄ．泡トラップのチャンバの入口通路を開けて、それをＴコネクタＴ１の鉛直方向の上端の通路に接続する。
ｅ．泡トラップの出口通路を開けて、それを灌流回路の管５３に接続する。管をねじらないように注意のこと。
ｆ．泡トラップを鉛直位置に保持する。
ｇ．灌流回路の管５３が泡トラップのチャンバに接続されるとすぐに、管５３からクランプ１７１を取り外す。ポンプを作動させて、バイオリアクタの上流のＴコネクタＴ２の上端のキャップを開けて、プロセス中に管５３に形成されたかもしれないすべての気泡を除去して、気泡が足場に達することを防ぐ。灌流回路とバイオリアクタ－足場システムよりなる組み立てられたシステムにポンプによって加えられた蠕動が足場の灌流を可能にする。
ｈ．これを確認した後、バイオリアクタの上流のＴコネクタＴ２をそのキャップで閉じる。

（３）第２の好ましい実施形態による、灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法（灌流方法）（図２２～図２７）
本接続方法は、播種（（１）項において上記した実施形態による、足場の内腔に細胞培養物を播種するための方法）後、内皮細胞の接着の２４時間後の以下の一連のステップに基づく。

３．１無菌状態を維持しながら、灌流回路の管（図２２、５１、５２、５３、５４、５５）と、本発明において泡トラップという技術用語で規定された気泡除去要素（図２２、ＢＴ）と、貯槽（図２２、５６）とを接続する。気泡除去要素または泡トラップ（ＢＴ：ｂｕｂｂｌｅｔｒａｐ）は、キャップで閉じられたチャンバ、好ましくはガラス製のチャンバによって代表され、入口の機能を有する、止め栓およびチューブクランプを有する通路（図２７、２１１）、および出口の機能を有する、チューブクランプのみ有する通路（図２７、２２１）の２つの非対称の通路を有する要素よりなる。泡トラップのチャンバには、ある量の流体（この場合は温かい新しい培地）およびある量の空気が入っており、泡トラップのチャンバの２つの通路を通って流れる灌流の流体中のいかなる泡も捕捉する。

３．２作動させると、流体を、この場合は温かい新しい培地を吸引および送出することができる蠕動力を発生する蠕動ポンプ（図２２、５７）の圧力がかかるように灌流閉回路のポンプループ配管（図２２、５２）を配置する。灌流閉回路は、貯槽（図２２、５６）に接続された灌流回路の管（図２２、５１）によって、温かい新しい培地が吸引および送出されて満たされる。この温かい新しい培地は前もって貯槽（図２２、５６）に注がれ、次いで貯槽は閉じられている。温かい新しい培地（上記で規定）が、灌流閉回路の管５５（図２２、５５）を経て貯槽に戻るまで、灌流回路のすべての管、泡トラップ（図２２、ＢＴ）、および貯槽（図２２、５６）を、温かい新しい培地などの灌流流体で満たす。ＢＴおよび貯槽は、特定の量の空気を残すように満たされなければならない。特に、前記泡トラップのチャンバが、前記新しい培地で満たされる容積の第１の部分と、空気で満たされる容積の第２の部分を有し、前記容積の前記第２の部分が、泡トラップ（ＢＴ）の前記入口通路（２１１）および前記出口通路（２１２）を通って流れる灌流流体（温かい新しい培地）中に存在する気泡を捕捉する機能を有するように、泡トラップ（図２２、ＢＴ）は満たされなければならない（図２２）。

３．３管５４を、好ましくはＢＴの近くの位置にあるクランプ（図２３、１７２）で塞ぎ（図２３）、（灌流回路の管に垂直な位置で）ＢＴの止め栓を閉じる。

３．４灌流回路と同じ無菌状態で、バイオリアクタ－足場システムを配置する。

３．５管５５を、好ましくは管５４との接続部Ｃ（図２３、Ｃ）の近くの位置にあるクランプ（図２３、１７１、図１７、１７１）で塞ぐ（図２３）。バイオリアクタの上流に配置されたＴコネクタＴ２（図４、Ｔ２）の上端および側方端を開ける。

３．６バイオリアクタの上流に配置されたＴコネクタＴ２（図４）の上端および側方端からキャップを取り外すとき、泡が形成されていれば、温かい新しい培地の同等な量を手で加える（パスツールピペットを用いることが好ましい）ことによって泡の形成を補償する（図１６）。

３．７閉じられた灌流回路の管５４（図２３）を鉛直位置に保持し、灌流回路の管５４（図２３）と管５５（図２３）との間のコネクタをねじって外し、好ましくは、灌流回路の管５５をキャップで蓋をする（図２４）。

３．８バイオリアクタの上流のＴコネクタＴ２（図２７）の側方通路につながるその開いた側方
端に灌流回路の管５４をねじって取り付ける（図２７）。バイオリアクタの上流のコネクタは、常に鉛直位置に保たなければならない（図１８または図２７）。

３．９バイオリアクタの下流のＴコネクタＴ３（図４）を、側方開口のキャップをねじって外すことによって開ける。

３．１０歯車Ｒ（図４）を静止した状態に保持して回転コネクタＴ３をＴコネクタＣＲ２（図４）と一緒にねじって外し、管５５のコネクタ（図２５）を足場支持部１４ａ（図１）の側方開口にねじって取り付ける（図２５）。

３．１１灌流回路の管５５を塞いでいるクランプ１７１を取り外す（図２６）。

３．１２灌流回路に接続された、播種されたバイオリアクタ－足場システムを約５％ＣＯ_２、約３７℃の状態で配置し、ポンプループ配管５２（図２７）を自由な位置に配置し、灌流回路の管と並行に配置された泡トラップＢＴ（図２７）の止め栓を開け、クランプ１７２（図２７）を取り外し、ポンプ（図２７、５７）を作動させる。灌流回路とバイオリアクタ－足場システムよりなる組み立てられたシステムにポンプによって加えられた蠕動が足場の灌流を可能にする。

本書で説明する接続方法（灌流方法）は、上記の第１の実施形態および第２の実施形態が両方とも、足場、好ましくは管状足場の灌流回路を播種されたバイオリアクタ－足場システムに接続することを可能にすることが有利である。この手順は、気泡の形成を防ぎ、万が一形成された場合には、バイオリアクタ－足場システムの、内皮細胞が播種された足場に泡が達するのを防ぐ。さらに、すでに灌流回路内にあるいかなる気泡も、回路自体にある泡トラップ（図２１、７１、図２７、ＢＴ）の存在のおかげで足場に達しない。このように、本出願者によって開発された方法は、足場の内腔内に気泡が全くないことを保証する。このシステムは、バイオリアクタの構成によって課せられた必要条件を満足する。本書で説明する詳細のすべては、本方法が操作者に依存しない、したがって機能的な内皮の構築の工業的なインビトロ産生での結果の再現性を保証する必要がある。さらに、この方法論によって、すべての作業が単純であるので無菌状態で行うことができる。さらに、この迅速で追跡可能な手順は、気泡が細胞に接触する危険性を減らし、したがって、足場、好ましくは管状足場の内腔に接着している内皮細胞を傷つけることを防ぐ。前記灌流方法によって、連続的（すなわち、コンフルエントな細胞の単層を有する）かつ機能的である内皮で被覆された内腔を有する足場を有する、工学的操作された血管組織／構築物を得ることが可能になる。

接続方法の実験的立証
灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法の評価に対する実験的分析は、足場、好ましくは管状足場における細胞培養物のための播種方法の評価に適用されたものと同じである。

本発明の文脈では、「灌流回路」（図５および図２２）は、管（図５、５１～５４または図２２、５１～５５）、貯槽（図５または図２２、５６）、蠕動ポンプ（図５、５５または図２２、５７）、および気泡を除去するための要素（図２１、７１または図２２、ＢＴ）の一式を意味する。気泡の除去のための前記要素は、播種されたバイオリアクタ－足場システムに灌流回路を接続する前に灌流回路にあってもよく（灌流方法の第２の実施形態）、または、その代わりに、播種されたバイオリアクタ－足場システムに灌流回路を接続した後に灌流回路に挿入されてもよい（灌流方法の第１の方法）。前記管は、生体適合性のものであり、バイオリアクタ１１内に固定された足場、好ましくは管状足場を、蠕動ポンプ（図５、５５、図２２、５７）（この場合、Easy-Load II 77200-62ヘッド（Masterflex（登録商標）、Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）を付けたMasterflex、Ｌ／Ｓデジタル送液ポンプ駆動装置０７５５１－２０、Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）によって灌流することができるように互いに接続される（図２１および図２７）。上記の、および図２７に示した灌流方法の第２の実施形態を参照すると、灌流回路は、主として、内径３／１６インチの５つの管よりなり、それらは貯槽から出る第１の吸入管５１、ポンプループ配管の第２の管５２、回路を泡トラップＢＴに接続する第３の管５３、ＢＴをバイオリアクタ－足場システムの上流のＴコネクタＴ２に接続する第４の管５４、バイオリアクタ－足場システムの下流のＴコネクタＴ３に接続された、貯槽５６に戻る第５の管５５である。

上記の、および図８に示した灌流方法の第１の実施形態を参照すると、管５１はポンプループ配管５２に、ポンプループ配管５２はＢＴに、ＢＴは管５３に、管５３はバイオリアクタ－足場システムの上流のＴコネクタＴ２に、管５４はバイオリアクタ－足場システムの下流のＴコネクタＴ３および貯槽５６に接続される。

貯槽（図５または図２２、５６）は、温かい新しい培地（例えば、Endothelial Growth Medium EGM、Sigma Aldrich）が入る要素であり、管５１（図５または図２２）はそこから吸入し、管５４（図５）または管５５（図２２）はそこに戻して、回路全体および播種されたバイオリアクタ－足場システムを閉回路に保つ。貯槽（図５または図２２、５６）は、貯槽のキャップに０．２２μｍのフィルタがあるため大気圧であり、このフィルタはその空気の無菌性を保証する。

以下の好ましい実施形態ＲＰｎもまた、下記で説明するように、本発明の主題である。

ＲＰ１．医療製品を試験するための、血管組織、好ましくは足場（図２、２１）の作製のためのプロセスであって、
－足場（図２、２１）の内腔に内皮細胞培養物を播種して、播種された足場を生じさせるための方法であって、前記播種された足場がバイオリアクタ（図４、１１）内にあって、播種されたバイオリアクタ－足場システムを生じさせる、方法と、その後に、
－前記播種された足場の内腔にある内皮細胞を灌流するための方法であって、灌流回路（図６、５１、５２、５３、５４、５５、および５６）を前記播種されたバイオリアクタ－足場システムに接続することにある、灌流方法と
を含むプロセス。

ＲＰ２．請求項ＲＰ１に記載のプロセスであって、足場の内腔に内皮細胞培養物を播種する前記方法が、
－足場（２１）、好ましくは電界紡糸絹フィブロインの管状足場を足場支持部（図１、１３、１３ａ、１３ｂ）の取付部に取り付けて、足場（２１）を有する前記足場支持部（１３）をバイオリアクタのチャンバ（１１）内に固定してバイオリアクタ（図４、１１）－足場（図４、２１）システムを生じさせるステップと、
－バイオリアクタチャンバ（１１）内の前記足場支持部（１３）に取り付けられた前記足場（２１）の内腔に新しい培地を注入するステップと、
－すでに前記培地を注入された、足場（２１）を有する前記足場支持部（１３）があるバイオリアクタチャンバ（１１）内に前記新しい培地を加えるステップと、
－２０℃から３０℃の間、好ましくは２５℃の温度で、好ましくは１時間から１８時間の間の時間、すでに前記培地を注入された、足場（２１）の内腔内、および足場（２１）を有する前記足場支持部（１３）があるバイオリアクタチャンバ（１１）内に前記培地を入れたままにするステップと、
－足場（２１）の内腔の内部、およびバイオリアクタチャンバの内部から培地を取り除くステップと、
－バイオリアクタ（１１）の上流に配置されたコネクタ要素（Ｔ２）に取り付けられたシリンジタイプの容器（図１０、９１）内の前記新しい培地、およびＨＵＶＥＣタイプの内皮細胞よりなる細胞懸濁物を要素（ＣＲ１）によって放出するステップであって、前記細胞懸濁物が気泡を発生しないでコネクタ（Ｔ２）内を下り、足場（２１）の内腔内にあるいかなる気泡もバイオリアクタ
（１１）の下流に配置されたコネクタ（Ｔ３）の開口に向けて押してシステムから出すことができる流速になるように、前記細胞懸濁物が、バイオリアクタ（１１）のチャンバ内にある足場（２１）の内腔に連続流で放出される、ステップと、
－前記細胞懸濁物が入っている、足場（２１）を有する前記足場支持部（１３）があるバイオリアクタチャンバ（１１）内に前記新しい培地を加えるステップと、
－好ましくは、５％ＣＯ_２の存在下、３７℃で２４時間の間、バイオリアクタチャンバ（１１）内に固定された足場（２１）をインキュベートするステップと
を含むプロセス。

ＲＰ３．ＲＰ１またはＲＰ２に記載のプロセスであって、前記播種された足場の内腔内の内皮細胞の前記灌流方法が、
－管（図５、５１、５２、５３、５４、５５、および５６）を備える灌流閉回路（図５）を用意するステップと、
－コネクタ（Ｃ）に近い位置にあるクランプタイプの閉止要素（図１７、１７１）で灌流回路の管（５４）を塞ぐステップと、
－灌流回路の管５３と管５４（図５、図１７）との間に配置されたコネクタ（Ｃ）をねじって外すステップと、
－バイオリアクタの上流のコネクタ（Ｔ２）の側方通路のその開いた側方端に灌流回路の管（５３）をねじって取り付けるステップ（図１８）と、
－バイオリアクタの下流のコネクタ（Ｔ３）を開けて、側方開口のキャップをねじって外すステップ（図１９ａ）と、
－無菌状態を維持しながら、灌流回路の管（５４）をバイオリアクタの下流のコネクタ（Ｔ３）の側方開口に接続して（図１９ｂ）、クランプタイプの閉止要素（図２０、１７１）を取り外すステップと
を含むプロセス。

ＲＰ４．ＲＰ３に記載のプロセスであって、入口（２１１）と出口（２１２）の機能を有する２つの通路を有する、キャップ（７２）で閉じられた泡トラップタイプのチャンバ（図２１）によって代表される要素（７１）が灌流回路（図８、図２１）の管（５３）内に挿入され、前記チャンバが容積を有し、その第１の部分が温かい新しい培地で満たされ、その第２の部分が空気で満たされ、前記通路（２１１および２１２）を通って流れる灌流流体内にあるいかなる気泡も後者の第２の部分に捕捉される、プロセス。

ＲＰ５．請求項ＲＰ１から４のいずれか一項に記載のプロセスであって、足場、好ましくは管状足場が、例えば、電界紡糸絹フィブロインあるいはＰＧＡ／ＰＬＡ（ポリグリコール酸／ポリ乳酸）またはＰＧＡ／ＰＣＬ（ポリグリコール酸／ポリカプロラクトン）のコポリマーなど、単一ポリマーまたはコポリマーから形成された天然または合成由来のポリマーの足場から選ばれた、プロセス。

ＲＰ６．ＲＰ１から５のいずれか一項に記載のプロセスであって、内皮細胞が、例えば、ＨＡＯＥＣ（ヒト大動脈内皮細胞）、ＨＣＡＥＣ（ヒト冠状動脈内皮細胞）、ＨＭＥＶＥＣ（ヒト皮膚微小血管内皮細胞）、またはＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）などの血管組織の内皮を構成する細胞の中から選択された、プロセス。

ＲＰ７．ＲＰ１から６のいずれか一項に記載のプロセスであって、培地がEndothelial Growth Medium（ＥＧＭ、Sigma Aldrich、２１１－５００）である、好ましくは３７℃に加熱されたものである、プロセス。

ＲＰ８．ＲＰ１から７のいずれか一項に記載のプロセスによって得られた、連続した機能的な内皮で被覆された内腔を有する足場。

ＲＰ９．例えば、心臓弁、ステント、グラフト、およびカテーテルなどの、心血管および末梢血管領域に使用するための医療製品のインビトロ前臨床試験および臨床試験を実施するための、ＲＰ８に記載の足場の使用。

実施および最適化する第１のステップは、細胞、好ましくは内皮細胞を播種するステップであり、その後、灌流回路をバイオリアクタおよび足場を備えるシステムに接続する第２の重要なステップが続き、その結果、連続した機能的な内皮のインビトロ産生のための工業化プロセスの信頼性、効率、および再現性が保証される。

工学的操作された血管組織／構築物の作製、好ましくは、コンフルエントな細胞の単層を有する機能的で連続した内皮で被覆された内腔を有する足場の作製のためのこの発明による工業化プロセスの成功は、主に、播種、および灌流回路とバイオリアクタ－足場システムとの接続の成功、その結果、システム全体から気泡を信頼性が高く再現可能に除去することにある。播種方法は、細胞供給源および細胞の密度、足場の化学的性質および空隙率、ならびに細胞懸濁物の注入時の足場の空洞から気泡を完全に除去することに依存する。一方、灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法は、組み立てられたシステムの無菌性が保たれること、および気泡が播種された足場と接触することができないことを保証することに基づく。気泡は、細胞を傷つけ、それらの活力を損ない、したがって足場の内皮化を妨げる可能性があるので、気泡の形成を避けなければならないことに留意されたい。

本発明の説明は、灌流回路をバイオリアクタ－足場システムに接続するための方法の選択が、その前に最適化された、内皮細胞を播種するための方法に依存することを示している。というのは、接続の前記方法が実験準備および灌流の要件に適合されなければならないからである。また、本発明の説明は、接続方法の選択が、インキュベータ内でのこのシステムに対して選ばれた位置の選択にも依存することを示している。

足場、好ましくは管状足場に播種するためのプロセスは、本発明の説明において示したように、コンフルエントな内皮を有する、機能的な工学的操作された血管構築物のインビトロ産生において重要な要素の一つである。このプロセスは、内腔での一様で均一な内皮細胞の分布、および前記細胞の表面への接着に関与している。本発明の説明は、任意のバイオリアクタ－足場システムに適合された最も適切な播種方法の選択が、プロセスの再現性を決めることを示し、結果の再現性におけるその利点を示している。

前臨床試験でさえ、また、それだけでなく、機能的な血管構築物の大規模作製のためには再現可能な方法が必要である。

したがって、本発明のよる播種方法は、明確で追跡可能であり、内皮細胞の接着においては非常に一様な分布、および結果の良好な再現性を保証し、前臨床試験だけでなく工業的な試験に対するモデルとして血管構築物のインビトロ作製に焦点を絞った研究を行っている試験所にとって必要である。

接着の２４時間後、足場、主として管状足場の内腔に接着している細胞は、均一な血管内皮を形成することができるように形態および活力を維持しなければならない。したがって、（形成しているときに）細胞の接着を変え、したがって成長している血管層を失う可能性がある接続プロセス中のいかなる細胞変化も防ぐことが重要である。

バイオリアクタを灌流回路に接続するための知られている方法は、内皮細胞を傷つけ、それらを部分的にでも内腔表面から引き離し、その結果、機能的な内皮層の形成は遅くなる、または妨げられる。さらに、バイオリアクタを灌流回路に接続するための知られている方法は、灌流時に接続管を（全体または部分的に）圧縮する、または曲げることによって形成されることがある気泡を全くなくすことを保証しない。気泡が播種された足場に達する前に気泡を除去することができる要素、例えば泡トラップを導入することによって、前記気泡と播種された足場との接触を完全に避けることが重要である。この不都合なことは、本発明によるプロセスによってうまく克服され、内皮細胞の一様な機能的な層、特にコンフルエントな細胞層で被覆された足場の内面が得られる。

１１バイオリアクタ
１３足場支持部
１３ａ足場支持部
１３ｂ足場支持部
１４ａ足場支持部
２１足場
４１バイオリアクタチャンバの上流の入口
４２バイオリアクタチャンバの下流開口
５１管
５２管
５３管
５４管
５５蠕動ポンプ
５６貯槽
５７蠕動ポンプ
７１気泡除去要素
７２キャップ
９１容器
１０１ピペット
１０２プランジャ
１７１閉止要素、クランプ
１７２クランプ
２１１入口通路
２１２出口通路
ＢＴ気泡除去要素
Ｃコネクタ
ＣＲ１回転コネクタ
ＣＲ２回転コネクタ
Ｔ１Ｔコネクタ
Ｔ２Ｔコネクタ
Ｔ３Ｔコネクタ

Claims

医療製品または獣医学的製品を試験するための、工学的操作された血管組織または構築物の作製のためのプロセスによって得られる、コンフルエントな細胞の単層を有する連続した機能的な内皮で被覆された内腔を有する足場（２１）であって、
前記プロセスは、
－足場（２１）の内腔に内皮細胞培養物を播種して、播種された足場（２１）を生じさせるための方法であって、前記播種された足場（２１）がバイオリアクタ（１１）内にあって、播種されたバイオリアクタ（１１）－足場（２１）システムを生じさせ、
－前記バイオリアクタ（１１）の上流に配置されたＴコネクタ（Ｔ２）に取り付けられた容器（９１）内の新しい培地および内皮細胞を含む細胞懸濁物の形態の前記内皮細胞培養物を回転コネクタ（ＣＲ１）によって放出するステップと、それに続いて、
－前記細胞懸濁物が気泡を発生しないで前記Ｔコネクタ（Ｔ２）内を下り、前記足場（２１）の前記内腔内にある気泡を前記バイオリアクタ（１１）の下流に配置されたＴコネクタ（Ｔ３）の開口に向けて押して出すことができる流速になるように、前記内皮細胞培養物を、前記バイオリアクタ（１１）のチャンバ内の前記足場（２１）の前記内腔に連続流で放出するステップと
を含む播種方法と、
引き続いて、
－３０℃から４５℃の間の温度の新しい培地で、前記播種された足場（２１）の前記内腔にある前記内皮細胞を灌流する方法であって、前記播種されたバイオリアクタ（１１）－足場（２１）システムに灌流回路（５１～５６）または（５１～５７およびＢＴ）を接続することによって実現され、
－前記灌流回路にある、前記気泡の除去のための要素（７１）または（ＢＴ）を前記新しい培地で部分的に満たすステップであって、前記気泡の除去のための前記要素（７１）または（ＢＴ）が、チャンバ、前記チャンバを閉じるキャップ、入口通路（２１１）、および出口通路（２１２）を備え、前記気泡の除去のための前記要素（７１またはＢＴ）が容積を有し、前記容積の第１の部分が前記新しい培地で満たされ、前記容積の第２の部分が空気で満たされ、前記容積の前記第２の部分が、前記入口通路（２１１）および前記出口通路（２１２）を通って流れる前記新しい培地内にある気泡を捕捉する機能を有する、ステップ
を含む灌流方法と
を適用することを特徴とする足場（２１）。
前記足場（２１）の前記内腔に前記内皮細胞培養物を播種する前記方法が、
－前記足場（２１）を足場支持部（１３、１３ａ、１３ｂ）の取付部に取り付けて、前記足場（２１）を有する前記足場支持部（１３、１３ａ、１３ｂ）をバイオリアクタチャンバ（１１）内に固定してバイオリアクタ（１１）－足場（２１）システムを生じさせるステップと、
それに続いて、
－前記バイオリアクタチャンバ（１１）内の前記足場支持部（１３）に留められた前記足場（２１）の前記内腔に前記新しい培地を注入するステップと、それに続いて、
－前記培地を注入された、前記足場（２１）を有する前記足場支持部（１３、１３ａ、１３ｂ）がある前記バイオリアクタチャンバ（１１）内に前記新しい培地を加えるステップと、それに続いて、
－２０℃から３０℃の間の温度で、１時間から１８時間の間の時間、前記培地を注入された、前記足場（２１）の前記内腔内、および前記足場（２１）を有する前記足場支持部（１３）がある前記バイオリアクタチャンバ（１１）内に前記培地を入れたままにするステップと、それに続いて、
－前記足場（２１）の前記内腔の内部、および前記バイオリアクタチャンバ（１１）の内部から前記培地を取り除くステップと、それに続いて、
－請求項１に記載の前記容器（９１）内の前記内皮細胞培養物を放出するステップと、それに続いて、
－前記細胞懸濁物を請求項１に記載の前記足場（２１）の前記内腔に放出するステップと、それに続いて、
－内腔に前記細胞懸濁物が入っている、前記播種された足場（２１）を有する前記足場支持部（１３）がある前記バイオリアクタチャンバ（１１）内に前記新しい培地を加えるステップと、それに続いて、
－前記バイオリアクタチャンバ（１１）内に固定された前記足場（２１）をインキュベートするステップと
を含むことを特徴とする請求項１に記載の足場（２１）。
前記播種された足場（２１）の前記内腔内の前記内皮細胞の前記灌流方法が、
－管（５１）、（５２）、（５３）、（５４）、および任意選択的に管（５５）を備える灌流閉回路を用意するステップと、
－コネクタ（Ｃ）の近くに配置された閉止要素（１７１）で前記灌流回路の前記管（５４）または（５５）を塞ぐステップと、それに続いて、
－前記灌流回路の前記管（５３）または前記管（５４）と前記管（５４）または前記管（５５）との間に配置された前記コネクタ（Ｃ）をねじって外すステップと、
－前記バイオリアクタ（１１）の上流の前記Ｔコネクタ（Ｔ２）の側方通路のその開いた側方端に前記灌流回路の前記管（５３）または（５４）をねじって取り付けるステップと、それに続いて、
－前記バイオリアクタ（１１）の下流の前記Ｔコネクタ（Ｔ３）を開けて、前記Ｔコネクタ（Ｔ３）の側方開口のキャップをねじって外すステップと、それに続いて、
－前記灌流回路の前記管（５４）または（５５）を前記バイオリアクタ（１１）の下流に配置された前記Ｔコネクタ（Ｔ３）の前記側方開口に接続して、前記閉止要素（１７１）を取り外すステップと、
－前記灌流回路の前記管（５３）とポンプループ配管の前記管（５２）との間に前記気泡の除去のための前記要素（７１）を挿入するステップと
を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の足場（２１）。
前記気泡の除去のための前記要素（７１）または（ＢＴ）が泡トラップであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の足場（２１）。
前記足場（２１）が、合成または天然由来のポリマーの足場から選ばれ、前記ポリマーの足場が、単一ポリマーまたはコポリマー、電界紡糸絹フィブロインあるいはポリグリコール酸／ポリ乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）またはポリグリコール酸／ポリカプロラクトン二酸（ＰＧＡ／ＰＣＬ）のコポリマーから形成されたことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の足場（２１）。
前記内皮細胞が、血管組織の内皮を構成する細胞、ＨＡＯＥＣ（ヒト大動脈内皮細胞）、ＨＣＡＥＣ（ヒト冠状動脈内皮細胞）、ＨＭＥＶＥＣ（ヒト皮膚微小血管内皮細胞）、またはＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）の中から選択されたことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の足場（２１）。
前記培地が、ウシ胎仔血清（２％）、アデニン（０．２μｇ／ｍｌ）、メタバナジン酸アンモニウム（０．０００６μｇ／ｍｌ）、アムホテリシンＢ（０．３μｇ／ｍｌ）、塩化カルシウム２Ｈ_２Ｏ（３００μｇ／ｍｌ）、塩酸コリン（２０μｇ／ｍｌ）、硫酸銅５Ｈ_２Ｏ（０．００２μｇ／ｍｌ）、チオクト酸ＤＬ－６，８（０．００３μｇ／ｍｌ）、ホリン酸（カルシウム）（０．６μｇ／ｍｌ）、ヘパリン（４μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（２μｇ／ｍｌ）、Ｌ－アスパラギン酸（１５μｇ／ｍｌ）、Ｌ－システイン（３０μｇ／ｍｌ）、Ｌ－チロシン（２０μｇ／ｍｌ）、硫酸第一マンガン一水和物（０．０００２μｇ／ｍｌ）、モリブデン酸アンモニウム４Ｈ_２Ｏ（０．００４μｇ／ｍｌ）、ニコチンアミド（８μｇ／ｍｌ）、塩化ニッケル６Ｈ_２Ｏ（０．０００１μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（６０μｇ／ｍｌ）、フェノールレッドナトリウム塩（１５μｇ／ｍｌ）、塩化カリウム（３００μｇ／ｍｌ）、プトレシン二塩酸塩（０．０００２μｇ／ｍｌ）、ピリドキシン塩酸塩（３μｇ／ｍｌ）、メタケイ酸ナトリウム９Ｈ_２Ｏ（３μｇ／ｍｌ）、硫酸ナトリウム７Ｈ_２Ｏ（２００μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（０．０１μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン硫酸塩（１００μｇ／ｍｌ）、塩酸チアミン（４μｇ／ｍｌ）、および硫酸亜鉛７Ｈ_２Ｏ（０．０００３μｇ／ｍｌ）を含むEndothelial Growth Mediumであることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の足場（２１）。
心血管および末梢血管領域、好ましくは、弁、心臓弁、ステント、グラフト、カテーテル、包帯、メッシュ、またはフィルタに使用される、動物に使用するための獣医学的製品のインビトロ前臨床試験または臨床試験を実施する際の、請求項１に記載の足場（２１）の使用。