JP2022035989A - 液状医療材料 - Google Patents

Abstract

【課題】常温でゾル状態を保ちながら、フィブリン糊よりも創傷被覆材及び止血材としての機能が高く、安全で、安価に製造可能な液状医療材料を提供する。
【解決手段】濃度０．２Ｍ以上１．０Ｍ以下のカルシウムを含む、濃度５重量％以上４０重量％以下、平均分子量８０，０００以上１２０，０００以下、かつ分子量分布２０，０００以上３００，０００以下のゼラチン水溶液と、ゼラチンの架橋を誘導するトランスグルタミナーゼとを含む。カルシウムは濃度０．２Ｍ以上０．７Ｍ以下であり、ゼラチンのブルームは１６０以上２５０以下であり、トランスグルタミナーゼの単位当たりの活性は３６～４００Ｕ/ｍｌであることが好ましい。
【選択図】図１

Description

本発明は、液状医療材料に関する。

生体の組織損傷による体液（血液、組織液など）漏出を防ぐ組織閉塞は、手術などの臨床上、重要な意味を持つ。損傷部からの体液漏出を効果的に抑えることは、患者の手術中の生命維持、術後の生活の質（ＱＯＬ）の向上につながる。

臨床においては、止血が重要視される。その理由として、以下が挙げられる。
１．失血は死亡の大きな要因の１つであり、失血要因には、重篤な外傷、動脈瘤、食道や胃における潰瘍、および食道静脈瘤の破裂などがある。特に、緊急に止血治療を受けることができない場合には、死亡の可能性が高くなる。
２．手術時における出血は、手術における大きな懸念の一つで、出血により、全身感染症や臓器の機能不全が生じる。また、出血は術野を妨げるだけでなく、出血した血液の除去は手術の遅延につながる。
３．出血は、最小侵襲手術（腹腔鏡下手術など）を行っている場合でも問題となり、出血を十分に抑制できない場合、切開手術に変更せざるをえない場合もある。

既存の止血方法としては、以下が挙げられる。
１．出血部の血管に直に圧迫する方法（圧迫止血）。この止血法の欠点は、時間と手間がかかり圧力を維持しておく必要がある点、また患者に血腫ができる恐れがある点である。
２．その他の物理的手段による止血方法として、出血部近傍をクランプ、クリップする方法、出血部にプラグやスポンジのようなものを乗せる方法がある。これらの止血法の欠点は、多数の微小血管から出血している場合に扱いが困難である点である。
３．熱によって血液を凝固させ、出血している血管を焼灼する方法（電気メス）。この方法の欠点は、周囲組織を熱損傷させ患者への侵襲が大きい点、医療用器具が必要で専門性を要する点である（医療機関以外では使用できない）。

既存の止血材としては、以下が挙げられる。
１．アルギン酸
２．ゼラチンスポンジ
３．コラーゲン線維
４．フィブリン糊。
５．自己組織合成ペプチド
上記のうちコラーゲン線維とフィブリン糊が効果的な止血材として、臨床でしばしば利用されている。

血管縫合は心臓・血管系手術だけでなく、一般的な腹腔内手術時にも必要になることがある。術後、血管縫合部からわずかな血液漏出があるため、それを持続的に抑える止血材が求められている。

胆汁婁・膵液婁は、胆道系手術、膵炎や膵臓手術などによって胆汁、膵液が漏れ出し、他の臓器に悪影響を及ぼす症状のことである。現在、胆汁や膵液の漏出を効果的に抑え、かつ臨床使用可能な物質は知られておらず、安全かつ効果的に胆汁婁・膵液婁を防ぐ方法が求められている。

肺において、肺胞の嚢包が破れる自然気胸や、肋骨骨折やカテーテル穿刺等の外傷性気胸などにより、空気が漏出する病状が知られている。症状によっては自然治癒を待つしかなく、患部に上層するだけで肺組織と接着し、嚢包の穴を塞ぐことが可能な方法は、気胸を治療する手段として、簡便かつ安全性が高い方法の一つと考えらえる。

内視鏡技術の発達により、病変部を内視鏡的に切除する技術が開発されてきている。特に食道、胃又は腸を含む消化管のポリープや早期がん（リンパ節転移がないと考えられている表層癌）等の病変部を内視鏡的に切除する手術法が確立されてきている。内視鏡的粘膜切除術では、一般的に病変部を含む粘膜下層に高張食塩水などを注入して病変部を隆起させ、切除部分を把持しながら電気メスなどにより病変部を含む組織の切除を行う。
当該手技において、病変部と固有筋層を引き離すために粘膜下層へ高張食塩水等の溶液を注入するが、食塩水等の粘性の低い溶液では病変部の隆起を手術中維持できないという問題点があり、患部の隆起を手術中維持可能な注入液が望まれている。

カテーテル療法の発達により、腫瘍や筋腫等の血流支配をうける病変部へ流入する動脈を閉塞させることにより、腫瘍や筋腫等を死滅させる手術方法が確立されてきている。具体的には、肝臓脈閉塞術、子宮動脈閉塞術、脳動脈閉塞術等を挙げることができる。
当該手技において、動脈を閉塞させるために、ウレタン前駆体やエチレンビニルアルコールなどの液体を注入するが、生体毒性が間違いなくあり、重篤でない限り使用が制限されている。そこで、感染の危険性がなく、かつ、生体毒性の低い注入液の開発が望まれている。
また、注入液は、抗癌剤や造影剤の添加が可能なものが求められている。

そこで、近年、その物理的、化学的、生物学的性質から、新規マテリアルとして注目を浴びている高度に制御された自己組織化ペプチドがある（特許文献１参照）。そのアミノ酸配列により、多数のペプチド分子が規則正しく並んだ自己会合体を形成する特性を有する。
自己組織化ペプチドは、電荷を帯びた親水性アミノ酸と電気的に中性な疎水性アミノ酸が交互に並び、正電荷と負電荷が交互に分布する構造をもち、生理的なｐＨと塩濃度においてβ構造をとる。

自己組織化ペプチドの止血への応用では、肝臓切開部末端から持続的な血液漏出が認められ、完全止血ができていない。止血が不完全な理由は、自己組織化ペプチドゲルと組織の接着が不十分なためと推測される。したがって、自己組織化ペプチドの止血効果を臨床応用可能なレベルにまで引き出すためには、さらなる改良が必要である。

フィブリン糊と同様に臨床で用いられている、ゼラチンに架橋剤であるホルムアルデヒドやグルタルアルデヒドなどを加えてゲル化させたポリアミン-アルデヒド系は、血管閉塞等の後遺障害の可能性や低分子アルデヒド類の高い神経・組織障害性が指摘されており、決して満足のいくようなものではない。

これらの問題点を克服すべく、多くの研究が実施されている。例えば、食品添加物を原料とするデキストランとε-ポリ-L-リジン（以下、単にε-PLLとも称する）を原料とする、架橋型シッフ塩基形成に基づく接着剤が研究されている（例えば、特許文献２参照）。

また、強度的に強い接着剤としてはクエン酸を活性エステル化した誘導体とコラーゲン等のタンパクを接着成分とする組織接着剤も研究されている（例えば、特許文献３参照）。

また、架橋可能なゼラチンとトランスグルタミナーゼとカルシウムと尿素とを、酢酸緩衝液及びクエン酸緩衝液を組合せた溶液中に含有する、創傷被覆材および止血材として使用可能な組成物が開示されている（例えば、特許文献４参照）。

ＷＯ２０１０／０４１６３６国際公開公報 国際公開第２００９／０５７８０２号 特開２００４－２６１２２２号公報 特開２０１１－５２５１２８号公報

しかしながら、特許文献１に記載の組織閉塞剤は、自己組織化ペプチドであるが、フィブリン糊よりも止血力が低いという課題があった。
また、特許文献２に記載のε-PLL原料の接着剤では、ゲル強度が市販止血剤であるフィブリン糊よりも劣り、止血材としての強度不足が懸念されるという課題があった。
また、特許文献３に記載の組織接着剤では、活性エステル化合物が化学的に不安定であり、水溶液での長期保存が不可能なため、使用直前に生体に悪影響を及ぼすリスクを有する溶媒に溶解させる必要性があり、さらに医師が外科手術などで緊急に使用するときにはすぐに使用できないために支障を来す可能性が高いという課題があった。
また、これらの接着剤は、非常に高価であるという課題があった。
特許文献４に記載のゼラチンとトランスグルタミナーゼとを使用した組成物は、ゲルを安定化するために尿素を必要とするので、製造工程が煩雑であり、さらに、安全性に問題があるという課題があった。

本発明は、このような課題に着目してなされたもので、常温でゾル状態を保ちながら、フィブリン糊よりも創傷被覆材及び止血材としての機能が高く、安全で、安価に製造可能な液状医療材料を提供することを目的としている。

前記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、至適な、ゼラチンの種類、ゼラチン濃度、カルシウム濃度が存在することを発見し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明に係る液状医療材料は、濃度０．２Ｍ以上１．０Ｍ以下のカルシウムを含む、濃度５重量％以上４０重量％以下、平均分子量８０，０００以上１２０，０００以下、かつ分子量分布２０，０００以上３００，０００以下のゼラチン水溶液と、前記ゼラチンの架橋を誘導するトランスグルタミナーゼとを含むことを、特徴とする。
本発明に係る液状医療材料において、前記カルシウムは濃度０．２Ｍ以上０．７Ｍ以下であり、前記ゼラチンのブルームは１６０以上２５０以下であり、前記トランスグルタミナーゼの単位当たりの活性は３６～４００Ｕ/ｍｌであることが好ましい。
本発明に係る液状医療材料は、前記ゼラチン水溶液中のゼラチン重量濃度［ｗｔ％］に対するカルシウム濃度［Ｍ］の割合が０．００５～０．０４０［Ｍ/ｗｔ％］であることが好ましい。
本発明に係る液状医療材料は、前記トランスグルタミナーゼとともに、ＤＥ値が１０以上２５以下、平均分子量が５０００より大きく２５０００以下のデキストランを含むことが好ましい。
本発明に係る液状医療材料は、前記トランスグルタミナーゼとともに、ＤＥ値が２５以上、平均分子量が５０００以下のデキストランを含むことが好ましい。
本発明に係る液状医療材料は、例えば、生体用組織接着剤、止血材、細胞保存液、臓器保存液、人工軟膏、歯槽骨再建剤、生体組織癒着防止剤、粘膜隆起剤、後出血防止剤、創傷被覆材、インプラント補助材料または血管内治療時の塞栓物質である。
本発明に係る液状医療材料は、特に、動脈止血材であることが好ましい。
本発明に係る液状医療材料は、常温でゾル状態を保ちながら、フィブリン糊よりも創傷被覆材及び止血材としての機能が高く、安全で、安価に製造可能である。

本発明によれば、常温でゾル状態を保ちながら、フィブリン糊よりも創傷被覆材及び止血材としての機能が高く、安全で、安価に製造可能な液状医療材料を提供することができる。

本発明の実施例の、トランスグルタミナーゼ活性が異なるサンプルを用いた時の止血材料の粘弾性変化を示すグラフである。 本発明の実施例の、トランスグルタミナーゼとともにデキストランを含む場合の（Ａ）ＤＥ値と止血機能との関係を示すグラフ、（Ｂ）平均分子量と止血機能との関係を示すグラフである。

以下、本発明の実施の形態の液状医療材料について説明する。
本発明の実施の形態の液状医療材料は、濃度０．２Ｍ以上１．０Ｍ以下のカルシウムを含む、濃度５重量％以上４０重量％以下、平均分子量８０，０００以上１２０，０００以下、かつ分子量分布２０，０００以上３００，０００以下のゼラチン水溶液と、ゼラチンの架橋を誘導するトランスグルタミナーゼとを含む。
カルシウムは濃度０．２Ｍ以上０．７Ｍ以下であり、ゼラチンのブルームは１６０以上２５０以下であり、トランスグルタミナーゼの単位当たりの活性は３６～４００Ｕ/ｍｌであることが好ましい。
カルシウムは、例えば、塩化カルシウム、炭酸カルシウムなどから成り、特に、塩化カルシウムから成ることが好ましい。
前記ゼラチン水溶液中のゼラチン重量濃度［ｗｔ％］に対するカルシウム濃度［Ｍ］の割合が０．００５～０．０４０［Ｍ/ｗｔ％］であることが好ましい。
トランスグルタミナーゼとともに、ＤＥ値が１０以上２５以下、平均分子量が５０００より大きく２５０００以下のデキストランを含むことが好ましい。
また、トランスグルタミナーゼとともに、ＤＥ値が２５以上、平均分子量が５０００以下のデキストランを含むことが好ましい。
本発明の実施の形態の液状医療材料は、例えば、生体用組織接着剤、止血材、細胞保存液、臓器保存液、人工軟膏、歯槽骨再建剤、生体組織癒着防止剤、粘膜隆起剤、後出血防止剤、創傷被覆材、インプラント補助材料または血管内治療時の塞栓物質である。
本発明の実施の形態の液状医療材料は、特に、動脈止血材であることが好ましい。
本発明において、「血液」は、ヒトの血液のほか、ヒト以外の血液であってもよい。

本発明の実施の形態の液状医療材料は、常温でゾル状態を保ちながら、フィブリン糊よりも創傷被覆材及び止血材としての機能が高く、安全で、安価に製造可能である。
本発明の実施の形態の液状医療材料は、２５℃の条件および生体内の３７℃前後の条件で、ゼラチン材料が固化（ゲル化）しておらず、トランスグルタミナーゼを添加した時に、３００秒以内、好ましくは９０秒以内、さらに好ましくは３０秒以内で固化させることができる。
特に、血液に使用したときには、血液がない状態よりも同等またはそれ以上の速さで固化させて、粘弾性が非常に高い膜を形成することができる。
創傷被覆に使用したときには、トランスグルタミナーゼを混合させた時、非常に速く固化させて、粘弾性が非常に高い膜を形成することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、「％」は重量％を意味する。

（試験１）
以下のゼラチン／カルシウム水溶液を作製した。
ゼラチンの種類：
Ａ：平均分子量１００，０００（分布が２０，０００～３００，０００）酸処理ゼラチン
Ｂ：平均分子量１００，０００（分布が２０，０００～３００，０００）アルカリ処理ゼラチン
Ｃ：平均分子量２０，０００ゼラチン（ポリペプチド）
Ｄ：分子量がほぼ１００，０００（分布が８０，０００～１２０，０００）ゼラチン
ゼラチン濃度：５～４０ｗｔ％(５、１０、２０、３０、４０ｗｔ％)
カルシウム濃度：０．０～１．０Ｍ（０、０．２、０．４、０．５、０．７、１．０Ｍ）
（１）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの５、１０、２０、３０、４０ｗｔ％ゼラチン／水溶液を作製した。
２５℃の条件下、Ａ、Ｂ、Ｄのゼラチン水溶液は５％濃度で固化した。Ｃのゼラチン水溶液は４０％でも固化せず、流動状態であった。
（２）Ａ、Ｂ、Ｄについて、表１に示すゼラチン濃度及びカルシウム濃度のゼラチン／カルシウム水溶液を作製した。
２５℃の条件下、それぞれのゼラチン／カルシウム水溶液の状態を観察し、固化、流動、強粘度のいずれかで評価した。
固化：サンプルを倒しても、水溶液が全く動かない状態
流動：サンプルを倒したら、水溶液が動き出す状態
強粘度：サンプルを倒したら、しばらくして少しずつ液面が動く状態。

以上の結果から、２５℃において、固化していない状態、すなわち、強粘度、流動状態の水溶液が選択される。その選択条件は、以下のとおりである。
＜条件＞
Ａ,Ｂ：０％＜適した条件≦４０％ゼラチン＜ゼラチン水溶液が作製される濃度まで
０．２Ｍカルシウム≦適した条件≦１．０Ｍカルシウム＜カルシウム水溶液が作製される濃度まで
Ｃ：０％＜適した条件≦４０％ゼラチン＜ゼラチン水溶液が作製される濃度まで
０Ｍカルシウム＜適した条件＜カルシウム水溶液が作製される濃度まで
Ｄ:０％＜適した条件＜４０％ゼラチン
０．２Ｍカルシウム≦適した条件≦１．０Ｍカルシウム＜カルシウム水溶液が作製される濃度まで

（試験２）
適したトランスグルタミナーゼの活性の範囲を調べるため、トランスグルタミナーゼ活性が異なるサンプルを用いた時の止血材料の粘弾性変化を測定した。
０．５ＭＣａＣｌ_２含有、２０％（ブルーム２５０、平均分子量１００，０００）ゼラチンを用いて、トランスグルタミナーゼ活性が異なるサンプルの評価を行った。表２に、各サンプルのトランスグルタミナーゼ活性を示す。図１に、粘弾性変化の測定結果を示す。

図１の結果から、止血材料の架橋剤に用いられるトランスグルタミナーゼは、トランスグルタミナーゼ活性［Ｕ/ｍｌ］が１７．２より高いものが好ましく、特に３４．４より高いものがより好ましいことがわかる。

（試験３）
血液粘弾性検査装置（商品名「ソノクロット」：サイエンコ社製）を用いて、止血材料の架橋評価試験を行った。トランスグルタミナーゼを添加後、架橋により相対粘弾性が上昇するその傾きをＫとし、それを比較した。
＜基本実験＞
表３に示すカルシウム含有ゼラチンと、相対活性が５１．６Ｕ/ｍｌのトランスグルタミナーゼを用いて実験を行った。その結果を表３の右欄に示す。

この結果から、既存特許に準じて作製した比較例１では、最初の粘弾性の伸びが悪く、時間がたっても、あまり固化しにくいのに対し、実施例１～３では、最初の粘弾性の伸びが良好で、固化しやすいことがわかる。

試験１のＢの２０％ゼラチン／０．２Ｍカルシウム水溶液（材料α）を選択して、トランスグルタミナーゼによる架橋試験を実施した。使用したトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）の活性と濃度を表４に示す。

材料α１００μＬに対して、それぞれ活性、濃度の異なるＴＧ５０μＬを添加し、撹拌し、固化時間を測定した。その結果を表５に示す。
表５の結果より、ＴＧとしてＴＧＡを選択した。

トランスグルタミナーゼおよび種々のゼラチン／カルシウム水溶液を用いて、架橋試験を行った。試験を行ったサンプルの条件を表６および表７に示す。

また、比較のため、特許文献４に基づき、参考例を以下のとおり準備し、同様に架橋試験を行った。
参考例１：２Ｍ尿素、１Ｍカルシウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウムを含む２５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液（ゼラチンはブタの酸処理ゼラチンでブルーム２７０）に、０．５Ｍ酢酸ナトリウムにカルシウム非依存性の微生物性トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）を溶解した７．５％（ｗ／ｗ）微生物性トランスグルタミナーゼ（味の素株式会社製：１０％ｗ／ｗ ｍＴＧ－ＡＣＴＩＶＡ－ＴＧ）溶液を混合して溶液を調製した。
参考例２：参考例１で、０．５Ｍ酢酸ナトリウムの代わりに０．５Ｍクエン酸ナトリウムを用いて溶液を調製した。

液状医療材料の機能としては、２５℃の条件下にて、架橋する前は、固まっておらず、混ぜても、不均一な塊が起こらず、架橋後の固化時間（元の状態から２乗以上の粘性になった時間(例えば、１０ｃｐｓ→１００ｃｐｓ）が３００秒以下、さらには９０秒以下、特に３０秒以下になるものが好ましい。
２５℃の条件下で固化せずに、８５秒で固化しないものは、直視術野での使用は難しいと考えられる。また、３００秒で固化しないものは、カテーテル術野での使用は難しいと考えられる。

血液１００μＬとＢの２０％ゼラチン／０．２Ｍカルシウム水溶液（材料α）１００μＬとトランスグルタミナーゼ５０μＬとを混合して、固化時間を測定した。試験を行ったサンプルの条件を表８に示す。

表８に示すとおり、２５℃の条件下で固化せずに、６０秒で固化しないものは、直視術野での止血、特に動脈止血は難しいと考えられる。また、２００秒で固化しないものは、カテーテル術野での止血は難しいと考えられる。

（試験４）
以下のゼラチン／カルシウム水溶液を作製した。平均分子量１００，０００（分布が２０，０００～３００，０００）アルカリ処理ゼラチン（ゼラチン濃度：２０ｗｔ％）／０．５Ｍカルシウム水溶液。このゼラチン水溶液を用いて、トランスグルタミナーゼによる架橋試験を実施した。
トランスグルタミナーゼ（ＴＧ）は、活性８６Ｕ／ｇ、濃度６ｍｇ／ｍｌ、多糖類濃度６００ｍｇ/ｍｌのもの（名称：ＴＧＡ、商品名：ＫＳ－ＯＴ（味の素社製））を使用し、含まれる多糖類を除去した後、以下の５種類のデキストランをそれぞれ６００ｍｇ/ｍｌ添加した。架橋試験の結果をそれぞれ右に示す。
（１）ＤＥ値３８、平均分子量４０００、多孔質有り：架橋反応が５分以内
（２）ＤＥ値１６、平均分子量１５０００、多孔質有り：架橋反応が３０秒以内
（３）ＤＥ値１０、平均分子量２５０００、多孔質有り：架橋反応した
（４）ＤＥ値１０、平均分子量２３０００、多孔質無し：架橋試験が行えなかった
（５）ＤＥ値１２、平均分子量２００００、多孔質無し：架橋試験が行えなかった
また、止血機能について、架橋試験が行えなかったものを１、架橋反応したものを２、架橋反応が５分以内のものを３、架橋反応が２分以内のものを４、架橋反応が３０秒以内のものを５と評価し、ＤＥ値と止血機能との関係を図２（Ａ）、平均分子量と止血機能との関係を図２（Ｂ）に示す。
以上の結果より、止血機能の観点から、トランスグルタミナーゼとともに、ＤＥ値が１０以上２５以下、平均分子量が５０００より大きく２５０００以下のデキストランを含むことが好ましいことがわかった。また、トランスグルタミナーゼとともに、ＤＥ値が２５以上、平均分子量が５０００以下のデキストランを含むものも好ましいことがわかった。

Claims (7)

1. 濃度０．２Ｍ以上１．０Ｍ以下のカルシウムを含む、濃度５重量％以上４０重量％以下、平均分子量８０，０００以上１２０，０００以下、かつ分子量分布２０，０００以上３００，０００以下のゼラチン水溶液と、前記ゼラチンの架橋を誘導するトランスグルタミナーゼとを含むことを、特徴とする液状医療材料。
2. 前記カルシウムは濃度０．２Ｍ以上０．７Ｍ以下であり、前記ゼラチンのブルームは１６０以上２５０以下であり、前記トランスグルタミナーゼの単位当たりの活性は３６～４００Ｕ/ｍｌであることを、特徴とする請求項１記載の液状医療材料。
3. 前記ゼラチン水溶液中のゼラチン重量濃度［ｗｔ％］に対するカルシウム濃度［Ｍ］の割合が０．００５～０．０４０［Ｍ/ｗｔ％］であることを、特徴とする請求項１または２記載の液状医療材料。
4. 前記トランスグルタミナーゼとともに、ＤＥ値が１０以上２５以下、平均分子量が５０００より大きく２５０００以下のデキストランを含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の液状医療材料。
5. 前記トランスグルタミナーゼとともに、ＤＥ値が２５以上、平均分子量が５０００以下のデキストランを含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の液状医療材料。
6. 生体用組織接着剤、止血材、細胞保存液、臓器保存液、人工軟膏、歯槽骨再建剤、生体組織癒着防止剤、粘膜隆起剤、後出血防止剤、創傷被覆材、インプラント補助材料または血管内治療時の塞栓物質であることを、特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の液状医療材料。
7. 動脈止血材であることを、特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の液状医療材料。
   
   

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