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JP2022034068A - 非ｅｒｋ ｍａｐｋ経路阻害剤耐性のがんを処置するための方法および組成物 - Google Patents

非ｅｒｋ ｍａｐｋ経路阻害剤耐性のがんを処置するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤耐性のがんを処置するための方法および組成物の提供。【解決手段】本発明は、とりわけ、対象において、非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤療法に対して抗療性または耐性であるがんを処置するかまたはその作用を改善するための方法、医薬組成物およびキットを提供する。ＥＲＫ阻害剤による療法から恩恵を受けるだろうがん対象を同定するための方法、および非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤に対して抗療性または耐性であるがん細胞でのＲＳＫのリン酸化を阻害するための方法も提供される。本方法は、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩を有効量で対象に投与することを含む。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１３年１２月２０日に出願された米国特許出願第６１／９１９，５５１号の利益を主張する、２０１４年１２月１９日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０７１７４９号の部分継続出願である、２０１６年５月２０日に出願された米国特許出願第１５／１６１，１３７号の利益を主張し、これらの全ては、それらの全体が、本明細書において完全に記載されているかのように参考として援用される。
本発明は、とりわけ、対象において、非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤療法に対して抗療性または耐性であるがんを処置するかまたはその作用を改善するための方法、医薬組成物およびキットを提供する。
配列表の参照による組込み
本出願は、２０１６年５月２０日に作成されたファイルサイズ３５１ＫＢの配列表テキストファイル「０３９８８５０ｐｃｔ．ｔｘｔ」として、これと並行して出願されたアミノ酸および／または核酸配列への参照も含有する。上記の配列表は、米国特許法施行規則§１．５２（ｅ）（５）に従って本明細書に参照により完全に組み込まれる。
分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達経路の構成成分を標的とする薬物阻害剤は、様々ながん、特にＢＲＡＦプロテインキナーゼに突然変異を有するがんにおいて臨床的有効性を示す。ＲＡＦおよびＭＥＫ阻害剤は、進行した転移性のＢＲＡＦ突然変異メラノーマにおける単剤使用のために承認されている。単独でまたは組合せにより、ＢＲＡＦおよびＭＥＫ阻害剤活性は他のがんでは予測不能であり、ＢＲＡＦ突然変異甲状腺および肺がんにおける有効性は有望であるが、ＢＲＡＦ突然変異結腸直腸がんにおいてはわずかな活性があるだけである。
他の標的化療法と同様に、ＲＡＦおよびＭＥＫ阻害剤への疾患応答のパターンは、薬物が使用されるがんに存在する固有の遺伝的不均一性によって影響されるようである。例えば、ＰＴＥＮおよびＰＩ３Ｋ細胞増殖シグナル伝達経路を活性化する他の変化を含むある特定の遺伝子改変は、ＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブにより処置されるＢＲＡＦ突然変異メラノーマにおいて不良な初期応答および／または比較的迅速な進行を予測できることが示されている。同様に、ＭＥＫ遺伝子座における直接的な突然変異は、ＢＲＡＦ、ＭＥＫまたは組合せ薬物処置の後に進行した腫瘍において出現するようである。ＲＡＳおよびＲＡＦ遺伝子増幅およびスプライシング突然変異からのいくつかのさらなる例は、腫瘍形成の多面作用が標的化薬物処置の選択圧に遭遇するときに後天性の薬物耐性が生成されることを示唆する。
上述を考慮すると、腫瘍形成経路の多様な節を理想的に阻害し、多様ながんゲノムの適応能力を超える選択圧の負荷を誘導することによって組合せにおいて有効でもあるだろう新規の標的化剤が必要とされている。本出願は、これらおよび他の必要性を満たすことを対象とする。
本発明の一実施形態は、対象において、非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤療法に対して抗療性または耐性であるがんを処置するかまたはその作用を改善するための方法である。本方法は、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩を有効量で対象に投与することを含む。
本発明の別の実施形態は、対象においてがんを処置するかまたはその作用を改善するための方法である。本方法は、
（ａ）ＢＲＡＦ阻害剤療法、ＭＥＫ阻害剤療法またはＢＲＡＦおよびＭＥＫ阻害剤療法に対して抗療性または耐性になったがんを有する対象を同定することと；
（ｂ）前記抗療性または耐性のがんを有する対象にＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩であるＥＲＫ阻害剤を有効量で投与することと
を含む。
本発明のさらなる実施形態は、対象においてＢＲＡＦ阻害剤療法、ＭＥＫ阻害剤療法、またはその両方に対して抗療性または耐性であるがんを処置するかまたはその作用を改善するための方法である。本方法は、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩を有効量で対象に投与することを含む。
本発明の別の実施形態は、ＥＲＫ阻害剤による療法から恩恵を受けるだろう、がんを有する対象を同定するための方法である。本方法は、
（ａ）対象から生体試料を得ることと、
（ｂ）対象が、以下のマーカー：
（ｉ）ＲＡＦアイソフォームの間のスイッチ、
（ｉｉ）受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）またはＮＲＡＳシグナル伝達の上方制御、
（ｉｉｉ）分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達の再活性化、
（ｉｖ）ＭＥＫ活性化突然変異の存在、
（ｖ）突然変異ＢＲＡＦの増幅、
（ｖｉ）ＳＴＡＴ３上方制御、
（ｖｉｉ）ＭＥＫへの阻害剤の結合を直接的に遮断するかまたは構成的ＭＥＫ活性につながるＭＥＫのアロステリックポケットにおける突然変異、
の１つまたは複数を有するかどうか判定するために試料をスクリーニングすることと
を含み、ここで、マーカーの１つまたは複数の存在は、対象のがんがＢＲＡＦおよび／またはＭＥＫ阻害剤療法に対して抗療性または耐性であること、ならびに、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩であるＥＲＫ阻害剤による療法から対象が恩恵を受けるだろうことを確認する。
本発明のさらなる実施形態は、対象において非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路療法に対して抗療性または耐性であるがんを処置するかまたはその作用を改善するための医薬組成物である。本組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤およびＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩の有効量を含む。
本発明の別の実施形態は、対象において非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路療法に対して抗療性または耐性であるがんを処置するかまたはその作用を改善するためのキットである。キットは、本発明による医薬組成物のいずれかを、その使用説明書と一緒にパックされた形で含む。
本発明の別の実施形態は、非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤に対して抗療性または耐性であるがん細胞でのＲＳＫのリン酸化を阻害するための方法である。本方法は、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩の有効量とがん細胞を、がん細胞でのＲＳＫのリン酸化が阻害されるのに十分な時間、接触させることを含む。
本発明の別の実施形態は、切除不能または転移性のＢＲＡＦ６００突然変異陽性メラノーマを有する対象を処置する方法であって、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩を６００ｍｇ ＢＩＤで対象に投与することを含む方法である。
本発明の別の実施形態は、切除不能または転移性のＢＲＡＦ６００突然変異陽性メラノーマを有する対象を処置するための組成物であって、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩の６００ｍｇ、および任意選択で薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含む組成物である。
本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１）
切除不能または転移性のＢＲＡＦ６００突然変異陽性メラノーマを有する対象を処置する方法であって、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩を６００ｍｇ ＢＩＤで前記対象に投与することを含む、方法。
（項目２）
前記突然変異がＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異である、項目１に記載の方法。
（項目３）
哺乳動物が、ヒト、霊長類、畜産動物および家畜からなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
哺乳動物がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記メラノーマがＭＡＰＫ活性を有する、項目１に記載の方法。
（項目６）
切除不能または転移性のＢＲＡＦ６００突然変異陽性メラノーマを有する対象を処置するための組成物であって、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩の６００ｍｇ、および任意選択で薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含む、組成物。
（項目７）
前記対象が哺乳動物である、項目６に記載の組成物。
（項目８）
哺乳動物が、ヒト、霊長類、畜産動物および家畜からなる群から選択される、項目６に記載の組成物。
（項目９）
哺乳動物がヒトである、項目６に記載の組成物。
（項目１０）
前記メラノーマがＭＡＰＫ活性を有する、項目６に記載の組成物。
（項目１１）
前記突然変異がＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異である、項目６に記載の組成物。
本特許または出願のファイルは、カラーで製作された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面（複数可）を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、要請し、必要な料金を支払えば、特許庁により提供されるであろう。
図１Ａ～図１Ｃは、１カ月目についてのヒト悪性メラノーマ細胞株（Ａ３７５細胞）における用量漸増試験の進行を示すグラフである。種々の処置（トラメチニブ（２型ＭＥＫ阻害剤）、ダブラフェニブ（ＢＲＡＦ阻害剤）、およびＢＶＤ－５２３（ＥＲＫ１／２阻害剤））は表示されている通りである。 同上。
図２Ａ～図２Ｈは、１カ月目における漸増薬剤（複数可）に対する感受性の変化を追跡する増殖アッセイの結果を示すグラフである。種々の処置（トラメチニブ、ダブラフェニブ、ＢＶＤ－５２３、およびパクリタキセル（pacitaxel））はグラフの上部に表示されている通りである。グラフの右側の説明は、用量漸増試験で生成した種々の細胞の型を示す。例えば、「ダブラフェニブ」とは、用量漸増試験の１カ月目からの最高用量のダブラフェニブを用いて処置された細胞を指す。親とは、薬物で処置されていない対照細胞を指す。図２Ａ、図２Ｃおよび図２Ｇは、対照に対して正規化したものであり、一方、図２Ｄ、図２Ｆおよび図２Ｈは未加工のデータを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図３Ａ～図３Ｄは、２カ月目についてのＡ３７５細胞における用量漸増試験の進行を示すグラフである。種々の処置（トラメチニブ、ダブラフェニブ、およびＢＶＤ－５２３）は表示されている通りである。 同上。
図４Ａ～図４Ｈは、２カ月目における漸増薬剤（複数可）に対する感受性の変化を追跡する増殖アッセイの結果を示す。種々の処置（トラメチニブ、ダブラフェニブ、ＢＶＤ－５２３、およびパクリタキセル）はグラフの上部に表示されている通りである。グラフの右側の説明は、用量漸増試験で生成した種々の細胞の型を示す。例えば、「ダブラフェニブ」とは、用量漸増試験の２カ月目からの最高用量のダブラフェニブを用いて処置された細胞を指す。親とは、薬物で処置されていない対照細胞を指す。図４Ａ、図４Ｃおよび図４Ｇは、対照に対して正規化したものであり、一方、図４Ｄ、図４Ｆおよび図４Ｈは未加工のデータを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図５Ａ～図５Ｈは、図４Ａ～図４Ｈからの親細胞株データおよびＢＶＤ－５２３細胞株データのみを示すグラフである。種々の処置（トラメチニブ、ダブラフェニブ、ＢＶＤ－５２３、およびパクリタキセル）は表示されている通りである。図５Ａ、図５Ｃおよび図５Ｇは、対照に対して正規化したものであり、一方、図５Ｄ、図５Ｆおよび図５Ｈは未加工のデータを示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図６Ａ～図６Ｄは、３カ月目についてのヒト悪性細胞株（Ａ３７５細胞）における用量漸増試験の進行を示すグラフである。種々の処置（トラメチニブ、ダブラフェニブ、およびＢＶＤ－５２３）は表示されている通りである。 同上。
図７は、用量漸増アッセイからのＤＭＳＯ対照ウェルにおいて増殖させた細胞に適用した増殖アッセイの結果を示すヒストグラムである。
図８Ａ～図８Ｄは、試験の３カ月目についての増殖アッセイを示す線グラフのセットである。種々の処置（トラメチニブ、ダブラフェニブ、ＢＶＤ－５２３、およびパクリタキセル）はグラフの上部に表示されている通りである。グラフの右側の説明は、用量漸増試験で生成した種々の細胞の型を示す。例えば、「ダブラフェニブ」とは、用量漸増試験の３カ月目からの最高用量のダブラフェニブを用いて処置された細胞を指す。親とは、薬物で処置されていない対照細胞を指す。 同上。 同上。 同上。
図９Ａ～図９Ｄは、図８Ａ～図８Ｄからの親細胞株データ、ダブラフェニブ細胞株データ、およびＢＶＤ－５２３細胞株データのみを示すグラフである。 同上。 同上。 同上。
図１０Ａは、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞におけるトラメチニブ／ダブラフェニブの組合せによる％阻害を示す用量マトリックスである。図１０Ｂは、トラメチニブ／ダブラフェニブの組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す用量マトリックスである。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞における、ダブラフェニブ単剤処置およびトラメチニブ単剤処置についての、ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を示すグラフである。図１０Ｅは、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞における、ダブラフェニブとトラメチニブの組合せ処置についての、ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を示すグラフである。 同上。 同上。 同上。
図１１Ａは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞におけるトラメチニブ／ダブラフェニブの組合せによる％阻害を示す用量マトリックスである。図１１Ｂは、トラメチニブ／ダブラフェニブの組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す用量マトリックスである。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞における、ダブラフェニブ単剤処置およびトラメチニブ単剤処置についての、ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を示すグラフである。図１１Ｅは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞における、ダブラフェニブとトラメチニブの組合せ処置についての、ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を示すグラフである。 同上。 同上。 同上。
図１２Ａは、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞におけるＢＶＤ－５２３／ダブラフェニブの組合せの％阻害を示す用量マトリックスである。図１２Ｂは、ＢＶＤ－５２３／ダブラフェニブの組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す用量マトリックスである。図１２Ｃおよび図１２Ｄは、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞における、ダブラフェニブ単剤処置およびＢＶＤ－５２３単剤処置についての、ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を示すグラフである。図１２Ｅは、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞における、ダブラフェニブおよびＢＶＤ－５２３の組合せ処置についての、ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を示すグラフである。 同上。 同上。 同上。
図１３Ａは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞におけるＢＶＤ－５２３／ダブラフェニブ組合せの％阻害を示す用量マトリックスである。図１３Ｂは、ＢＶＤ－５２３／ダブラフェニブの組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す用量マトリックスである。図１３Ｃおよび図１３Ｄは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞における、ダブラフェニブ単剤処置およびＢＶＤ－５２３単剤処置についての、ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を示すグラフである。図１３Ｅは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞における、ダブラフェニブおよびＢＶＤ－５２３の組合せ処置についての、ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を示すグラフである。 同上。 同上。 同上。
図１４Ａは、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞におけるトラメチニブ／ＢＶＤ－５２３の組合せの％阻害を示す用量マトリックスである。図１４Ｂは、トラメチニブ／ＢＶＤ－５２３の組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す用量マトリックスである。図１４Ｃおよび図１４Ｄは、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞における、ＢＶＤ－５２３単剤処置およびトラメチニブ単剤処置についての、ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を示すグラフである。図１４Ｅは、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞における、ＢＶＤ－５２３とトラメチニブの組合せ処置についての、ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を示すグラフである。 同上。 同上。 同上。
図１５Ａは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞におけるトラメチニブ／ＢＶＤ－５２３の組合せの％阻害を示す用量マトリックスである。図１５Ｂは、トラメチニブ／ＢＶＤ－５２３の組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す用量マトリックスである。図１５Ｃおよび図１５Ｄは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞における、ＢＶＤ－５２３単剤処置およびトラメチニブ単剤処置についての、ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を示すグラフである。図１５Ｅは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存能力アッセイを使用した、Ａ３７５細胞における、ＢＶＤ－５２３とトラメチニブの組合せ処置についての、ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を示すグラフである。 同上。 同上。 同上。
図１６Ａ～図１６Ｄは、種々の濃度（ｎＭを単位として）のＢＶＤ－５２３、ダブラフェニブ（Ｄａｂ）、およびトラメチニブ（Ｔｒａｍ）を用いて４時間処置した後のＡ３７５細胞におけるＭＡＰＫシグナル伝達のウェスタンブロット分析を示す画像のセットである。別段の指示がなければ、各レーンに総タンパク質４０μｇをロードした。本実験では、２連の試料を収集した。図１６Ａおよび図１６Ｂは、２連の試料からの結果を示す。同様に、図１６Ｃおよび図１６Ｄも、２連の試料からの結果を示す。図１６Ａおよび図１６Ｂにおいて、ｐＲＳＫ１は、Ａ３７５細胞において他のマーカーと比較して比較的弱いシグナルを有した。Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇからの異なるｐＲＳＫ１－Ｓ３８０抗体（カタログカタログ番号１１９８９）を試験したが、検出可能なシグナルはもたらされなかった（データは示していない）。図１６Ｃおよび図１６Ｄにおいて、ｐＣＲＡＦ－３３８により最小のシグナルがもたらされた。 同上。
図１７Ａ～図１７Ｄは、種々の濃度（ｎＭを単位として）のＢＶＤ－５２３、ダブラフェニブ（Ｄａｂ）、およびトラメチニブ（Ｔｒａｍ）を用いて４時間処置した後のヒト結腸直腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６細胞）におけるＭＡＰＫシグナル伝達のウェスタンブロット分析を示す画像のセットである。別段の指示がなければ、各レーンに総タンパク質４０μｇをロードした。本実験では、２連の試料を収集した。図１７Ａおよび図１７Ｂは、２連の試料からの結果を示す。同様に、図１７Ｃおよび図１７Ｄも、２連の試料からの結果を示す。図１７Ａおよび図１７Ｂにおいて、ｐＲＳＫ１レベルはＨＣＴ１１６細胞において非常に低いと思われ、図１７Ｃおよび図１７Ｄにおいて、ｐＣＲＡＦ－３３８シグナルも非常に弱いものであった。 同上。
図１８Ａ～図１８Ｄは、表示されている通り、種々の濃度（ｎＭを単位として）のＢＶＤ－５２３（「ＢＶＤ５２３」）、トラメチニブ（「ｔｒａｍ」）および／またはダブラフェニブ（「Ｄａｂ」）を用いて２４時間処置した後の、Ａ３７５メラノーマ細胞における細胞周期およびアポトーシスシグナル伝達のウェスタンブロット分析を示す画像のセットである。別段の指示がなければ、各レーンに総タンパク質５０μｇをロードした。本実験では、２連の試料を収集した。図１８Ａおよび図１８Ｂは、２連の試料からの結果を示す。同様に、図１８Ｃおよび図１８Ｄも、２連の試料からの結果を示す。図１８Ａおよび図１８Ｂにおいて、切断されたＰＡＲＰに対応するサイズ（８９ｋＤａ）のバンドは明らかでなかった。 同上。
図１９は、ＢＶＤ－５２３により、ｉｎ－ｖｉｖｏにおいて標的とされた薬物に対する獲得耐性を処置することができることを示す図である。患者由来の株ＳＴ０５２Ｃを、ＭＡＰＫ経路を対象とする療法を用いた１０カ月の療法後に進行したＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノーマ患者から単離した。ｅｘ ｖｉｖｏで処置して、ＳＴ０５２Ｃは、５０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤでダブラフェニブに対して獲得交差耐性を示した。その一方で、ＢＶＤ－５２３は、ＳＴ０５２Ｃにおいて、１００ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤで単剤として有効であった。
図２０は、本明細書で使用される用量漸増プロトコールを示すフローチャートである。
図２１は、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の概略図を示す図である。
図２２Ａ～図２２Ｅは、単剤増殖アッセイの結果を示すグラフである。ＢＶＤ－５２３（図２２Ａ）、ＳＣＨ７７２９８４（図２２Ｂ）、ダブラフェニブ（図２２Ｃ）、トラメチニブ（図２２Ｄ）、およびパクリタキセル（図２２Ｅ）を用いた処置についての増殖結果が示されている。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２３Ａ～図２３Ｏは、ＢＶＤ－５２３とダブラフェニブの組合せの結果を示す図である。図２３Ａは、ＲＫＯ親細胞における、組合せについての阻害（％）を示す用量マトリックスを示す。図２３Ｂ～図２３Ｃは、図２３Ａにおける組合せについての単剤増殖アッセイの結果を示す。図２３Ｄは、図２３Ａにおける組合せについてのＬｏｅｗｅ過剰を示し、図２３Ｅは、図２３Ａにおける組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す。図２３Ｆは、ＲＫＯ ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ／＋）－クローン１細胞における、組合せについての阻害（％）を示す用量マトリックスを示す。図２３Ｇ～図２３Ｈは、図２３Ｆにおける組合せについての単剤増殖アッセイの結果を示す。図２３Ｉは、図２３Ｆにおける組合せについてのＬｏｅｗｅ過剰を示し、図２３Ｊは、図２３Ｆにおける組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す。図２３Ｋは、ＲＫＯ ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ／＋）－クローン２細胞における、組合せについての阻害（％）を示す用量マトリックスを示す。図２３Ｌ～図２３Ｍは、図２３Ｋにおける組合せについての単剤増殖アッセイの結果を示す。図２３Ｎは、図２３Ｋにおける組合せについてのＬｏｅｗｅ過剰を示し、図２３Ｏは、図２３Ｋにおける組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２４Ａ～図２４Ｏは、ＳＣＨ７７２９８４とダブラフェニブの組合せの結果を示す。図２４Ａは、ＲＫＯ親細胞における、組合せについての阻害（％）を示す用量マトリックスを示す。図２４Ｂ～図２４Ｃは、図２４Ａにおける組合せについての単剤増殖アッセイの結果を示す。図２４Ｄは、図２４Ａにおける組合せについてのＬｏｅｗｅ過剰を示し、図２４Ｅは、図２４Ａにおける組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す。図２４Ｆは、ＲＫＯ ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ／＋）－クローン１細胞における、組合せについての阻害（％）を示す用量マトリックスを示す。図２４Ｇ～図２４Ｈは、図２４Ｆにおける組合せについての単剤増殖アッセイの結果を示す。図２４Ｉは、図２４Ｆにおける組合せについてのＬｏｅｗｅ過剰を示し、図２４Ｊは、図２４Ｆにおける組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す。図２４Ｋは、ＲＫＯ ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ／＋）－クローン２細胞における、組合せについての阻害（％）を示す用量マトリックスを示す。図２４Ｌ～図２４Ｍは、図２４Ｋにおける組合せについての単剤増殖アッセイの結果を示す。図２４Ｎは、図２４Ｋにおける組合せについてのＬｏｅｗｅ過剰を示し、図２４Ｏは、図２４Ｋにおける組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２５Ａ～図２５Ｏは、トラメチニブとダブラフェニブの組合せの結果を示す。図２５Ａは、ＲＫＯ親細胞における、組合せについての阻害（％）を示す用量マトリックスを示す。図２５Ｂ～図２５Ｃは、図２５Ａにおける組合せについての単剤増殖アッセイの結果を示す。図２５Ｄは、図２５Ａにおける組合せについてのＬｏｅｗｅ過剰を示し、図２５Ｅは、図２５Ａにおける組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す。図２５Ｆは、ＲＫＯ ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ／＋）－クローン１細胞における、組合せについての阻害（％）を示す用量マトリックスを示す。図２５Ｇ～図２５Ｈは、図２５Ｆにおける組合せについての単剤増殖アッセイの結果を示す。図２５Ｉは、図２５Ｆにおける組合せについてのＬｏｅｗｅ過剰を示し、図２５Ｊは、図２５Ｆにおける組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す。図２５Ｋは、ＲＫＯ ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ／＋）－クローン２細胞における、組合せについての阻害（％）を示す用量マトリックスを示す。図２５Ｌ～図２５Ｍは、図２５Ｋにおける組合せについての単剤増殖アッセイの結果を示す。図２５Ｎは、図２５Ｋにおける組合せについてのＬｏｅｗｅ過剰を示し、図２５Ｏは、図２５Ｋにおける組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２６Ａは、試験した組合せについてのＬｏｗｅ体積（Ｌｏｗｅ Ｖｏｌｕｍｅ）を示すグラフである。図２６Ｂは、試験した組合せについてのＢｌｉｓｓ体積（Ｂｌｉｓｓ Ｖｏｌｕｍｅ）を示すグラフである。図２６Ｃは、試験した組合せについての相乗性スコアを示すグラフである。 同上。
図２７Ａ～図２７Ｉは、ＭＥＫ獲得耐性におけるＭＡＰＫおよびエフェクター経路シグナル伝達の変化を示す図である。同質遺伝子型ＲＫＯ親細胞およびＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ／＋）細胞を化合物で４時間または２４時間処置し、次いで、示されている抗体を用いて免疫ブロッティングした。ダブラフェニブはＢＲＡＦ阻害剤であり、トラメチニブはＭＥＫ阻害剤である。図２７Ａは、ＲＫＯ ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ／＋）細胞におけるシグナル伝達の増大を示す。図２７Ｂ～図２７Ｃは、ＲＫＯ親細胞（２７Ｂ）およびＲＫＯ ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ／＋）細胞（２７Ｃ）における、実験１における４時間の処置（実施例７を参照されたい）の結果を示す。図２７Ｄ～図２７Ｅは、ＲＫＯ親細胞（２７Ｄ）およびＲＫＯ ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ／＋）細胞（２７Ｅ）における、実験２における４時間の処置（実施例７を参照されたい）の結果を示す。図２７Ｆ～図２７Ｇは、ＲＫＯ親細胞（２７Ｆ）およびＲＫＯ ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ／＋）細胞（２７Ｇ）における、実験２における４時間の処置（実施例７を参照されたい）の結果を示す。図２７Ｈ～図２７Ｉは、ＲＫＯ親細胞（２７Ｈ）およびＲＫＯ ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ／＋）細胞（２７Ｉ）における結果の要約を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２８Ａ～図２８Ｅは、ＢＶＤ－５２３とＳＣＨ７７２９８４の組合せの結果を示す。図２８Ａは、Ａ３７５細胞における組合せについての阻害（％）を示す用量マトリックスを示す。図２８Ｂ～図２８Ｃは、図２８Ａにおける組合せについての単剤増殖アッセイの結果を示す。図２８Ｄは、図２８Ａにおける組合せについてのＬｏｅｗｅ過剰を示し、図２８Ｅは、図２８Ａにおける組合せについてのＢｌｉｓｓ過剰を示す。 同上。
図２９Ａ～図２９Ｆは、新規のＥＲＫ１／２阻害剤ＢＶＤ－５２３（ウリキセルチニブ）の発見および特徴付けを示す図である。図２９Ａは、ＢＶＤ－５２３が可逆的ＡＴＰ競合的阻害を示すことを実証する。これは、図２９Ｂに示されている通り、ＡＴＰ濃度が上昇するにしたがってＥＲＫ２の阻害についてのＩＣ５０値が直線的に増加することによって実証される。図２９Ｃは、用量応答曲線の代表的なプロットを示し、図２９Ｄは、経時的なＩＣ５０のプロットを示す。図２９Ｅは、陰性対照タンパク質ｐ３８と比較した、ＢＶＤ－５２３のＥＲＫ２およびホスホ－ＥＲＫ２（ｐＥＲＫ２）への結合を示す。図２９Ｆは、ＥＲＫ阻害剤ＳＣＨ７７２９８４およびピラゾリルピロールと比較した、ＢＶＤ－５２３のＥＲＫ２への結合を示す。 同上。 同上。
図３０Ａ～図３０Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＢＶＤ ５２３により、細胞増殖が阻害され、カスパーゼ３活性およびカスパーゼ７活性が増強することを示す図である。図３０Ａは、ＢＶＤ－５２３が、ＲＡＳファミリーメンバーおよびＲＡＦに突然変異が存在することによって定義されるＭＡＰＫ経路突然変異を有する細胞において優先的活性を示すことを示す。さらに、図３０Ｂに示されている通り、ＢＶＤ－５２３により、細胞周期のＧ１期にある感受性細胞株が遮断される。図３０Ｃは、ＢＶＤ－５２３により、Ａ３７５、ＷＭ２６６、およびＬＳ４１１Ｎがん細胞株において、７２時間の曝露後に、カスパーゼ活性の濃度依存的かつ時間依存的増大が誘導されたことを示す。図３０Ｄは、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体Ａ３７５細胞において、ＭＡＰＫ経路およびエフェクタータンパク質が、短時間（４時間）および長時間（２４時間）のＢＶＤ－５２３による処置によってモジュレートされることを示す。 同上。 同上。
図３１Ａ～図３１Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＢＶＤ－５２３抗腫瘍活性を示すグラフである。ＢＶＤ－５２３単剤療法により、（図３１Ａ）Ａ３７５および（図３１Ｂ）Ｃｏｌｏ２０５細胞株異種移植モデルにおける腫瘍増殖が阻害される（ａＰ＜０．０００１、ビヒクル対照；１４日目および１８日目にのみ投薬したＣＰＴ－１１と比較して）。略語：ＢＩＤ、１日２回；ＣＭＣ、カルボキシメチルセルロース；ＱＤ、毎日；Ｑ４Ｄ、４日毎。図３１Ｃは、Ｃｏｌｏ２０５異種移植片では、ＥＲＫ１／２リン酸化の増加がＢＶＤ－５２３濃度と相関することを示す。 同上。 同上。
図３２Ａは、ＥＲＫ１／２阻害剤のシグナル伝達への影響を示す図である。ＲＰＰＡを使用して、ＥＲＫ１／２阻害剤ＢＶＤ－５２３（ＢＶＤ）、Ｖｘ１１ｅ（Ｖｘ）、ＧＤＣ－０９９４（ＧＤＣ）、またはＳＣＨ７２２９８４（ＳＣＨ）を用いた処置後の細胞株（Ａ３７５、ＡＮ３Ｃａ、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９およびＭＩＡＰａｃａ２）において、タンパク質に対する影響を測定する。図３２Ｂは、ＥＲＫ阻害剤ＢＶＤ－５２３、ＧＤＣ－０９９４、およびＶｘ１１ｅが、ＳＣＨ７２２９８４と比較して、ホスホ－ＥＲＫ（ＥＲＫ １／２ Ｔ２０２ Ｙ２０４）に対して示差的な影響を有することを示す図である。ホスホ－ＲＳＫ（ｐ９０ ＲＳＫ ３８０）およびサイクリンＤ１は、試験したＥＲＫ阻害剤によって阻害される。略語：ＢＲＡＦｉ、ＢＲＡＦ阻害剤；ＭＥＫｉ、ＭＥＫ阻害剤。図３２Ｃは、ＢＶＤ－５２３、トラメチニブ、ＳＣＨ７２２９８４、またはダブラフェニブを用いて処置した後のＲＫＯ細胞株からの細胞画分および核画分のウェスタンブロットアッセイを示す図である。ヒストンＨ３（核に局在するタンパク質）およびＨＳＰ９０（細胞質に局在するタンパク質）を核画分および細胞質画分が適正に富化されていることを確認するための陽性対照として含めた；核画分はＨ３を多く有し、細胞質画分はＨＳＰ９０をより多く有する。 同上。 同上。
図３３は、ＥＲＫ阻害剤ＢＶＤ－５２３、Ｖｘ１１、ＧＤＣ－０９９４、およびＳＣＨ７７２９８４（ＳＣＨ）が、細胞株依存性のホスホ－ＡＴＫレベルの変化を示すことを示す図である。略語：ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド。
図３４Ａ～図３４Ｄは、ＢＶＤ－５２３が、ＢＲＡＦ／ＭＥＫ阻害に対して耐性のモデルにおいて活性を示すことを示す図である。薬物濃度上昇への曝露後のＢＲＡＦＶ６００ＥＡ３７５細胞におけるＢＶＤ－５２３、ダブラフェニブ、またはトラメチニブに対する耐性の出現が示されている。耐性の獲得の動態が処置間で確実に同等になるように、厳密な「基準」のセットを適用して、いつ用量を増加させることができるかを判定した。実施例１を参照されたい。時間がＩＣ５０の乗数に対して示されている；プロットされた線上の各点は、培地または細胞分割の変化を表す。図３４Ａは、細胞をＢＶＤ－５２３の存在下で増殖に適合させることが、ダブラフェニブまたはトラメチニブのいずれかを用いた場合よりも困難であったことを示す。図３４Ｂは、ＢＲＡＦ阻害（ダブラフェニブ）＋ＭＥＫ阻害（トラメチニブ）の組合せに対する耐性を獲得するように培養したＡ３７５細胞においてＢＶＤ－５２３感受性が保持されることを示す。図３４Ｃでは、細胞を化合物で９６時間処置し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）を使用して生存能力を評価した。ＢＲＡＦ阻害剤（ダブラフェニブ）およびＭＥＫ阻害剤（トラメチニブ）に対して交差耐性のＢＲＡＦＶ６００ＥＲＫＯ細胞では、ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐの内在性ヘテロ接合性ノックインに起因して、ＢＶＤ－５２３活性が保持される。図３４Ｄは、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体細胞株ＲＫＯにおけるｐＲＳＫのＢＶＤ－５２３による阻害が、ＭＥＫ阻害およびＢＲＡＦ阻害に対する耐性を付与するＭＥＫ１Ｑ５６Ｐの存在下で維持されることを示す。ＳＷ４８細胞株へのＫＲＡＳ突然変異体対立遺伝子のノックインにより、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブおよびセルメチニブに対する感受性は有意に減弱するが、一方、比較的に、ＢＶＤ－５２３に対する感受性は保持される。 同上。 同上。 同上。
図３５Ａは、ベムラフェニブ－再発患者に由来する異種移植片におけるＢＶＤ－５２３のｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。ＢＶＤ－５２３、１００ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、単独、ダブラフェニブ、５０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ、単独、およびＢＶＤ－５２３、１００ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤ＋ダブラフェニブ、５０ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤについての平均腫瘍体積（±ＳＥＭ）が示されている。略語：ＢＩＤ、１日２回；ＳＥＭ、標準誤差。
図３６Ａ～図３６Ｄは、ＢＶＤ－５２３およびＢＲＡＦ阻害の組合せの利益を示すグラフである。図３６Ａ～図３６Ｂは、腫瘍の出発体積が７５～１４４ｍｍ３であるＡ３７５ ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体メラノーマ細胞株異種移植モデルにおいて、ＢＶＤ－５２３＋ダブラフェニブの組合せが、いずれかの薬剤を単独で用いた処置と比較して優れた抗腫瘍活性を示したことを示す。図３６Ｃ～図３６Ｄは、投薬開始時の腫瘍体積が大きな（７００～８００ｍｍ３）同じモデルからの同様のデータを示す。平均腫瘍増殖のプロット（左側のパネル）およびカプラン・マイヤー生存（右側のパネル）が各試験について示されている。略語：ＢＩＤ、１日２回；ＱＤ、１日１回。 同上。
図３７Ａは、パクリタキセルに応答するようにＫＲＡＳ対立遺伝子を用いて工学的に操作されたＳＷ４８結腸直腸細胞が対照と比較して変化しなかったことを示すグラフである。図３７Ｂは、濃度の８×１０マトリックスを使用し、Ｌｏｅｗｅ相加性（Ｌｏｅｗｅ Ａｄｄｉｔｉｖｉｔｙ）およびＢｌｉｓｓ独立モデル（Ｂｌｉｓｓ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ Ｍｏｄｅｌ）を使用して評価し、Ｈｏｒｉｚｏｎ’ｓ Ｃｈａｌｉｃｅ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析したＢＶＤ－５２３とベムラフェニブの組合せ相互作用を示す。Ｃｈａｌｉｃｅにより、潜在的な相乗性相互作用を、用量マトリックスにわたって相加性であると予測されたものに対する算出された過剰阻害をヒートマップとして示すことによって、および定量的「相乗性スコア」をＬｏｅｗｅモデルに基づいて報告することによって同定することが可能になる。結果から、ＢＶＤ－５２３とベムラフェニブとの間の相互作用が少なくとも相加性であり、一部の場合では、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を有するメラノーマ細胞株において相乗性であることが示唆される。図３７Ｃは、ＢＶＤ－５２３とダブラフェニブの組合せにより、Ａ３７５ ＢＲＡＦＶ６００Ｅメラノーマ細胞における獲得耐性の発生が著しく遅延することを示すグラフである。漸増濃度のダブラフェニブ単独、またはＢＶＤ－５２３もしくはトラメチニブとの組合せに応答した耐性の時間的獲得を評価した。用量をいつ増加させることができるかに関しては、適応動態が処置間で確実に同等になるように、厳密な基準を適用した。実施例１を参照されたい。 同上。 同上。
図３８は、ＢＶＤ－５２３により、ヒト全血において、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるＰＭＡにより刺激されるＲＳＫ１／２リン酸化が阻害されることを示すグラフである。ＢＶＤ－５２３濃度データセットの平均が（－）により示されている。各濃度のＢＶＤ－５２３についてｎ＝２０。略語：ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞；ＲＳＫ、リボソームＳ６キナーゼ。
図３９Ａは、定常状態ＢＶＤ－５２３薬物動態（サイクル１、１５日目）を示すグラフである。赤色の破線は、ＥＣ５０ ２００ｎｇ／ｍＬ ＨＷＢを示す。略語：ＡＵＣ、曲線下面積；ＢＩＤ、１日２回；Ｃｍａｘ、最大濃度；ＥＣ５０、５０％最大有効濃度；ＨＷＢ、ヒト全血；ＳＤ、標準偏差。図３９Ｂは、ヒト全血におけるＢＶＤ－５２３によるＥＲＫリン酸化の薬力学的阻害を示すグラフである。略語：ＢＩＤ、１日２回；ｐＲＳＫ、ホスホ－ＲＳＫ；ＲＳＫ、リボソームＳ６キナーゼ。 同上。
図４０Ａは、ＢＶＤ－５２３で処置された患者における最良のＸ線撮影応答を示す図である。≧１用量の試験処置を受け、＞１処置中の腫瘍評価を有した、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１により測定される疾患を有する全ての患者を含めた（２５／２７；２名は標的病変に関する両方のスキャンを受けなかった）。応答を各標的病変の最長直径の合計のベースラインからの変化として測定した。示されている用量は、患者が応答時に受けていた用量である。破線は、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１に従った部分奏効の閾値を示す。略語：ＣＲＣ、結腸直腸がん；ＮＥＴ、神経内分泌腫瘍；ＮＳＣＬＣ、非小細胞肺がん；ＮＳＧＣＴ、非セミノーマ胚細胞性腫瘍；ＰＮＥＴ、膵臓ＮＥＴ；ＰＴＣ、甲状腺乳頭がん；ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１、固形がんの治療効果判定基準バージョン１．１；ＳＬＤ、最も大きな直径の合計。図４０Ｂは、ＢＶＤ－５２３を用いて処置された、ＢＲＡＦ突然変異体メラノーマを有する６１歳の患者において確認された部分奏効のコンピュータ化断層撮影走査を示す図である。 同上。
図４１は、腫瘍応答および腫瘍の進行を示す図である。応答が評価可能なＢＶＤ－５２３で処置された患者における腫瘍応答、腫瘍の進行、および処置の持続時間のスイマープロットが示されている。垂直方向の軸の起点は、ランダム化日または参照開始日に対応する。分析カットオフ日：２０１５年１２月１日。略語：ＢＩＤ、１日２回。
本発明の一実施形態は、対象において、非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤療法に対して抗療性または耐性であるがんを処置するかまたはその作用を改善するための方法である。本方法は、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩を有効量で対象に投与することを含む。
本明細書で使用するように、用語「処置する」、「処置すること」、「処置」およびその文法上の変形体は、個々の対象を、その対象、例えば患者において生理的応答または転帰を得ることが望まれるプロトコール、レジメン、過程または治療手段に供することを意味する。特に、本発明の方法および組成物は、疾患症状の発達を遅くするために、または疾患もしくは状態の発症を遅延させるために、または疾患発達の進行を停止させるために使用することができる。しかし、あらゆる処置対象が特定の処置プロトコール、レジメン、過程または治療手段に応答することができるとは限らないので、処置は、所望の生理的応答または転帰がどの対象または対象集団、例えば患者集団においても達成されることを必要としない。したがって、所与の対象または対象集団、例えば患者集団は、処置に応答しないかまたは不十分に応答することがある。
本明細書で使用するように、用語「改善する」、「改善すること」およびその文法上の変形体は、対象における疾患の症状の重症度を低下させることを意味する。
本明細書で使用するように、「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。ヒトに加えて、本発明の範囲内の哺乳動物のカテゴリーには、例えば、畜産動物、家畜、実験動物等が含まれる。畜産動物の一部の例には、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ等が含まれる。家畜の一部の例には、イヌ、ネコ等が含まれる。実験動物の一部の例には、霊長類、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等が含まれる。
本発明では、ＢＶＤ－５２３は、式（Ｉ）：
Figure 2022034068000001
 による化合物、および薬学的に許容されるその塩に対応する。ＢＶＤ－５２３は、例えば、米国特許第７，３５４，９３９号に開示される方法によって合成することができる。ＢＶＤ－５２３の鏡像異性体および両方の鏡像異性体のラセミ混合物も、本発明の範囲内であると考える。ＢＶＤ－５２３はユニークであり、ある特定の他のＥＲＫ１／２阻害剤、例えば、ＳＣＨ７７２９８４およびHatzivassiliouら（２０１２年）によって使用されるピリミジン構造体と異なると考えられている作用機構を有するＥＲＫ１／２阻害剤である。例えば、他のＥＲＫ１／２阻害剤、例えばＳＣＨ７７２９８４は、ＥＲＫの自己リン酸化を阻害する（Morrisら、２０１３年）が、ＢＶＤ－５２３はＥＲＫの自己リン酸化を可能にしつつなおＥＲＫを阻害する（例えば、図１８を参照）。
本明細書で使用するように、「耐性」および「抗療性」という単語は、互換的に使用される。非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤療法処置に対して「耐性である」とは、非ＥＲＫ ＭＡＰＫ阻害剤は、がんの処置における有効性が低減したことを意味する。
本明細書で使用するように、「非ＥＲＫ ＭＡＰＫ阻害剤」は、ＥＲＫ１／２阻害剤を除いて、細胞増殖の低減または細胞死の増加をもたらすＭＡＰＫ経路のタンパク質または他のメンバーの活性、発現またはリン酸化を低減する任意の物質を意味する。本明細書で使用するように、「ＥＲＫ１／２阻害剤」は、（ｉ）例えばＥＲＫ１／２に結合することによって、ＥＲＫ１および／またはＥＲＫ２と直接的に相互作用する、ならびに（ｉｉ）ＥＲＫ１および／またはＥＲＫ２プロテインキナーゼの発現または活性を減少させる物質を意味する。したがって、ＥＲＫ１／２の上流で作用する阻害剤、例えばＭＥＫ阻害剤およびＲＡＦ阻害剤は、本発明によるＥＲＫ１／２阻害剤ではない（しかし、それらは非ＥＲＫ ＭＡＰＫ阻害剤である）。本発明によるＥＲＫ１／２阻害剤の非限定的な例には、ＡＥＺＳ－１３１（Ａｅｔｅｒｎａ Ｚｅｎｔａｒｉｓ）、ＡＥＺＳ－１３６（Ａｅｔｅｒｎａ Ｚｅｎｔａｒｉｓ）、ＢＶＤ－５２３（ＢｉｏＭｅｄ Ｖａｌｌｅｙ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ＳＣＨ－７２２９８４（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．）、ＳＣＨ－７７２９８４（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．）、ＳＣＨ－９００３５３（ＭＫ－８３５３）（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．）、薬学的に許容されるその塩、およびその組合せが含まれる。
哺乳動物のＭＡＰＫカスケードの概要を、図２１に示す。ＭＡＰＫ経路は、例えば、Akinleyeら、２０１３年にレビューされる。簡潔には、図２１のＥＲＫ１／２モジュール（淡紫色のボックス）に関して、ＭＡＰＫ１／２シグナル伝達カスケードは、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に結合するリガンドによって活性化される。活性化受容体はアダプタータンパク質Ｇｒｂ２およびＳＯＳを動員し、リン酸化し、それらは次に膜結合ＧＴＰアーゼＲａｓと相互作用し、その活性化を引き起こす。その活性化ＧＴＰ結合形態、Ｒａｓは、ＲＡＦキナーゼ（Ａ－ＲＡＦ、Ｂ－ＲＡＦおよびＣ－ＲＡＦ／ＲＡＦ－１）を動員し、活性化する。活性化ＲＡＦキナーゼはＭＡＰＫ１／２（ＭＫＫ１／２）を活性化し、それはＥＲＫ１／２の活性化配列Ｔｈｒ－Ｇｌｕ－Ｔｙｒのトレオニンおよびチロシン残基のリン酸化を代わって触媒する。ＪＮＫ／ｐ３８モジュール（図２１の黄色のボックス）に関して、上流のキナーゼＭＡＰ３Ｋ、例えば、ＭＥＫＫ１／４、ＡＳＫ１／２およびＭＬＫ１／２／３は、ＭＡＰ２Ｋ３／６（ＭＫＫ３／６）、ＭＡＰ２Ｋ４（ＭＫＫ４）およびＭＡＰ２Ｋ７（ＭＫＫ７）を活性化する。これらのＭＡＰ２Ｋは、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２およびＪＮＫ３を含むＪＮＫプロテインキナーゼ、ならびにｐ３８α／β／γ／δを次に活性化する。それらの機能を実行するために、ｃ－Ｊｕｎ、ＡＴＦ－２、ＮＦ－ＡＴｃ１、ＨＳＦ－１およびＳＴＡＴ３を含むいくつかの転写因子をＪＮＫは活性化する。ＥＲＫ５モジュール（図２１の青色のボックス）に関して、ＭＡＰ２Ｋ５の上流のキナーゼ（ＭＫＫ５）は、ＭＥＫＫ２およびＭＥＫＫ３である。ＭＥＫ５の最も特徴付けられた下流の標的は、他のＭＡＰＫのサイズの２倍であるので大きいＭＡＰキナーゼ１（ＢＭＫ１）としても知られる、ＥＲＫ５である。
本発明による非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤の非限定的な例には、ＲＡＳ阻害剤、ＲＡＦ阻害剤（例えば、Ａ－ＲＡＦ、Ｂ－ＲＡＦ、Ｃ－ＲＡＦ（ＲＡＦ－１）の阻害剤）、ＭＥＫ阻害剤およびその組合せが含まれる。好ましくは、非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびその組合せである。
本明細書で使用するように、「ＲＡＳ阻害剤」は、（ｉ）例えばＲＡＳに結合することによってＲＡＳと直接的に相互作用する、および（ｉｉ）ＲＡＳの発現または活性を低下させる物質を意味する。非限定的で例示的なＲＡＳ阻害剤には、限定されずに、Ｍａｕｒｅｒ（Maurerら、２０１２年）によって開示されるファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、チピファルニブおよびロナファルニブ）、ファルネシル基含有小分子（例えば、サリラシブおよびＴＬＮ－４６０１）、ＤＣＡＩ、Ｓｈｉｍａ（Shimaら、２０１３
年）に開示されるＫｏｂｅ００６５およびＫｏｂｅ２６０２、ＨＢＳ３（Patgiriら、２
０１１年）ならびにＡＩＫ－４（Ａｌｌｉｎｋｙ）が含まれる。
本明細書で使用するように、「ＲＡＦ阻害剤」は、（ｉ）例えばＲＡＦに結合することによってＲＡＦと直接的に相互作用する、ならびに（ｉｉ）ＲＡＦ、例えば、Ａ－ＲＡＦ、Ｂ－ＲＡＦおよびＣ－ＲＡＦ（ＲＡＦ－１）の発現または活性を低下させる物質を意味する。ＢＲＡＦ阻害剤を含む非限定的で例示的なＲＡＦ阻害剤には、以下が含まれる：
Figure 2022034068000002
Figure 2022034068000003
Figure 2022034068000004
Figure 2022034068000005
Figure 2022034068000006
Figure 2022034068000007
Figure 2022034068000008
 ＡＡＬ８８１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＡＢ－０２４（Ａｍｂｉｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＲＱ－７３６（ＡｒＱｕｌｅ）、ＡＲＱ－７６１（ＡｒＱｕｌｅ）、ＡＺ６２８（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ ＢＶ）、ＢｅｉＧｅｎｅ－２８３（ＢｅｉＧｅｎｅ）、ＢＩＩＢ－０２４（ＭＬＮ ２４８０）（Ｓｕｎｅｓｉｓ ＆ Ｔａｋｅｄａ）、ｂ－ｒａｆ阻害剤（Ｓａｒｅｕｍ）、ＢＲＡＦキナーゼ阻害剤（Ｓｅｌｅｘａｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＢＲＡＦ ｓｉＲＮＡ ３１３（ｔａｃａｃｃａｇｃａａｇｃｔａｇａｔｇｃａ）および５２３（ｃｃｔａｔｃｇｔｔａｇａｇｔｃｔｔｃｃｔｇ）（Liuら、
２００７年）、ＣＴＴ２３９０６５（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）、ＤＰ－４９７８（Ｄｅｃｉｐｈｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＨＭ－９５５７３（Ｈａｎｍｉ）、ＧＤＣ－０８７９（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＷ－５０７４（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＳＩＳ ５１３２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、Ｌ７７９４５０（Ｍｅｒｃｋ）、ＬＢＴ６１３（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＬＥｒａｆＡＯＮ（ＮｅｏＰｈａｒｍ，Ｉｎｃ．）、ＬＧＸ－８１８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＰＬＸ３２０２（Ｐｌｅｘｘｉｋｏｎ）、ＰＬＸ４７２０（Ｐｌｅｘｘｉｋｏｎ）、ＰＬＸ５５６８（Ｐｌｅｘｘｉｋｏｎ）、ＲＡＦ－２６５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＲＡＦ－３６５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、レゴラフェニブ（Ｂａｙｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、ＲＯ ５１２６７６６（Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ
Ｒｏｃｈｅ）、ＳＢ－５９０８８５（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＳＢ６９９３９３（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ソラフェニブ（Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＴＡＫ ６３２（Ｔａｋｅｄａ）、ＴＬ－２４１（Ｔｅｌｉｇｅｎｅ）、ベムラフェニブ（ＲＧ７２０４またはＰＬＸ４０３２）（Ｄａｉｉｃｈｉ Ｓａｎｋｙｏ）、ＸＬ－２８１（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＺＭ－３３６３７２（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、薬学的に許容されるその塩およびその組合せ。
本明細書で使用するように、「ＭＥＫ阻害剤」は、（ｉ）例えばＭＥＫに結合することによってＭＥＫと直接的に相互作用する、および（ｉｉ）ＭＥＫの発現または活性を低下させる物質を意味する。したがって、ＭＥＫの上流で作用する阻害剤、例えばＲＡＳ阻害剤およびＲＡＦ阻害剤は、本発明によるＭＥＦ阻害剤ではない。ＭＥＫ阻害剤の非限定的な例には、炭疽毒素、アントロキノノール（Ｇｏｌｄｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＡＲＲＹ－１４２８８６（６－（４－ブロモ－２－クロロ－フェニルアミノ）－７－フルオロ－３－メチル－３Ｈ－ベンゾイミダゾール－５－カルボン酸（２－ヒドロキシエトキシ）－アミド）（Ａｒｒａｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ）、ＡＲＲＹ－４３８１６２（Ａｒｒａｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ）、ＡＳ－１９４０４７７（Ａｓｔｅｌｌａｓ）、ＡＳ－７０３９８８（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）、ベンタマピモド（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）、ＢＩ－８４７３２５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｅ－６２０１（Ｅｉｓａｉ）、ＧＤＣ－０６２３（Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、ＧＤＣ－０９７３（コビメチニブ）（Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、Ｌ７８３２７７（Ｍｅｒｃｋ）、炭疽毒素の致死因子部分、ＭＥＫ１６２（Ａｒｒａｙ ＢｉｏＰｈａｒｍａ）、ＰＤ ０９８０５９（２－（２’－アミノ－３’－メトキシフェニル）－オキサナフタレン－４－オン）（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＤ １８４３５２（ＣＩ－１０４０）（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＤ－０３２５９０１（Ｐｆｉｚｅｒ）、ピマセルチブ（Ｓａｎｔｈｅｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＲＤＥＡ１１９（Ａｒｄｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｂａｙｅｒ）、レファメチニブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＲＧ４２２（Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．）、ＲＯ０９２２１０（Ｒｏｃｈｅ）、ＲＯ４９８７６５５（Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、ＲＯ５１２６７６６（Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４）（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＳＬ３２７（Ｓｉｇｍａ）、ＴＡＫ－７３３（Ｔａｋｅｄａ）、トラメチニブ（Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ）、Ｕ０１２６（１，４－ジアミノ－２，３－ジシアノ－１，４－ビス（２－アミノフェニルチオ）ブタジエン）（Ｓｉｇｍａ）、ＷＸ－５５４（Ｗｉｌｅｘ）、ＹｏｐＪポリペプチド（Mittalら、２０１０年）、薬学的に許容されるその塩、およびその組合せが含まれる。
この実施形態の一態様では、リボソームのｓ６キナーゼ（ＲＳＫ）の実質的に全てのリン酸化は、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩の投与の後に阻害される。ＲＳＫリン酸化との関連で本明細書において使用するように、「実質的に全て」は、５０％より大きい低減、好ましくは５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より大きい低減を意味する。
この実施形態の別の態様では、がんは、ＭＡＰＫ活性を有する。本明細書で使用するように、「ＭＡＰＫ活性」を有するとは、ＥＲＫの上流のタンパク質が活性でない場合でも、ＥＲＫの下流のタンパク質がなお活性であることを意味する。そのようながんは、固形腫瘍がんまたは血液がんであってもよい。
本発明では、がんには、固形および血液のがんの両方が含まれる。固形がんの非限定的な例には、副腎皮質癌、肛門がん、膀胱がん、骨がん（骨肉腫など）、脳がん、乳がん、カルチノイドがん、癌腫、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、肝臓外胆管がん、ユーイングファミリーのがん、頭蓋外胚細胞がん、眼がん、胆嚢がん、胃がん、胚細胞腫瘍、妊娠期栄養膜腫瘍、頭頸部がん、下咽頭がん、島細胞癌、腎臓がん、大腸がん、喉頭がん、白血病、唇および口腔がん、肝腫瘍／がん、肺腫瘍／がん、リンパ腫、悪性中皮腫、メルケル細胞癌、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻咽頭がん、神経芽細胞腫、口のがん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞がん、膵臓がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、形質細胞新生物、前立腺がん、横紋筋肉腫、直腸がん、腎細胞がん、腎盤および尿管の移行細胞がん、唾液腺がん、セザリー症候群、皮膚がん（皮膚ｔ細胞リンパ腫、カポジ肉腫、肥満細胞腫瘍およびメラノーマなど）、小腸がん、軟部組織肉腫、胃がん、精巣がん、胸腺腫、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、膣がん、外陰部がんおよびウィルムス腫瘍が含まれる。
血液がんの例には、限定されずに、白血病、例えば成人／小児急性リンパ芽球性白血病、成人／小児急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病および毛様細胞白血病、リンパ腫、例えばＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、成人／小児ホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、成人／小児非ホジキンリンパ腫、一次中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫およびワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに他の増殖性障害、例えば慢性骨髄増殖性疾患、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、および脊髄形成異常／骨髄増殖性の新生物が含まれる。
好ましくは、がんは、大腸がん、乳がん、膵臓がん、皮膚がんおよび子宮内膜がんからなる群から選択される。より好ましくは、がんはメラノーマである。
この実施形態の別の態様では、本方法は、がんを処置するかまたはその作用を改善するのに有効な少なくとも１つのさらなる治療剤を対象に投与することをさらに含む。さらなる治療剤は、抗体またはその断片、細胞傷害剤、毒素、放射性核種、免疫調節物質、光活性治療剤、放射線増感剤、ホルモン、抗血管新生剤およびその組合せからなる群から選択することができる。
本明細書で使用するように、「抗体」は、天然に存在する免疫グロブリンならびに天然に存在しない免疫グロブリン、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異的抗体）を包含する。抗体の断片には、抗原に結合するもの（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧ）が含まれる。例えば、Pierce Catalog and Handbook、１９９４～１９９５年（Pierce Chemical Co.、Rockford、Ill.）；Kuby, J.、Immunology、第３版、W.H. Freeman & Co.、New York（１９９８年）も参照する。用語抗体には、二価または二重特異的分子、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディも含まれる。用語「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体がさらに含まれる。
本発明で使用することができる治療的抗体の例には、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）およびイブリツモマブ（Ｚｅｖａｌｉｎ）が含まれる。
本発明による細胞傷害剤には、ＤＮＡ傷害剤、代謝拮抗物質、抗微小管剤、抗生剤等が含まれる。ＤＮＡ傷害剤には、アルキル化剤、白金をベースとした薬剤、挿入剤およびＤＮＡ複製の阻害剤が含まれる。ＤＮＡアルキル化剤の非限定的な例には、シクロホスファミド、メクロルエタミン、ウラムスチン、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ブスルファン、テモゾロマイド、薬学的に許容されるその塩、プロドラッグおよびその組合せが含まれる。白金をベースとした薬剤の非限定的な例には、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン、薬学的に許容されるその塩、プロドラッグおよびその組合せが含まれる。挿入剤の非限定的な例には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、薬学的に許容されるその塩、プロドラッグおよびその組合せが含まれる。ＤＮＡ複製の阻害剤の非限定的な例には、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、薬学的に許容されるその塩、プロドラッグおよびその組合せが含まれる。代謝拮抗物質には、葉酸アンタゴニスト、例えばメトトレキセートおよびプレメトレキセド、プリンアンタゴニスト、例えば６－メルカプトプリン、ダカルバジンおよびフルダラビン、ならびにピリミジンアンタゴニスト、例えば５－フルオロウラシル、アラビノシルシトシン、カペシタビン、ゲムシタビン、デシタビン、薬学的に許容されるその塩、プロドラッグおよびその組合せが含まれる。抗微小管剤には、限定されずに、ビンカアルカロイド、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））およびイクサベピロン（Ｉｘｅｍｐｒａ（登録商標））が含まれる。抗生剤には、限定されずに、アクチノマイシン、アントラサイクリン、バルルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、薬学的に許容されるその塩、プロドラッグおよびその組合せが含まれる。
本発明による細胞傷害剤には、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害剤も含まれる。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害剤の非限定的な例には、Ａ－６７４５６３（ＣＡＳ＃５５２３２５－７３－２）、ＡＧＬ ２２６３、ＡＭＧ－３１９（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＡＳ－０４１１６４（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イルメチレン－チアゾリジン－２，４－ジオン）、ＡＳ－６０４８５０（５－（２，２－ジフルオロ－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イルメチレン）－チアゾリジン－２，４－ジオン）、ＡＳ－６０５２４０（５－キノキシリン－６－メチレン－１，３－チアゾリジン－２，４－ジオン）、ＡＴ７８６７（ＣＡＳ＃８５７５３１－００－１）、ベンズイミダゾール系、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、ＢＭＬ－２５７（ＣＡＳ＃３２３８７－９６－５）、ＣＡＬ－１２０（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ＣＡＬ－１２９（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＡＬ－１３０（Ｇｉｌｅａｄ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＡＬ－２５３（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＡＬ－２６３（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＡＳ＃６１２８４７－０９－３、ＣＡＳ＃６８１２８１－８８－９、ＣＡＳ＃７５７４７－１４－７、ＣＡＳ＃９２５６８１－４１－０、ＣＡＳ＃９８５１０－８０－６、ＣＣＴ１２８９３０（ＣＡＳ＃８８５４９９－６１－６）、ＣＨ５１３２７９９（ＣＡＳ＃１００７２０７－６７－１）、ＣＨＲ－４４３２（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｌｔｄ．、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）、ＦＰＡ １２４（ＣＡＳ＃９０２７７９－５９－３）、ＧＳ－１１０１（ＣＡＬ－１０１）（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＧＳＫ ６９０６９３（ＣＡＳ＃９３７１７４－７６－０）、Ｈ－８９（ＣＡＳ＃１２７２４３－８５－０）、ホオノキオール、ＩＣ８７１１４（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＰＩ－１４５（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ Ｉｎｃ．）、ＫＡＲ－４１３９（Ｋａｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃｈｉｌｗｏｒｔｈ、ＵＫ）、ＫＡＲ－４１４１（Ｋａｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＫＩＮ－１（Ｋａｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＫＴ ５７２０（ＣＡＳ＃１０８０６８－９８－０）、ミルテフォシン、ＭＫ－２２０６二塩化水素化物（ＣＡＳ＃１０３２３５０－１３－２）、ＭＬ－９（ＣＡＳ＃１０５６３７－５０－１）、塩酸ナルトリンドール、ＯＸＹ－１１１Ａ（ＮｏｒｍＯｘｙｓ Ｉｎｃ．、Ｂｒｉｇｈｔｏｎ、ＭＡ）、ペリホシン、ＰＨＴ－４２７（ＣＡＳ＃１１９１９５１－５７－１）、ＰＩ３キナーゼデルタ阻害剤、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）、ＰＩ３キナーゼデルタ阻害剤、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ．）、ＰＩ３キナーゼデルタ阻害剤、Ｉｎｃｏｚｅｎ（Ｉｎｃｏｚｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｐｖｔ．Ｌｔｄ．、Ｈｙｄｒａｂａｄ、Ｉｎｄｉａ）、ＰＩ３キナーゼデルタ阻害剤－２、Ｉｎｃｏｚｅｎ（Ｉｎｃｏｚｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ｒｏｃｈｅ－４（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ．）、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ｒｏｃｈｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ．）、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ｒｏｃｈｅ－５（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ．）、ＰＩ３－アルファ／デルタ阻害剤、Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、ＰＩ３－デルタ阻害剤、Ｃｅｌｌｚｏｍｅ（Ｃｅｌｌｚｏｍｅ ＡＧ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＩ３－デルタ阻害剤、Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ＰＩ３－デルタ阻害剤、Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ－１（Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）、ＰＩ３－デルタ阻害剤、Ｐａｔｈｗａｙ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ－２（Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）、ＰＩ３－デルタ／ガンマ阻害剤、Ｃｅｌｌｚｏｍｅ（Ｃｅｌｌｚｏｍｅ ＡＧ）、ＰＩ３－デルタ／ガンマ阻害剤、Ｃｅｌｌｚｏｍｅ（Ｃｅｌｌｚｏｍｅ ＡＧ）、ＰＩ３－デルタ／ガンマ阻害剤、Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ Ｉｎｃ．）、ＰＩ３－デルタ／ガンマ阻害剤、Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ
Ｉｎｃ．）、ＰＩ３－デルタ／ガンマ阻害剤、Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）、ＰＩ３－デルタ／ガンマ阻害剤、Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）、ＰＩ３－ガンマ阻害剤Ｅｖｏｔｅｃ（Ｅｖｏｔｅｃ）、ＰＩ３－ガンマ阻害剤、Ｃｅｌｌｚｏｍｅ（Ｃｅｌｌｚｏｍｅ ＡＧ）、ＰＩ３－ガンマ阻害剤、Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｐａｔｈｗａｙ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄ．）、ＰＩ３Ｋデルタ／ガンマ阻害剤、Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ－１（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ Ｉｎｃ．）、ＰＩ３Ｋデルタ／ガンマ阻害剤、Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ－１（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ Ｉｎｃ．）、ピクチリシブ（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ Ｉｎｃ．）、ＰＩＫ－９０（ＣＡＳ＃６７７３３８－１２－４）、ＳＣ－１０３９８０（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、ＳＦ－１１２６（Ｓｅｍａｆｏｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、ＳＨ－５、ＳＨ－６、テトラヒドロクルクミン、ＴＧ１００－１１５（Ｔａｒｇｅｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、トリシリビン、Ｘ－３３９（Ｘｃｏｖｅｒｙ、Ｗｅｓｔ Ｐａｌｍ Ｂｅａｃｈ、ＦＬ）、ＸＬ－４９９（Ｅｖｏｔｅｃｈ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、薬学的に許容される塩およびその組合せが含まれる。
本発明では、用語「毒素」は、植物または動物起源の抗原性の毒物または毒液を意味する。例は、ジフテリア毒素またはその部分である。
本発明では、用語「放射性核種」は、例えば静脈内または経口的に患者に投与される放射性物質を意味し、その後にそれは患者の正常な代謝を通して標的の器官または組織に浸透し、そこでそれは短時間、局所放射線照射を送達する。放射性核種の例には、限定されずに、Ｉ－１２５、Ａｔ－２１１、Ｌｕ－１７７、Ｃｕ－６７、Ｉ－１３１、Ｓｍ－１５３、Ｒｅ－１８６、Ｐ－３２、Ｒｅ－１８８、Ｉｎ－１１４ｍおよびＹ－９０が含まれる。
本発明では、用語「免疫調節物質」は、それらの生成を開始した抗原を認識して、それと反応する抗体または感作細胞を生成する免疫系の能力を増強または低減することによって、免疫応答を変更する物質を意味する。免疫調節物質は、組換え、合成または天然の調製物であってよく、サイトカイン、コルチコステロイド、細胞傷害剤、サイモシンおよび免疫グロブリンが含まれる。一部の免疫調節物質は体内に天然に存在し、これらの若干は薬理学的調製物の形で入手可能である。免疫調節物質の例には、限定されずに、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インターフェロン、イミキモドおよび細菌からの細胞膜分画、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ７および合成シトシンリン酸－グアノシン（ＣｐＧ）が含まれる。
本発明では、用語「光活性治療剤」は、露光の後に活性になる化合物および組成物を意味する。光活性治療剤のある特定の例は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１５２２３０Ａ１号、「Photoactive Metal Nitrosyls For Blood Pressure Regulation And Cancer Therapy」に開示される。
本発明では、用語「放射線増感剤」は、腫瘍細胞を放射線療法に対してより感受性にする化合物を意味する。放射線増感剤の例には、ミソニダゾール、メトロニダゾール、チラパザミンおよびトランスクロセチンナトリウムが含まれる。
本発明では、用語「ホルモン」は、体の別の部分の細胞に影響する体の一部分の細胞によって放出される物質を意味する。ホルモンの例には、限定されずに、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、アミリン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、副腎皮質ホルモン、アンジオテンシノーゲン、アンジオテンシン、バソプレシン、アトリオペプチン、脳ナトリウム排泄増加性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、エンケファリン、エンドセリン、エリスロポイエチン、濾胞刺激ホルモン、ガラニン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、増殖ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、ソマトメジン、レプチン、リプトロピン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、モチリン、オレキシン、オキシトシン、膵臓のポリペプチド、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロラクチン放出ホルモン、リラキシン、レニン、セクレチン、ソマトスタチン（somatostain）、トロンボポエチン、甲状腺刺激ホルモン、テストステロン、デヒドロエピアンドロ
ステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、アルドステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、コルチゾール、プロゲステロン、カルシトリオールおよびカルシジオールが含まれる。
一部の化合物はある特定のホルモンの活性を妨害するか、またはある特定のホルモンの生成を中止する。これらのホルモン妨害性の化合物には、限定されずに、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（登録商標））およびフルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標））が含まれる。そのような化合物も、本発明におけるホルモンの意味の範囲内である。
本明細書で使用するように、「抗血管新生」剤は、新しい血管の増殖を低減または阻害する物質、例えば、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤および内皮細胞移動の阻害剤を意味する。抗血管新生剤には、限定されずに、２－メトキシエストラジオール、アンギオスタチン、ベバシズマブ、軟骨由来血管新生阻止因子、エンドスタチン、ＩＦＮ－α、ＩＬ－１２、イトラコナゾール、リノミド、血小板因子－４、プロラクチン、ＳＵ５４１６、スラミン、タスキニモド、テコガラン、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン、トロンボスポンジン、ＴＮＰ－４７０、ｚｉｖ－アフリベルセプト、薬学的に許容されるその塩、プロドラッグおよびその組合せが含まれる。
本発明の別の実施形態は、対象においてがんを処置するかまたはその作用を改善するための方法である。本方法は、
（ａ）ＢＲＡＦ阻害剤療法、ＭＥＫ阻害剤療法またはＢＲＡＦおよびＭＥＫ阻害剤療法に対して抗療性または耐性になったがんを有する対象を同定することと；
（ｂ）前記抗療性または耐性のがんを有する対象にＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩であるＥＲＫ阻害剤を有効量で投与することと
を含む。
適する、好ましい対象は、本明細書に開示される通りである。この実施形態では、本方法は、上に開示されるがんを処置するために使用することができる。本発明によると、がんはＭＡＰＫ活性を有することができる。
この実施形態の一態様では、ＢＲＡＦおよび／またはＭＥＫ阻害剤療法に対して抗療性または耐性であるがんを有する対象を同定することは、
（ａ）対象から生体試料を得ることと、
（ｂ）ＢＲＡＦ阻害剤療法、ＭＥＫ阻害剤療法およびその組合せからなる群から選択される阻害剤療法に対象が耐性になったかどうか判定するために試料をスクリーニングすることと
を含む。
本発明では、生体試料には、限定されずに、血液、血漿、尿、皮膚、唾液および生検が含まれる。当技術分野で公知であるルーチンの手順および方法によって、生体試料を対象から得る。
好ましくは、ＢＲＡＦ阻害剤療法に対して抗療性または耐性であるがんについてスクリーニングすることは、例えば、（ｉ）ＲＡＦアイソフォームの間のスイッチ、（ｉｉ）ＲＴＫまたはＮＲＡＳシグナル伝達の上方制御、（ｉｉｉ）分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達の再活性化、（ｉｖ）ＭＥＫ活性化突然変異の存在、およびその組合せを同定することを含むことができる。
ＲＡＦアイソフォームの間のスイッチは、ＢＲＡＦ阻害剤療法に対する獲得耐性を有する対象において起こることができる。そのようなスイッチを検出するために、ＢＲＡＦ阻害剤耐性腫瘍細胞を患者から取り出すことができ、ＢＲＡＦ阻害剤の存在下でＥＲＫおよびホスホＥＲＫレベルについてウェスタンブロッティングを通して分析することができる。ＢＲＡＦ阻害剤で処置したＢＲＡＦ阻害剤感受性の細胞との比較は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性腫瘍細胞におけるホスホＥＲＫのより高いレベルを明らかにすることがあり、これは、別のＲＡＦアイソフォームがＢＲＡＦの代わりにＥＲＫをリン酸化するスイッチが生じたことを暗示している。どのＲＡＦアイソフォームが発生したかの確認は、ＢＲＡＦ阻害剤に曝露させたＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞におけるＡＲＡＦおよびＣＲＡＦ個々のｓｈ／ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンと、続くＥＲＫおよびホスホＥＲＫレベルについての以降のウェスタンブロッティングを含むことができる。例えば、ＢＲＡＦ阻害剤に曝露させたＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞におけるＡＲＡＦノックダウンがホスホＥＲＫの高レベルをなおもたらすならば、それは、ＣＲＡＦがＥＲＫのリン酸化を引き受けたことを示すだろう。同様に、ＢＲＡＦ阻害剤に曝露させたＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞においてＣＲＡＦがノックダウンされ、ＥＲＫがなお高度にリン酸化されていたならば、それは、ＡＲＡＦがＥＲＫリン酸化を引き受けたことを意味するだろう。ＲＡＦアイソフォームスイッチングは、ＢＲＡＦ阻害剤の存在下でＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞におけるＡＲＡＦおよびＣＲＡＦの同時ノックダウンを含むこともでき、全てのＲＡＦ媒介リン酸化を効果的に遮断する。結果としてのＥＲＫリン酸化の減少は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞が、ＥＲＫをリン酸化するためにＲＡＦアイソフォームの間で切り替える能力を有することを示すだろう（Villanuevaら、２０１０年）。
ＲＴＫまたはＮＲＡＳシグナル伝達の上方制御も、ＢＲＡＦ阻害剤耐性の原因であることもある。検出は、例えば、下流ＲＡＦエフェクターＭＥＫ１／２およびＥＲＫ１／２の活性化を分析するために、ホスホ特異的抗体によるウェスタンブロッティングプロトコールを使用することを先ず含むことができる。ＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞がＢＲＡＦ阻害剤の存在下でこれらのタンパク質の高い活性化レベルを示すならば、ＲＴＫまたはＮＲＡＳの上方制御は原因である可能性がある。ＢＲＡＦ阻害剤の存在下でのＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞の遺伝子発現プロファイリング（または、他の関連した方法）は、ＢＲＡＦ阻害剤感受性の細胞と比較してＫＩＴ、ＭＥＴ、ＥＧＦＲおよびＰＤＧＦＲβ ＲＴＫのより高い発現レベルを明らかにすることができる。これらの遺伝子のいずれかに注目したリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応実験、または他の類似の手法は、より高い発現レベルを確認することができるが、ホスホＲＴＫアレイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）は高活性化に関連したチロシンリン酸化を示すことができる。代わりに、ＮＲＡＳ活性化は、様々な遺伝子配列決定プロトコールによって検出することができる。ＮＲＡＳ、特にＱ６１Ｋにおける活性化突然変異は、Ｂ－ＲＡＦシグナル伝達が迂回されたことを示している可能性がある。メラノーマ細胞では、活性化ＮＲＡＳは、ＭＥＫ－ＥＲＫにシグナル伝達するためにＣ－ＲＡＦを使用する。したがって、活性化ＮＲＡＳは、ＢＲＡＦ阻害剤に曝露させたＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞において類似のバイパス経路を可能にすることができる。所与のＢＲＡＦ阻害剤耐性試料におけるこれらの機構のさらなる確認は、例えば、ＢＲＡＦ阻害剤の存在下で上方制御されたＲＴＫまたは活性化ＮＲＡＳのｓｈ／ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンを使用して達成することができる。増殖阻害のいかなる有意なレベルも、ＲＴＫまたはＮＲＡＳシグナル伝達の上方制御がその特定の試料におけるＢＲＡＦ阻害の原因であることを示すことができる（Nazarianら、２０１０年）。
ＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞におけるＭＡＰＫシグナル伝達の再活性化を検出することは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性のための別のバイパス機構を示している可能性がある。ＣＯＴおよびＣ－ＲＡＦは、ＢＲＡＦ阻害剤に曝露させたＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅバックグラウンドにおいて上方制御されることが示された。例えば、定量的リアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、ＢＲＡＦ阻害剤の存在下でＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞におけるＣＯＴ発現の増加を明らかにすることができる。さらに、ＢＲＡＦ阻害剤の存在下でのＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞におけるＣＯＴのｓｈ／ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞の生存度を低減することができ、これらの特定の細胞がＣＯＴ阻害および／または組み合わせたＢＲＡＦ阻害剤／ＭＥＫ阻害剤による処置に感受性である可能性があることを示す（Johannessenら
、２０１０年）。
ＭＡＰＫシグナル伝達の再活性化は、ＭＥＫ１における活性化突然変異によって、ＢＲＡＦ阻害剤耐性バックグラウンドにおいて達成することもできる。ＢＲＡＦ阻害剤耐性腫瘍からのゲノムＤＮＡの標的化大規模並行配列決定は、ＭＥＫ１、例えばとりわけＣ１２１Ｓ、Ｇ１２８Ｄ、Ｎ１２２ＤおよびＹ１３０における活性化突然変異を明らかにすることができる。ＭＥＫ１における他の報告されていない突然変異は、例えば、Ａ３７５などのＢＲＡＦ阻害剤感受性細胞株における特定の突然変異を発現させることによって分析することができる。ＢＲＡＦ阻害剤への曝露の後のこれらの細胞における増殖阻害のレベルを決定することは、ＭＥＫ１突然変異がＢＲＡＦ阻害性療法に対する耐性を引き起こしているかどうかを示すことができる。このような知見を確認するために、ＭＥＫ１突然変異を異所的に発現している細胞におけるホスホ－ＥＲＫ１／２の上昇したレベルのウェスタンブロッティングは、ＢＲＡＦ阻害剤耐性腫瘍がＢＲＡＦを迂回し、ＭＥＫ１を通してＥＲＫのリン酸化を促進することをＭＥＫ１突然変異が可能にしていることを示すことができる（Wagleら、２０１１年）。
本発明により、ＭＥＫ阻害剤療法に対して抗療性または耐性であるがんについてスクリーニングすることは、例えば、（ｉ）突然変異体ＢＲＡＦの増幅、（ｉｉ）ＳＴＡＴ３上方制御、（ｉｉｉ）ＭＥＫへの阻害剤の結合を直接的に遮断するかまたは構成的ＭＥＫ活性につながるＭＥＫのアロステリックポケットにおける突然変異、およびその組合せを同定することを含むことができる。
突然変異体ＢＲＡＦの増幅は、ＭＥＫ阻害剤耐性を引き起こすことができる。ＭＥＫ阻害剤耐性は、ＭＥＫ阻害剤の存在下でリン酸化されたＥＲＫおよびＭＥＫの高レベルと一般的に関連し、それは、例えばウェスタンブロッティングを通して評価することができる。ＭＥＫ阻害剤耐性細胞株における突然変異体ＢＲＡＦの増幅は、例えば、耐性細胞株のゲノムＤＮＡからの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）または定量的ＰＣＲによって検出することができる。ＢＲＡＦ増幅がＭＥＫ阻害剤耐性の主因であるとの確認は、耐性細胞においてＢＲＡＦ標的化ｓｈ／ｓｉＲＮＡを使用することを必要とする可能性がある。ＭＥＫまたはＥＲＫリン酸化における有意な減少が観察されるならば、ＢＲＡＦ増幅はさらなる治療アプローチのための適する標的である可能性がある（Corcoranら、２０１０年）。
ＳＴＡＴ３上方制御を同定することは、特定の腫瘍試料がＭＥＫ阻害剤療法に対して耐性であることを示すことができる。ゲノムワイド発現プロファイリングは、ＳＴＡＴ３経路が腫瘍において上方制御されることを明らかにすることができる。他の技術、例えばホスホＳＴＡＴ３のためのウェスタンブロッティングならびにＳＴＡＴ経路関連遺伝子ＪＡＫ１およびＩＬ６ＳＴのためのリアルタイムｑＰＣＲは、上方制御されたＳＴＡＴ３を明らかにすることができる。ＳＴＡＴ３上方制御が特定の試料においてＭＥＫ阻害剤耐性を引き起こすとのさらなる確認は、試料中のＳＴＡＴ３に対するｓｈ／ｓｉＲＮＡの使用、続いてＭＥＫおよびＥＲＫの活性化ならびにホスホＳＴＡＴ３および全ＳＴＡＴ３のための適当なウェスタンブロッティングを含むことができる。増殖阻害研究は、ＳＴＡＴ３ノックダウンが、以前にＭＥＫ阻害剤耐性の細胞をＭＥＫ阻害に感受性にすることを示すことができる。試料をＪＳＩ－１２４などのＳＴＡＴ３阻害剤に曝露させた場合に、類似の作用を見ることができる。ＳＴＡＴ３上方制御が特定の腫瘍におけるＭＥＫ阻害剤耐性の原因であるとのさらなる確認は、ＢＩＭ－ＥＬ、ＢＩＭ－ＬおよびＢＩＭ－ＳＬを含むＢＩＭ発現のためのウェスタンブロッティングから生じる可能性がある。ＢＩＭ発現は、ＭＥＫ阻害剤誘導アポトーシスにつながり、このように、ＳＴＡＴ３上方制御はＢＩＭレベルを低下させることができる。ＳＴＡＴ３は、ＢＩＭ発現を抑制するｍｉＲ １７－９２の発現を調節することが公知である。上方制御されたＳＴＡＴ３は、ｍｉＲ １７－９２のより高いレベルにつながる可能性があり、それはＢＩＭレベルを低下させ、ＭＥＫ阻害に対する耐性を促進する。したがって、ｍｉＲ １７－９２レベルのリアルタイムｑＰＣＲは、ＳＴＡＴ３上方制御が特定の試料においてＭＥＫ阻害耐性を引き起こしているかどうかの評価を助けることもできる（Daiら、２０１１年）。
ＭＥＫへの阻害剤の結合を直接的に遮断するかまたは構成的ＭＥＫ活性につながり得るＭＥＫのアロステリックポケットにおける突然変異は、下に開示される方法によって検出することができる。そのような突然変異は、Ｅｍｅｒｙおよび同僚（Emeryら、２００９
年）ならびにＷａｎｇおよび同僚（Wangら、２０１１年）によって以前に同定された。他の突然変異は、Ｐ１２４ＬおよびＱ５６Ｐなどの、Ｎ末端の負の調節ヘリックスの中に位置するかまたはそれに接するＭＥＫ１コドンに影響することができる（同上）。
上で同定されたＭＥＫ遺伝子などの、核酸における突然変異を同定するための方法は、当技術分野で公知である。核酸は、生体試料から得ることができる。本発明では、生体試料には、限定されずに、血液、血漿、尿、皮膚、唾液および生検が含まれる。当技術分野で公知であるルーチンの手順および方法によって、生体試料は対象から得られる。
突然変異を同定するための方法の非限定的な例には、ＰＣＲ、配列決定、ハイブリッド捕捉、溶液内捕捉、分子反転プローブ、蛍光性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイ、およびその組合せが含まれる。
様々な配列決定方法が、当技術分野で公知である。これらには、限定されずに、サンガー配列決定（ジデオキシ配列決定法とも呼ばれる）および、例えばMetzker、２００５年
に開示されるような様々な合成による配列決定（ＳＢＳ）方法、ハイブリダイゼーションによる、ライゲーションによる（例えば、ＷＯ２００５０２１７８６）、分解による（例えば、米国特許第５，６２２，８２４号および第６，１４０，０５３号）配列決定、およびナノポア配列決定（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＫから市販されている）が含まれる。ディープシークエンシング技術では、配列決定過程の間に配列中の所与のヌクレオチドは２回以上読み取られる。ディープシークエンシング技術は、例えば、米国特許出願公開第２０１２０２６４６３２号および国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２１２５８４８に開示される。
突然変異を検出するためのＰＣＲをベースとした方法は当技術分野で公知であり、ＰＣＲ増幅を用い、ここでは、試料中の各標的配列は、ユニークで配列特異的なプライマーの対応する対を有する。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応－制限断片長多型（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）方法は、ゲノム配列がＰＣＲによって増幅される後の突然変異の迅速な検出を可能にする。突然変異は特異的制限エンドヌクレアーゼによる消化によって識別され、電気泳動によって同定される。例えば、Otaら、２００７年、を参照。突然変異は、リアルタイム
ＰＣＲを使用して検出することもできる。例えば、国際出願公開番号ＷＯ２０１２０４６９８１を参照。
ハイブリッド捕捉方法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１３０２０３６３２号ならびに米国特許第８，３８９，２１９号および第８，２８８，５２０号に開示される。これらの方法は、ユーザー設計のオリゴヌクレオチドへの標的ゲノム領域の選択的ハイブリダイゼーションに基づく。ハイブリダイゼーションは、高いか低い密度のマイクロアレイの上に固定化されたオリゴヌクレオチドに対して（アレイ上の捕捉）であってもよく、または、ビーズなどの固体表面にその後固定化することができる、リガンド（例えばビオチン）で改変したオリゴヌクレオチドへの溶液相ハイブリダイゼーション（溶液中の捕捉）であってもよい。
分子反転プローブ（ＭＩＰ）技術は当技術分野で公知であり、例えば、Absalanら、２
００８年、に開示される。この方法はＭＩＰ分子を使用し、それは、遺伝子タイピングのための特別な「南京錠（ｐａｄｌｏｃｋ）」プローブ（Nilssonら、１９９４年）である
。ＭＩＰ分子は、特異的領域、汎用性配列、制限部位およびＴａｇ（指標）配列（１６～２２ｂｐ）を含有する線状オリゴヌクレオチドである。ＭＩＰは、目的の遺伝子マーカー／ＳＮＰの周囲に直接的にハイブリダイズする。ＭＩＰ方法は、並行してゲノムＤＮＡにハイブリダイズするいくつかの「南京錠」プローブセットを使用することもできる（Hardenbolら、２００３年）。完全な一致の場合、配置の反転（その技術の名称から示唆され
るように）を経て、環状分子を形成することによって、ゲノム相同性領域はライゲーションされる。第１の制限処理の後、全ての分子は汎用性プライマーで増幅される。ハイブリダイゼーションのための短い断片をマイクロアレイの上に確保するために、アンプリコンは再び制限処理される。生成された短い断片は標識され、Ｔａｇ配列を通して、アレイの上のｃＴａｇ（指標のための相補鎖）にハイブリダイズされる。Ｔａｇ－ｃＴａｇ二重鎖の形成の後、シグナルが検出される。
以下の表１、２および３は、配列表の様々な動物に由来する野生型ＢＲＡＦ、Ｎ－ＲＡＳおよびＭＥＫ１の代表的核酸およびアミノ酸配列の配列番号を示す。これらの配列は、突然変異ＢＲＡＦ、Ｎ－ＲＡＳおよびＭＥＫ１遺伝子型を有する対象を同定するための方法で使用することができる。
Figure 2022034068000009
Figure 2022034068000010
Figure 2022034068000011
Figure 2022034068000012
この実施形態の別の態様では、本方法は、本明細書に開示される少なくとも１つのさらなる治療剤、好ましくはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害剤を投与することをさらに含む。
本発明のさらなる実施形態は、対象においてＢＲＡＦ阻害剤療法、ＭＥＫ阻害剤療法、またはその両方に対して抗療性または耐性であるがんを処置するかまたはその作用を改善するための方法である。本方法は、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩を有効量で対象に投与することを含む。
適する、好ましい対象は、本明細書に開示される通りである。この実施形態では、本方法は、上で同定される突然変異バックグラウンド、耐性プロファイルおよびＭＡＰＫ活性を有するがんを含む、上に開示されるがんを処置するために使用することができる。そのような突然変異を同定する方法も、上に示す通りである。
この実施形態のさらなる態様では、本方法は、本明細書に開示される少なくとも１つのさらなる治療剤、好ましくはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害剤を対象に投与することをさらに含む。
本発明の別の実施形態は、ＥＲＫ阻害剤による療法から恩恵を受けるだろうがん対象を同定するための方法である。本方法は、
（ａ）対象から生体試料を得ることと、
（ｂ）対象が、以下のマーカー：
（ｉ）ＲＡＦアイソフォームの間のスイッチ、
（ｉｉ）ＲＴＫまたはＮＲＡＳシグナル伝達の上方制御、
（ｉｉｉ）分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達の再活性化、
（ｉｖ）ＭＥＫ活性化突然変異の存在、
（ｖ）突然変異ＢＲＡＦの増幅、
（ｖｉ）ＳＴＡＴ３上方制御、
（ｖｉｉ）ＭＥＫへの阻害剤の結合を直接的に遮断するかまたは構成的ＭＥＫ活性につながるＭＥＫのアロステリックポケットにおける突然変異、
の１つまたは複数を有するかどうか判定するために試料をスクリーニングすることと
を含み、ここで、マーカーの１つまたは複数の存在は、対象のがんがＢＲＡＦおよび／またはＭＥＫ阻害剤療法に対して抗療性または耐性であること、ならびに、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩であるＥＲＫ阻害剤による療法から対象が恩恵を受けるだろうことを確認する。
適する、好ましい対象は、本明細書に開示される通りである。この実施形態では、本方法は、上で同定される突然変異バックグラウンド、耐性プロファイルおよびＭＡＰＫ活性を有するがんを含む、上に開示されるがんを有する対象を同定するために使用することができる。そのような突然変異を同定する方法も、上に示す通りである。
この実施形態の一態様では、本方法は、マーカーの１つまたは複数を有する対象にＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩を投与することをさらに含む。好ましくは、本方法は、マーカーの１つまたは複数を有する対象に本明細書に開示される少なくとも１つのさらなる治療剤、好ましくはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害剤を投与することをさらに含む。
本発明のさらなる実施形態は、対象において非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路療法に対して抗療性または耐性であるがんを処置するかまたはその作用を改善するための医薬組成物である。本組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤およびＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩の有効量を含む。
適する、好ましい対象および非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤療法のタイプは、本明細書に開示される通りである。この実施形態では、本医薬組成物は、上で同定される突然変異バックグラウンド、耐性プロファイルおよびＭＡＰＫ活性を有するがんを含む、上に開示されるがんを処置するために使用することができる。そのような突然変異を同定する方法も、上に示す通りである。
この実施形態の一態様では、本医薬組成物は、本明細書に開示される少なくとも１つのさらなる治療剤、好ましくはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害剤をさらに含む。
本発明の別の実施形態は、対象において非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路療法に対して抗療性または耐性であるがんを処置するかまたはその作用を改善するためのキットである。このキットは、本発明による任意の医薬組成物を、その使用説明書と一緒にパックされた形で含む。
キットは、対象に医薬組成物を投与することにおいて使用するための、各医薬組成物および他の試薬、例えば緩衝液、平衡塩溶液等のために適する保存容器、例えば、アンプル、バイアル、チューブ等を含むこともできる。医薬組成物および他の試薬は、任意の都合のよい形態、例えば溶液形態または粉末形態でキット中に存在することができる。キットは、医薬組成物および他の任意選択の試薬を収納するための１つまたは複数の区画を任意選択で有する、パッケージング容器をさらに含むことができる。
適する、好ましい対象および非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤療法のタイプは、本明細書に開示される通りである。この実施形態では、本キットは、本明細書で同定される突然変異バックグラウンド、耐性プロファイルおよびＭＡＰＫ活性を有するがんを含む、上に開示されるがんを処置するために使用することができる。そのような突然変異を同定する方法は、上に示す通りである。
この実施形態の一態様では、本キットは、本明細書に開示される少なくとも１つのさらなる治療剤、好ましくはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の阻害剤をさらに含む。
本発明の別の実施形態は、非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤に対して抗療性または耐性であるがん細胞でのＲＳＫのリン酸化を阻害するための方法である。本方法は、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩の有効量とがん細胞を、がん細胞でのＲＳＫのリン酸化が阻害されるのに十分な時間、接触させることを含む。この実施形態では、「接触させること」は、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩、および任意選択で１つまたは複数のさらなる治療剤をがん細胞に近接させることを意味する。これは、哺乳動物への薬物送達の従来の技術を使用して、または、例えば、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩および任意選択で他の治療剤を、がん細胞が位置する培養培地に提供することによってｉｎ ｖｉｔｒｏの状況で達成することができる。ｅｘ ｖｉｖｏの状況では、接触させることは、例えば、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩および任意選択で他の治療剤をがん組織に提供することによって実行することができる。
適する、好ましい非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤のタイプは、本明細書に開示される通りである。この実施形態では、がん細胞死の実行は、上に開示される様々な突然変異バックグラウンド、耐性プロファイルおよびＭＡＰＫ活性を有するがん細胞において達成することができる。そのような突然変異を同定する方法も、上に示す通りである。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実行することができるこの実施形態の方法は、例えば、本明細書に開示されるがんのタイプの細胞においてがん細胞を死滅させることによって、がん細胞死を実行するために使用することができる。
この実施形態の一態様では、５０％を超えるＲＳＫリン酸化が阻害される。この実施形態の別の態様では、７５％を超えるＲＳＫリン酸化が阻害される。この実施形態のさらなる態様では、９０％を超えるＲＳＫリン酸化が阻害される。この実施形態のさらなる態様では、９５％を超えるＲＳＫリン酸化が阻害される。この実施形態の別の態様では、９９％を超えるＲＳＫリン酸化が阻害される。この実施形態のさらなる態様では、１００％のＲＳＫリン酸化が阻害される。
この実施形態のさらなる態様では、がん細胞は、哺乳動物のがん細胞である。好ましくは、哺乳動物のがん細胞は、ヒト、霊長類、畜産動物および家畜からなる群から選択される哺乳動物から得られる。より好ましくは、哺乳動物のがん細胞は、ヒトがん細胞である。
この実施形態のさらなる態様では、接触させるステップは、がん細胞が得られた対象にＢＶＤ－５２３または薬学的に許容される塩を投与することを含む。
本発明では、本明細書に開示される化合物または組成物の「有効量」または「治療的有効量」は、対象に投与したときに本明細書に記載される有益なまたは所望の結果を達成するのに十分であるそのような化合物または組成物の量である。有効な剤形、投与様式および投薬量は経験的に決定することができ、そのような決定は当技術分野の技術の範囲内である。投薬量は、投与経路、排泄速度、処置期間、投与される任意の他の薬物の種類、哺乳動物、例えばヒト患者の年齢、サイズおよび種、ならびに医薬および獣医薬の技術分野において周知である類似の因子によって異なることが当業者によって理解される。一般に、本発明による化合物または組成物の適する用量は、所望の効果をもたらすのに有効な最低用量である組成物の量である。本発明の化合物または組成物の有効用量は、１日を通して適当な間隔で別々に投与される、２、３、４、５、６またはそれより多くの下位用量として投与することができる。
ＢＶＤ－５２３および本明細書に開示される他の抗がん剤の投薬量の適する、非限定的な例は、１日につき約１ｍｇ／ｋｇから約２４００ｍｇ／ｋｇ、例えば１日につき約１ｍｇ／ｋｇから約１２００ｍｇ／ｋｇ、１日につき７５ｍｇ／ｋｇから１日につき約３００ｍｇ／ｋｇ、例えば１日につき約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇである。そのような薬剤の他の代表的な投薬量には、１日につき約１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇ、７００ｍｇ／ｋｇ、８００ｍｇ／ｋｇ、９００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１１００ｍｇ／ｋｇ、１２００ｍｇ／ｋｇ、１３００ｍｇ／ｋｇ、１４００ｍｇ／ｋｇ、１５００ｍｇ／ｋｇ、１６００ｍｇ／ｋｇ、１７００ｍｇ／ｋｇ、１８００ｍｇ／ｋｇ、１９００ｍｇ／ｋｇ、２０００ｍｇ／ｋｇ、２１００ｍｇ／ｋｇ、２２００ｍｇ／ｋｇおよび２３００ｍｇ／ｋｇが含まれる。本明細書に開示されるＢＶＤ－５２３および他の抗がん剤の有効用量は、１日を通して適当な間隔で別々に投与される、２、３、４、５、６またはそれより多くの下位用量として投与することができる。
本明細書に開示されるＢＶＤ－５２３、他の阻害剤および様々な他の抗がん剤、または本発明の医薬組成物は、経口摂取のために、または眼への局所投与のための軟膏もしくは滴剤として、または、任意の適当な方法、例えば腹腔内、皮下、局所、皮内、吸入、肺内、直腸、膣、舌下、筋肉内、静脈内、動脈内、クモ膜下もしくはリンパ内による非経口もしくは他の投与のために、任意の所望のおよび有効な方法で投与することができる。さらに、本明細書に開示されるＢＶＤ－５２３、他の阻害剤および様々な他の抗がん剤、または本発明の医薬組成物は、他の治療薬と組み合わせて投与することができる。本明細書に開示されるＢＶＤ－５２３、他の阻害剤および様々な他の抗がん剤、または本発明の医薬組成物は、所望により封入することができるか、さもなければ胃または他の分泌物から保護することができる。
本発明の医薬組成物は、１つまたは複数の有効成分を、１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤または担体との、および、任意選択で１つまたは複数の他の化合物、薬物、成分および／または材料との混合物の形態で含む。選択される投与経路に関係なく、本発明の薬剤／化合物は、当業者に公知である従来の方法によって薬学的に許容される剤形に製剤化される。例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy（第
２１版、Lippincott Williams and Wilkins、Philadelphia、PA.）を参照。
薬学的に許容される希釈剤または担体は当技術分野で周知であり（例えば、Remington,
The Science and Practice of Pharmacy（第２１版、Lippincott Williams and
Wilkins、Philadelphia、PA.）、およびThe National Formulary（American Pharmaceutical Association、Washington、D.C.）を参照）、例えば、糖（例えば、ラクトー
ス、スクロース、マンニトールおよびソルビトール）、デンプン、セルロース調製物、リン酸カルシウム（例えば、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウムおよびリン酸水素カルシウム）、クエン酸ナトリウム、水、水溶液（例えば、食塩水、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、デキストロース注射、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射、乳酸加リンゲル液）、アルコール（例えば、エチルアルコール、プロピルアルコールおよびベンジルアルコール）、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）、有機エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびトリグリセリド）、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド－ポリグリコリド、ポリ（オルソエステル）およびポリ（無水物））、エラストマーマトリックス、リポソーム、マイクロスフェア、油（例えば、コーン、胚芽、オリーブ、ヒマ、ゴマ、綿実および落花生）、カカオバター、ワックス（例えば、坐薬ワックス）、パラフィン、シリコーン、タルク、サリチル酸塩（silicylate）等が含まれる。本発明の医薬組成物において使用される薬学的に許容される希釈剤または担体の各々は、製剤の他の成分に適合し、対象に有害でないという意味において「許容」されるものでなければならない。選択される剤形および予定の投与経路のために適する希釈剤または担体は、当技術分野で周知であり、選択される投与の剤形および方法のための許容される希釈剤または担体は、当技術分野の通常の技術を使用して決定することができる。
本発明の医薬組成物は、任意選択で、医薬組成物において一般的に使用されるさらなる成分および／または材料を含有することができる。これらの成分および材料は、当技術分野で周知であり、（１）充てん剤または増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸；（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルジネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよびアラビアゴム；（３）保湿剤、例えばグリセロール；（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、グリコール酸デンプンナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび炭酸ナトリウム；（５）溶解緩和剤、例えばパラフィン；（６）吸収促進剤、例えば四級アンモニウム化合物；（７）湿潤剤、例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール；（８）吸収材、例えばカオリンおよびベントナイト粘土；（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコールおよびラウリル硫酸ナトリウム；（１０）懸濁剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント；（１１）緩衝剤；（１２）賦形剤、例えばラクトース、乳糖、ポリエチレングリコール、動物および植物脂、油、ワックス、パラフィン、カカオバター、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、サリチル酸塩、酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末；（１３）不活性な希釈剤、例えば水または他の溶媒；（１４）保存剤；（１５）界面活性剤；（１６）分散剤；（１７）制御放出または吸収遅延剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、生分解性ポリマー、リポソーム、マイクロスフェア、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンおよびワックス；（１８）乳白剤；（１９）アジュバント；（２０）湿潤剤；（２１）乳化および懸濁剤；（２２）可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（特に、綿実、落花生、コーン、胚芽、オリーブ、ヒマおよびゴマの油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル；（２３）噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素および揮発性の未置換の炭化水素、例えばブタンおよびプロパン；（２４）抗酸化剤；（２５）製剤を予定レシピエントの血液と等張性にする薬剤、例えば糖および塩化ナトリウム；（２６）増粘剤；（２７）コーティング材料、例えばレシチン；ならびに（２８）甘味料、香料、着色剤、芳香および保存剤が含まれる。そのような成分または材料の各々は、製剤の他の成分に適合し、対象に有害でないという意味において「許容」されるものでなければならない。選択される剤形および予定の投与経路のために適する成分および材料は、当技術分野で周知であり、選択される投与の剤形および方法のための許容される成分および材料は、当技術分野の通常の技術を使用して決定することができる。
経口投与のために適する本発明の医薬組成物は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、散剤、顆粒、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液、水中油型もしくは油中水型液体の乳剤、エリキシル剤もしくはシロップ剤、トローチ、ボーラス、舐剤またはペーストの形態であってよい。これらの製剤は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、従来の汎コーティング、混合、顆粒化または凍結乾燥工程によって調製することができる。
経口投与のための固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣剤、散剤、顆粒など）は、例えば、有効成分（複数可）を１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤または担体と、および、任意選択で１つまたは複数の充てん剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解緩和剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸収材、滑沢剤および／または着色剤と混合することによって調製することができる。類似の型の固体組成物は、適する賦形剤を使用したソフトおよびハード充填のゼラチンカプセルにおいて充填剤として用いることができる。錠剤は、任意選択で１つまたは複数の副成分と一緒に、圧縮または成形によって作製することができる。圧縮錠剤は、適する結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、保存剤、崩壊剤、表面活性または分散剤を使用して調製することができる。成形錠剤は、適する機械で成形によって作製することができる。錠剤および他の固体剤形、例えば糖衣剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤は、任意選択で切り目を付けることができ、または医薬製剤分野で周知である腸溶コーティングおよび他のコーティングなどのコーティングおよびシェルで調製することができる。それらは、その中の有効成分の徐放性または制御放出を提供するように製剤化することもできる。それらは、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって滅菌することができる。これらの組成物は乳白剤を任意選択で含むこともでき、また、それらが有効成分を腸管のある特定の部分だけに、またはそこに優先的に、任意選択で遅延型の様式で放出するような組成のものであってよい。有効成分は、マイクロカプセルの形態であってもよい。
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。液体剤形は、当技術分野で一般的に使用される、適する不活性な希釈剤を含有することができる。不活性な希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤などのアジュバント、甘味料、香料、着色剤、芳香および保存剤を含むこともできる。懸濁液は、懸濁剤を含有することができる。
直腸または膣投与のための本発明の医薬組成物は、坐薬として提供することができ、これは、１つまたは複数の有効成分（複数可）を、室温で固体であるが体温で液体であり、したがって直腸または膣の腔内で溶融して活性化合物を放出する、１つまたは複数の適する非刺激性希釈剤または担体と混合することによって調製することができる。膣投与のために適する本発明の医薬組成物には、適当であることが当技術分野で公知であるそのような薬学的に許容される希釈剤または担体を含有する、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたは噴霧製剤も含まれる。
局所または経皮投与のための剤形には、散剤、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、滴剤および吸入剤が含まれる。活性剤（複数可）／化合物（複数可）は、適する薬学的に許容される希釈剤または担体と無菌条件下で混合することができる。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは、賦形剤を含有することができる。散剤および噴霧剤は、賦形剤および噴射剤を含有することができる。
非経口投与のために適する本発明の医薬組成物は、１つまたは複数の薬剤（複数可）／化合物（複数可）を、１つまたは複数の薬学的に許容される無菌の等張性の水性もしくは非水性の溶液、分散液、懸濁液または乳剤または、使用時に、適する抗酸化剤、緩衝液、製剤を予定レシピエントの血液と等張性にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含有することができる、無菌の注射可能な溶液もしくは分散液中に復元することができる無菌の粉末と組み合わせた形で含むことができる。例えばコーティング材の使用によって、分散液の場合は所望の粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。これらの医薬組成物は、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの適するアジュバントを含有することもできる。等張剤を含有させることも望ましい可能性がある。さらに、吸収を遅らせる薬剤の含有によって、注射用の医薬剤形の長期吸収をもたらすことができる。
一部の場合には、薬物（例えば、医薬製剤）の作用を長くするために、皮下または筋肉内注射からのその吸収を遅くすることが望ましい。これは、水溶性が低い結晶性または非晶質の材料の液体懸濁液の使用によって達成することができる。
有効成分／薬物の吸収速度は次にその溶解速度に依存し、それは結晶のサイズおよび結晶形に次に依存する可能性がある。あるいは、非経口的に投与される薬剤／薬物の遅延される吸収は、有効成分／薬物を油ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成することができる。注射用デポー剤形は、生分解性ポリマーの中で有効成分のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製することができる。有効成分対ポリマーの比および用いられる特定のポリマーの性質によって、有効成分の放出速度を制御することができる。デポー注射製剤は、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を取り込むことによっても調製される。注射可能な材料は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって滅菌することができる。
製剤は、単位用量または多回用量密封容器、例えばアンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に無菌の液体希釈剤または担体、例えば注射用水を添加するだけでよい、凍結乾燥状態で保存することができる。即時使用の注射溶液および懸濁液は、上記のタイプの無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
本発明は、非ＥＲＫ ＭＡＰＫ経路阻害剤療法に対して抗療性または耐性であるがんの処置を提供し、ＥＲＫ阻害剤の作用を増強することが示された組合せを開示する。本明細書において、出願人は、異なるＥＲＫ阻害剤の組合せが同様に相乗的であることも示した。したがって、本明細書に記載される組合せの作用は、１つまたは複数のさらなるＥＲＫ阻害剤の使用によってさらに向上させることができると考えられる。したがって、本発明の一部の実施形態は、１つまたは複数のさらなるＥＲＫ阻害剤を含む。
本発明は、切除不能または転移性のＢＲＡＦ６００突然変異陽性メラノーマを有する対象を処置する方法であって、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩を６００ｍｇ ＢＩＤで対象に投与することを含む方法も提供する。
本発明の一部の実施形態では、突然変異はＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異である。
本発明は、切除不能または転移性のＢＲＡＦ６００突然変異陽性メラノーマを有する対象を処置するための組成物であって、ＢＶＤ－５２３または薬学的に許容されるその塩の６００ｍｇ、および任意選択で薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含む、組成物も提供する。
本発明の方法をさらに例示するために、以下の実施例が提供される。これらの実施例は例示的であるだけであり、本発明の範囲を限定するものでは決してない。
（実施例１）
材料および方法
がん細胞株を、標準の培地および血清条件下、細胞培養物中で維持した。用量漸増試験のために、Ａ３７５細胞を分割し、約４０～６０％集密まで増殖させ、次いで、初回用量の指定の薬物で処置した。表４は、漸増させた薬物による処置の要約を示す。
Figure 2022034068000013
単剤用量漸増をLittleら、２０１１年に基づいて実施し、図２０に概説した。次いで、細胞を７０～９０％集密まで増殖させ、分割した。分割比はできるだけ「標準」に保ち、処置間で合理的に一貫させた（例えば、最低でも親の標準の分割比の５０％）。培地を３～４日毎に新しいものにした。細胞が再度約４０～６０％集密に達したら、用量を漸増させた。４０～６０％ウインドウを逃した場合には、細胞を再度分割し、それらが４０～６０％集密に達したら投薬を行った。再度、培地を３～４日毎に新しいものにした。プロセスを必要に応じて繰り返した（図２０）。
単剤処置に関しては、出発濃度および用量の増加を概算ＩＣ５０から開始して、少しずつまたは穏やかに漸増させ、最初の４～５用量に関しては、用量を倍加させ、次の４用量に関しては同じ増分だけ増加させ、次いで、その後の用量に関しては１．５倍の濃度上昇に移して行った。
組合せ処置に関しては、出発濃度および用量の増加を各化合物の概算ＩＣ５０の半分から開始して（組合せアッセイにより、この結果、約４０～７０％阻害範囲がもたらされることが示唆される）、単剤と同様に漸増させた（すなわち、最初の倍加を投薬し、次いで、次の４用量に関しては同じ増分だけ増加させ、次いで、１．５倍の濃度上昇に移した）。表５は、これらのスキームを使用した、計画された用量の増加を示す。
Figure 2022034068000014
限界希釈によってプールした耐性細胞からクローン耐性細胞集団を得た。
増殖アッセイを使用して、漸増薬剤（複数可）に対する感受性の変化を適切な時間間隔（例えば月毎であるが、タイミングは利用可能な適切な細胞数に応じる）で追跡した。増殖アッセイのために、細胞を、９６ウェルプレート中、薬物を含まない、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に１ウェル当たり細胞３０００個で播種し、終夜接着させた後、化合物またはビヒクル対照を添加した。化合物はＤＭＳＯストックから調製して、図２Ａ～図２Ｈに示されている最終濃度範囲をもたらした。最終的なＤＭＳＯ濃度は０．１％で一定にした。試験化合物を細胞と一緒に３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気中で９６時間インキュベートした。次いで、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ １０％（ｖ／ｖ）を添加し、４時間インキュベートし、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダーを使用して蛍光生成物を検出した。培地のみのバックグラウンド値の平均を差し引き、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで４パラメータロジスティック方程式を使用してデータを分析した。パクリタキセルを陽性対照として使用した。
１カ月目についての増殖アッセイを、２８日目に、表６に示されている各薬剤の濃度で増殖している細胞を使用して開始した。
Figure 2022034068000015
２カ月目についての増殖アッセイを、５６日目に、表７に示されている各薬剤の濃度で増殖している細胞を使用して開始した。
Figure 2022034068000016
３カ月の漸増期間の最後に、培養物を最高濃度で２週間維持した後、増殖アッセイおよび潜在的な単一細胞クローニングの最終ラウンドを行った。増殖アッセイ／単一細胞クローニングには活発に増殖している細胞が必要なので、最高濃度において細胞が非常に緩徐に増殖している処置、または、直近に漸増した処置に関しては、より低い濃度でバックアップ培養物も維持した（表８）。ＢＶＤ－５２３による処置に関しては、細胞が、増殖がほぼ完全に停止したように見え、特に最高濃度（１．８μＭ）で脆弱に見える場合には、培養物をより低い濃度で２週間にわたって維持した。
Figure 2022034068000017
３カ月目についての増殖アッセイに、表９に示されている各薬剤の濃度で増殖している細胞を使用した。
Figure 2022034068000018
組合せ試験のために、Ａ３７５細胞（ＡＴＣＣ）を、３連の９６ウェルプレートに、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中、ウェル当たり細胞３０００個の細胞密度で播種し、終夜接着させた後、試験化合物またはビヒクル対照を添加した。１０×８用量マトリックスを使用し、最終的なＤＭＳＯ濃度を０．２％として、組合せについて試験した。９６時間のアッセイインキュベーション期間の後、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ １０％（ｖ／ｖ）を添加し、４時間インキュベートした後、蛍光プレートリーダーで読み取りを行った。Ａｌａｍａｒ
Ｂｌｕｅの読み取り後、培地／Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ混合物を払い落とし、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ／ＰＢＳ（１：１）１００μｌを添加し、プレートを製造者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ）通り処理した。培地のみのバックグラウンド値を差し引いた後、データを分析した。次いで、Ｂｌｉｓｓ相加性モデルを適用した。
簡単に述べると、組合せによる阻害について予測される阻害分率値を、方程式Ｃｂｌｉｓｓ＝Ａ＋Ｂ－（Ａ×Ｂ）（式中、ＡおよびＢは、薬物Ａ単独または薬物Ｂ単独で、特定の濃度において得られる阻害分率である）を使用して算出した。Ｃｂｌｉｓｓは、２種の薬物の組合せが厳密に相加性であるかどうかが予期される阻害分率である。Ｃｂｌｉｓｓ値を実験により観察された阻害分率値から差し引いて、「Ｂｌｉｓｓ過剰」値を得る。Ｂｌｉｓｓ過剰値が０よりも大きいことにより相乗性が示され、当該値が０未満であることにより拮抗性が示される。Ｂｌｉｓｓ過剰値は、ヒートマップ±ＳＤとしてプロットされる。
単一データおよび組合せデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで作成される用量応答曲線としても示される（ＤＭＳＯのみで処置された対照に対する％生存能力を使用してプロットする）。
集中的な組合せ試験のために、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ生存能力アッセイを組合せ試験に関して上記の通り実施した。さらに、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ ３／７アッセイを実施した。簡単に述べると、ＨＣＴ１１６細胞を、白色９６ウェルプレートに、マッコイ５Ａ＋１０％ＦＢＳ中、ウェル当たり細胞５０００個の細胞密度で、３連で播種した。Ａ３７５細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中にウェル当たり細胞５０００個の密度で播種した。細胞を終夜接着させた後、試験化合物またはビヒクル対照を添加した。ＤＭＳＯの最終濃度を０．２％にし、８００ｎＭのスタウロスポリンを陽性対照として含めた。２４時間および４８時間のアッセイインキュベーション期間を使用した。次いで、Ｃａｓｐａｓｅ－Ｇｌｏ（登録商標）３／７ ５０％（ｖ／ｖ）を添加し、プレートをオービタルシェーカーで５分にわたって混合し、室温で１時間インキュベートした後、発光プレートリーダーでの読み取りを行った。培地のみのバックグラウンド値を差し引いた後、データを分析した。
示差走査型蛍光定量法のために、ＳＹＰＲＯオレンジ（５，０００×溶液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を緩衝溶液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中に希釈した（１：１，０００）。Ｈｉｓ×６タグを付けたタンパク質として不活性ＥＲＫ２、活性ＥＲＫ２（ｐｐＥＲＫ２）、またはｐ３８αを含め、最終濃度を１μＭとした。１００％ＤＭＳＯ中タンパク質／色素溶液および化合物をウェル（最終的なＤＭＳＯ濃度２％ｖ／ｖ）に添加して所望の最終濃度を達成し、混合し、およびＲＴ－ＰＣＲ計器に入れた。次に、融解曲線を２５～９５℃から毎分１℃の速度で作成し、各タンパク質について化合物の非存在下または存在下での融解温度（Ｔｍ）を決定した。種々の薬物濃度の存在下でのＴｍの変化（ΔＴｍ）を示す。
ＥＲＫ１のＫｉ決定のために、活性化ＥＲＫ１（１０ｎＭ）を、２．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中種々の濃度の化合物と一緒に、０．１ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．５ｍＭのホスホエノールピルビン酸、２００μＭのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、１５０μｇ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ、５０μｇ／ｍＬの乳酸デヒドロゲナーゼ、および２００μＭのＥｒｋｔｉｄｅペプチド中、３０℃で１０分インキュベートした。６５μＭのＡＴＰを添加することによって反応を開始させた。吸光率（３４０ｎｍ）の低下をモニターし、阻害剤の濃度に応じたＩＣ５０を決定した。
ＥＲＫ２のＫｉを決定するために、ＢＶＤ－５２３のＥＲＫ２に対する阻害活性を、放射測定アッセイを使用し、構成成分の最終濃度を１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．１２ｎＭのＥＲＫ２、１０μＭのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、および５０μＭの３３Ｐ－γ－ＡＴＰとして決定した。反応の構成成分のＡＴＰおよびＭＢＰを除いた全てを予備混合し、９６ウェルプレートに分注した（３３μＬ）。ＤＭＳＯ中化合物のストック溶液を使用して、５００倍希釈物を作製した；ＤＭＳＯまたはＤＭＳＯ中阻害剤の１．５μＬアリコートを各ウェルに添加した。基質３３Ｐ－γ－ＡＴＰおよびＭＢＰ（３３μＬ）を添加することによって反応を開始させた。２０分後に、４ｍＭのＡＴＰを含有する２０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）（５５μＬ）を用いて反応をクエンチし、ＧＦ／Ｂフィルタープレートに移し、５％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ）を用いて３回洗浄した。Ｕｌｔｉｍａｔｅ
Ｇｏｌｄ（商標）シンチレーション剤（５０μＬ）を添加した後、試料をＰａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔで計数した。活性対濃度滴定曲線から、Ｐｒｉｓｍソフトウェア、バージョン３．０を使用してデータを競合的な密接結合阻害動態に関する方程式にあてはめることによってＫｉ値を決定した。
ＥＲＫ２のＩＣ５０を決定するために、標準の共役酵素アッセイによって活性をアッセイした。最終濃度は、以下の通りであった：０．１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、２．５ｍＭのホスホエノールピルビン酸、２００μＭのＮＡＤＨ、５０μｇ／ｍＬのピルビン酸キナーゼ、１０μｇ／ｍＬの乳酸デヒドロゲナーゼ、６５μＭのＡＴＰ、および８００μＭのペプチド（ＡＴＧＰＬＳＰＧＰＦＧＲＲ）。反応の構成成分をＡＴＰ以外は全てＥＲＫと予備混合し、アッセイプレートウェルに分注した。ＤＭＳＯ中ＢＶＤ－５２３を各ウェルに導入し、ウェル当たりのＤＭＳＯの濃度を一定に保った。ＢＶＤ－５２３濃度は、各滴定について５００倍の範囲にわたった。アッセイプレートを分光光度計（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）のプレートリーダーコンパートメント中、３０℃で１０分間インキュベートした後、ＡＴＰを添加することによって反応を開始させた。３４０ｎｍにおける吸光度の変化を時間に応じてモニターした；最初の傾きは反応の速度に対応する。速度対ＢＶＤ－５２３の濃度滴定曲線を、Ｋｉの値を決定するために競合的な密接結合阻害動態の方程式に、または、ＩＣ５０を決定するために３パラメータあてはめに、Ｐｒｉｓｍソフトウェア、バージョン３．０を使用してあてはめた。
アポトーシスアッセイのために、細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり細胞２×１０４個でプレーティングし、終夜付着させた、または５０％集密度まで増殖させた。細胞を、培地中ＢＶＤ－５２３の段階希釈物（最終的な体積２００μＬ、濃度範囲４～０．２５μＭ）を用いて処置し、３７℃、ＣＯ２インキュベーター中で４８時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ１００μＬで洗浄し、放射性免疫沈降アッセイ緩衝液６０μＬを添加し（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％［ｗ／ｖ］ＮＰ－４０、０．５％［ｗ／ｖ］デオキシコール酸ナトリウム、１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳ）、次いで、４℃で１０分間インキュベートして細胞を溶解させた。溶解物のアリコート３０μＬをカスパーゼアッセイ緩衝液（１２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのジチオスレイトール、１２．５μｇ／ｍＬのＡＣ－ＤＥＶＤ－ＡＭＣカスパーゼ基質）１００μＬに添加し、ＲＴで４時間～終夜インキュベートした。プレートを蛍光光度計（励起波長３６０ｎｍ、放出波長４６０ｍｍ）で読み取った。残りの３０μＬの溶解物を、ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して総タンパク質含有量について分析した（試料対ｗｏｒｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔの比１：８）。最終的な正規化されたカスパーゼ活性をタンパク質１μｇ当たりの蛍光単位として導き出し、ＤＭＳＯ対照と比較したカスパーゼ活性の増大倍率に変換した。
Ａ３７５異種移植片における抗腫瘍活性を測定するために、異種移植片を、雌の胸腺欠損ヌードマウスにおける段階的な皮下移植によって維持したＡ３７５細胞を用いて開始した。各試験マウスに、Ａ３７５腫瘍断片（１ｍｍ３）を右側腹部の皮下に埋め込んだ。腫瘍が標的サイズ（８０～１２０ｍｍ３）に達したら、動物を処置群および対照群にランダム化し、薬物による処置を開始した。
ＢＶＤ－５２３単剤療法を評価するために、１％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）中ＢＶＤ－５２３を、経口（ｐ．ｏ．）、ＢＩＤ、５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、または１５０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。陽性参照化合物としてテモゾロミドを７５ｍｇ／ｋｇまたは１７５ｍｇ／ｋｇで１日１回（ＱＤ）、合計で５回の処置（ＱＤ×５）で経口投与した。
ＢＶＤ－５２３とダブラフェニブの組合せの有効性を、１５匹の９群および１０匹の１群（群１０）にランダム化したマウスにおいて評価した。単独で、および組合せで、試験終了まで、ダブラフェニブを５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ、ＱＤでｐ．ｏ．投与し、ＢＶＤ－５２３を５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＤでｐ．ｏ．投与した；ビヒクルで処置した対照群およびテモゾロミドで処置した（１５０ｍｇ／ｋｇ、ＱＤ×５）対照群も含めた。組合せ投薬を２０日目に停止して腫瘍の再増殖をモニターした。動物を個別にモニターし、各腫瘍がエンドポイント体積２０００ｍｍ３に到達した時、または最終日（４５日目）のいずれか最初に来た時点で安楽死させ、エンドポイントまでの時間（ＴＴＥ）の中央値を算出した。２２８～１００８ｍｍ３の範囲のより大きな腫瘍を評価する場合には、上のステージのＡ３７５モデルにおいても組合せを評価した。ここでは、マウスを１４匹の１群（群１）および２０匹の４群（群２～５）にランダム化した。１日目にダブラフェニブプラスＢＶＤ－５２３（２５ｍｇ／ｋｇのダブラフェニブ＋５０ｍｇ／ｋｇのＢＶＤ－５２３ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇのダブラフェニブ＋１００ｍｇ／ｋｇのＢＶＤ－５２３）を用いて投薬を開始し、各薬剤を試験終了までｐ．ｏ．、ＢＩＤで与えた。試験には、５０ｍｇ／ｋｇのダブラフェニブおよび１００ｍｇ／ｋｇのＢＶＤ－５２３単剤療法群ならびにビヒクルで処置した対照群を含めた。腫瘍を週２回測定した。組合せ投薬を４２日目に停止して、腫瘍の再増殖を試験終了（６０日目）までモニターした。処置の転帰を、処置マウス対対照マウスに対するＴＴＥ中央値のパーセント増大と定義される％ＴＧＤから決定し、群間の差異をログランク生存分析によって分析した。ＴＧＩ分析のために、％ＴＧＩ値を、各処置（Ｔ）群対対照（Ｃ）に対して、最初の（ｉ）および最終的な（ｆ）腫瘍測定値を使用して、次式：％ＴＧＩ＝１－Ｔｆ－Ｔｉ／Ｃｆ－Ｃに基づいて算出し、報告した。マウスをＣＲ応答およびＰＲ応答についてもモニターした。試験終了時にＣＲの動物をＴＦＳにさらに分類した。
Ｃｏｌｏ２０５異種移植片におけるＢＶＤ－５２３活性を測定するために、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および２ｍＭのＬ－グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞を、埋め込みの前に、４回未満の継代で培養した。雌の胸腺欠損ヌードマウス（１９～２３ｇ）に対して、０日目に、Ｃｏｌｏ２０５細胞２×１０６個を右背側の腋窩領域に皮下注射した。
おおよその腫瘍体積が２００ｍｍ３であるマウスを６つの実験群にランダム化した。ビヒクル対照、１％ＣＭＣ（ｗ／ｖ）を週に１回調製した。ＢＶＤ－５２３を１％（ｗ／ｖ）ＣＭＣに所望の濃度で懸濁させ、氷上、６，５００ｒｐｍで５０分ホモジナイズした。ＢＶＤ－５２３懸濁液を週に１回調製し、ｐ．ｏ．、ＢＩＤ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、および２００ｍｇ／ｋｇの総１日用量（ｎ＝１２／群）、８時間または１６時間の投薬スケジュールで１３日間、投与した。ビヒクル対照（ｎ＝１２）を同じ投薬レジメンを使用して投与した。ＣＰＴ－１１を陽性参照化合物として投与した（ｎ＝１２）。各１ｍＬのＣＰＴ－１１注射はイリノテカン２０ｍｇ、ソルビトール４５ｍｇ、および乳酸０．９ｍｇを含有した。ＣＰＴ－１１を２つの連続した用量について４日毎に１日当たり１００ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。
Ｃｏｌｏ２０５異種移植片におけるＥＲＫ１／２同位元素でタグ付けした内部標準（ＩＴＩＳ）質量分析を測定するために、凍結腫瘍を１０体積の氷冷溶解緩衝液（１０ｍＭのＴＲＩＳ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル［Ｒｏｃｈｅ、カタログカタログ番号１８３６１７０］、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩ［Ｓｉｇｍａ、カタログカタログ番号Ｐ－２８５０］、ホスファターゼ阻害剤カクテルＩＩ［Ｓｉｇｍａ カタログカタログ番号５７２６］、およびベンゾナーゼ［Ｎｏｖａｇｅｎ カタログカタログ番号７０６６４］）に溶解させた。溶解物を遠心分離（４℃、１００，０００×ｇで６０分）によって清澄化し、上清を溶解緩衝液で２ｍｇ／ｍＬに調整した。アガロースとカップリングし、汎抗ＥＲＫ１抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ カタログカタログ番号ｓｃ－９３ａｃ）を使用してＥＲＫ１を免疫沈降させた。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分解し、ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色し、ＥＲＫバンドをかみそりで切り取った。ゲルスライスを２０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３３００μＬで洗浄し、さいの目に切って小片にし、Ｐａｇｅ
Ｅｒａｓｅｒ Ｔｉｐ（Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ、カタログ番号ＳＥＭ０００７）に入れた。ゲル断片を還元し、アルキル化した後、トリプシン消化した。トリプシン断片を５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸７５μＬ中に単離し、得られた試料をＳｐｅｅｄＶａｃ中に０～１０μＬまで濃縮した。
ＩＴＩＳ分析のために、消化した試料に、重原子で標識したペプチド標準物質をスパイクとして加え、リン酸化の分率を連結液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＭＳ）によって数量化した。１：７５０分裂後にナノスケールのフローを送達するＦｌｕｘ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＲｈｅｏｓ ２０００バイナリーポンプ、ＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ｎａｎｏ－ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ（Ｃ１８、５ｍｍ、１００Å、３０ｍｍ ＩＤ×１ｍｍ）、および、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）エミッターとしての機能も果たすＮｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ＰｉｃｏＦｒｉｔ ＡＱＵＡＳＩＬ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ（Ｃ１８、５ｍｍ、７５／１５ｍｍ ＩＤ×１０ｃｍ）を使用してナノキャピラリークロマトグラフィーを実施した。ナノＥＳＩ供給源と連結したＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ＡＰＩ ３０００質量分析計をＭＳ分析に使用した。噴霧ガス供給源と接続した自社製ガスノズルを使用して定常のナノフロー噴霧を補助した。データを多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで獲得した：全てのＭＲＭチャネルについて、噴霧ガス、３；カーテンガス、７；衝突ガス、５；イオンスプレー電圧、２１５０ボルト、出口電位、１０ボルト；Ｑ１／Ｑ３分解能、低／単位；および滞留時間、６５ｍｓｅｃ。全ての生ＭＳデータをＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍからのＡｎａｌｙｓｔソフトウェアスーツとカスタムツールの組合せを使用して処理した。
獲得耐性の細胞株モデルにおける薬物感受性を評価するために、用量を漸増させたＡ３７５細胞および同質遺伝子型ＲＫＯ細胞の薬物感受性を９６時間増殖アッセイで評価した。ＲＫＯ同質遺伝子型細胞（１０％［ｖ／ｖ］ＦＢＳを含有するマッコイ５Ａ）または用量を漸増させたＡ３７５細胞（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを９６ウェルプレートに播種し、終夜接着させた後、化合物またはビヒクル対照を添加した。用量を漸増させたＡ３７５細胞を阻害剤の非存在下で播種したことに留意されたい。化合物を０．１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯストックから調製して、示されている最終濃度を得た。試験化合物を、細胞と一緒に３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気中で９６時間インキュベートした。ＲＫＯ細胞に関しては、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の指示に従って添加し、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダーを使用して発光を検出した。Ａ３７５アッセイのために、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）１０％（ｖ／ｖ）を添加し、４時間インキュベートし、次いで、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒを使用して蛍光生成物を検出した。培地のみのバックグラウンド値の平均を差し引き、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで４パラメータロジスティック方程式を使用してデータを分析した。
ＥＲＫ１のＩＣ５０決定を最終的な反応体積２５μＬで測定した。ＥＲＫ１（ヒト）（５～１０ｍＵ）を、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．０２ｍＭのグリコールエーテルジアミン四酢酸（ethyleneglycoltetracetic acid）、２５０μＭのペプチド、１０ｍＭの酢酸Ｍｇ、およびγ－３３Ｐ－ＡＴＰ（特異的活性およそ５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ、必要に応じた濃度）と一緒にインキュベートした。Ｍｇ ＡＴＰを添加することによって反応を開始させた。室温（ＲＴ）で４０分インキュベートした後、３％（ｗ／ｖ）リン酸溶液５μＬを添加することによって反応を停止させた。次いで、反応物１０μＬをＰ３０フィルターマット上にスポットし、７５ｍＭのリン酸で３回、５分にわたって洗浄し、次いで、メタノールで１回洗浄した後、乾燥およびシンチレーション係数を行った。
ＲＫＯ ＭＥＫ１ Ｑ５６Ｐ同質遺伝子型細胞は、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ；＃ＨＤ １０６－０１９）により、組換えＡＡＶ媒介遺伝子標的化戦略を使用して作製された。簡単に述べると、ｒＡＡＶウイルスを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への適切な標的化ベクターおよびヘルパーベクターのトランスフェクション後に生成し、ＡＡＶ精製キット（Ｖｉｒａｐｕｒ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）を使用して精製し、ｑＰＣＲを使用して力価測定を行った。次いで、親ホモ接合性ＲＫＯ細胞（ＭＥＫ１についてホモ接合性野生型）にｒＡＡＶウイルスを感染させ、選択カセットが組み込まれたクローンをＧ４１８選択によって同定し、拡大増殖させた。単一の対立遺伝子へのＭＥＫ１ Ｑ５６Ｐ点突然変異のノックインについてヘテロ接合性である、厳密に標的化されたクローンをＰＣＲおよび配列決定によって同定した。
突然変異体ＫＲＡＳ（De Roockら、２０１０年、JAMA、３０４巻、１８１２～１８２
０頁）のノックインについてヘテロ接合性の同質遺伝子型ＳＷ４８細胞株をＨｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから得た（カタログ番号；ＨＤ １０３－００２、ＨＤ １０３－００６ ＨＤ １０３－００７、ＨＤ １０３－００９、ＨＤ １０３－０１０、ＨＤ
１０３－０１１、ＨＤ １０３－０１３）。増殖アッセイのために、細胞を、９６ウェルプレート、１０％ＦＢＳを補充したマッコイ５Ａ培地中に播種し、終夜接着させた後、化合物またはビヒクル対照を添加した。試験化合物を、細胞と一緒に、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で９６時間インキュベートした。次いで、Ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅを使用して生存能力を評価した。
Ｕｐｓｔａｔｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙにおいて独自のＫｉｎａｓｅＰｒｏｆｉｌｅｒアッセイを行い、Ｄａｖｉｅｓらが用いたものと同様の放射測定検出を使用して、７０種のキナーゼのパネルに対するＢＶＤ－５２３の選択性をプロファイリングした。
薬物感受性分析を、以前に記載されている（Yangら、２０１３年）ハイスループットスクリーニングを使用したＴｈｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｊｅｃｔの一部として行った。
ウェスタンブロット分析のために、Ａ３７５細胞を、１０ｃｍディッシュ、ダルベッコ改変イーグル培地プラス１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳに播種した。細胞を終夜接着させた後、試験化合物またはビヒクルを添加した。ＲＫＯ細胞を用いた実験のために、これらの細胞を、マッコイ５Ａ＋１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを伴う６ウェルプレートまたは１０ｃｍディッシュに播種した。次いで、細胞を所望の濃度および持続時間で処置した。細胞をトリプシン処理により採取し、ペレット化し、スナップ凍結した。溶解物を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製し、１１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって清澄化し、ビシンコニン酸アッセイによって定量化した。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分解し、ポリフッ化ビニリデン膜にブロッティングし、示されている標的を対象とする抗体（すなわち、ｐＲＢ［Ｓｅｒ７８０］、カタログカタログ番号９３０７；ＣＣＮＤ１、カタログカタログ番号ａｂ６１５２；ＢＣＬ－ｘＬ、カタログカタログ番号２７６２；ＰＡＲＰ、カタログカタログ番号９５４２；ＤＵＳＰ６、カタログカタログ番号３０５８Ｓ）を用いてプローブした。
Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｈａｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＰＰＡ）のために、Ａ３７５細胞、ＭＩＡＰａＣａ－２細胞、ＨＣＴ１１６細胞、Ｃｏｌｏ２０５細胞、ＨＴ－２９細胞、およびＡＮ３Ｃａ細胞（ＡＴＣＣ）を８０％集密でプレーティングし、終夜回復させ（ＭＩＡＰａＣａ－２細胞は３０％集密でプレーティングし、３日間にわたって回復させた）、次いで、１０μＭの各化合物（すなわち、ＢＶＤ－５２３、ＳＣＨ７２２９８４、ＧＤＣ－０９９４、またはＶｘ－１１ｅ）を用いて３７℃で６時間にわたって処置した。対照ウェルは、細胞溶解物の生成前にＤＭＳＯを０．１％（ｖ／ｖ）で用いて６時間にわたって処置した。次いで、試料を、逆相タンパク質マイクロアレイ技術（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ Ｈｅａｌｔｈ）を使用して分析した。
Ｃｏｌｏ２０５異種移植片におけるｐＥＲＫ ＩＨＣを分析するために、異種移植腫瘍を７０％～１００％の段階的エタノールを用いて終夜処置し、キシレンを２回交換して清澄し、パラフィンに浸潤させ、パラフィンブロックに包埋した。次いで、５μｍの切片を切り取り、正電荷をもつガラススライド上に置き、少なくとも３０分、ただし１時間未満、６０℃で焼いた。各動物および用量群からの単一の切片を抗ホスホｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰＫ抗体（ｐＥＲＫ［１：１００］、ＣＳＴ；カタログ番号９１０１；ロット番号１６）を用いてプローブし、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、次いで、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ ２顕微鏡を使用して顕微鏡レベルで分析した。アイソタイプ対照（ウサギ、Ｚｙｍｅｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号０８－６１９９、ロット番号４０１８６４５８）を陰性対照として実行した。
ＦＡＣＳ分析のために、細胞をこすり取り、１，５００ｒｐｍで５分間にわたってペレット化し、次いで、緩衝液１ｍＬに再懸濁させ、－７０℃で凍結した。凍結細胞を解凍し、再度遠心分離し、その後、緩衝液Ａ（スペルミン四塩酸塩界面活性剤緩衝液中トリプシン）０．２５ｍＬに１０分間再懸濁させて、細胞凝集塊を脱凝集させ、細胞膜および細胞骨格を消化した。緩衝液Ｂ（緩衝液中トリプシン阻害物質およびリボヌクレアーゼＩ、０．２ｍＬ）を暗闇中で１０分にわたって添加した。得られた、ＤＮＡが染色された核を濾過し、ＦＡＣＳによって分析した。ヒストグラムを分析して、ｎおよび２ｎ ＤＮＡ（またはそれよりも高い）含有量の存在に基づいて細胞周期のＧ１期、Ｓ期、およびＧ２／Ｍ期にある細胞の割合を確立した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組合せ活性を測定するために、Ｇ－３６１細胞５０００個を、３連の、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを伴うマッコイ５Ａを含有する９６ウェルプレートに播種し、終夜接着させた。ベムラフェニブ／ＢＶＤ－５２３組合せを、１０×８用量マトリックスを使用して試験した。化合物を、細胞と一緒に、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気中で７２時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を製造者の指示に従って添加し、ＭＢＧ ＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダーを使用して発光を検出した。用量マトリックスにわたる相互作用を、ＨｏｒｉｚｏｎのＣｈａｌｉｃｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してＬｏｅｗｅ相加性およびＢｌｉｓｓ独立モデルによって決定した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて用量漸増によって化合物耐性を生じさせるために、Ａ３７５親細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６１９）を、１０％熱失活ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で約４０～６０％集密まで増殖させ、次いで、初回用量のＢＶＤ－５２３、トラメチニブ、またはダブラフェニブを単独で、または組み合わせて、各化合物のＩＣ５０でまたはでそれよりもわずかに低く用いて処置した；組合せ試験に関しては、最初の投薬は各化合物のＩＣ５０の半分とした。細胞を約７０～９０％集密まで増殖させ、分割した；培地を３～４日毎に新しいものにした。細胞が再び約４０～６０％集密に達したら、用量を同じ増分（出発濃度と等しい）だけ漸増させ、次いで、１．５倍の濃度上昇に移し、その後、細胞が急速に適合し続けた場合にはさらに２倍の上昇に移した（例えば、ダブラフェニブ漸増の最初の６用量は、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、および３７．５ｎＭであった）。このプロセスを必要に応じて繰り返した。
図３０Ａの細胞生存能力アッセイを、５日間薬物処置した後、十分な血清中、高グルコース条件下でＲｅｓａｚｕｒｉｎ（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）代謝アッセイにより実施した。細胞を３８４ウェルマイクロプレート中、１０％ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトアビジン＋高グルコース（１８～２５ｍＭ）を伴う培地に約１５％～５０％集密に播種した。薬物処置中の増殖を最適化するために、各細胞株について最適な細胞数を決定した。細胞株の付着のために、終夜インキュベートした後、細胞を、液体ハンドリングロボット工学を使用して９つの濃度の各化合物（一連の２倍希釈物）で処置し、９６時間の時点でアッセイのためにインキュベーターに戻した。懸濁液細胞株に関しては、細胞を、プレーティングした直後に化合物で処置し、９６時間の時点でインキュベーターに戻した。次いで、細胞を、グルタチオンを含まない培地中に調製した５５μｇ／ｍｌのＲｅｓａｚｕｒｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を用いて４時間染色した。蛍光シグナル強度の定量化を、蛍光プレートリーダーをレサズリンに対する５３５／５９５ｎｍの励起および放出波長で使用して実施した。全てのスクリーニングプレートをストリンジェントな品質管理基準に供した。細胞生存能力に対する影響を測定し、曲線あてはめアルゴリズムを未加工のデータセットに適用して、最大半数阻害濃度（ＩＣ５０）を含めた、薬物応答に関する多パラメータ記述を導き出した。ＩＣ５０は、μＭ単位のＩＣ５０の自然対数で表される（ＬＮ＿ＩＣ５０；ＥＸＰはμＭ単位のＩＣ５０に戻る）。ＩＣ５０の外挿には、非常に高い値をもたらす場合を考慮した。所望であれば、最大の試験濃度（および低値に関しては最小の試験濃度）におけるＩＣ５０値に上限を設けることによってデータを試験濃度範囲に制限した。
ベムラフェニブに対して臨床的に抗療性になったＢＲＡＦＶ６００Ｅ患者に由来するメラノーマを表す患者由来の異種移植片（ＡＴ０５２Ｃ）におけるＢＶＤ－５２３の有効性試験に関して。腫瘍断片を宿主動物から採取し、免疫欠損マウスに埋め込んだ。平均腫瘍体積がおよそ１７０ｍｍ３の時点で試験を開始し、その時点で動物を対照（１％［ｖ／ｖ］ＣＭＣ ｐ．ｏ．、ＢＩＤ×３１）および３つの処置群（ＢＶＤ－５２３［１００ｍｇ／ｋｇ］、ダブラフェニブ［５０ｍｇ／ｋｇ］、またはＢＶＤ－５２３／ダブラフェニブ［１００／５０ｍｇ／ｋｇ］、ｎ＝１０／群）を含めた４つの群にランダム化した；処置薬物は全てＢＩＤ×３１スケジュールでｐ．ｏ．投与した。
ヒト全血試料におけるＰＭＡにより刺激されるＲＳＫ１リン酸化のＢＶＤ－５２３による阻害についてのＩＣ５０を決定するために、１０名の健康なドナー（２２～６１歳）について、１０μＭのＢＶＤ－５２３から５ｎＭのＢＶＤ－５２３までにわたる８点濃度曲線を使用して、ＰＭＡにより刺激されるＲＳＫ１リン酸化のＢＶＤ－５２３による阻害についてのＩＣ５０値を決定した。対照は、各ドナーについての３つの無刺激試料および３つのＰＭＡで刺激した試料からなるものであった。各試料について、ホスホ－ＲＳＫ（ｐＲＳＫ）レベルおよび総ＲＳＫレベルの両方を決定し、ｐＲＳＫ／ＲＳＫレベルを使用してデータを算出した。
各ドナーから血液３０ミリリットルをナトリウムヘパリンバキュテイナ中に採血した。ドナー当たり２２本の２ｍＬマイクロチューブそれぞれに全血１ｍｌを添加した。マイクロチューブにドナー番号（１～１０）を標識し、その後に処置名を標識した：「Ａ」は、ＰＭＡ刺激のみ（最大）、「Ｂ」は、ＰＭＡ刺激を受ける、ＢＶＤ－５２３を含有する試料；および「Ｃ」は、無刺激試料（最小）であった。群Ａおよび群Ｃの全てのチューブにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を最終濃度０．１％まで添加した。次いで、試料を室温で穏やかに揺り動かした。
ＢＶＤ－５２３（１００％ＤＭＳＯ中１０ｍＭ）を、１００％ＤＭＳＯへの３倍希釈を用いて段階的に希釈した。次いで、これらの１００％ＤＭＳＯ中に段階的に希釈したＢＶＤ－５２３試料を、１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中に１０倍希釈し、指定のＢＶＤ－５２３濃度それぞれについて、これらの希釈標準溶液のそれぞれ１０μＬを血液１ｍＬ当たりに添加した。ＢＶＤ－５２３の各濃度について２連で実行し、それぞれ２つの１ｍＬ血液試料から、完全な８点濃度曲線のために１６の全試料を得た。次いで、試料を室温で、最低でも２時間であるが、３時間未満にわたって穏やかに揺り動かした。
全ドナーについて、群Ａおよび群Ｂのヒト全血試料を、ＰＭＡを最終濃度１００ｎＭで用いて室温で２０分刺激した。群Ｃの試料は、ＰＭＡを用いた処置はしなかったが他の全ての試料と同様に揺り動かし、取り扱った。
各試料についてＰＭＡによる処置が完了したら、末梢血単核細胞をヒト全血から単離した。各試料由来の血液１ｍｌを、２ｍＬ微量遠心チューブ中、０．７５ｍＬの室温Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７に穏やかに重ねた。試料をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ微量遠心機において１６，０００×ｇで２分間遠心分離した。界面および上層を取り出し、低温ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）１ｍＬを含有するチューブに添加した。次いで、これらの試料を１６，０００×ｇで３０秒間遠心分離して細胞をペレット化した。緩衝液の上清を吸引によって除去し、ペレットを低温ＤＰＢＳ １ｍＬに再懸濁させた。次いで、各試料からのペレットを上記の通り再ペレット化した。緩衝液を吸引によって除去し、ペレットを以下に示されている通り溶解させた。
完全な溶解緩衝液は、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｒｉｓ溶解緩衝液、１×Ｈａｌｔ プロテアーゼ阻害剤カクテル、１×ホスファターゼ阻害剤カクテル２、１×ホスファターゼ阻害剤カクテル３、２ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル、および０．１％ドデシル硫酸ナトリウムからなるものであった。各試料群について溶解緩衝液を氷上で維持し、新鮮にした。最終的な細胞ペレットを、完全な溶解緩衝液１２０μＬを添加することによって溶解させた。試料を、細胞ペレットが消失するまでボルテックスし、次いで、ドライアイス上で急速冷凍した。試料を、ｐＲＳＫおよび総ＲＳＫをＥＬＩＳＡによって測定する前に－２０℃で保管した。
ｐＲＳＫ ＥＬＩＳＡ（ＰａｔｈＳｃａｎ）に関しては、解凍した溶解物を試料希釈剤（ＥＬＩＳＡキット中に提供される）と１：１で組み合わせた：丸底９６ウェルプレート中、溶解物１２０μＬを試料希釈剤１２０μＬに添加した。次いで、この組合せをｐＲＳＫマイクロウェルにウェル当たり１００μＬで移した。総ＲＳＫ ＥＬＩＳＡ（ＰａｔｈＳｃａｎ）に関しては、すでに試料希釈剤中に１：１希釈しておいた溶解物２０μＬを、丸底９６ウェルプレート、試料希釈剤２００μＬ中にさらに希釈した。次いで、この組合せを総ＲＳＫマイクロウェルにウェル当たり１００μＬで移した。プレートをプレートシールで密閉し、４℃で、標的タンパク質の最良の検出がもたらされることが示された時間である１６～１８時間にわたってインキュベートした。どちらのＥＬＩＳＡもキットの指示に従って展開した。
１８歳以上の患者を、治癒不可能な組織学的に確認された転移性または進行期の悪性腫瘍を有する；ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが０または１である；適切な腎機能、肝機能、骨髄機能、および心機能；ならびに平均余命が３カ月以上である場合、参加適格とした。患者は、転移性疾患に対して最大２種の先行選択の化学療法を受けていてよい。除外基準は、公知の制御されていない脳転移；試験薬の吸収が損なわれる可能性がある胃腸の状態；網膜静脈閉塞症または中心性漿液性網膜症の履歴または現行の証拠／リスク；ならびに、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｄ６、およびＣＹＰ３Ａ４の強力な阻害剤であるまたはＣＹＰ３Ａ４の強力な誘導因子であることが公知の薬物を用いた同時療法であった。参加者全員があらゆる試験手順の開始前にインフォームドコンセントを提示した。
少なくとも１つの用量のＢＶＤ－５２３を受けた患者を、ＳＡＳ（バージョン９．３）ソフトウェアを使用した分析に含めた。データカットオフは２０１６年１２月１日であった。この試験は、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ番号ＮＣＴ０１７８１４２９で登録されている。
本発明は、進行悪性腫瘍を有する患者における漸増用量のＢＶＤ－５２３の安全性、薬物動態学、および薬力学を評価するための、オープンラベル、多施設第Ｉ相試験からのデータを示す。投薬レジメンは、加速滴定および標準のコホート３＋３用量漸増スキーマの両方を組み合わせたものであり、これらを共同で使用して、進行固形腫瘍を有する患者におけるＢＶＤ－５２３のＭＴＤおよびＲＰ２Ｄを同定した。処置コホート当たり１～６名の患者を、１０ｍｇ ＢＩＤの用量から出発して逐次的に増量した経口用量のＢＶＤ－５２３をＢＩＤスケジュール（１２時間間隔）、２１日サイクルで受けるように割り当てた。ＢＶＤ－５２３を、２１日サイクル、以下の用量：１０ｍｇ（ｎ＝１）；２０ｍｇ（ｎ＝１）；４０ｍｇ（ｎ＝１）；７５ｍｇ（ｎ＝１）；１５０ｍｇ（ｎ＝１）；３００ｍｇ（ｎ＝４）；６００ｍｇ（ｎ＝７）；７５０ｍｇ（ｎ＝４）；および９００ｍｇ（ｎ＝７）で連続的にＢＩＤ投与した。
患者は、疾患の進行、許容されない毒性、または別の中止基準を満たす臨床的観察まで、ＢＩＤ経口用量を受けた。用量漸増は、単一の患者コホートにおいて、患者１名にグレード２以上の毒性（脱毛症または下痢を除く）が生じるまで、最大１００％の増分で行った。次いで、コホートをそれぞれ少なくとも３名の患者に拡大し、その後の用量漸増の増分を最大１００％から最大５０％に減らした。患者３名のコホート内の少なくとも１名の患者にＤＬＴが生じた場合には、最大３名の追加の患者をこの用量レベルで処置する。１を超えるＤＬＴが患者６名以下で生じた場合には、この用量レベルを非耐用量と定義し、用量漸増を停止した。最も高い現行用量を受けている患者が少なくとも３週間にわたって観察されており、用量制限副作用の報告が所与の用量に割り当てられた患者６名のうち２名未満であれば、患者内用量漸増を許容した。ＤＬＴまたは許容されない毒性が生じた患者では、毒性がグレード１以下に戻るまで処置を中断した。次いで、ＢＶＤ－５２３による処置の再開を、次に低い試験用量レベルで、または２０％～３０％用量を減少させて開始し、カプセル投与量と調和させた。
第Ｉ相試験の主要目的は、ＢＶＤ－５２３の安全性および忍容性を、用量制限毒性、ＭＴＤ、およびＲＰ２Ｄを決定することによって定義することであった。副次目的には、進行悪性腫瘍を有する患者におけるＢＶＤ－５２３の薬物動態プロファイルの決定、および、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１を使用して身体検査または放射線学的検査によって評価される腫瘍応答に対するあらゆる予備的な臨床効果の調査が含まれた。探索的目的には、薬力学的マーカー（バイオマーカー）測定基準の評価および示されている通り１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴによって評価される腫瘍応答に対する予備的な臨床効果の調査が含まれた。
ＭＴＤ、ＤＬＴ、およびＲＰ２Ｄの決定に関しては、ＭＴＤを、処置の最初の２１日間で、ＢＶＤ－５２３に関連するＤＬＴが患者の３３％以下に生じる最高用量コホートと定義した。ＤＬＴを、処置の最初の２１日間で、＞１日にわたるグレード４以上の血液学的毒性；合併症を伴うグレード３の血液学的毒性（例えば、出血を伴う血小板減少症）；無処置の悪心、嘔吐、便秘、疼痛、および皮疹以外（これらは、適切な処置にもかかわらずＡＥが持続した場合にＤＬＴになる）のグレード３以上の非血液学的毒性；またはＢＶＤ－５２３に関連する毒性に起因してサイクル１において３日間を超える処置の中断（もしくは＞７日間にわたってサイクル２に入れないこと）をもたらすＢＶＤに関連する毒性と定義した。
ＲＰ２Ｄは、ＭＴＤと同じ高さにすることができ、臨床治験責任医師、医療モニター、およびスポンサーとの議論で決定した。薬物動態学、薬力学、および多数のサイクルの後に観察されるあらゆる累積的毒性に関連する観察を、ＲＰ２Ｄを裏付ける理論的根拠に含めた。
安全性評価に関しては、ＡＥを、医薬品を投与された患者に生じたあらゆる好ましくない医療上の出来事であり、必ずしもＢＶＤ－５２３との因果関係を有するものではないと定義し、ＭｅｄＤＲＡコード付け辞書を使用してコード付けした。ＳＡＥは、用量を問わず生じる、死に至るもの、生命を脅かすもの、入院もしくは現在の入院の延長が必要になるもの、または永続的もしくは顕著な能力障害／不全または先天異常／出生時欠損をもたらすあらゆる好ましくない医療上の出来事とした。ＡＥの重症度は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ、Ｇｒａｄｉｎｇ Ｓｃａｌｅ、バージョン４に従ってグレード付けした。
安全性評価は、ベースライン、８日目、１５日目、２２日目、２９日目、３６日目、および４３日目に、ならびに、処置を継続した患者においては、３週間毎に、または臨床的に必要が示された場合にはその後に行った。各評価には、身体検査および臨床検査を含めた。臨床的に有意である場合および治験責任医師の自由裁量で心電図を繰り返した。治験責任医師は、ＡＥが試験薬に関連するものであるか否かに関して判断を下し、消散もしくは安定化まで、または、ＡＥがもはや臨床的に有意でないと判断されるまで経過観察した。
薬物動態分析に関しては、薬物動態集団は、少なくとも１つの用量のＢＶＤ－５２３を受け、血漿および／または尿についての評価可能な薬物動態データを有する患者からなるものであった。血液試料を、投薬前、次いで、１日目（受診２；ベースライン／処置開始）および１５日目（受診４；定常状態で）の朝の投薬後０．５時間（±５分）、１時間（±５分）、２時間（±１０分）、４時間（±１０分）、６時間（±１０分）、８時間（±１０分）、および１２時間（±２時間）に収集した。２２日目に、用量投与前に、最終的な血液試料を薬物動態分析のために収集した。尿試料を、１日目および１５日目に、投薬前、ならびに投薬後１～６時間および６～１２±２時間間隔で収集した。血漿および尿試料を、有効なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を使用してＢＶＤ－５２３および代謝産物について分析した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）を使用し、非コンパートメント法を用いて標準の薬物動態パラメータを得た。用量と曝露の関係を、標準の最小二乗回帰分析を使用して算出した。
ＢＶＤ－５２３による標的阻害の薬力学的確認に関しては、ＢＶＤ－５２３による標的化ＥＲＫ阻害を、第Ｉ相試験中、異なる用量のＢＶＤ－５２３（１０～９００ｍｇ ＢＩＤ）を受けた進行固形腫瘍を有する患者（Ｎ＝２７）から得たヒト全血試料中のｐＲＳＫを標的バイオマーカーとして調査することによって決定した。４つの時点（ベースラインの投薬前、ベースラインの投薬後４時間、１５日目の投薬前、および１５日目の投薬後４時間）からのＢＶＤ－５２３の活性を、ＢＶＤ－５２３と一緒にインキュベートした、ＰＭＡで刺激した血液のパーセント活性（ｐＲＳＫ）として表した。
抗腫瘍応答の測定に関しては、身体検査に基づく腫瘍測定をベースラインおよび各処置サイクルの１日目に行った。ＣＴおよび他の評価を２～３サイクル毎に行った。所見をＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１に従って評価した：ＣＲを全ての標的病変の消失と定義した；ＰＲを、ベースライン測定値を参照とみなして標的病変の最長直径の合計の３０％以上の減少と定義した；安定な疾患を、ベースライン測定値を参照とみなして、ＰＲと認定するには十分な縮小ではなく、進行性疾患と認定するには十分な増加でないことと定義した。代謝応答を、１８Ｆ－グルコースの腫瘍による取り込みを１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴスキャンを第１の用量のＢＶＤ－５２３を受ける前および１５日目（受診４）に可視化することによって評価した。
（実施例２）
用量漸増および増殖アッセイ － １カ月目
用量漸増の進行 － １カ月目
Ａ３７５細胞に、ＢＶＤ－５２３、ダブラフェニブ、およびトラメチニブを単剤としてまたは組合せでのいずれかで使用して用量漸増を行った。１カ月目の間、用量を少しずつ増加させた。増殖速度の顕著な低下以外は、細胞は、一般に、漸増をよく忍容し、用量を、２カ月目ではより大きな増分を使用してより積極的に漸増するように計画した。図１Ａ～図１Ｃは、用量漸増試験についての１カ月目の進行を示す。
増殖アッセイ結果 － １カ月目
ＢＶＤ－５２３、ダブラフェニブ、およびトラメチニブによる処置に対する、漸増を受けた細胞株の応答対親細胞株の応答を評価するために増殖アッセイを実施した。
図２Ａ～図２Ｈは、試験の１カ月目からの正規化された増殖アッセイ結果および未加工の増殖アッセイ結果を示す。異なる処置間のＤＭＳＯ対照における最大シグナルの差異（図２Ｄ、図２Ｆ、および図２Ｈ）は処置間の示差的な増殖速度を示唆するものであることに留意されたい。これらの差異は、増殖アッセイにおける阻害剤に対する株の応答に影響を及ぼす可能性がある。
表１０は、試験の１カ月目についてのＩＣ５０データを示す。
Figure 2022034068000019
漸増用量のダブラフェニブまたはトラメチニブの、単剤としてまたは組合せでの存在下で増殖させた細胞が、増殖アッセイにおいてこれらの２種の薬剤に対する応答の低減を示す早期のわずかな兆しがあった。
２カ月目の初期に、ダブラフェニブのみで処置された細胞の増殖速度が１カ月目の初期と比べて著しく増大した。これにより、進行の速度の増大が可能になり、耐性が明らかになり始めたことが示唆された。
（実施例３）
用量漸増および増殖アッセイ － ２カ月目
用量漸増の進行 － ２カ月目
試験の２カ月目では、大部分の処置で最初の穏やかな漸増期と比較してより大きな増分（１．５倍）で用量を増加させる期に移るのが見られた。ダブラフェニブ単剤およびトラメチニブ単剤の漸増が最も急速であり、細胞は１００×親細胞ＩＣ５０と等しい濃度で増殖した（図３Ａおよび図３Ｂ）。ＢＶＤ－５２３単剤の漸増は、ダブラフェニブおよびトラメチニブと比較してより緩徐に進行した（図３Ｃ）。単剤漸増の比較については図３Ｄを参照されたい。ＢＶＤ－５２３の漸増を受けた細胞はより「脆弱な」外観を有し、ダブラフェニブおよびトラメチニブ漸増集団と比較してより多数の浮遊細胞が存在した。
組合せ剤の漸増は、単剤処置よりも緩徐に進行した。細胞の進行の防止にはＢＶＤ－５２３／トラメチニブ組合せが特に有効であった。
増殖アッセイ結果 － ２カ月目
単剤漸増ダブラフェニブおよびトラメチニブ細胞集団に対する増殖アッセイにより、用量応答曲線における穏当なシフトが明らかになり、これにより、耐性細をさらに富化するために追加の漸増期間が有益であることが示唆される。興味深いことに、増殖アッセイにおいて、ＢＶＤ－５２３に曝露した細胞が、阻害剤を中止すると増殖があまり良くなくなることを示唆する証拠が存在し、これにより、おそらく、嗜癖のレベルが示される。
図４Ａ～図４Ｈは、試験の２カ月目からの正規化された増殖アッセイ結果および未加工の増殖アッセイ結果を示す。異なる処置間のＤＭＳＯ対照における最大シグナルの差異（図４Ｄ、図４Ｆ、および図４Ｈ）は処置間の示差的な増殖速度を示唆することに留意されたい。これらの差異は、増殖アッセイにおける阻害剤に対する株の応答に影響を及ぼす可能性がある。
図５Ａ～図５Ｈは、試験の２カ月目からの正規化された増殖アッセイ結果および未加工の増殖アッセイ結果を、親およびＢＶＤ－５２３株のデータのみに焦点を当てて示す。
表１１は、試験の２カ月目についてのＩＣ５０データを示す。相対的ＩＣ５０をＰｒｉｓｍにおける４パラメータ曲線あてはめから決定した。
Figure 2022034068000020
 （実施例４）
用量漸増および増殖アッセイ － ３カ月目
用量漸増の進行 － ３カ月目
図６Ａ～図６Ｃは、試験の３カ月目についての単剤および組合せ剤の漸増を示す。図６Ｄは、単剤漸増の比較を示す。
増殖アッセイ結果 － ３カ月目
図７は、ＤＭＳＯ対照ウェルにおける増殖アッセイ中の増殖の評価を示す。図８Ａ～図８Ｄは、試験の３カ月目からの結果を示す。図９Ａ～図９Ｄは、試験の３カ月目からの結果を単一処置細胞株に焦点を当てて示す。
表１２は、試験の３カ月目についてのＩＣ５０データを示す。相対的ＩＣ５０をＰｒｉｓｍにおける４パラメータ曲線あてはめから決定した。トラメチニブを漸増させた細胞株はアッセイ中増殖がなかったのでＩＣ５０値を決定しなかった（ＮＤ：行っていない）。
Figure 2022034068000021
図１９は、試験の３カ月目についての単剤および組合せ剤の漸増を示す。ダブラフェニブまたはトラメチニブが親Ａ３７５細胞におけるこれらの薬剤のＩＣ５０の１００倍を超える濃度で存在する中で増殖することができた細胞株バリアントを得た。比較すると、ＢＶＤ－５２３に対して耐性である細胞株は、親ＩＣ５０濃度の１０×未満でのみ維持することができた。感受性試験により、ダブラフェニブ耐性細胞株およびトラメチニブ耐性細胞株はＢＶＤ－５２３に対しては比較的感受性のままであること；耐性細胞株におけるＢＶＤ－５２３についてのＩＣ５０「シフト」の増大はダブラフェニブまたはトラメチニブによる処置後の対応するＩＣ５０増大よりも穏当なものであることが示唆された。同様に、ダブラフェニブまたはトラメチニブによる処置と比較して、耐性細胞株を、ＢＶＤ－５２３を親Ａ３７５株におけるそのＩＣ５０の１０倍の濃度で用いて処置した場合、細胞増殖のより徹底的な阻害が観察された。全体で、耐性および交差感受性のパターンにより、ＢＶＤ－５２３が獲得耐性の状況においても有効なままであり得ることが示唆される。
（実施例５）
組合せ試験結果
予期した通り、ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）突然変異を有するＡ３７５細胞はダブラフェニブに対して感受性であった。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを使用して算出した単剤ＩＣ５０値（図１０Ａ～図１０Ｅ、図１２Ａ～図１２Ｅ、および図１４Ａ～図１４Ｅ）は、一般に、ダブラフェニブおよびＢＶＤ－５２３について、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを使用して導き出したものと比較してわずかに低かった（図１１Ａ～図１１Ｅ、図１３Ａ～図１３Ｅ、および図１５Ａ～図１５Ｅ）。７２時間ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイにおけるダブラフェニブおよびトラメチニブについての公開されたＩＣ５０値は、それぞれ２８±１６ｎＭおよび５±３ｎＭであった（Gregerら、２０１２年；Kingら、２０１３年）－本明細書で報告される単剤の結果は、これらの値と一致する。全ての処置において相乗性のウインドウの証拠がいくつか存在した。３連の間の変動は少なかったが、薬物を用いない対照に対して一部の処置において観察された増殖の明白な増強（例えば、トラメチニブ／ＢＶＤ－５２３組合せで特に明白であった）が説明される可能性がある縁効果の証拠がいくつか存在した。これにより、一部の処置では相乗性のレベルの人為的な増強がもたらされた可能性があるので、Ｂｌｉｓｓ分析の解釈がより困難になる。
組合せアッセイをＡ３７５細胞に対して繰り返した。単剤ＢＶＤ－５２３、トラメチニブおよびダブラフェニブの効力は、本明細書に開示されている以前の試験で報告されたものと一致した。
つまり、総合すると、データから、ＭＥＫおよびＢＲＡＦ耐性細胞を、ＥＲＫ阻害剤であるＢＶＤ－５２３を用いた処置によって克服することができたことが示される。
（実施例６）
ＢＶＤ－５２３によりＭＡＰＫキナーゼ活性およびエフェクター機能のマーカーが変化した
ウェスタンブロット試験のために、ＨＣＴ１１６細胞（５×１０６個）を、１０ｃｍディッシュ中、マッコイ５Ａ＋１０％ＦＢＳに播種した。Ａ３７５細胞（２．５×１０６個）を、１０ｃｍディッシュ中、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに播種した。細胞を終夜接着させた後、示されている量の試験化合物（ＢＶＤ－５２３）またはビヒクル対照を添加した。以下に明記されている通り、細胞を４時間または２４時間のいずれかにわたって処置した後、全細胞タンパク質溶解物を単離した。細胞をトリプシン処理によって採取し、ペレット化し、スナップ凍結した。溶解物を、ＲＩＰＡ（放射性免疫沈降アッセイ）緩衝液を用いて調製し、遠心分離によって清澄化し、ビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ）アッセイによって定量化した。タンパク質２０～５０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって分解し、ＰＶＤＦ膜にブロッティングし、以下の表１３（４時間の処置に関して）および表１４（２４時間の処置に関して）に詳述されている抗体を使用してプローブした。
Figure 2022034068000022
Figure 2022034068000023
図１６Ａ～図１６Ｄ、図１７Ａ～図１７Ｄ、および図１８Ａ～図１８Ｄは、ＢＶＤ－５２３を種々の濃度で用いて処置した細胞の以下についてのウェスタンブロット分析を示す：１）４時間後のＡ３７５細胞におけるＭＡＰＫシグナル伝達構成成分；２）種々の量のＢＶＤ－５２３を用いて２４時間処置したＡ３７５における細胞周期およびアポトーシスシグナル伝達；ならびに３）４時間にわたって処置したＨＣＴ－１１６細胞におけるＭＡＰＫシグナル伝達。結果から、ｉｎ－ｖｉｔｒｏでのＲＡＦおよびＲＡＳ突然変異体がん細胞におけるＢＶＤ－５２３を用いた短時間処置および長時間処置により、基質リン酸化およびＥＲＫキナーゼのエフェクター標的の両方が影響を受けることが示される。これらの変化を誘導するために必要なＢＶＤ－５２３の濃度は、一般には、低マイクロモルの範囲である。
いくつかの特異的活性マーカーの変化は注目すべきものである。第１に、ＥＲＫキナーゼのゆっくり泳動されるアイソフォームの存在量はＢＶＤ－５２３による処置後に増加する；穏当な変化は短時間に観察することができ、長時間処置後に増大する。これにより、酵素的に活性なリン酸化型のＥＲＫの増加が示され得るが、ＥＲＫにより直接的制御および間接的制御の両方を受ける多数のタンパク質がＢＶＤ－５２３による処置後に「オフ」のままになることに依然として注目すべきである。第１に、ＲＳＫ１／２タンパク質は、タンパク質修飾についてＥＲＫに厳密に依存する残基（Ｔ３５９／Ｓ３６３）におけるリン酸化の減少を示す。第２に、ＢＶＤ－５２３による処置により、ＭＡＰＫフィードバックホスファターゼ、ＤＵＳＰ６の複雑な変化が誘導される：ゆっくり泳動されるタンパク質アイソフォームは短時間処置後に減少するが、総タンパク質レベルは、長時間のＢＶＤ－５２３による処置後に著しく低下する。これらの所見はどちらも、翻訳後機構および転写機構の両方を通じてＤＵＳＰ６機能を制御するＥＲＫキナーゼの活性の低下と一致する。全体として、一般には活性であると考えられる細胞形態のＥＲＫが増加したにもかかわらず、細胞ＥＲＫ酵素活性はＢＶＤ－５２３を用いた短時間処置または長時間処置の後に完全に阻害される可能性が高いと思われる。
これらの観察と一致して、ＭＡＰＫ経路シグナル伝達を必要とするエフェクター遺伝子はＢＶＤ－５２３を用いた処置後に変化する。Ｇ１／Ｓ細胞周期装置は翻訳後レベルおよび転写レベルの両方でＭＡＰＫシグナル伝達によって制御され、サイクリン－Ｄ１タンパク質レベルは長時間のＢＶＤ－５２３による処置後に著しく低下する。同様に、アポトーシスエフェクターの遺伝子発現およびタンパク質存在量は、多くの場合、インタクトなＭＡＰＫシグナル伝達を必要とし、Ｂｉｍ－ＥＬの総レベルは長時間のＢＶＤ－５２３による処置後に上昇する。しかし、上記の通り、ＰＡＲＰタンパク質の切断およびアポトーシスの増大はＡ３７５細胞バックグラウンドでは認められなかった；これにより、ＢＶＤ－５２３／ＥＲＫ依存性エフェクターシグナル伝達の変化が細胞死および細胞周期停止などの最終的な事象に転換されるかどうかには追加の因子が影響を及ぼす可能性があることが示唆される。
ＢＶＤ－５２３の細胞での活性と一致して、マーカー分析から、ＥＲＫ阻害によりがん細胞における種々の分子シグナル伝達事象が変化し、それにより、がん細胞が細胞増殖および生存の両方の減少を受けやすくなることが示唆される。
つまり、図１６Ａ～図１６Ｄ、図１７Ａ～図１７Ｄ、および図１８Ａ～図１８Ｄは、ＢＶＤ－５２３が、ＭＡＰＫシグナル伝達経路を阻害し、この状況においてＲＡＦまたはＭＥＫ阻害と比較してより好都合であり得ることを示す。
最後に、ＢＶＤ－５２３は、その性質により、同様の活性を有する他の薬剤と比較して、ＥＲＫ阻害剤として使用するための好ましい薬剤になり得る。キナーゼ阻害薬はそれらの酵素標的とユニークで特異的な相互作用を示すこと、および薬効が、直接阻害の方式、ならびに、処置後に生じる適応変化を受けやすいことの両方により強力な影響を受けることが公知である。例えば、ＡＢＬ、ＫＩＴ、ＥＧＦＲおよびＡＬＫキナーゼの阻害剤は、それらの同類の標的が活性または不活性立体配置で見出される場合にのみ有効である。同様に、ある特定のこれらの阻害剤は、タンパク質標的の二次的な遺伝子突然変異、または翻訳後の適応変化のいずれかに一意的に感受性である。最後に、ＲＡＦ阻害剤は、ある特定のタンパク質複合体および／または細胞内の局在で存在するＲＡＦキナーゼに対して示差的な効力を示す。要約すると、ＥＲＫキナーゼはいずれも同様に、多様な、変動する、複雑な生化学的状態で存在することが公知であるので、ＢＶＤ－５２３は、他の薬剤とは別個であり、高度に好ましい様式でこれらの標的と相互作用し、それを阻害することができる可能性が高いと思われる。
（実施例７）
生存能力およびＭＡＰＫシグナル伝達に対するＢＶＤ－５２３およびベンチマークＥＲＫ ＢＲＡＦおよびＭＥＫ阻害剤の効果
単剤増殖アッセイ
細胞を、９６ウェルプレート中、１０％ＦＢＳを含有するマッコイ５Ａに表１５に示されている密度で播種し、終夜接着させた後、化合物またはビヒクル対照を添加した。化合物はＤＭＳＯストックから調製して、所望の最終濃度を得た。最終的なＤＭＳＯ濃度は０．１％で一定にした。試験化合物を、細胞と一緒に、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気中で９６時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造者の指示に従って添加し、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して発光を検出した。培地のみのバックグラウンド値の平均を差し引き、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで４パラメータロジスティック方程式（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してデータを分析した。
組合せ増殖アッセイ
細胞を、３連の９６ウェルプレート中、１０％ＦＢＳを含有するマッコイ５Ａに表１５に示されている密度で播種し、終夜接着させた後、試験化合物またはビヒクル対照を添加した。１０×８用量マトリックスを使用して組合せを試験した。最終的なＤＭＳＯ濃度は０．２％で一定にした。
試験化合物を、細胞と一緒に、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気中で９６時間インキュベートした。細胞をＨｏｅｃｈｓｔ染色で染色し、上記の通り蛍光を検出した。培地のみのバックグラウンド値の平均を差し引き、データを分析した。
組合せ用量マトリックスにわたる相互作用を、Ｃｈａｌｉｃｅ（商標） Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｇｒｏｕｐ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用し、使用者マニュアル（ｃｈａｌｉｃｅ．ｈｏｒｉｚｏｎｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ｃｏｍ／ｃｈａｌｉｃｅ－ｐｏｒｔａｌ／ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ／ａｎａｌｙｚｅｒ／ｈｏｍｅ．ｊｓｐにおいて入手可能）に概説されている通り、Ｌｏｅｗｅ相加性およびＢｌｉｓｓ独立モデルによって決定した。相乗性は、各組合せ点における実験により観察された阻害のレベルを、マトリックスの縁に沿った単剤応答から導き出される相加性について予期した値と比較することによって決定される。潜在的な相乗性相互作用を、ヒートマップとしての用量マトリックスにわたって相加性であると予測されるものを超える算出された過剰阻害を示すことによって、および、定量的「相乗性スコア」をＬｏｅｗｅモデルに基づいて報告することによって同定した。組合せアッセイプレートから導き出された単剤データをＣｈａｌｉｃｅ（商標）で作成した用量応答曲線として示した。
Figure 2022034068000024
 ウェスタンブロッティング
細胞を、６ウェルプレート（実験１）または１０ｃｍディッシュ（実験２）中、１０％ＦＢＳを含有するマッコイ５Ａに表１５に示されている密度で播種し、終夜接着させた後、化合物またはビヒクル対照を添加した。試験化合物を添加し、細胞と一緒に、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気中で４時間または２４時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理によって採取し、遠心分離によってペレット化し、ドライアイス上でスナップ凍結した。
溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－塩酸塩、ｐＨ８．０；１５０ｍＭの塩化ナトリウム；１．０％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０（ＮＰ－４０）；０．５％デオキシコール酸ナトリウム；０．１％ドデシル硫酸ナトリウム；１×完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ；カタログ０５ ８９２ ７９１ ００１）；１×ｐｈｏｓＳＴＯＰホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｎｕｔｌｅｙ、ＮＪ；カタログ０４ ９０６ ８３７ ００１））を使用して調製し、卓上遠心分離機において１１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって清澄化した。
溶解物中の総タンパク質をＢＣＡアッセイによって製造者の指示に従って定量化し（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；カタログ２３２２５）、試料緩衝液（ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ；（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログＮＰ０００７））中で煮沸し、－８０℃で保管した。
等量タンパク質（４０μｇ）をＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログＷＧ１４０２ＢＯＸ）で分離し、ｉＢｌｏｔゲル転写デバイス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）でｉＢｌｏｔゲル転写スタック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ；カタログＩＢ４０１０－０１）を使用し、製造者の指示に従ってＰＶＤＦ膜にブロッティングした。
ブロットを、表１６に詳述されている抗体およびブロッキング条件を使用してプローブした。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＥＣＬ２ウェスタンブロッティング基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；カタログ８０１９６）を使用してウェスタンブロットを展開し、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ Ｍ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｉｍａｇｅｒ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して画像処理した。
Figure 2022034068000025
ＭＡＰＫ経路を上方制御し、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤に対する獲得耐性を駆動することが公知である臨床的に関連するＭＥＫ１／２活性化突然変異のクラスが、ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ）突然変異により例示される。
この試験では、ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ）活性化突然変異の有無について同質遺伝子型であるＲＫＯ ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）細胞株の対を使用して、新規のＥＲＫ阻害剤ＢＶＤ－５２３に応答してその活性化ＭＥＫ突然変異が有する効果を他のベンチマークＭＡＰＫ阻害剤に対して評価した。
細胞生存能力に対する効果を、９６時間後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）を使用して細胞ＡＴＰレベルを定量化することによって評価した。単剤アッセイにより、二重突然変異体ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）：：ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ）細胞がベンチマーク臨床的ＢＲＡＦ阻害剤（ダブラフェニブにより例示される）またはＭＥＫ阻害剤（トラメチニブにより例示）を用いた阻害に対して親ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）細胞と比べて著しく低下した感受性を示すことが実証され、これにより、診療所においてこのクラスの突然変異に関連することが公知の獲得耐性を再現するための、この同質遺伝子型モデルの適合性が実証される（表１７）。
Figure 2022034068000026
対照的に、ＢＶＤ－５２３に対する応答は親細胞と二重突然変異体細胞のどちらにおいても同一であり、これにより、ＢＶＤ－５２３が獲得耐性の機構を受けにくいことが示される。
これらの結果は、２つの独立に得た二重突然変異体ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）：：ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ）細胞株クローンにおいて同一であり、これにより、これらの親細胞に対する応答の差異が、無関係のクローンアーチファクトではなくＭＥＫ１突然変異の存在に特異的に関連することが確認される（図２２Ａ～図２２Ｅ）。第２の機構的に別個のベンチマークＥＲＫ阻害剤（ＳＣＨ７７２９８４）を用いた場合にも同様の結果が観察され、これにより、これらの観察がＥＲＫの阻害に特異的に関連し、オフターゲットの効果に起因するものではないという概念が裏付けられる。
ＢＶＤ－５２３とＢＲＡＦ阻害剤（ダブラフェニブにより例示される）を組み合わせることの効果も、これらの細胞株において、ＨｏｒｉｚｏｎのＣｈａｌｉｃｅ（商標） ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅでＬｏｅｗｅ相加性またはＢｌｉｓｓ独立モデルを使用して濃度のマトリックスにわたって評価した（図２３～図２３Ｏおよび図２４Ａ～図２４Ｏ）。次いで、潜在的な相乗性相互作用の存在を、ヒートマップとしての用量マトリックスにわたって相加性であると予測されるものを超える算出された過剰阻害を示すことによって、および、組合せに対する全体的な応答が相乗性（正の値）であるか、拮抗性（負の値）であるかまたは相加性（約０）であるかを示す「体積スコア（Ｖｏｌｕｍｅ Ｓｃｏｒｅ）」を算出することによって評価した。
結果から、ＢＶＤ－５２３：：ダブラフェニブ組合せが親細胞株および突然変異体細胞株において主に相加性であったことが示唆される。対照的に、ＭＥＫ阻害剤（トラメチニブ）とダブラフェニブの組合せでは、親細胞株では大部分が相加性であったが、二重突然変異体ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）：：ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ）細胞株では強力な相乗性が示された（図２５Ａ～図２５Ｏ）。Ｌｏｅｗｅ体積、Ｂｌｉｓｓ体積および試験した組合せについての相乗性スコアをそれぞれ表１８～２０に示し、図２６Ａ～図２６Ｃにグラフで示す。
Figure 2022034068000027
Figure 2022034068000028
Figure 2022034068000029
ＭＡＰＫ経路シグナル伝達に対する効果をウェスタンブロット法によって評価した。ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ）発現株では親と比べて基本のＥＲＫリン酸化（ＤＭＳＯ試料）のレベルが著しく上方制御され、これにより、この同質遺伝子型モデルがＭＥＫ活性化獲得耐性突然変異の発現について予期される表現型を忠実に再現するものであることがさらに確認される。
親ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）ＲＫＯ細胞では、ＲＡＦ、ＭＥＫおよびＥＲＫキナーゼ阻害剤を薬理活性のある濃度で用いた短時間処置後にＲＳＫ１／２リン酸化のレベルの低下が観察される。対照的に、同質遺伝子型の二重突然変異体ＢＲＡＦＶ６００Ｅ：：ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐ細胞は、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤による処置後にＲＳＫリン酸化の減少を示さないが、ＢＶＤ－５２３は同様の濃度で有効なままである（図２７Ａ～図２７Ｉ）。点線は、トラメチニブで処置した試料（加えて、マッチするＤＭＳＯ対照）およびブロットが、ＢＲＡＦｉおよびＢＶＤ－５２３で処置した試料とは別の実験に由来することを示す。
長時間の阻害剤による処置後に、細胞増殖阻害パターンと一致したエフェクター遺伝子シグナル伝達の変化が観察される。親ＲＫＯ株では、長時間のＭＥＫ阻害剤による処置およびＥＲＫ阻害剤による処置後に、リン酸化ｐＲＢのレベルの低下が観察される。ｐＲＢモジュレーションのレベルでは、ＭＥＫ１突然変異体株は低濃度のＭＥＫ阻害剤による処置に対して非感受性であると思われるが、より高い濃度では有効なままである。肝心なことに、ｐＲＢ活性に対するＢＶＤ－５２３の効力は、ＭＥＫ突然変異の影響を強力には受けないと思われる。驚いたことに、ＲＡＦ阻害剤による処置は、親およびＭＥＫ突然変異体バックグラウンドのどちらにおいても、上流シグナル伝達を強力に阻害するにもかかわらず、ｐＲＢの状態には影響を及ぼさない。
要約すると、これらの結果から、ＢＶＤ－５２３が、ＭＥＫ１（Ｑ５６Ｐ）などのＭＥＫ活性化突然変異によって駆動される獲得耐性を受けにくいことが示される。さらに、組合せでは、ＢＶＤ－５２３とＢＲＡＦｉ（ダブラフェニブにより例示される）との間の相互作用は、ＭＥＫ活性化突然変異の存在に関係なく相加性であることが示唆される。
（実施例８）
ＥＲＫ阻害剤間の組合せ相互作用
ＲＡＦ突然変異体メラノーマ細胞株Ａ３７５細胞を、１０％ＦＢＳを伴うＤＭＥＭ中で培養し、３連の９６ウェルプレート中、最初の密度１ウェル当たり細胞２０００個で播種した。７２時間後にＥＲＫ阻害剤ＢＶＤ－５２３とＳＣＨ７７２９８４との間の組合せ相互作用を実施例４において上記の通り分析した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造者の指示に従って使用して生存能力を決定し、ＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して発光を検出した。
ＬｏｅｗｅおよびＢｌｉｓｓ「過剰阻害」ヒートマップの可視化により、ＢＶＤ－５２３とＳＣＨ７７２９８４の組合せが主に相加性であり、中域用量で潜在的な相乗性のウインドウを有することが示唆された（図２８Ａ～図２８Ｅ）。
要約すると、これらの結果から、ＢＶＤ－５２３とＳＣＨ７７２９８４との間の相互作用が少なくとも相加性であり、一部の場合では相乗性であることが示唆される。
（実施例９）
がんにおけるＭＡＰＫシグナル伝達経路の標的化：新規の選択的ＥＲＫ１／２阻害剤ＢＶＤ－５２３（ウリキセルチニブ）の有望な活性
がんに対する処置戦略は、古典的な細胞傷害性に基づく手法から、腫瘍の増殖および生存に必須の異常なシグナル伝達を駆動する遺伝子病変の影響を打ち消す薬剤へと発展してきた。例えば、分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達カスケードのＥＲＫモジュール（ＲＡＳ－ＲＡＦ－ＭＥＫ－ＥＲＫ）（CargnelloおよびRouxx、２０１１年）は、ＲＡＳおよびＢＲＡＦなどの経路構成成分の構成的に活性化される突然変異に加えて、いくつかの受容体チロシンキナーゼ（例えば、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ－２）によって作動され得る（Gollobら、２００６年）。ＥＲＫシグナル伝達の異常な活性化を通じて、ＲＡＳまたはＢＲＡＦの遺伝子変化により、迅速な腫瘍増殖、細胞生存の増大、およびアポトーシスに対する耐性がもたらされる（Poulikakosら、２０１１年、Corcoranら、２０１０年、Nazarianら、２０１０年、Shiら、２０１４年、Wagleら、２０１１年）。ＲＡＳファミリーメンバーＫＲＡＳおよびＮＲＡＳの活性化突然変異は、全てのヒトがんの約３０％で見出され、膵臓がん（Kandaら、２０１２年）および結腸直腸がん（Arringtonら、２０１４年）における発生率が特に高い。通常はアミノ酸６００におけるバリンをコードするＢＲＡＦ遺伝子の構成的に活性化される突然変異が、メラノーマ、甲状腺癌、結腸直腸がん、および非小細胞肺がんにおいて観察されている（Hallら、２０１４年）。下流の構成成分ＥＲＫおよびＭＥＫの変化をもたらす遺伝子突然変異を有するがんも報告されている（Ojesinaら、２０１４年、Arcilaら、２０１５年）。ＭＡＰＫ経路を
活性化する変化も標的化療法に対する耐性の状況においてよく見られる（Groenendijkら
、２０１４年）。したがって、ＭＡＰＫ経路末端マスターキナーゼ（ＥＲＫ１／２）の標的化は、そのような経路活性化変化（例えば、ＢＲＡＦ、ＮＲＡＳ、およびＫＲＡＳ）を有する腫瘍に対する有望な戦略である。
３種のＭＡＰＫ経路を標的とする薬物：ＢＲＡＦ阻害剤であるベムラフェニブおよびダブラフェニブならびにＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブが、ＢＲＡＦＶ６００突然変異を伴う切除不能なまたは転移性の皮膚メラノーマの単剤処置に関してアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。さらに、ダブラフェニブとトラメチニブの組合せもこの適応症に関して承認されている（Queiroloら、２０１５年およびMasseyら、２０１５年）。追加のＭＥＫ阻害剤コビメチニブは、この適応症に関して、ＢＲＡＦ阻害剤との組合せレジメンの一部として承認されている。これらの薬物を用いた臨床経験により、ＭＡＰＫ経路が治療標的として検証されている。ＢＲＡＦＶ６００突然変異体メラノーマを有する患者における第ＩＩＩ相試験では、単剤ベムラフェニブおよびダブラフェニブにより、細胞傷害性化学療法（ダカルバジン）よりも優れた奏効率（およそ５０％対５～１９％）および無増悪生存期間の中央値（ＰＦＳ、５．１～５．３カ月対１．６～２．７カ月）が実証された（Chapmanら、２０１１年およびHauschildら、２０１２年）。さらに、ＢＲＡＦ＋ＭＥＫ標的化療法の臨床併用により、ＭＡＰＫ経路の異なるノードを同時に標的化することにより応答の大きさおよび持続時間を増強することができることが実証された。ＢＲＡＦ＋ＭＥＫ標的化剤（ダブラフェニブ／トラメチニブまたはコビメチニブ／ベムラフェニブ）の第一選択使用により、単剤ＢＲＡＦ阻害と比較して全生存期間の中央値がさらに改善された（Robertら、２０１５年、Longら、２０１５年、Larkinら、２０１４年）。したがって、ＢＲＡＦ標的化療法／ＭＥＫ標的化療法の組合せは、ＢＲＡＦＶ６００突然変異を伴う転移性メラノーマを有する患者に対する有益な処置選択肢である。
ＢＲＡＦ阻害剤／ＭＥＫ阻害剤組合せ療法を用いて見られる臨床転帰の改善にもかかわらず、永続的な利益は、最終的な獲得耐性の発生およびその後の疾患の進行によって限定され、ＰＦＳの中央値はおよそ９～１１カ月の範囲である（Robertら、２０１５年、Longら、２０１５年、Larkinら、２０１４年、およびFlahertyら、２０１２年）。単剤ＢＲＡＦ阻害に対する遺伝学的な獲得耐性の機構は熱心に研究されており、耐性機構の同定は、ＢＲＡＦのスプライスバリアント（Poulikakosら、２０１１年）、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ増幅（Corcoranら、２０１０年）、ＭＥＫ突然変異（Wagleら、２０１４年）、ＮＲＡＳ突
然変異、およびＲＴＫ活性化（Nazarianら、２０１０年およびShiら、２０１４年）を含
む。ＢＲＡＦ阻害剤／ＭＥＫ阻害剤組合せ療法の状況における耐性機構が出現し始めており、また、これは、ＢＲＡＦ単剤耐性の機構を映すものである（Wagleら、２０１４年お
よびLongら、２０１４年）。これらの遺伝子事象は全て、共通して、ＥＲＫシグナル伝達を再活性化する能力を共有する。実際に、ＥＲＫ転写標的によって測定される再活性化されたＭＡＰＫ経路シグナル伝達は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性患者由来の腫瘍生検材料においてよく見られる（Rizosら、２０１４年）。さらに、ＥＲＫ１／２再活性化は、耐性の遺伝
子機構の非存在下で観察されている（Carlinoら、２０１５年）。したがって、永続的な
臨床的利益を達成するための探求するなかで、研究者は下流のＭＡＰＫ構成成分であるＥＲＫ１／２を標的とする追加の薬剤を評価することに焦点を当てるようになってきた。ＥＲＫの阻害により、獲得ＢＲＡＦ／ＭＥＫ阻害に対する耐性を有する患者に対して重要な臨床的利益がもたらされ得る。ＥＲＫファミリーキナーゼには、ＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤に対して耐性のがんを含めた前臨床的がんモデルにおける治療標的としての見込みが示されている（Morrisら、２０１３年およびHatzivassiliouら、２０１２年）。しかし、そのようなＥＲＫ１／２阻害剤の潜在的使用は、メラノーマにおける獲得耐性を超えて拡大する。
ＥＲＫ１／２の標的化は、ＢＲＡＦ／ＭＥＫ療法による再発患者だけではなく、公知のＭＡＰＫの駆動体を有する任意の腫瘍型において合理的な戦略である。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２は経路の下流に存在するので、上流の耐性機構を回避することができる、ＭＡＰＫカスケード内での特に魅力的な処置戦略である。本明細書では、薬物に対してナイーブのモデルおよびＢＲＡＦ／ＭＥＫ療法獲得耐性モデルを含めた、ＭＡＰＫ経路依存性がんのモデルにおけるＢＶＤ－５２３（ウリキセルチニブ）の前臨床的特徴付けが報告される。ＢＶＤ－５２３の第Ｉ相用量設定試験の結果は本雑誌の、対になる論文として含まれる。実施例１７～２４を参照されたい。
本発明では、ＢＶＤ－５２３が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける抗がん活性を有する、ＥＲＫ１／２の強力な、高度に選択的な、可逆的な、小分子ＡＴＰ競合阻害剤であることが示された。
ＢＶＤ－５２３（ウリキセルチニブ）は、高い効力およびＥＲＫ１／２選択性を有する新規の可逆的なＡＴＰ競合ＥＲＫ１／２阻害剤であると同定され、特徴付けられた。ＢＶＤ－５２３により、とりわけ、ＭＡＰＫ（ＲＡＳ－ＲＡＦ－ＭＥＫ）経路突然変異を有する細胞において、増殖の低減およびカスパーゼ活性の増強が引き起こされた。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ異種移植試験では、ＢＶＤ－５２３により、用量依存的な増殖阻害および腫瘍退縮が示された。興味深いことに、ＢＶＤ－５２３により、ＥＲＫ１／２のリン酸化の増加にもかかわらず、標的基質のリン酸化が阻害された。ＢＶＤ－５２３は、単剤およびＢＲＡＦ／ＭＥＫ標的化療法の組合せに対する獲得耐性のモデルにおける抗腫瘍活性も実証された。ＢＶＤ－５２３をＢＲＡＦ阻害と組み合わせた場合にも、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体メラノーマ細胞株異種移植モデルにおける相乗性な抗増殖効果が実証された。これらの試験により、ＢＶＤ－５２３には、腫瘍がＭＡＰＫ経路の上流ノードを標的とする他の処置に対する獲得耐性を有する物を含めたＥＲＫ依存性がんに対する処置としての見込みがあることが示唆される。
（実施例１０）
新規のＥＲＫ１／２阻害剤、ＢＶＤ－５２３（ウリキセルチニブ）の発見および最初の特徴付け
最初に同定されたリードのハイスループットな小分子スクリーニング（Aronovら、２００９年）を使用した広範囲にわたる最適化の後、新規のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）競合ＥＲＫ１／２阻害剤、ＢＶＤ－５２３（ウリキセルチニブ）が同定された（図２９Ａ）。ＢＶＤ－５２３は、ＥＲＫ２に対するＫｉが０．０４±０．０２ｎＭである、強力なＥＲＫ阻害剤である。ＢＶＤ－５２３は、ＡＴＰ濃度が上昇するにしたがってＥＲＫ２阻害についてのＩＣ５０値が直線的に増大するので、ＡＴＰの可逆的な競合阻害剤であることが示された（図２９Ｂおよび図２９Ｃ）。ＩＣ５０は１０分以上のインキュベーション時間にわたってほぼ一定のままであり、これにより、ＢＶＤ－５２３とＥＲＫ２の迅速な平衡および結合が示唆される（図２９Ｄ）。ＢＶＤ－５２３はまた、組換えＥＲＫ１の密接結合性阻害剤でもあり（Rudolphら、２０１５年）、０．３ｎＭ未満のＫｉを示す。
ＢＶＤ－５２３のＥＲＫ２への結合を、熱量測定試験を使用して実証し、ＥＲＫ阻害剤ＳＣＨ７７２９８４およびピラゾリルピロールを使用して生成されたデータと比較した（Arovovら、２００７年）。全ての化合物が、正のΔＴｍ値によって示される通り濃度が上昇した不活性ＥＲＫ２に結合し、それを安定化した（図２９Ｅ）。ＢＶＤ－５２３およびＳＣＨ－７７２９８４を用いて観察されたΔＴｍの１０℃～１５℃の変化は、低ナノモルの結合親和性を有する化合物と一致する（Fedorovら、２０１２年）。ＢＶＤ－５２３は
、リン酸化活性ＥＲＫ２（ｐＥＲＫ２）および不活性ＥＲＫ２のどちらに対しても強力な結合親和性を示した（図２９Ｆ）。ｐＥＲＫ２に対して不活性ＥＲＫ２と比較してより強力な親和性が観察された。ＢＶＤ－５２３は、陰性対照タンパク質ｐ３８α ＭＡＰキナーゼと相互作用しなかった（図２９Ｆ）。
ＢＶＤ－５２３は、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２に加えて７５種のキナーゼに対する生化学的カウンタースクリーニングに基づいて、優れたＥＲＫ１／２キナーゼ選択性を示した。全てのアッセイにおいてＡＴＰ濃度はＫｍとほぼ同等であった。２μＭのＢＶＤ－５２３により５０％よりも大きく阻害されたキナーゼを再試験してＫｉ値（または見かけのＫｉ；表２１）を生成した。１４種のキナーゼのうち１２種が１μＭ未満のＫｉを有した。ＥＲＫ２に対するＢＶＤ－５２３の選択性は、０．３ｎＭ未満のＫｉ（１０倍）で阻害されたＥＲＫ１以外の試験されたキナーゼ全てについて＞７０００倍であった。したがって、ＢＶＤ－５２３は、ＥＲＫ１／２の非常に強力かつ選択的な阻害剤である。
Figure 2022034068000030
 （実施例１１）
ＢＶＤ－５２３は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＭＡＰＫ経路活性化突然変異を有するがん細胞株において、細胞増殖を優先的に阻害し、カスパーゼ－３／７活性を増強する
ＢＶＤ－５２３細胞活性を種々の系列および遺伝的背景のがん細胞株およそ１，０００種のパネルにおいて評価した（図３０Ａおよび表２２）。細胞株を、ＲＡＳファミリーメンバーおよびＢＲＡＦの突然変異の有無に応じてＭＡＰＫ野生型（ｗｔ）または突然変異体に分類した。いくつかのＭＡＰＫ－ｗｔ細胞株がＢＶＤ－５２３に対して感受性であったが、一般に、ＭＡＰＫ経路の変化を有する細胞の増殖がＢＶＤ－５２３により優先的に阻害された。
次に、ＢＶＤ－５２３による処置の感受性細胞に対する増殖および生存に関する影響を特徴付けた。ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体メラノーマ細胞株ＵＡＣＣ－６２に対して、ＢＶＤ－５２３を５００ｎＭまたは２０００ｎＭで用いて２４時間処置した後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を実施した。処置した細胞は濃度依存的に細胞周期のＧ１期で停止した（図３０Ｂ）。
さらに、多数のヒトがん細胞株においてカスパーゼ－３／７活性をアポトーシスの測定基準として分析した。ＢＶＤ－５２３を用いて７２時間処置した後、カスパーゼ３／７の濃度依存的かつ細胞株依存的上昇が観察された（図３０Ｃ）。ＢＶＤ－５２３による処置の結果、ＢＲＡＦＶ６００突然変異（Ａ３７５、ＷＭ２６６、およびＬＳ４１１Ｎ）を有するＭＡＰＫ活性化細胞株サブセットにおいて明白なカスパーゼ－３／７誘導がもたらされた。これは、ＭＡＰＫ経路突然変異体がん細胞株におけるＢＶＤ－５２３による増殖の優先的阻害に関する以前の観察と一致する（図３０Ａ）。
ＢＶＤ－５２３によって引き出されるシグナル伝達に対する作用機構および影響をさらに特徴付けるために、ＢＶＤ－５２３により処置したＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体Ａ３７５メラノーマ細胞において種々のエフェクターおよびＭＡＰＫ関連タンパク質のレベルを評価した（図３０Ｄ）。ホスホ－ＥＲＫ１／２レベルは４時間および２４時間のＢＶＤ－５２３による処置の後に濃度依存的に上昇した。２μＭのＢＶＤ－５２３による処置でｐＥＲＫ１／２の顕著な濃度依存的上昇が観察されたにもかかわらず、ＥＲＫ１／２標的ＲＳＫ１／２のリン酸化は４時間および２４時間のどちらの時点でも減少し、これは、持続的阻害と一致する。ＥＲＫ１／２活性の遠位マーカーであるＤＵＳＰ６の総タンパク質レベルも、４時間および２４時間の時点で減弱した。ＢＶＤ－５２３を用いた２４時間の処置後、アポトーシスマーカーＢＩＭ－ＥＬは用量依存的に増加したが、サイクリンＤ－１およびｐＲＢは２μＭで減弱した。影響は全てオンターゲットのＥＲＫ１／２阻害と一致する。
（実施例１２）
ＢＶＤ－５２３は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体がん細胞株異種移植片モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す
ＢＶＤ－５２３により濃度依存的に増殖が低減し、アポトーシスが誘導されたという本発明者らのｉｎ ｖｉｔｒｏでの所見に基づいて、ＢＶＤ－５２３を、そのｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性をＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路依存性を有するモデルにおいて実証するために、経口栄養補給によって投与した。メラノーマの異種移植モデル（細胞株Ａ３７５）、および結腸直腸がんの異種移植モデル（細胞株Ｃｏｌｏ２０５）を利用し、これらはどちらもＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を有するものであった。
Ａ３７５細胞株異種移植片において、ＢＶＤ－５２３の有効性を、対照である細胞傷害性アルキル化剤テモゾロミドと、１４日間の処置後に比較した。ＢＶＤ－５２３は、５０ｍｇ／ｋｇ、１日２回（ＢＩＤ）から出発して、有意な用量依存的抗腫瘍活性を示した（図３１Ａ）。５０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤおよび１００ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤの用量により、腫瘍増殖が有意に減弱し、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）はそれぞれ７１％（Ｐ＝０．００４）および９９％（Ｐ＜０．００１）であった。１００ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ群において７つの部分退縮（ＰＲ）が認められた；他の群のいずれにおいても退縮応答は認められなかった。観察された有効性は、７５ｍｇ／ｋｇおよび１７５ｍｇ／ｋｇで投与した場合にそれぞれ３４％（Ｐ＞０．０５）および７８％（Ｐ＝０．００５）という穏当な用量依存的ＴＧＩがもたらされたテモゾロミドの有効性に好都合に匹敵した。
さらに、ＢＶＤ－５２３は、Ｃｏｌｏ２０５ヒト結腸直腸がん細胞株異種移植片モデルにおいても抗腫瘍有効性を示した（図３１Ｂ）。ＢＶＤ－５２３は、また、５０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ、７５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ、および１００ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤの用量で有意な用量依存的腫瘍退縮を示し、それぞれ平均腫瘍退縮Ｔ／Ｔｉ（Ｔ＝処置終了、Ｔｉ＝処置開始）－４８．２％、－７７．２％、および－９２．３％（全てＰ＜０．０００１）をもたらした。最低用量のＢＶＤ－５２３（２５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ）では退縮は観察されなかった；しかし、Ｔ／Ｃ（Ｔ＝処置、Ｃ＝対照）２５．２％（Ｐ＜０．０００１）の有意な腫瘍増殖阻害が観察された。忍容性は良好ではないが、陽性対照である化学療法剤イリノテカン（ＣＰＴ－１１）では、有意な抗腫瘍活性が示され、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍増殖が６．４％のＴ／Ｃ（Ｐ＜０．０００１）で阻害された。しかし、マウスにおけるその最大耐量においてさえ、ＣＰＴ－１１は５０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ、７５ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ、または１００ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤの用量のＢＶＤ－５２３ほど有効ではなかった。
薬物動態学と薬力学の関係を確立するために、ＢＶＤ－５２３の血漿中濃度とｐＥＲＫ１／２レベルを、腫瘍においてＢＶＤ－５２３の単回の１００ｍｇ／ｋｇの経口投薬後２４時間にわたって免疫組織化学的検査および同位元素でタグ付けした内部標準質量分析によって測定して比較した（図３１Ｃ）。無処置の腫瘍（０時間）ではＥＲＫ１／２のリン酸化は低かった。ＢＶＤ－５２３を用いた処置後、ＥＲＫ１／２リン酸化は投薬後１時間から投薬後８時間で最大レベルになるまで着実に上昇し、次いで、２４時間までに投薬前レベルに戻った。このｐＥＲＫ１／２の上昇は、ＢＶＤ－５２３薬物血漿中濃度と相関した。ＢＶＤ－５２３による処置に伴うｐＥＲＫ１／２の上昇のｉｎ ｖｉｖｏにおける観察は、以前のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける所見と一致する（図３０Ｄ）。
（実施例１３）
ＢＶＤ－５２３により、ＥＲＫ１／２リン酸化の上昇にもかかわらずＥＲＫ１／２基質阻害がもたらされる
ＢＶＤ－５２３のシグナル伝達に対する影響を他の公知のＥＲＫ１／２阻害剤（ＳＣＨ７７２９８４、ＧＤＣ－０９９４、およびＶｘ－１１ｅ）（Morrisら、２０１３年およびLiuら、２０１５年）と比べて調査するために、ＥＲＫ阻害に対する感受性を有する種々
の細胞株においておよそ４０種のタンパク質の大規模逆相タンパク質アレイ（ＲＰＰＡ）を使用した。ＢＲＡＦおよびＲＡＳに共通の変化を有する細胞株をアッセイした：ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体株Ａ３７５、Ｃｏｌｏ２０５、およびＨＴ２９；ＫＲＡＳＧ１２Ｃ突然変異体細胞株ＭＩＡＰＡＣａ－２；ＫＲＡＳＧ１３Ｄ突然変異体細胞株 ＨＣＴ１１６；および非定型ＨＲＡＳＦ８２Ｌ突然変異を有するＡＮ３Ｃａ。タンパク質レベルの変化は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）により処置した親対象からの百分率の変化として示される（図３２Ａおよび表２３）。全てのＥＲＫ阻害剤により、ＥＲＫ１／２のリン酸化（ｐＥＲＫ１／２［ＥＲＫ１／２－Ｔ２０２、－Ｙ２０４］）以外は定性的に類似したタンパク質への影響が引き出された；ＳＣＨ７７２２９８４ではすべての細胞株においてｐＥＲＫ１／２が阻害されたが、ＢＶＤ－５２３、ＧＤＣ－０９９４、およびＶｘ－１１ｅでは、ｐＥＲＫ１／２が著しく増加した。それぞれｐＥＲＫ１／２の近位標的および遠位標的であるホスホ－ｐ９０ ＲＳＫ（ｐＲＳＫ１）およびサイクリンＤ１は、ＥＲＫ１／２リン酸化の程度にかかわらず、試験した全ての阻害剤によって同様に阻害された（図３２Ｂ）。ＢＶＤ－５２３についてのこれらの独立した所見は、ｐＥＲＫ１／２および不活性ＥＲＫ１／２へのＢＶＤ－５２３による結合および安定化を実証するタンパク質結合試験（図２９Ｅおよび図２９Ｆ）に加えて、Ａ３７５細胞におけるウェスタンブロットにより、ＥＲＫ１／２基質ＲＳＫ１／２のリン酸化が、ｐＥＲＫ１／２が劇的に上昇したにもかかわらず阻害されたままであることを示す試験（図３２Ｄ）と一致する。したがって、ｐＥＲＫ１／２レベルの上昇の測定はＢＶＤ－５２３についての臨床的な薬力学的バイオマーカーとみなすことができ、同時に、ｐＲＳＫ１およびＤＵＳＰ６などのＥＲＫ１／２標的の阻害を数量化することも同じく同様の目的に役立ち得る。
このＲＰＰＡデータセットにおいて追加のタンパク質変化に注目すべきである（図３２Ａ）。ｐＳ６－リボソームタンパク質の減少は、全ての細胞株において全ての化合物で証明されるので、ＥＲＫ１／２阻害の別の薬力学的マーカーであると思われる（図３２Ｂ）。さらに、各ＥＲＫ１／２阻害剤により、細胞株Ａ３７５およびＡＮ３ＣＡ細胞におけるｐＡＫＴが誘導され、ｐＡＫＴの顕著な誘導は細胞株依存的観察であると思われる（図３３）。興味深いことに、生存マーカーｐＢＡＤの阻害の程度は、化合物間で異なると思われ、ＧＤＣ－０９９４によるｐＢＡＤの阻害は試験した他のＥＲＫ１／２阻害剤と比較してわずかなものである（図３２Ａ）。
次に、ＢＶＤ－５２３がＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体ＲＫＯ結腸直腸細胞株におけるＥＲＫ１／２および下流の標的ｐＲＳＫの細胞局在にどのように影響を及ぼすか（図３２Ｃ）を調査した。休止状態の細胞では、ＥＲＫ１／２は細胞質に局在し、刺激を受けると、ｐＥＲＫ１／２は標的細胞小器官、特に核に移動し、そこで転写標的が活性化される（Wainsteinら、２０１６年）。ＤＭＳＯにより処置した対照細胞では、ｐＥＲＫ１／２は
核画分および細胞質画分のどちらにおいても明らかであり、これは、この細胞株にＢＲＡＦＶ６００Ｅが存在することに起因するＭＡＰＫ経路活性を反映する可能性がある。ＢＶＤ－５２３を用いた処置の結果、ＤＭＳＯで処置した細胞と比較して核および細胞質におけるｐＥＲＫ１／２の上昇ならびに核内総ＥＲＫ１／２の穏当な増加がもたらされ、これにより、化合物により誘導されるｐＥＲＫ１／２の安定化によりいくらかの核移行が刺激されることが示唆される。どちらの区画においてもｐＥＲＫ１／２が増加したにもかかわらず、細胞質区画および核区画におけるｐＲＳＫレベルはＤＭＳＯ対照と比較して低い。比較器であるＭＡＰＫシグナル伝達阻害剤（すなわち、トラメチニブ、ＳＣＨ７７２２９８４、ダブラフェニブ）では、核区画および細胞質区画におけるレベルがより低いことによって反映される通り、ＥＲＫ１／２のリン酸化およびＲＳＫが阻害された。これらのデータから、重ねて、細胞質および核の両方においてＢＶＤ－５２３に関連するｐＥＲＫ１／２の増加が明らかであることが示唆される；しかし、これは、標的基質の活性化には転換されない。これは、図３０Ｄおよび図３２Ａにおいて提示されているデータと一致する。
（実施例１４）
ＢＶＤ－５２３は、ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤耐性のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて活性を示した
ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤に対する耐性の出現により、それらの臨床的有効性が限定される。ここで、本実験では、モデルを探求し、ＢＲＡＦ（ダブラフェニブ）、ＭＥＫ（トラメチニブ）、およびＥＲＫ１／２（ＢＶＤ－５２３）阻害に対する耐性の発生をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて比較する。数カ月にわたって、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体Ａ３７５細胞を、各阻害剤を次第に増加させて培養した。高濃度のトラメチニブまたはダブラフェニブの下での増殖後に薬物耐性Ａ３７５細胞株が容易に得られたが、ＢＶＤ－５２３に対する耐性を有する細胞株の発生は困難であることが判明した（図３４Ａ）。全体として、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏデータから、同様の標的阻害がもたらされる濃度では、ＢＶＤ－５２３に対する耐性がダブラフェニブまたはトラメチニブと比較して遅延し、臨床での永続的な応答に転換され得ことが示唆される。
ＥＲＫ１／２シグナル伝達の再活性化および依存性は、ＢＲＡＦ／ＭＥＫ阻害に対する獲得耐性の一般的な特徴である（Morrisら、２０１３年およびHatzivassiliouら、２０１２年）；したがって、獲得耐性のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおけるＢＶＤ－５２３の活性を評価した。まず、記載されている濃度上昇法を使用してダブラフェニブとトラメチニブの組合せに対して耐性のＡ３７５集団を得た。ＢＲＡＦ／ＭＥＫ組合せに対して耐性の集団におけるダブラフェニブ、トラメチニブ、およびＢＶＤ－５２３についての親Ａ３７５からのＩＣ５０およびＩＣ５０の倍率変化が表２４に示されている。ＢＶＤ－５２３のＩＣ５０は穏当にシフトしたが（２．５倍）、ダブラフェニブおよびトラメチニブではより有意にシフトした（それぞれ８．５倍および１３．５倍）（表２４）。細胞傷害性薬剤であるパクリタキセルを対照として試験し、効力のわずかなシフトが観察された。これらのデータから、この細胞集団における耐性の機構はまだ特徴付けられていないが、ＢＲＡＦ／ＭＥＫ療法に対する耐性の状況におけるＢＶＤ－５２３の調査が裏付けられる。
Figure 2022034068000031
公知のＢＲＡＦ阻害剤耐性の機構を有するモデルにおけるＥＲＫ１／２阻害の扱いやすさをさらに調査するために、ＡＡＶ媒介遺伝子標的化を使用して、ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐ活性化突然変異の工学的に操作されたヘテロ接合性ノックインの有無について同質遺伝子型であるＲＫＯ ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体細胞株の対を生成した（Trunzerら、２０１
３年およびEmeryら、２００９年）。ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐを含めたＭＥＫ１／２突然変異は
、患者における単剤ＢＲＡＦおよびＢＲＡＦ／ＭＥＫ療法の組合せに対する獲得耐性の両方に関係づけられている（Wagleら、２０１１年、Wagleら、２０１４年、Emeryら、２０
０９年およびJohnsonら、２０１５年）。単剤アッセイにより、親ＢＲＡＦＶ６００Ｅ：
：ＭＥＫ１ｗｔ細胞と比べて、二重突然変異体ＢＲＡＦＶ６００Ｅ：：ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐ細胞はＢＲＡＦ阻害剤であるベムラフェニブおよびダブラフェニブならびにＭＥＫ阻害剤であるトラメチニブに対して著しく低下した感受性を示すことが実証された（図３４Ｂ）。対照的に、ＢＶＤ－５２３に対する応答は、親細胞およびＭＥＫＱ５６Ｐ突然変異体細胞のどちらにおいても基本的に同一であり、これにより、ＢＶＤ－５２３が獲得耐性の機構を受けにくいことが示される。これらの結果は、２つの独立に得た二重突然変異体ＢＲＡＦＶ６００Ｅ：：ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐ細胞株クローンにおいて確認され、したがって、結果が、無関係のクローンアーチファクトではなく、ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐ突然変異の存在に特異的に関連することが検証される（データは示していない）。第２の機構的に別個のＥＲＫ１／２阻害剤（ＳＣＨ７７２９８４）を用いた場合にも同様の結果が観察され、これにより、これらの観察の予期がＥＲＫ１／２の機構的阻害に特異的に関連し、オフターゲットの化合物効果に起因するものではないことが裏付けられる。
ＢＶＤ－５２３のＢＲＡＦＶ６００Ｅ：：ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐ細胞株におけるＭＡＰＫ経路シグナル伝達に対する機構的影響をさらに特徴付けるために、タンパク質レベルをウェスタンブロットによって評価した（図３４Ｃ）。親ＢＲＡＦＶ６００ＥＲＫＯ細胞では、ＢＲＡＦ阻害剤（ベムラフェニブ）、ＭＥＫ阻害剤（トラメチニブ）、またはＥＲＫ１／２阻害剤（ＢＶＤ－５２３）を薬理活性のある濃度で用いて４時間処置した後、ｐＲＳＫ１／２のレベルの低下が観察された。対照的に、同質遺伝子型二重突然変異体ＢＲＡＦＶ６００Ｅ：：ＭＥＫ１Ｑ５６Ｐ細胞はＢＲＡＦ阻害剤またはＭＥＫ阻害剤による処置後にＲＳＫリン酸化の減少を示さなかったが、ＢＶＤ－５２３はｐＲＳＫ１／２を親ＲＫＯと同等のレベルまで阻害することに関して有効なままであった。同様に、ｐＲＢが減少し、これにより、親ＲＫＯおよびＢＲＡＦＶ６００Ｅ：：ＭＥＫ１Ｑ５６ＰのどちらにおいてもＢＶＤ－５２３による処置の２４時間までにＧ０／Ｇ１での停止が起こることが示される。
獲得ＫＲＡＳ突然変異も、ＭＡＰＫ経路阻害剤に対する耐性の公知の駆動体である。この耐性の機構に対するＢＶＤ－５２３の易罹患性を理解するために、結腸直腸細胞株ＳＷ４８における臨床的に関連するＫＲＡＳ突然変異の同質遺伝子型パネルを使用した。ＢＶＤ－５２３に対する感受性をＭＥＫ阻害剤であるセルメチニブおよびトラメチニブと比較した（図３４Ｄ）。パクリタキセルに対する感受性は変化しなかった（図３７Ａ）。いくつかの突然変異体ＫＲＡＳ対立遺伝子により、中間レベルのＭＥＫ阻害に対する耐性に頑強性が付与されたが、ＢＶＤ－５２３に対する感受性は大多数の対立遺伝子によって変化せず、また、トラメチニブまたはセルメチニブを用いた場合には観察されなかった程度の感受性のシフトが観察された。全体として、これらのデータから、ＢＶＤ－５２３が、この状況でＭＥＫ阻害剤よりも効果的であることが示唆される。
（実施例１５）
ＢＶＤ－５２３は、ＢＲＡＦ阻害剤耐性患者由来のメラノーマ異種移植モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏ活性を示す
ＢＲＡＦ－／ＭＥＫに対する獲得耐性のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいて観察されたＢＶＤ－５２３の抗腫瘍効果を確認し、拡張するために、ベムラフェニブに対する耐性を有する患者に由来するＢＲＡＦ耐性異種移植モデルを利用した。ＢＶＤ－５２３を経口栄養補給によって１００ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤで２８日間、単独で、および５０ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤのダブラフェニブと組み合わせて、投薬した（図３５）。予期した通り、単剤ダブラフェニブについては最小の抗腫瘍活性が実証された（２２％のＴＧＩ）。ＢＶＤ－５２３活性はビヒクル対照と比較して有意であり（Ｐ≦０．０５）、ＴＧＩは７８％であった。このモデルでは、ＢＶＤ－５２３とダブラフェニブを組み合わせることにより、７６％のＴＧＩがもたらされた（Ｐ≦０．０５）；したがって、ＢＲＡＦに対する獲得耐性のこのモデルでは、組合せに関して単剤ＢＶＤ－５２３と比較してさらなる利益は得られなかった。
（実施例１６）
ＢＶＤ－５２３とＢＲＡＦ阻害剤の組合せ療法により有望な抗腫瘍活性がもたらされる
ＢＲＡＦ突然変異体がんを有する患者では、ＢＲＡＦ／ＭＥＫ組合せ療法に対する耐性が獲得される可能性があり（Wagleら、２０１４年）、これにより、ＭＡＰＫ経路内の他
の組合せ手法の考察が正当化される。ＢＶＤ－５２３とＢＲＡＦ阻害剤であるベムラフェニブを組み合わせることの抗増殖効果をＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体メラノーマ細胞株Ｇ－３６１において評価した。期待された通り、単剤ＢＶＤ－５２３およびベムラフェニブはどちらも活性であり、組み合わせた場合には穏当な相乗性が観察された（図３７Ｂ）。これにより、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異を有するメラノーマ細胞株において、ＢＶＤ－５２３とＢＲＡＦ阻害剤の組合せは少なくとも相加性であり、潜在的に相乗性であることが示される。さらに、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体細胞株（Ａ３７５）をＢＲＡＦ阻害剤＋ＢＶＤ－５２３の下で継続的に培養した後にｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて獲得耐性の発生は困難であった。対照的に、ダブラフェニブ単独に対する耐性は比較的急速に生じた（図３７Ｃ）。ダブラフェニブとトラメチニブの組合せに対して同等の耐性がダブラフェニブ＋トラメチニブ前に出現した。
ＢＲＡＦ阻害とＥＲＫ阻害の組合せの利益は、濃度が忍容性によって限定されないｉｎ
ｖｉｔｒｏ組合せ試験では完全には実現されない可能性がある。組合せの利益を理解するために、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５の異種移植片を利用してｉｎ ｖｉｖｏにおいて有効性を評価した。組合せ処置に対して注目すべき応答があったので、組合せ群における投薬を２０日目に停止して腫瘍の再増殖をモニターし、４２日目に再開した（図３６Ａ）。４５日目に試験を終了するまで腫瘍を週２回測定した。対照についてのエンドポイントまでの時間（ＴＴＥ）の中央値は９．２日であり、可能な限り最大の腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ）である３５．８日を１００％と定義した。テモゾロミドによる処置の結果、ＴＧＤは１．３日（４％）であり、退縮はもたらされなかった。５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇのダブラフェニブ単剤療法では、それぞれ６．９日（１９％）および１９．３日（５４％）のＴＧＤ、有意な生存利益（Ｐ＜０．００１）、および１００ｍｇ／ｋｇ群における１件のＰＲがもたらされた。１００ｍｇ／ｋｇのＢＶＤ ５２３単剤療法では、９．３日（２６％）のＴＧＤ、有意な生存利益（Ｐ＜０．００１）、および２件の永続的な完全奏効がもたらされた。ダブラフェニブとＢＶＤ－５２３の組合せでは、それぞれ可能な限り最大の１００％のＴＧＤが注目すべき退縮応答とともにもたらされ、それらの対応する単剤療法と比較して統計学的に優れた全生存がもたらされた（Ｐ＜０．００１）。最低用量での組合せにより、注目すべき７／１５の無腫瘍生存者（ＴＦＳ）がもたらされ、３つの高投与量組合せで、治癒的なまたはほぼ治癒的な活性と一致して合計４３／４４のＴＦＳがもたらされた（図３６Ｂ）。要約すると、ダブラフェニブとＢＶＤ－５２３の組合せにより、いずれの単剤よりも多数のＴＦＳおよび優れた有効性がもたらされた。
出発腫瘍体積がおよそ７５～１４４ｍｍ３であるＡ３７５異種移植片モデルにおけるＢＶＤ－５２３＋ダブラフェニブの活性に基づいて、フォローアップ実験を行って、「上のステージ」のＡ３７５異種移植片（腫瘍の出発体積の平均、７００～８００ｍｍ３）における組合せ療法の有効性を決定した（図３６Ｃ）。対照についてのＴＴＥ中央値は６．２日であり、これにより、可能な限り最大のＴＧＤ ５３．８日が確立され、これを６０日間の試験についての１００％ＴＧＤと定義した。ＢＶＤ－５２３ １００ｍｇ／ｋｇの単剤療法では、無視できるＴＧＤ（０．７日、１％）がもたらされ、対照との有意な生存差異はもたらされなかった（Ｐ＞０．０５）。ＴＴＥの分布および２件のＰＲから、ＢＶＤ－５２３を単独で用いた処置に対する応答者のサブセットが存在していた可能性があることが示唆された。ダブラフェニブ５０ｍｇ／ｋｇの単剤療法は効果的であり、４６．２日のＴＧＤ（８６％）および対照と比較して有意な生存利益（Ｐ＜０．００１）がもたらされた。この群は、評価可能なマウス１１匹の中で、３件のＴＦＳを含めた、５件のＰＲおよび５件のＣＲを有した（図３６Ｄ）。ダブラフェニブとＢＶＤ－５２３の組合せのいずれでも、最大１００％のＴＧＤおよび対照と比較して有意な生存利益（Ｐ＜０．００１）がもたらされた。各組合せにより、退縮活性には違いがあったが、評価可能なマウスの中で１００％の退縮応答がもたらされた。２５ｍｇ／ｋｇのダブラフェニブと５０ｍｇ／ｋｇのＢＶＤ－５２３組合せではＰＲが２件、ＣＲが８件あり、ＴＦＳは６／１０であり、一方、５０ｍｇ／ｋｇのダブラフェニブと１００ｍｇ／ｋｇのＢＶＤ－５２３の組合せでは６０日目にＴＦＳが１１／１１だった（図３６Ｄ）。全体として、これらのデータにより、ＢＲＡＦＶ６００突然変異体メラノーマにおけるＢＶＤ－５２３とＢＲＡＦ標的化療法の最先端の組合せについての理論的根拠が裏付けられ、また、これは、この変化を有する他の腫瘍型に拡張される可能性がある。
考察
ＢＶＤ－５２３は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏがんモデルにおける活性を有する、ＥＲＫ１／２の強力な、高度に選択的な、可逆的な、小分子ＡＴＰ競合阻害剤である。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＢＶＤ－５２３は、その作用機構と一致して、いくつかのヒト腫瘍細胞株、特に、ＭＡＰＫシグナル伝達経路に活性化突然変異を有する物に対して強力な阻害を示した。ＢＶＤ－５２３により、ＥＲＫ１／２の直接基質であるｐＲＳＫの阻害、および総ＤＵＳＰ６タンパク質レベルを含めた、下流の標的およびエフェクタータンパク質の変化が引き出された。これらの所見は、ＥＲＫ１／２阻害を用いたｐＲＳＫの有効な抑制が実証された他のＥＲＫ１／２阻害剤に関する以前の試験（Morrisら、２０１３年およびHatzivassiliouら、２０１２年）の所見に沿ったものである。興味深いことに、ＢＶＤ－５２３による処置の結果、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてＥＲＫ１／２リン酸化の顕著な増加がもたらされた。本発明者らの所見と同様に、ＥＲＫ１／２阻害剤であるＶｘ１１ｅを用いたｐＥＲＫ１／２の増加が報告されている；逆に、ＳＣＨ７７２９８４を用いるとｐＥＲＫ１／２阻害が起こる（Morrisら、２０１３年）。試験した種々のＥＲＫ１／２阻害剤の中でｐＥＲＫ１／２レベルの差異が観察されたが、下流のエフェクター（すなわち、ｐＲＳＫ１および総ＤＵＳＰ６）も同様に阻害された。これらの所見から、ｐＲＳＫ１などのＥＲＫ１／２標的基質の数量化が、ＥＲＫ１／２活性のＢＶＤ－５２３により媒介される阻害の信頼できる薬力学的バイオマーカーとしての機能を果たし得ることが示唆される。
ＢＲＡＦ阻害剤（ダブラフェニブ、ベムラフェニブ）およびＭＥＫ阻害剤（トラメチニブ、コビメチニブ）により、ＭＡＰＫ経路が特にＢＲＡＦＶ６００突然変異を有する患者における治療標的として検証される一方で、抗腫瘍応答は、獲得耐性の出現およびその後の疾患の進行により限定されている。耐性は、代償的なシグナル伝達分子の上方制御および活性化（Nazarianら、２０１０年、Villanuevaら、２０１０年、Johannessenら、２０
１０年およびWangら、２０１１年）、標的遺伝子の増幅（Corcoranら、２０１０年）、および経路構成成分（例えば、ＲＡＳ、ＭＥＫ）の活性化突然変異（Wagleら、２０１１年
、Emeryら、２００９年およびWangら、２０１１年）に起因している。ＥＲＫ１／２経路
の再活性化は、獲得耐性機構の一般的な結果の１つである。ＭＥＫＱ５６ＰがＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体メラノーマ細胞株Ａ３７５に導入されると、ＭＥＫ阻害およびＢＲＡＦ阻害に対する耐性が付与される（Wagleら、２０１１年）。対照的に、ＢＶＤ－５２３
は、工学的に操作されたＭＥＫＱ５６Ｐ細胞株においてその強力な阻害活性を保持し、これにより、ＥＲＫ１／２阻害が、ＢＲＡＦ／ＭＥＫによる処置に応答して生じる可能性がある上流活性化変化の状況において有効であることが示される。獲得耐性の状況におけるＢＶＤ－５２３の役割のさらなる証拠として、ＢＶＤ－５２３の有効性は、ベムラフェニブで疾患が進行した患者由来の腫瘍試料に由来する異種移植モデルで明らかであった；ＢＲＡＦ阻害剤であるダブラフェニブはこのモデルにおいて有効でなかった。これらのデータから、ＢＲＡＦ／ＭＥＫ耐性の状況においてＥＲＫ１／２を標的化することの役割が裏付けられ、以前公開された所見が補完される（Morrisら、２０１３年およびHatzivassiliouら、２０１２年）。ＭＡＰＫ経路の阻害剤に対する耐性をさらに特徴付けるために、ＢＶＤ－５２３自体に対する耐性の出現を調査した。がん細胞のＢＶＤ－５２３での単剤処置が永続的であり、上流のＭＡＰＫシグナル伝達構成成分（すなわち、ダブラフェニブ、トラメチニブ）を標的とする他の薬剤と比較して耐性の発生が困難であることが見出された。これは、ＥＲＫ１／２－標的化剤に対する耐性の獲得が、ＢＶＤ－５２３がＡＴＰ結合性部位のより保存された活性なコンフォメーション（confirmation）を優先的に標的とするという事実に潜在的に起因して、ＢＲＡＦ療法またはＭＥＫ療法に対する耐性の獲得よりも達成しがたいことを示唆するものである可能性がある。しかし、他のＥＲＫ１／２阻害剤を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により、耐性を駆動するＥＲＫ１／２の特定の突然変異体が同定された（Jhaら、２０１６年およびGoetzら、２０１４年）；これらの特定の突然変異はＥＲＫ１／２阻害剤で再発患者に由来する臨床試料ではまだ同定されていない。
ＢＶＤ－５２３を用いたＥＲＫ１／２阻害の潜在的な臨床的有用性は、ＢＲＡＦ／ＭＥＫ療法耐性患者の状況を超えて拡張される。ＥＲＫ１／２はこのＭＡＰＫ経路内の下流のマスターノードであるので、その阻害は、腫瘍増殖がＭＡＰＫシグナル伝達に依存する多数のがんの状況において魅力的である。全てのがんのおよそ３０％がＲＡＳ突然変異を有する；したがって、ＢＶＤ－５２３を用いて下流のＥＲＫ１／２を標的とすることは、これらのがんに対する合理的な処置手法である。さらに、Ｈａｙｅｓらの試験からの結果は、ＫＲＡＳ突然変異体膵がんにおける長時間ＥＲＫ１／２阻害に老化様増殖抑制が伴うことを示すものである（Hayesら、２０１６年）。しかし、ＲＡＳ突然変異の状況における
ＭＡＰＫシグナル伝達の最大かつ永続的な減弱のためには組合せ手法が必要になり得る。例えば、ＫＲＡＳ突然変異体結腸直腸がん細胞におけるＭＥＫ阻害により、ＥｒｂＢファミリー活性化の適応応答がもたらされ、これは、ＭＥＫ阻害に対する応答を低下させるものである（Sunら、２０１４年）。同様の状況特異的な適応応答がＢＶＤ－５２３を用い
たＥＲＫ１／２阻害後に生じる可能性がある。種々の遺伝子プロファイルおよびがん組織学的検査に対する最適な処置組合せは、進行中の研究の対象である。ＢＲＡＦＶ６００突然変異およびＲＡＳ突然変異に加えて、ＭＡＰＫを駆動する他の変化が出現している。例えば、ＲＡＦ二量体化を促進する新規のＲＡＦ融合物および非定型非Ｖ６００ ＢＲＡＦ突然変異によりＭＡＰＫ経路が活性化される（Yaoら、２０１５年）。ＢＲＡＦＶ６００
突然変異体単量体タンパク質を阻害するベムラフェニブおよびダブラフェニブなどのＢＲＡＦ阻害剤は、ＭＡＰＫシグナル伝達を二量体化依存的に駆動する非定型ＲＡＦ変化では不活性であることが示されている（Yaoら、２０１５年）。しかし、これらの腫瘍におい
て下流のＥＲＫ１／２を標的とするためのＢＶＤ－５２３を用いた処置が、このまだ対処されていない医学的必要性に取り組むための新規の手法になり得る。
ＢＲＡＦＶ６００突然変異体メラノーマ腫瘍の状況において、ＢＲＡＦ阻害とＭＥＫ阻害の組合せにより、同じ経路の異なるノードを標的とする薬剤によりどのように処置応答および持続時間が改善されるかが例示される。ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５のＢＲＡＦＶ６００Ｅ突然変異体異種移植片に対する本発明者らの組合せ試験により、ＢＶＤ－５２３とＢＲＡＦ阻害剤の組合せ療法についての裏付けがもたらされる。組合せにより、治癒的応答と一致する結果を含め、単剤処置と比べて優れた利益が実証された。ＢＲＡＦ／ＢＶＤ－５２３組合せ療法の臨床的有効性および忍容性は、まだ決定されていない。ＢＲＡＦ／ＥＲＫ１／２組合せが、標的化ＢＲＡＦ／ＭＥＫ組合せと有効性が少なくとも同等であると予期することは非現実的なことではない。さらに、獲得ＢＶＤ－５２３に対する耐性の達成が他のＭＡＰＫ経路阻害剤と比較して困難であるというｉｎ ｖｉｔｒｏにおける観察から、ＢＲＡＦ／ＢＶＤ－５２３阻害剤組合せがより永続的な応答をもたらす潜在性を有することが示唆される。
メラノーマに対する免疫療法を使用してかなりの進歩が達成されてきた。ＵＳ ＦＤＡは、進行メラノーマの処置に関して、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４標的化剤であるイピリムマブならびにプログラム死－１阻害剤であるペムブロリズマブおよびニボルマブを含めた種々の免疫チェックポイント阻害剤を承認している。ＢＶＤ－５２３をそのような免疫療法と組み合わせることは、魅力的な治療選択肢である；投薬スケジュールを探究すること、および相乗的応答を達成することができるかどうかを評価することがさらなる調査の十分な理由になる。
前臨床データに基づいて、ＢＶＤ－５２３は、腫瘍が他の処置に対する獲得耐性を有するものを含めた、ＭＡＰＫシグナル伝達に依存する悪性腫瘍を有する患者の処置に関する見込みがあり得る。ＢＶＤ－５２３の臨床開発を以下に記載する。実施例１７～２４を参照されたい。
（実施例１７）
進行固形腫瘍を有する患者における画期的医薬品である新規の経口ＥＲＫ１／２キナーゼ阻害剤ＢＶＤ－５２３（ウリキセルチニブ）の第Ｉ相用量漸増試験
本発明は、進行固形腫瘍を有する患者を処置するためのＥＲＫ１／２阻害剤のファースト・イン・ヒューマン用量漸増試験について記載する。ＢＶＤ－５２３は、好都合な薬物動態学および臨床的活性の初期の証拠を伴う許容される安全性プロファイルを有する。
ＲＡＳ－ＲＡＦ－ＭＥＫ－ＥＲＫカスケードを介した分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達は発がんにおいて決定的な役割を果たす；したがって、治療標的として著しい関心を集める。この遍在する経路は、プロテインキナーゼＲＡＦ、ＭＥＫ１／２、およびＥＲＫ１／２のカスケードの上流のＲＡＳで構成される。ＲＡＳがＧＴＰ結合によって活性化され、これにより今度は各プロテインキナーゼの活性化が逐次的にもたらされる。これらは単にＭＥＫ１／２の生理的基質であると思われるが、ＥＲＫ１／２は、細胞質内および核内に、転写因子Ｅｌｋ１、ｃ－Ｆｏｓ、ｐ５３、Ｅｔｓ１／２、およびｃ－Ｊｕｎを含めた多くの標的を有する（Shaulら、２００７年）。ＥＲＫ１
／２活性化およびキナーゼ活性は、細胞の増殖、分化、および生存に、リボソームＳ６キナーゼ（ＲＳＫ）ファミリーメンバーの活性化（Romeoら、２０１２年）を含めた種々の
機構を通じて影響を及ぼす（Rasolaら、２０１０年）。
ＲＡＳ－ＲＡＦ－ＭＥＫ１／２－ＥＲＫ１／２シグナル伝達経路の構成的な、異常な活性化が同定され、多くのがんの発生または維持に関係づけられている（Schubbertら、２
００７年およびGollobら、２００６年）。ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＨＲＡＳなどのＲＡＳファミリー遺伝子の突然変異が最も一般的であり、活性化ＲＡＳ突然変異はヒトがんの約３０％において生じる（Schubbertら、２００７年）。ＫＲＡＳ突然変異は、膵臓が
ん（＞９０％）（Kandaら、２０１２年）、胆道がん（３％～５０％）（Hezelら、２０１４年）、結腸直腸がん（３０％～５０％）（Arringtonら、２０１２年）、肺がん（２７
％）（Pennycuickら、２０１２年）、卵巣がん（１５％～３９％）（Dobrzyckaら、２０
０９年）、および類内膜子宮内膜がん（１８％）（O'HaraおよびBell、２０１２年）で広く見られ、ＮＲＡＳ突然変異は、メラノーマ（２０％）（Khattakら、２０１３年）およ
び骨髄性白血病（８％～１３％）（Yohe、２０１５年）で広く見られ、ＨＲＡＳ突然変異は、膀胱がん（１２％）で広く見られる（Fernandez-MedardeおよびSantos、２０１１年
）。ＲＡＦファミリー遺伝子、とりわけＢＲＡＦの突然変異が特にメラノーマにおいて発生頻度が高い。ＢＲＡＦ突然変異は、悪性メラノーマの６６％および広範囲の他のがんの約７％で同定されており（Daviesら、２００２年）、一方、ＭＥＫ突然変異はより稀であり、メラノーマにおける全体的な発生頻度は８％である（Nikolaevら、２０１２年）。対照的に、腫瘍形成をもたらすＥＲＫ突然変異は現在までめったに報告されていない（Deschenes-Simardら、２０１４年）。
アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）は、２種の選択的ＢＲＡＦ阻害剤、ベムラフェニブおよびダブラフェニブを、ＢＲＡＦＶ６００突然変異体転移性メラノーマを有する患者に対する単剤療法として承認している（Ｔａｆｌｉｎａｒ［添付文書］およびＺｅｌｂｏｒａｆ［添付文書］）。これらの標的化療法についての奏効率はＢＲＡＦＶ６００突然変異を有する患者において５０％の高さであり得るが、応答の持続時間は、多くの場合、数年単位ではなく数カ月単位で測定されている（Hauschildら、２０１２年およびMcArthurら、
２０１４年）。ＭＥＫ１／２阻害剤であるトラメチニブも、この状況における単剤療法として承認されているが（Ｍｅｋｉｎｉｓｔ［添付文書］）、より一般には、ＢＲＡＦ阻害剤であるダブラフェニブと組み合わせて使用される。トラメチニブとダブラフェニブの組合せ投与という第一選択使用により、ベムラフェニブ単剤療法と比較して、全体的な毒性の増加を伴わずに全生存のはるかに大きな改善がもたらされ（Robertら、２０１５年）、これにより、このＭＡＰＫシグナル伝達経路の多数のタンパク質を同時に標的とすることの潜在的な有用性が強調される。この治療的組合せでは、ＭＥＫ阻害剤に関連する皮疹およびＢＲＡＦ阻害剤により誘導される過剰増殖皮膚病変の発生率も各単剤単独と比較して低かった（Flahertyら、２０１２年）。最近、第ＩＩＩ相試験により、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ／Ｋ突然変異陽性メラノーマを有する患者において、ダブラフェニブ＋トラメチニブを用いた場合に、ダブラフェニブ単独に対して、全生存（２５．１カ月対１８．７カ月、ハザード比［ＨＲ］０．７１、Ｐ＝０．０１０７）、無増悪生存期間（ＰＦＳ）（１１．０カ月対８．８カ月、ＨＲ ０．６７、Ｐ＝０．０００４）、および全体的な応答（６９％対５３％；Ｐ＝０．００１４）の有意な改善も実証された（Longら、２０１５年）。同様に、コビメチニブ＋ベムラフェニブの組合せを用いた場合に、ベムラフェニブ単独と比較してＰＦＳ（９．９カ月対６．２カ月、ＨＲ ０．５１、Ｐ＜０．００１）および完全奏効（ＣＲ）率または部分奏効（ＰＲ）率（６８％対４５％；Ｐ＜０．００１）の有意な改善も実証された（Larkinら、２０１４年）。この目的のために、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ／Ｋ突然変異メラノーマに対するベムラフェニブとコビメチニブ（cobemetinib）の組合せに
対してＦＤＡによる認可が最近与えられた。これらおよび関連する所見に基づいて、ＢＲＡＦ阻害剤＋ＭＥＫ阻害剤の組合せが、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ／Ｋ突然変異を含有する転移性メラノーマを有する患者に対する標準の標的化処置選択肢になっている。
ＢＲＡＦ／ＭＥＫ標的化組合せ療法では、単剤選択肢を超える有意な追加の利益がもたらされることが実証されているが、大多数の患者で、最終的に、約１２カ月後に耐性および疾患の進行が生じる（Robertら、２０１５年、Flahertyら、２０１２年およびLongら、２０１５年）。ＢＲＡＦスプライシングバリアントの生成、ＢＲＡＦ増幅、ＮＲＡＳまたはＭＥＫ突然変異の発生、およびバイパス経路の上方制御を含めた、単剤療法または組合せ療法のいずれかの後のいくつかの獲得耐性の機構が同定されている（Poulikakosら、２０１１年、Corcoranら、２０１０年、Nazarianら、２０１０年、Shiら、２０１４年、Johannessenら、２０１０年、Wagleら、２０１１年、Wagleら、２０１４年およびAhronianら、２０１５年）。これらの耐性の機構の多くの中心は、ＭＡＰＫ経路シグナル伝達の迅速な回復および腫瘍細胞の単剤ＢＲＡＦまたはＢＲＡＦ／ＭＥＫ阻害剤療法組合せからの逃避を可能にする、ＥＲＫシグナル伝達の再活性化である（Paraisoら、２０１０年）。Ｅ
ＲＫはこのＭＡＰＫシグナル伝達経路の最も遠位のマスターキナーゼであるので、ＥＲＫ阻害により、上流の機構から耐性を回避または克服する機会がもたらされ得る。これは、小分子阻害剤によるＥＲＫの阻害が、耐性の出現が阻害されるように、ならびに、ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤に対する獲得耐性が克服されるように作用するという前臨床的証拠によって裏付けられる（Morrisら、２０１３年およびHatzivassiliouら、２０１２年）。
ＢＶＤ－５２３は、ＢＲＡＦおよびＲＡＳ突然変異体異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を低下させ、腫瘍退縮を誘導することが示されている、非常に強力な、選択的な、可逆的な、ＡＴＰ競合ＥＲＫ１／２阻害剤である。さらに、単剤ＢＶＤ－５２３により、ＢＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤の両方に対して交差耐性であるヒト異種移植モデルが阻害された。実施例９～１６を参照されたい。したがって、さらなる研究のための最大耐量および推奨用量を同定するための、経口ＢＶＤ－５２３のオープンラベル、ファースト・イン・ヒューマン試験（Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ、ＮＣＴ０１７８１４２９）に着手した。本試験はまた、進行がんを有する患者における薬物動態および薬力学的性質ならびに予備的な有効性を評価することも目的とした。
（実施例１８）
患者の特性
合計２７名の患者が登録され、２０１３年４月４日から２０１５年１２月１日まで少なくとも１つの用量の試験薬を受けた。ベースライン人口統計および疾患特性を表２５に示す。患者の年齢の中央値は６１歳であった（範囲、３３～８６歳）。患者の５２パーセント（１４／２７）が男性であり、６３％（１７／２７）がＥａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータス１を有した。メラノーマが最も一般的ながんであった（３０％；これらの患者の７／８にＢＲＡＦ突然変異が存在した）。残りの患者は結腸直腸がん（１９％；５／２７）、甲状腺乳頭がん（１５％；４／２７）、または非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（７％；２／２７）を有し、８（３０％）は、他のがんを有すると分類された（膵臓がん２名、虫垂がん１名、非セミノーマ生殖細胞がん１名、卵巣がん１名および原発不明がん３名）。大多数の患者が、２種またはそれよりも多くの先行選択の全身療法を受けており、４１％（１１／２７）が２～３種の先行選択の全身療法を受けており、４８％（１３／２７）が＞３種の先行選択の全身療法を受けていた。
Figure 2022034068000032
 （実施例１９）
ｅｘ ｖｉｖｏにおけるＢＶＤ－５２３のＲＳＫ１／２リン酸化に対する効果
ＢＶＤ－５２３のＥＲＫ活性に対する阻害効果を実証するために、臨床試験を支持するために使用することができるｅｘ ｖｉｖｏバイオマーカーアッセイを展開した。このアッセイにより、ＢＶＤ－５２３、ダブラフェニブ、トラメチニブ、およびベムラフェニブなどのＭＡＰＫシグナル伝達の阻害剤がＢＲＡＦ突然変異体がん細胞株において阻害剤の濃度に応じてＲＳＫリン酸化を阻害することが示された前臨床的細胞データが拡張される。実施例９～１６を参照されたい。具体的には、全血におけるＥＲＫ基質ＲＳＫ１のホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）により刺激されるリン酸化のＥＲＫ阻害剤依存性阻害を標的マーカーとして使用した。ＢＶＤ－５２３を健康な志願者由来の全血に直接添加した場合、ＰＭＡにより刺激されるＲＳＫリン酸化は漸増濃度のＢＶＤ－５２３で減少した（図３８）。累積データに関する平均ＩＣ５０はＢＶＤ－５２３について４６１±２０ｎＭであり、最大阻害は１０μＭのＢＶＤ－５２３で７５．８±２．７％であった。最大阻害は、１０μＭのＢＶＤ－５２３の存在下で測定されるＲＳＫリン酸化と定義した。ＢＶＤ－５２３の投薬直前または投薬後の定義された時点において収集した患者由来の全血試料を同様に試験し、ＲＳＫリン酸化のレベルを定量化した。
（実施例２０）
用量漸増、用量制限毒性（ＤＬＴ）、最大耐量（ＭＴＤ）、および推奨される第ＩＩ相用量（ＲＰ２Ｄ）
プロトコールの通り、５つの単一の患者のコホート（１０～１５０ｍｇ、１日２回［ＢＩＤ］）は、ＤＬＴの証拠を伴わず続行した。３００ｍｇ ＢＩＤコホートは、ＢＶＤ－５２３曝露をより詳細に特徴付けるために拡大した。６００ｍｇ ＢＩＤを受けた患者６名のうち１名にグレード３の皮疹であるＤＬＴが生じた。９００ｍｇ ＢＩＤ用量はＭＴＤを超え、患者１名にグレード３のそう痒およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の上昇が生じ、別の患者にグレード３の下痢、嘔吐、脱水、およびクレアチニン上昇が生じた（表２６）。続く中間用量である７５０ｍｇ ＢＩＤもＭＴＤを超え、患者１名におけるグレード３の皮疹およびグレード２の下痢ならびにグレード２の低血圧、別の患者におけるクレアチニン上昇、および貧血であるＤＬＴが伴った。したがって、ＭＴＤおよびＲＰ２Ｄを６００ｍｇ ＢＩＤと決定した。
Figure 2022034068000033
 （実施例２１）
有害事象（ＡＥ）
治験責任医師により、グレードを問わず患者２７名のうち２６名（９６％）に認められた処置に関連するＡＥが評価された。処置に関連するＡＥ（＞３０％）の最も一般的なものは皮疹（主にざ瘡様）（７０％）、疲労（５９％）、下痢（５２％）、および悪心（５２％）であった（表２７）。グレード４または５の処置に関連するＡＥが生じた患者または処置に関連するＡＥに起因して処置を中止した患者はいなかった。大多数の事象はグレード１～２であり、処置に関連するグレード３の事象は患者２７名のうち１３名（４８％）で認められた。患者の１０％以上に存在した唯一のグレード３の処置に関連する事象は下痢（１５％）および肝機能検査値の上昇（１１％）であり、これらは全て６００ｍｇ ＢＩＤ用量よりも上で生じた。
Figure 2022034068000034
１４名の患者に合計２８の重篤なＡＥ（ＳＡＥ）が生じた。これらの患者のうち９名が、治験責任医師によってＢＶＤ－５２３に関連するまたはおそらく関連するとみなされ、当該ＳＡＥには、脱水、下痢、またはクレアチニン上昇（それぞれ２名の患者）、嘔吐、悪心、および発熱（それぞれ１名の患者）が含まれた。他のＳＡＥは全てＢＶＤ－５２３を用いた処置には無関係であるとみなされた。試験中、３名の患者でＡＥに起因した用量の低減を行った：１名の患者では６００ｍｇ ＢＩＤから３００ｍｇ ＢＩＤへの低減を行い、２名の患者では９００ｍｇ ＢＩＤから６００ｍｇ ＢＩＤへの低減を行った。
（実施例２２）
薬物動態学
ＢＶＤ－５２３の単一用量および定常状態の薬物動態学が図３９Ａおよび表２８に要約されている。一般に、進行悪性腫瘍を有する患者において、経口投与されたＢＶＤ－５２３は緩徐に吸収される。最大濃度（Ｃｍａｘ）に達した後、血漿ＢＶＤ－５２３レベルはおよそ２～４時間にわたって持続する。その後、血漿薬物濃度は緩徐に低下する。血漿薬物濃度は朝の投薬の１２時間後までしか測定しなかったので、有効または終末相消失速度を算出するのは不可能であった。ＢＶＤ－５２３の薬物動態学は、最大６００ｍｇ ＢＩＤで投与した場合、Ｃｍａｘおよび曲線下面積（ＡＵＣ）のどちらに関しても、直線的であり、用量に比例した。用量を６００から９００ｍｇ ＢＩＤに増加させても曝露のさらなる増大は観察されなかった。Ｃｍａｘは、２０ｍｇ ＢＩＤを超える全ての用量について、ｅｘ ｖｉｖｏ全血アッセイ（約２００ｎｇ／ｍＬ）に基づいて、ＥＣ５０のレベルに達した。さらに、定常状態の曝露は、≧１５０ｍｇ ＢＩＤの用量レベルについて、投薬期間全体を通して標的ＥＣ５０またはそれを上回ったままであった。ＢＶＤ－５２３のおよびその代謝産物の最小の血漿蓄積は１５日目に低（＜７５ｍｇ ＢＩＤ）用量レベルで観察されたが、高用量レベルについての蓄積は、およそ１．３～４．０倍にわたった。２２日目の投薬前濃度は、一般に、１５日目の投薬前濃度と同様であり、これにより、１５日目までに定常状態にすでに達していることが示される（データは示していない）。ＢＶＤ－５２３およびその代謝産物への血漿曝露に関する患者間の変動性の程度は中等度であり、問題ないとみなされた。
Figure 2022034068000035
ＢＶＤ－５２３の第１の投薬後および定常状態における尿中排出は、投薬後１２時間以内の全用量レベルで無視できるものであり（用量の＜０．２％）、この非常に低い百分率の範囲内で用量には関連しなかった。腎クリアランスは、用量に依存しないと思われた。個々の腎クリアランス値は０．１２８～０．０８９５Ｌ／ｈｒ（用量レベル当たりｎ＝１）にわたり、平均値は０．０１４９～０．０３００Ｌ／ｈｒ（ｎ≧３）にわたった。
（実施例２３）
ＢＶＤ－５２３による標的阻害の薬力学的確認
ＢＶＤ－５２３によるオンターゲットおよび経路阻害を確認するために、ＢＶＤ－５２３を受けた、固形腫瘍を有する患者由来のヒト全血試料において、ＲＳＫ－１のリン酸化を標的バイオマーカーとして調査した。１５日目の投薬の直前に収集した、ＢＶＤ－５２３で処置した患者由来の定常状態の全血試料では、ＰＭＡにより刺激されるＥＲＫ活性の濃度依存的阻害が示され（図３９Ｂ）、これは、ＢＶＤ－５２３を１０ｍｇ ＢＩＤで投薬した場合の０％ＥＲＫ阻害から、９００ｍｇ ＢＩＤで投薬した場合の９３±８％ＥＲＫ阻害までにわたった。ＥＲＫリン酸化の５０％阻害をもたらす血漿中ＢＶＤ－５２３濃度は、ＢＶＤ－５２３を健康な志願者の血漿に直接スパイクしたか患者の経口投薬後に存在したかにかかわらず同様であった。
（実施例２４）
抗腫瘍効果
ＢＶＤ－５２３に対する腫瘍応答を、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓバージョン１．１（ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１）を使用して評価可能な患者２５名において評価した；２名の患者は標的病変に関する両方のスキャンを受けず、したがって、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１を使用した評価を行わなかった。完全奏効が達成された患者はいなかったが、３名の患者（全ての患者がＢＲＡＦＶ６００突然変異を有するメラノーマを有した）で部分奏効が達成された（１２９日［ＢＲＡＦ／ＭＥＫ阻害剤に対してナイーブ］、２９４日継続［以前のＢＲＡＦ／ＭＥＫ阻害剤に対して抗療性］、データカットオフ日まで３１３日継続［他のＢＲＡＦ／ＭＥＫ阻害剤に対して不耐性］）（図４０Ａ）。興味深いことに、部分応答者３名全てがＢＲＡＦ突然変異体メラノーマを有した。ＢＶＤ－５２３を４５０ｍｇ ＢＩＤの用量で受けた１名の部分応答者では、標的病変の合計がベースラインからおよそ７０％低減したが、他の部分応答者では、４７．０％および３３．６％の低減が示された。１８名の患者で疾患の安定が実証され、そのうち６名は６カ月よりも長く疾患の安定を有し、６名の追加の患者は３カ月よりも長く疾患の安定を有した。本研究では、４名の患者が第１の評価時点で進行を示した。
図４０Ｂは、以前のベムラフェニブおよびその後のダブラフェニブ／トラメチニブによる処置では進行した部分応答者（ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１）３名のうち１名のコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）スキャンを示す；ＢＶＤ－５２３を６００ｍｇ ＢＩＤで＞３００日にわたって投薬した後、永続的な部分奏効が観察された。フルオロデオキシグルコース陽性放出断層撮影法（１８Ｆ－ＦＤＧ－ＰＥＴ）を使用して、評価可能な患者１６名のうち５名においてＢＶＤ－５２３が代謝応答に関連付けられた。
図４１は、試験集団における効果発現までの時間および応答の持続時間を示す。ＢＶＤ－５２３に対する応答が示した２名の患者は、試験カットオフ日（＞５００日）の時点で試験に残り、ＢＶＤ－５２３による処置を継続した；さらに、気管支肺胞ＮＳＣＬＣを有する１名の患者（分子プロファイリングには十分な組織でない）は、＞７００日にわたって安定な疾患で処置を受けた。患者２７名のうち２４名（９０％）は、進行（２２／２７、８２％）または他の理由（２／２７、７％）によって処置を中止した。中止前のＢＶＤ－５２３による処置の平均持続時間は４．７カ月であった。
考察
本発明は、進行固形腫瘍を有する患者２７名におけるＢＶＤ－５２３の安全性、薬物動態学、薬力学、および予備的な有効性を評価するファースト・イン・ヒューマン試験からの結果を示す。この用量漸増試験では、経口ＢＶＤ－５２３を用いた処置により、ＲＥＣＩＳＴ ｖ１．１によるＸ線撮影応答（３件の部分奏効）と、大多数が２種以上の以前の全身療法で処置されていた一部の患者における長時間疾患安定化との両方がもたらされた。１８Ｆ－グルコースの腫瘍による取り込みのイメージングにより、患者のサブセットにおいて、腫瘍における代謝応答のＢＶＤ－５２３依存性阻害の証拠が確立された。薬物曝露は、用量を６００ｍｇ ＢＩＤまで増加させるにしたがって直線的に増大し、６００ｍｇ ＢＩＤでの曝露では、ｅｘ ｖｉｖｏ全血アッセイにおいてＥＲＫ依存性基質（ＲＳＫ－１）リン酸化のほぼ完全な２４／７阻害がもたらされた。さらに、ＢＶＤ－５２３に対する忍容性は、６００ｍｇ ＢＩＤと決定されたそのＭＴＤおよびＲＰ２Ｄまでで投与した場合、管理可能であった。
ＢＶＤ－５２３は、一般に、忍容性が良好であり、管理可能かつ可逆的な毒性を有した。最も一般的なＡＥは、皮疹（通常、ざ瘡様）、疲労、ならびに、悪心、嘔吐、および下痢を含めた胃腸の副作用であった。ＢＶＤ－５２３の安全性プロファイルは、そのＭＡＰＫ経路の選択的阻害と一致する；ＡＥプロファイルから、ＭＥＫ阻害剤で生じるものとの考慮すべき重複が示される。しかし、いずれの標的化療法に付随する毒性も、特定の機構および標的阻害の程度ならびにあらゆるオフターゲットの効果の両方への依存を含み得る（Ｚｅｌｂｏｒａｆ［添付文書］およびHauschildら、２０１２年）。進行中のおよび今
後の調査は、この用量漸増試験において実証された有効性および安全性プロファイルの両方に拡張され、ＥＲＫ阻害剤ＢＶＤ－５２３のユニークなプロファイルをどのように単剤としてまたは他の薬剤と組み合わせて使用することができるかの手引きになるであろう。
ＲＡＦ阻害剤およびＭＥＫ阻害剤による永続的な応答は、多くの場合、内因性のおよび最終的な獲得耐性により限定され、これらには、ＥＲＫ経路の再活性化の関与があることが多い一般的な特徴が伴う（Poulikakosら、２０１１年、Corcoranら、２０１０年、Nazarianら、２０１０年、Shiら、２０１４年、Johannessenら、２０１０年、Wagleら、２０
１１年、Wagleら、２０１４年、Ahronianら、２０１５年およびParaisoら、２０１０年）。したがって、ＢＶＤ－５２３を単独で用いたまたは他のＭＡＰＫシグナル伝達経路阻害剤と組み合わせたＥＲＫ阻害には、既存の療法に対する耐性の発生を遅らせる、およびより広範な患者集団に有益になる潜在性があり得る。ＢＲＡＦ耐性細胞株およびＭＥＫ耐性細胞株において効力を保持するＢＶＤ－５２３を含めたＥＲＫ阻害剤により、標準治療（ＢＲＡＦ／ＭＥＫ組合せ療法）に対する獲得耐性を有する患者におけるＥＲＫ阻害剤の使用に関する前臨床的証拠がもたらされる。例えば、実施例９～１６を参照されたい。重要なことに、本研究では、最初にＢＲＡＦ阻害剤（ベムラフェニブ）を用いて処置し、その後、ＢＲＡＦ阻害剤とＭＥＫ阻害剤（ダブラフェニブ／トラメチニブ）を組み合わせて処置した場合に疾患の安定後にがんが進行した患者は、単剤ＢＶＤ－５２３を受けると部分奏効を有した。この患者は、本明細書において報告されている試験のカットオフ日の時点で合計７０８日にわたって試験を受け続けた。この患者において観察された抗腫瘍効果に一部基づいて、ＦＤＡは、ＢＲＡＦおよび／またはＭＥＫ阻害剤（複数可）を用いた処置に対して抗療性である、または処置後に進行した、切除不能または転移性ＢＲＡＦＶ６００突然変異陽性メラノーマを有する患者を処置するためのＢＶＤ－５２３に関する調査をＦａｓｔ Ｔｒａｃｋ開発プログラムに指定した。ＢＶＤ－５２３により厳密にどのように患者の介護を最良に支持できるか（例えば、単剤としてまたは種々の組合せで）を的確に定義するためには追加の臨床試験が必要である。
要約すると、本実施例は、新規の画期的医薬品ＥＲＫ阻害剤であるＢＶＤ－５２３を、進行がんを有する患者に対する処置として評価する第Ｉ相試験の用量漸増部分からの最初のデータからのデータを提示する。継続的な、１日２回の経口ＢＶＤ－５２３を用いた処置の結果、利用可能なＭＡＰＫ経路標的化療法に対してナイーブであるまたは当該療法で進行した患者を含めた数名の患者において抗腫瘍効果がもたらされた。ＢＶＤ－５２３は、概して、この進行がん患者集団において忍容性が良好であり、毒性は管理可能であった；ＭＴＤおよびＲＰ２Ｄは６００ｍｇ ＢＩＤであった。ＢＶＤ－５２３への曝露は、ＲＰ２Ｄまで直線的に増大し、この用量レベルで頑強な薬力学効果が明らかであった。用量漸増期になされた観察を確認し、拡張するために、この第Ｉ相臨床研究の拡大が現在進行中である。具体的には、患者を、種々の腫瘍組織学的検査値にわたって分子的に分類された拡大コホート（例えば、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫまたはＥＲＫの変化）に登録する。さらに、拡大コホートでは、利用可能なＭＡＰＫ経路療法に対してナイーブである患者またはそのような処置で疾患が進行したがんを有する患者におけるＢＶＤ－５２３の使用を評価する。
文書
Figure 2022034068000036
Figure 2022034068000037
Figure 2022034068000038
Figure 2022034068000039
Figure 2022034068000040
Figure 2022034068000041
Figure 2022034068000042
Figure 2022034068000043
Figure 2022034068000044
Figure 2022034068000045
Figure 2022034068000046
本出願において引用される文書は全て、これにより、本明細書に全部列挙されているのと同じく参照により組み込まれる。
本明細書には本発明の例示的な実施形態が記載されているが、本発明は、記載されている実施形態に限定されないこと、および、当業者は本発明の範囲または主旨から逸脱することなく種々の他の変化または改変をなすことができることが理解されるべきである。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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