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JP2022008651A - オリゴヌクレオチドを利用して細胞内の核酸を編集するための組成物および方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチドを利用して細胞内の核酸を編集するための組成物および方法 Download PDF

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JP2022008651A JP2021159689A JP2021159689A JP2022008651A JP 2022008651 A JP2022008651 A JP 2022008651A JP 2021159689 A JP2021159689 A JP 2021159689A JP 2021159689 A JP2021159689 A JP 2021159689A JP 2022008651 A JP2022008651 A JP 2022008651A
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M Woolf Tod
レベデブ、アレクサンドル
Lebedev Alexandre
アイ． ホグレフ、リチャード
I Hogrefe Richard
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Abstract

Figure 2022008651000001
【課題】編集オリゴヌクレオチドを利用した医学的状態もしくは疾患の治療のための組成物および方法を提供する。
【解決手段】編集オリゴヌクレオチドは、標的核酸とのハイブリダイゼーションに適切な位置に活性編集部分を位置付ける糖またはリンカーを含有し、約１０～約５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を、編集部分の各側に含有し、また、ゲノム内の標的配列からのヌクレオチド配列変化を少なくとも１つ含有し得る。本方法は、編集プロセスを補助する追加のタンパク質または核酸を用いずに、編集オリゴヌクレオチドを利用して細胞内のゲノム配列を修飾することを含む。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
以下の出願は、２０１５年１１月９日出願の仮特許出願第６２／２５２，６９３号、２０１５年６月１６日出願の同第６２／１８０，１７５号、２０１５年３月３１日出願の同第６２／１４１，０７７号、および２０１４年１２月１２日出願の同第６２／０９１，０２７号の優先権を主張するものである。
連邦政府資金による研究開発の記載
該当なし
共同研究契約の当事者の名称
該当なし
コンパクトディスクで提出された資料の参照による援用
該当なし
本発明は、ヒトおよび動物の治療学（インビボおよびエクスビボの治療用途を含む）、美容手技、前臨床開発、基礎研究の分野における用途のため、また、農業における備蓄食糧の改善、畜産における望ましい特徴を与えるための動物（農業用動物および他の家畜化された動物）の品種改良、およびエネルギー生産のために、ゲノムまたはＲＮＡの配列を修飾するオリゴヌクレオチドを使用することに関する。
過去１０年間にわたるオリゴヌクレオチド化学およびインビボ核酸送達技術の進歩は、ＤＮＡおよびＲＮＡ修飾療法の潜在性を開いてきた。多数の臨床治験における肯定的なデータ、および米国における初めての全身用アンチセンス薬、ミポメルセン（Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の認可は、オリゴヌクレオチド薬の臨床有用性をさらに実証している。
ＲＮＡレベルの調整によりタンパク質発現を阻害するために治療用オリゴヌクレオチドを使用することの臨床的利益は実証されているが、核酸編集または修復手法の臨床的潜在性はおそらく、これらの阻害手法の利益を上回るであろう（Ｔ．Ｍ．Ｗｏｏｌｆ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｖｏｌ．９２：８２９８－８３０２，１９９５、およびＴ．Ｍ．Ｗｏｏｌｆ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｖｏｌ．１６：３４１－３４４，１９９８）。堅固な編集技術プラットフォームは、変異ＤＮＡの部位特異的な化学的補正、保護的アレルの創生、または、研究、治療、美容、もしくは農業目的で望ましい、生物全体、細胞、もしくは組織のゲノム内の変化を別法で創生することを可能にする。そのようなプラットフォームは、遺伝子点変異および他の遺伝子病変により生じる広範な疾患のための治療介入および潜在的な治療法として、幅広い有用性を有するであろう。
核酸を用いた配列編集には、２つの一般的機構が存在する。それらは、化学修飾、および標的への核酸配列の組み込みである。化学修飾機構では、編集オリゴヌクレオチドは、標的ヌクレオチドのコーディングが変化するような標的ヌクレオチドの化学修飾を引き起こす。第２の一般的機構は、１個以上のオリゴヌクレオチドを標的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列に組み込むことによる。この機構では、オリゴヌクレオチドは、「ドナー」ＤＮＡと称されることが多い。この機構は、漠然と相同組換え（ＨＲ）または相同指向修復と称されるが、遺伝子変換、トランススプライシング、または鎖侵入、その後の核酸合成のプライミングなどの、他の機構を含む場合もある。
次世代シーケンシングおよびＳＮＰ分析に推進された、遺伝経路および分子経路に関する情報の急増は、一遺伝子性および多遺伝子性の疾患を治療するための治療的編集に関する多数の標的を提供している。これらの疾患の例としては、家族性アルツハイマー病、高血圧、高コレステロール、ＨＩＶ（ＣＣＲ５変異を誘導することによる）、鎌状赤血球貧血、肥満、糖尿病、いくつかの形態の筋ジストロフィー、および多くの先天性代謝異常が挙げられる。ＤＮＡ編集修復の治療的潜在性は、有望なデータによって実証されてきた。操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）は、ＨＩＶの治療に使用されており、エクソンスキッピングアンチセンスモルホリノ（Ｓａｒｅｐｔａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）および２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｓｅｎｓａ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は、ある特定の形態のデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用されている。加えて、編集効率の向上に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ－９遺伝子編集手法は、治療用途におけるいくつかの研究成果および投資を生み出している。
治療的なｍＲＮＡ編集は、Ｗｏｏｌｆらによって脊椎動物モデル系で初めて示された（ＰＮＡＳ Ｖｏｌ．９２：８２９８－８３０２，１９９５）。この系では、デュシェンヌ型筋ジストロフィーｍＲＮＡにおける標的となる終止コドン変異が、標的部位における編集アンチセンスＲＮＡとの二重鎖形成によって修飾された。Ｗｏｏｌｆらによる研究は、特異性が限定された編集を誘導した。
Ｍｏｎｔｉｅｌら（ＰＮＡＳ １１０（４５）：１８２８５－９０，２０１３）は、嚢胞性線維症のｍＲＮＡ修復の関連機構を実証し、哺乳動物細胞において２０％の補正が達成された。これは治療的編集の原理を示すことに成功したが、Ｍｏｎｔｉｅｌの方法は、臨床用途への適用が容易ではない。この主要な理由は、Ｍｏｎｔｉｅｌらの方法が、修飾遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク質を、遺伝子療法、ｍＲＮＡ療法、または他の方法によって細胞内に導入することを必要とすることである。このため、遺伝子療法およびｍＲＮＡ療法に認められる既知の不利点のすべてが、Ｍｏｎｔｉｅｌの治療的編集方法にも関連する。
別の手法において、Ｓｉｎｇｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２７（２４）：３８－４５，１９９９）は、ＲｅｃＡタンパク質に補助され、標的鎖にハイブリダイズした、アルキル化オリゴマーを有するＤＮＡを標的にした。この研究では、反応性ナイトロジェンマスタード基が、アミノ－プロピルリンカーを介して、侵入オリゴヌクレオチドの内部ｄＵ残基の５位に接合された。このオリゴヌクレオチドの最大５０％が、標的ＤＮＡ配列と架橋することが観察され、標的配列の最大２％の変異が、１回の処置サイクル後の哺乳動物細胞への複合体のトランスフェクションに際して確認された。しかしながら、侵入オリゴヌクレオチドを標的ＤＮＡに架橋することは、典型的に、ＤＮＡのある領域にわたって分布する様々な変異をもたらし、複製の阻害をもたらし得る。オリゴヌクレオチドに対する反応性の塩基修飾性化学構造の接合、および標的ｄｓＤＮＡ配列の配列特異性修飾が達成されている（Ｆ．Ｎａｇａｔｓｕｇｉ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３１（６）：ｅ３１ ＤＯＩ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｎｇ０３１，２００３）。この研究では、２－アミノ－６－ビニルプリンヌクレオシド類似体が、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）に合成的に組み込まれた。このＴＦＯは、緩衝液中で標的ＤＮＡプラスミドと反応し、標的ＤＮＡ配列の最大２５～４０％の修飾が達成された。この架橋されたＴＦＯとＤＮＡ標的との混合物は、次いで、細胞内にトランスフェクトされ、変異原性のレベルが判定された。この研究は、標的塩基に対するいくらかの特異性、そして低いが有意な効率（１回の処置で０．３％）と共に、標的配列の部位特異性を実証した。しかしながら、この方法は、架橋をもたらすため、Ｓｉｎｇｅｒらと同じ不利点を有する。
Ｓａｓａｋｉら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２６（２９）：８８６４－８８６５，２００４；米国特許第７，４９５，０９５号も参照されたい）は、一酸化窒素（ＮＯ）をＤＮＡ配列の特異的なシトシン部位に送達し、続いてシトシン塩基を特異的に脱アミノ化するための方法を開発した。この方法では、６－チオグアノシン含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）のニトロソ化が、Ｓ－ニトロソ－Ｎ－アセチルペニシラミンを用いて行われた。結果として生じたＳ－ニトロソチオグアニンは、次いで、鎖間のＮＯ移動反応、続いて標的部位における脱アミノ化を行うために使用された。ｄｍＣからｄＴへの４２％の形質転換比が観察されたが、標的部位にミスマッチのｄＴ、ｄＡ、またはｄＧを有する相補的なＯＤＮでは、ＮＯ移動反応（および脱アミノ化）は観察されなかった。この技術は、反応の発生を可能にするための非生理学的なｐＨ、および長いインキュベーション時間を必要としたが、これは治療介入に必ずしも適用可能ではないであろう。加えて、化学反応性のオリゴヌクレオチドによる方略は、細胞内で効率的にされたとしても、複雑な化学合成を必要とし、ＤＮＡを含む非標的細胞成分と反応性であり得、これは理想的ではない。それらはまた、塩基変化毎に異なる標的化学構造を必要とし、トランスバージョンではなくトランジションにのみ好適であり、これにより、それらの全体的な有用性が限定される。さらに、この方法は、欠失および挿入を修復せず、これは、何らかの変異を補正することに対するそれらの一般的な適用形態をさらに限定するものである。とはいえ、編集に対するこの化学修飾手法は、編集を促進するために細胞に外因性タンパク質を添加することを必要とせず、原理上は、より良好な組織分布および細胞取り込みを可能にし得る、高度に修飾されたオリゴヌクレオチド骨格と共に使用され得るという利点を有する。
１つの研究グループは、１９９０年代にキメラオリゴヌクレオチド構築物を用いた編集を達成し、次いで２０００年代に一本鎖オリゴヌクレオチドを用いた編集を達成した（Ｂｒａｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｋｍｉｅｃ，ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ４：４４５－４５７，２００５）。この編集手法では、所望の編集された配列が編集オリゴヌクレオチド内に含有され、この配列が、ゲノム内の既存の配列に置き換わった（図１）。キメラオリゴヌクレオチド構築物を用いて１９９０年代に報告された編集の効率は不定であり、この手法は、相当の投資にもかかわらず臨床適用に成功しなかった。一本鎖編集オリゴヌクレオチドを用いて同じ研究グループにより行われた後続研究は、一貫した再現可能な編集をもたらしたが、効率は比較的低かった（約０．１～１％）。最も活性な一本鎖編集オリゴヌクレオチドは未修飾のＤＮＡ内部領域を有し、これが、細胞内での急速なヌクレアーゼ分解をもたらし、また、Ｔｏｌｌ様受容体活性化をもたらしたと思われる。編集効率は、以下の手法によって上昇した：
１． ３個のホスホロチオエート残基を編集オリゴヌクレオチドの各端部に付加すること（しかしながら、細胞内での急速なエンドヌクレアーゼ消化に依然として影響されやすい場合の結果として生じる編集オリゴヌクレオチド、そしてホスホロチオエートはそれらの毒性を増加させる）；
２． 細胞がＳ期の間に編集オリゴヌクレオチドで処置されるように細胞周期を同調させること。残念ながら、これは編集効率をある程度上昇させたが、この手法は煩雑であり、必ずしもインビボ治療に実用的とは限らない；そして
３． 複製フォークの進行を減速させ、かつ／または細胞内でＤＮＡ鎖切断を誘導する試薬で、細胞を処置し、これにより細胞内のＤＮＡ修復の増加をもたらすこと（しかしながら、これは編集効率をある程度上昇させたが、この手法も煩雑であり、必ずしもインビボ治療に実用的とは限らない。
４． ＰＮＡクランプ、すなわち標的編集の近傍に結合する鎖侵入一本鎖ＰＮＡを付加すること（Ｂａｈａｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｏｌ．１４（５）：３３１－４２（２０１４）、Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｖｏｌ １０５（３６）：１３５１４－１３５１９（２００８）、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｖｏｌ．９９（２６）：１６６９５－１６７００（２００２）、米国特許第８，３０９，３５６号。
これらの改善点は、インビトロの細胞系モデルにおいて編集効率を最大およそ５％上昇させたが、各手法は上述の制限を有した（Ｋｍｉｅｃ，Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２４：９５－９９，２０１５）。
より近年では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系が、ゲノム編集の効率を向上させるために使用されている。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、オフターゲット修飾を引き起こし、潜在的に危険かつ望ましくない染色体内の一本鎖および二本鎖切断を必要とすることが多い。この系はまた、外来性の細菌タンパク質が発現されるか、または機能的な形態で細胞に送達されることを厳密に必要とする。この細胞タンパク質すなわちＣａｓ９は免疫原性であり、したがって治療用途にあまり望ましくない。加えて、タンパク質の発現または細胞へのその送達は、臨床開発における重要課題である。１つの配列から別の規定の配列への特異的変更を行うために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系は、Ｃａｓ９に加えて、７０ヌクレオチドを超えるｇＲＮＡと、ゲノム内の挿入のための１個または２個の追加のオリゴヌクレオチドとを必要とする。このように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集系は高度に複雑であり、この複雑性が臨床開発における課題を生み出す。
その結果、一般に、そして特により短い編集オリゴヌクレオチドでより効率的に機能し、かつ、作用の方法として標的核酸の核酸塩基に編集オリゴヌクレオチドを架橋すること；修復をもたらすために標的核酸に切断を導入すること；送達ビヒクル；免疫原性タンパク質または未修飾の不安定ＲＮＡを細胞内に送達すること；ならびにベクター配列を標的核酸および／または細胞に導入することを厳密に必要としない、核酸編集化合物が、生物医学およびバイオテクノロジー産業で必要とされている。加えて、これらの核酸編集化合物は、ほとんどの点変異ならびに小さな挿入および欠失を修復することができ、薬物動態を向上させる化学修飾を含有し、編集活性を実質的に低減させることなく体内分布および細胞内ヌクレアーゼ安定性を有し、任意選択により、Ｔｏｌｌ様受容体の活性化を低減させ、かつ、標的ＤＮＡ配列を、そしていくつかの実施形態ではＲＮＡ配列を編集することにより、潜在する遺伝的病因を補正することが望ましい。
本発明の一態様は、配列編集のために、ゲノムのＤＮＡ鎖のうちの１本またはＲＮＡに相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを利用する方法である。本方法は、該ゲノム配列の編集を補助する外因性タンパク質または核酸を厳密に必要とすることなく、細胞または生物に、一本鎖オリゴヌクレオチドを導入するステップを含む。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的配列に対する、挿入または欠失を含む１つ以上のミスマッチを例外として、標的配列に実質的に相補的である。そのようなオリゴヌクレオチドは、本明細書において、オリゴヌクレオチド、本発明のオリゴヌクレオチド、または編集オリゴヌクレオチドと称され得る。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ゲノム内の標的配列に実質的に相補的であり、かつ、標的配列上のヌクレオチドと反応するか、またはそれとの反応を促進する、１個以上の化学修飾を含む。そのような反応の例としては、アルキル化、アセチル化、架橋、アミノ化、脱アミノ化、遊離（非共有結合）反応性化合物の生成が挙げられる。そのような化学修飾の一例はニトロソアミンである。そのようなオリゴヌクレオチドも、本明細書において、オリゴヌクレオチド、本発明のオリゴヌクレオチド、または編集オリゴヌクレオチドと称され得る。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、１個以上の化学修飾を有し得る。この／これらの化学修飾（複数可）修飾（複数可）は、１個以上の骨格修飾（複数可）、糖修飾（複数可）、および／または核酸塩基修飾（複数可）を含み得る。オリゴヌクレオチドは、以下に記載されるように、ゲノム内の標的配列に相補的であり、ミスマッチを有する場合がある。修飾は、未修飾オリゴヌクレオチドと比較して、または各末端上に３個のホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼ安定性を増加させることによって、編集の効率を上昇させ得る。
所望の編集は、トランジションもしくはトランスバージョン、または欠失もしくは挿入であり得る。一実施形態において、編集オリゴヌクレオチド配列は、編集が完了した後に所望される配列である。特定の理論または機構に束縛されることを望むものではないが、編集オリゴヌクレオチドは、転写または複製などの細胞プロセス中に標的配列が反対側のゲノム鎖から分離するとき、部分的に相補的な標的ゲノムＤＮＡ配列に結合する。いくつかの場合では、二本鎖ゲノムＤＮＡ標的に対する編集オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、標的ＤＮＡの「ブリージング」または過渡的な融解の間に起こり得る。編集オリゴヌクレオチドと標的ゲノムＤＮＡ鎖との間にヘテロ二重鎖が形成されたら、不完全な相補性の領域が、細胞ＤＮＡ修復によって補正される。編集オリゴヌクレオチドが修復のための「補正」鋳型として使用される場合、所望の編集が、標的ゲノムＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖に組み込まれる。同様に細胞内で起こり得る第２の機構において、編集オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡなどの標的核酸に相同組換え（ＨＲ）によって組み込まれるか、または、編集オリゴヌクレオチド配列が標的ＤＮＡまたはＲＮＡに組み込まれることをもたらす他のプロセスによって組み込まれる。
本発明の別の態様は、標的ヌクレオチドのコーディングが変化するような標的ヌクレオチドの部位特異的化学修飾を引き起こす、編集オリゴヌクレオチドを提供する。これらの編集オリゴヌクレオチドは、
Figure 2022008651000002
Figure 2022008651000003
Figure 2022008651000004
Figure 2022008651000005
Figure 2022008651000006
Figure 2022008651000007
Figure 2022008651000008
の構造を含み得、式中、各オリゴヌクレオチドは、該標的核酸に実質的に相補的であり、約１０～約５０または１０～約２００ヌクレオチドであり、Ｘは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｒ１、ＳＲ１、またはＯＲ１であり、ハロゲンは、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、またはＩであり、Ｒ１は、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、または－ＣＨ２ＯＣＨ３である。標的核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。標的がＲＮＡである場合、それはｍＲＮＡであることが好ましい。
一実施形態において、編集オリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドは、次のヌクレオチド間結合または糖修飾、ホスホジエアテル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅａｔｅｒ）、ホスホトリエステル（アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール）、メチルホスホネート、ボラノホスフェート、モルホリノ、非架橋ジアルキルホスホロアミデート、架橋３’－ＮＨ－もしくは５’－ＮＨ－、架橋３’－Ｓ－もしくは５’－Ｓ－または２’修飾糖、あるいは図２０および２２に列記される他の修飾のうちの少なくとも１つを含む。
他の実施形態は、薬学的担体または送達ビヒクル、および編集オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上を含む、薬学的組成物（該担体は、水、食塩水、または生理緩衝食塩水であり得る）、ならびに、編集オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上を含有する細胞を含む。
本発明の別の態様は、医学的状態の治療を必要とする個体の健康を改善するか、あるいは、医学的状態の治療を必要とする個体における該状態を低減させるか、または排除する方法であって、少なくとも１つの編集オリゴヌクレオチドを含有する組成物を個体に投与することを含む、方法である。投与は、筋肉内注射、硝子体内、腹腔内注射、皮下注射静脈内注射、経皮送達、エアロゾル吸入、直腸坐剤、または膣坐剤であり得る。治療され得る医学的状態としては、例えば、アデノシンデアミナーゼ欠損症、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アルツハイマー病、アミロイド病、ベッカー型筋ジストロフィー、乳がん素因変異、カナバン病、シャルコー・マリー・トゥース病、嚢胞性線維症、１型糖尿病、２型糖尿病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ファブリー病、遺伝性高チロシン血症Ｉ型（ＨＴＩ）、家族性大腸腺腫症、家族性アミロイド心筋症、家族性アミロイド多発ニューロパチー、家族性自律神経障害、家族性高コレステロール血症、フリートライヒ運動失調症、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ、糖原貯蔵障害ＩＩ型、ＧＭ２ガングリオシドーシス、血色素症、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、卵巣がん素因変異、肥満、フェニルケトン尿症、多嚢胞性腎疾患、プリオン病、老人性全身性アミロイドーシス、鎌状赤血球症、スミス・レムリ・オピッツ症候群、脊髄性筋萎縮症、ウィルソン病、および遺伝性盲目が挙げられる。他の疾患には、図２３に列記される標的を含め、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／のＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（商標登録）Ａｎ Ｏｎｌｉｎｅ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（２０１５年３月２日更新）に列記される、点変異または小さな欠失もしくは挿入、あるいは、それらの点変異または小さな欠失もしくは挿入によって補正され得る疾患が含まれる。
本発明の他の態様は、少なくとも１つの編集オリゴヌクレオチドを、その投与によって治療され得る状態を有する疑いのある個体に投与する方法を含み、その状態は、標的核酸内の変異ヌクレオチドを野生型ヌクレオチドに復帰させること；標的核酸内の変異コドンの非変異ヌクレオチドを修飾して野生型コドンを生成すること；標的核酸内の中途終止コドンをリードスルー非野生型コドンに変換すること；または、標的核酸内の変異コドンを修飾して、疾患を引き起こさないアミノ酸をもたらし、また、いくつかのヌクレオチド（例えば、いくつかの場合では、約１０個未満、約５個未満、または３個未満）を挿入または欠失させる編集をもたらす、非野生型コドンを生成すること、によって、低減するか、防止されるか、または排除され得る。これらの方法において、編集オリゴヌクレオチドで治療され得る状態または医学的状態には、例えば、ベータサラセミア、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、およびハーラー症候群が含まれる。
本発明の別の態様は、タンパク質もしくは機能性ＲＮＡをコードする核酸を修飾するか、または、遺伝子の転写レベルを制御して、該タンパク質もしくはＲＮＡの活性を調整するか、または、変異タンパク質を修飾して、その疾患を引き起こす作用を抑制するための方法であって、細胞または個体に、少なくとも１つの編集オリゴヌクレオチドを投与するステップを含む、方法である。これらの方法において、編集のための標的核酸はＤＮＡである。
本発明の編集オリゴヌクレオチドは、以下を含む機能のうちの１つ以上を実行し得る：変異塩基から、野生型ＤＮＡまたはＲＮＡ配列のコーディング特異性を有する塩基への、正確な復帰；変異コドンを変化させて、疾患を引き起こさないアミノ酸を生じる非野生型をコードすること；終止コドンを、非野生型のリードスルーコドン、すなわち標的タンパク質の活性または部分的活性を依然として許容するコドンにする修飾；野生型コドンまたは非疾患アミノ酸コドンを生じる、変異コドンの非変異塩基を変化させること；タンパク質の核酸配列を変化させて、そのタンパク質のあるドメインの活性を増加または減少させる（もしくは排除する）こと；ＲＮＡまたはＤＮＡの配列を変化させて、疾患を防ぐことで知られるアレルを生成すること；変異遺伝子の疾患を引き起こす作用を抑制する、標的変異タンパク質内にある変異または疾患異型コドン以外の部位を変化させること；変異遺伝子の疾患を引き起こす作用を抑制する、遺伝子もしくはＲＮＡ内にある変異または疾患異型以外の部位を変化させること（第２部位サプレッサー）；病的状態が低減されるように、疾患関連遺伝子の発現を調整する、遺伝子のプロモーター、エンハンサー、またはサイレンシング領域を変化させること（環境の変化に対する遺伝子発現の応答の上方もしくは下方の制御または調整）；標的配列のエピジェネティック状態を変化させる、ＤＮＡ内の糖のメチル化、ならびに／あるいは、スプライス部位配列をＤＮＡもしくはＲＮＡレベルで変化させて、疾患状態を治療するスプライシングパターンに影響を及ぼすこと。
他の実施形態は、可逆的に電荷を中和するホスホトリエステル骨格修飾を有する編集オリゴヌクレオチドを含む。これらの修飾は、オリゴヌクレオチドが標的細胞の細胞質に移動する際の改善された送達およびヌクレアーゼ安定性をオリゴヌクレオチドに与える利点を有する。これは、編集オリゴヌクレオチドがミスマッチ修復を使用するとき、中心的な編集領域において好ましい場合があり、また、自己送達性編集オリゴヌクレオチドを使用するときに特に有用となり得る。自己送達性オリゴヌクレオチドとは、送達ビヒクルなしで細胞の内側に効率的に侵入する化学構造、例えば、Ｇａｌ－ＮＡＣ接合オリゴヌクレオチド、親油性基接合編集オリゴヌクレオチド（米国特許出願第２０１２００６５２４３ Ａ１号）、または、ホスホロチオエート尾部を有するか、さもなければ約８個以上のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド（米国特許出願第２０１２００６５２４３ Ａ１号）などを指す。それは、ヌクレアーゼに富むエンド－リソソーム経路を生き延びなければならない］。標的細胞の細胞質内に入ると、細胞のエステラーゼによって修飾が除去され、細胞の相同組換えおよびミスマッチ修復機構によってより良好に認識される、天然またはより天然の構造を備える、編集オリゴヌクレオチドが遊離する。
Ｂｒａｃｈｍａｎ，Ｅｒｉｎ Ｅ．およびＥｒｉｃ Ｂ．Ｋｍｉｅｃによって以前に説明された、編集機構の概略図である。 編集有効性を百分率で示す、表１に提示されるオリゴヌクレオチドのいくつかからのデータを示すものである。Ｇｅｎ ３Ａは、オリゴヌクレオチド１０００１３番および１０００１４番であり、Ｇｅｎ ３Ｂは、オリゴヌクレオチド１０００１５番および１０００１６番であり、Ｇｅｎ ３Ｃは、オリゴヌクレオチド１０００１７番および１０００１８番であり、Ｇｅｎ １は、オリゴヌクレオチド１００００３番および１００００４番であり、Ｇｅｎ ２は、オリゴヌクレオチド１００００５番および１００００６番である。 アデノシンからイノシンへの変換のための２’－デオキシウリジン－ＮＯＣ－１８接合体を含む編集オリゴヌクレオチドの合成、（Ａ）５－カルボキシビニル－２’－デオキシウリジン残基を含有するオリゴヌクレオチド、（Ｂ）１－ヒドロキシ－２－オキソ－３，３－ビス（２－アミノエチル）－１－トリアゼン（ＮＯＣ－１８）、および（Ｃ）２’－デオキシウリジン－ＮＯＣ－１８接合体。 ５－（４，４’－ジメトキシトリチル）－ペンタン酸エチルエステル３－ホスホラミダイトの合成。（Ａ）３，５－ビス－Ｏ，Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）ペンタン酸の調製、（Ｂ）３，５－ビス－Ｏ，Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）ペンタン酸エチルエステルの調製、（Ｃ）３－ヒドロキシ－５－（４，４’－ジメトキシトリチル）－ペンタン酸エチルエステルの調製、および（Ｄ）５－（４，４’－ジメトキシトリチル）－ペンタン酸エチルエステル３－ホスホラミダイトの調製。 内部ペンタン酸残基のカルボン酸基を含有するオリゴヌクレオチドに対するＮＯＣ－１８の接合。 Ｎ２－イソブチリル－７－デアザ－７－アミノメチル－２’－デオキシグアノシンの合成。（Ａ）９－［３’，５’，Ｎ２－トリ（ｔｅｒｔ－ブチル－ジメチルシリル）－β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル］－７－デアザ－７－カルバミド－６－クロロプリンの調製、（Ｂ）９－β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル－７－デアザ－７－カルバミド－６－クロロプリンの調製、（Ｃ）７－デアザ－７－カルバミド－２’－デオキシグアノシンの調製、（Ｄ）７－デアザ－７－カルバミド－Ｎ２－イソブチリル－２’－デオキシグアノシンの調製、および（Ｅ）７－デアザ－７－アミノメチル－Ｎ２－イソブチリル－２’－デオキシグアノシンの調製。 ５’－ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチリル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシグアノシン３’－ホスホラミダイトの合成。（Ａ）５’－ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチリル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’デオキシグアノシンの調製、および（Ｂ）および５’－ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチリル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシグアノシン３’－ホスホラミダイトの調製。 １－（４，４－ジメトキシトリチル）－２－ｄ２－トリフルオロアセトアミド］エチル－３－ホスホラミダイトの合成。（Ａ）２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－［４－ヒドロキシ－３－（ヒドロキシメチル）ブチル］アセトアミドの調製、（Ｂ）２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－［４－ジメトキシトリチル－３－（ヒドロキシメチル）ブチル］アセトアミドの調製、および（Ｃ）１－（４，４－ジメトキシトリチル）－２－［２－トリフルオロアセトアミド］エチル－３－ホスホラミダイトの調製。 ２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－（２，２，５－トリオキソオキサチオラン－４－イル）アセトアミドの合成。 一級アミノ基を含むオリゴヌクレオチドに対する２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－（２，２，５－トリオキソオキサチオラン－４－イル）アセトアミドの接合。 ＧからＯ６－Ｍｅ－Ｇへの変換のための２－デオキシシチジン－ニトロソアルキル接合体を含むオリゴヌクレオチドの合成。５’－ジメトキシトリチル－５－（Ｅ）－（３－トリフルオロアセトアミドアリル）－Ｎ４－ホルムアミジン－２’－デオキシシチジン（Ａ）の調製、および５’－ジメトキシトリチル－５－（Ｅ）－（３－トリフルオロアセトアミドアリル）－Ｎ４－ホルムアミジン－２’－デオキシシチジン３’－ホスホラミダイト（Ｂ）の調製。 ４－｛［メチル（ニトロソ）アミノ］メトキシ｝－４－オキソ－ブタン酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）エステルの合成。 一級アミノ基を含むオリゴヌクレオチドに対する４－｛［メチル（ニトロソ）アミノ］メトキシ｝－４－オキソ－ブタン酸のＮＨＳエステルの接合。 ＵからＯ４－Ｍｅ－Ｕへの変換のための２’－デオキシアデノシン－ニトロソ－Ｎ－メチル接合体を含む編集オリゴヌクレオチドの合成。（Ａ）７－デアザ－７－メトキシカルボニル－Ｎ６－ベンゾイル－２’－デオキシアデノシンの調製、（Ｂ）７－デアザ－７－アミノメチル－Ｎ６－ベンゾイル－２’－デオキシアデノシンの調製、（Ｃ）５’－ジメトキシトリチル－Ｎ６－ベンゾイル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシアデノシンの調製、および（Ｄ）５’－ジメトキシトリチル－Ｎ６－ベンゾイル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシアデノシン３’－ホスホラミダイトの調製。 一級アミノ基を含有する修飾オリゴヌクレオチドに対する４－｛［メチル（ニトロソ）アミノ］メトキシ｝－４－オキソ－ブタン酸のＮＨＳエステルの接合。 ニトロソアミンメチル化基を含有する編集オリゴヌクレオチドを使用した、ｍＲＮＡにおけるＵからＯ４－Ｍｅ－Ｕへの変換。 ニトロソアミンメチル化基を含有する編集オリゴヌクレオチドを使用した、ｍＲＮＡにおけるＧからＯ６－Ｍｅ－Ｇへの変換。 亜硫酸水素塩生成基を含有する編集オリゴヌクレオチドを使用した、ｍＲＮＡにおけるＣからＵへの変換。 標的核酸塩基を化学修飾することによって作用する編集オリゴヌクレオチドの実施形態の構成要素（大きな三角形はピリミジンを表し、より小さな三角形はプリンを表す）。 骨格修飾の例示的一覧 核酸塩基修飾の例示的一覧 糖修飾の例示的一覧 本発明のオリゴヌクレオチドで治療することのできる疾患および障害の例示的一覧。 代表的な疾患および障害に関連する遺伝子を標的にする編集オリゴヌクレオチドの例示的一覧。アミノ酸位置は、標的配列との比較から明らかであるように、シグナルペプチドの始点または成熟タンパク質の始点から付番されている。「編集の主要な結果」は、一般的な標的変異の成功裏の編集または他の所望の編集の後にコードされる、結果として生じるアミノ酸である。編集部位は、記載される場合、小文字の配列で示される。「鎖」は、センスとして転写された配列に関するものである。 任意選択のセグメントを有する編集オリゴヌクレオチドの概略図。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の開示全体にわたって参照される特許、特許出願、ウェブサイトの投稿、および刊行物はすべて、それらの全体において参照により援用される。本明細書における用語に複数の定義が存在する場合には、本節の定義が優先する。
本明細書で使用される場合、「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、および「Ｕ」という文字は各々、概して、それぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミン、およびウラシルを塩基として含有するヌクレオチドを表す。しかしながら、「ヌクレオチド」という用語が、以下にさらに詳述されるように、修飾されたヌクレオチドを指す場合があることは理解されよう。配列において、用いられる化学構造がＲＮＡまたは修飾ＲＮＡである場合、「Ｔ」は「Ｕ」を指すと理解される。同様に、配列において、「Ｕ」は、ＤＮＡまたは修飾ＤＮＡでは「Ｔ」であると理解される。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、およびウラシルが、置換部分を保有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変更することなく、他の部分で置き換えられ得ることを熟知している。例えば、限定されないが、イノシンをその塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合を形成し得る。また、例えば、５－メチルＣが、Ｃの代わりに、標的部位ＤＮＡ内、または編集オリゴヌクレオチド内に存在し得る。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）などの他の代替物のいずれかの、ポリマー形態のヌクレオチドを指し、これは、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｅｘｉｑｏｎ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）、あるいはより長いオリゴヌクレオチドについてはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）を含む、多くの供給元から商業的に入手され得、当該技術分野で既知の方法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２８８（２００５）Ｐｉｅｔ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ（Ｅｄｉｔｏｒ）ＩＳＢＮ：１５８８２９２３３９ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＬＬＣ）ｃを用いて作製され得る、少なくとも８、または概して約５～約２００、または化学的に作製された場合は最大５００、またはより一般的には～約１００の範囲の長さの天然および非天然ヌクレオチドを組み込んだ、ポリマー形態の核酸塩基である。特殊な合成法が用いられる場合、例えば、一本鎖ベクターＤＮＡ、またはインビトロ転写プラスミドｍＲＮＡからの逆転写ｃＤＮＡといった一本鎖ＤＮＡの非化学的合成源が用いられる場合、一本鎖の編集「オリゴヌクレオチド」またはドナーＤＮＡは、最大２，０００ヌクレオチドになり得る。したがって、この用語は、二本鎖および一本鎖のＤＮＡならびに一本鎖ＲＮＡを含む。加えて、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ抵抗性であり得、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、拘束された（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）またはロックド核酸（ＬＮＡ）、２’フルオロ、ホスホロチオエートヌクレオチド（キラル富化（ｃｈｉｒａｌｌｙ ｅｎｒｉｃｈｅｄ）ホスホロチオエートヌクレオチドを含む）、ホスホロジチオエートヌクレオチド、ホスホロアミデートヌクレオチド、およびメチルホスホネートヌクレオチド（キラル富化メチホスホネート（ｍｅｔｈｙｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）を含む）を含むが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドはまた、ＰＮＡまたはモルホリノ核酸（ＭＮＡ）中にあるような非天然のヌクレオシジル間（ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｉｄｙｌ）結合を含有してもよい。上記の定義は、「編集オリゴヌクレオチド」という表現に含まれる場合、標的配列上のヌクレオチドと反応するか、またはそれとの反応を促進する、１個以上の化学修飾（例えば、ニトロソアミン）をさらに含み得る、オリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される「核酸」という用語は、標準的なホスホジエステル結合もしくは他の結合によって共有結合した、窒素性の複素環式塩基もしくは塩基類似体を有する、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む、オリゴヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド化合物を指す。核酸には、２’修飾糖を有する核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラＤＮＡ－ＲＮＡポリマー、またはそれらの類似体が含まれる。核酸において、骨格は、糖－ホスホジエステル結合、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）結合（ＰＣＴ出願国際公開第９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な結合によって構成され得る。核酸内の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または、置換、例えば、２’メトキシおよび２’ハロゲン化物（例えば、２’－Ｆ）、ＬＮＡ（または他の立体構造的に制限された修飾オリゴヌクレオチド）、およびＵＮＡ（非連結核酸）の置換を有する、同様の化合物であってもよい。
核酸に関して本明細書で使用される「２’修飾糖」という用語は、２’Ｆ、２’アミノ、２’－Ｏ－Ｘを指す（式中、Ｘは、限定されないが、アルキル基（例えば、メチル、エチル、もしくはプロピル）、またはメトキシエトキシなどの置換アルキル基、あるいは、限定されないが、ＬＮＡおよびｃＥＴ－ＢＮＡ、架橋３’－ＣＨ２－もしくは５’－ＣＨ２－、架橋３’－アミド（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）もしくは５’－アミド（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、２’リボースを４’リボース位に架橋する基（すなわち、拘束ヌクレオチドとしばしば称される）を含む、ハイブリダイゼーション可能オリゴヌクレオチドをもたらすことが当該技術分野で既知である修飾である。
本明細書で使用される「標的配列」という用語は、編集オリゴヌクレオチドによって修飾される、細胞内のＤＮＡ配列または細胞内のＲＮＡ配列のヌクレオチド配列の近接部分を指す。
「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド配列に関する第１のヌクレオチド配列（例えば、編集オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）を説明するために使用される場合、当業者には理解されるように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、ある特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、二重鎖（または三重鎖）構造を形成する能力を指す。好ましい条件は、生物内部で経験され得るような生理的に適切な条件であり、適用することができる。当業者であれば、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終用途に従って２つの配列の相補性を試験するための最も適切な条件一式を決定することができるであろう。
ハイブリダイゼーションは、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対合を形成することを含む。そのような配列は、本明細書では互いに対して「完全に相補的」と称される場合があるが、本発明の編集オリゴヌクレオチドのいくつかの場合では、少なくとも１個の塩基が、標的配列の相補的塩基とは異なる。
本明細書で使用される「実質的に相補的」という用語は、オリゴヌクレオチドのうち十分な割合のヌクレオチドが標的配列のヌクレオチドと対合を形成してハイブリダイゼーションを促進する、本発明のオリゴヌクレオチドと標的ゲノム配列との間の関係を指す。いくつかの実施形態では、その割合は、９９パーセント超、９５パーセント超、または９０パーセント超である。いくつかの実施形態では、その割合は、８０パーセント超、７０パーセント超、または６０パーセント超である。
本明細書で使用される「相補的配列」という用語はまた、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソン－クリック塩基対、ならびに／または、非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含むか、または完全にそれらから形成されてもよい。
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、「アニールする」、または「アニーリング」という用語は、適切な条件下で、実質的に相補的な配列を有する核酸が、ワトソン＆クリック塩基対合によって互いに結合する能力を指す。核酸アニーリングまたはハイブリダイゼーション技術は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃａｕｃｕｓ，Ｎ．Ｊ．（１９９４）、または細胞内の生理的条件を参照されたい。
本明細書で使用される「細胞に導入すること」、「細胞への導入」という用語は、当業者に理解されているように、細胞内への取り込みまたは吸収を促進することを指す。編集オリゴヌクレオチドの吸収または取り込みは、補助のない拡散性または活発な細胞プロセスを通して、または補助的な薬剤もしくはデバイスによって起こり得る。この用語の意味はインビトロの細胞に限定されず、編集オリゴヌクレオチドは、細胞が生きている生物の一部である場合にも「細胞に導入され」得る。そのような事例において、細胞への導入は、生物への送達を含む。例えば、インビボ送達の場合、編集オリゴヌクレオチドは、組織部位に注入するか、または全身投与することができる。インビトロでの細胞への導入は、電気穿孔、微量注入、核穿孔（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポフェクション、または弾道的方法などの、当該技術分野で既知の方法を含む。
「編集する」という用語は、標的配列に関して使用されるとき、本明細書では、標的遺伝子内の配列の変化によって顕在化する、標的遺伝子の少なくとも部分的な編集を指す。編集の範囲は、標的遺伝子が転写され、かつ、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが同様に処置されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して編集オリゴヌクレオチドで処置されている、第１の細胞または細胞群から、ＲＮＡまたはＤＮＡを単離することによって、決定され得る。
代替的に、編集の程度は、標的遺伝子の転写に機能的に関連付けられたパラメータ、例えば、細胞により分泌される標的遺伝子によってコードされるタンパク質の量、または、ある特定の表現型、例えばアポトーシスを提示する細胞の数の、低減もしくは増加の観点から示されてもよい。原理上、編集は、標的を発現する任意の細胞内で、任意の適切なアッセイによって決定され得る。
例えば、ある特定の事例では、標的遺伝子は、本発明の編集オリゴヌクレオチドの投与により、標的細胞の少なくとも約０．１％、１％、３％、５％、１０％、２０％、２５％、３５％、または５０％において編集される。具体的な実施形態では、標的遺伝子は、発明の編集オリゴヌクレオチドの投与により、標的細胞の少なくとも約６０％、７０％、または８０％において編集される。標的細胞は、多くの場合、標的遺伝子の２つのコピーを含有し、これらのコピーの一方または両方が編集され得る。いくつかの場合では、標的細胞は、編集の標的とされる遺伝子のコピーを１つしか含有せず、その結果、細胞１個当たり所望の編集１つしか発生しない場合がある。
「治療する」、「治療」などの用語は、ある状態の緩和または軽減を指す。本発明の文脈では、本明細書で以下に列挙される他の状態のいずれかに関連する限りにおいて、「治療する」、「治療」などの用語は、そのような状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和もしくは軽減すること、またはそのような状態の進行を減速もしくは逆転させること、または将来の疾患の形成を防ぐことを意味する。治療は、農業および工業用途の事例において、生物の特性を改変することを含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」および「予防有効量」という表現は、ある状態もしくはその状態の顕性症状の治療、防止、または管理において治療利益を提供する量を指す。治療上有効である具体的な量は、通常の医師によって容易に決定することができ、例えば、疾患の種類、患者の病歴および年齢、疾患の段階、ならびに他の治療剤の投与の可能性などの、当該技術分野で既知の要因に応じて異なり得る。
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」は、薬理学的有効量の編集オリゴヌクレオチド、および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療有効量」、または単に「有効量」とは、意図される薬理的、治療的、または予防的な結果をもたらすのに有効な、編集オリゴヌクレオチドの量を指す。例えば、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータが少なくとも２５％低減するときに、所与の臨床治療が有効と見なされる場合、その疾患または障害の治療のための薬物の治療有効量は、そのパラメータの少なくとも２５％の低減をもたらすのに必要な量（可能性のある複数用量を含む）である。
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療剤の投与のための担体を指す。そのような担体としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。経口投与される薬物の場合、薬学的に許容される担体としては、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、着色剤、および防腐剤などの、薬学的に許容される賦形剤が挙げられるが、これらに限定されない。好適な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびにラクトースが挙げられ、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸は、好適な崩壊剤である。結合剤はデンプンおよびゼラチンを含み得、滑沢剤は、存在する場合、概してステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクである。所望の場合、錠剤をモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングして、編集オリゴヌクレオチドの消化管内での吸収を遅延させてもよい。
本発明の一態様では、ゲノムのＤＮＡ鎖のうちの１本に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドが、配列編集のために利用される（図１９参照）。所望の編集は、トランジションもしくはトランスバージョン、または欠失もしくは挿入であり得る。本発明のこの態様において、編集オリゴヌクレオチド配列は、編集が完了した後に所望される配列である。特定の理論または機構に束縛されるものではないが、編集オリゴヌクレオチドは、転写または複製などの細胞プロセス中に標的配列が反対側のゲノム鎖から分離するとき、部分的に相補的または完全に賛辞的な標的ゲノムＤＮＡ配列に結合する。いくつかの場合では、二本鎖ゲノムＤＮＡ標的に対する編集オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、標的ＤＮＡの「ブリージング」、過渡的な融解、または巻き戻しの間に起こり得る。編集オリゴヌクレオチドと標的ゲノムＤＮＡ鎖との間にヘテロ二重鎖が形成されたら、不完全な相補性の領域が、細胞ＤＮＡ修復（相同組換え（ＨＲ）を含む）によって補正される。編集オリゴヌクレオチドが修復のための鋳型として使用されるとき、所望の編集が、標的ゲノムＤＮＡ鎖に組み込まれる。
本発明の編集オリゴヌクレオチドは、５’から３’の順序で列記される次のセグメントのいくつかまたはすべてを含む：５’末端セグメント、５’近位セグメント、５’編集セグメント、編集部位、３’編集セグメント、３’近位セグメント、および３’末端セグメント。これらのセグメントは、それらの位置および／または化学修飾によって区別されるが、修飾されているか、または天然のＤＮＡもしくはＲＮＡかを問わず、核酸骨格によって近接して連結されている。
これらのセグメントの各々におけるヌクレオチドは、任意選択により、編集オリゴヌクレオチドの次の特性のうちの１つ以上を改善するように修飾されてもよい：編集の効率；薬物動態特性；体内分布；血清中のヌクレアーゼ安定性；エンドソーム／リソソーム経路内のヌクレアーゼ安定性；細胞質および核細胞質内のヌクレアーゼ安定性；効率的な編集に必要な毒性（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体の免疫刺激）および最小の長さ（例えば、より短いオリゴヌクレオチドは一般的に作製費用がより低く、インビボで細胞に送達するのがより容易である）。そのような修飾の非限定的な例が、本明細書に提供される。
編集オリゴヌクレオチドは、上に列記した７つのセグメントの部分集合またはすべてを含み得、編集部位と、編集部位に対して５’および３’の少なくとも１つのセグメントとを含む。これらのセグメントの各々は、任意選択により、編集オリゴヌクレオチドの特性を向上させるために、同じかまたは異なる化学修飾を含有してもよく、この修飾は、いくつかの場合では、セグメント全体で均一であってもよく、他の場合では、セグメント内のヌクレオチドの一部分でのみ起こる。
他の実施形態は、可逆的に電荷を中和するホスホトリエステル骨格修飾を有する編集オリゴヌクレオチドを含む。これらの修飾は、オリゴヌクレオチドが標的細胞の細胞質に移動する際の改善された送達およびヌクレアーゼ安定性をオリゴヌクレオチドに与える利点を有する。標的細胞の細胞質内に入ると、細胞のエステラーゼによって修飾が除去され、細胞の相同組換えおよびミスマッチ修復機序によってより良好に認識される、天然またはより天然の構造を備える、編集オリゴヌクレオチドが遊離する（Ｍｅａｄｅ，Ｂ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡｉ ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｃｈａｒｇｅ－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：１２５６－１２６１（２０１４）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０７８）。
Ｉ． 編集オリゴヌクレオチド：
ある特定の実施形態において、本発明の編集オリゴヌクレオチドは、式（Ｉ）に従う構造を有する。
Ｔ５－Ｐ５－Ｅ５－ＳＥ－Ｅ３－Ｐ３－Ｔ３
（Ｉ）
式（Ｉ）の概略表現については図２５を参照されたい。
Ａ． ５’末端セグメント（Ｔ５）
３’末端はＤＮＡ延長のプライミングにおいて機能し得、これが３’末端セグメントを概して遊離した３’ヒドロキシルを有する修飾に限定し得るため、５’末端セグメントは、多数の異なる種類の修飾に３’末端よりも適している場合がある。このプライミング機能は、５’末端において通常は必要ではない。０～５ヌクレオチド長であり得る任意選択の５’末端セグメントは、さもなければ体液（例えば、血液もしくは間質液）、培養培地、飲食作用経路、または細胞質もしくは核細胞質において編集オリゴヌクレオチドを容易に分解し得る、５’エキソヌクレアーゼを遮断するよう機能する。このセグメントは、５’近位セグメントよりもヌクレアーゼ抵抗性である非ヌクレオチド末端ブロッキング基および／または修飾ヌクレオチド（複数可）（例えば、逆位Ｔなどの逆位塩基）を含んでもよい。５’末端セグメントが用いられない場合、５’近位セグメントは単純に、編集オリゴヌクレオチドの最も５’側の部分である。非ヌクレオチド末端ブロッキング基は、この作業の実行に使用するための当業者に既知の任意のリンカー、例えば、３’Ｃ３アミノリンカー、３’Ｃ７アミノリンカー、５’＆３’Ｃ６アミノリンカー、５’Ｃ１２アミノリンカー、５’光切断可能アミノリンカー、３’Ｃ３ジスルフィドリンカー、５’＆３’Ｃ６、ジスルフィドリンカー、ジチオールリンカー、４－ホルミルベンズアミド、アルデヒド、Ｃ８－アルキン－チミジン、カルボキシ－ｄＴリンカー、ＤＡＤＥリンカー（５’カルボキシルリンカー）、３’グリセリル、５’ヘキシニル、チミジン－５－Ｃ２およびＣ６アミノリンカー、２’－デオキシアデノシン、８－Ｃ６アミノリンカー、２’－デオキシシチジン－５－Ｃ６アミノリンカー、２’－デオキシグアノシン－８－Ｃ６アミノリンカー、Ｃ７、ならびに内部アミノリンカーなどを含んでもよい。リンカー長は、炭素１個から炭素約２０個、または他の化学構造の同等の長さに及び得るが、好ましくは、炭素１０個未満または１０個の炭素と同等の長さである。
５’末端ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ抵抗性セグメントは、１個、２個、３個、または４個のホスホロチオエート修飾を含み得る。これら１個以上のホスホロチオエート修飾に加えて、またはそれらの代わりに、５’末端エキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ安定性を向上させることで知られる２’糖修飾を含んでもよい。さらに、メチルホスホネート、モルホリノ、またはＰＮＡなどの中性ヌクレオチド類似体は、エキソヌクレアーゼに対して高度に抵抗性であり、５’末端におけるそのような修飾のうちの１個、２個、３個、４個、または５個は、末端ブロッキング基として利用されてもよい。好ましい実施形態において、５’末端は、２個のメチルホスホネートである（表１）。これらの末端基は、必ずしも標的に相補的である必要はない。
Ｂ． ５’近位セグメント（Ｐ５）
５’近位セグメントは、上記の５’末端セグメントに関して前述したものと同じ理由のうちのいくつかのために、多数の異なる種類の修飾に３’末端よりも適している場合がある。それは、１～１５０ヌクレオチド長、好ましくは約５～約２０ヌクレオチド長であり得る。５’近位セグメントの主な機能は、標的配列にハイブリダイズする編集オリゴヌクレオチドの親和性および能力を向上させることである。したがって、このセグメントは、任意選択により、編集セグメントよりも実質的に修飾されていてもよい。５’近位セグメントは、本明細書で言及されるオリゴヌクレオチド修飾のいずれを含有してもよい。このセグメントは、ＤＮＡまたはＲＮＡ（任意選択により、ＬＮＡおよび他の拘束された骨格を含むよう広く定義されている２’修飾ＲＮＡ）から構成されていてもよい。この領域内の追加のホスホロチオエート（例えば、向上したキラル純度を有するジホスホロチオエートおよびホスホロチオエート）は、ヌクレアーゼ安定性のために厳密には必要とされないが、追加のホスホロチオエートは、ＲＮＡおよびＤＮＡ結合のヌクレアーゼ安定性を向上させるために有用である。また、このセグメント内のホスホロチオエートがヌクレアーゼ安定性に必要でない場合であっても、それらは、全体的なホスホロチオエート含有量を増加させ得、これは、ホスホロチオエートの化学的に「粘着性の」性質に起因して、血清タンパク質結合および細胞結合を増加させ、動物およびヒトにおける血清中半減期の増加につながり、細胞質取り込みを向上させる。これらの理由のため、好ましい実施形態において、編集オリゴヌクレオチドの全ホスホロチオエート含有量は、５個、１０個、１５個、または２０個を上回り得る。約２０個のホスホロチオエートの含有量は、多くの場合、優れた血清タンパク質結合および細胞結合／取り込みをもたらす。しかしながら、編集オリゴヌクレオチドの相補的領域内のより多くの数（例えば、６個超）のホスホロチオエート結合は編集効率を抑制し得るため、ホスホロチオエートの尾部が、標的ＤＮＡに相補的な領域の５’または３’末端に付加され得る。この尾部は、１～約４、約５～約９ヌクレオチド、または約１０～約２５ヌクレオチドの長さであり得、好ましくは、標的に非相補的な領域内に位置付けられ得る。
Ｃ． ５’編集セグメント（Ｅ５）
５’編集セグメントは、１～約１０ヌクレオチド、または１～約１００ヌクレオチド、または１～約２００ヌクレオチドの長さであり、編集部位の５’末端に位置付けられ、この位置は、対向するゲノムＤＮＡ鎖の編集をもたらすように細胞機構に影響を及ぼすのに十分に編集部位に近接している。いかなる理論にも束縛されるものではないが、このＤＮＡミスマッチ修復系は、編集セグメント（これは５’編集セグメント、編集部位、および３’編集セグメントである）を、編集のための鋳型鎖として使用する場合がある。したがって、５’編集セグメント、編集部位、および３’編集セグメント内のヌクレオチドは、天然ＤＮＡまたは天然ＤＮＡ化学構造と好ましくは実質的に同様であり（例えば、図２において、化合物１０００１３は、編集部位の５’に約８個の未修飾ヌクレオチドを有し、これは、親化合物と比較して全体的な編集効率を抑制しなかった）、また、未修飾であってもよく、または、ホスホロチオエート、５’Ｓ、２’Ｆ、２’アミノ、もしくは３’Ｓ、可逆的に電荷を中和するホスホホトリエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）、および核酸塩基修飾などの、１個以上の修飾を含んでもよい。
本発明の好ましい一実施形態では、編集オリゴヌクレオチド内のデオキシ－シトシンのうちの１つ、いくつか、またはすべてが、５メチルシトシン、特に、編集部位（複数可）の５’または３’の約５～約１０個の塩基内のシトシンヌクレオシドになるように修飾される。５メチルシトシンを編集オリゴヌクレオチドに組み込む理由の１つは、複製、続いてミスマッチ修復の間、ミスマッチ修復機構が非メチル化シトシンを新生鎖と認識し、５メチルシトシンを含有するＤＮＡ鎖を修復のための鋳型鎖として優先的に使用することである。加えて、編集オリゴヌクレオチドが５メチルシトシンをほとんどまたは全く含有しない場合、修復機構は、編集を引き起こすＤＮＡ修復反応の間の鋳型として、この鎖を選択しない可能性が高い。当該技術分野における編集オリゴヌクレオチドが複数の５－メチルシトシンを含有していないという事実は、それらの編集における効率が比較的低い理由のうちの１つである。
好ましい実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、編集部位におけるＣｐＧ配列内に５－メチルシトシンを有する。より好ましい実施形態では、編集部位内のこのＣｐＧは、標的配列内のＴｐＧと誤対合を形成する。この場合、細胞内の５－メチル結合タンパク質は、ミスマッチのメチル化ＣｐＧに結合し、細胞のミスマッチ修復系にミスマッチＴをマッチしたＣに変換させる。５’編集セグメントは、修飾を含有しなくてもよく、または、１個以上の修飾を最大でセグメント内の塩基の数まで含有してもよい。
Ｄ． 編集部位（ＳＥ）
編集部位は、標的ゲノムＤＮＡに相補的でないヌクレオチド（複数可）を含有し、１～６ヌクレオチド長であり得るが、必要に応じてより長くてもよい。トランジション／トランスバージョン修飾の場合、編集部位は、ミスマッチ塩基の数（例えば、１個～約６個、特に１個のヌクレオチド）に等しい。欠失を作り出すための編集の場合、編集部位は、ゲノムＤＮＡ内の塩基対合を形成しないヌクレオチドのちょうど反対側で標的ゲノムＤＮＡ鎖と塩基対合を形成する、２個の５’および３’ヌクレオチド間の接合部である。いくつかの場合では、１つの編集オリゴヌクレオチドが、集団内の異なる患者において発生し得る、標的ＤＮＡに対する相補性領域内にある近隣部位における異なる変異を治療するために使用され得る。この場合、患者の変異体遺伝子型に応じて、異なる編集部位が存在する。これらの場合において、編集部位は、最も５’側および最も３’側の変異、ならびにこれらの変異間の領域を含むことになる。好ましい一実施形態では、編集部位は、標的遺伝子内の全エクソンにハイブリダイズする。
Ｅ． ３’編集セグメント（Ｅ３）
３’編集セグメントは、その位置が編集部位の３’にあることを除いて、Ｅ５の３’編集セグメントと同じ範囲の特徴、特性、およびパラメータを有する。
Ｆ． ３’近位セグメント（Ｐ３）
３’近位セグメントは、他のセグメントに対するその位置を除いて、５’近位セグメントと同じ範囲の特徴およびパラメータを有する。好ましい実施形態において、３’近位セグメントは、２’修飾ヌクレオチドから構成され、より好ましい実施形態では、２’Ｆ修飾ヌクレオチドから構成される。最も好ましい実施形態では、それは、８個の２’Ｆ修飾ヌクレオチドを含む（図２）。
Ｇ． ３’末端セグメント（Ｔ３）
３’末端セグメントは、以下に詳解することを除いて、５’末端セグメントと同じ範囲の特徴および特性を含み得る。３’末端セグメントは、ＤＮＡ複製および修復間にＤＮＡ合成のプライマーとして機能し、ひいては編集オリゴヌクレオチドがゲノムＤＮＡ内に近接して組み込まれることを可能にし得る。その結果、一実施形態において、このセグメントは、遊離３’ヒドロキシを有することになり、天然様の修飾または未修飾のＤＮＡもしくはＲＮＡから成ってもよい。
３’末端における非ヌクレオチド末端ブロッキング基は、いくつかの場合では、編集活性を低減させるか、または排除し得るが、編集部位と編集オリゴヌクレオチドの３’末端との間に、編集オリゴヌクレオチドを標的ＤＮＡにハイブリダイズするとＲＮアーゼＨによって切断されるＲＮＡの領域が存在する場合、鎖延長のプライマーとして好適な遊離３’ヒドロキシルが作り出される。また、ミスマッチ修復として知られる別の編集機構は、遊離３’ヒドロキシル、または３’末端において標的と塩基対合を形成する編集オリゴヌクレオチドの領域を必要としない場合がある。この場合、３’非ヌクレオチド末端ブロッキング基または他の実質的な修飾を、３’末端セグメント内に用いてもよい。これらの末端ブロッキング基または修飾は、５’末端セグメントの説明において上述した５’末端ブロッキング基と同様または類似である。３’特異的な修飾は、５’特異的部分に変更される。例えば、そして５’末端上に位置する逆位Ｔは、３’－５’結合を有することになる。
式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドは、２０～２０００個のヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、１００～２５０個のヌクレオチドを含んでもよい。別の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、２５０～２０００個のヌクレオチドを含んでもよい。具体的な実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、２０～１００個のヌクレオチドを含む。より具体的には、このオリゴヌクレオチドは、２５～９０個のヌクレオチドを含む。
ＢｒａｃｈｍａｎおよびＫｍｉｅｃの方法を使用する一本鎖編集オリゴヌクレオチドの現行の設計は、編集にはあまり効率的でない未修飾ＤＮＡか、または、各末端上に３個のホスホロチオエートを有し、編集オリゴヌクレオチドの残部が未修飾ＤＮＡを含むものを用い、後者は編集により効率的であり、両方の場合において、およそ７２ヌクレオチドの最適な長さを有する。ＢｒａｃｈｍａｎおよびＫｍｉｅｃは、Ｓ期に処置された同調細胞が最も効率的に編集されたことを見出したが（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｋｍｉｅｃ，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ７（１０）：１４０２－１４１４，２００８）、上述のＫｍｉｅｃの編集オリゴヌクレオチド設計は、細胞エンドヌクレアーゼに非常に影響されやすいことが現在分かっている。編集効率を上昇させ、かつ（例えば、細胞がＳ期に自然に入るまで、安定な編集オリゴヌクレオチドが各細胞内で持続することから）細胞同調の必要をなくすために、本発明は、向上したヌクレアーゼ抵抗性を有する編集オリゴヌクレオチドを提供する。表１～３は、これらの編集オリゴヌクレオチドの例を提供する。細胞エンドヌクレアーゼに対する抵抗性の増加は、ヌクレオチド結合のうちの１個以上を修飾して、５’および／または３’末端の近くに位置付けられるホスホロチオエート結合にすることによって達成され得る。一実施形態において、４個以上のホスホロチオエート結合が好ましい。抵抗性は、「編集セグメント」を除いて、ヌクレオチド結合のすべてをホスホロチオエート結合で置き換えることによっても達成され得る。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート修飾は、編集塩基（例えば、標的配列と異なる塩基）を包囲するヌクレオチド結合を、１個から最大７個まで含み得る。一実施形態において、結合はすべて、ホスホロチオエートＤＮＡである。ホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）結合はまた、１個おきの結合がホスホロチオエート結合であるか、または３個おきの結合がホスホロチオエート結合であるか、または２個のホスホロチオエート結合が１個もしくは２個のホスホジエステル結合と交互になっているなど、完全または部分的に交互になっていてもよい。編集オリゴヌクレオチドは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のホスホロチオエート結合を含み得る。これらのホスホロチオエート構成は、本明細書に記載されるように、他の修飾または天然糖と組み合わせることができる。具体的には、ＤＮＡ糖の一部が、ＲＮＡ糖で置き換えられてもよい。好ましくは、ＲＮＡ置換は、３’末端で始まり、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の塩基にわたって５’の方向に延びる、ＲＮＡ結合ブロックを含む。これは、３’末端を天然のＯｋａｚａｋｉ断片のようにするためであり、これは、より自然な合成のプライミングおよびＲＮアーゼＨによる除去をもたらす。しかしながら、ＲＮアーゼＨによって編集セグメントが除去されるのは望ましくないため、このＲＮＡ修飾は、「編集セグメント」においては好ましくない。
Ｈ． 他の修飾
編集オリゴヌクレオチドをより効率的にする別の手法は、化学修飾によって親和性を増加させることである。本明細書に記載される修飾は、編集オリゴヌクレオチド内で組み合わされてもよく、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、２’Ｆ ＲＮＡ、およびＬＮＡを含む拘束核酸を含む。これらの修飾は、それらが免疫刺激を低減させることもできるという追加の利点を有する。修飾は、ハイブリダイゼーションのための高親和性「シード」領域を形成するようにグループ化され得る。好ましい実施形態において、このシード領域は、約２個～約１２個の連続した修飾と共に、５’近位セグメント内に位置付けられることになる。他の実施形態では、シード領域は、３’近位セグメント内に位置付けられてもよい。あまり好ましくない実施形態では、修飾は、「編集セグメント」内に位置付けられ得る。編集セグメントは細胞修復機構と相互作用しなければならず、このセグメント内のある特定の修飾は修復に干渉し得るため、これはあまり好ましくない。修飾は、５’セグメント、編集セグメント、および／または３’セグメントにおいて、交互になっている、すなわち、３個おきまたは４個おきの結合であってもよい。５’セグメント、３’セグメント、または編集セグメント内にある化学修飾された核酸塩基の全割合は、独立して、約２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の範囲であり得る。
本明細書では、式（Ｉ）のオリゴヌクレオチドの様々な実施形態が提供される。一実施形態において、式（Ｉ）は、ＲＮＡである。別の実施形態では、式（Ｉ）は、ＤＮＡである。具体的な実施形態では、式（Ｉ）は、一本鎖である。一実施形態において、式（Ｉ）は、修飾されない。一実施形態において、式（Ｉ）は、化学修飾される。化学修飾は、糖修飾（具体的には、例えば２’－Ｏ－メチルおよび２’－フルオロ）を含む。一実施形態において、式（Ｉ）は、骨格修飾を含む。別の実施形態では、式（Ｉ）は、本明細書に記載される骨格修飾を含む。別の実施形態では、式（Ｉ）は、本明細書に記載されるリンカーを含む。別の実施形態では、式（Ｉ）は、接合分子（例えば、ｇａｌ－ｎａｃまたは親油性修飾）をさらに含む。前述の修飾は、様々な組み合わせで存在してよい。例えば、１個、２個、または３個の骨格修飾が、１個、２個、または３個の糖修飾、および／またはリンカー、および／または接合分子と共に存在してもよい。
本発明のある特定のオリゴヌクレオチドは、標的配列上のヌクレオチドと反応するか、またはそれとの反応を促進する、１個以上の化学修飾を含む。そのような反応の例としては、アルキル化、アセチル化、架橋、アミノ化、脱アミノ化、遊離（非共有結合）反応性化合物の生成が挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、保護基を含んでもよい。好適な保護基は、合成、精製、貯蔵、および使用中の間に化学反応基を保護する（例えば、酸性、細胞内エステラーゼ、または還元条件を含む条件からオリゴヌクレオチドを保護するものとして、当業者に既知である。編集を達成するために単一のオリゴヌクレオチドのみを使用することは簡便であるが、本明細書の実施形態を向上させるものとしては、追加のオリゴヌクレオチドが挙げられる。「ヘルパー」オリゴヌクレオチドまたは「ヘルパー」オリゴヌクレオチド（複数）の使用、ここで、「ヘルパー」オリゴヌクレオチド（複数）とは、編集オリゴヌクレオチドに（例えば、３’末端、５’末端、または２個のヘルパーオリゴヌクレオチドの場合は両端、または、編集オリゴヌクレオチド結合部位から、例えば編集部位の５’もしくは３’に２００ヌクレオチドだけさらに離れた位置でタンデム結合する、オリゴヌクレオチドを指す。ヘルパーオリゴヌクレオチドは、標的部位の構造を開くのに役立つか、または別様に編集オリゴヌクレオチドの結合効率を改善する。ヘルパーオリゴヌクレオチドの別の標的は、編集配列により標的とされるＤＮＡ鎖の反対側の鎖であり得る。この場合、ヘルパーオリゴヌクレオチド（複数可）は、編集オリゴヌクレオチド自体に強くハイブリダイズしないように、編集オリゴヌクレオチドの結合部位のちょうど５’側および／または３’側に結合することが好ましい。他の実施形態では、５’および／または３’のヘルパーオリゴヌクレオチドは、編集オリゴヌクレオチド結合部位と、約１～５個、約５～１０個、または約１～１５個の塩基だけ重複する。このようにすれば、ヘルパーオリゴヌクレオチドが編集オリゴヌクレオチドに過度に密接に結合して、標的に結合する編集オリゴヌクレオチドに悪影響を与えることはないであろう。これらのヘルパーオリゴヌクレオチドは、任意選択により、ホスホジエステルもしくは修飾ホスホジエステル結合によって、または他の共有結合リンカーによって、編集オリゴヌクレオチドに共有結合させてもよい。別の実施形態では、三重鎖形成オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、約２００ヌクレオチドの編集部位内の標的ＤＮＡに結合し、編集効率の上昇をもたらす（ＭｃＮｅｅｒ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ ７９５２ ｐｇｓ．１－１１，２０１５）、Ｂａｈａｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １４（５）ｐｐ３３１－４２（２０１４）、Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０５（３６）：１３５１４－１３５１９（２００８）、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９９（２６）：１６６９５－１６７００（２００２）、および米国特許第８，３０９，３５６号。）。
いくつかのヘルパーオリゴヌクレオチドは、編集オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを保護し、一本鎖特異的ヌクレアーゼによるヌクレアーゼ分解を遮断する。保護オリゴヌクレオチドは、編集オリゴヌクレオチドのすべてまたは所望の部分を覆う。それらは概して、編集オリゴヌクレオチドの一部分が一本鎖のまま残り、したがって標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションに利用可能であるように、編集オリゴヌクレオチドよりも短い。一実施形態において、プロテクターオリゴヌクレオチドは、編集オリゴヌクレオチドのＤＮＡ部分に相補的な、いくつかまたはすべてのＲＮＡ領域から構成され、その結果、それらが細胞内でＲＮアーゼＨにより除去されて、編集オリゴヌクレオチドの一本鎖領域がさらに露出し得る。
Ｉ． 外因性タンパク質
編集組成物中に外因性タンパク質を厳密に必要としないことが有利である一方で、ある特定の外因性タンパク質は、編集オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼ分解から保護することによって、また標的ゲノムＤＮＡに対する編集オリゴヌクレオチドの結合を強化することによって、上述の実施形態を向上させることができる。次のタンパク質またはリボ核タンパク質のうちの１つ以上が、編集オリゴヌクレオチドと併せて添加され得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｃａｒｒｏｌｌ Ｄ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８８：７７３ｅ８２．（２０１１））、ＴＡＬＥＮ、メガＴＡＬＥＮ、他のホーミングエンドヌクレアーゼを含む、プログラム可能ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｉｆｅ ２０１３；２：ｅ００４７１）、または、相同のもしくは同様に作用するリボ核タンパク質（すなわち、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、またはＣ２Ｃ３）（ＤＮＡ結合親和性を低減させることによって標的特異性を増加させるように選択されているそれらの変異形態（ｅＳｐＣａｓ９、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５））と、「ｃｒＲＮＡ」が編集のためのドナーＤＮＡとして作用し得るように、ｃｒＲＮＡ領域内のより多くのＤＮＡ置換に耐えるよう選択されている変異形態と、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが不活性化されている変異形態とを含む）、ＲｅｃＡ、ラムダファージベータタンパク質（米国特許第７，５６６，５３５号）、ｓｓＤＮＡ結合タンパク質、ＲＡＤ、またはアルゴノート。
タンパク質は、編集オリゴヌクレオチドから別々に製造し、精製し、次いで編集オリゴヌクレオチド（複数可）と前複合体化する（ｐｒｅ－ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）ことができ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２４：１０１２ｅ９（２０１４））、または、タンパク質は、標的細胞／組織内で発現させてもよい。細胞または組織内での外因性タンパク質の発現は、遺伝子療法ベクター、ネイキッドＤＮＡトランスフェクション、またはｍＲＮＡトランスフェクションを含む、当該技術分野で既知の方法で行うことができる。
Ｃａｓ９の場合、好ましい実施形態は、両方のヌクレアーゼドメインが当該技術分野で既知の変異によって不活性化されたＣａｓ９を用いる。ｃｒＲＮＡは、好ましくはｔｒａｃＲＮＡとは別であり、所望の編集された配列を有する。ｃｒＲＮＡはまた、本明細書において定義されるように、編集部位内、かつ任意選択によりその周囲に、置換された少なくとも１個かつ最大約１５個のＤＮＡ結合を有する。このようにして、Ｂｒａｃｈｍａｎ Ｋｍｉｅｃ型ゲノム編集、または本明細書に記載されるような標的核酸塩基を修飾してそのコーディングを変更する化学反応基を含有するオリゴヌクレオチドを用いる編集の特異性および非染色体性切断の利点が、Ｃａｓ９によって推進される向上したハイブリッド形成により、有効性において向上する。別の実施形態では、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃＲＮＡの約１８ヌクレオチドのガイドＲＮＡ部分は、編集オリゴヌクレオチドにより、５’または３’まで延長される。編集オリゴヌクレオチドは、未修飾であっても、または本明細書に記載される様々な修飾を有してもよい。編集オリゴヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃＲＮＡガイドに、ホスホジエステル（またはホスホジエステル類似体）結合、もしくは化学リンカーによって共有結合するか、または、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの一部分との塩基対合形成、もしくはＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡの延長によって非共有結合することになる。好ましい実施形態において、編集オリゴヌクレオチド部分は、ｔｒａｃＲＮＡまたはｃｒＲＮＡのガイド部分に対して賛辞的な配列に近接してハイブリダイズし、標的ＤＮＡを有する二重鎖を標的変異の領域内まで延長する。Ｃａｓ－９／ＣＲＩＳＰＲは鎖侵入の効率を向上させるため、この手法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用しないオリゴヌクレオチド指向ゲノム手法よりも効率的となるであろう。この手法は、標的染色体を切断し、かつ別々のドナーオリゴを必要とする一般的なＣａｓ－９／ＣＲＩＳＰＲ手法よりも、選択的かつ簡素となるであろう。
各事例において、編集効率は、任意選択により、編集オリゴヌクレオチドへの曝露中またはその前にＳ期の細胞を同調させるか、複製フォークを減速させるか（Ｅｒｉｎ Ｅ．Ｂｒａｃｈｍａｎ ａｎｄ Ｅｒｉｃ Ｂ．Ｋｍｉｅｃ ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ４：４４５－４５７（２００５）、または別様に相同ＤＮＡ修復機構の発現および／または活性を増加させる薬剤、例えばヒドロキシル尿素、ＨＤＡＣ阻害薬、またはカンプトテシン（Ｆｅｒｒａｒａ ａｎｄ Ｋｍｉｅｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２（１７）：５２３９－５２４８，２００４）などで、標的となる細胞または生物を処置することによって、向上させることができる。
本明細書に記載される化学修飾された編集オリゴヌクレオチドは、相同組換え編集のためのドナーオリゴヌクレオチドとして使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いた精確な編集はドナーＤＮＡを使用するが、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９は、典型的には、本明細書に記載される化学修飾されたドナーＤＮＡと共に使用されない。化学修飾された「ドナー」編集オリゴヌクレオチドの相同組換えの効率を向上させるための別の方法は、標的変異近くへのＰＮＡクランプの付加である（Ｓｃｈｌｅｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１８（９）：１１８９－１１９８，２０１１）。Ｇｌａｚｅｒは、この技術を第２世代編集化学（例えば、ドナーＤＮＡオリゴヌクレオチドの両端のうちの一方における３個のホスホチオエート修飾）に用いたが、ＰＮＡクランプは、本明細書に記載および参照される、第３世代のより重度に修飾されたドナーＤＮＡには用いられていない。（Ｂａｈａｌ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １４（５）：３３１－４２（２０１４）、Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０５（３６）：１３５１４－１３５１９（２００８）、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９９（２６）：１６６９５－１６７００（２００２）、および米国特許第８，３０９，３５６号）。
Ｊ． 合成
本発明の編集オリゴヌクレオチドとして利用される特定のオリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、次の米国特許に見出され得る：ポリアミン接合オリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，１３８，０４５号および同第５，２１８，１０５号；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドの調製のためのモノマーに関する米国特許第５，２１２，２９５号；修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，３７８，８２５および同第５，５４１，３０７号；骨格修飾オリゴヌクレオチドおよび還元カップリングによるその調製に関する米国特許第５，３８６，０２３号；３－デアザプリン環系に基づく修飾核酸塩基およびその合成方法に関する米国特許第５，４５７，１９１号；Ｎ－２置換プリンに基づく修飾核酸塩基に関する米国特許第５，４５９，２５５号；キラルリン結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのプロセスに関する米国特許第５，５２１，３０２号；ペプチド核酸に関する米国特許第５，５３９，０８２号；．ベータ．－ラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５５４，７４６号；オリゴヌクレオチドの合成のための方法および材料に関する米国特許第５，５７１，９０２号；アルキルチオ基を有するヌクレオシドに関する米国特許第５，５７８，７１８号（かかる基は、ヌクレオシドの様々な位置のいずれかにおいて結合した他の部分とのリンカーとして使用され得る）；高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５８７，３６１および同第５，５９９，７９７号；２’－Ｏ－アルキルグアノシンおよび２，６－ジアミノプリン化合物を含む関連化合物の調製のためのプロセスに関する米国特許第５，５０６，３５１号；Ｎ－２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５８７，４６９号；３－デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第５，５８７，４７０号；両方とも接合４’－デスメチルヌクレオシド類似体に関する米国特許第５，２２３，１６８号および米国特許第５，６０８，０４６号；骨格修飾オリゴヌクレオチド類似体に関する米国特許第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号；２’－フルオロ－オリゴヌクレオチドの合成方法にとりわけ関する米国特許第６，２６２，２４１号および同第５，４５９，２５５号。
２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－エチル、２’－Ｏ－プロピル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－アミノアルキル、または２’－デオキシ－２’－フルオロ基を、オリゴヌクレオチドのヌクレオシドに組み込むことは、向上したハイブリダイゼーション特性をオリゴヌクレオチドに与える。さらに、ホスホロチオエート骨格を含有するオリゴヌクレオチドは、向上したヌクレアーゼ安定性を有する。したがって、官能化され、連結された本発明のヌクレオシドは、ＬＮＡ、拘束された糖、２’－デオキシ－２’－フルオロ基、ホスホロチオエート骨格、および／または２’修飾糖を含むようにさらに修飾されてもよく、糖は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－エチル、２’－Ｏ－プロピル、２’－Ｏ－アミノアルキル、２’－Ｏ－アリル、または２’－メトキシエトキシを含むように修飾されてもよい。
Ｋ． 保護基
多くの場合、保護基は、本発明の化合物の調製中に使用される。本明細書で使用される場合、「保護される」という用語は、指示される部分が、付加された保護基を有することを意味する。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、化合物は、１個以上の保護基を含有する。広範な保護基を本発明の方法に用いることができる。概して、保護基は、化学官能基を特定の反応条件に対して不活性にするものであり、分子の残部を実質的に損傷することなく、分子内のそのような官能基に付加し、そこから取り除くことができる。
代表的なヒドロキシル保護基は、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅらによって開示されている（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８：２２２３－２３１１，１９９２）。さらなるヒドロキシル保護基、ならびに他の代表的な保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，２ｄ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、およびＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ，１９９１において開示されている。
ヒドロキシル保護基の例としては、ｔ－ブチル、ｔ－ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１－エトキシエチル、１－（２－クロロエトキシ）エチル、２－トリメチルシリルエチル、ｐ－クロロフェニル、２，４－ジニトロフェニル、ベンジル、２，６－ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’－ジニトロベンズヒドリル、ｐ－ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ－ブチルジメチルシリル、ｔ－ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ピバロエート、ベンゾエート、ｐ－フェニルベンゾエート、９－フルオレニルメチルカーボネート、メシレート、およびトシレートが挙げられるが、これらに限定されない。
酸処理に対して安定なアミノ保護基は、塩基処理で選択的に除去され、置換に選択的に利用可能な反応性アミノ基を作製するために使用される。そのような基の例は、Ｆｍｏｃ（Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｓ．Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ，Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，１９８７，ｖｏｌｕｍｅ ９，ｐ．１）、およびＮｓｃ基に例示される様々な置換スルホニルエチルカルバメートである（Ｓａｍｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３５：７８２１，１９９４、Ｖｅｒｈａｒｔ ａｎｄ Ｔｅｓｓｅｒ，Ｒｅｃ．Ｔｒａｖ．Ｃｈｉｍ．Ｐａｙｓ－Ｂａｓ，１０７：６２１，１９８７）。
追加のアミノ保護基としては、２－トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、１－メチル－１－（４－ビフェニルイル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、ｔ－ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）などのカルバメート保護基；ホルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル、およびニトロフェニルアセチルなどのアミド保護基；２－ニトロベンゼンスルホニルなどのスルホンアミド保護基；ならびにフタルイミドおよびジチアスクシノイルなどのイミンおよび環状イミド保護基が挙げられるが、これらに限定されない。これらのアミノ保護基の均等物もまた、本発明の化合物および方法に包含される。
Ｌ． 固体支持体
多くの固体支持体が市販されており、当業者であれば、固相合成ステップにおいて使用される固体支持体を容易に選択することができる。ある特定の実施形態において、ユニバーサルサポートが使用される。ユニバーサルサポートは、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する異常なまたは修飾されたヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドの調製を可能にする。Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ ５００およびＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｕｐｐｏｒｔ ＩＩは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２２８２５ Ｄａｖｉｓ Ｄｒｉｖｅ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ）から市販されているユニバーサルサポートである。ユニバーサルサポートに関するさらなる詳細については、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，１９９４，Ｅｄ．Ｒｏｇｅｒ Ｅｐｔｏｎ，Ｍａｙｆｌｏｗｅｒ Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ，１１５－１２４］、Ａｚｈａｙｅｖ，Ａ．Ｖ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５５，７８７－８００，１９９９、およびＡｚｈａｙｅｖ ａｎｄ Ａｎｔｏｐｏｌｓｋｙ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５７，４９７７－４９８６，２００１を参照されたい。加えて、オリゴヌクレオチドが、塩基性加水分解をより容易に受けるｓｙｎ－１，２－アセトキシホスフェート基を介して固体支持体に結合しているとき、オリゴヌクレオチドは、より穏和な反応条件下でユニバーサルサポートから切断され得ることが報告されている。Ｇｕｚａｅｖ，Ａ．Ｉ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２５：２３８０，２００３を参照されたい。
本発明のリガンド接合オリゴヌクレオチドにおける使用に想定される好ましい修飾オリゴヌクレオチドの具体例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸（ＭＮＡ）、または他の修飾骨格などの修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書に定義されるように、修飾された骨格またはヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドには、骨格内にリン原子を保持するもの、および骨格内にリン原子を有しないものが含まれる。本発明では、糖間骨格内にリン原子を有しない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドと見なすことができる。
具体的なオリゴヌクレオチド化学修飾を以下に記載する。所与の化合物内のすべての位置が均一に修飾される必要はない。反対に、１個より多くの修飾が、単一の編集オリゴヌクレオチド化合物内、またはさらにはその単一のヌクレオチド内に組み込まれてもよい。
Ｍ． ヌクレオシジル間結合
好ましい修飾されたヌクレオシド間結合または骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルならびに３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’連結類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接する対が３’－５’対５’－３’または２’－５’対５’－２’で連結している逆転した極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。図２０も参照されたい。
上記のリン原子含有結合の調製に関する代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，６２５，０５０号、および同第５，６９７，２４８号が挙げられるが、これらに限定されず、これらの各々は、参照により本明細書に援用される。
リン原子を中に含まない好ましい修飾されたヌクレオシド間結合または骨格（すなわち、オリゴヌクレオシド）は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または１個以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式の糖間結合から形成される骨格を有する。これらには、ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成され得るモルホリノ結合を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、および－ＣＨ２構成部分を有する他のものが含まれる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製に関する代表的な米国特許としては、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、および同第５，６７７，４３９号が挙げられるが、これらに限定されない。可能性のある骨格修飾の一覧については、図２０を参照されたい。
Ｎ． ヌクレオシド模倣物
他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣物において、ヌクレオシド単位の糖とヌクレオシド間結合との両方、すなわち骨格が、新規の基で置き換えられる。核酸塩基単位は、適切な核酸標的合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているそのようなオリゴヌクレオチド、すなわちオリゴヌクレオチド模倣物の１つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、具体的にはアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分の原子に直接的または間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、および同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７，１９９１に見出すことができる。
本発明のいくつかの好ましい実施形態は、ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド、ならびに、ヘテロ原子骨格、具体的には－ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－（メチレン（メチルイミノ）すなわちＭＭＩ骨格として知られる）、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、および上記に参照した米国特許第５，４８９，６７７号の－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－（ここで、天然ホスホジエステル骨格は－Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨ２－と表わされる）、および上記に参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を有する、オリゴヌクレオシドを用いる。上記に参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも好ましく、図２０を参照されたい。
Ｏ． 核酸塩基修飾
本発明の編集オリゴヌクレオチドに用いられるオリゴヌクレオチドは、追加または代替として、核酸塩基修飾または置換を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「未修飾」または「天然」の核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、他の合成および天然の核酸塩基、例えば５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンならびにグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンならびにグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシン、およびチミン、５－ウラシル（シュードウラシルとしても知られる）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換アデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル、ならびに他の５－置換ウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどを含む。図２１および２２も参照されたい。
上述の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基のうちの特定のものの調製に関する代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６８１，９４１号、および同第５，８０８，０２７号が挙げられる。
ある特定の実施形態において、本明細書に提供されるアンチセンス化合物、またはそれらの特定の部分は、標的核酸、標的領域、標的セグメント、またはそれらの特定の部分に対して相補的であるか、または少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％相補的である。可能性のある核酸塩基修飾の一覧については、図２１を参照されたい。
Ｐ． 相補性
編集オリゴヌクレオチドと標的核酸とは、所望の作用が起こる（例えば、ハイブリダイゼーション後に所望の塩基修飾が起こることを許容する）ように、オリゴヌクレオチドの十分な数の核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができるとき、互いに相補的である。
編集オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の非相補的な核酸塩基は、編集オリゴヌクレオチドが標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能なままであるならば、耐用され得る。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される編集オリゴヌクレオチド、またはその特定の部分は、標的核酸またはその特定の部分に対して相補的であるか、または少なくとも７０％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％相補的である。編集オリゴヌクレオチドの標的核酸との相補性パーセントは、日常的な方法を使用して決定することができる。例えば、２０個の核酸塩基のうち１６個が標的核酸に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするであろう編集オリゴヌクレオチドは、８０％の相補性となる。この例において、残りの非相補的な核酸塩基は、クラスター状であっても、または相補的な核酸塩基が散在していてもよく、互いにもしくは相補的な核酸塩基に近接している必要はない。それらは、編集オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端、または内部位置にあってもよい。別の例では、標的核酸との完全な相補性をもつ２個のオリゴヌクレオチドが側面に位置する、１個の非相補的な核酸塩基を有する１８個の核酸塩基の長さである編集オリゴヌクレオチドは、標的核酸と９４．４％の全体的な相補性を有することになり、したがって本発明の範囲内に含まれる。
標的核酸のある領域との編集オリゴヌクレオチドの相補性パーセントは、当該技術分野で既知のＢＬＡＳＴプログラム（塩基局所配列検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを使用して日常的に決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３ ４１０，１９９０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，７：６４９－６５６，１９９７）。ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２－４８９，１９８１）を利用し、デフォルト設定を使用した、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージ、Ｕｎｉｘ用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）もまた、使用され得る。
ＩＩ． 作用様式：
Ａ． ハイブリダイゼーション
編集オリゴヌクレオチドと標的核酸とのハイブリダイゼーションは、異なるストリンジェントな条件下で起こり得、配列依存性であり、ハイブリダイズされる核酸分子の性質および組成によって決定される。最も一般的なハイブリダイゼーション機構は、核酸分子の相補的な核酸塩基間の水素結合（例えば、ワトソン－クリック型、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型の水素結合）を伴う。
配列が標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能かどうかを判定する方法は、当該技術分野で周知である。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される編集オリゴヌクレオチドは、標的核酸と特異的にハイブリダイズ可能である。
Ｂ． 標的結合
本発明の編集オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを標的にするように設計される。編集ヌクレオチド（複数可）の片側または両側には、標的核酸に対して完全に相補的または実質的に相補的なオリゴヌクレオチドが位置してもよい。
好ましい結合方法は、ＤＮＡのワトソンもしくはクリック鎖のいずれかに対するハイブリダイゼーションをもたらす鎖置換によるものか、またはＲＮＡが標的である場合は、センスＲＮＡ鎖に対するアンチセンス編集オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによるものである。
Ｃ． 編集オリゴヌクレオチド
編集オリゴヌクレオチドは、任意選択により、送達部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させる「リンカー」を含有してもよい。リンカー結合は、編集オリゴヌクレオチド内の任意の核酸塩基に対するもの、５’末端に対するもの、３’末端に対するもの、糖残基に対するもの、または骨格に対するものであってもよい。リンカーは、この作業の実行に使用するための、当業者に既知の任意のリンカーであってよい。代替的に、リンカーは、編集オリゴヌクレオチドにおけるその性能を決定するために利用および試験されてもよい。例えば、本発明で利用され得るリンカーとしては、３’Ｃ３アミノリンカー、３’Ｃ７アミノリンカー、５’＆３’Ｃ６アミノリンカー、５’Ｃ１２アミノリンカー、５’光切断可能アミノリンカー、３’Ｃ３ジスルフィドリンカー、５’＆３’Ｃ６、ジスルフィドリンカー、ジチオールリンカー、４－ホルミルベンズアミドアルデヒド、Ｃ８－アルキン－チミジン、カルボキシ－ｄＴリンカー、ＤＡＤＥリンカー（５’カルボキシルリンカー）、３’グリセリル、５’ヘキシニル、チミジン－５－Ｃ２およびＣ６アミノリンカー、２’－デオキシアデノシン、８－Ｃ６アミノリンカー、２’－デオキシシチジン－５－Ｃ６アミノリンカー、２’－デオキシグアノシン－８－Ｃ６アミノリンカー、Ｃ７、内部アミノリンカー、光切断可能リンカー、または、介入基が、反応性基を標的核酸塩基の付近に位置付けるように機能する、介入物質含有リンカーが挙げられる。リンカー長は、炭素１個から炭素約２０個、または他の化学構造の同等の長さに及び得るが、好ましくは、炭素１０個未満または１０個の炭素と同等の長さである。
化学修飾様式の編集の場合、編集オリゴヌクレオチドを用いた成功裏の処理は、「標的核酸」のいくらかの割合が修飾されることをもたらす。
化学修飾様式の編集の場合、単一のヌクレオチドの変化から生じる核酸配列の変異は、トランジションまたはトランスバージョンであり得る。トランジションは、点変異がプリンヌクレオチドを別のプリンヌクレオチドに、例えばアデノシンをグアノシンに、または、ピリミジンヌクレオチドを別のピリミジンヌクレオチドに、例えばシチジンをチミジンに変化させるときに生じる。
トランジションまたはトランスバージョンが遺伝コード内で生じるとき、それらは、ｍＲＮＡから発現されるタンパク質に、その産生に干渉することによって、または翻訳中にタンパク質のアミノ酸配列に変化を導入することによって、直接影響を及ぼし得る。ｍＲＮＡに転写されるＤＮＡ内に提供される情報は、タンパク質に翻訳される核酸の分離したセグメントまたは長さを提供する。加えて、これらのセグメントは、翻訳が始まり終わるべき場所を示す制御要素を含有し、その結果、リボソームが、適切なアミノ酸配列を有するタンパク質を産生することができる。終止コドンを産生するｍＲＮＡに沿った点変異は、翻訳の終結の合図となり、所望のタンパク質の産生を妨げるか、または、翻訳の早期終結をもたらし、機能しないタンパク質を産生する場合がある。開始コドンは、近くの配列または開始因子が翻訳を開始することを必要とするが、終結を開始するには、終止コドン単独で十分である。
本発明は、標的配列を野生型もしくは均等物に戻し、コドンが野生型でないにもかかわらず適切なアミノ酸に翻訳するように点変異を修飾するか、または、終止コドンがリードスルーコドンになり、タンパク質の産生が可能になるように点変異を修飾する、点変異の補正を提供する。ｍＲＮＡにおいて、リードスルーコドンに変換され得る点変異の例は、５’ＵＡＡからＣＡＡ、５’ＵＡＧからＣＡＧもしくはＵＧＧ、または５’ＵＧＡからＣＧＡもしくはＵＧＧへのトランジションを含み、ＤＮＡにおいては、５’ＴＡＡからＣＡＡ、３’ＡＴＴからＧＴＴ、５’ＴＡＧからＣＡＧもしくはＴＧＧ、３’ＡＴＣからＧＴＣもしくはＡＣＣ、５’ＴＧＡからＣＧＡもしくはＴＧＧ、および３’ＡＣＴからＧＣＴもしくはＡＣＣである。
点変異がｍＲＮＡのタンパク質翻訳セグメント内で起こるとき、結果として生じるコドンは、異なるアミノ酸として読み取られる場合がある。例えば、アデニンからグアニンへのトランスバージョンから生じ得る具体的なコドン変化としては、ＭｅｔからＶａｌ、ＴｙｒからＣｙｓ、ＨｉｓからＡｒｇ、ＧｌｎからＡｒｇ、ＡｓｐからＳｅｒ、ＬｙｓからＡｒｇ、ＡｓｐからＧｌｙ、およびＧｌｕからＧｌｙが挙げられる。加えて、終止コドンは、例えばアンバーストップからＴｒｐ、またはＵＧＡ終止コドンからＴｒｐのように、アミノ酸コドンに変異し得る。
例えばＴからＣへのトランジションなどの点変異がＤＮＡまたはＲＮＡ内で起こるとき、転写、続いて翻訳は、結果として生じるタンパク質内のアミノ酸を変化させ得る。例えば、ＴからＣへの変化は、ＰｈｅからＬｅｕ、ＣｙｓからＡｒｇ、ＴｒｐからＡｒｇ、ＰｈｅからＳｅｒ、ＴｙｒからＨｉｓ、ＩｌｅからＴｈｒ、ＭｅｔからＴｈｒ、ＶａｌからＡｌａ、６つの連続したセリンのうち４つのＰｒｏへの変化、４つの連続したロイシンのうち２つからＳｅｒ、または６つのロイシンのうち４つからＰｒｏへの、アミノ酸変化をもたらし得る。加えて、終止コドンは、例えばＵＡＡもしくはＵＡＧ終止コドンからＴｒｐ、またはＵＧＡ終止コドンからＡｒｇのように、アミノ酸コドンに変異し得る。
Ｄ． 標的核酸塩基の化学修飾による編集
図１９は、化学修飾様式の編集のために本発明の編集オリゴヌクレオチドを利用する編集の機構を示す。編集オリゴヌクレオチドの長さは、例えば、編集を行うために利用されている化学構造の種類、標的に対して行われる編集の種類、およびリンカーの長さを含む、編集プロセスのいくつかの物理的態様に応じて異なり得る。
編集の化学修飾法における編集オリゴヌクレオチドは、「ガイドオリゴヌクレオチド」、「配列修飾反応基」をガイドオリゴヌクレオチドに共有結合させる「リンカー」を含む、少なくとも３つの構成要素を含む。図１９中、リンカーは、編集オリゴヌクレオチドの核酸塩基に結合した状態で示されている。しかしながら、この結合は、編集オリゴヌクレオチド内の任意の核酸塩基に対するもの、５’末端に対するもの、３’末端に対するもの、糖残基に対するもの、または骨格に対するものであってもよい。リンカーは、この作業の実行に使用するための、当業者に既知の任意のリンカーであってよい。代替的に、リンカーは、編集オリゴヌクレオチドにおけるその性能を決定するために利用および試験されてもよい。例えば、本発明で利用され得るリンカーとしては、３’Ｃ３アミノリンカー、３’Ｃ７アミノリンカー、５’＆３’Ｃ６アミノリンカー、５’Ｃ１２アミノリンカー、５’光切断可能アミノリンカー、３’Ｃ３ジスルフィドリンカー、５’＆３’Ｃ６、ジスルフィドリンカー、ジチオールリンカー、４－ホルミルベンズアミドアルデヒド、Ｃ８－アルキン－チミジン、カルボキシ－ｄＴリンカー、ＤＡＤＥリンカー（５’カルボキシルリンカー）、３’グリセリル、５’ヘキシニル、チミジン－５－Ｃ２およびＣ６アミノリンカー、２’－デオキシアデノシン、８－Ｃ６アミノリンカー、２’－デオキシシチジン－５－Ｃ６アミノリンカー、２’－デオキシグアノシン－８－Ｃ６アミノリンカー、Ｃ７、内部アミノリンカー、光切断可能リンカー、または、反応性基を標的核酸塩基の付近に位置付ける介入基サーバー、介入物質含有リンカーが挙げられる。リンカー長は、炭素１個から炭素約２０個、または他の化学構造の同等の長さに及び得るが、好ましくは、炭素１０個未満または１０個の炭素と同等の長さである。
化学修飾様式における編集オリゴヌクレオチドを用いた成功裏の処理は、「標的核酸」のいくらかの割合が修飾されることをもたらす。図１９中、「化学修飾」（三角形）は、化学部分（例えば、メチル基）の付加を表すが、本明細書に記載される修飾は、化学基の様々な付加、または標的核酸配列の標的核酸塩基からの除去のうちの１つ（例えば、脱アミノ化）であってもよい。
単一のヌクレオチドの変化から生じる核酸配列の変異は、トランジションまたはトランスバージョンであり得る。トランジションは、点変異がプリンヌクレオチドを別のプリンヌクレオチドに、例えばアデノシンをグアノシンに、または、ピリミジンヌクレオチドを別のピリミジンヌクレオチドに、例えばシチジンをチミジンに変化させるときに生じる。トランジションは、酸化的脱アミノ化、互変異性化、およびアルキル化試薬の作用によって引き起こされ得る。トランスバージョンは、プリンヌクレオチドがピリミジンヌクレオチドに、またはピリミジンヌクレオチドがプリンヌクレオチドに、例えばシチジンがアデノシンに、そしてグアノシンがチミジンに変換されるときに起こる。トランスバージョンは、電離放射線およびアルキル化試薬の作用によって引き起こされ得る。
本発明は、様々な変異から生じる作用を低減させるか、または排除することのできる、編集オリゴヌクレオチドを提供する。例えば、変異がトランジション変異である場合、潜在的な編集機能は、好ましくはシトシンと対合するイノシンの形成をもたらす、６位におけるアデニン塩基の一酸化窒素媒介性脱アミノ化によって達成され得るＡ－Ｇ様変換；好ましくはウラシルまたはチミン塩基と対合するＯ６－アルキルグアニンをもたらす、グアニン塩基のＯ６－アルキル化によって達成され得るＧ－Ａ様変換；アデニン塩基と対合するウラシルの形成をもたらす、４位におけるシトシン塩基の一酸化窒素媒介性または亜硫酸水素塩媒介性脱アミノ化によって達成され得るＣ－Ｔ様変換；および、好ましくはグアニン塩基と対合する４－アルキルチミンまたは４－アルキルウラシル塩基をもたらす、チミンまたはウラシル塩基のＯ４－アルキル化によって達成され得るＴまたはＵ－Ｃ様変換を含み得る。
変異がトランスバージョン変異である場合、潜在的な編集機能は、次のものを含み得る：Ａ－Ｃ様変換は、アデニン塩基の付加体を生成するベンゾ［ａ］ピレンとの反応であり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより回避されるアデニンのＮ６－ベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシド（ＢＰＤＥ）付加体をもたらし、高い確率で修飾アデニンの反対側のＧの誤取り込みを導く；Ａ－Ｔ様変換は、アデニン塩基の付加体を生成するベンゾ［ａ］ピレンとの反応であり、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより回避されるアデニンのＮ６－ベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシド（ＢＰＤＥ）付加体をもたらし、高い確率で修飾アデニンの反対側のＡの誤取り込みを導く；そしてＧ－Ｔ様変換は、８－オキソ－ＧへのＧの酸化によって行われ得、これは、ＲＮＡポリメラーゼによって８－オキソ－Ｇ修飾の反対側のＲＮＡ鎖にＡが約５０％取り込まれることをもたらす。
Ｅ． 化学構造
本発明の化学修飾様式を用いる編集オリゴヌクレオチドは、アルキル化および脱アミノ化を含む様々な特異的化学反応によって、それらの機能を実行する。各種の反応において、任意選択の反応性基は、特異性を増加させ（Ｓｉｎｇｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｒｇｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｄｒｕｇｓ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｖｏｌｕｍｅ １０ Ａｐｒｉｌ ２０１１）、合成、精製、および貯蔵の間の反応性を回避するために用いられ得、また、標的細胞に達する前に、細胞のｐＨ、例えばエンドソームまたはリソソーム内の低いｐＨなど、細胞内エステラーゼ、温度、光、または還元環境によって、放出され得る。
Ｆ． 編集作用
本発明は、様々な変異から生じる作用を低減させるか、または排除することのできる、編集オリゴヌクレオチドを提供する。
本発明の一実施形態において、西洋の人口において嚢胞性線維症を引き起こす一般的な変異配列である、デルタＦ５０８が補正され得る。ｄｅｔａｌＦ５０８のような欠失変異の修復は、編集オリゴヌクレオチドを用いて、欠失した３個のヌクレオチドを挿入し直すことによって達成され得る。ＭｃＮｅｅｒ，Ｎ．Ａ．ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ ７９５２ ｐｇｓ．１－１１，２０１５）は、３個のホスホロチオエート修飾を各端部に有する編集オリゴヌクレオチドを用いる一例を提供する。改善された化学修飾パターンを有するオリゴヌクレオチド、および同じ領域を標的にする本発明の編集オリゴヌクレオチドの構成は、３個のホスホロチオエート修飾を各端部に有し、かつＭｃＮｅｅｒらによって使用されたものと同様の編集オリゴヌクレオチドに置き換えることができる。しかしながら、単一塩基のトランジションまたはトランスバージョンは、挿入と比較して、編集によってより効率的に達成され得、したがって、デルタＦ５０８変異の有害作用を抑制するＣＦタンパク質コード配列におけるＲ５５３からＭ（Ｒ５５３Ｍ）への変化は、この変異の表現型作用を補正することに対する代替的な手法である（Ｘ．Ｌｉｕ１ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５１（２５）：５１１３－５１２４，２０１２．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ３０００１８ｅ。これは、デルタＦ５０８のサプレッサー変異を作り出すために治療的編集を初めて適用するものである。
ＣＦタンパク質コード配列における、Ｒ５５５からＫ（Ｒ５５５Ｋ）への別の変化は、デルタＦ５０８変異の有害作用を抑制する（Ｘ．Ｌｉｕ１ ｅｔ ａｌ．上記）。
本発明の別の態様は、１つ以上の疾患に対して保護的であるアレル配列を個体のＤＮＡまたはＲＮＡ内に作り出すために、個体に編集オリゴヌクレオチドを投与することを含む。例えば、ＡＰＰタンパク質の一般的なアレルから、アルツハイマー防御性のＡＰＰのアレル配列への変化を、ＤＮＡレベルで脳内において誘導することは、個体がアルツハイマー病の発症に対して抵抗性になることにつながる（Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４８８（７４０９）：９６－９，２０１２．ＰｕｂＭｅｄ ａｎｄ Ｋｅｒｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ，３４（５）：１５１８，２０１３）。好ましいアレル配列は、アルツハイマー病に対して約８０％の生涯保護作用を有する、Ａｌａ６７３Ｔｈｒアレルである。この変更は、例えば、この位置におけるコドンであるＧＣＡをＡＣＡに変化させることによって行うことができる。
アルツハイマー病のリスクを低減させ、かつ／またはその進行を減速させるための、保護的アレルを作り出すことの別の例は、アルツハイマー病リスクアレルであるＡＰＯＥ４をＡＰＯＥ３アレルに変換するように、ＡＰＯＥ内のＡｒｇ１１２をコードする核酸配列のＣｙｓ１１２への変化を編集することである。この変更は、任意選択により、Ａｒｇ１５８からＣｙｓ１５８への変化と併せて行うことができ、これは、アルツハイマー病リスクアレルであるＡＰＯＥ４を保護的アレルであるＡＰＯＥ２に変化させる。この二重の変化は、単一の長い編集鎖、またはより小さい２個の別々の編集オリゴヌクレオチドを用いて達成され得る。Ａｒｇ１５８からＣｙｓ１５８への単一の変化は、ＡＰＯＥ３を、より保護的なアレルであるＡＰＯＥ２に変換する。図２４の例示的な編集オリゴ配列を参照されたい。
保護的アレルを作り出すことの別の例は、中途終止コドンを作り出すことによる肝臓内のＰＣＳＫ９の不活性か、または、ＰＣＳＫ９を不活性化させるか、もしくはその活性を低減させる、多数の修飾のうちの１つである。ＰＣＳＫ９における自然発生のヌル変異体アレルは、閉塞性脳卒中および冠動脈疾患などの動脈硬化に基づく疾患に対して、最大９０％の保護的な生涯にわたる作用を有する。さらに、機能ＰＣＳＫ９を中和する治療抗体は、血清コレステロールレベルを低減させる。これらの抗体は高価であり、慢性的に投与される必要があるのに対し、ＤＮＡレベルでの編集は、血清コレステロールレベルの恒久的な低減をもたらす。変異アレルを修復することに対して、編集オリゴヌクレオチドを使用して保護的アレルを作り出すことの非自明的な利点の１つは、ヒト疾患を引き起こす変異の多くは集団内で不均質であり、したがって、様々な遺伝子型を有する患者を治療するために、異なる編集オリゴヌクレオチドのパネルが利用可能であることが必要であるのに対し、保護的編集のための標的配列は、集団内で大幅により均質であることである。
ＩＩＩ． 治療
Ａ． 疾患
本発明の編集オリゴヌクレオチドは、疾患の作用を低減させるか、減少させるか、または排除するために利用され得る。本発明の編集オリゴヌクレオチドで治療され得る疾患としては、アデノシンデアミナーゼ欠損症；アルファ１アンチトリプシン欠損症；アルツハイマー病；アミノアシラーゼ２欠損症；アスパルトアシラーゼ欠損症；動脈硬化、粥状動脈硬化、カナバン－ファン・ボガエール－バートランド病（Ｃａｎａｖａｎ－Ｖａｎ Ｂｏｇａｅｒｔ－Ｂｅｒｔｒａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ）；シャルコー・マリー・トゥース病；嚢胞性線維症；乳がん素因変異；インスリン受容体変異により生じる糖尿病１型；糖尿病２型（例えば、標的遺伝子ＰＴＰ－１ＢおよびＡＢＣＡ１Ｃ６９Ｔアレル（Ａｌｈａｒｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．３８（５）：８９３－８９７（２０１３））、鎌形赤血球症；ファブリー病；家族性大腸腺腫症；家族性アミロイド心筋症；家族性アミロイド多発ニューロパチー；家族性自律神経障害；家族性高コレステロール血症；フリートライヒ運動失調症；ゴーシェ病Ｉ型；ゴーシェ病Ｉ型Ｉ；糖原貯蔵障害ＩＩ型；ＧＭ２ガングリオシドーシス；血色素症；血友病Ａ；血友病Ｂ；血友病Ｃ；遺伝性盲目（ｒｄ１の変異を補正する編集オリゴヌクレオチドの網膜への送達の一例について、Ａｎｄｒｉｅｕ－Ｓｏｌｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ １３：６９２－７０６，２００７を参照されたい）；遺伝性高チロシン血症Ｉ型（ＨＴＩ）（フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ（ＦＡＨ）の変異により生じる、Ｙｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（６），２０１４）ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；高コレステロール血症、卵巣がん素因変異；フェニルケトン尿症；多嚢胞性腎疾患；プリオン病；老人性全身性アミロイドーシス；鎌状赤血球症；鎌状赤血球貧血；スミス・レムリ・オピッツ症候群；脊髄性筋萎縮症；およびウィルソン病が挙げられる。
具体的な疾患標的としては、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子遺伝子（ＣＦＴＲ）；ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）；アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質遺伝子（ＡＰＰ）；第ＸＩＩ因子遺伝子；第ＩＸ因子遺伝子；第ＸＩ因子遺伝子；ＨｇｂＳ；インスリン受容体遺伝子；アデノシンデアミナーゼ遺伝子；アルファ－１アンチトリプシン遺伝子；乳がん１遺伝子（ＢＲＣＡ１）；乳がん２遺伝子（ＢＲＣＡ２）；アスパルトシクラーゼ遺伝子（ＡＳＰＡ）；ガラクトシダーゼアルファ遺伝子（ＧＬＡ）；大腸腺腫症遺伝子（ＡＰＣ）；Ｂ細胞内のカッパ軽ポリペプチド遺伝子エンハンサーの阻害薬、キナーゼ複合体関連タンパク質（ＩＫＢＫＡＰ）；グルコシダーゼベータ酸遺伝子（ＧＢＡ）；グルコシダーゼアルファ酸遺伝子（ＧＡＡ）；血色素症遺伝子（ＨＦＥ）；アポリポタンパク質Ｂ遺伝子（ＡＰＯＢ）；低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＬＤＬＲ）、低密度リポタンパク質受容体アダプタータンパク質１遺伝子（ＬＤＬＲＡＰ１）；プロタンパク質コンバターゼサブチリシン／ケキシン９型遺伝子（ＰＣＳＫ９）；多嚢胞性腎疾患１（常染色体優性）遺伝子（ＰＫＤ－１）；プリオンタンパク質遺伝子（ＰＲＮＰ）；ＰＴＰ－１Ｂ；７－デヒドロコレステロールレダクターゼ遺伝子（ＤＨＣＲ７）；生存運動ニューロン１、テロメア遺伝子（ＳＭＮ１）；ビキチン（ｂｉｑｕｉｔｉｎ）様修飾因子活性化酵素１遺伝子（ＵＢＡ１）；ダイニン、細胞質１、重鎖１遺伝子（ＤＹＮＣ１Ｈ１）、生存運動ニューロン２、セントロメア遺伝子（ＳＭＮ２）；（シナプス小胞結合膜タンパク質）関連タンパク質ＢおよびＣ（ＶＡＰＢ）；ヘキソサミニダーゼＡ（アルファポリペプチド）遺伝子（ＨＥＸＡ）；トランスサイレチン遺伝子（ＴＴＲ）；ＡＴＰアーゼ、Ｃｕ＋＋輸送、ベータポリペプチド遺伝子（ＡＴＰ７Ｂ）；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子（ＰＡＨ）；ロドプシン遺伝子；網膜色素変性症１（常染色体優性）遺伝子（ＲＰ１）；網膜色素変性症２（Ｘ連鎖劣性）遺伝子（ＲＰ２）、ならびに他の既知の遺伝子標的が挙げられる。
編集オリゴヌクレオチドは、２型糖尿病（例えば、標的遺伝子ＰＴＰ－１Ｂ）、アルツハイマー病（ＡＰＰ）、および家族性高コレステロール血症（ＰＣＳＫ９）などにおける保護アレルを作り出すか、または、嚢胞性線維症デルタ５０８変異などの遺伝子内サプレッサーを作り出すように、変異がミスセンス変異であるときの疾患症状（例えば鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、鎌状赤血球貧血（ＳＣＡ）、もしくは鎌形赤血球症など）、ナンセンス変異（例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびベッカー型筋ジストロフィーなどにおける）、スパイシング変異（例えば家族性自律神経障害などにおける）を寛解させるために、利用され得る。他のミスセンスまたはナンセンス変異としては、アデノシンデアミナーゼ欠損症、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アミノアシラーゼ２欠損症、アミロイド病、アスパルトアシラーゼ欠損症、乳がん素因変異、カナバン－ファン・ボガエール－バートランド病、シャルコー・マリー・トゥース病、嚢胞性線維症、糖尿病１型（インスリン受容体変異により生じる）、ファブリー病、家族性大腸腺腫症、家族性アミロイド心筋症、家族性アミロイド多発ニューロパチー、フリートライヒ運動失調症、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ、糖原貯蔵障害ＩＩ型、ＧＭ２ガングリオシドーシス、血色素症、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、卵巣がん素因変異、フェニルケトン尿症、多嚢胞性腎疾患、プリオン病、老人性全身性アミロイドーシス、スミス・レムリ・オピッツ症候群、脊髄性筋萎縮症、ウィルソン病、および遺伝性盲目が挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチドで治療することのできる疾患および障害の追加の例、ならびに該オリゴヌクレオチドを使用する方法は、図２３に開示されている。
代表的な疾患および障害に関連する遺伝子を標的にする編集オリゴヌクレオチドの非限定的な例は、図２４に開示されている。
Ｂ． 薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は、標的遺伝子の発現をもたらすのに十分な投与量で投与される。概して、編集オリゴヌクレオチドの好適な用量は、受容者の体重１キログラム当たり１日に０．０１～５．０ミリグラムの範囲、または必要であれば１キログラム当たり最大５０ミリグラム、好ましくは体重１キログラム当たり１日に０．１～２００マイクログラムの範囲、より好ましくは体重１キログラム当たり１日に０．１～１００マイクログラムの範囲、さらにより好ましくは体重１キログラム当たり１日に１．０～５０マイクログラムの範囲、最も好ましくは体重１キログラム当たり１日に１．０～２５マイクログラムの範囲である。本薬学的組成物が１日１回投与されてもよく、あるいは、編集オリゴヌクレオチドが、１日を通して適切な間隔における２回、３回、４回、５回、６回、もしくはそれを超える部分用量で、またはさらには継続的輸注を使用して投与されてもよい。その場合、各部分用量に含有される編集オリゴヌクレオチドは、１日の全投与量を達成するために、相応により少量でなければならない。投与量単位は、例えば、数日の期間にわたって編集オリゴヌクレオチドの徐放をもたらす従来の徐放性製剤を使用した、数日間にわたる送達のために調合することもできる。徐放性製剤は、当該技術分野で周知である。この実施形態において、投与量単位は、対応する複数の１日用量を含む。
ｉ． 投与量
当業者であれば、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要とされる投与量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の組成物を用いた対象の治療は、単一の治療または一連の治療を含むことができる。本発明に包含される個別の編集オリゴヌクレオチドの有効な投与量およびインビボ半減期の推定は、従来の方法論を使用して、または本明細書の他の箇所に記載される適切な動物モデルを使用したインビボ試験に基づいて、行うことができる。
ｉｉ． 投与経路
本発明に包含される薬学的組成物は、経口、または、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、直腸、膣、ならびに局所（口腔および舌下を含む）投与を含む非経口経路を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の手段によって投与されてよい。好ましい実施形態において、本薬学的組成物は、静脈内投与される。
筋肉内、皮下、および静脈内の使用については、本発明の薬学的組成物は、概して、適切なｐＨおよび等張性に緩衝された、無菌水溶液または懸濁液中で提供される。好適な水性ビヒクルとしては、リンゲル液および等張塩化ナトリウムが挙げられる。好ましい実施形態において、担体は、もっぱら水性緩衝液から成る。この文脈において、「もっぱら」とは、標的遺伝子を発現する細胞における編集オリゴヌクレオチドの取り込みに影響を及ぼすかまたはそれを媒介し得る、補助的な薬剤またはカプセル化物質が存在しないことを意味する。そのような物質としては、例えば、以下に記載されるリポソームまたはカプシドなどのミセル構造体が挙げられる。本発明による水性懸濁液は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル－ピロリドン、およびトラガントゴムなどの懸濁剤、ならびにレシチンなどの湿潤剤を含み得る。水性懸濁液のための好適な防腐剤としては、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エチルおよびｐ－ヒドロキシ安息香酸ｎ－プロピルが挙げられる。
本発明による有用な薬学的組成物は、身体からの急速な排除から編集オリゴヌクレオチドを保護するカプセル製剤、例えばインプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などを含む。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性かつ生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製法は、当業者には明らかであろう。これらの材料は、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）およびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｌａ Ｖｉｓｔａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的にするリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、ＰＣＴ出願国際公開第９１／０６３０９号、および欧州特許公開第ＥＰ－Ａ－４３０７５号に記載される、当業者に既知の方法に従って調製するか、または、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｕｒｎａｂｙ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ）、もしくはＡｒｂｕｔｕｓ ＢｉｏＰｈａｒｍａ（Ｂｕｒｎａｂｙ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）から商業的に入手することができる。ナノ粒子送達を使用してもよく、これは、Ｊ．Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，６：８５－１０７，２０１３、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｈ６０１００８５，ＭｃＮｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０（６）：６５８－６６９，２０１３、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１２．８２，ＭｃＮｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ ７９５２ ｐｇｓ．１－１１，２０１５、およびＹｕｅｎ Ｙ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，５：４９８－５０７，２０１３、ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ５０３０４９８に記載されている。
ｉｉｉ 毒性および有効性
かかる化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するためのある範囲の投与量の処方に使用することができる。本発明の組成物の投与量は、毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で異なってもよい。本発明の方法に使用されるいかなる化合物についても、治療有効用量は、細胞培養アッセイから初めに推定することができる。用量は、細胞培養液中で決定された場合に、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する被験化合物の濃度）を含む、化合物の、または適切な場合は標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、ポリペプチドの濃度低下を達成する）ように、動物モデルにおいて処方され得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィによって測定され得る。
ＩＶ． 組成物および方法
本発明のオリゴヌクレオチドは、組成物および方法において提供される。
一態様において、生物内の単離細胞（複数可）内の核酸配列を修飾する方法であって、相補的な細胞核の修飾（複数可）が生じるようにオリゴヌクレオチドを該細胞に導入するステップを含む方法が、本明細書に提供され、該修飾は、疾患を防ぐアレルを作り出すか、変異を修復するか、または遺伝子をノックアウトする。
別の実施形態では、疾患を防ぐアレルは、標的遺伝子の機能を不活性化させないが、標的遺伝子の機能を調整する。
なおも別の実施形態において、本方法は、標的遺伝子の機能の調整をもたらす。標的遺伝子の機能の調整は、遺伝子産物の活性または発現を増加させ得る。標的遺伝子の機能の調整は、翻訳後にプロセシングされる遺伝子産物の活性または発現を部分的に減少させ得る。
標的遺伝子の機能の調整は、翻訳後にプロセシングされる遺伝子産物の活性または発現を、修飾された細胞において５０パーセント以下、部分的に減少させ得る。標的遺伝子の機能の調整は、翻訳後にプロセシングされる遺伝子産物の活性または発現を、修飾された細胞において７５パーセント以下、部分的に減少させ得る。標的遺伝子の機能の調整は、翻訳後にプロセシングされる遺伝子産物の活性または発現を、修飾された細胞において９０パーセント以下、部分的に減少させ得る。
本方法のある特定の実施形態において、標的遺伝子産物は、プロテアーゼ切断によって翻訳後に修飾されたタンパク質である。具体的な実施形態では、標的遺伝子タンパク質はＡＰＰであり、遺伝子の修飾は、ＡＰＰの配列を変化させて、それをベータ－セクレターゼによる切断に影響されにくくする。ＡＰＰにおける６７３位をコードする配列は、アラニンからスレオニンに変化させられ得る。
別の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドを含む組成物が、本明細書に提供される。本組成物は、本明細書に記載の方法において使用され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが、製剤（例えば、編集オリゴヌクレオチド製剤）中に存在する。一実施形態において、編集オリゴヌクレオチド製剤は、編集効率を上昇させる外因性タンパク質またはリボ核タンパク質（または該タンパク質もしくはリボ核タンパク質を発現する核酸）を含む。編集効率を上昇させる外因性タンパク質またはリボ核タンパク質は、プログラム可能ヌクレアーゼであり得る。編集効率を上昇させる外因性タンパク質またはリボ核タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９、ジンクフィンガー、またはＴａｌｅｎプログラム可能ヌクレアーゼであり得る。編集オリゴヌクレオチドは、一本鎖の未修飾ＤＮＡであり得る。編集オリゴヌクレオチドは、一本鎖であり、少なくとも１０個のデオキシリボース糖を含有してもよい。編集オリゴヌクレオチドは、化学修飾されていてもよい。
編集オリゴヌクレオチドの化学修飾は、ホスホロチオート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｔｅｓ）を含み得る。編集オリゴヌクレオチドの化学修飾は、各末端における３個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。編集オリゴヌクレオチドの化学修飾は、末端における合計１～５個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。編集オリゴヌクレオチドの化学修飾は、合計７個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。一実施形態において、編集オリゴヌクレオチドの化学修飾は、合計７個以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むが、ホスホロチオエート修飾されていない少なくとも１０個のヌクレオチド間結合が残存する。一実施形態において、修飾は、いかなるホスホロチオエート修飾も含有しない。一実施形態において、修飾は、ホスホロチオートではないエキソヌクレアーゼ末端ブロッキング基を含む。
ある特定の実施形態において、本組成物は、化学修飾された核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを含む。化学修飾された核酸塩基（複数可）は、５メチルデオキシシチジンとすることができる。いくつかの実施形態では、１個～約５００個の５メチルデオキシシチジンが存在する。他の実施形態では、１個～約５０個の５メチルデオキシシチジンが存在する。他の実施形態では、１個～約１０個の５メチルデオキシシチジンが存在する。他の実施形態では、１個～約５個の５メチルデオキシシチジンが存在する。他の実施形態では、１個～約５個の５メチルデオキシシチジンが存在する。他の実施形態では、１個の５メチルデオキシシチジンが存在する。他の実施形態では、５メチルデオキシシチジンのうちの１個は、ミスマッチ５’ＴＧにハイブリダイズされた５’ＣｐＧ配列内に存在する。具体的な実施形態では、この５’ＴＧ標的部位が、メチオニン開始コドンのＴＧであり、編集は、機能性標的タンパク質の産生を低減させるか、または排除する。
本明細書に記載される方法および組成物の具体的な実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、２’修飾を含む。本明細書に記載される方法および組成物の別の具体的な実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、２’修飾のみを含む。具体的な実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、編集部位の５’側に２’Ｆ、および編集部位の３’側に２’－Ｏ－ｍｔ、またはその両方を含む。別の具体的な実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、編集部位近くの親和性を増加させる修飾塩基を含み、該修飾塩基は、５メチルＣではない。
本明細書に記載される方法および組成物の具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、送達ビヒクル内でカプセル化される（核酸の送達ビヒクルの説明については、Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１５：５４１－５５５（２０１４）を参照されたい）。
本明細書に記載される方法および組成物の具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、向上した細胞取り込みを与える接合分子をさらに含む。
本明細書に記載される方法および組成物の具体的な実施形態では、本方法および組成物は、ヘルパーオリゴヌクレオチドをさらに含む。
一態様において、編集オリゴヌクレオチドが本明細書に提供され、該編集オリゴヌクレオチドは、細胞内の相補的な標的配列を編集することができ、この編集オリゴヌクレオチドは、図２０に列記される修飾から選択される１個以上の骨格修飾を含む。
編集オリゴヌクレオチドの一実施形態において、骨格修飾は中性である。骨格修飾は、１個～約２０個の中性修飾を含むことができる。具体的な実施形態では、骨格修飾は、２個～約４個の中性修飾を含む。
別の実施形態では、骨格修飾は、メチルホスホネートである。骨格修飾は、１個～約２０個のメチルホスホネートを含み得る。具体的な実施形態では、骨格修飾は、２～４個のメチルホスホネートを含む。具体的な実施形態では、骨格修飾は、２個のメチルホスホネートを含む。より具体的な実施形態では、骨格修飾は、２個のメチルホスホネートを５’末端上に含む。
別の実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、１個～約２０個の骨格修飾を、単一の修飾骨格編集オリゴヌクレオチド内に含み得る。一実施形態において、修飾のうちの少なくとも２個は、末端セグメント内にある。具体的な実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、２個の修飾を５’末端に含む。
別の態様では、本明細書に記載される編集オリゴヌクレオチドを使用して、細胞または生物内の遺伝子を編集する方法が、本明細書に提供される。一実施形態において、細胞は、単離されたヒト細胞である。一実施形態において、生物は、ヒトである。ある特定の実施形態において、本方法は、図２３に列記される適応症から選択される適応症を治療するために使用される。具体的な実施形態では、この適応症は、図２４に列記される適応症から選択される。
一実施形態において、遺伝子は、図２４に列記される標的遺伝子である。具体的な実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、図２４に列記される配列の少なくとも２５パーセントを含む。別の具体的な実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、図２４からの配列の少なくとも５１パーセントを含む。
別の態様において、編集オリゴヌクレオチドが本明細書に提供され、該編集オリゴヌクレオチドは、細胞内の相補的な標的配列を編集することができ、該編集オリゴヌクレオチドは、図２１に列記される１個以上の骨格核酸塩基修飾を含む。一実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、図２１からの修飾核酸塩基を、１個～約１００個含む。一実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、図２１からの修飾核酸塩基を、１個～約３０個含む。一実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、図２１からの修飾核酸塩基を、１個～約１０個含む。具体的な実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、表１の修飾パターン種による修飾核酸塩基を、１個以上含む。
編集オリゴヌクレオチドの別の実施形態では、修飾核酸塩基は、哺乳動物において、編集オリゴヌクレオチドによって免疫刺激を減少させる。具体的な実施形態では、修飾核酸塩基は、５’メチルＣ化学修飾を含む。別の具体的な実施形態では、核酸塩基修飾は、編集オリゴヌクレオチドの、その賛辞的な標的に対する親和性を増加させる。
別の態様において、編集オリゴヌクレオチドが本明細書に提供され、該編集オリゴヌクレオチドは、細胞内の相補的な標的配列を編集することができ、この編集オリゴヌクレオチドは、図２２に列記される１個以上の糖修飾を含む。一実施形態において、糖修飾は、２’糖修飾から選択される。２’糖修飾は、２’Ｆとすることができる。２’糖修飾は、２’Ｏ－メチルであり得る。２’糖修飾は、２’Ｆと２’Ｏ－メチル修飾との組み合わせであってもよい。
編集オリゴヌクレオチドの一実施形態において、２’Ｆ修飾の過半数（例えば、５０％超）は、編集部位の３’にある。編集オリゴヌクレオチドの別の実施形態では、２’Ｏ－メチル修飾の過半数（例えば、５０％超）は、編集部位の５’にある。
２’糖修飾は、オリゴヌクレオチドの、その標的核酸に対する親和性を増加させることができる。一実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、１～７５個の糖修飾を含む。別の実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、２～３０個の糖修飾を含む。別の実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、２～１６個の糖修飾を含む。
一実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、約５～１００％化学修飾された塩基を含む。別の実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、約２５～７５％化学修飾された塩基を含む。別の実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、約４０～６０％化学修飾された塩基を含む。具体的な実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、２個の修飾を含む。具体的な一実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、２’Ｆおよび２’Ｏ－メチル修飾を含有する。
一実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、図２４に列記される遺伝子を標的にする。
別の態様において、ゲノム編集によってヒト疾患を治療する方法であって、かかる治療を必要とする個人に、本明細書に記載される編集オリゴヌクレオチドを投与するステップを含む方法が、本明細書に提供される。
なおも別の態様では、本明細書に提供されるのは編集オリゴヌクレオチドであり、１つ以上の送達接合体を含む。具体的な実施形態では、編集オリゴヌクレオチドは、１つの送達接合体を含む。送達接合体は、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを促進することができる。送達接合体は、生物における細胞内へのオリゴヌクレオチドの取り込みを向上させることができる。送達接合体は、編集オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドに直接的あるいは間接的に共有結合している化学部分であり得る。直接的な共有結合は、例えば、オリゴヌクレオチドに対する化学部分の共有結合を含む。間接的な共有結合は、例えば、オリゴヌクレオチドと化学部分との両方に共有結合しているリンカーの使用を含む。一実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、生物における細胞内の取り込みを向上させる送達ビヒクルによってカプセル化されていない。
一実施形態において、送達接合体は、受容体のリガンドである。具体的な実施形態では、リガンドは、１～１０個のＧａｌ－Ｎａｃである。別の具体的な実施形態では、リガンドは、３個のＧａｌ－Ｎａｃである。一実施形態において、送達接合体は、親油性基である。親油性基は、約１０個～約５０個の炭素を有し得る。親油性基は、ある形態のコレステロールであってもよい。
１つ以上の送達接合体を含む編集オリゴヌクレオチドは、疾患の治療に有用である。一態様において、ヒト疾患を治療または防止する方法であって、かかる治療を必要とする患者に、本明細書に記載される１つ以上の送達接合体を含む編集オリゴヌクレオチドを投与することによる方法が、本明細書に提供される。一実施形態において、本方法は、遺伝子を編集の標的にし、標的となる遺伝子は、図２３に列記されるものである。別の実施形態では、治療のための標的遺伝子は、図２４に列記されるものである。本方法の一実施形態において、編集オリゴヌクレオチド配列は、図２４の配列のうちの１つを含む。
Ｖ． 結果
表１に提示されるオリゴヌクレオチド構造物は、細胞培養液中のそれらの活性が親化合物未満であり得るとしても、研究および治療用途に有用であるが、それは、これらのオリゴヌクレオチドの各々が化学構造を付加し、免疫刺激の低減、ヌクレアーゼ安定性の上昇、標的特異性の上昇、化学毒性の低減、および／または親和性の上昇といった、他の予測される治療利益に寄与するからである。
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編集オリゴヌクレオチド１０００３４は、５’および３’の２’Ｆアーム（５’および３’近位セグメント）を有し、低いが有意な編集を示す。２’Ｆは２’－Ｏ－メチルよりも立体的にＤＮＡに類似しているため、これは予想外であり、２’Ｆは、３’アームに組み込まれると編集において高度に活性であった。５’アームでは、２’－Ｏ－メチル修飾が２’Ｆ修飾よりも良好に耐用され、これも同様に予想外であった。これは、編集オリゴヌクレオチド１０００５８のような構造物が、各アーム内に同じ修飾を有する構築物と比べて好ましいことを暗示する。
編集オリゴヌクレオチド１０００４７で見られるような広範な修飾は編集と適合性があったが、これは、修飾の各々が、当該技術分野で使用されることの多い親オリゴヌクレオチド（５’および３’のホスホロチオエートＤＮＡエキソヌクレアーゼブロッキング末端セグメントが、当該技術分野で一般的に使用されている）と比べて、予測される毒性を低下させるため、有用である。この毒性の低減の一部は、ＤＮＡ内の２’ＨまたはＲＮＡ内の２’ＯＨと比較して、２’修飾結合による、Ｔｏｌｌ様受容体の活性化の低減に起因すると考えられる。アームが効率的な編集部位として機能せず、したがってオフターゲット相互作用の潜在性が低いため、より高い標的特異性が達成される。
５’のメチルホスホネートエキソヌクレアーゼブロッキング末端セグメントがかなり活性であった一方で、５’と３’と両方のメチルホスホネート末端セグメントを使用することは、有用ではあったが活性は低かった。この構造物は、多くのインビトロアッセイで細胞増殖の遮断に関連するすべてのホスホロチオエートを除去した。
編集部位近くの単一の５’メチルＣ修飾は、複数の５’メチルＣ修飾がそうであったように、比較的高い編集効率と一致した。
３’近位セグメント修飾の区間を３’編集セグメントに向かって延長することは、編集反応への干渉のためにあまり好ましくない場合があるが、これらの追加の修飾は、ヌクレアーゼ安定性をさらに増加させ、免疫刺激を低減させると予測される（例えば、編集オリゴヌクレオチド１０００６２）。このことは、５’修飾にも当てはまる（例えば、編集オリゴヌクレオチド１０００６６）。
ＤＮＡよりもＲＮＡに近い２’－Ｏ－メチル修飾を編集部位内に延長すること（例えば、編集オリゴヌクレオチド１０００６８）は、編集活性を劇的に低減させるか、または排除すると予想される。また、３’の２’Ｆ修飾を編集部位内に延長すること（例えば、編集オリゴヌクレオチド１０００６４）は、編集活性を低減させるか、または排除すると予想される。
より長い編集オリゴヌクレオチドは、５’もしくは３’編集セグメント、または編集部位から離れた位置で修飾され得る結合を、より多く有する（例えば、編集オリゴヌクレオチド１０００７２）。
メチルホスホネートは優れた５’末端ブロックとなったが。編集オリゴヌクレオチド１０００７４は、ＣＹ３の５’末端ブロック、および３’末端上に３つの賛辞的なホスホロチオエートＤＮＡを有し、別の新規の組み合わせを提供する。
ロックド核酸（ＬＮＡ）も末端ブロッキング基として用いられ得るが、それらは、インビボ毒性を増加させる場合がある。この理由のため、本発明者らは、ヌクレアーゼ末端ブロックとして、末端の一方もしくは両方に、アンロックド核酸（ＵＮＡ）（例えば、編集オリゴヌクレオチド１０００７８）または簡素なリンカーを用いることを好む。エキソヌクレアーゼはＤＮＡの単一の修飾を飛び越えることができるが、２’修飾末端残基と組み合わせれば（例えば、編集オリゴヌクレオチド１０００８０）、この問題は軽減され得る。末端ブロッキングリンカーは、編集オリゴヌクレオチドに接合体を連結させるために使用することもできるという追加の利点を有する。これらの接合体（例えば、コレステロール（米国特許出願第２０１３０１３１１４２ Ａ１号）およびＧａｌ－Ｎａｃとの接合（米国特許第８，１０６，０２２号）は、培養液中および動物生体内での細胞へのオリゴヌクレオチドの取り込みを増加させることが示されている。編集オリゴヌクレオチドとのこれらの部分の接合体は、当該技術分野で既知の方法を利用して調製することができ、費用および／または毒性を付加する送達ビヒクル（例えば、リポソーム）の必要性を排除するであろう。
一本鎖ＤＮＡが二重鎖よりも編集のために良好であるかどうかに関しては、いくらかの議論がある。編集オリゴヌクレオチド１０００８２は、編集オリゴヌクレオチド１００００５、１０００３１、およびこの修飾系列における他のものに対して賛辞的な末端ブロックを含有する。編集オリゴヌクレオチドは、賛辞的なオリゴヌクレオチドとは別々に細胞に付加されてもよく、または、二重鎖を形成するように、本明細書に記載される任意の修飾化学構造の賛辞的な編集オリゴヌクレオチドとプレハイブリダイズされてもよい。事前形成された二重鎖の利点は、二本鎖ＤＮＡは一本鎖ヌクレアーゼに抵抗性があることである。しかしながら、二重鎖に認められる不利点は、何らかの細胞修復／組換え機構が標的結合を促進しない限り、塩基が標的ＤＮＡと自由にハイブリダイズできないことであり得る。標的遺伝子、細胞型、および投与経路に応じて、一本鎖または二本鎖の編集オリゴヌクレオチドが編集により好適となり得る。
編集オリゴヌクレオチド１０００８３は、編集オリゴヌクレオチド１００００５、１０００３１、および本明細書に開示される化学修飾された編集オリゴヌクレオチドＧＦＰ配列の系列における他のものに対して賛辞的な末端ブロックを有する、ＲＮＡプロテクターオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、賛辞的な編集ガイドオリゴヌクレオチドを、血清、エンド－リソソーム経路、および細胞質におけるヌクレアーゼから保護する。細胞質または核細胞質内にあるとき、ＲＮＡ鎖は、内因性ＲＮアーゼＨによって最終的には分解され、一本鎖編集オリゴヌクレオチドが標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションのために遊離する。これは、おそらくは標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションに干渉することによって編集オリゴヌクレオチドの活性を低減させた、２’－Ｏ－メチル保護オリゴヌクレオチドを改善するものである。
編集オリゴヌクレオチド（例えば、１０００８５）は、５’近位領域がプロテクターオリゴヌクレオチド１００８６にハイブリダイズされると、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内に充填することのできる二重鎖を形成するように、設計されている。相補的な標的核酸（ＲＮＡとＤＮＡ両方の標的；Ｓａｌｏｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６２：８４－９６，２０１５）に対するガイド鎖のハイブリダイゼーション速度は、アルゴノート内に充填される結果として劇的に上昇する。ＲＩＳＣによるハイブリダイゼーションオン速度のこの向上は、ｓｉＲＮＡを対応するアンチセンスよりも約１０～１００倍強力にするものである（例えば、アンチセンスではＲＩＳＣによる向上が観察されない）。したがって、アルゴノート内に充填された編集オリゴヌクレオチドの５’末端は、より急速に標的染色体ＤＮＡにハイブリダイズし、ゲノム編集の効力および／または効率を上昇させる。この機構は、内因性細胞機構を使用して標的結合を向上させ、したがって、標的結合を促進向上させるためにＣａｓ９のような外因性タンパク質の付加を必要としない。本発明のこの実施形態の利点は、それが外因性タンパク質を細胞に送達するという課題を回避することである。標的ＤＮＡへの結合が、アルゴノートと複合体形成した編集オリゴヌクレオチドの５’近位領域によってシーディングされると、残りの二重鎖が急速に生じる。
編集オリゴヌクレオチド１０００３７に関する本明細書のデータに基づくと、編集オリゴヌクレオチドの５’末端領域は、編集効率を維持しながら２’－Ｏ－メチルＲＮＡで修飾され得、２’－Ｏ－メチル修飾でのオリゴヌクレオチドの部分修飾は、ＲＩＳＣ充填と適合性があるようである（米国特許出願第２０１３０３１７０８０号、同第２０１５０２６７２００号、同第２０１５０１０５５４５号、同第２０１１００３９９１４号、および米国特許出願第１２／８２４，０１１号）。プロテクターオリゴヌクレオチド（パッセンジャー鎖）は、好ましくは１０～５０個のヌクレオチド、より好ましくは１２～３０個のヌクレオチド、最も好ましくは１９～２７個のヌクレオチドであり、標的に対して完全または実質的に相補的である。この構造物において、編集オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉまたはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の調製に関する一般的に許容されるいくつかの設計規則に従って設計されている。例えば、パッセンジャー鎖の２塩基対３’オーバーハングが好ましいが、ＲＮＡｉと適合性のある平滑末端および他の末端構造も有用である。ガイド（編集鎖）上の遊離５’ヒドロキシルまたはリン酸化５’ヒドロキシルも提供される。ＲＮＡｉと適合性のある、ある範囲の化学修飾および構造が、この編集方略に用いられ得る。パッセンジャーＲＮＡと二重鎖を形成する編集オリゴヌクレオチドの５’末端は、パッセンジャー鎖のＲＮアーゼＨ切断を活性化し、ＲＩＳＣ充填を低減させ得る、パッセンジャー鎖内のＲＮＡに結合したＤＮＡ結合を、約４個より多く有しないことが好ましい。好ましい実施形態において、ダイサー基質として機能するために十分に長い編集オリゴヌクレオチド内のＲＩＳＣ充填二本鎖領域を用いるとき、ダイサー切断部位（複数可）における２’－Ｏ－メチル修飾（複数可）の組み込みなどの、ダイサー切断を低減させるかまたは排除することが当該技術分野で既知である様式で、化学修飾またはミスマッチが挿入されてもよい（Ｓａｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（１１）：３７７１－９ Ｆｅｂ．２０１０）。ダイサー切断の低減が有益であるのは、編集部位に最も近い二重鎖の側面における編集オリゴヌクレオチドのダイサー切断が、編集オリゴヌクレオチドの残りからＲＩＳＣ充填領域を切り離し、これが標的ＤＮＡ二重鎖内への鎖侵入の前に起こった場合、ＲＩＳＣ充填の利点が排除されるからである。
ＲＩＳＣ内に充填することのできる二本鎖構造体は当該技術分野で既知であり、ＳＴＥＡＬＴＨ ＲＮＡｉ化合物（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡおよび米国特許第８，８１５，８２１号）、ダイサー基質（米国特許第８，３４９，８０９号、同第８，５１３，２０７号、および同第８，９２７，７０５号）、ｒｘＲＮＡ ｏｒｉ（ＲＸｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、短縮二重鎖を有するＲＮＡｉトリガ（２００９年出願の米国特許出願第２０１２００６５２４３号）、およびｓｉＲＮＡ（米国特許第７，９２３，５４７号、同第７，９５６，１７６号、同第７，９８９，６１２号、同第８，２０２，９７９号、同第８，２３２，３８３号、同第８，２３６，９４４号、同第８，２４２，２５７号、同第８，２６８，９８６号、同第８，２７３，８６６号、および米国特許出願第１３／６９３，４７８号）を含む。これらのＲＮＡｉトリガ構成は、ＲＩＳＣ充填を支持し、またいくつかの場合では組織および細胞取り込みを向上させることで知られる、様々な化学修飾パターンにより、編集鎖上の遊離５’ヒドロキシルまたはリン酸化５’ヒドロキシルが維持されるか、または細胞内で遊離する限り、本明細書に記載のＲＩＳＣ充填編集オリゴヌクレオチド（ＥＴＡＧＥＮ整理番号１０００８５を１０００８６にハイブリダイズしたもの）におけるｓｉＲＮＡで行われているように、編集オリゴヌクレオチドに組み込むことができる。
ＶＩ． 利点
Ｋｍｉｅｃ法は、化学反応基が編集オリゴヌクレオチドに結合することを必要とせず、塩基を任意の他の天然塩基にする編集を達成し、小さな挿入または欠失を可能にするため、Ｋｍｉｅｃ法を用いる本発明の実施形態は、化学修飾法に勝るいくつかの利点を有する。
化学修飾法は、標的核酸塩基の塩基対合特異性を変化させるための特定の基の付加または除去（すなわち、メチル化、エチル化、または脱アミノ化）を含み、したがって活発な細胞組換え機構を必要としないため、化学修飾法を用いる本発明の実施形態は、Ｋｍｉｅｃ法に勝るいくつかの利点を有する。
本発明の編集オリゴヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ、またはジンクフィンガーもしくは操作されたプログラム可能ヌクレアーゼなどのタンパク質を伴わずに利用され得る。ＣＲＩＳＰＲおよび／またはジンクフィンガーを利用する方法は、ＣＲＩＳＰＲ内のガイドＲＮＡではないが別々の一本鎖オリゴヌクレオチドである一本鎖オリゴヌクレオチドを、部位を修復するためのドナーとして使用している。しかしながら、本発明の方法および組成物は、これらの他の外因性タンパク質成分を厳密に必要とせず、現行の方法と同様または実質的に同様の効率の精確な編集をもたらす。
本発明は、潜在的に危険な切断をＤＮＡ内に作り出すことなく、変異体配列を直接かつ正確に修復するため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ジンクフィンガー、およびＴａｌｅｎ ＤＮＡ編集手法とは異なる核酸修復手法である。加えて、本発明は、任意選択により、送達粒子または免疫原性タンパク質を用いずに投与されてもよい。
本発明は、転写を防止する所望の位置において、部位特異的変異、例えば終止コドンを作り出すことによって、任意の遺伝子をサイレンシングするために利用され得る。しかしながら、本発明の独自の適用形態の１つは、他の既知のサイレンシング方法では対処することができない、遺伝子の機能を調整または補正する点変異（例えば、優性変異により生じる機能獲得型変異）を標的にすることである。
競合遺伝子療法およびｍＲＮＡ置換方略などの他の手法は、変異遺伝子産物を置き換えることができる。しかしながら、本発明は、ベクター配列の組み込み、またはベクター挿入部位における染色体の損傷を引き起こすことなく、完全に正常な遺伝子の制御および発現レベルを達成するという利点を有する。
上述の方法のいずれも、本明細書におけるある特定の他の方法と組み合わせて使用しても、またはそのような組み合わせで使用しなくてもよいことは理解されよう。さらに、上述の組成物のいずれも、任意選択により、本明細書に記載のある特定の方法と共に使用することができる。
ＶＩＩ．実施例
表１および図２は、本発明の編集オリゴヌクレオチドの実施例を記載する。表１図２における編集オリゴヌクレオチド配列は、緑色蛍光タンパク質中のヌル変異を標的にし、この変異を補正して、蛍光のアッセイにより容易に監視することのできる機能性配列にする（Ｅｒｉｎ Ｅ．ＢｒａｃｈｍａｎおよびＥｒｉｃ Ｂ．Ｋｍｉｅｃ（上記））。これらの化学修飾パターンは、変異を標的にする編集オリゴヌクレオチド、保護的アレルを作り出す編集オリゴヌクレオチド、または他の望ましいゲノムの変化を作り出す編集オリゴヌクレオチドに適用することができる。これらの実施例の各事例において、開示される配列により既に決定されていない場合、また本発明の他の実施形態において、編集部位は、編集オリゴヌクレオチドの中央領域内にあってもよく、または、５’末端もしくは３’末端の方に片寄っていてもよい。好ましい実施形態において、編集部位は、いずれかの末端から５ヌクレオチド超離れている。各事例において、未修飾であるか、または修飾されている場合は、依然として細胞のＤＮＡ修復および複製機構によりＤＮＡと認識される保存的修飾（すなわち、ホスホロチオエートまたは５’メチルＣを有する、ＤＮＡの領域内の編集部位を有することが好ましい場合もある。
編集オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡのいずれかの鎖に相補的であるように設計され得る。それらは、ラギング鎖合成のために鋳型鎖に結合するように設計されることが好ましく、それは、これがより効率的な編集をもたらす傾向があるためである。しかしながら、各鎖が標的にされてもよく、どの鎖がより効率的な編集をもたらすかは容易に判定することができる。
図２は、表１のいくつかのオリゴヌクレオチドからのデータを示す。Ｇｅｎ ３Ａは、オリゴヌクレオチド１０００１３番および１０００１４番であり、Ｇｅｎ ３Ｂは、オリゴヌクレオチド１０００１５番および１０００１６番であり、Ｇｅｎ ３Ｃは、オリゴヌクレオチド１０００１７番および１０００１８番であり、Ｇｅｎ １は、オリゴヌクレオチド１００００３番および１００００４番であり、Ｇｅｎ ２は、オリゴヌクレオチド１００００５番および１００００６番である。
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図２および表１の実験に用いられた方法
Ａ． 細胞株および培養条件
ＨＣＴ１１６細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から取得した。ＨＣＴ１１６－１９は、変異ｅＧＦＰ遺伝子を含有するｐＥＧＦＰ－Ｎ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を組み入れることによって作り出された。変異ｅＧＦＰ遺伝子は、非機能性ｅＧＦＰタンパク質を生じる１６７位のナンセンス変異を有する。これらの実験では、１０％のウシ胎仔血清、２ｍＭのＬ－グルタミン、および１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したマッコイ５Ａ改変培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）中で、ＨＣＴ１１６－１９細胞を培養した。細胞は、３７℃および二酸化炭素５％に維持した。
Ｂ． ＨＣＴ１１６－１９細胞のトランスフェクション
同調細胞を利用した実験では、ＨＣＴ１１６－１９細胞を１００ｍｍの皿に２．５×１０６細胞で播種し、標的化の前に６ｍＭアフィディコリンで２４時間同調させた。細胞を４時間（または指示された時間）にわたって遊離させ、その後、ＰＢＳ（２／２）で洗浄し、完全増殖培地を添加することによって、トリプシン処理およびトランスフェクションを行った。ＨＣＴ１１６－１９細胞を同調させたものと同調させていないものとに、４ｍｍギャップのキュベット（ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ，Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，ＵＴ）内で５×１０５細胞／１００ｕｌの濃度において、トランスフェクションを行った。Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸＣｅｌｌ（商標）電気穿孔システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、一本鎖オリゴヌクレオチドを電気穿孔した（２５０Ｖ、ＬＶ、１３ｍｓパルス長、２パルス、１秒間隔）。次いで、完全増殖培地を含む６ウェルプレートにおいて、細胞を３７℃で指示された時間にわたって回復させ、その後分析した。遺伝子編集された細胞の分析。Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ５ ＨＴ（商標）フローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）によって、蛍光（ｅＧＦＰ）を測定した。細胞をトリプシン処理により採取し、ＰＢＳで１回洗浄し、緩衝液（０．５％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含むＰＢＳ）中に再懸濁させた。ヨウ化プロピジウムを使用して、細胞生存率をそのように測定し、生存細胞はＰＩ（取り込み）に対して陰性に染色する。補正効率は、各試料中の全生細胞と比べた全ｅＧＦＰ陽性生細胞の割合として計算した。エラーバーは、標準誤差の計算値を使用して３セットのデータ点から生成される。
例１
ＡからＩへの変換のための２’－デオキシウリジン－ＮＯＣ－１８接合体を含む編集オリゴヌクレオチドの合成（Ｇ模倣体、図３Ａ～Ｃ）。
５’－ジメトキシトリチル－（Ｅ）－５－（カルボメトキシビニル）－２’－デオキシウリジン－３’－ホスホラミダイトを、国際公開第２０１３１５０９０２号に記載のように調製する。５－カルボキシビニル－２’－デオキシウリジン残基を含有するオリゴヌクレオチド（図３Ａ）を、ヌクレオシドホスホラミダイト構成要素を使用した標準的な自動オリゴヌクレオチド合成により調製する。このオリゴヌクレオチドに、１つ以上の所望の位置で、５’－ジメトキシトリチル－（Ｅ）－５－（カルボメトキシビニル）－２’－デオキシウリジン－３’－ホスホラミダイトを組み込む。このオリゴヌクレオチドを、室温で１時間にわたり０．５Ｍの水性水酸化ナトリウムを用いる処理、続いて５０℃で３時間にわたり濃水酸化アンモニウムを用いる処理によって、脱保護する。粗製オリゴヌクレオチドを、アニオン交換と逆相ＨＰＬＣとの組み合わせによって単離させ、精製する。配列および構造を質量分析によって確認する。
１μｍｏｌのオリゴヌクレオチドを、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５～１０．０）中で、２０μｍｏｌの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）および２０μｍｏｌのＮＯＣ－１８と共にインキュベートすることによって、１－ヒドロキシ－２－オキソ－３，３－ビス（２－アミノエチル）－１－トリアゼン（ＮＯＣ－１８）（Ａｌｄｒｉｃｈ；カタログ番号Ａ５５８１、図１Ｂ）を、オリゴヌクレオチド内の１個以上の５’－ジメトキシトリチル－（Ｅ）－５－（カルボメトキシビニル）－２’－デオキシウリジン残基に接合させる。ＥＤＡＣを２μｍｏｌに分けて１０分毎に添加する。反応が完了した後、２’－デオキシウリジン－ＮＯＣ－１８接合体（図３Ｃ）を、アニオン交換と逆相ＨＰＬＣとの組み合わせによって単離させ、精製する。配列および構造を質量分析によって確認する。
例２
ＡからＩへの変換（Ｇ模倣体）およびＣからＵへの変換のための３，５－ペンタン酸－ＮＯＣ－１８接合体を含むオリゴヌクレオチドの合成
Ａ． ５－（４，４’－ジメトキシトリチル）－ペンタン酸エチルエステル３－ホスホラミダイトの合成（図４）
１． ３，５－ビス－Ｏ，Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）ペンタン酸の調製（図４Ａ）
３，５－ジヒドロキシペンタン酸を、室温で１２時間にわたり、２．２当量の塩化ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ－Ｃｌ）を含むピリジンで処理する。この混合物を、減圧下で蒸発させる。この残渣を精製せずに次のステップで使用する。
２． ３，５－ビス－Ｏ，Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）ペンタン酸エチルエステルの調製（図４Ｂ）
粗製３，５－ビス－Ｏ，Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）ペンタン酸を、無水ピリジンと無水エタノールとの混合物（９：１）中に溶解させる。５モル当量のＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミドを添加し、この混合物を室温で４時間撹拌する。この溶液を濾過し、濾液を蒸発させる。この粗製生成物を次のステップで使用する。
３． ３－ヒドロキシ－５－（４，４’－ジメトキシトリチル）－ペンタン酸エチルエステルの調製（図４Ｃ）
３，５－ビス－Ｏ，Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）ペンタン酸エチルエステルを、１Ｍのフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を含むテトラヒドロフラン中に溶解させ、室温で２４時間撹拌する。この混合物を蒸発させ、無水ピリジン中に溶解させる。塩化４，４’－ジメトキシイトリチル（４，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｙｔｒｉｔｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＤＭＴ－Ｃｌ、１．２当量）を添加し、この混合物を１２時間撹拌する。この生成物をジクロロメタン（ＤＣＭ）／１Ｍ塩化ナトリウムで抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。３－ヒドロキシ－５－（４，４’－ジメトキシトリチル）－ペンタン酸エチルエステルを、ＤＣＭ－メタノール（０．１％ピリジン）でのシリカゲルクロマトグラフィによって精製する。純粋な生成物を含有する留分を合わせ、蒸発させ、高真空で乾燥させる。この化合物の構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
４． ５－（４，４’－ジメトキシトリチル）－ペンタン酸エチルエステル３－ホスホラミダイトの調製（図４Ｄ）
３－ヒドロキシ－５－（４，４’－ジメトキシトリチル）－ペンタン酸エチルエステルをＤＣＭ中に溶解させ、１当量のトリエチルアミンおよび１．１当量の２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトを添加する。２時間後、この混合物を蒸発させ、残渣を酢酸エチル中に溶解させる。粗製の１－（４，４－ジメトキシトリチル）－２－［２－リフルオロアセト（ｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔ）－アミド］エチル－３－ホスホラミダイトを、０．１％のピリジンを含有するヘキサン－酢酸エチルでのシリカゲルクロマトグラフィによって精製する。純粋な生成物を含有する留分を合わせ、蒸発させ、高真空で乾燥させる。この化合物の構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
Ｂ． 内部ペンタン酸残基に結合したカルボン酸基を含有するオリゴヌクレオチドの合成
１個以上の内部ペンタン酸残基を含有するオリゴヌクレオチドを、ヌクレオシドホスホラミダイト構成要素を使用した標準的な自動オリゴヌクレオチド合成により調製する。５－（４，４’－ジメトキシトリチル）－ペンタン酸エチルエステル３－ホスホラミダイトを、１つ以上の所望の位置でオリゴヌクレオチドに組み込むために使用する。このオリゴヌクレオチドを、室温で１時間にわたり０．５Ｍの水性水酸化ナトリウムを用いる処理、続いて５０℃で３時間にわたり濃水酸化アンモニウムを用いる処理によって、脱保護する。粗製オリゴヌクレオチドを、アニオン交換と逆相ＨＰＬＣとの組み合わせによって単離させ、精製する。配列および構造を質量分析によって確認する。
Ｃ． 内部ペンタン酸残基のカルボン酸基を含有するオリゴヌクレオチドに対するＮＯＣ－１８の接合（図５）
ペンタン酸残基を含有する１μｍｏｌのオリゴヌクレオチドを、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５～１０．０）中で、２０μｍｏｌの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）および２０μｍｏｌのＮＯＣ－１８と共にインキュベートすることによって、オリゴヌクレオチドへのＮＯＣ－１８の接合を行う。ＥＤＡＣを２μｍｏｌに分けて１０分毎に添加する。ＮＯＣ－１８－オリゴヌクレオチド接合体を、アニオン交換と逆相ＨＰＬＣとの組み合わせによって単離させ、精製する。配列および構造を質量分析によって確認する。
例３
ＣからＵへの変換のためのＬ－システイン酸接合体を含む編集オリゴヌクレオチドの合成
Ａ． Ｎ２－イソブチリル－７－デアザ－７－アミノメチル－２’－デオキシグアノシンの合成
１． ９－［３’，５’，Ｎ２－トリ（ｔｅｒｔ－ブチル－ジメチルシリル）－β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル］－７－デアザ－７－カルバミド－６－クロロプリンの調製（図６Ａ）
９－［３’，５’，Ｎ２－トリ（ｔｅｒｔ－ブチル－ジメチルシリル）－β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル］－７－デアザ－７－カルボメトキシ－６－クロロプリン（米国特許公開第２０１３／００３５２３７号）を、室温で２４時間にわたり、７Ｍアンモニアメタノール溶液で処理する。この溶液を蒸発させ、粗製の固体を精製せずに次のステップで使用する。
２． ９－β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル－７－デアザ－７－カルバミド－６－クロロプリンの調製（図６Ｂ）
９－［３’，５’，Ｎ２－トリ（ｔｅｒｔ－ブチル－ジメチルシリル）－β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル］－７－デアザ－７－カルバミド－６－クロロプリンを、１ＭのＴＢＡＦを含むテトラヒドロフランで２４時間処理する。この混合物を蒸発させ、粗製のヌクレオシドを逆相ＨＰＬＣによって精製する。この化合物の構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
３． ７－デアザ－７－カルバミド－２’－デオキシグアノシンの調製（図６Ｃ）
９－β－Ｄ－２’－デオキシリボフラノシル－７－デアザ－７－カルバミド－６－クロロプリンを、５モル当量の１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）を含有する水中に溶解させる。この溶液を一晩還流し、粗製のヌクレオシドを逆相ＨＰＬＣによって精製する。化合物の構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
４． ７－デアザ－７－カルバミド－Ｎ２－イソブチリル－２’－デオキシグアノシンの調製（図６Ｄ）
７－デアザ－７－カルバミド－２’－デオキシグアノシンを無水ピリジンと３回同時蒸発させる。この残渣をピリジンと無水イソ酪酸との混合物（３：１）中に溶解させ、結果として生じる混合物を室温で２４時間撹拌する。フラスコを氷水浴中で冷却し、等体積のメタノールをゆっくり添加する。４時間後、この混合物を蒸発させ、残渣をピリジン中に溶解させ、氷水浴中で０℃に冷却し、等体積の１Ｍ水酸化ナトリウムを添加する。２０分後、過剰量のピリジニウム形態のＤｏｗｅｘ樹脂を添加する。この混合物を濾過し、Ｄｏｗｅｘ樹脂を５０％水性ピリジンで洗浄する。この溶液を蒸発させ、粗製の７－デアザ－７－カルバミド－Ｎ２－イソブチリル－２’－デオキシグアノシンを精製せずに次のステップで使用する。
５． ７－デアザ－７－アミノメチル－Ｎ２－イソブチリル－２’－デオキシグアノシンの調製（図６Ｅ）
粗製の７－デアザ－７－カルバミド－Ｎ２－イソブチリル－２’－デオキシグアノシンをメタノール中に溶解させ、厚肉ガラスバイアルに入れる。１０％パラジウム炭素の粉末を添加する。この混合物を、４０ｐｓｉの水素圧力で２４時間撹拌する。この溶液を濾過し、７－デアザ－７－アミノメチル－Ｎ２－イソブチリル－２’－デオキシグアノシンを逆相ＨＰＬＣによって精製する。この化合物の構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
Ｂ． ５’－ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチリル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシグアノシン３’－ホスホラミダイトの合成
１． ５’－ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチリル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシグアノシンの調製（図７Ａ）
７－デアザ－７－アミノメチル－Ｎ２－イソブチリル－２’－デオキシグアノシンを無水ピリジン中に溶解させ、１０モル当量の無水トリフルオロ酢酸を添加する。混合物を室温で１時間撹拌する。フラスコを氷水浴中で０℃に冷却し、等体積のメタノールを添加し、３０分後、この混合物を減圧下で蒸発させる。この混合物を、メタノールとさらに３回、そして無水ピリジンと２回、同時蒸発させる。結果として生じる残渣をピリジン中に溶解させる。
塩化ＤＭＴ（１．２当量）を添加し、この混合物を室温で６時間撹拌する。この混合物を減圧下で蒸発させ、残渣をＤＣＭ中に溶解させる。５’－ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチリル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシグアノシンを、メタノール／ＤＣＭの段階勾配を使用したシリカゲルクロマトグラフィによって精製する。純粋な生成物を含有する留分を合わせ、蒸発させ、高真空で乾燥させる。化合物の構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
２． ５’－ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチリル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシグアノシン３’－ホスホラミダイトの調製（図７Ｂ）
ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチリル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシグアノシンをＤＣＭ中に溶解させ、１当量のトリエチルアミンおよび１．１当量の２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトを添加する。２時間後、この混合物を回転蒸発装置で蒸発させ、残渣を酢酸エチル中に溶解させる。粗製の５’－ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチリル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシグアノシン３’－ホスホラミダイトを、０．１％のピリジンを含有するヘキサン－酢酸エチルでのシリカゲルクロマトグラフィによって精製する。純粋な生成物を含有する留分を合わせ、蒸発させ、高真空で乾燥させる。化合物の構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
Ｃ． １－（４，４－ジメトキシトリチル）－２－［２－トリフルオロアセトアミド］エチル－３－ホスホラミダイトの合成
１． ２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－［４－ヒドロキシ－３－（ヒドロキシメチル）ブチル］アセトアミドの調製（図８Ａ）
２－（２－アミノエチル）プロパン－１，３－ジオールを、室温で１時間にわたり、過剰量の無水トリフルオロ酢酸を含むピリジンで処理する。等体積のメタノールを添加し、２時間後、この混合物を減圧下で蒸発させ、無水ピリジンと２回同時蒸発させる。この残渣を精製せずに次のステップで使用する。
２． ２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－［４－ジメトキシトリチル－３－（ヒドロキシメチル）ブチル］アセトアミドの調製（図８Ｂ）
粗製の２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－［４－ヒドロキシ－３－（ヒドロキシメチル）ブチル］アセトアミドをピリジン中に溶解させ、１．１モル当量の塩化４，４－ジメトキシトリチルを溶液に添加する。この混合物を室温で４時間撹拌する。この溶液を蒸発させ、この生成物を、０．１％のピリジンを含有するＤＣＭ－メタノールでのシリカゲルクロマトグラフィによって精製する。純粋な生成物を含有する留分を合わせ、蒸発させ、高真空で乾燥させる。化合物の構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
３． １－（４，４－ジメトキシトリチル）－２－［２－トリフルオロアセトアミド］エチル－３－ホスホラミダイトの調製（図８Ｃ）
２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－［４－ジメトキシトリチル－３－（ヒドロキシメチル）ブチル］アセトアミドをＤＣＭ中に溶解させ、１当量のトリエチルアミンおよび１．１当量の２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトを添加する。２時間後、この混合物を蒸発させ、残渣を酢酸エチル中に溶解させる。粗製の１－（４，４－ジメトキシトリチル）－２－［２－リフルオロアセト－アミド］エチル－３－ホスホラミダイトを、０．１％のピリジンを含有するヘキサン－酢酸エチルでのシリカゲルクロマトグラフィによって精製する。純粋な生成物を含有する留分を合わせ、蒸発させ、高真空で乾燥させる。化合物の構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
Ｄ． ２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－（２，２，５－トリオキソオキサチオラン－４－イル）アセトアミドの合成（図９）
Ｌ－システイン酸（Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０１２，Ｖ．４７，ｐｐ．５２９－５３８）を、大過剰の無水トリフルオロ酢酸を含むピリジンで数時間処理する。この混合物を蒸発させ、ピリジンと２回、そしてトルエンと２回、同時蒸発させる。この粗製生成物を精製せずに使用する。
Ｅ． ＣからＵへの変換のための内部一級アミノ基を含むオリゴヌクレオチドの合成
７－デアザ－７－アミノメチル－２’－デオキシグアノシン残基または２－（２－アミノエチル）－１，３－プロピレン残基を含有するオリゴヌクレオチドを、ヌクレオシドホスホラミダイト構成要素を使用した標準的な自動オリゴヌクレオチド合成により調製する。５’－ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチリル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシグアノシン３’－ホスホラミダイトまたは１－（４，４－ジメトキシトリチル）－２－［２－トリフルオロアセトアミド］エチル－３－ホスホラミダイトを、１つ以上の特定の位置でオリゴヌクレオチドに組み込むために使用する。このオリゴヌクレオチドを、５０℃で３時間にわたり濃水酸化アンモニウムを用いる処理によって脱保護する。粗製オリゴヌクレオチドを、アニオン交換と逆相ＨＰＬＣとの組み合わせによって単離させ、精製する。構造および配列を質量分析によって確認する。
Ｆ． 一級アミノ基を含むオリゴヌクレオチドに対する２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－（２，２，５－トリオキソオキサチオラン－４－イル）アセトアミドの接合（図１０）
一級アミノ基を含有するオリゴヌクレオチドのトリエチルアンモニウム塩を乾燥ＤＭＦ中に溶解させ、１０モル過剰の２，２，２－トリフルオロ－Ｎ－（２，２，５－トリオキソオキサチオラン－４－イル）アセトアミドを添加する。この混合物を５０℃で一晩撹拌する。この混合物を５体積の１００ｍＭ ＴＥＡＢで希釈し、アニオン交換と逆相クロマトグラフィとの組み合わせによって精製する。
例４
ＧからＯ６－Ｍｅ－Ｇへの変換のための２－デオキシシチジン－ニトロソアルキル接合体を含むオリゴヌクレオチド（Ａ模倣体）の合成
１． ５’－ジメトキシトリチル－５－（Ｅ）－（３－トリフルオロアセトアミドアリル）－Ｎ４－ホルムアミジン－２’－デオキシシチジンの調製（図１１Ａ）
５－（Ｅ）－（３－トリフルオロアセトアミドアリル）－Ｎ４－ホルムアミジン－２’－デオキシシチジン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１１，Ｖ．５２，ｐｐ．１８１－１８３）を無水ピリジン中に溶解させ、塩化ＤＭＴ（１．２当量）を添加する。この混合物を室温で６時間撹拌する。この混合物を減圧下で蒸発させ、残渣をＤＣＭ中に溶解させる。粗製の５’－ジメトキシトリチル－５－（Ｅ）－（３－トリフルオロアセトアミドアリル）－Ｎ４－ホルムアミジン－２’－デオキシシチジンを、メタノール／ＤＣＭの段階勾配を使用したシリカゲルクロマトグラフィによって精製する。純粋な生成物を含有する留分を合わせ、蒸発させ、高真空で乾燥させる。ヌクレオシドの構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
２． ５’－ジメトキシトリチル－５－（Ｅ）－（３－トリフルオロアセトアミドアリル）－Ｎ４－ホルムアミジン－２’－デオキシシチジン３’－ホスホラミダイトの調製（図１１Ｂ）
５’－ジメトキシトリチル－５－（Ｅ）－（３－トリフルオロアセトアミドアリル）－Ｎ４－ホルムアミジン－２’－デオキシシチジンをＤＣＭ中に溶解させ、１当量のトリエチルアミンおよび１．１当量の２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトを添加する。２時間後、この混合物を回転蒸発装置で蒸発させ、残渣を酢酸エチル中に溶解させる。粗製の５’－ジメトキシトリチル－Ｅ－５－（２－カルベトキシビニル）－Ｎ４－ベンゾイル－２’－デオキシシチジン３’－ホスホラミダイトを、０．１％のピリジンを含有するヘキサン－酢酸エチルでのシリカゲルクロマトグラフィによって精製する。純粋な生成物を含有する留分を合わせ、蒸発させ、高真空で乾燥させる。ヌクレオシドの構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
３． ４－［［メチル（ニトロソ）アミノ］メトキシ］－４－オキソ－ブタン酸の合成
ヒドロキシメチルメチルニトロソアミン（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙカタログ番号ＫＳＴ－１４２５９９５１）をピリジン中に溶解させ、１．１当量の無水コハク酸を添加する。この混合物を４時間撹拌する。この粗製生成物をヘキサンで沈殿させ、次のステップで使用する。
４． ４－［［メチル（ニトロソ）アミノ］メトキシ］－４－オキソ－ブタン酸のＮＨＳエステルの合成（図１２）
４－［［メチル（ニトロソ）アミノ］メトキシ］－４－オキソ－ブタン酸をピリジン中に溶解させ、１当量のＮ－ヒドロキシスクシンイミドを添加する。その混合物に、３当量のＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジアミドを添加する。この混合物を室温で８時間撹拌する。この混合物を濾過し、粗製生成物をヘキサンで沈殿させ、次のステップで使用する。
５． ＧからＯ６－ＭｅＧへの変換のための内部一級アミノ基を含むオリゴヌクレオチドの合成
５－アミノアリル－２’－デオキシシチジン残基または２－（２－アミノエチル）－１，３－プロピレン残基を含有するオリゴヌクレオチドを、ヌクレオシドホスホラミダイト構成要素を使用した標準的な自動オリゴヌクレオチド合成により調製する。５’－ジメトキシトリチル－５－（Ｅ）－（３－トリフルオロアセトアミドアリル）－Ｎ４－ホルムアミジン－２’－デオキシシチジン３’－ホスホラミダイトまたは１－（４，４－ジメトキシトリチル）－２－［２－トリフルオロアセトアミド］エチル－３－ホスホラミダイトを、１つ以上の特定の位置でオリゴヌクレオチドに組み込むために使用する。このオリゴヌクレオチドを、５０℃で３時間にわたり濃水酸化アンモニウムを用いる処理によって脱保護する。粗製オリゴヌクレオチドを、アニオン交換と逆相ＨＰＬＣとの組み合わせによって単離させ、精製する。構造および配列を質量分析によって確認する。
６． 一級アミノ基を含むオリゴヌクレオチドに対する４－｛［メチル（ニトロソ）アミノ］メトキシ｝－４－オキソ－ブタン酸のＮＨＳエステルの接合
（図１３）
一級アミノ基を含有する修飾オリゴヌクレオチドをＤＭＦ－０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（１：３）混合物中に溶解させ、１０モル過剰の４－［［メチル（ニトロソ）アミノ］メトキシ］－４－オキソ－ブタン酸のＮＨＳエステルを添加する。混合物を室温で２時間撹拌する。この混合物を５体積の１００ｍＭ ＴＥＡＢで希釈し、オリゴヌクレオチド－４－［［メチル（ニトロソ）アミノ］メトキシ］－４－オキソ－ブタン酸接合体を、アニオン交換と逆相クロマトグラフィとの組み合わせによって精製する。非ヌクレオシド単位を含むオリゴヌクレオチドは、ＧからＯ６－ＭｅＧへの変換アデノシン模倣体）のため、またはＵからＯ４－ＭｅＵへの変換（シチジン模倣体）のために使用することができる。
例５
ＵからＯ４－Ｍｅ－Ｕへの変換のための２’－デオキシアデノシン－ニトロソ－Ｎ－メチル接合体を含む編集オリゴヌクレオチド（シチジン模倣体）の合成
Ａ． ７－デアザ－７－アミノメチル－Ｎ－ベンゾイル－５’－ＤＭＴ－ｄＡ－ホスホラミダイトの合成
１． ７－デアザ－７－カルボキサミド－Ｎ６－ベンゾイル－２’－デオキシアデノシンの調製（図１４Ａ）
２’－デオキシサンギバマイシン（Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｍｅｍ．１９８３，ｖｏｌ．２６ ｐｐ．２５－２９）を無水ピリジンと３回同時蒸発させる。次いでこの残渣をピリジンと塩化ベンゾイルとの混合物（９：１）中に溶解させ、結果として生じる混合物を室温で２４時間撹拌する。フラスコを氷水浴中で冷却し、等体積のメタノールをゆっくり添加する。メタノールを添加したら、この混合物を１時間静置させる。この溶液を蒸発させ、粗製の７－デアザ－７－カルボキサミド－Ｎ６－ベンゾイル－２’－デオキシアデノシンを、メタノール／ＤＣＭの段階勾配を使用したシリカゲルクロマトグラフィによって、または代替的に、アセトニトリル／１００ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウム勾配での逆相ＨＰＬＣによって精製する。純粋な生成物を含有する留分を合わせ、蒸発させ、高真空で乾燥させる。ヌクレオシドの構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
２． ７－デアザ－７－アミノメチル－Ｎ６－ベンゾイル－２’－デオキシアデノシンの調製（図１４Ｂ）
７－デアザ－７－カルボキサミド－Ｎ６－ベンゾイル－２’－デオキシアデノシンを、室温で１２時間にわたり、水素化ジイソブチルアルミニウム（３モル当量）を含むＴＨＦの１Ｍ溶液で処理する。この混合物を、勢いよく撹拌したロッシェル塩溶液（１．２Ｍの水性酒石酸カリウムナトリウム）中に注ぐ。この溶液を２時間勢いよく撹拌し、混合物をＤＣＭで抽出する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させる。粗製の７－デアザ－７－アミノメチル－Ｎ６－ベンゾイル－２’－デオキシアデノシンを、アセトニトリル／１００ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウム勾配での逆相クロマトグラフィによって精製する。純粋な７－デアザ－７－アミノメチル－Ｎ６－ベンゾイル－２’－デオキシアデノシンを含有する留分を合わせ、蒸発させ、メタノールと、そして無水ピリジンと２回、同時蒸発させる。
３． ５’－ジメトキシトリチル－Ｎ６－ベンゾイル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシアデノシンの調製（図１４Ｃ）
７－デアザ－７－アミノメチル－Ｎ６－ベンゾイル－２’－デオキシアデノシンを無水ピリジン中に溶解させ、１０モル当量の無水トリフルオロ酢酸を添加する。混合物を室温で１時間撹拌する。フラスコを氷水浴中で０℃に冷却し、等体積のメタノールを添加し、３０分後、この混合物を減圧下で蒸発させる。この混合物を、メタノールと３回、そして無水ピリジンと２回、同時蒸発させる。この残渣をピリジン中に溶解させる。
塩化ＤＭＴ（１．２当量）を添加し、この混合物を室温で６時間撹拌する。次いでこの混合物を減圧下で蒸発させ、残渣をＤＣＭ中に溶解させる。５’－ジメトキシトリチル－Ｎ６－ベンゾイル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシアデノシンを、メタノール／ＤＣＭの段階勾配を使用したシリカゲルクロマトグラフィによって精製する。純粋な生成物を含有する留分を合わせ、蒸発させ、高真空で乾燥させる。ヌクレオシドの構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
４． ５’－ジメトキシトリチル－Ｎ６－ベンゾイル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシアデノシン３’－ホスホラミダイトの調製（図１４Ｄ）
５’－ジメトキシトリチル－Ｎ６－ベンゾイル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシアデノシンをＤＣＭ中に溶解させ、１当量のトリエチルアミンおよび１．１当量の２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホラミダイトを添加する。２時間後、この混合物を回転蒸発装置で蒸発させ、残渣を酢酸エチル中に溶解させる。粗製の５’－ジメトキシトリチル－Ｎ６－ベンゾイル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシアデノシン３’－ホスホラミダイトを、０．１％のピリジンを含有するヘキサン－酢酸エチルでのシリカゲルクロマトグラフィによって精製する。純粋な生成物を含有する留分を合わせ、蒸発させ、高真空で乾燥させる。ヌクレオシドの構造を、ＮＭＲおよび質量分析によって確認する。
Ｂ． ＵからＯ４－Ｍｅ－Ｕへの変換のための内部一級アミノ基を含むオリゴヌクレオチドの合成
７－デアザ－７－アミノメチル－２’－デオキシアデノシン残基または２－（２－アミノエチル）－１，３－プロピレン残基を含有するオリゴヌクレオチドを、ヌクレオシドホスホラミダイト構成要素を使用した標準的な自動オリゴヌクレオチド合成により調製する。５’－ジメトキシトリチル－Ｎ６－ベンゾイル－７－デアザ－７－（トリフルオロアセトアミド）メチル－２’－デオキシアデノシン３’－ホスホラミダイトまたは１－（４，４－ジメトキシトリチル）－２－［２－トリフルオロアセトアミド］エチル－３－ホスホラミダイトを、１つ以上の特定の位置でオリゴヌクレオチドに組み込むために使用する。このオリゴヌクレオチドを、５０℃で３時間にわたり濃水酸化アンモニウムを用いる処理によって脱保護する。粗製オリゴヌクレオチドを、アニオン交換と逆相ＨＰＬＣとの組み合わせによって単離させ、精製する。構造および配列を質量分析によって確認する。
Ｃ． 一級アミノ基を含むオリゴヌクレオチドに対する４－［［メチル（ニトロソ）アミノ］メトキシ］－４－オキソ－ブタン酸のＮＨＳエステルの接合（図１５）
一級アミノ基を含有する修飾オリゴヌクレオチドをＤＭＦ－０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（１：３）混合物中に溶解させ、１０モル過剰の４－［［メチル（ニトロソ）アミノ］メトキシ］－４－オキソ－ブタン酸のエステルを添加する。この混合物を室温で２時間撹拌する。次いでこの混合物を５体積の１００ｍＭ炭酸水素トリエチルアンモニウムで希釈し、オリゴヌクレオチド－４－［［メチル（ニトロソ）アミノ］メトキシ］－４－オキソ－ブタン酸接合体を、アニオン交換と逆相クロマトグラフィとの組み合わせによって精製する。
例６
ニトロソアミンメチル化基を含有する編集オリゴヌクレオチドを使用した、ｍＲＮＡにおけるＵからＯ４－Ｍｅ－Ｕへの変換スキーム（図１６）
１つの概略的な合成法の一例を図１６に示す。
例７
ニトロソアミンメチル化基を含有する編集オリゴヌクレオチドを使用した、ｍＲＮＡにおけるＧからＯ６－Ｍｅ－Ｇへの変換スキーム（図１７）
１つの概略的な合成法の一例を図１７に示す。
例８
亜硫酸水素塩生成基を含有する編集オリゴヌクレオチドを使用した、ｍＲＮＡにおけるＣからＵへの変換スキーム（図１８）
１つの概略的な合成法の一例を図１８に示す。
例９
編集オリゴヌクレオチドの長さおよび位置決めの最適化のためのプロセス
編集オリゴヌクレオチドが編集部位のおよそ中央（中央の編集部位）に位置するように編集オリゴヌクレオチドを位置付けることは、典型的にいくらかのレベルの編集効率をもたらすが、それは必ずしも最適とは限らない。変異補正、または他の標的配列変化を標的にする（例えば、特定の保護的アレルを作り出す）とき、全体的な標的部位は、所望の配列変化の位置によって決定される。この場合、任意選択の長さの最適化、および標的部位に沿った編集オリゴヌクレオチドの５’－３’位置決めは、いくぶんか拘束され、次のように行うことができる。ＤＮＡ標的の場合、編集オリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖を標的にするように設計することができる。ＲＮＡ標的の場合、編集オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに対して相補的にのみ設計することができる。ＤＮＡを標的にする場合とＲＮＡを標的にする場合との両方において、最適化は、標的変異上のおよそ中央に位置する親編集オリゴヌクレオチドから開始することができる。この編集オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載される化学修飾パターンのうちの１つを有することができる。好ましくは、部位のスクリーニングのために使用される最初の編集オリゴヌクレオチドは、長さならびに５’および３’の位置決めが単純に変化してもよい、簡素な末端ブロック修飾パターンを有し得る。標的核酸塩基の化学修飾により機能する編集オリゴヌクレオチドの場合、その塩基修飾活性は、標的核酸塩基の付近に位置したままである必要がある。
完全または部分的な不活性化のための遺伝子を標的にする場合、その遺伝子に沿った標的部位の選択は拘束が大幅に少なく、その遺伝子に沿って１つまたは多くの標的部位を使用およびスクリーニングのために選択することができる。例えば、ほとんどの遺伝子は、コード配列に沿った様々な配列のうちの１つにおいて中途終止コドンを作り出すことによって、完全または部分的に不活性化される。編集オリゴヌクレオチドは、これらの標的部位のうちの１つ以上に対して生成され、細胞または生物において、相対的な編集効率、そして場合により特異性について試験され得る。この初期スクリーニングに基づいて最も望ましい特性を有するいくつかの編集オリゴヌクレオチドが、以下に記載される位置および長さの最適化に供され得る。
ＤＮＡ標的では、約４０～約７２ヌクレオチドの長さを有する編集オリゴヌクレオチドから開始することが好ましい。ＲＮＡを標的にする場合、１８～２５ヌクレオチドの編集オリゴヌクレオチドから開始することが好ましい。次いで、この編集オリゴヌクレオチドは、５’方向および３’方向に１～約１０ヌクレオチドの増分でシフトされ得る。結果として生じる各配列を細胞または生物における活性について試験して、編集効率そしてまた潜在的な編集特異性を判定することができる。これらの結果に基づいて、最適な位置（複数可）を決定することができる。この第１回目の最適化から所望される編集効率範囲の編集オリゴヌクレオチド配列から開始して、編集オリゴヌクレオチド配列は、１～約２０ヌクレオチドの増分で５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端との両方において、標的に相補的な塩基を付加するか、または除去することによって、長さを改変され得る。有効性および潜在的な特異性に関する細胞または生物における追加の試験は、１つのリードまたは複数のリードの編集オリゴヌクレオチド配列をもたらす。代替的に、親配列から開始して長さがまず最適化されてもよく、次いで、結果として生じるリード（複数可）が、編集オリゴヌクレオチドを５’および／または３’方向にシフトすることによってさらに最適化されてもよい。
最適化された長さ、鎖（アンチセンスまたはセンス）、および５’－３’位置決めが決定されたら（または、このプロセスが行われない場合は、非最適化オリゴヌクレオチド配列を起点として使用することができる）、所望の有効性を有する任意の編集オリゴヌクレオチド配列は、化学修飾パターンに関して変更され、細胞または生物において試験され得る。最適化中に親編集オリゴヌクレオチドの長さを増加または減少させる場合、５’編集セグメント、編集部位、および３’編集セグメントは、長さおよび編集部位に対する位置付けが同じまたは実質的に同じのままである一方で、５’近位セグメントおよび３’近位セグメントは、長さが増加または減少することが好ましい。代替的に、５’末端セグメント、５’近位セグメント、３’近位セグメント、および３’末端セグメントは、長さおよび編集オリゴヌクレオチドの末端に対する位置が同じまたは実質的に同じのままであり、５’編集セグメントおよび３’編集セグメントは、長さが増加または減少する。

Claims (49)

  1. 細胞または個体内のゲノム配列を修飾する方法であって、
    前記ゲノム配列の編集を補助する追加の外因性タンパク質または核酸を用いずに、前記細胞または前記個体に、一本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチドを導入するステップを含み、前記修飾（複数可）が、１個以上の骨格修飾（複数可）、糖修飾（複数可）、および／または核酸塩基修飾（複数可）であり、前記オリゴヌクレオチドが、前記ゲノム配列内の標的配列に実質的に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドの前記修飾が、未修飾オリゴヌクレオチドまたは各末端上に３個のホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼ安定性を増加させることによって、編集の効率を上昇させる、方法。
  2. 前記一本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチドが、薬学的担体を含む薬学的組成物である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記薬学的担体が、水、食塩水、または生理緩衝食塩水である、請求項２に記載の方法。
  4. 医学的状態の治療を必要とする個体の健康を改善する方法であって、
    前記ゲノム配列の編集を補助する追加のタンパク質または核酸を用いずに、個体に、一本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記修飾が、ホスホロチオエート骨格修飾であり、前記オリゴヌクレオチドが、前記ゲノム配列内の標的配列に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドの前記修飾が、未修飾オリゴヌクレオチドまたは各末端上に３個のホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼ安定性を増加させることによって、編集の効率を上昇させる、方法。
  5. 医学的状態の治療を必要とする個体における前記状態を低減させるか、または排除するための方法であって、
    前記ゲノム配列の編集を補助する追加のタンパク質または核酸を用いずに、個体に、一本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチドを投与することを含み、前記修飾が、ホスホロチオエート骨格修飾であり、前記オリゴヌクレオチドが、前記ゲノム配列内の標的配列に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドの前記修飾が、未修飾オリゴヌクレオチドまたは各末端上に３個のホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼ安定性を増加させることによって、編集の効率を上昇させる、方法。
  6. 前記投与が、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、または静脈内注射によるものである、請求項４～５に記載の方法。
  7. 前記投与が、経皮送達、エアロゾル吸入、直腸坐剤、または膣坐剤によるものである、請求項４～５に記載の方法。
  8. 標的核酸内の変異ヌクレオチドを野生型ヌクレオチドに復帰させるための方法であって、
    前記ゲノム配列の編集を補助する追加のタンパク質または核酸を用いずに、前記変異ヌクレオチドを有するかもしくは有する疑いのある細胞または個体に、一本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチドを投与するステップを含み、前記修飾が、ホスホロチオエート骨格修飾であり、前記オリゴヌクレオチドが、前記ゲノム配列内の標的配列に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドの前記修飾が、未修飾オリゴヌクレオチドまたは各末端上に３個のホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼ安定性を増加させることによって、編集の効率を上昇させ、前記変異ヌクレオチドのうち少なくとも１つが、前記野生型ヌクレオチドに復帰する、方法。
  9. 標的核酸内の変異コドンの非変異ヌクレオチドを修飾して、野生型コドンを生成するための方法であって、
    前記ゲノム配列の編集を補助する追加のタンパク質または核酸を用いずに、前記変異コドンを有するかもしくは有する疑いのある個体に、一本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチドを投与するステップを含み、前記修飾が、ホスホロチオエート骨格修飾であり、前記オリゴヌクレオチドが、前記ゲノム配列内の標的配列に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドの前記修飾が、未修飾オリゴヌクレオチドまたは各末端上に３個のホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼ安定性を増加させることによって、編集の効率を上昇させ、前記変異コドンが、前記野生型コドンになるように修飾される、方法。
  10. 標的核酸内の終止コドンをリードスルー非野生型コドンに変換するための方法であって、
    前記ゲノム配列の編集を補助する追加のタンパク質または核酸を用いずに、前記終止コドンを有するかもしくは有する疑いのある個体に、一本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチドを投与するステップを含み、前記修飾が、ホスホロチオエート骨格修飾であり、前記オリゴヌクレオチドが、前記ゲノム配列内の標的配列に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドの前記修飾が、未修飾オリゴヌクレオチドまたは各末端上に３個のホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼ安定性を増加させることによって、編集の効率を上昇させ、前記終止コドンが、前記リードスルー非野生型コドンになるように修飾される、方法。
  11. 標的核酸内の変異コドンを修飾して、疾患を引き起こさないアミノ酸を生じる非野生型コドンを生成するための方法であって、前記ゲノム配列の編集を補助する追加のタンパク質または核酸を用いずに、前記変異コドンを有するかもしくは有する疑いのある個体に、一本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチドを投与するステップを含み、前記修飾が、ホスホロチオエート骨格修飾であり、前記オリゴヌクレオチドが、前記ゲノム配列内の標的配列に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドの前記修飾が、未修飾オリゴヌクレオチドまたは各末端上に３個のホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼ安定性を増加させることによって、編集の効率を上昇させ、前記変異コドンが、疾患を引き起こさないアミノ酸を生じる非野生型コドンになるように修飾される、方法。
  12. タンパク質をコードする核酸を修飾して、前記タンパク質の活性を調整するための方法であって、
    前記ゲノム配列の編集を補助する追加の外因性タンパク質または核酸を用いずに、個体に、一本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチドを投与するステップを含み、前記修飾が、ホスホロチオエート骨格修飾であり、前記オリゴヌクレオチドが、前記ゲノム配列内の標的配列に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドの前記修飾が、未修飾オリゴヌクレオチドまたは各末端上に３個のホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼ安定性を増加させることによって、編集の効率を上昇させ、前記タンパク質の活性が調整される、方法。
  13. 変異タンパク質をコードする核酸を修飾して、その疾患を引き起こす作用を抑制するための方法であって、前記ゲノム配列の編集を補助する追加の外因性タンパク質または核酸を用いずに、個体に、一本鎖の化学修飾オリゴヌクレオチドを投与するステップを含み、前記修飾が、ホスホロチオエート骨格修飾であり、前記オリゴヌクレオチドが、前記ゲノム配列内の標的配列に相補的であり、前記オリゴヌクレオチドの前記修飾が、未修飾オリゴヌクレオチドまたは各末端上に３個のホスホロチオエートを有するオリゴヌクレオチドと比較してヌクレアーゼ安定性を増加させることによって、編集の効率を上昇させ、前記変異タンパク質の疾患を引き起こす作用が、減少するか、抑制されるか、または排除される、方法。
  14. 前記疾患が、ベータサラセミア、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、またはハーラー症候群である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記医学的状態が、アルツハイマー病、乳がん素因変異、嚢胞性線維症デルタ５０８変異、２型糖尿病（標的遺伝子ＰＴＰ－１Ｂ）、家族性自律神経障害、家族性高コレステロール血症（ＰＣＳＫ９）、卵巣がん素因変異、鎌状赤血球症、および脊髄性筋萎縮症から成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記医学的状態が、２型糖尿病であり、前記編集オリゴヌクレオチドが、前記ＰＴＰ－１Ｂ遺伝子を標的にする、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記鎌状赤血球症が、鎌状赤血球貧血である、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記医学的状態が、アデノシンデアミナーゼ欠損症、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アミロイド病、ベッカー型筋ジストロフィー、カナバン病、シャルコー・マリー・トゥース病、嚢胞性線維症、１型糖尿病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ファブリー病、家族性大腸腺腫症、家族性アミロイド心筋症、家族性アミロイド多発ニューロパチー、フリートライヒ運動失調症、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ、糖原貯蔵障害ＩＩ型、ＧＭ２ガングリオシドーシス、血色素症、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、フェニルケトン尿症、多嚢胞性腎疾患、プリオン病、老人性全身性アミロイドーシス、スミス・レムリ・オピッツ症候群、ウィルソン病、および遺伝性盲目から成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  19. 標的核酸の部位特異的修飾のための編集オリゴヌクレオチドであって、
    Figure 2022008651000039



    オリゴヌクレオチド


    の構造を含み、式中、
    各オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸に実質的に相補的であり、約１０～約５０ヌクレオチドであり、
    Ｘが、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｒ１、ＳＲ１、またはＯＲ１であり、
    ハロゲンが、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、またはＩであり、
    Ｒ１が、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、または－ＣＨ２ＯＣＨ３である、編集オリゴヌクレオチド。
  20. 標的核酸の部位特異的修飾のための編集オリゴヌクレオチドであって、
    Figure 2022008651000040
    の構造を含み、式中、
    各オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸に実質的に相補的であり、約１０～約５０ヌクレオチドであり、
    Ｘが、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｒ１、ＳＲ１、またはＯＲ１であり、
    ハロゲンが、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、またはＩであり、
    Ｒ１が、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、または－ＣＨ２ＯＣＨ３である、編集オリゴヌクレオチド。
  21. 標的核酸の部位特異的修飾のための編集オリゴヌクレオチドであって、
    Figure 2022008651000041
    の構造を含み、式中、
    各オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸に実質的に相補的であり、約１０～約５０ヌクレオチドであり、
    Ｘが、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｒ１、ＳＲ１、またはＯＲ１であり、
    ハロゲンが、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、またはＩであり、
    Ｒ１が、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、または－ＣＨ２ＯＣＨ３である、編集オリゴヌクレオチド。
  22. 標的核酸の部位特異的修飾のための編集オリゴヌクレオチドであって、
    Figure 2022008651000042
    の構造を含み、式中、
    各オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸に実質的に相補的であり、約１０～約５０ヌクレオチドであり、
    Ｘが、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｒ１、ＳＲ１、またはＯＲ１であり、
    ハロゲンが、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、またはＩであり、
    Ｒ１が、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ３、または－ＣＨ２ＯＣＨ３である、編集オリゴヌクレオチド。
  23. 標的核酸の部位特異的修飾のための編集オリゴヌクレオチドであって、
    Figure 2022008651000043
    の構造を含み、式中、各オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸に実質的に相補的であり、約１０～約５０ヌクレオチドである、編集オリゴヌクレオチド。
  24. 標的核酸の部位特異的修飾のための編集オリゴヌクレオチドであって、
    Figure 2022008651000044
    の構造を含み、式中、各オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸に実質的に相補的であり、約１０～約５０ヌクレオチドである、編集オリゴヌクレオチド。
  25. 標的核酸の部位特異的修飾のための編集オリゴヌクレオチドであって、
    Figure 2022008651000045
    の構造を含み、式中、各オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸に実質的に相補的であり、約１０～約５０ヌクレオチドである、編集オリゴヌクレオチド。
  26. 前記各オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のホスホジエステル、少なくとも１個のホスホトリエステル、少なくとも１個のメチルホスホネート、少なくとも１個のホスホロチオエート、またはメチルホスホロチオエートヌクレオシジル間リンカーを含む、請求項１９～２５に記載の編集オリゴヌクレオチド。
  27. 前記各オリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のボラノホスフェートヌクレオチド間結合、アルキルホスホトリエステルヌクレオチド間結合、モルホリノヌクレオチド間結合、非架橋ジアルキルホスホロアミデートヌクレオチド間結合、架橋３’－ＮＨ－もしくは５’－ＮＨ－ヌクレオチド間結合、架橋３’－Ｓ－もしくは５’－Ｓ－ヌクレオチド間結合、架橋３’－ＣＨ２－もしくは５’－ＣＨ２－ヌクレオチド間結合、または架橋３’－アミド（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）もしくは５’－アミド（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－）ヌクレオチド間結合を含む、請求項１９～２５に記載の編集オリゴヌクレオチド。
  28. 前記標的核酸が、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１９～２５に記載の編集オリゴヌクレオチド。
  29. 前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項２８に記載の編集オリゴヌクレオチド。
  30. 薬学的担体と、請求項１９～２５に記載の１つ以上の編集オリゴヌクレオチドと、を含む、薬学的組成物。
  31. 前記薬学的担体が、水、食塩水、または生理緩衝食塩水である、請求項３０に記載の薬学的組成物。
  32. 請求項１９～２５に記載の編集オリゴヌクレオチドを含有する細胞。
  33. 医学的状態の治療を必要とする個体の健康を改善する方法であって、請求項１９～２５に記載の編集オリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含有する組成物を前記個体に投与することを含む、方法。
  34. 医学的状態の治療を必要とする個体における前記状態を低減させるか、または排除するための方法であって、請求項１９～２５に記載の編集オリゴヌクレオチドを少なくとも１つ含有する組成物を前記個体に投与することを含む、方法。
  35. 前記投与が、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、または静脈内注射によるものである、請求項３３～３４に記載の方法。
  36. 前記投与が、経皮送達、エアロゾル吸入、直腸坐剤、または膣坐剤によるものである、請求項３３～３４に記載の方法。
  37. 標的核酸内の変異ヌクレオチドを野生型ヌクレオチドに復帰させるための方法であって、
    前記変異ヌクレオチドを有するかもしくは有する疑いのある細胞または個体に、請求項１９～２５に記載のオリゴヌクレオチドプローブを投与するステップを含み、前記変異ヌクレオチドのうち少なくとも１つが、前記野生型ヌクレオチドに復帰する、方法。
  38. 標的核酸内の変異コドンの非変異ヌクレオチドを修飾して、野生型コドンを生成するための方法であって、
    前記変異コドンを有するかもしくは有する疑いのある細胞または個体に、請求項１９～２５に記載のオリゴヌクレオチドプローブを投与するステップを含み、前記変異コドンが、前記野生型コドンになるように修飾される、方法。
  39. 標的核酸内の終止コドンをリードスルー非野生型コドンに変換するための方法であって、
    前記終止コドンを有するかもしくは有する疑いのある細胞または個体に、請求項１９～２５に記載のオリゴヌクレオチドプローブを投与するステップを含み、前記終止コドンが、前記リードスルー非野生型コドンになるように修飾される、方法。
  40. 標的核酸内の変異コドンを修飾して、疾患を引き起こさないアミノ酸を生じる非野生型コドンを生成するための方法であって、
    前記変異コドンを有するかもしくは有する疑いのある細胞または個体に、請求項１９～２５に記載のオリゴヌクレオチドプローブを投与するステップを含み、前記変異コドンが、疾患を引き起こさないアミノ酸を生じる非野生型コドンになるように修飾される、方法。
  41. タンパク質を修飾して、前記タンパク質の活性を調整するための方法であって、
    細胞または個体に、請求項１９～２５に記載のオリゴヌクレオチドプローブを投与するステップを含み、前記タンパク質の活性が調整される、方法。
  42. 変異タンパク質を修飾して、その疾患を引き起こす作用を抑制するための方法であって、
    細胞または個体に、請求項１９～２５に記載のオリゴヌクレオチドプローブを投与するステップを含み、前記変異タンパク質の疾患を引き起こす作用が、減少するか、抑制されるか、または排除される、方法。
  43. 前記標的核酸が、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項３７～４２に記載の方法。
  44. 前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記疾患が、ベータサラセミア、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、またはハーラー症候群である、請求項４３に記載の方法。
  46. 前記医学的状態が、アルツハイマー病、乳がん素因変異、嚢胞性線維症デルタ５０８変異、２型糖尿病（標的遺伝子ＰＴＰ－１Ｂ）、家族性自律神経障害、家族性高コレステロール血症（ＰＣＳＫ９）、卵巣がん素因変異、鎌状赤血球症、および脊髄性筋萎縮症から成る群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  47. 前記医学的状態が、２型糖尿病であり、前記編集オリゴヌクレオチドが、前記ＰＴＰ－１Ｂ遺伝子を標的にする、請求項３４に記載の方法。
  48. 前記鎌状赤血球症が、鎌状赤血球貧血または鎌形赤血球症である、請求項４６に記載の方法。
  49. 前記医学的状態が、アデノシンデアミナーゼ欠損症、アルファ１アンチトリプシン欠損症、アミロイド病、ベッカー型筋ジストロフィー、カナバン病、シャルコー・マリー・トゥース病、嚢胞性線維症、１型糖尿病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ファブリー病、家族性大腸腺腫症、家族性アミロイド心筋症、家族性アミロイド多発ニューロパチー、フリートライヒ運動失調症、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ、糖原貯蔵障害ＩＩ型、ＧＭ２ガングリオシドーシス、血色素症、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病Ｃ、ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、フェニルケトン尿症、多嚢胞性腎疾患、プリオン病、老人性全身性アミロイドーシス、スミス・レムリ・オピッツ症候群、ウィルソン病、および遺伝性盲目から成る群から選択される、請求項３４に記載の方法。
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