JP2022001880A - タンパク質汚れの迅速検出のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】表面上のタンパク質または生物膜の存在について迅速に試験するための組成物及び方法を提供し、その結果として、タンパク質含有の汚れまたは生物膜で表面が汚れているか否かに関する標示を提供する。
【解決手段】表面上のタンパク質または生物膜の存在を検出するための方法は、組成物を表面に適用することと、タンパク質または生物膜が表面上に存在する場合に、呈色反応を観察することとを含む。組成物は、硫酸銅を含む第１の部分と、タンパク質または生物膜と接触したときに、硫酸銅と反応して可視呈色反応を引き起こすことのできる試薬を含む第２の部分とを含む。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、ＰＣＴ国際出願として２０１７年２月８日に提出され、２０１６年２月９日に提出された米国仮出願第６２／２９３，１１８号に対する優先権の利益を主張し、該米国仮出願はその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は、タンパク質系の汚れ及び生物膜の検出のための組成物及び方法に関する。具体的には、本開示は、表面上のタンパク質汚れまたは生物膜の迅速な検出に使用され得る組成物及び方法に関する。本開示は、さらに、洗浄方法を改善及び開発し、かつ洗浄方法について人員を訓練するために本開示の組成物を使用するための方法に関する。

洗浄手順の有効性は、例えば、食料サプライチェーン及び医療施設において、効果的に殺菌するため、かつ微生物汚染を削減するために重要である。例えば、食品調理及び食品保管場所または患者の治療場所で使用する洗浄手順は、細菌、ウイルス、及び他の微生物を寄生させ得る、または害虫を引き付け得る様々な汚れを除去するために十分であるべきである。

汚れの存在が自動的に病原菌の存在を意味するものではないが、汚れた表面は、清潔な表面よりも病原菌を寄生させやすく、害虫を引き付ける場合がある。しかしながら、洗浄方法は、表面上の全ての汚れを除去するのに常に完全に効果的であるとは限らない。洗浄方法が、いくつかの汚れを除去するのに非効率的である可能性があり、洗浄スタッフが、洗浄手順に従わない場合があり、または本方法で使用する用具もしくは化学薬品が、非効率的である場合がある。

本開示は、この背景に照らしてなされるものである。

表面上のタンパク質または生物膜の存在を検出するための方法は、組成物を表面に適用することと、タンパク質または生物膜が表面上に存在する場合に、呈色反応を観察することとを含む。組成物は、硫酸銅を含む第１の部分と、タンパク質または生物膜と接触したときに、硫酸銅と反応して可視呈色反応を引き起こすことのできる試薬を含む第２の部分とを含む。組成物は、１１．５未満のｐＨを有する。

様々な汚れ及び／または病原菌の存在について試験するためのいくつかの方法が存在する。しかしながら、これらの方法の多くは、訓練を受けた研究員、高額もしくは複雑な設備、及び／または結果を受け取るまでの長い待ち時間を必要とする。ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）及び細菌培養等のいくつかの方法は、表面を試験するためにスワブに依存する。しかしながら、これらの試験方法は、スワブ塗布（ｓｗａｂｂｅｄ）された場所を試験するだけであるため、表面全体の有機物または細菌についての標示を提供しない。さらに、これらの試験は、偽陽性を提供すること、ならびに誤った結果を提供する一般的に使用される洗浄化学薬品及び用具と相互関係を有することが知られている。さらに、スワブまたは培養による結果は、スワブを行う人が使用する特有の技術に応じて変化し得る。大きな表面積を被覆するためには、多数のスワブが必要となり、これにより試験方法が極めて高額になる。

生物膜の存在を検出するために使用するいくつかの方法は、過酸化水素を含有する液体組成物を噴霧することによって数分以内に結果を提供する。過酸化水素は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＬｉｓｔｅｒｉａまたはＥ．ｃｏｌｉ等のカタラーゼ酵素に陽性である微生物と反応して、微生物が十分なレベルで存在する場合に気体を生成し得る。しかしながら、試験は、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉまたはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ等のカタラーゼ陰性の有機体を検出することができない。

ビウレット反応に基づく様々なアッセイ（例えば、スミスアッセイ、ローリータンパク質アッセイ、ブラッドフォードタンパク質アッセイ、ＰＩＥＲＣＥ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイ）は、液体試料中のタンパク質を定量的に測定するための確実な方法として知られている。ビウレット反応は、Ｃｕ^２＋からＣｕ^１＋への還元、ならびに銅と着色複合体を形成する化合物とのＣｕ^１＋の反応を伴う。例えば、アッセイのうちのいくつかは、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）塩、銅（ＩＩ）塩、及び酒石酸ナトリウムの強アルカリ性溶液を使用し、これらは、タンパク質の存在下で紫色を発生させる。しかしながら、そのアッセイを使用することは、訓練を受けた研究員及び比色デバイス（例えば、ＵＶ−ＶＩＳリーダ）を備えた研究所を必要とする。アッセイは、一般的には、呈色反応が生じるまでの潜伏時間（例えば、３０分以上）を含む。ビウレットアッセイキットは、例えば、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．より市販されている。

本開示は、表面上のタンパク質または生物膜の存在について迅速に試験するための組成物及び方法を提供し、その結果として、タンパク質含有の汚れまたは生物膜で表面が汚れているか否かに関する標示を提供する。また、組成物及び方法は、タンパク質及び生物膜を適正洗浄で除去するべきであることから、洗浄有効性の監視の一部としても使用され得る。洗浄プログラムの一部として使用する場合、組成物及び方法は、表面上のタンパク質及び生物膜の存在の監視、洗浄手順の有効性に関するフィードバックの提供、洗浄手順の開発または改善、及び適正洗浄手順における洗浄人員の訓練に適切である。

実施形態によると、方法は、組成物を表面上に適用することと、呈色反応を観察することとを含む。組成物は、概して、噴霧、霧化、スワブ塗布（ｓｗａｂｂｉｎｇ）、スポンジ塗布（ｓｐｏｎｇｉｎｇ）、滴下、注出、拭き取り、または任意の他の適切な方法によって適用され得る。組成物は、適用時に混合される２液型溶液、または適用前に調製される１液型溶液であってもよい。１液型溶液は、適用前（例えば、数分以内または最大１週間以内）に現場で調製され得るか、または調製済み溶液であり得る。

方法及び組成物は、処理工場、商業用キッチン、企業用キッチン、食品保管場所、フルサービス及び迅速サービスのレストラン、カフェテリア、食料品店、ならびに家庭用キッチン及び食品保管場所等の食品及び飲料処理施設ならびにサービス機関で使用され得る。例えば、方法及び組成物は、食肉加工工場、レストランのキッチン、または食料品店のデリカデッセン（「デリ」）における洗浄手順を監視するために使用され得る。方法及び組成物は、さらに、病院、診療所、ならびに他の医療及び長期ケア施設等の医療背景において使用され得る。例えば、方法及び組成物は、手術室、緊急治療室、病室、または他の場所におけるタンパク質及び生物膜を検出するために使用され、その結果として、表面が汚れているという標示を提供し得る。

組成物は、硬表面及びいくつかの多孔質表面または軟表面を含む様々な表面に適用され得る。表面は、粗面、平滑面、または研摩面を含み得る。組成物が適用され得る表面の例として、金属、硬質プラスチック、柔軟なプラスチック、木材、処理木材、複合材、石材、ゴム、及び繊維が挙げられる。

ある実施形態によると、組成物がタンパク質または生物膜と反応すると、組成物は、組成物の表面への適用の約６０秒以下以内、約１０秒以内、約５秒以内、約３秒以内、約２秒以内、または約０．５〜約４５秒、または約１〜約３０秒、もしくは約１〜約１０秒以内に色を発生させる。組成物は、表面に適用され得、呈色反応は、タンパク質または生物膜が存在する場所に発生する。実施形態の少なくともいくつかでは、その色は、ヒトの目に可視的であり、経時的により強くなってもよい（例えば、より暗くまたはより濃くもしくはより飽和した）。例えば、その色は、約２〜３秒で可視的になり始めてもよく、次の１０秒〜１２０秒の間にわたって濃さが増してもよい。

実施形態では、組成物は、表面上に存在するタンパク質または生物膜と接触したときに呈色反応を発生させる活性成分を含む。組成物は、第１の部分及び第２の部分を含んでもよく、これらは、タンパク質または生物膜の存在下で呈色反応を形成する。第１の部分及び第２の部分は、適用時または適用直前に混合される２液型溶液として別々に提供され得るか、または１液型溶液として提供され得る。組成物は、さらに、濃縮液としてまたは使用溶液として提供されてもよい。水または別の水溶液等の適切な希釈剤で濃縮組成物（１液型または２液型に関わらず）を希釈して、使用前に使用溶液を形成してもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、水性溶媒等の適切な溶媒に粉末を溶解することによって調製され得る粉末濃縮物として提供される。

いくつかの実施形態では、第１の部分は、水和硫酸銅（ＩＩ）（例えば、硫酸銅（ＩＩ）五水和物または別の適切な水和物）の水溶液を含む。１液型使用溶液は、約０．００５〜１．０重量％、約０．０１〜０．５重量％、約０．０２〜０．２重量％、または約０．０５〜０．１重量％の水和硫酸銅（ＩＩ）を含んでもよい。組成物が２液型溶液として提供される場合、硫酸銅を含む第１の部分は、約０．０１〜０．５重量％、約０．０５〜０．３重量％、約０．１０〜０．２５重量％、または約０．１２〜０．１８重量％の水和硫酸銅（ＩＩ）を含んでもよい。第１の部分は、さらに、酒石酸もしくはその塩（例えば、酒石酸ナトリウム）、ヨウ化物（例えば、ヨウ化カリウム）、金属水酸化物または炭酸塩等のアルカリ性供給源等の安定剤、ならびに緩衝剤（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、及び重炭酸ナトリウム、またはクエン酸及びクエン酸ナトリウム）を含んでもよい。

第２の部分は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）もしくはその塩、サリチル酸もしくはその塩、３−ヒドロキシフラボン、またはある特定の有機酸及びその塩等の、Ｃｕ^１＋と反応し、かつ着色生成物を形成することのできる試薬の水溶液を含んでもよい。適切な有機酸の例として、アスコルビン酸、クエン酸、またはベンゼン環構造を有する有機酸が挙げられる。一実施形態では、有機酸は、銅イオンをキレートすることができる。Ｃｕ^１＋と反応するように意図される試薬の量は、硫酸銅（ＩＩ）の量に基づいて調整され得る。また、第２の部分と混合される第１の部分の量も、調整され得る。２液型溶液の第１の部分は、硫酸銅の銅隔離剤（例えば、ＢＣＡ）に対する比率が重量基準で約１０：１〜１：２０、約５：１〜１：１５、約１：１〜１：１０、または約１：３〜１：７になるように、第２の部分と混合される。好適な実施形態では、硫酸銅の銅隔離剤（例えば、ＢＣＡ）に対する比率は、約１：３〜１：４．５である。いくつかの実施形態では、２液型溶液の第２の部分は、約０．２〜約３．０重量％、約０．４〜約２．０重量％、または約０．５〜約１．５重量％の、Ｃｕ^１＋と反応できる試薬を含んでもよい。第２の部分は、さらに、金属水酸化物または炭酸塩、酒石酸またはその塩（例えば、酒石酸ナトリウム）等のアルカリ性供給源、ならびに緩衝剤（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、及び重炭酸ナトリウム、またはクエン酸及びクエン酸ナトリウム）を含んでもよい。組成物が１液型溶液として調製される場合、組成物は、約０．０５〜約３．０重量％、約０．１〜約２．０重量％、または約０．２〜約１．５重量％の、Ｃｕ^１＋と反応できる試薬を含んでもよい。

組成物が噴霧のために２液型溶液として提供される実施形態では、第１の部分及び第２の部分の相対量を調整して、呈色反応の速度を調整することができる。

一例示的実施形態では、第１の部分は、約０．１５重量％のビウレットで調製され、第２の部分は、約１．０重量％のＢＣＡで調製される。第１の部分及び第２の部分は、２チャンバ式噴霧ボトルを使用して適用され、この場合、第１の部分は一方のチャンバにあり、第２の部分は別のチャンバにある。第１の部分及び第２の部分は、組成物がボトルから噴霧されるときに、適用時に混合される。噴霧ボトルは、約５０：１〜約１：３、または１：１、１．５：１、１．８５：１、２：１、２．２５：１、２．５：１、３：１、４：１等のその間の任意の比率で、第１の部分及び第２の部分を引き込むように調整される。一実施形態では、噴霧比率は、約１．８５：１に調整される。別の実施形態では、噴霧比率は、約１．５：１に調整され、さらに別の実施形態では、約２．２：１に調整される。例示的実施形態における溶液及び活性成分（硫酸銅及び銅隔離剤、例えば、ＢＣＡ）の量を、以下の表１に示す。

組成物（例えば、第１の部分及び第２の部分、またはその混合配合）のｐＨは、約８以上、例えば、約８〜約１３．５、約８．５〜約１３、約９〜約１２．５、約９．５〜約１２、約１０〜約１１．５、または約１０．５〜約１１．４の範囲であってもよい。好ましくは、組成物のｐＨは、手袋、ゴーグル、保護衣服等の個人用保護具（「ＰＰＥ」）無しで組成物を使用することができるようにするものである。ＰＰＥは、一般的に、約ｐＨ１１．５以上の溶液を取り扱う場合に必要とされる。ゆえに、ある実施形態によると、組成物のｐＨは、１１．５未満である。一実施形態では、組成物のｐＨは、約１０．８〜１１．４である。組成物のｐＨは、酸または塩基等の一般的なｐＨ調整剤を含むことによって調整され得る。適切な酸は、カルボン酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロパン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、アセチルサリチル酸、マンデル酸等）等の有機酸、及び鉱酸（例えば、リン酸、硝酸、塩酸、硫酸）等の無機酸を含む。適切な塩基は、例えば、アルカリ金属水酸化物（例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ）、炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム）を含む。

いくつかの実施形態では、組成物は、追加の薬剤を含んでもよい。例えば、組成物は、希釈剤、可溶化剤、安定剤、界面活性剤、発泡剤、乳化剤、レオロジー改質剤、着色剤、香料等を含んでもよい。
実施形態によると、組成物は、１つ以上の希釈剤を含む。適切な希釈剤は、例えば、水、アルコール、グリコールエーテル、または他の水溶性有機溶媒を含む。適切なアルコールの例として、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、グリコール、プロパンジオール、及びブタンジオールが挙げられる。希釈剤は、可溶化剤としての役割も果たしてもよい。

適切な安定剤の例として、重炭酸、炭酸塩、酒石酸カリウムナトリウム及びその水和物（有機酸塩）、ヨウ化カリウム、二塩基酸、ならびにそれらの組み合わせ等のアルカリ金属塩、水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウム及びそれらの組み合わせ等のアルカリ金属水酸化物が挙げられる。

また、組成物は、非イオン性、アニオン性、または両性界面活性剤等の適切な界面活性剤も含んでもよい。アニオン性界面活性剤には、親水性基上に負電荷を持つもの、または、ｐＨが中性以上に上昇されない限り分子の疎水性区分が電荷を担持しない界面活性剤（例えばカルボン酸）が含まれる。アニオン性界面活性剤は、屈水性効果のため、または雲り点制御のために、洗浄界面活性剤、ゲル化系または増粘系の一部としてのゲル化剤、可溶化剤として使用され得る。大規模な商業用のアニオン性界面活性剤の大部分は、当業者に既知であり、“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ，”Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ＆Ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．１０４（２）７１−８６（１９８９）に記載されている、５つの主要な化学的クラス及びさらなる下位群に細分され得る。第１のクラスは、アシルアミノ酸（及び塩）、例えば、アシルグルアメート（ａｃｙｌｇｌｕｔａｍａｔｅｓ）、アシルペプチド、サルコシネート（例えば、Ｎ−アシルサルコシネート）、タウレート（例えば、Ｎ−アシルタウレート、及びメチルタウリド（ｍｅｔｈｙｌ ｔａｕｒｉｄｅ）の脂肪酸アミド）等を含む。第２のクラスは、カルボン酸（及び塩）、例えば、アルカン酸（及びアルカノエート）、エステルカルボン酸（例えば、コハク酸アルキル）、エーテルカルボン酸等を含む。第３のクラスは、リン酸エステル及びそれらの塩を含む。第４のクラスは、スルホン酸（及び塩）、例えば、イセチオナート（例えば、アシルイセチオナート）、アルキルアリールスルホナート、アルキルスルホナート、スルホスクシナート（例えば、スルホスクシナートのモノエステル及びジエステル）等を含む。第５のクラスは、硫酸エステル（及び塩）、例えば、硫酸アルキルエーテル、硫酸アルキル等を含む。

有用な非イオン界面活性剤は、概して、有機疎水性基及び有機親水性基の存在を特徴とし、一般的には、有機脂肪族、アルキル芳香族、またはポリオキシアルキレン疎水性化合物と、一般的には、エチレンオキシドまたはその多水和生成物（ｐｏｌｙｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ）、例えば、ポリエチレングリコールである親水性アルカリ性オキシド部分との縮合によって生成される。適切な非イオン性界面活性剤の例としては、アルキル−、アリール−、及びアリールアルキル−アルコキシレート、アルキルポリグリコシド及びこれらの誘導体、アミン及びこれらの誘導体、ならびにアミド及びこれらの誘導体が挙げられる。さらなる有用な非イオン性界面活性剤としては、界面活性剤分子の一部としてポリアルキレンオキシドポリマーを有するものが挙げられる。このような非イオン性界面活性剤としては、例えば、塩素、ベンジル、メチル、エチル、プロピル、ブチル、及び他のアルキルでキャップされた、脂肪アルコールのポリオキシエチレン及び／またはポリオキシプロピレングリコールエーテル；アルキルポリグリコシド等のポリアルキレンオキシド不含非イオン性物質；ソルビタン及びスクロースのエステルならびにそれらのエトキシレート；アルコキシル化エチレンジアミン；例えばアルコールエトキシレートプロポキシレート、アルコールプロポキシレート、アルコールプロポキシレートエトキシレートプロポキシレート、アルコールエトキシレートブトキシレート等のアルコールアルコキシレート；グリセロールエステル、ポリオキシエチレンエステル、脂肪酸のエトキシル化及びグリコールエステル等のカルボン酸エステル；ジエタノールアミン縮合物、モノアルカノールアミン縮合物、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のカルボン酸アミド；ならびにエトキシル化アミン及びエーテルアミン、ならびに他の同様の非イオン性化合物が挙げられる。シリコーン界面活性剤も使用され得る。ポリアルキレンオキシドポリマー部分を有する非イオン性界面活性剤としては、１〜約２０個のエチレンオキシド基を有するＣ６〜Ｃ２４アルコールエトキシレートの非イオン性界面活性剤；１〜約１００個のエチレンオキシド基を有するＣ６〜Ｃ２４アルキルフェノールエトキシレート；１〜約２０個のグリコシド基を有するＣ６〜Ｃ２４アルキルポリグリコシド；Ｃ６〜Ｃ２４脂肪酸エステルエトキシレート、プロポキシレート、またはグリセリド；及びＣ４〜Ｃ２４モノまたはジアルカノールアミドが挙げられる。

両性及び双性界面活性剤としては、第二級及び第三級アミンの誘導体、複素環式第二級及び第三級アミンの誘導体、または第四級アンモニウムの誘導体、第四級ホスホニウムもしくは第三級スルホニウム化合物が挙げられる。アンモニウム、ホスホニウム、またはスルホニウム化合物は、脂肪族置換基、例えば、アルキル、アルケニル、もしくはヒドロキシアルキル；アルキレンまたはヒドロキシアルキレン；またはカルボキシレート、スルホネート、サルフェート、ホスホネート、もしくはホスフェート基で置換され得る。

組成物は、腐食防止剤を含んでもよい。例えば、組成物は、アルミニウム表面の保護に役立つように、アルカリ金属ケイ酸塩等のケイ酸塩、またはリン酸エステルを含んでもよい。

溶液は、任意選択で、１つ以上のレオロジー改質剤（例えば、増粘剤またはゲル化剤）を含んでもよい。適切な無機増粘剤は、概して、コロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウム、コロイド粘土（Ｂｅｎｔｏｎｉｔｅｓ）、またはヒュームドシリカ等の化合物である。適切な天然ヒドロゲル増粘剤は、トラガカント、カラヤ、及びアカシアゴム等の錯アニオン性多糖類の塩、ならびにカラギーナン、ローカストビーンガム、グアーガム、及びペクチン等の抽出物、またはキサンタンガム等の純培養発酵生成物を含む。適切な合成天然系の増粘剤は、アルキル及びヒドロキシルアルキルセルロース、具体的には、メチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びカルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体を含む。増粘剤としての使用に適切な合成石油系の水溶性ポリマーは、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリアクリル酸及びポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ならびにポリエチレンイミンを含む。

組成物は、任意選択で、様々な染料、香料、及び他の美観向上剤を含んでもよい。好適な染料は、ＦＤ＆Ｃ染料、Ｄ＆Ｃ染料等を含む。

いくつかの実施形態によると、組成物は、適用時に混合される２液型溶液であってもよく、第１の部分及び第２の部分を含む。２つの部分は、使用前に容器中（例えば、ボトル）で混合され得るか、または２チャンバ式噴霧ボトルのノズルもしくは噴霧ノズル等のアプリケータ自体で混合され得る。代替として、組成物は、適用前（例えば、適用前最大１または２週間）に調製される１液型溶液として提供され得るか、または調製済み溶液であり得る。

組成物は、噴霧ボトルに提供され、噴霧によって適用されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、２チャンバ式噴霧ボトルに提供され、この場合、第１の部分は一方のチャンバにあり、第２の部分は別のチャンバにある。第１の部分及び第２の部分は、組成物がボトルから噴霧されるときに、適用時に混合される。また、組成物は、単一チャンバ式噴霧ボトルにも提供されてもよく、この場合、第１の部分及び第２の部分は混合される。組成物は、代替として、ワイプ、ドロッパー、アプリケータ先端（例えば、スポンジ先端）付きのアンプル、試験ストリップ、またはより大きい面積への適用のためのポンプ及び噴霧ノズル付きの容器に提供されてもよい。

組成物は、概して、噴霧、霧化、発泡、スポット適用、滴下、注出、拭き取り、スワブ塗布、または任意の他の適切な方法によって適用され得る。

いくつかの実施形態では、組成物は、スワブとの使用のために提供され得る。例えば、２液型溶液のうちの一方の部分は、スワブ上に含浸され、他方の部分は、別々に提供され得る（例えば、ボトル、噴霧ボトル、ドロッパー、または事前に湿らせたパッドに）。次いで、組成物は、試験表面をスワブでスワブ塗布し、かつ他方の部分をスワブに適用することによって、または他方の部分を試験表面上に噴霧し、かつ噴霧された試験表面をスワブでスワブ塗布することによって使用され得る。

いくつかの実施形態では、組成物を訓練プログラムの一部として使用して、洗浄手順を改善してもよい。適正な洗浄化学薬品、用具、及び技術を使用して表面を洗浄する場合、その表面には、洗浄後、タンパク質または生物膜が表面上にないはずである。ゆえに、表面がちょうど洗浄されたところで、表面上のタンパク質または生物膜の存在を標示する変色を本開示の組成物が示す場合、その表面は、洗浄化学薬品、用具、または技術の不良により、部分的に適切に洗浄されていなかった。

本開示の組成物を使用して、訓練プログラムの一部として使用する場合に、全体的な洗浄を改善することができる。例えば、洗浄スタッフは、どの化学薬品をどの適用に使用するか、使用するのに適切な化学的濃度及び量、化学薬品の概算の保存可能期間、及び洗浄溶液を取り替えるべき時期または新しい溶液を使用すべき時期等の、洗浄化学薬品の適正使用について教育を受けることができる。レストラン及び食品工場等のある特定の場所では、洗浄化学薬品は、現場で希釈して溶液を使用する濃縮液として提供されてもよい。使用溶液は、ボトル、バケツ、または噴霧ボトル等の容器に保存されてもよい。経時的に、これらの使用溶液は、溶液が汚れで汚染され、または空気にさらされるためにその有効性を失い得る。さらに、過度に汚れた使用溶液は、実際には、表面の汚染源になり得る。使用溶液を効果的にするために、時々、古い溶液を廃棄し、新しい溶液を調製及び／または使用するべきである。訓練プログラムを使用して、洗浄手順の有効性に関する情報を提供することができる。洗浄用具に関し、洗浄スタッフは、どの適用にどの洗浄用具を使用するかについて、及び洗浄用具をいつ取り替えるかについて教育を受けることができる。レストラン及び食品工場では、一般的に使用される洗浄用具は、洗浄用クロス及びタオル（例えば、マイクロファイバークロス及びタオル）、スクイージー、ブラシ、モップ、バケツ、スクレーパー、スポンジ、及びワイプを含む。経時的に、クロス、タオル、及びワイプ等の洗浄用具は、汚れて汚染源になる場合があり、取り替えるべきである。他の洗浄用具（例えば、スクイージー、スクレーパー）は、損傷する場合があり、効果的にするために取り替える必要がある。洗浄技術に関し、洗浄スタッフは、適正洗浄技術、汚染源、タンパク質及び生物膜汚れ等の教育を受けることができる。

いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法は、監査プログラムと併用して使用することができる。このような監査プログラムは、表面の洗浄後に表面（例えば、表面の既定のリスト上の表面）がタンパク質または生物膜を表面上に有するかを決定し得る。監査プログラムは、合格／不合格点数に基づくシステム等の採点システムを利用し得る。例えば、タンパク質または生物膜の不在は、表面が適切に洗浄されたために「合格」が与えられることを標示し得る。反対に、タンパク質または生物膜の存在は、表面が適切に洗浄されておらず、表面が「不合格」を与えられ得ることを標示し得る。様々な表面に関する合格／不合格点数を集計及び使用して、英数字の等級、点数、または合格／不合格格付けを提供し得る。このような等級、点数、または格付けを個々の洗浄スタッフのメンバーについて収集するか、またはシフト、場所（レストランの場所等）、地形、または企業によって集約し得る。このような等級、点数、または格付けをベースライン点数と比較して傾向を決定し得るか、または他の地形もしくは場所または集約ベンチマークと比較して、同様の設定との比較を提供し得る。手動的に紙を使用して、または電気的にコンピュータアプリケーションを使用して、またはその組み合わせを使用して、点数を収集しかつ集約し得る。

レストランでは、タンパク質または生物膜の存在を決定するための例示的表面として、食品調理表面、食品保管場所及び表面、ならびに食品提供表面が挙げられる。食料品店またはデリでは、タンパク質または生物膜の存在を決定するための例示的表面として、食品調理表面、食品保管場所及び表面、食品提供表面、ならびにディスプレイ場所及び表面が挙げられる。食品工場では、タンパク質または生物膜の存在を決定するための例示的表面として、調理及び食肉解体場所及び設備、製造場所及び設備、梱包場所及び設備の中及びそれに接する表面が挙げられる。食品サービス施設における表面、構造、及びデバイスの例として、調理台、テーブル、棚、トレイ、まな板、容器、冷却器、冷蔵庫、冷凍庫、調理表面、ディスプレイ場所及びケース、食肉解体及び清掃場所、流し台及び周辺の場所、カッター、ミキサー、タンク、押し出し機、コンベヤー、ヒーター、乾燥機、オーブン等の設備、床、排水管、壁のタイル等が挙げられる。病院または医療背景では、タンパク質または生物膜の存在を決定するための例示的表面として、待合室、病室、準備室、手術室の中及びそれに接する表面が挙げられる。医療背景における表面、構造、及びデバイスの例として、調理台、テーブル、棚、トレイ、容器、病室、手術室、準備場所、待合場所、ドア、ドアノブ、ベッド、ベッドの柵、他の家具、手すり、医療及び歯科用設備及び器具、流し台及び周辺の場所、トイレ、便器、シャワー室、床、壁、排水管、洗浄用具、電話、呼び出しボタン、リモートコントロール等が挙げられる。

訓練プログラムまたは評価の一部として使用する場合、ベースライン点数を最初に収集することが望ましい場合がある。ベースライン点数を収集することは、洗浄手順を変更せずに、タンパク質または生物膜の存在に基づいて、対象場所の清浄度を評価及び採点することを伴ってもよい。ベースライン点数を収集した後、正式な訓練プログラムを実施し、洗浄化学薬品、用具、及び／または技術について洗浄人員を訓練してもよい。その後、洗浄点数を再び収集して、洗浄後のタンパク質及び生物膜の汚れの保有率を決定してもよい。進行中の継続的改善工程の一部として、及び新しいスタッフメンバーの訓練の一部として本工程を繰り返して、その表面が洗浄後に汚れたままではないことを確実にすることができる。

訓練プログラムまたは評価の一例示的実施形態では、洗浄された表面は、従業員、管理者、品質保証人員、監査機関、または業者によって試験される。表面は、洗浄毎に、及び／またはランダムな間隔で試験され得る。試験された値を採点して、または閾値と比較して、合格／不合格点数を付けることができ、経時的に監視することができる。洗浄手順に関する訓練は、試験に合格しない場所について、その場所が洗浄しにくい、または不十分に洗浄していたという理由で、繰り返される。試験結果を使用して、洗浄手順及び衛生手順、化学薬品、または設備を調整することもできる。例えば、試験結果の長期監視によって、既存の手順、化学薬品、または設備が所望の結果を達成するには不十分である場所が明らかになり得る。追加の訓練機会を、試験結果の記録に基づいて特定することができる。試験結果を従業員評価の一部として含めてもよく、試験結果を使用して報酬または補償を調整し、洗浄手順及び衛生手順の適正使用を奨励し、かつ肯定的なフィードバックを提供して洗浄人員の士気を高めてもよい。

いくつかの実施形態では、ホーソン効果（監視されているという意識に応じた行動変化）を回避するために、監査を極秘に行うことが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、タンパク質及び生物膜汚れを完全に除去するにはどこの表面をさらに洗浄することができるかに関する視覚的標示をスタッフメンバーに提供するために、洗浄スタッフと共に監査を行うことが望ましい場合がる。例えば、表面の９０％が適切に洗浄されているが、ある場所（隅または届きにくい場所）が日常的に見逃されていることもある。いくつかの実施形態では、極秘及び公然の監査の組み合わせを使用することが望ましい場合があり、この監査では、洗浄スタッフメンバーは洗浄前に監査を受けることに気付いていないが、洗浄が完了すると、洗浄によってタンパク質及び生物膜汚れが効果的に除去されたことを確認するためにスタッフメンバーと監査を行う。

いくつかの実施形態では、組成物は、表面を被覆するように、または試験される表面のかなりの部分（例えば、約７５％以上、または約９０％以上）を被覆するように適用される。組成物は、噴霧、霧化、拭き取り、注出、または場所への適用に適切な任意の他の方法によって適用することができる。一実施形態では、組成物は、表面上のタンパク質または生物膜を阻害（例えば、除去、移動、または再分配）しないように噴霧することによって適用される。呈色反応は、タンパク質または生物膜が表面上に存在する場合に、表面への組成物の適用から約１〜１２０秒以内、または約２〜約６０秒以内、約３〜約４５秒以内、または約３〜約３０秒以内、または約５〜約２０秒以内に観察されてもよい。色は、経時的に暗くなる場合がある。呈色反応は、視覚的に、または色検出器具（例えば、比色計）を使用して観察することができる。

一実施形態では、組成物は、アプリケータ先端、スポンジ、もしくはドロッパーを有する、またはスワブを有するアンプルから組成物を適用することによって、汚れまたは生物膜について表面を抽出検査するように添加される。別の実施形態では、組成物は、組成物で湿らせたワイプで拭き取ることによって適用される。色は、表面上またはワイプ上のいずれかで観察されてもよい。

いくつかの実施形態では、洗浄点数は、データベースに収集され、ベースライン点数と比較した、表面、スタッフメンバー、シフト、場所、企業単位、またはその組み合わせの経時的な洗浄点数を示すレポートを作成するために使用される。これらのレポートを、訓練プログラムの一部として洗浄スタッフと共有することができる。点数は、データベースに手動で入力され得るか、またはスマートフォンのアプリケーション、タブレット、もしくはコンピュータを使用して収集され得る。データ収集のための情報フィールドは、アプリケーションを使用する環境及び収集したいデータに基づいて調整することができる。例えば、アプリケーションまたはソフトウェアプログラムは、従業員、日付、時間、場所、部屋、表面識別、現場、色の結果、是正措置等のデータフィールドを含むことができる。

好適な実施形態では、ＰＰＥ無しで組成物を使用することができるように、かつ水洗浄または簡単な洗い流しで表面から組成物を除去することができるように、組成物は、安全かつ無毒である。

一態様では、本開示の方法は、組成物を表面上に適用することと、呈色反応を観察することとを含む。組成物は、適用時に混合される２液型溶液、または適用前に調製される１液型溶液であってもよい。１液型溶液は、適用前（例えば、数分以内または最大１週間以内）に現場で調製され得るか、または調製済み溶液であり得る。組成物の第１の部分及び第２の部分は、適用時または適用直前に混合される２液型溶液として別々に提供され得るか、または１液型溶液として提供され得る。組成物は、概して、噴霧、霧化、スワブ塗布、スポンジ塗布、滴下、注出、拭き取り、または任意の他の適切な方法によって適用され得る。組成物は、２チャンバ式噴霧ボトルのノズルまたは噴霧ノズル等のアプリケータで混合され得る。第１の部分は、水和硫酸銅（ＩＩ）（例えば、硫酸銅（ＩＩ）五水和物または別の適切な水和物）の水溶液を含んでもよい。１液型使用溶液は、約０．００５〜１．０重量％、約０．０１〜０．５重量％、約０．０２〜０．２重量％、または約０．０５〜０．１重量％の水和硫酸銅（ＩＩ）を含んでもよい。組成物が２液型溶液として提供される場合、硫酸銅を含む第１の部分は、約０．０１〜０．５重量％、約０．０５〜０．３重量％、約０．１０〜０．２５重量％、または約０．１２〜０．１８重量％の水和硫酸銅（ＩＩ）を含んでもよい。第１の部分は、さらに、酒石酸またはその塩（例えば、酒石酸ナトリウム）、ヨウ化物（例えば、ヨウ化カリウム）、金属水酸化物または炭酸塩等のアルカリ性供給源等の安定剤、ならびに緩衝剤（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、及び重炭酸ナトリウム、またはクエン酸及びクエン酸ナトリウム）を含んでもよい。第２の部分は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）もしくはその塩、サリチル酸もしくはその塩、３−ヒドロキシフラボン、またはある特定の有機酸及びその塩等の、Ｃｕ^１＋と反応し、かつ着色生成物を形成することのできる試薬の水溶液を含んでもよい。適切な有機酸の例として、アスコルビン酸、クエン酸、またはベンゼン環構造を有する有機酸が挙げられる。２液型溶液の第１の部分は、硫酸銅の銅隔離剤（例えば、ＢＣＡ）に対する比率が重量基準で約１０：１〜１：２０、約５：１〜１：１５、約１：１〜１：１０、または約１：３〜１：７になるように、第２の部分と混合される。２液型溶液の第２の部分は、約０．２〜約３．０重量％、約０．４〜約２．０重量％、または約０．５〜約１．５重量％の、Ｃｕ^１＋と反応できる試薬を含んでもよい。第２の部分は、さらに、金属水酸化物または炭酸塩、酒石酸またはその塩（例えば、酒石酸ナトリウム）等のアルカリ性供給源、ならびに緩衝剤（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、及び重炭酸ナトリウム、またはクエン酸及びクエン酸ナトリウム）を含んでもよい。組成物が１液型溶液として調製される場合、組成物は、約０．０５〜約３．０重量％、約０．１〜約２．０重量％、または約０．２〜約１．５重量％の、Ｃｕ^１＋と反応できる試薬を含んでもよい。組成物（例えば、第１の部分及び第２の部分、またはその混合配合）のｐＨは、約８〜約１３．５、約８．５〜約１３、約９〜約１２．５、約９．５〜約１２、約１０〜約１１．５、または約１０．５〜約１１．４であってもよい。組成物のｐＨは、カルボン酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロパン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、オクタン酸、ノナン酸、デカン酸、ウンデカン酸、ドデカン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、アセチルサリチル酸、マンデル酸等）、鉱酸（例えば、リン酸、硝酸、塩酸、硫酸）等の無機酸、アルカリ金属水酸化物（例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨ）、及び炭酸塩（例えば、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム）等の一般的なｐＨ調整剤を含むことによって調整され得る。組成物は、希釈剤（例えば、水、アルコール、グリコールエーテル、または他の水溶性有機溶媒）、可溶化剤、安定剤（例えば、重炭酸、炭酸塩、酒石酸カリウムナトリウム及びその水和物、ヨウ化カリウム、二塩基酸、及びそれらの組み合わせ等のアルカリ金属塩）、界面活性剤（例えば、非イオン性、アニオン性、または両性界面活性剤）、発泡剤、乳化剤、レオロジー改質剤、着色剤、香料等の追加の薬剤も含んでもよい。表面上のタンパク質または生物膜に適用されるとき、組成物は、約６０秒以下以内、約１０秒以内、約５秒以内、約３秒以内、約２秒以内、または約０．５〜約４５秒、または約１〜約３０秒、もしくは約１〜約１０秒以内に色を発生させる。本開示の組成物を使用して、訓練プログラムまたは監査プログラムの一部として使用する場合に、全体的な洗浄を改善することができる。プログラムは、採点システムを利用することができる。組成物は、安全かつ無毒であり、かつＰＰＥ無しで使用することができるように調製され得る。

例示的組成物を以下の表２に示す。

実施例１
タンパク質で汚れた表面への組成物の適用について、２重チャンバ式噴霧ボトル（Ｍｅｒｌｉｎ，ＯＲのＤｅａｒｄｏｒｆｆ Ｆｉｔｚｓｉｍｍｏｎｓ Ｃｏｒｐ．より入手可能）を使用して試験した。噴霧ヘッドは、チャンバの各々から引き出される体積の比率を変化させるように構成され得る。各トリガープルは、約０．５〜１．５ｇの噴霧を送る。ボトルの一方のチャンバは、組成物の部分Ａを含有し、他方のチャンバは、部分Ｂを含有した。部分Ａ及び部分Ｂの組成を表３Ａ及び３Ｂに示す。

プラスチック（ＨＤＰＥ）のまな板を、まな板表面の半分に大豆タンパク質を付けて汚した。タンパク質をその表面上で乾燥させた。次いで、１：１、１．５１：１、１．８４：１、２．２１：１、及び１：５０の部分Ａ対部分Ｂの体積比を使用して、まな板表面を組成物で噴霧した。４〜５回のトリガープルを使用して、表面全体を被覆した。

活性成分の濃度は、部分Ａ中の０．１５％の硫酸銅五水和物及び部分Ｂ中の１％のＢＣＡであった。ゆえに、噴霧中の活性成分の比率は、それぞれ、１：６．５８、１：４．４３、１：３，６７、１：３．０５、及び７．１３：１であった。

比率の各々によって、変色が引き起こされた。タンパク質で汚したまな板の側面に紫色が確認された。呈色反応は、１：１の比率を使用して噴霧した後に約１０秒、１．５１：１、１．８４：１、２．２１：１、及び１：５０の比率を使用して噴霧した後に約３秒で開始した。

実施例２
実施例１の組成物の適用について、様々な汚れに関して試験した。２：１の部分Ａ対部分Ｂの比率で、組成物を調製表面上に噴霧した。変色を視覚的に観察し、「＋」（変色発生）または「−」（変色無し）として記録した。汚れの種類及び結果を表４に示す。

調理済みの鶏肉及びチーズは、基質を表面に擦り付けることによって適用した。パン及びチーズは、パン及びチーズの試料の表面上に組成物の滴を適用することによって、試験した。液体試料（ジュース、殺菌剤、ハンドソープ）を表面上に適用し、試験前に乾燥させた。

調理済みの鶏肉、ジュース、細菌コロニー、パン、チーズ、及び生物膜の全てが陽性結果をもたらしたことが観察された。殺菌剤及びハンドソープは組成物に反応しなかった。

実施例３
実施例１（部分Ａ及び部分Ｂ）の組成物を、異なる種類の汚れの検出について試験した。２：１（部分Ａ対部分Ｂ）に設定した噴霧比で、２チャンバ式噴霧ボトルを使用して組成物を噴霧した。プラスチック表面及びステンレス鋼表面の両方で試験を行い、可視汚れ及び不可視汚れの両方について試験した。汚れの種類及び試験結果を以下の表５Ａ及び５Ｂに示す。

微陽性変色の結果となった揚げ油以外の全ての汚れの種類について、組成物が陽性結果（観察可能な変色）をもたらしたことが観察された。変色は、不可視汚れについて約３秒後に、可視汚れについて噴霧適用ほぼ直後に観察された。

実施例４
実施例１（部分Ａ及び部分Ｂ）の組成物を、機械洗浄後のミルクセーキ機の様々な表面に関してＡＴＰ試験と比較した。市販のＡＴＰスワブ試験を使用した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡのＣｈａｒｍ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．より入手可能なＰＯＣＫＥＴＳＷＡＢ（登録商標）Ｐｌｕｓ）。ＡＴＰ試験の結果を相対発光量（ＲＬＵ）で示し、より高い測定値がより多い量のＡＴＰに相関することになる。ＡＴＰ、つまりアデノシン三リン酸の存在を使用して、生物学的汚れの存在を標示することができる。

試験した表面には、機械の内壁及び外壁、ならびにミキサーのシャフト及びノズルが含まれた。製造会社の説明書に従ってＡＴＰ試験を実施した。実施例１（部分Ａ及び部分Ｂ）の試験組成物を、スワブを使用して適用した。スワブを組成物の部分Ａで湿らせ、それを使用して試験表面にスワブ塗布した。組成物の部分Ｂで湿らせたパッドから部分Ｂをスワブに適用した。

試験結果を以下の表６に示す。

ＡＴＰ測定値にもかかわらず、表面の各々上に組成物が観察可能な変色を引き起こしたことが観察された。試験組成物の変色は、スワブ上及びパッド上の両方で約３秒後に可視的であった。

本発明のある特定の実施形態を説明してきたが、他の実施形態も存在し得る。本明細書は詳細な説明を含むが、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって示される。上記の特定の特徴及び行為は、本発明の例示的な態様及び実施形態として開示される。様々な他の態様、実施形態、修正、及びそれらの等価物が、本明細書の説明の読後、本発明の主旨または特許請求される主題の範囲から逸脱することなく当業者には想起され得る。

Claims (22)

1. 表面上のタンパク質または生物膜の存在を検出するための方法であって、
   （ａ）組成物を前記表面に適用することであって、前記組成物が、
   ｉ．硫酸銅を含む第１の部分と、
   ｉｉ．タンパク質または生物膜と接触したときに、Ｃｕ^１＋イオンと反応して可視呈色反応を引き起こすことのできる試薬を含む第２の部分と、を含み、
   前記組成物が、１１．５未満のｐＨを有する、適用することと、
   （ｂ）タンパク質または生物膜が前記表面上に存在する場合に、呈色反応を観察することと、を含む、方法。
2. 前記組成物が、噴霧、霧化、発泡、スワブ塗布（ｓｗａｂｂｉｎｇ）、スポンジ塗布（ｓｐｏｎｇｉｎｇ）、滴下、注出、または拭き取りによって適用される、請求項１に記載の方法。
3. 前記組成物が、前記表面の少なくとも７５％を被覆するように適用される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記第１の部分が、約０．０１〜約０．５重量％の水和硫酸銅（ＩＩ）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第２の部分が、約０．２〜約３．０重量％のビシンコニン酸を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記組成物が、約１０．５〜１１．４のｐＨを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記第１の部分及び前記第２の部分が、適用時に合わせて混合される別々の溶液として提供される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第１の部分及び前記第２の部分が、適用前に合わせて混合される別々の溶液として提供される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記第１の部分及び前記第２の部分が、１液型使用溶液として提供される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記表面が、プラスチック表面である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記表面が、金属表面である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記表面が、食品調理表面である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記呈色反応が、タンパク質または生物膜が存在する場合に、前記組成物を適用してから約１０秒以内に発生する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記呈色反応が、タンパク質または生物膜が存在する場合に、前記組成物を適用してから約５秒以内に発生する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記タンパク質または生物膜が、前記組成物を適用する前に不可視である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記組成物が、訓練プログラムの一部として適用される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記組成物が、評価プログラムの一部として適用される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記呈色反応の結果をモバイルアプリケーションまたはソフトウェアプログラムに入力することをさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 前記モバイルアプリケーションまたはソフトウェアプログラムが、日付、時間、場所、現場、色の結果、是正措置、またはそれらの組み合わせのデータフィールドを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 表面上のタンパク質または生物膜の存在を検出するための方法であって、
    （ａ）組成物を前記表面に適用することであって、前記組成物が、
    ｉ．約０．０１〜約０．５重量％の水和硫酸銅（ＩＩ）を含む第１の部分と、
    ｉｉ．タンパク質または生物膜と接触したときに、Ｃｕ^１＋イオンと反応して可視呈色反応を引き起こすことのできる約０．２〜約３．０重量％の試薬を含む第２の部分と、を含み、
    前記水和硫酸銅（ＩＩ）及び前記試薬が、５：１〜１：１５の比率で適用され、前記組成物が、１１．５未満のｐＨを有する、適用することと、
    （ｂ）タンパク質または生物膜が前記表面上に存在する場合に、前記組成物を適用してから３０秒以内に呈色反応を観察することと、を含む、方法。
21. 前記組成物が、噴霧、霧化、発泡、スワブ塗布、スポンジ塗布、滴下、注出、または拭き取りによって適用される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記第１の部分及び前記第２の部分が、適用前に合わせて混合される別々の溶液として提供される、請求項２０または２１に記載の方法。